KR20080020596A - 재생 의약에서 성체 줄기 세포를 비롯한 세포 부분집합의수집, 처리, 이식을 위한 통합된 기계 장치 - Google Patents

Abstract

특히, 재생 의약에서 기관 회복 목적으로, 성체 줄기 세포와 혈소판을 비롯한 세포 부분집합을 추출, 수집, 처리, 이식하는 기계 장치, 상기 기계 장치는 한 세트의 일회용 유체-수송 요소를 포함하고, 이들 요소는 미리 연결되거나, 무균 방식으로 이들 사이에 상호연결이 형성되도록 무균 커넥터를 보유하거나, 또는 무균으로 연결되도록 개조된다. 상기 세트는 일반적으로, 접시와 같은 서포트 상에서 블리스터 팩 내에 포장된 일회용 무균 요소의 3가지 키트: 수집 키트, 처리 키트, 이식 키트를 포함하고, 상기 블리스터 팩은 세트의 각 상호-연결가능 키트를 수용하기 위한 하나의 구획을 보유한다. 상기 세트는 환자로부터 골수, 또는 세포 부분집합의 다른 공급원을 추출하기 위하여, 예로써, 골 천자(bone puncture) 또는 정맥 천자(vein puncture)용 바늘을 보유하는 추출 장치를 포함한다.

기관 회복

Description

재생 의약에서 성체 줄기 세포를 비롯한 세포 부분집합의 수집, 처리, 이식을 위한 통합된 기계 장치{Integrated System for Collecting, Processing and Transplanting Cell Subsets, including Adult Stem Cells, for Regenerative Medicine}

본 발명은 조직을 회복하기 위하여 골수, 말초혈, 제대혈 또는 지방 조직 내에서 관찰되는 세포 부분집합을 국소 재주입하는 목적으로, 이들 세포의 수집, 자동화된 처리 및 이식에 관계한다. 세포 부분집합은 전형적으로, 성체 줄기 세포 또는 혈소판이지만, 더욱 일반적으로, 적혈구와 백혈구와 같은 임의의 세포 소집단이 포함된다. 이들 절차는 세포 처리 실험실이 없는 병원이나 의료 시설에서 수행될 가능성이 높고, 또한, 비전문적인 기술자에 의해 수행될 가능성이 높다. 본 발명은 또한, 투명 관을 통과하는 세포 부분집합을 모니터하는 새로운 유형의 광학 센서에 관계한다.

줄기 세포는 복수의 세포 계통으로 분화되는 클론원성(clonogenic)과 자기-재생 능력을 보유하는 세포로서 정의된다. 배아 줄기 세포는 배반포(blastocyst) 단계에서 포유동물 배아로부터 유래되고 체내에서 최종 분화된 세포를 산출하는 능력을 보유하는 반면, 성체 줄기 세포는 그들이 분화하도록 운명된, 출생후 생물체 의 조직-특이적 세포의 일부이다. 성체 줄기 세포는 배아 줄기 세포에 비하여 실제적인 이점을 제공한다. 후자와 달리, 이들은 윤리적 문제를 유발하지 않고, 환자 자신으로부터 추출될 수 있다. 이들은 공급량이 풍부하고 인체의 다양한 조직에 내재한다. 성체 줄기 세포의 가장 가용한 공급원은 최근의 연구에서 확인된 바와 같이, 골수, 말초혈, 제대혈 및 아마도, 지방 조직이다. 이들 세포는 생리학적 세포 생성(cell turnover) 또는 상처에 기인한 조직 손상의 결과로써, 그들 자신의 특이적인 조직 내에서 최종 분화된 세포를 유지하고 산출하고 대체할 수 있다. 세포 형성성(cell plasticity)이라고 하는 이런 능력은 병든 기관의 생리 현상과 기능을 회복시키는 목적으로, 결함된 조직의 재생을 목표하는 치료적 적용의 개발을 이끌어냈다. 성체 줄기 세포는 수십 년 전부터 알려진 바와 같이 조혈 세포를 산출할 수 있을 뿐만 아니라, 최근에 밝혀진 바와 같이, 혈관, 근육, 뼈, 연골, 피부, 신경 등을 산출할 수 있다. 이들 세포는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)로 알려져 있다. 이에 더하여, 혈소판 농축액으로 제조된 혈소판은 상처 치유를 가속화시키는데 이용될 수 있고, 결과적으로, 뼈, 피부 또는 기타 조직과 같은 조직의 재구성에 도움을 주는 재생 의약에서 일정한 역할을 수행할 수 있다.

조혈 줄기 세포는 화학요법을 받은 환자에 이식하여 그들의 조혈(hematopoiesis)을 회복하는데 주로 이용되고 있다. 초기에 골수로부터 추출되었던 이들 세포는 최근에, 말초혈 또는 제대혈로부터 공급되고 있는데, 이들 후자는 최대 증식 능력을 보유한다. 이식용 세포는 세포 분리 및 때때로, 차후의 선별 및/또는 증폭 과정과 같은 특별한 처리를 요한다. 현재까지, 이런 조작은 장비가 잘 갖춰진 세포-처리 실험실 내에서 세포 생물학과 혈액학에 능통한 고도로 숙련된 요원에 의해 수행되고 있다. 이런 조작은 튜브 내에서 원심분리, 밀도 구배 분리 등을 포함하는 노동 집중적인 실험실 준비를 필요로 하고, 박테리아 등에 의한 오염의 위험이 있는 개방된 기계 장치에서 종종 수행된다.

재생 의약 분야에서 줄기 세포에 의해 제공되는 이들 새로운 방식은 이들 기술에 적합하지 않은 환경에서 이들 세포를 조작해야 하는 실제적인 문제에 부딪힌다. 주요한 문제점 중의 하나는 이들 세포의 안전한 처리가 가능한 깨끗한 장소의 부족이다. 줄기 세포 기초된 요법을 실험하지만 적절한 세포 처리 시설이 부족한 심장학, 정형외과, 신경학 분야를 예로 들 수 있다. 결과적으로, 밀폐된 기계 장치 내에서 성체 줄기 세포 또는 임의의 세포 부분집합을 자동적으로, 그리고 신속하게 처리하여 환자의 임상(bedside)에서 온-라인 세포 처리 기계 장치를 제공할 수 있는 간편한 기계 장치가 필요하다.

본 발명의 요약

본 발명에서는 재생 의약에서 조직 회복을 목표하는 세포 부분집합의 추출, 수집, 처리, 이식이 가능한 기계 장치를 제시한다. 상기 기계 장치는 이러한 절차를 수행하기 위한 개별 키트를 보유하는 접시와 같은 서포트 상에 제공될 수 있다. 이들 개별 키트는 미리 연결되거나, 무균 방식으로 이들 사이에 상호연결이 형성되도록 무균 커넥터가 구비되거나, 또는 용접(welding)에 의해 작동하는 SCD(Terumo)와 같은 무균 연결 장치를 이용하여 연결될 수 있다.

본 발명에서는 청구항 1에 열거된 바와 같이, 환자의 임상에 온-라인 세포 처리 기계 장치를 제공할 수 있는 밀폐된 기계 장치 내에서 세포 부분집합을 자동적으로 처리/농축하는 간편한 기계 장치를 제시한다. 본 발명의 구체예는 종속항에 열거된다.

한 구체예에서, 환자로부터 세포 부분집합을 수집하는데 이용되는 수집 용기는 분리 챔버로도 이용될 수 있도록 하는 방식으로 설계될 수 있다. 유사하게, 분리된 세포를 수집하는데 이용되는 용기는 세포를 환자에게 환원하는 재주입 용기로도 기능할 수 있도록 하는 방식으로 설계될 수 있다. 이들 세포의 분리는 백혈구연층(buffy-coat) 집합을 표적하거나, 또는 EP-B-912 250(Claude Fell)과 PCT/IB99/020523(Biosafe)에 기술된 바와 같은 기계 장치에 기초하여, 밀도 구배 기초된 분리 과정 및 차후의 세포 세척을 이용하여 달성될 수 있다. 이들 세포를 처리하는 다른 방법은 WO03/009889(CellGenix/Biosafe)에 기술된 바와 같은 단클론 항체로 코팅된 마이크로비드를 이용하는 것이다.

투명 관으로 유동하는 세포에 기인한 흡수와 반사를 측정할 수 있는 광학 검출기(optical detector)의 병용은 혈소판과 같은 특정 세포 부분집합을 더욱 정확하게 수집하여 혈소판 농축액을 생산하는 것을 가능하게 한다. 이런 혈소판 농축액은 별개의 절차에서, 또는 세포 부분집합을 표적하는 절차 동안 부산물로서 획득될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 개별 이용을 위한 혈소판 농축액의 제조에서 앞서 기술된 기계 장치의 이용을 고려한다.

이런 이유로, 본 발명에서는 밀폐된 기계 장치를 이용함으로써 오염 위험을 최소화하는, 임상 개입(bedside intervention)을 위한 완전히 통합된 기계 장치를 제시한다. 이는 상당한 수준의 자동화를 제공하고, 특수한 전문적인 세포 처리 기술에 의존하지 않는다. 이는 임의의 세포 공급원(가령, 성체 줄기 세포, 혈소판)을 취급하는데 적합하고, 특히, 자기이식(autologous) 또는 동족이식(allogenic) 환경에서 골수 줄기 세포 제조에 적합하다.

본 발명은 예로써, 첨부된 개요도를 참조하여 더욱 상세하게 기술될 것이다:

도 1은 본 발명에 따른 골수 처리 키트의 전반적인 구성을 예시하는 다이어그램이다;

도 2에서는 본 발명에 따른 예시된 키트의 상이한 구성요소를 도시하는 도 3-7에 이용된 기호를 도시한다;

도 3A와 3B에서는 필터 단위를 포함하거나 포함하지 않는 수집 키트의 2가지 구체예를 도시한다;

도 4에서는 무균 커넥터에 의해 도 3A 또는 3B에 도시된 바와 같은 수집 키트에, 또는 도 5A 또는 5B에 열거된 바와 같은 이식 키트에 연결될 수 있는 처리 키트를 도시한다;

도 5A에서는 이식 키트의 개별 요소를 도시하고, 도 5B에서는 이식 키트를 구성하는 요소의 조합을 도시한다;

도 6에서는 완전한 기계 장치를 구성하기 위한 키트의 상이한 조합을 도시한다;

도 7은 회전가능 처리 챔버가 세포의 수집과 이식에 이용되는 분리 주사기를 구성하는 올인원(all-in-one) 골수 처리 세트의 다이어그램이다;

도 7A, 7B, 7C에서는 각각, 수집, 처리, 이식을 위한 도 7의 세트의 구성요소의 작업 배열(operative configuration)을 도시한다;

도 8A, 8B, 8C에서는 세포의 흡수와 반사 특성을 이용하여 광학 라인 센서에 의한 이들 세포의 탐지 원리를 도시한다;

도 8D에서는 LED와 리시버 장치가 존재하는 광학 라인 센서의 수직 분할(vertical view)을 도시한다;

도 9에서는 도 8의 광학 라인 센서의 전형적인 출력 신호를 도시한다.

본 발명은 손상되거나 결함된 조직을 회복시키거나 재생하는 목적으로, 세포 부분집합의 수집, 이들의 처리/농축 및 특정 세포 부분집합이 풍부한 산물의 재주입을 가능하게 하는 통합된 기계 장치에 관계한다.

이러한 공정은 자가이식 환경에서 기술된다, 다시 말하면, 이들 세포는 동일한 환자로부터 추출되고 동일한 환자에게 재주입된다. 일반적으로, 이런 자가이식 치료는 공여자와 수용자 사이의 불친화성(incompatibility)에 기인한 면역학적 반응이나 부작용이 나타나지 않기 때문에, 선호된다. 하지만, 이러한 원리는 동종이식 환경에도 동일하게 적용된다.

줄기 세포, 더욱 구체적으로, 중간엽 줄기 세포는 현재까지의 지식으로 골수에서 발견되지만, 여러 연구에서 제대혈, 말초혈 또는 심지어 지방 조직에도 존재하는 것으로 확인되고 있다. 이러한 원리가 줄기 세포의 다양한 공급원에도 적용될 수 있긴 하지만, 본 명세서에 기술된 공정은 골수의 처리에 관계한다.

이러한 공정은 먼저, 국소 마취 하에 골반 부위(pelvic zone)로부터 골수 추출로 구성된다. 뼈는 예로써, Tyco 타입의 골수 추출기를 이용하여 천공된다. 골수는 얼마간의 항응혈제, 통상적으로, 헤파린 또는 구연산염/인산염 용액으로 미리-채워진 하나 또는 복수의 주사기를 이용하여 흡인된다. 50 ㎖ 용량이 전형적으로 수집되지만, 수치는 변할 수 있다. 흡인된 골수는 일반적으로, PVC 수집 봉지로 이전되고, 여과되거나 여과되지 않고, 교반기 위에 놓일 수 있다. 이후, PVC 수집 봉지는 가급적, EP-B-912 250과 PCT/IB99/02052에 기술된 기계 장치 상에서 무균 기술을 이용하여 연결되고, 줄기 세포의 분리와 농축이 수행된다. 다른 원심분리 처리 챔버(가령, 회전축이 실린더형 처리 챔버의 축에 평형하지 않은 챔버), 또는 유연성 용기가 이용될 수 있다.

EP-B-O 912 250(CFELL)에서는 생물학적 유체의 처리와 구성요소로의 분리를 위한 기계 장치를 기술하는데, 상기 기계 장치는 분리되는 생물학적 유체 및 분리된 구성요소를 수용하기 위한 한 세트의 용기 및 선택적으로, 추가적인 용액을 위한 하나이상의 부가적인 용기를 포함한다. 속이 빈 원심분리 처리 챔버는 처리 챔버와 회전 구동 단위(rotary drive unit)의 맞물림(engagement)에 의해 회전축 주변으로 회전한다. 처리 챔버는 처리되는 생물학적 유체 및 생물학적 유체의 처리된 구성요소를 위한 축 방향 입구/출구를 보유한다. 이러한 입구/출구는 가변 체적의 분리 공간으로 이어지는데, 여기서 생물학적 유체의 전체 원심분리 처리가 진행된다. 처리 챔버는 처리 챔버의 말단 벽(end wall)으로부터 돌출하는 전체적으로 실린더형 벽을 포함하는데, 여기서 실린더형 벽은 회전축과 동축의 속이 빈 열린 실린더형 공간을 점유하는 속이 빈 처리 챔버를 한정하고, 상기 축 방향 입구/출구는 상기 전체적으로 실린더형 벽과 동축의 말단 벽 내에서 상기 속이 빈 처리 챔버 내로 통하기 위하여 제공된다. 처리 챔버는 전체적으로 실린더형 벽 내에서 피스톤과 같은 축 방향 이동성 멤버를 보유한다. 가변 체적의 분리 공간은 전체적으로 실린더형 벽에 의해, 그리고 처리 챔버의 전체적으로 실린더형 벽 내에 포함된 축 방향 이동성 멤버에 의해 상기 처리 챔버의 상부에 한정되는데, 여기서 이동성 멤버의 축 방향 이동은 분리 공간의 체적을 변화시키고, 상기 이동성 멤버는 원심분리 처리 이전에 또는 이러한 처리 동안 처리되는 선택된 양의 생물학적 유체를 입구를 통하여 분리 공간 내로 흡입하고 원심분리 처리 동안 또는 이러한 처리 이후에 분리 공간으로부터 처리된 생물학적 유체 구성요소를 출구를 통하여 급송하도록 처리 챔버 내에서 축 방향으로 이동된다. 이동성 멤버의 위치를 모니터함으로써 생물학적 유체의 흡입량 및 분리된 구성요소의 급송을 제어하는 수단이 제공된다. 이러한 기계 장치는 처리 챔버와 선택된 용기 사이에 선택적 소통(selective communication)을 확립하는, 또는 처리 챔버와 용기가 소통하지 않도록 하는 분배 밸브 정렬을 더욱 포함한다.

PCT/IB99/02052에 따라, 이런 기계 장치는 분리와 비-분리 전송 모드에서 작동하도록 정렬되는데, 이는 이전에 고려되지 않았던 새로운 적용, 예를 들면, 조혈 줄기 세포의 분리와 전반적인 실험실 처리를 비롯한, 상기 기계 장치의 더욱 높은 이용 가능성을 제공한다. 따라서, 이러한 기계 장치는 아래와 같이 작동하도록 정렬될 수 있다:

- 분리 모드에서, 유체는 회전하는 상태, 또는 정지한 상태의 처리 챔버 내로 흡입될 수 있고, 챔버 내로 흡입된 유체는 원심분리되고 구성요소로 분리되고, 분리된 구성요소는 챔버가 회전하는 상태에서 급송되고, 또는 선택적으로, 최종 분리된 구성요소는 정지한 상태에서 급송된다;

- 전송 모드에서, 처리 챔버는 유체를 흡입하고 챔버가 정지한 상태에서 유체를 급송한다. 밸브 구동 정렬은 유체의 원심분리 또는 구성요소로의 분리 없이 멤버를 이동시킴으로써, 처리 챔버를 통하여 한 용기에서 다른 용기로 일정량의 유체를 전달하도록 구동되고, 이동성 멤버의 위치를 모니터하는 수단은 전달되는 비-분리된 유체의 양을 제어한다.

EP-B-912 250과 PCT/IB99/02052에 따른 분리 챔버를 유익하게 이용하는 본 발명에 따른 새로운 적용에서, 분리는 임의의 특이적인 세포 부분집합 표적화 없이 줄기 세포에서 최대 수거(recovery)를 가능하게 하는 백혈구연층 집합을 표적할 수 있다. 공급원이 앞서 기술된 바와 같은 최초 산물은 피스톤을 하강시킴으로써 분리 챔버 내로 도입된다. 일단 산물이 분리 챔버 내로 적하되면 - 이는 분리 챔버의 입구 주변에 배치된 광학 라인 센서에 의해 탐지된다 - 전형적으로 5-10 분의 침강 사이클(sedimentation cycle)이 혈장과 적혈구 층 사이에 백혈구연층 층을 산출한다. 추출 시점에, 혈장은 먼저, 피스톤을 상승시킴으로써 추출된다. 광학 라인 센서, 예를 들면, 도 8에 도시된 광학 라인 센서는 백혈구연층에 속하는 세포를 탐지하고, 원하는 용량 및 제약(constraint)을 처리하는 시간에 따라, 세포 수거를 최적화하기 위하여 상이한 파라미터(추출 속도, 추출된 용량, 원심분리 속도)를 조정한다. 이들 백혈구연층 세포는 지정된 봉지 또는 바이알(처리 키트의 형태에 따라)로 추출된다. 남아있는 적혈구 세포는 지정된 봉지로 추출되거나, 또는 챔버 내에 유지된다(처리 시간을 절약하기 위하여). 백혈구연층 추출 단계 동안 최적화된 파라미터에 따라, 앞서 기술된 것과 같은 연속적인 침강/추출 사이클이 재개될 수 있다. 이는 백혈구연층 추출된 용량을 완결하고 세포 산물의 최종 적용에 따른 이의 특성을 최적화한다.

더욱 특이적인 세포 소집단을 선별하기 위하여, 반사와 흡수로 더욱 특이적인 세포 부분집합을 탐지하는 동일한 타입의 광학 라인 센서에 의해 앞서 기술된 원리(충전/침강/추출)가 이용될 수 있다. 혈장 추출 동안, 액체의 흡수와 반사는 매우 낮다. 세포가 튜브 내에서 유동하기 시작하면, 유출 산물의 흡수와 반사 모두 증가한다. 반사는 또한, 세포의 유형과 크기에 좌우된다. 이러한 의존성은 특정 세포 부분집합의 선별을 가능하게 한다. 최종적으로, 세포 농도가 높으면, 흡수는 최대 수준이고 반사는 더 이상 가능하지 않다. 이는 혈소판과 같은 상이한 크기를 갖는 세포 부분집합을 탐지하고 혈소판 농축액을 산출하는데 이용될 수 있다.

세포 부분집합 선별을 달성하기 위하여 선호되는 방법은 한정된 세포 소집단을 더욱 특이적으로 표적하는 밀도 구배(density gradient) 배지를 이용하는 것이다. 이는 적혈구 세포에서 오염 및 다른 원치 않는 세포 부분집합을 감소시킴으로써, 산물의 순도를 증가시킬 것이다. 밀도 구배 배지는 표적된 부분집합에 따라 선택된다. 가령, 단핵구 부분집합을 표적하기 위하여, Ficoll™ 기초된 배지가 이용될 수 있다. 이런 경우에, 먼저, 밀도 구배 배지가 분리 챔버 내로 도입된다. 이후, 피스톤을 전형적으로, 5 ㎖/min의 속도로 하강시킴으로써 골수가 천천히 도입되고 밀도 구배 배지의 층에 정착된다. 적혈구와 과립구는 밀도 구배 배지의 층을 통과하는 경향이 있는 반면, 단핵구 세포와 혈소판은 층의 앞면에 잔류한다. 광학 라인 센서(도 8)에 의해 상기 기구의 상부에서 탐지되는 바와 같이, 골수의 전체 용량이 도입되면 피스톤은 중지되고 예로써, 10-20 분의 침강 단계가 시작된다. 기계 장치에 연결된 등장액(isotonic solution)에 의한 산물의 완전한 흡인이후 상기 기계 장치에 의한 추가적인 희석이 자동적으로 수행될 수 있다. 침강 시간을 줄이기 위하여 원심분리 속도가 증가될 수 있다. 이후, 피스톤을 상승시킴으로써 수집이 시작된다. 액상 상층액은 혈장만을 포함한다. 이후, 첫 번째 세포가 뒤따르는데, 이들은 광학 라인 센서에 의한 탐지에서 유출 관을 불투명화시킨다. 이는 표적된 줄기 세포를 포함하는 단핵구 세포의 수집을 유인한다. 작업자 메뉴에 의해 미리 결정된 용량이후, 또는 유출 라인이 다시 투명해지면, 세포 수집은 중단되고 분리 챔버의 나머지 내용물은 상기 챔버가 완전히 비워질 때까지 폐기물 봉지에 수집된다. 이 단계에서, 분리 챔버는 등장액에 의해 모든 잔류 적혈구가 세척된다. 수집된 세포는 분리 챔버에 재도입되고, 염수/알부민(대안으로, 인산염 완충액 등도 이용될 수 있다)과 같은 세척 용액으로 후행되거나 선행된다. 이들 세포와 세척 용액은 혼합된다. 피스톤은 미리 결정된 용량이후, 또는 챔버가 완전히 차면 중지된다. 이후, 새로운 침강 단계가 수행되는데, 이 단계 동안, 수집 봉지는 침강 동안 생성된 상층액으로 세척되어 밀도 구배 배지의 잔류물이 제거될 수 있다. 이후, 상층액(세척 용액과 밀도 구배 배지로 구성됨)은 급송된다. 이러한 과정은 첫 번째 세포가 유출 라인(effluent line)에 다시 나타날 때 중지되거나, 또는 더욱 우수한 세척액을 획득하기 위하여 반복될 수 있다. 세포는 수집 용기 내로 최종적으로 수집되는데, 상기 수집 용기는 수집된 세포의 추가적인 이용을 용이하게 하도록 특수하게 설계될 수 있다. 필요한 경우에, 상기 챔버는 세척된다. 이들 세포는 환자의 표적된 기관 내로의 재도입이 용이하거나, 또는 선별이나 증폭 목적으로 더욱 조작될 수 있다. 이를 위하여, 본 발명의 기계 장치는 원하는 배양 배지 내에서 직접적으로 세포를 재-현탁시킬 수 있다.

밀도 구배 배지를 이용하는 것보다 더욱 개선된 분리는 단클론 항체로 코팅된 마이크로비드를 포함하는 배지 내에서 골수를 배양하는 것이다. 이런 분리 방법은 WO03/009889(CellGenix/Biosafe)에서 기술된다. 이러한 절차는 아래와 같이 수행된다. 특정 항체에 연결된 마이크로비드를 포함하는 산물은 목적하는 세포를 포함하는 혈액 산물과 혼합한다. 얼마간의 배양 시간 이후, 이들 마이크로비드는 표적된 세포의 표면에 유착하여 이들의 밀도를 변화시킨다. 혼합물은 분리 챔버 내에 부어 넣고, 기존 특허에서 기술된 바와 같이 부유 밀도(buoyant density) 분리를 개시한다. 침강이 완결되면, 상층액은 상기 챔버로부터 폐기물 봉지로 뽑아내고, 적혈구 세포 역시 버린다. 마이크로비드로 표시되고 최대 밀도를 보유하는 목적하는 세포는 상기 챔버를 마지막으로 빠져나오게 된다. 이들은 적당한 용기에 수집하고, 필요한 경우에, 후속으로 세척하여 항체 용액을 제거할 수 있다.

처리가 수행된 이후 즉시 재도입의 경우에, 수집된 세포는 무균 기술을 이용하여, 이들의 환자로의 이식을 가능하게 하는 장치에 연결될 수 있다. 심장학 분야에서, 이런 장치는 예로써, 급성 심근 경색 치료와 연관하여 이들 세포를 국소 재주입하기 위한, 혈관조영(angiography)에 이용되는 것과 같은 풍선 카테터(balloon catheter)일 수 있다. 이러한 경우에, 3 ㎖씩 단계별로 10 ㎖ 양의 농축된 줄기 세포가 재주입되어, 풍선을 규칙적인 간격으로 팽창시키고 줄기 세포의 확산을 가능하게 한다. 이런 방법은 Zeiher et al., TOPCARE - Circulation October 2002에서 기술되었다.

혈소판 농축액 수집의 경우에, 수거된 혈소판은 단독으로, 또는 환자의 혈장으로부터 획득가능한 트롬빈(thrombine)과 조합으로 이용되어, 상처 치유를 조장하는 혈소판 겔을 형성할 수 있다. 이런 혈소판 겔은 단독으로, 또는 줄기 세포와 공동으로, 조직 회복을 유리하게 촉진할 수 있는 성장 인자를 포함한다.

전체 공정은 환자의 임상에서 수행될 수 있고, 따라서, 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이, 온-라인 공정으로서 간주된다. 이는 안전성, 물류, 반응 시간에서 현저한 이점을 제공하고, 세포 처리의 임의의 특수한 전문 기술에 의존하지 않는다.

다양한 표적된 세포 부분집합의 수집은 동일한 작업 동안 상이한 시간 간격에서 이런 세포 부분집합을 이용하는 목적으로, 동일한 수집 절차에 의해 달성될 수 있다.

본 발명에서는 수집, 분리, 이식을 각각 수행하기 위한 개별적인 일회용 무 균 세트를 이미 포함하는 기계 장치 또는 “맞춤 팩”을 제시한다. 이런 팩은 일회용 세트 또는 키트: 골수 추출용 세트; 가급적, EP-B-912 250과 PCT/IB99/020523에 기술된 기계 장치에 기초한 타입의 골수 분리용 세트; 세포의 재주입용 세트를 각각 포함하는 3 구획을 보유하는 “블리스터(blister)”로 제공될 수 있다. 각 세트는 얼마간 변동될 수 있고, 최대 변동성(versatility)을 갖는 세트는 이식 세트인데, 그 이유는 이식 세트가 처리되는 표적된 조직(가령, 뼈, 근육, 혈관 등)에 좌우되기 때문이다. 개별 세트 배열은 도 2-7에 도시된다.

예로써, 완전 밀폐된 기계 장치를 이용하기 원하는 경우에, 이들 세트는 서로 함께 미리 연결되거나, 또는 3개의 세트 중에서 2개가 미리 연결될 수 있다. 미리 연결되지 않은 경우에 실용적인 해법은 무균 연결 하에 연결되어 밀폐된 기계 장치의 특징이 유지되도록 담보하기 위하여, 특수하게 설계된 무균 커넥터, 예를 들면, PALL(ref. ACD)에 의해 제공되고 US 특허 3,650,093, 5,868,433, 6,536,805, 6,655,655에 기술된 Medlock 기계 장치를 이용하는 것으로 구성된다. 다른 가능성은 무균 연결 장치를 이용하여 세트를 연결하는 것이다. 상기한 임의의 배열 - 미리 연결되거나, 또는 무균 연결 장치 또는 살균 연결 장치로 연결된 - 은 기능적으로 밀폐된 기계 장치를 제공한다. 이런 기능적으로 밀폐된 기계 장치는 깨끗한 공간 또는 적층 유동 시스템(laminar flow system)이 필요하지 않은데, 이는 일반적으로, 이들 요건을 충족시키는 설비가 갖추어지지 않은 작업실 또는 개입 단위 환경(interventional unit environment)에서 매우 중요한 이점이다.

본 발명의 다른 개선은 처리 챔버로서 지칭되는, 두 번째 단계에서 분리 챔 버로서 기능하는 골수 흡인 용기이다. 이의 설계는 PCT/IB99/020523에 기술된 분리 챔버와 유사하고, 골반 뼈(pelvic bone)를 관통하기 위한 특수한 바늘이 설치될 수 있다. 이는 항응혈제로 미리 채워지거나, 또는 수집을 시작하기에 앞서, 항응혈제로 자극될 수 있다. 뼈가 관통되면, 골수는 수동 또는 전기 진공 소스에 의해 작동된 처리 챔버의 피스톤을 하강시킴으로써 흡인된다. 이후, 처리 챔버는 이러한 기구의 원심분리기 내로 삽입되고, 관 라인과 봉지의 어레이로 구성되는 세트가 상기 챔버 상에 연결된다. 그 다음, 예로써, 백혈구연층 원심분리 프로토콜을 이용하여, 앞서 기술된 공정에 따라 분리를 개시할 수 있다.

본 발명의 다른 개선은 분리된 세포를 특수한 용기 내로 수집하는 것인데, 상기 용기는 이들 세포를 환자에게 재주입하는 기계 장치에 용이하게 연결되거나 설치될 수 있다. 이런 용기는 한 단부에 분리 세트가 연결되고 다른 단부에 카테터에 후속 연결을 위한 루어 락(luer lock) 커넥터가 구비된 Y 커넥터가 설치된 눈금 표시된 주사기일 수 있다.

도 3A와 3B에서는 각각, 필터 단위를 포함하지 않는 수집 키트 및 필터 단위를 포함하는 수집 키트를 도시한다. 이러한 수집 키트는 골수 흡인을 달성하기 위하여 필요한 모든 것을 통합한다:

a. 입력 지점(input point)은 예로써, 골수 추출기(가령, TYCO 타입)이고, 전형적으로, 골 천자용 바늘 또는 정맥 천자용 바늘을 보유한다. 이는 스톱콕 밸브 또는 다른 밸브를 통하여 키트의 나머지 부분에 직접적으로 연결될 수 있다.

b. 흡인을 수행하기 위하여 필요한 하나이상의 주사기(1...n).

c. 도 3B에 도시된 바와 같이, 수집이후 골수를 여과하는 필터가 수집 키트에 삽입될 수 있다.

d. 수집된 골수(여과되거나 여과되지 않은)는 처리에 앞서 전달 봉지 내에 저장된다.

e. 가능하면, 골수에 희석 산물을 추가하고 및/또는 필터를 세척하기 위하여 부가적인 주사기가 이용될 수 있다.

f. 무균 커넥터(Pall ACD 등)가 이용될 수 있다.

수집 키트는 예로써, 아래와 같이 배열될 수 있다:

C11 처리 키트 상에서 뼈바늘(a)이 미리 연결된, 필터(c) 없는 수집 키트.

주사기(b)의 양 X.

C12 처리 키트 상에서 뼈바늘(a)이 미리 연결되지 않은, 필터 없는 수집

키트. 주사기(b)의 양 X.

C21 처리 키트 상에서 뼈바늘(a)이 미리 연결된, 필터(c) 포함 수집 키트.

주사기(b)의 양 X.

C22 처리 키트 상에서 뼈바늘(a)이 미리 연결되지 않은, 필터(c) 포함 수집

키트. 주사기(b)의 양 X.

이들 모든 배열에서, 뼈바늘은 정맥 천자용 바늘로 대체될 수 있다.

도 4에서는 무균 연결에 의해 앞서 기술된 수집 키트에 연결되도록 개조된 처리 키트를 도시한다.

a. 무균 연결은 무균 조건 하에 무균 커넥터(가령, Pall ACD 등) 또는 스파 이크 커넥터(spike connector)를 통하여 달성될 수 있다.

b. 기포가 처리 통로 내로 들어오는 것을 예방하기 위하여 선택적 드립 챔버(drip chamber)가 이용될 수 있다.

c. 유체 통로의 방향은 본 실시예에서 3개의 스톱콕(stopcock)이 적재된 스톱콕 밸브 램프(stopcock valve ramp), 또는 다른 타입의 밸브, 예를 들면, 멀티포트 밸브에 의해 선택될 수 있다.

d. 분리 공정에 예로써, EP-B-912 250과 PCT/IB99/02052에 기술된 분리 챔버가 이용된다.

e. 부가적인 산물(등장액, 배양 배지,...)은 하나이상의 연결(스파이크 커넥터, ... - 1...n)이 구비된 라인에 의해 유입된다.

f. 폐기된 산물과 밀도 구배 배지 입력에 대하여 폐기물 봉지가 이용된다.

g. 선택적 중간 봉지가 구비된 출력 라인은 산물을 이식 키트로 안내한다.

h. 이러한 라인에 무균 커넥터(Pall ACD 등)가 이용될 수 있다.

처리 키트의 주요 변형은 아래와 같다:

P1 중간 봉지 없는 처리 키트

P2 중간 봉지 포함 처리 키트.

도 5A에서는 이식 키트의 가능한 개별 요소를 도시하고, 도 5B에서는 이식 키트를 구성하는 요소의 가능한 조합을 도시한다. 이러한 이식 키트는 무균 연결을 통하여 앞서 기술된 처리 키트에 연결되도록 개조되고, 이식을 위한 최종 산물을 보유한다. 이러한 무균 연결은 무균 조건 하에 무균 커넥터(가령, Pall ACD 등) 또 는 스파이크 커넥터(spike connector)를 통하여 달성될 수 있다.

이식 키트는

T1 봉지

T2 수집 바이알

T3 주사기

T4 이식을 위한 특정 장치(가령, 심근 경색에서 카테터)

T5 T1-T4의 조합을 포함할 수 있다.

일반적으로, 이러한 이식 키트는 적어도 하나의 이식을 위한 특정 장치(T4)를 최소한 포함하는데, 상기 장치는 다른 구성요소, 예를 들면, 봉지(T1) 또는 수집 바이알(T2) 및/또는 주사기(T3)의 다양한 조합과 합체될 수 있다.

도 6에서는 완전한 기계 장치를 구성하기 위한 키트의 상이한 조합을 도시한다. 이러한 완전한 시스템은 예로써, 앞서 기술된 바와 같은 수집 키트(C11 내지 C22), 처리 키트(P1 또는 P2), 이식 키트(T1 - T4)의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.

도 7은 예로써, EP-B-912 250과 PCT/IB99/020523에 기술된 회전가능 처리 챔버(b3)가 세포의 수집과 이식에 이용되는 분리 주사기를 구성하는 올인원(all-in-one) 골수 처리 세트의 다이어그램이다. 수집 키트(a)는 입력 지점, 예를 들면, 처리 챔버(b3)에 연결을 위한 무균 커넥터가 설치된 골수 추출기(가령, TYCO 타입)로 구성된다. 처리 키트(b)는 세척 봉지(b2)와 밀도 구배 배지/폐기물 봉지(b4)에 연결된 스톱콕 밸브(b1) 및 무균 커넥터에 의해 스톱콕(b1), 또는 수집 키트(a), 또 는 이식 키트(c)에 연결가능한 분리/처리/이식 챔버(b3)를 포함한다. 이식 키트(c)는 처리 챔버(b3)에 연결을 위한 무균 커넥터가 설치된 이식을 위한 특정 장치(가령, 심근 경색에서 카테터)로 구성된다.

도 7A, 7B, 7C에서는 각각, 수집, 처리, 이식을 위한 도 7의 세트의 구성요소의 작업 배열(operative configuration)을 도시한다.

도 7A에서, 수집/처리 챔버(b3)는 무균 커넥터에 의해 수집 시스템(a)의 입력 지점에 연결되고, 따라서, 처리 챔버는 추출된 줄기 세포를 수집하는 역할을 수행한다. 줄기 세포의 흡입은 처리 챔버(b3) 피스톤의 변위(displacement)에 의해 제어된다.

도 7B에서, 수집/처리 챔버(b3)는 무균 커넥터에 의해 스톱콕(b1)에 연결되고, 상기 스톱콕은 처리된/농축된 줄기 세포가 처리 챔버(b3)로 환원되면 종결되는 앞서 기술된 처리 작업을 위하여, 이를 세척 봉지(b2) 및 밀도 구배 배지/폐기물 봉지(b4)에 선택적으로 연결한다. 이후, 처리 챔버(b3)는 재주입 챔버로서 기능한다.

도 7C에서는 무균 커넥터에 의해 이식 키트(c)의 이식 장치에 연결된, 처리 키트의 스톱콕 밸브(b1)로부터 분리이후 처리 챔버(b3)를 도시한다. 이러한 배열에서, 처리된 줄기 세포의 환자 내로의 재주입은 처리/재주입 챔버(b3) 피스톤의 변위에 의해 제어될 수 있다.

이러한 구체예는 순차적인 수집, 처리, 재주입 작업을 수행하기 위하여 처리 챔버(b3)를 수집 키트(a)로, 또는 스톱콕 밸브(b1)를 통하여 처리 키트의 나머지 부분으로, 또는 이식 키트(c)로 선택적으로 연결하는 무균 커넥터의 이용에 의존한다. 이는 불필요한 요소를 포함하지 않고 이용하기 편의한 압축된 기계 장치를 제공한다.

도 8A, 8B, 8C에서는 투명 관을 통과하는 세포의 흡수와 반사 특성을 이용하여 광학 라인 센서 LS에 의한 이들 세포의 탐지 원리를 도시한다. 도 8A는 투명한 액체를 보유하는 관의 배열인데, 여기서 LS로부터 광은 반사되지 않고 광축(light axis) 상에서 전방 검출기(forward detector) R로 직접적으로 진행된다. 도 8B는 투명 액체에서 현탁 상태의 세포를 보유하는 관의 배열이다; 이 경우에, 세포는 광을 무작위 방향으로 반사하고, 축에 대하여 대략 90°로 배치된 전방 검출기 R과 측방 검출기(lateral detector) R 둘 모두에 의해 포착된다. 도 8C는 광이 반사되지 않는 불투명 액체를 보유하는 관의 배열이다. 도 8D에서는 LED와 리시버 장치가 위치하는 광학 라인 센서의 수직 분할(vertical view)을 도시하고, 특히, Forward Blue(Fblue), Lateral Blue(Lblue), Forward Red(Fred), Lateral Red(Lred) 광의 위치를 도시한다.

도 9에서는 “전방(forward)”과 “측방(lateral)” 센서로부터 기록되는, 광학 라인 센서의 전형적인 출력 신호를 도시한다. “측방” 반사된 신호로부터 획득된 정보는 수집을 개시하거나 종결하는 유발인자로서 이용될 수 있다. 센서 출력 수치(sensor output value)(Y 축)는 최대 수준의 백혈구연층(BC) 추출(전체 용량에서 비율)이다. X 축은 관을 통과하는 용량의 정보에 상당한다(전체 용량에서 비율).

당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 기술적 사상 또는 본질적인 특성을 벗어나지 않는 여러 상이한 형태로 구현될 수 있다. 본 발명의 범위는 상세한 설명이 아닌 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된다. 이런 이유로, 특허청구범위의 등가물의 의미와 범위 내에 속하는 모든 구체예는 이들 특허청구범위에 포섭된다.

Claims (19)

1. 특히, 재생 의약에서 기관 회복 목적으로, 성체 줄기 세포와 혈소판을 비롯한 세포 부분집합을 추출, 수집, 처리, 이식하는 기계 장치에 있어서, 상기 기계 장치는 한 세트의 일회용 무균 유체-수송 요소를 포함하고, 이들 요소는 미리 연결되거나, 무균 방식으로 이들 사이에 상호연결이 형성되도록 무균 커넥터를 보유하거나, 또는 무균으로 연결되도록 개조되고, 상기 세트는

   - 환자로부터 골수, 또는 세포 부분집합의 다른 공급원을 추출하기 위하여, 예로써, 골 또는 정맥 천자용 바늘을 보유하는 추출 장치;

   - 추출 장치에 의해 환자로부터 추출된 세포를 수집하기 위하여 상기 추출 장치에 미리 연결되거나 연결가능한 수집 챔버; 수집된 세포 상에서 처리와 전달 작업을 수행하는 처리 장비와 공조하도록 개조된 처리 챔버; 환자에게 환원되는 처리된 세포를 보관하기 위한 재주입 챔버를 비롯한, 환자로부터 추출된 세포 부분집합의 수집, 처리, 재주입을 위한 적어도 하나의 챔버; 여기서, 수집, 처리, 재주입 챔버는 분리가능하고 미리-연결되거나 상호연결가능하고, 또는 다중-목적 처리 챔버가 수집-처리 챔버, 처리-재주입 챔버 또는 수집-처리-재주입 챔버의 복합 기능을 제공하고;

   - 처리된 세포를 환자에게 환원하기 위하여 재주입 챔버에 미리 연결되거나 연결가능한 이식 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
2. 청구항 1에 있어서, 일회용 요소의 세트는 접시와 같은 서포트 상에서 블리스터 팩 내에 포장되고, 상기 블리스터 팩은 전체 상호연결된 세트를 수용하기 위한 하나의 구획, 또는 세트의 다른 부분에 연결을 위한 무균 커넥터를 보유하는, 상기 세트의 일부분을 각각 수용하는 복수의 구획을 보유하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 일회용 요소의 세트는 일회용 요소의 3가지 키트: 수집 키트, 처리 키트, 이식 키트를 포함하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
4. 청구항 3에 있어서, 수집 키트는 단독으로, 또는 적어도 하나의 주사기, 수집 챔버를 형성하는 전달 봉지 및 선택적으로, 처리 키트에 연결을 위한 무균 커넥터와 공동으로, 골수 추출기 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
5. 청구항 4에 있어서, 수집 키트는 주사기와 전달 봉지 사이에 연결되거나 연결가능한 필터를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
6. 청구항 3, 4, 5중 어느 한 항에 있어서, 처리 키트는 처리 챔버 및 처리 챔버 내외로, 그리고 일회용 용기 내외로 유체의 선택적인 전달을 가능하게 하는 적어도 하나의 스톱콕 밸브 또는 멀티포트 밸브를 통하여 상기 처리 챔버에 연결된 적어도 하나의 일회용 용기를 포함하고, 상기 처리 챔버는 수집 키트에 연결되거 나, 수집 키트에 연결을 위한 무균 커넥터를 보유하거나, 또는 무균 연결이 형성되도록 개조되고, 상기 처리 챔버는 또한, 이식 키트에 연결되거나, 상기 이식 키트에 연결을 위한 무균 커넥터를 보유하거나, 또는 무균 연결이 형성되도록 개조되는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
7. 청구항 6에 있어서, 처리 키트는 스톱콕 밸브 또는 멀티포트 밸브에 부가적인 용기를 연결하기 위한 하나이상의 커넥터가 구비된 라인(line)을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
8. 청구항 3 내지 8중 어느 한 항에 있어서, 이식 키트는 적어도 하나의 이식 장치; 또는 적어도 하나의 이식 장치 및 수집 봉지, 수집 바이알, 주사기 중에서 적어도 하나의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
9. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 처리 챔버는 처리되는 세포 및 처리된 세포에 대한 입구/출구를 보유하는 속이 빈 원심분리 처리 챔버이고, 상기 처리 챔버는 이들 세포를 수용하기 위한 가변 크기의 분리 공간을 한정하는 이동성 멤버를 보유하고, 상기 이동성 멤버는 처리되는 선택된 양의 세포를 상기 입구를 통하여 분리 챔버 내로 흡입하고 분리 챔버로부터 처리된 세포를 상기 출구를 통하여 급송하도록 이동되는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
10. 청구항 9에 있어서, 원심분리 처리 챔버는 일반적으로, 실린더형이고 실린더 축 주변으로 회전가능하며, 이동성 멤버는 원심분리 처리 챔버 내에서 유체가 새지 않으면서 이동가능하게 적재된 피스톤인 것을 특징으로 하는 기계 장치.
11. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서,

    - 환자로부터 골수, 또는 세포 부분집합의 다른 공급원을 추출하기 위한 장치, 상기 장치는 추출된 줄기 세포를 처리 챔버 내에 수집하기 위하여 무균 연결에 의해 상기 처리 챔버에 연결가능하고;

    - 처리 챔버 내외로, 그리고 일회용 용기 내외로 유체의 선택적인 전달을 가능하게 하는 적어도 하나의 스톱콕 밸브 또는 멀티포트 밸브를 통하여 상기 처리 챔버에 연결된 적어도 하나의 일회용 용기, 상기 처리 챔버는 무균 커넥터를 통하여 스톱콕 또는 멀티포트 밸브에 연결가능하고;

    - 처리된 세포의 환자로의 전달을 위한 재주입 챔버로서 처리 챔버가 기능할 수 있도록 무균 연결에 의해 상기 처리 챔버에 연결가능한 적어도 하나의 이식 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
12. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 처리 챔버는 특정의 세포 부분집합 농축된 산물(성체 줄기 세포와 혈소판 포함)을 생산하도록 정렬되는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
13. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 처리 챔버는 밀도-구배 기초된 공정 및 차후의 세포 세척을 이용하여 줄기 세포를 분리하도록 정렬되는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
14. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 단클론 항체로 코팅된 마이크로비드를 이용하여 줄기 세포를 처리하도록 정렬되는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
15. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 투명 관을 통과하는 세포 부분집합에 의한 광의 차별적 반사를 탐지하기 위한 광학 라인 센서(optical line sensor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 기계 장치.
16. 개별적으로 이용되는 혈소판 농축액을 제조하기 위한 전술한 항중 어느 한 항에 따른 기계 장치의 용도.
17. 특히, 재생 의약에서 기관 회복 목적으로, 인간 내로 이식을 위하여 상기 인간으로부터 추출된 세포 부분집합을 수집하고 처리하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

    줄기 세포를 보유하는 세포, 특히, 골수를 추출하는 추출 장치에 연결된 수집 챔버 내에서 추출된 세포를 수집하고,

    수집 챔버와 동일하거나 상기 수집 챔버에 연결된 원심분리 처리 챔버 내에 서 세포를 처리하고,

    처리 챔버와 동일하거나 상기 처리 챔버에 연결된 재주입 챔버 내에서 처리된 세포를 수집하고, 상기 재주입 챔버는 처리된 세포 부분집합을 환자에게 환원하기 위하여 재주입 챔버에 연결된 이식 장치에 연결된다.
18. 청구항 17에 있어서, 청구항 1 내지 15중 어느 한 항에 따른 기계 장치를 이용하여 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 투명 관을 통과하는 세포 부분집합의 흡수와 반사를 측정할 수 있는 광학 센서.

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