MX2007009177A - Composiciones inmunologicamente activas. - Google Patents

Composiciones inmunologicamente activas.

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Laszlo Stipkovits
Peter Grandics
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Abstract

Esta invencion provee un sistema vehiculo para microparticula que comprende una o mas proteinas, peptidos, acidos nucleicos, carbohidratos, lipidos u otras sustancias bioactivas con o sin moleculas direccionadoras unidas; ademas, la invencion tambien provee composiciones moduladoras inmunes y metodos para inducir respuestas inmunes protectoras tanto en hospederos no infectados como en hospederos infectados asi como la induccion de tolerancia inmune.

Description

COMPOSICIONES INMUNOLOGICAMENTE ACTIVAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta invención provee composiciones inmunológicamente activas que pueden inducir inmunidad protectora o tolerancia. La composición para inducir inmunidad protectora tanto en hospederos no infectados o infectados consiste de epítopes antigénicos pero excluye o elimina epítopes que participan en el "escape" inmune o que inducen la tolerancia. La inmunidad protectora también se puede inducir por una composición que incluye un patrón(es) molecular asociado al patógeno y/o un vehículo con o sin los epítopes antigénicos. Otra composición inmunológícamente activa que induce tolerancia incluye un epítope(s) de escape o un patrón(es) molecular para escape del patógeno, con o sin un vehículo. Además, la invención provee métodos para identificar dichas moléculas inmunológicamente activas. El progreso en la inmunobiología ha identificado los factores inmunológicos esenciales para el desarrollo de moduladores inmunes, incluyendo el requerimiento para inducir respuestas inmunes innatas y adaptativas que controlan a los patógenos. Con la llegada de la resistencia extendida a los antibióticos, los moduladores inmunes pueden ser el método más efectivo para suministrada protección a largo plazo en contra de microorganismos incluyendo patógenos intracelulares. El enfoque actual sobre los moduladores inmunes requiere el desarrollo de vectores novedosos, vehículos efectivos y sistemas adyuvantes. Puesto que los patógenos también pueden inducir la respuesta a Th2 en la tolerancia, esta comprensión también se puede utilizar para el desarrollo de moduladores inmunes para enfermedades autoinmunes, transplante y otras aplicaciones médicas. La mayoría de los patógenos entran al cuerpo a través de la piel y de las membranas mucosas. Por lo tanto, estas rutas de administración son particularmente adecuadas para la modulación inmune en contra de infecciones que entran a través de la piel, las vías aéreas, el tracto gastrointestinal, o los órganos sexuales. Las vacunas tradicionales se administran parenteralmente, lejos del sitio real de infección y su respuesta mucosal es menos pronunciada. Actualmente es evidente que además de los receptores semejantes a Toll (TLRs) existen otros receptores y rutas que desempeñan un papel importante en la respuesta inmune innata. Un ejemplo de éstos son las proteínas con dominio para oligomerízación del nucleótido (NOD) que reconocen motivos microbianos de microorganismos intracelulares. Mindin, una proteína de matriz extracelular también es un mediador de la respuesta inflamatoria a varios componentes de la superficie bacteriana. Estos y otros estudios sugieren que la inmunidad innata incluye factores adicionales independientes de la señalización por TLR y que la producción de NFKB o IL-1 puede no ser suficiente para controlar las infecciones.
Los elementos típicos de la inmunidad innata incluidos en el control de las infecciones son: (1 ) respuesta proinflamatoria: mediada por NFKB, activa muchos agentes de inflamación, sobre-estimulación puede resultar en choque; (2) péptidos catiónicos de defensa del hospedero: producción incrementada de péptidos estimulada por patrones moleculares asociados con el patógeno bacteriano (PAMPs) y moléculas de señalización; (3) activación de la célula fagocítica: eliminación intracelular incrementada en neutrófilos y macrófagos (mejoría tanto en mecanismos oxidativos como no oxidativos, producción incrementada de citoquina; (4) quimotaxis: adhesión endotelial incrementada de células fagocíticas, migración celular al sitio de la infección, diapedesís; (5) mecanismo de eliminación extracelular: activación del complemento, acción quelante mejorada del hierro, secreción del péptido antimícrobiano, producción de enzimas degradantes; (6) contención de la infección: formación de coágulo vía activación del fibrinógeno; (7) reparación de la herida: crecimiento y adherencia del fibroblasto, angiogénesis; y (8) respuestas inmunes adaptativas: activación de la célula B y T, frecuentemente vía células dendríticas. La estimulación de la inmunidad innata se puede lograr mediante el uso de interferones, monofosforil-lípido A, imiquimod, nucleótidos CpG o péptidos catiónicos. Sin embargo, la inmunidad innata tiene una capacidad limitada para detener las infecciones y en dicho escenario la respuesta inmune adaptativa toma lugar.
Recientemente, se ha reconocido que las células dendríticas son esenciales para asociar la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa y este conocimiento permite a los inmunólogos diseñar estrategias de modulación inmune en contra de antígenos escasamente inmunogénicos. Las células dendríticas (DC) se originan a partir de precursores tanto de los linajes mieloide como linfoide, pero son principalmente células presentadoras del antígeno (APC). Las DCs están presentes en cada tejido, y durante una infección son las células inmune clave que entran en contacto con el patógeno invasor. Estas son el puente entre la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. Las células endoteliales y epiteliales, monocitos, macrófagos y otras células, incluyendo DCs inmaduras expresan receptores para reconocimiento del patrón del patógeno (receptores TLR, a receptores del dominio de lectina y otros receptores) que se unen a las estructuras moleculares conservadas asociadas con el patógeno (PAMPs para brevedad) compartidas por los patógenos tales como lipopolísacárídos la partir de bacterias Gram negativas, ácido lipoteícóico a partir de bacterias Gram positivas, peptidoglicano, lipoproteínas asociadas a peptidoglicano, ADN bacteriano y flagelina a partir de bacterias Gram negativas y Gram positivas así como ARN viral. Las células diferentes expresan receptores diferentes permitiendo una respuesta adaptada por el patógeno. Después de la activación, las DC inmaduras que capturan el antígeno se diferencian hacia DC maduras presentadoras del antígeno, capaces de presentar el antígeno en los contextos de las MHC clase II y clase I, así como sobre-regulan la expresión de moléculas de superficie co-estimulantes tales como CD80 y CD86. La DC madura y activada migra hacia los órganos linfoides secundarios (nodulos linfáticos, bazo, placas de Peyer), en donde se translocan hacia las áreas de la célula T. La interacción de DC con y la estimulación de las células T es dependiente de las citoquinas, quimocinas y moléculas de adhesión tales como moléculas intracelulares de adhesión celular (l-CAMs), molécula asociada a la función del leucocito 1 (LFA-1 ) e ICAM específica de la célula dendrítíca que no toma la integrina (DC-SEÑAL). Dependiendo del ambiente local de la citoquína y del antígeno, se activan en grados variables las respuestas inmunes orientadas a Th2 o Treg mediadas por el anticuerpo humoral y por el anticuerpo auxiliar T celular (Th1 ). Se ha mostrado que la dosis de antígeno dirige la diferenciación Th1/Th2, con altas dosis estimulando preferiblemente la respuesta Th-1 y bajas dosis estimulando preferiblemente la respuesta Th-2. Se ha mostrado que las proteínas antigénicas que exhiben dispositivos vehículo y las vacunas de ADN se toman por las células dendrítícas inmaduras y llevan a una respuesta inmune. Por lo tanto la DC representa un objetivo principal pero no el único del desarrollo para la modulación del sistema inmune. Las DCs mucosales específicamente proveen una primera línea de defensa importante por invasores externos que se ingieren vía tanto pínocitosis como endocitosis mediada por receptor. La DC desempeña un papel crítico en la inmunidad mucosal puesto que la mucosa corporal actúa como una barrera entre el interior y el exterior del cuerpo. La DC se puede encontrar en el revestimiento del tracto respiratorio y del intestino. Las células de Langerhans son una población de DC que se encuentra en la piel y en la mucosa. Las células DCs y M transportan antígenos del folículo linfoide subyacente que es el sitio inmuno-inductor del intestino. Los tejidos linfoides similares asociados a la zona nasal y a los bronquios se han descrito en el tracto respiratorio. Este sistema es importante en el tracto gastrointestinal, pero en las vías aéreas, la red DC subyacente puede ser incluso más importante. En el caso de la administración oral, el modulador inmune debe pasar sin degradación a través del estómago y los intestinos superiores. No es probable que ocurra dicha degradación a través de una ruta de administración nasal, ocular o genital. Subsecuentemente, el modulador inmune se debe tomar a través del epitelio intestinal, de manera que se absorba y subsecuentemente se presenta a las células competentes inmunes por las células presentadoras del antígeno. Las células competentes inmunes se localizan en el epitelio, la lámina propia o por debajo de la membrana basal. Por lo tanto, los componentes del modulador inmune se deben formular con un vehículo que los lleva a través de esta barrera. Cuando se unen a vehículos particulares, generalmente se acepta que las moléculas se pueden transportar a través de la barrera por las células M en las placas de Peyer.
La degradación prematura o liberación de las moléculas bioactivas ha impedido el desarrollo de vacunas basadas en partícula y tecnologías para suministro del fármaco. Esta es la explicación probable de porqué en la literatura publicada aún se requiere una alta dosis de antígeno/fármaco para lograr respuestas comparables en comparación con la contraparte inyectada. Además de la escasa utilización de los antígenos y de los fármacos, la otra crítica principal se refiere a la escasa capacidad de las células M en las placas de Peyer (PP) para transportar partículas y la inmunidad insuficiente y otras respuestas inducidas en humanos. Se sabe que las células M epiteliales de la PP permiten el transporte de ciertas bacterias, virus y protozoos a partir de los intestinos. Varios estudios han mostrado que la toma dependiente de tamaño con un diámetro máximo de 10 µm se puede presentar por las células M, DCs y células Caco-2. La información reciente de la toma de partículas por las células M y los diferentes tipos de células dendríticas (DCs) presentes en las PPs y su vecindad pueden proveer un entendimiento de los mecanismos implicados. Beyer (Beyer T., et al; Bacterial carriers and virus-like-particles as antigen delivery devices: Role of dendritic cells in antigen presentation. Curr. Drug Targets-lnfect. Disord, 2001 1 , 287-302) siguiendo la toma y cinéticas de las células de levadura de panadero (Saccharomyces cerevisiae) en las PP, asumiéndolo como un modelo inerte para transportar través de la mucosa. Se encontró una dependencia de tiempo típica compatible con el transporte a diferentes tipos de macrófagos que realizan fagocitosis, que poseen antígenos o células dendríticas para la distribución de las células de levadura en las células M, el saco intercelular por debajo de las células M y el espacio inferior a la membrana basal. Dependiendo de dónde se localicen las DCs, se encontró que éstas tienen diferentes funciones en el microambiente de la PP que produce citoquínesis dirigida por Th1 o Th2 después de la activación. El microambiente de la citoquina y de la quimocina decidirá entonces subsecuentemente la diferenciación de las células Th hacia subpoblaciones de Th1 y Th2, respectivamente y también afectará la supervivencia o apoptosis de las células T. Además, la diferenciación de las células B y el direccionamiento de las células plasmáticas mucosales se regulan por citoquinas separadas (IL-6 además del TGF-ß, IL-4, IL-5, e IL-10) y el receptor de direccionamiento específico, a4b . Por lo tanto se puede concluir que parece haber mecanismos disponibles en la mucosa, por medio de los cuales la modulación mucosal del sistema inmune puede inducir una respuesta inmune más diferenciada, una mejor imitación de la respuesta a una infección natural que se obtiene por otras rutas de administración. Aunque mucho se ha aprendido acerca de las DC, sus precursores y diversos subtipos de DC que han sido propuestos, el grado total de complejidad funcional y plasticidad de las DC hace difícil pronosticar el efecto aproximado de una vacuna específica sobre las DCs y las respuestas Th1 , Th2 y Treg subsecuentes. Sin embargo, algunos de los resultados obtenidos para la DC madurada in vitro se pueden extrapolar a la DC madura aislada a partir de los órganos linfoides puesto que exhiben características similares (Shortman K., et al; Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat. Rev. Immunol. 2002 Marzo 2 (3): 151-61 ). Por ejemplo, el potencial del lipopéptido de micoplasma MALP-2 para modular la respuesta de DC se ha estudiado in vitro (Weigt H., et al; Synthetíc mycoplasma-derived lipopeptide MALP-2 induces maturation and function of dendritic cells. Immunobiology 2003, 207 (3): 223-33). El tratamiento de DC con MALP-2 indujo la expresión de CD80, CD86 y la liberación de TNF-a bioactivo e IL-10, así como la proliferación de linfocitos autólogos y la producción de IL-4, IL-5 y ?-INF por el último. Estas características se correlacionan con una capacidad para estimular a las células T y por lo tanto sugiere un efecto posible de MALP-2 sobre DC ¡n vivo. Los vehículos sintéticos pueden facilitar el efecto inmunoestimulante de los antígenos para la presentación del MHC clase I y II. Los vehículos sintéticos se pueden desarrollar hacia un sistema versátil que se puede adaptar hacia una variedad de aplicaciones potenciales. El carácter de estos vehículos puede influenciar significativamente el resultado y eficiencia de la respuesta inmune. Los vehículos sintéticos, tales como partículas pueden facilitar el obstáculo de garantía de calidad y validación en el desarrollo y producción de vacuna, y por lo tanto acortar el tiempo para la aprobación y para la comercialización. Varios componentes estimulantes inmunes (péptidos, proteínas, lípidos o polisacáridos) de diferentes microorganismos infecciosos se pueden utilizar para vacunación. Esos componentes se pueden sintetizar, purificar a partir de los microorganismos o producir mediante tecnología de ADN recombinante. Sin embargo, requieren adyuvantes adecuados cuando se administran oralmente o parenteralmente en forma libre, soluble. Varios sistemas basados en partícula han sido evaluados como vehículos para diversos antígenos y fármacos. El quítosán, ácido poli-DL-láctíco, o micropartículas de almidón poliacrílico previamente se han descrito como un sistema vehículo del fármaco. Los ejemplos de dichos sistemas se describen en las patentes de E.U.A. 5,603,960 y 6,521 ,431. En un reporte, se observó que las micropartículas de almidón con albúmina de suero de humano covalentemente unida (HSA), como un antígeno modelo funcionaban como un adyuvante fuerte en los ratones cuando se administraba parenteralmente y las micropartículas solas no fueron inmunogénicas. Sin embargo, se debe señalar, que la toma es más probablemente dependiente de la estructura y también de las posibles propiedades adhesivas del vehículo. La agarosa y otros polisacáridos tienen propiedades mucoadhesivas intrínsecas, las cuales pueden mejorar su interacción con diferentes membranas mucosales y facilitar la toma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con esta invención, se describen nuevas composiciones para una composición o composiciones inmunológicamente activas se pueden inducir inmunidad protectora o tolerancia. La composición para inducir inmunidad protectora tanto en un hospedero no infectado o infectado consiste de epítopes antigénicos pero excluye o elimina los epítopes que participan en el "escape" inmune o inducen tolerancia. La inmunidad protectora también se puede inducir por una composición que incluye un patrón(es) molecular asociado con el patógeno y/o un vehículo con o sin los epítopes antigénicos. Otra composición inmunológicamente activa que induce la tolerancia incluye un epítope(es) de escape o un patrón(es) molecular importante para el escape del patógeno con o sin un vehículo. Además la invención provee métodos para identificar dichas moléculas inmunológicamente activas. Un ejemplo adecuado son las moléculas de reconocimiento del patrón molecular asociado con el patógeno (PAMPs) con o sin antígenos micoplasmales modificados añadidos. Dichas composiciones moleculares parecen modular las respuestas inmunes anti-micoplasmales tanto en hospederos no infectados como en hospederos infectados. Algunos de los antígenos indujeron tolerancia o escape inmune. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención es una composición inmunológicamente activa para inducir inmunidad protectora, la composición comprendiendo: (1 ) al menos un patrón molecular asociado al patógeno; (2) opcionalmente, al menos un antígeno inmune activo o un epítope antigénico; y (3) al menos un vehículo efectivo para suministrar la composición a un organismo de manera que se induce así inmunidad protectora. En muchos casos, es deseable incluir al menos un antígeno inmune activo o un epítope antígénico. Los ejemplos adecuados se describen adicionalmente a continuación. Típicamente, al menos un epítope antigénico activo inmune carece de epítopes de escape. Esto es importante para prevenir la presión de selección que podría de otra manera llevar a la evolución de patógenos cuya replicación no se bloquea por la respuesta inmune. Un ejemplo de un patógeno para el cual la presión de selección probablemente es importante es el virus de la influenza el cual muta rápidamente, hasta el grado en que se necesita preparar una vacuna novedosa para cada temporada de influenza para proveer inmunidad a la cepa o cepas particulares de la influenza que probablemente ocasionan enfermedad en humanos. Otro ejemplo de un patógeno para el cual la presión de selección probablemente es importante es el virus de la inmunodeficiencia de humano (VIH), el cual también muta rápidamente. Otro aspecto de la presente invención es una composición inmunológicamente activa para inducir tolerancia, la composición comprendiendo: (a) al menos un patrón molecular asociado al patógeno; (b) al menos un antígeno inmune activo o epítope antigénico; y (c) al menos un vehículo efectivo para suministrar la composición a un organismo de manera que la tolerancia se induce así. Típicamente, el epítope antigénico inmune activo es un péptido, proteína, un péptido recombinante o multi-péptido, una proteína recombinante, lípido, carbohidrato, ácido nucleico u otra molécula bioactiva o una combinación de cualquiera de éstas. Típicamente, si el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína, el péptido o proteína posee modulaciones post-transcripcionales moduladoras de la inmunidad. Típicamente, las modulaciones post-transcripcionales incluyen a las porciones carbohidrato y/o lípido. Típicamente, las modulaciones post-transcripcionales contienen una manosilación terminal; en esta alternativa, típicamente, las sustancias modulador las del sistema inmune terminalmente manosiladas carecen de la composición protectora inmune. Estas pueden ser eliminadas por un paso oxidativo, mediante tratamiento enzimático, o mediante unión por afinidad específica al azúcar. Alternativamente, las modulaciones post-transcripcionales incluyen a las porciones lípido y las porciones lípido se remueven mediante delipidación. Típicamente, el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína y el péptido o proteína inmune activa no tiene modificaciones post-transcripcionales que modulan el sistema inmune. También, típicamente, el péptido inmune activo o proteína no posee secuencias de aminoácidos capaces de llevar a cabo N-glicosilación y/o lipoilación. En otra alternativa preferida, el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína y la proteína inmune activa o péptido posee una secuencia de aminoácidos capaces de unirse a los glicosaminoglicanos (GAGs) de la superficie celular. Típicamente, estas secuencias de aminoácidos son polibásicas en naturaleza y de la fórmula general de XBBXBX, XBBBXXBX, BBXXBBBXXBB, BBBXXB, BXBXB, BBB, BXBXXXBXB, o BXBXXXXXBXB, en donde B es un aminoácido básico y X es cualquier otro aminoácido. Típicamente, las secuencias de unión de aminoácidos GAG se utilizan para generar anticuerpos para el péptido o proteína que son capaces de interferir con la unión del patógeno a las superficies celulares. El GAG se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de heparina y sus análogos. El péptido antigénico inmune activo o proteína puede poseer actividad activadora del complemento, solo o en combinación con los anticuerpos. El epítope antigénico inmune activo puede ser una pluralidad de péptidos que están combinados en un multi-péptído particular. Los epítopes antigénícos inmunes activos pueden incluir tanto epítopes de la célula T como epítopes de la célula B. Típicamente, el patrón molecular asociado al patógeno se selecciona a partir del grupo que consiste de: (1 ) un agonista del receptor TLR 1 ; (2) un agonista del receptor TLR 2; (3) un agonista del receptor TLR 3; (4) un agonista del receptor TLR 4; (5) un agonista del receptor TLR 5; (6) un agonista del receptor TLR 6; (7) un agonista del receptor TLR 7; (8) un agonista del receptor TLR 8; (9) un agonista del receptor TLR 9; (10) un agonista NOD-1 ; (11 ) un agonista NOD-2; (12) DC-SEÑAL; (13) L-SEÑAL; y (14) un receptor de mannosa. Cuando el patrón molecular asociado al patógeno es un agonista de NOD-1 o un agonista de NOD-2, el agonista de NOD-1 o el agonista de NOD-2 cepa de seleccionar a partir del grupo que consiste de peptidoglicano bacteriano y un derivado del peptidoglicano bacteriano. Otro aspecto de la presente invención es un método para identificar péptidos inmunes activos capaces de interferir con la unión al glicosaminoglicano de los patógenos que comprende los pasos de: (1 ) llevar a cabo la adsorción de heparina; (2) llevar a cabo la selección por ¡nmunoafinidad; y (3) opcionalmente, llevar a cabo la digestión proteolítica de una proteína o proteínas aisladas mediante selección por ¡nmunoafinidad para generar péptidos inmunes activos. La selección por inmunoafinidad se puede llevar a cabo mediante métodos bien conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en G.T. Hermanson et al., "Immobilized Affinity Ligand Techniques" (Academic Press, Inc., San Diego, 1992); otros métodos también se conocen en la técnica. Incluso otro aspecto de la presente invención es un método para identificar péptidos inmunes activos capaces de interferir con la unión del glicosaminoglicano de los patógenos que comprende el análisis de una secuencia de datos utilizando un método de análisis de bioinformática utilizando motivos lineales polibásicos. Incluso otro aspecto de la presente invención es un método para identificar péptidos activos inmunes que activan el complemento que comprende los pasos de: (1 ) llevar a cabo la unión de los anticuerpos que se fijan al complemento a una proteína del complemento; (2) utilizar los anticuerpos para selección por inmunoafinidad de los antígenos de proteína; y (3) opcionalmente, llevar a cabo la digestión proteolítica de los antígenos aislados de proteína. Los péptidos inmunes activos producidos por estos métodos también son aspectos de la invención. Adicionalmente, un anticuerpo protector se puede basar en el péptido inmune activo identificado para desplegarse en organismos hospederos.
En las composiciones anteriormente descritas, las moléculas pueden estar presentes como una mezcla. Alternativamente, las moléculas pueden estar químicamente asociadas. El vehículo típicamente es una micropartícula. Preferiblemente, las micropartículas tienen un estrecho intervalo de distribución de tamaño y son porosas. Típicamente, las micropartículas tienen menos de aproximadamente 10 µm de diámetro; más típicamente, las micropartículas son de menos de aproximadamente 5 µm de diámetro. Típicamente, las micropartículas se elaboran de un biopolímero. En una alternativa, los epítopes antigénicos inmunes activos no están covalentemente unidos a las micropartículas. En otra alternativa, los epítopes antigénicos inmunes activos están covalentemente unidos a las micropartículas. Más de un epítope antigénico inmune activo y más de un agonista del receptor para reconocimiento del patrón se puede asociar con las mícropartículas. Más de un agonista del receptor para reconocimiento del patrón se puede asociar con las micropartículas. Otro aspecto de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende el paso de administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende al menos un epítope antigénico inmune activo y al menos un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociado con las micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que un patógeno. La composición puede comprender más de un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno. Incluso otra aspecto de la invención es un método para suministrar in vivo una composición inmunológicamente activa con el objeto de inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende el paso de administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende al menos un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociado con micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que un patógeno. Incluso otro aspecto de la invención es un método para administración in vivo de una composición inmunológicamente activa con el objeto de inducir una respuesta inmune en un sujeto que comprende el paso de administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende al menos un epítope antigénico inmune activo y al menos un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociado con micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que un patógeno. Otro aspecto de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmune protectora a al menos un patógeno que comprende el paso de administrar, en una dosis particular o en múltiples dosis, una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición que comprende uno o más epítopes antigénicos inmunes activos y una combinación de agonista del receptor PR asociados con micropartículas, en donde dichas micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que el patógeno y la respuesta inmune comprende las respuestas Th1 o Th2 o una combinación de ambas. Incluso otro aspecto de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmune protectora a al menos un patógeno que comprende el paso de administrar, en una dosis particular o en múltiples dosis, una cantidad inmunológícamente efectiva de una composición que comprende uno o más epítopes antígénicos inmunes activos excluyendo antígenos que participan en mecanismos de escape inmunológico, y una combinación de agonista del receptor PR asociados con micropartículas, en donde dichas micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que el patógeno. En los métodos de administración o de suministro de conformidad con la presente invención, la administración de la composición se puede llevar a cabo vía una ruta mucosal, una ruta parenteral, o una ruta dermal. Otras rutas de administración se pueden utilizar de manera alternativa. En los métodos para inducir inmunidad de conformidad con la presente invención, típicamente, la respuesta inmune interfiere con los elementos de unión al glicosaminoglicano en un microorganismo patogénico. Alternativamente, las composiciones de conformidad con la presente invención se pueden utilizar en métodos para inducir tolerancia inmunológica. Un método para inducir tolerancia a un agente inmunológicamente activo comprende el paso de administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición de comprende uno o más epítopes antigénicos inmunes activos y una combinación del agonista PRR asociados con micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que un patógeno y la respuesta inmune comprende la inducción de una respuesta reguladora o subregulación de las funciones inmunes o escape inmune. La composición puede incluir en ésta un epítope antigénico inmune activo que tiene una porción que contiene lípido. Una porción que contiene un lípido inmunológicamente activo se puede unir a las micropartículas independientemente del epítope antigénico inmune activo. La porción que contiene un lípído inmunológicamente activo se puede unir a las micropartículas independientemente del epítope antigénico inmune activo. La porción que contiene lípido inmunológicamente activo puede tener constituyentes de carbohidrato; los constituyentes de carbohidrato pueden ser el resultado de la N-glicosilación. El epítope antigénico inmune activo puede comprender motivos incluyendo al menos un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de asparagina, treonina y serina en donde los motivos son motivos Asp-X-Ser o Asp-X-Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La siguiente invención se entenderá mejor con referencia a la especificación, reivindicaciones anexas, y dibujos anexos, en donde: La figura 1 es una gráfica que muestra la distribución de partículas de las micropartículas de agarosa adecuadas para uso en las composiciones vehículo de micropartícula de conformidad con la presente invención (ejemplo 1 ); las figuras 2A y 2B son gráficas que muestran la secreción de TNF-a por PBMC (figura 2A) o secreción del factor tisular (figura 2B) después del tratamiento con peptidoglicano (PepG) (barra blanca), o ADN CpG bacteriano (ADN bacteriano) (barra negra), o ambos simultáneamente a la misma concentración como cuando se añaden solos (barra sombreada); los números después de P y D, respectivamente, indican las concentraciones de PepG y ADN bacteriano en µg/ml respectivamente; de izquierda a derecha, estos son P3+D15, P3+D5, P3+D1.5, P1 +D15, P1 +D5, P1 +D1.5, P0.3+D15, P0.3+D5, y P0.3+D1.5; la figura 3 es una gráfica que muestra la inducción de diferentes respuestas Th1 y Th2 por partículas preparadas de diferentes maneras con antígenos tratados con eliminación por Con A o antígenos tratados con peryodato de sodio así como diversas concentraciones de agonistas TLR2, TLR3, TLR4, y TLR9 (barra gris, TNF-a x100, barra negra, IL-10); la figura 4 es una gráfica que muestra la relación TNF-a/IL-10 para monocitos tratados con partículas preparadas de diferentes maneras como para la figura 3; y la figura 5 es una gráfica que muestra la inducción de MHC-II y CD86 en células dendríticas después de la exposición a las preparaciones de micropartícula.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA Esta invención describe composiciones inmunológicamente activas, métodos para dirigir las moléculas a cierta población celular y la inducción de respuestas en un modelo animal en métodos para producir las presentes composiciones. Existe una necesidad para producir agentes moduladores inmunes más efectivos y vehículos para administración para numerosas enfermedades o condiciones así como para la protección de patógenos en contra de los cuales no hay vacunas actualmente disponibles o son inefectivas. Las vacunas tradicionales utilizando patógenos atenuados, muertos o genéticamente modificados se limitan a la respuesta inmune que determina el patrón molecular del patógeno y su interacción con los receptores para reconocimiento del patógeno (PRR) del sistema inmune. Los patógenos exitosos que pueden establecer infecciones crónicas tienen patrones moleculares que les permiten evadir la respuesta inmune del cuerpo mientras que otros patógenos, tales como el virus de la influenza, utilizan mutaciones (cambio antigéníco y desviación) que resultan en el escape, tales como la producción de anticuerpos que resultan en una toma viral incrementada para el mantenimiento de los mismos. En general, los anticuerpos específicos del patógeno desempeñan un papel importante en el control de las infecciones en numerosos métodos. Sin embargo, en algunos casos, la presencia de anticuerpos específicos puede ser benéfica al patógeno. Esta actividad se conoce como mejoría de la infección dependiente del anticuerpo (ADE). La ADE de la infección es un fenómeno en el cual los anticuerpos específicos del patógeno mejoran la entrada del patógeno, y en algunos casos la replicación del patógeno, tales como virus, dentro de los monocitos/macrófagos y células granulocíticas a través de la interacción con los receptores Fc. Este fenómeno ha sido reportado in vitro e in vivo para patógenos que representan numerosas familias y géneros de importancia de salud pública y veterinaria. Estos patógenos, tales como M. galliseptícum comparten ciertas características comunes tales como replicación preferencial en macrófagos, capacidad para establecer persistencia, y diversidad antigénica. Para algunos patógenos, la ADE de la infección se ha vuelto una gran preocupación para el control de la enfermedad por la vacunación. Consecuentemente, se han realizado numerosos métodos para el desarrollo de vacunas con un mínimo riesgo o sin riesgo de ADE. La identificación de epítopes del patógeno asociada con ADE o la neutralización es importante para este propósito. Además, el entendimiento evidente de los eventos celulares después de la entrada del patógeno a través de ADE se ha vuelto crucial para el desarrollo de una intervención eficiente. Sin embargo, los mecanismos de ADE aún quedan por ser aclarados. Por lo tanto, las vacunas efectivas en contra de estos patógenos son difíciles de desarrollar. Por lo tanto, hemos identificado motivos que fueron importantes para la inmunidad protectora mediante la interferencia con un mecanismo importante de unión celular y motivos que necesitan ser excluidos a partir de una formulación con el objeto de inducir inmunidad protectora sin escape. Los inventores también han identificado motivos que indujeron escape o tolerancia. Los inventores han investigado la posibilidad de dirigir moléculas inmunológicamente activas a ciertas células mediante un vehículo comprendido de un polisacárido, tal como agarosa nativa logrando así la modulación inmune tanto de las respuestas inmunes innatas como adaptativas y la protección de la infección. Esta invención obviamente se puede utilizar en otras aplicaciones en las cuales también se pueden dirigir otros receptores utilizando otras partículas. La agarosa tiene la ventaja de que es un polisacárido natural, un polímero de D-galactosa que es biodegradable y ha probado ser compatible con las células de mamífero. Se ha encontrado que las micropartículas de agarosa parenteralmente administradas exhiben una débil capacidad de activación del macrófago y una propiedad adyuvante comparable con el hidróxido de aluminio (Gronlund H. et al., Carbohydrate- based particles: a new adjuvant for allergen-specífic ¡mmunotherapy. Immunology 2002 107, 523- 529). Desde un punto de vista del usuario terminal, es importante que el producto de vacuna no requiera almacenamiento refrigerado y aún así tenga una larga vida de anaquel. Las partículas de agarosa pueden alcanzar estos requerimientos. También, es importante que la administración de la vacuna o del vehículo para administración del fármaco sea tan simple como sea posible. Esto es porqué una composición especialmente oralmente administrable, libre de aguja, mucosal tiene ventaja en comparación con las composiciones parenterales. Sin embargo, las aplicaciones orales, han estado plagadas con problemas de estabilidad debido los efectos del sistema digestivo. Los inventores han razonado que los antígenos acoplados a una matriz de agarosa porosa se pueden proteger de la degradación dentro del tracto Gl. El enlace entre los ligandos y las partículas asegura que las mismas células que procesan el antígeno toman el adyuvante y el antígeno. También, el tamaño de las micropartículas de agarosa (<5 µm) puede hacer las adecuadas para permitir que las partículas pasen dentro de las placas de Peyer (PPs). La efectividad del ADN CpG no metilado, Poli l:C o MALP-2 como adyuvantes sugiere que los motivos del patrón molecular asociado con el patógeno (PAMPs), si se co-inmoviliza con los antígenos, podría dirigir la toma de las composiciones inmunológicamente activas en superficies mucosales por diferentes APCs que expresan los receptores PAMP apropiados. Diversas subpoblaciones de DC y otras células inmunes competentes tienen diferentes receptores para reconocimiento del patrón. Utilizando una combinación de ligandos, se podría lograr el direccionamiento de la subpoblación de células apropiada. Por lo tanto, los inventores razonaron que las moléculas agonistas del receptor (receptor PAMP), tales como el receptor semejante a Toll (TLR), receptor de lectina o agonistas del receptor NOD deben ser co-inmovilizadas junto con las moléculas bioactivas al vehículo. Los inventores razonaron que las propiedades de unión, el llamamiento y la toma de composiciones ¡nmunológicamente activas se deben mejorar conforme el sistema inmune se expone a un "microorganismo sintético" diseñado, y esto puede mejorar significativamente la toma dirigida y eficiencia de dichos moduladores inmunes y se podría alcanzar una respuesta inmune adaptada. El direccionamiento adaptado también podría mejorar las farmacocinéticas y reducir los efectos laterales potenciales de dichos moduladores inmunes diseñados. Los receptores semejantes a Toll (TLRs) y NOD, receptores de lectina, etc. son receptores para reconocimiento del patrón del patógeno para moléculas derivadas de microorganismos. Estos son sensores primarios de los sistemas inmunes innatos y adaptativos. Existen 10 TLRs (TLR 1-10) actualmente identificados. Cada uno reconoce uno o más ligandos específicos y lleva a cabo la transducción de la señal. Los receptores recientemente descubiertos y las interacciones del receptor se encuentran regularmente implicados en la activación celular por productos bacterianos. Se ha incrementado la evidencia con respecto a la cooperación entre estos receptores que actúan al mejorar la discriminación del ligando y la especificidad de la respuesta. El agrupamiento de los receptores en balsas lipídicas también se ha encontrado después de la unión al ligando. Dichos estudios también revelaron rutas dependientes e independientes del gen 88 de respuesta primaria en la diferenciación mieloide (MyD88). Cada TLR es un receptor trasmembranal tipo I que tiene un dominio extracelular rico en leucina y una porción intracelular que contiene una región conservada denominada el dominio de homología Toll/IL-1 R (TIR), que después de la activación resulta en el reclutamiento de la proteína MyD88 en las formas de señalización dependientes de MyD88. Algunos patógenos microbianos también pueden ser endocitados y ejercen su actividad directamente en el citoplasma, utilizando el dominio rico en leucina de los TLRs, NOD-1 y NOD-2 como es el caso, por ejemplo, de la percepción del peptidoglicano bacteriano Gram positivo. Sin embargo, parece que estas diversas rutas convergen hacia la translocación nuclear de NF-?ß y la activación de los genes inflamatorios y la producción de diferentes citoquinas. La ligación de los TRLs 7, 8 y 9 resulta en IFN-a e IL-12p70, induciendo una fuerte respuesta Th1 con una presentación cruzada/CTL. La activación de TLR 3 resulta en una respuesta de INF-a y Th1 , mientras que TLR5 induce a Th1 a través de IL-12p70 y TLR4 induce Th1 a través de la producción de IL-12p70 e INF-a, todo llevando a la presentación cruzada/CTL. Sin embargo, la ligación de los TLRs 1 , 2 y 6 induce una respuesta IL-12p70 débil con altos niveles de IL-10 y junto con algunos otros PRR (receptores de reconocimiento del patógeno), tal como DC-SEÑAL resultan en las respuestas de Th0/Th2/Treg. TLR-4 ha sido el más ampliamente estudiado de esta familia de receptores. Se sabe que reconoce el lipopolisacárido a partir de bacterias Gram negativas y el ácido lipoteicóico a partir de bacterias Gram positivas, mientras que TLR-2 se une a las lipoproteínas/lipopéptidos bacterianos, componentes micobacterianos o micoplasmales. La mutación Lps2 identifica el papel de la proteína adaptadora de resistencia TIR (TIRAP) en la ruta independiente de MyD88 TLR-3 y TLR-4. Se ha descubierto que TIRAP como otro elemento ¡ntracelular cascada abajo de TLR-2 y TLR-4. También se mostró que una ruta independiente de MyD88 participaba en la regulación de la maduración de DC mediada por LPS. Se sabe que TLR-1 y TLR-6 funcionan como la otra parte de un heterodímero con el receptor TLR-2. TLR-3 reconoce el ARN viral de doble cadena. Se identificó TLR- 5 como el receptor para flagelina para las bacterias Gram negativas y Gram positivas, y se señalizó a través de MyD88. TLR-7 responde al ARN de cadena sencilla y a los modificadores inmunes sintéticos pequeños tales como imiquimod, R-848, bropirimina y loxoríbina. Se sabe que TLR-9 detecta el ADN bacteriano no metilado. Los oligonucleótidos de ADN CpG actualmente son investigados por su capacidad para servir como adyuvantes y estimulan las células dendríticas de humano para el desarrollo de vacunas. TLR-4, TLR-7 y TLR-9 son particularmente importantes con respecto al desarrollo de vacunas. TLR-8 de humano fue recientemente identificado como un receptor para el ARN de cadena sencilla y para resiquimod (R-848). TLR-7, TLR-8 y TLR-9 recientemente han sido propuestos para ser considerados como un subgrupo en la familia del receptor TLR siempre y cuando sus ligandos sean reconocidos en los compartimentos endosomales/lisosomales. Los receptores de lectina tipo C (dependientes de calcio) (CLRs) también se expresan y éstos se unen a los oligosacáridos conservados que comúnmente se encuentran sobre la superficie de las glicoproteínas de los virus, bacterias y otros patógenos. Los CLRs expresados por las DCs incluyen el receptor de mannosa (CD206), DEC-205 (CD205), Langerin (CD207) y la moléculas de adhesión intercelular específica de DC que no toma ¡ntegrina 3 (DC-SEÑAL; CD209). Estos receptores difieren no solamente en su expresión en diversas subpoblaciones de DCs y otros tejidos sino que también reconocen diferentes oligosacáridos discriminando así entre los ligandos diferentes. DC-SEÑAL es la proteína trasmembranales tipo II de 44 kDa que se une e internaliza diversos virus tales como el VIH, el virus de ébola, CMV, el virus del dengue, el virus de la hepatitis C y bacterias, tales como Mycobacteria aunque también se incluyen otros receptores. Otros patógenos también pueden interactuar con DC-SEÑAL. Es muy importante la función de DC, tanto en la mediación de las interacciones de la célula T sin afección a través de ICAM-3 como en un receptor oscilante que median los procesos de migración dependientes de ICAM-2 específicos de DC. Se ha descrito la colaboración entre TLR y otros receptores para reconocimiento inmune. Un ejemplo de esto es la determinación de colaboración de las respuestas inflamatorias por dectin-2 y TLR-2. Las partículas complejas tales como las paredes celulares de levadura se reconocen por múltiples receptores inmunes innatos incluyendo TLR2-TLR6, dectin-1 y CD14. Los heterodímeros TLR2-TLR6 activan a NF-?B y la producción de las quimocinas y citoquinas tal como TNF-a. Dectin-1 reconoce a los a-glucanos en la pared celular y activa la fagocitosis a la vez que activa la producción de oxígeno reactivo mediante la NADPH-oxídasa. Además, la señalización de dectin-1 combina con la señalización TLR2-TLR6 para mejorar la producción de citoquinas específicas, tal como IL-12. Debido a la cooperación entre los receptores TLR y con otros receptores y las interacciones entre los mecanismos moleculares intracelulares cascada abajo, no fue sorprendente observar efectos sinergísticos entre los compuestos patogénicos microbianos tales como el ácido lipoteicóico, el ADN CpG y el peptidoglicano, sugiriendo que el efecto de los activadores TLR como adyuvantes se puede amplificar cuando se utilizan en combinaciones en el desarrollo de los moduladores inmunes.
La co-inmovilización de los ligandos PRR (receptores para reconocimiento del patógeno) apropiados con moléculas bioactivas puede permitir la modulación dirigida de la respuesta inmune que lleva a una respuesta celular fuerte (bajo una influencia relativamente más fuerte de Th1 ) y/o una respuesta humoral (bajo influencia de Th2). Alternativamente, cuando se inmuniza con una composición diferente, se puede obtener una tolerancia inmune. Puede ser posible que una fuerte respuesta celular se induzca incluso en la presencia de una inmunidad humoral establecida o tolerancia. De esta manera los inventores pueden anticipar el desarrollo de un modulador inmune que es eficiente tanto en hospederos no infectados como infectados. Dicho resultado podría mejorar en gran medida la utilidad de la vacunación. Los inventores han establecido en un sistema de modelo en pollo que un grado significativo de protección se puede lograr en contra de la cepa infecciosa de Mycoplasma gallisepticum cuando los animales se vacunan antes de la prueba micoplasmal. Además, también se observó la reversión de los síntomas patológicos característicos en animales pre-infectados indicando que dicha vacuna es efectiva para tratar a una bandada infectada. Esto es significativo debido a la extendida resistencia a antibióticos de diversas cepas de microorganismos y la creciente preocupación pública y reguladora acerca del permiso de uso de los antibióticos profilácticos en animales de granja. Además, los inventores encontraron que solamente una muy pequeña cantidad de antígeno (10 µg) por animal era necesaria para inducir una respuesta protectora mediante este método en oposición a más de 100 µg descritos en la literatura utilizando micropartículas que han incorporado el antígeno. (Brayden, D. 2001 European Journal of Pharmaceutical Sciences 14: 183-789). Esto sugiere que la molécula(s) moduladora inmune no se degrada mientras atraviesa el intestino en los animales y que se administra a la célula inmune mucosal dirigida de manera eficaz. Esto es una mejoría significativa en comparación con las composiciones existentes inmunológicamente activas. Sin embargo, con dosis en escala del antígeno, se observó una reducción en el efecto protector sugiriendo la presencia de un componente supresor inmune entre los antígenos purificados por inmunoafinidad. DC-SEÑAL ha sido implicado en el mecanismo de escape de los patógenos. DC-SEÑAL es una lectina tipo C específica para moléculas lipídicas que tienen un alto contenido de mannosa. Las membranas micoplasmales están compuestas de altas proporciones de lípidos y se ha mostrado que diferentes micoplasmas se unen a la resina con afinidad a Concanavalina A, indicando la presencia de mannosa en la superficie del micoplasma. Los inventores sugieren que las moléculas que participan en el escape inmunológico incluyendo moléculas N-glicosíladas post-transcripcionalmente pueden mediar este efecto incluyendo la modificación post-transcripcional con lipoma nnano en una proteína(s) purificada que contiene porciones terminales de mannosa. Subsecuentemente se intentó la remoción de las mannosas terminales por digestión enzimática o degradación química. Además, las lipoproteínas terminalmente manosiladas se adsorbieron sobre una columna de lectina inmovilizada específica a mannosa-Concanavalina A (ConA). La columna ConA retuvo aproximadamente un tercio de los constituyentes del antígeno purificado y la vacuna preparada mediante este antígeno exhibió el mayor efecto protector y una dosis-respuesta lineal con una concentración creciente de antígeno. Por otra parte, el antígeno recuperado a partir de la columna ConA ocasionó una supresión de la reacción de inflamación en los animales mientras que se encontró en sus órganos internos una presencia del patógeno a un nivel muy elevado. Parece que estos componentes manosilados de M. gallísepticum participan en el mecanismo de escape de este patógeno, resultando en una supresión inmune y el desarrollo de tolerancia al patógeno. Nosotros también hemos demostrado que las características adecuadas del antígeno pueden ayudar a cambiar la respuesta inmune ya sea hacia protección o tolerancia. Esto confirmó la hipótesis de los inventores y también apoyó la observación realizada con las membranas micoplasmales inmovilizadas con respecto a que las modificaciones post-transcripcíonales de lipomannano pueden inducir tolerancia al patógeno en el hospederos. Este entendimiento se puede utilizar actualmente para preparar micropartículas moduladoras inmunes dotadas con la propiedad de inducción potencial de la tolerancia o supresión de las respuestas inmunes existentes. La modificación lipídica post-transcripcional de los antígenos también desempeñó un papel en el desarrollo de tolerancia a los patógenos. Por lo tanto, los inventores también intentaron la desacilación de antígenos purificados que probaron ser eficientes, confirmando el papel de los lípidos en el patomecanismo de micoplasmas. La conclusión principal a partir de estos experimentos es que una vacuna con el epítope derivada a partir del análisis de las proteínas nativas no debe contener epítopes ricos en aminoácidos que pueden llevar a cabo glicosilación y/o lipoilación (Asn, Thr, Ser) si uno desea lograr la inmunidad protectora aunque los ligandos que incorporan estos motivos de aminoácidos podrían ser utilizados para inducir tolerancia. Esto provee múltiples usos para las composiciones y métodos de conformidad con la presente invención. En estudios subsecuentes, los inventores han utilizado la sangre y suero a partir de animales protegidos con la vacuna con el objeto de identificar epítopes antigénicos que eran responsables de la protección. De esta manera, los inventores se han enfocado en el desarrollo de bases científicas para una vacuna basada en el epítope como una producción a gran escala de micoplasma puesto que la purificación de las proteínas antigénicas podría tener un costo prohibitivo para muchas aplicaciones. En un estudio previo, los inventores han mostrado que diversos micoplasmas son capaces de unirse a la heparina y análogos de la heparina (Szathmary, S., et al.: Binding of mycoplasmas to solid phase adsorbents. Acta Vet Hung 2005, 53 (3): 299-307). Los glicosaminoglicanos (GAGs) se expresan en la superficie de las células de mamífero y las proteínas para unión a glicosaminoglicano en la superficie de los patógenos median la adhesión a las células objetivo (Wadstrom T, Ljungh A: Glycosaminoglycan-binding microbial proteins ¡n tissue adhesión and invasión: key events in microbial pathogenicity. J Med Microbiol 1999, 48 (3): 223-233). Se han reportado las secuencias consenso de varios tipos, caracterizadas por aminoácidos predominantemente básicos en una región: XBBXBX, XBBBXXBX, BBXXBBBXXBB, BBBXXB, BXBXB, BBB, BXBXXXBXB, o BXBXXXXXBXB en donde B es un aminoácido básico y X es cualquier otro aminoácido. Otra manera de observar esto es que los motivos básicos lineales participan en el mecanismo de patogenicidad. Estas secuencias son esenciales para la unión lo cual probablemente sirve como un paso inicial en el mecanismo de entrada mucosal por los patógenos. Por lo tanto, la neutralización de esta capacidad podría prevenir la infección y posiblemente permitir el desarrollo de terapias de amplio espectro en contra de una variedad de microorganismos patogénicos. Esta posibilidad no ha sido reconocida anteriormente como una base para el desarrollo de vacunas. Los inventores resonaron que los epítopes antigénicos adyacentes o estéricamente cercanos a los dominios de unión a GAG podrían ser neutralizados y se eleva la posibilidad de que dichos sitios de unión posiblemente puedan ser incorporados dentro de epítopes neutralizantes. Por lo tanto, los inventores procedieron con el aislamiento de las proteínas para unión a heparina a partir de M. galliseptícum utilizando cromatografía por afinidad sobre una resina Heparina Actigel (Sterogene Bioseparations, Inc., Carlsbad, CA). Subsecuentemente, los inventores han purificados IgG a partir de sueros neutralizantes obtenidos a partir de pollos vacunados en contra de M. gallisepticum. La IgG purificada se inmovilizó en la resina Actigel ALD activada (Sterogene Bioseparatíons, Inc., Carlsbad, CA) y las proteínas de unión a heparina aisladas se adsorbieron a la columna. Las proteínas de unión se digirieron mediante la adición de tripsina a la columna y los fragmentos peptídicos que contenían epítopes inmunogénicos incluyendo secuencias de unión a heparina fueron eludidos y analizados mediante MALDI-MS con el objeto de obtener información de secuencia. En las IgGs purificadas utilizando dichos epítopes antigénicos o anticuerpos monoclonales en contra de dichos epítopes cuando se administran in vivo también pueden conferir inmunidad protectora a los hospederos infectados. Alternativamente, otras enzimas proteolíticas conocidas en la técnica, tales como quimotripsina, elastasa, bromelaína, proteasa V-8, pepsina, y termolisina se pueden utilizar en lugar de la tripsina. En experimentos paralelos, los inventores han re-adsorbido proteínas de unión a heparina aisladas en Heparina Actigel y llevaron a cabo una digestión tríptica similar de las proteínas unidas. Los fragmentos recuperados a partir de la resina también fueron analizados mediante MALDI-MS para información de secuencia. También es importante identificar epítopes que participan en la opso-fagocitosis, la cual utiliza el sistema del complemento. Específicamente, los anticuerpos que se fijan al complemento se purifican a partir de los sueros de pollos vacunados en una columna C1q inmovilizada y dichos anticuerpos se utilizan para la identificación de epítopes capaces de inducir dicha respuesta. La IgG purificada se inmoviliza subsecuentemente y se utiliza para capturar antígenos proteicos a partir del lisado MG sin purificar. Las proteínas unidas se digieren con una proteasa mientras se encuentran en la columna y las secuencias de los epítopes se eluyen y analizan mediante MALDI-MS con el objeto de obtener información de secuencia. Las IgGs purificadas utilizando dichos epítopes antigénicos o anticuerpos monoclonales en contra de dichos epítopes cuando se administran in vivo también pueden conferir inmunidad protectora a los hospederos infectados. Un problema principal con algunas de las vacunas actuales basadas en microorganismo es la co-adminístración de estimulación inmune y de epítopes supresores inmunes junto con la mezcla de agonistas PRR presentes en el patógeno mismo, algunos de los cuales inducen respuestas Th1 , algunas respuestas Th2 o Treg. Estas vacunas no superan la persistencia de diversos agentes infecciosos en el hospedero y pueden volverlo una "fábrica de patógeno" en la ausencia de una enfermedad clínica. Este método incluso puede aplicar una presión de selección sobre los patógenos y puede llevar el desarrollo de cepas más virulentas. En contraste, la estrategia de los inventores fue la creación de una micropartícula artificial "que imita al patógeno" que contiene sólo los epítopes estimulantes inmunes, a la vez que excluye los epítopes y/o agonistas PRR que participan en el escape de patógeno a partir del sistema inmune, junto con moléculas agonistas PRR adecuadas que detectan la respuesta inmune. Los epítopes identificados también se pueden combinar dentro de secuencias particulares de procesamiento que presentan múltiples péptidos o enlazadores entre los péptídos particulares del epítope antigénico. Mediante este método, la respuesta inmune distorsionada ocasionada por patógenos persistentes es superada y se desarrolla una mezcla balanceada de respuesta inmune celular y humoral que lleva a la erradicación de los agentes infecciosos. Los epítopes de escape o agonistas PRR podrían ser utilizados para el desarrollo de tolerancia cuando sea necesario para anular una reacción autoinmune no deseada. Típicamente, la molécula biológicamente activa es una molécula que es activa con el sistema inmune, tal como un inmunógeno u otra molécula que modula la función inmune, tal como un estimulante inmune, un inhibidor inmune, o un agente que induce tolerancia inmunológica. La molécula bioactiva puede estar no covalentemente o covalentemente unida a las micropartículas. Los métodos para la unión covalente se conocen en la técnica y se describen por ejemplo, en P. Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" (Elsevier, Amsterdam, 1985, pp. 283-289, en S.S. Wong, "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking" (CRC Press, Boca Raton, Florida, 1993), en T.E. Creighton, ed., "Protein Function: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, 1989), y en G.T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques" (Academic Press, San Diego, 1996), todos los cuales se incorporan en la presente invención como referencias. Típicamente, cuando las micropartículas son agarosa, la molécula bioactiva se une a un grupo hidroxilo de la agarosa. En general, los residuos hidroxilo de los polisacáridos se pueden activar mediante ciertos compuestos que forman derivados reactivos intermediarios que contienen buenos grupos residuales para la sustitución nucleofílíca subsecuente. La reacción de estos hídroxilos activados con nucleófilos tales como aminas (por ejemplo, grupos de lisina en proteínas o péptidos) resulta en enlaces coherentes estables que entrecruzan la molécula bioactiva con la agarosa. Los reactivos adecuados incluyen carboniildimidazol, derivados de cloroformato, cloruro de tresilo, cloruro de tosilo, bromuro de cianógeno, divinilsulfona, cloruro cianúrico, y bis-epóxídos. Alternativamente, los grupos hidroxilo de los carbohidratos tales como la agarosa se pueden modificar con ácido cloroacético para crear un grupo funcional de carboxilato. Como otra alternativa, se pueden crear los grupos funcionales de amina sobre los polisacáridos; los extremos reductores de las moléculas de carbohidratos o aldehidos generados se pueden hacer reaccionar con compuestos de diamína de baja longitud de cadena (por ejemplo, típicamente menor de aproximadamente 6 átomos de carbono en la cadena) para producir espaciadores cortos de alquilamina que se pueden utilizar para reacciones de conjugación subsecuentes. Los grupos de hidrazida se pueden crear similarmente utilizando compuestos de bis-hidrazida. El grupo funcional resultante se puede acoplar entonces a la molécula bioactiva utilizando diversas reacciones. Por ejemplo, si se generan grupos carboxilo, éstos se pueden conjugar entonces a las proteínas o péptidos vía el método de anhídrido mezclado, el método de carbodiimida, utilizando diciclohexilcarbodíimída, y el método de éster de N- hidroxisuccinimida. Las aminas alifáticas se pueden conjugar a las proteínas o a los péptidos mediante diversos métodos, incluyendo compuestos de carbodiim-da, tolilen-2,4-diísocianato, o compuestos de maleímida, particularmente los esteres de N-hidroxísuccinimida de los derivados de maleimida. Un ejemplo de dicho compuesto es el ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexan-1 -carboxílico. Otro ejemplo es el éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida. Incluso otro reactivo que se puede utilizar es el N-succinimidil-3-(2-pírid¡ld¡t¡o)propionato. También, los esteres bifuncíonales, tales como dimetilpimelimidato, dimetiladípimídato, o dimetilsuberimidato, se pueden utilizar para acoplar porciones que contienen un grupo amino a las proteínas. Se conocen en la técnica otros métodos para el enlace covalente de los compuestos, incluyendo péptidos, proteínas, y carbohidratos, así como otros compuestos, a los soportes sólidos. Los métodos para la unión no covalente dependen de múltiples interacciones no covalentes tales como uniones de hidrógeno, uniones hidrófobos, y enlaces de sal que pueden estabilizar la interacción. Típicamente, la molécula biológicamente activa es una o más de un péptido, proteína, péptído recombinante, proteína recombinante, lípido, carbohidratos, ácido nucleico, glicoproteína, o glicolípido. También se pueden utilizar las combinaciones de éstas de manera que se enlazan múltiples moléculas biológicamente activas a las mismas micropartículas. Sí la molécula inmune activa es un péptido o proteína, ésta puede llevar a cabo modificaciones post-transcripcíonales moduladoras del sistema inmune. Típicamente, estas incluyen a las porciones de azúcar y/o a las porciones lipídicas. Un ejemplo es la manosilación terminal. Sin embargo, otros residuos de azúcar se pueden añadir a las proteínas o a los péptidos. Alternativamente, la molécula inmune activa se puede aislar de tal manera que la preparación de la molécula inmune activa se elimina sustancialmente en moléculas terminalmente manosiladas. Esta eliminación se puede llevar a cabo mediante un paso oxidativo tal como oxidación con peryodato, mediante tratamiento enzimátíco, típicamente con enzimas hidrolítícas, o mediante unión por afinidad específica al azúcar y la purificación subsecuente de la fracción agotada. También se conocen en la técnica otros métodos para agotar los residuos manosilo terminales. De manera similar, la molécula inmune activa se puede aislar de tal manera que la preparación de la molécula inmune activa carece sustancialmente de lípidos que contienen porciones post-transcripcionales moduladoras del sistema inmune. Esto se puede realizar mediante hidrólisis química o mediante coprecipitación con ácido pentadecanóico. Alternativamente, los lípidos que contienen las porciones post transcripcionales moduladoras del sistema inmune se pueden bloquear con un detergente cargado. Un detergente particularmente adecuado es cloruro de cetil trimetil amonio. Alternativamente se pueden utilizar detergentes similares de amonio cuaternario. La molécula objetivo opcionalmente presente típicamente es una molécula para reconocimiento del patrón de patógeno. En una alternativa, la molécula para reconocimiento del patrón del patógeno es un agonista del receptor TLR, tal como un agonista del receptor TLR1 , agonista del receptor TLR2, agonista del receptor TLR3, agonista del receptor TLR4, agonista del receptor TLR5, agonista del receptor TLR6, agonista del receptor TLR7, agonista del receptor TLR8, o agonista del receptor TLR9. En otra alternativa, la molécula para reconocimiento del patrón del patógeno es un agonista de la proteína NOD tal como un agonista NOD-1 o agonista NOD-2. Típicamente, el agonista de la proteína NOD es peptidoglicano bacteriano o un delicado del peptidoglicano bacteriano. Se pueden incorporar en la composición más de una molécula biológicamente activa, tal como una molécula inmune activa, y más de una molécula para reconocimiento del patrón de patógeno, cuando están presentes, y se pueden asociar de manera estable con las micropartículas. Otro aspecto de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto mediante la administración de una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición como se describió anteriormente al sujeto. Típicamente, la composición también incluye la molécula objetivo, tal como la molécula para reconocimiento del patrón del patógeno. Se pueden incorporar en la composición más de una molécula inmune activa y más de una molécula para reconocimiento del patrón del patógeno. Incluso otro aspecto de la presente invención es un método de administración in vivo de una composición inmunológicamente activa que comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición como se describió anteriormente a un organismo que tiene un sistema inmune activo. De nuevo, más de una molécula inmune activa y más de una molécula para reconocimiento del patrón del patógeno se pueden incorporar en la composición. La administración in vivo de la composición inmunológicamente activa puede ser vía superficies mucosales, la ruta parenteral, la ruta dermal, o la ruta subcutánea. Se pueden utilizar otras rutas de administración. Incluso otro aspecto de la presente invención es un método para inducir una respuesta inmune protectora contra al menos un patógeno que comprende administrar una cantidad ¡nmunológicamente efectiva de una composición que comprende una o más moléculas inmunológicamente activas (por ejemplo, inmunógenos) y una combinación de agonistas del receptor TLR establemente asociados con micropartículas como se describió anteriormente a un sujeto para inducir la respuesta inmune protectora al patógeno en el sujeto. La respuesta inmune protectora comprende respuestas Th1 o Th2 o una combinación de ambas respuestas Th1 y Th2. La administración puede ser por medio de una dosis particular o de múltiples dosis. Incluso otro aspecto de la presente invención es un método para inducir la tolerancia a un agente inmunológicamente activo que comprende la administración de una cantidad ¡nmunológicamente efectiva de una composición que comprende una o más moléculas ¡nmunológicamente activas (por ejemplo, ¡nmunógenos) y una combinación de agonistas del receptor TLR y agonista de la proteína NOD establemente asociados con las micropartículas a un sujeto para inducir tolerancia al agente ¡nmunológicamente activo en el sujeto. Las moléculas ¡nmunológicamente activas pueden tener una porción que contiene lípido, la cual se puede unir a las micropartículas independientemente del remanente de las moléculas inmunológicamente activas. Alternativamente, la porción que contiene lípido inmunológicamente activo puede comprender adicionalmente grupos de carbohidratos. La toxicidad y la eficiencia terapéutica de las composiciones de conformidad con la presente invención se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal al 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED5o- Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosis para uso en humanos o en otros animales. La dosis de dichas composiciones yace preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la ED50 con poca toxicidad o sin toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosis empleada y la ruta de administración utilizada.
Para cualquier composición de conformidad con la presente invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar ¡nicíalmente a partir de los ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para que alcance un intervalo de concentración en plasma en circulación que incluye la IC50 como se determinó en cultivo celular (por ejemplo, la concentración de la composición prueba que alcanza una respuesta máxima media con respecto al efecto de la composición sobre el parámetro del sistema inmune a ser medido). Dicha información se puede utilizar para determinar de manera más precisa las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante CLAR. La formulación exacta, ruta de administración y dosis se pueden elegir por el médico individual en vista de la condición del paciente. (Véase por ejemplo Fingí et al., en The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975, capítulo 1 página 1 ). Se debe mencionar que el médico tratante podría conocer cómo y cuándo terminar, interrumpir, o ajustar la administración debido a la toxicidad, o a las distinciones en un órgano. Contrariamente, el médico tratante también podría saber cómo ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no es la adecuada (impidiendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el manejo del trastorno de interés variará con la severidad de la condición a ser tratada y con la ruta de administración. La severidad de la condición puede ser evaluada, por ejemplo, en parte, mediante métodos estándares de evaluación pronostica. Además, la dosis y tal vez la frecuencia de dosis, también variarán de conformidad con la edad, peso corporal, y respuesta del paciente individual. Un programa comparable a aquel anteriormente discutido se puede utilizar en la medicina veterinaria. El uso de vehículos farmacéuticamente aceptables para formular las composiciones descritas aquí para la práctica de la invención en dosis adecuadas para administración sistémica se encuentra dentro del alcance de la invención. Con una elección adecuada del vehículo y la práctica de elaboración adecuada, las composiciones de la presente invención, en particular, aquellas formuladas como soluciones, se pueden administrar parenteralmente, tal como mediante inyección intravenosa. Las composiciones se pueden formular fácilmente utilizando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica hacia dosis adecuadas para administración mucosal o subcutánea. La invención se ilustra por los siguientes ejemplos. Esos ejemplos se incluyen solamente para propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten la invención.
EJEMPLO 1 Selección de micropartículas Las micropartículas de agarosa en los intervalos de 1-10 µm ha sido producidas por Sterogene Bioseparations, Inc. (Carlsbad, CA) y se evaluaron utilizando un Satum DigíSizer 5200 (Mícromeritís instrument Corp).
Los datos mostrados en la figura 1 muestran que la distribución de partículas se encuentra 75% por debajo de 5 µm, 24% es de 5-10 µm y 1 % se encuentra por arriba de 10 µm.
EJEMPLO 2 Cultivo de Mycoplasma gallisepticum (MG) A 0.1 ml de medio para crecimiento de micoplasma, se le añadió la forma liofilizada de M. gallisepticum (K781 R-16P) y se colocó en 1.5 mL de medio de cultivo en una incubadora a 37°C Se monitoreó el crecimiento de micoplasma mediante cambio de color (rosa a naranja o amarillo) o mediante la siembra en placas de agar y el monitoreo de las colonias. Se crecieron grandes volúmenes (10-15 L) de cultivos de micoplasma mediante la transferencia de cultivos infectados a medio fresco. Subsecuentemente, los cultivos se centrifugaron las 5500 rpm por 30 minutos. El lavado del concentrado con PBS se llevó a cabo (20 minutos a 5500 rpm) hasta que la DO280 del sobrenadante se encontró por debajo de 0.2. El concentrado se resuspendíó en 20 mL de PBS.
EJEMPLO 3 Preparación de la columna de inmunoafinidad para la purificación del antígeno MG Paso 1 : A 64 ml de suero de pollo anti-M. gallisepticum, se les añadieron 128 mL de agua deionízada (DI) en un vaso de precipitado de vidrio. El pH que la solución se ajustó a 4.5 utilizando ácido acético glacial. La solución se agitó rápidamente pero se tuvo cuidado de evitar salpicaduras o formación de espuma. La solución precipitante CAP-8 (Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA) se agitó vigorosamente por 10 minutos. Subsecuentemente, se tomaron 64 ml de la solución precipitante CAP-8 y lentamente se añadieron a la pared lateral del vértex formado por la agitación durante un periodo de 1 a 2 minutos. La agitación se hizo más lenta a una velocidad que solamente movía la solución. La solución se agitó por 30 minutos a temperatura ambiente y luego se transfirió a un tubo de centrífuga de tamaño apropiado y se precipitó con centrifugación a 5,500 rpm por 15 minutos. El sobrenadante se decantó en un recipiente y el concentrado se lavó una vez con 20 mL de regulador de pH de acetato de Na 20 mM, pH 4.8. El sobrenadante se filtró mediante el uso de una jeringa equipada con un filtro de 0.22 µm.
Paso 2: La resina para intercambio catiónico SP Thruput Plus (Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA) se suspendió en 3 volúmenes del lecho de NaOH 1 M por 10 minutos y luego se lavó con agua DI para neutralizar. Subsecuentemente, se lavó con 10 volúmenes del lecho de acetato de sodio 0.5M, pH 4.8 y luego con 20 volúmenes del lecho de agua DI. La resina se equilibró con 15 volúmenes del lecho de acetato de sodio 20 mM, pH 4.8 y se empaquetó en una columna mediante el uso de regulador de pH para empaquetamiento de acetato 20 mM, pH 4.8. El sobrenadante a partir del paso 1 se cargó sobre la columna a una velocidad de flujo de 3 mL/minuto y la columna se lavó con regulador de pH de acetato de sodio 20 mM, pH 4.8. El flujo a través y el lavado se combinaron. La D028o se midió en contra de acetato de sodio 20 mM, pH 4.8. La columna se eluyó con regulador de pH de fosfato de sodio 50 mM, NaCI 300 mM, pH 8.0 y se midió la D028o del eluyente.
Paso 3: A 20 ml de resina Actigel ALD activada (Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA) se le añadió la solución purificada de IgG de pollo anti-M. gallisepticum a 10 mg/mL seguido por 10.5 mL de cianoborohidruro de sodio 1 M (solución para acoplamiento ALD, Sterogene Bioseparations, Inc. Carlsbad, CA). La suspensión se mezcló suavemente por 20 horas a 2-8°C seguido por un lavado extensivo con agua DI. La resina se almacenó en PBS, a pH 7.0 y 2-8°C.
EJEMPLO 4 Purificación de los antígenos MG Paso 1 : A 20 ml del concentrado MG lavado, se le añadieron 0.2 g de detergente Mega-10 y se mezclaron por 20 horas a temperatura ambiente. Después de 20 horas de incubación, también se añadió 1 mL de Tritón-X 100 a la suspensión y se continuó con el mezclado por otra hora a temperatura ambiente. Subsecuentemente, se centrifugó a 5,000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante se separó a partir del concentrado y se añadieron 200 ml de PBS, pH 7.2 al sobrenadante. La solución de proteína MG se mantuvo a 2-8°C por 5 días.
Paso 2: Una columna de IgG de pollo anti-MG-Actigel con un volumen del lecho de 200 ml se equilibró con 5 volúmenes del lecho de PBS, pH 7.2 a una velocidad de flujo de 3 mL/minuto. La solución de proteína MG se cargó sobre la columna a 8-15 mL/minuto. El flujo atravesar recolectó en una botella separada. La columna se lavó con 10 volúmenes del lecho de PBS, pH 7.2 a una velocidad de flujo de 8-15 mL/minuto y luego se eluyó con 20-40 mL de ácido cítrico 0.1 M, pH 2.5 a la misma velocidad de flujo. El pH del eluído se ajustó inmediatamente a 7.2 mediante el uso de Tris 2M. Esta purificación se repitió al menos cinco veces utilizando el flujo a través de la columna con el objeto de adsorber todos los antígenos. Todos los eluídos se combinaron y se concentraron en una bolsa para diálisis con azúcar en polvo durante toda la noche a 2-8°C. La solución concentrada se dializó en contra de 5 L de PBS, pH 7.2 a 2-8°C durante toda la noche. Se llevó a cabo el ensayo de proteína de Bradford para determinar la concentración del antígeno purificado utilizando albúmina de suero como un estándar.
EJEMPLO 5 Micropartículas de agarosa activada Las partículas se activaron mediante dos métodos diferentes. El primer método de activación se llevó a cabo por Sterogene Bioseparations, Inc. (Carlsbad, CA), utilizando una química de enlace al aldehido comercialmente disponible patentado, la cual se provee para una unión extremadamente estable de los ligandos. Otra ventaja de esta química es la alta reproducibílidad de la inmovilización. Esta química de aldehido patentado permite la inmovilización consecutiva de varios ligandos. Otra activación se llevó a cabo mediante el uso de un método de activación de bromuro de cianógeno (CNBr). Brevemente, a 30 mL de micropartículas de agarosa se le añadieron 30 mL de una solución de carbonato de sodio 2 M y se mantuvo en un baño con hielo por 3-5 minutos sin mezclado. Posteriormente, se pesaron 1.5 g de CNBr y se disolvieron en 9 mL de acetonitrilo. Inmediatamente, la solución de CNBr se añadió a la mezcla de resina y se mezcló vigorosamente en un baño con hielo por 2 minutos. Subsecuentemente, se lavó con 20 volúmenes del lecho de agua enfriará con hielo mediante centrifugación a 4,500 rpm, 2°C por 5 minutos.
EJEMPLO 6 Acoplamiento de los antígenos MG a las micropartículas La reacción de acoplamiento toma lugar entre los grupos amino en los antígenos purificados y los grupos aldehido o los grupos activados por CNBr en las mícropartículas. Cuando se utilizaron las partículas activadas por aldehido, el acoplamiento fue mediado con el reactivo para acoplamiento de cianoborohidruro de sodio como se describe bajo el ejemplo 3. Los antígenos se inmovilizaron a las concentraciones de 10 µg/0.2 mL y 50 µg/0.2 mL de micropartículas. En otra reacción de acoplamiento las micropartículas activadas por CNBr se utilizaron a la misma concentración que el antígeno como sigue. A 15 mL de micropartículas activadas por CNBr, se le añadió la solución purificada del antígeno MG a pH 8.0. La solución se mezcló suavemente a 2-8°C por 20 horas. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó con 10 volúmenes del lecho de agua DI.
Las resinas acopladas se almacenaron en agua LAL a 2-8°C. El ensayo de proteína de Bradford se utilizó para medir la proteína no unida en el sobrenadante.
EJEMPLO 7 Preparación y acoplamiento de la membrana de micoplasma A 3.0 mL del antígeno de mícoplasma concentrado se le añadieron 80 mL de agua DI sometida a autoclave y se mezclaron con una barra para agitación a 37°C por 1 hora. La solución se centrifugó a 5000 rpm por 30 minutos y el concentrado se lavó dos veces con agua sometida a autoclave. El concentrado se reconstituyó en 10 mL de PBS. A 1.5 mL de micropartículas activadas por CNBr, se le añadieron 0.5 mL del concentrado purificado, diluido en una relación 1 :3 con NaHC03 0.1 M a pH 8. La solución se mezcló suavemente a 2-8°C por 20 horas. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó con 10 volúmenes del lecho de agua DI. Las resinas acopladas se almacenaron en agua LAL a 2-8°C. El ensayo de proteína de Bradford se utilizó para medir la proteína no unida en el sobrenadante.
EJEMPLO 8 Acoplamiento del activador del receptor NOD1 a las micropartículas El peptidoglicano (PG), a 2 µg/0.2 mL de resina, se disolvió en NaHC03 0.1 M y se añadió a partículas activadas con CNBr de conformidad con el ejemplo 6. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL la cual también es el medio para almacenamiento.
EJEMPLO 9 Acoplamiento del activador TLR3 a las micropartículas Poli l:C a 10 µg/0.2 mL de lechos se inmovilizó en las micropartículas activadas por CNBr en NaHC03 0.1 M a pH 8, de conformidad con el ejemplo 6. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL la cual también es el medio para almacenamiento.
EJEMPLO 10 Acoplamiento del activador TLR4 a las micropartículas El lipopolisacárido bacteriano a 2 µg/0.2 mL de resina se disolvió en NaHC03 0.1 M a pH 8 y se inmovilizó en las micropartículas activadas por CNBr de conformidad con el ejemplo 6. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL la cual también es el medio para almacenamiento.
EJEMPLO 11 Acoplamiento del activador TLR5 a las micropartículas La flagelina a 2 µg/0.2 mL de resina se disolvió en NaHC03 0.1 M a pH 8 y se inmovilizó en las micropartículas activadas por CNBr de conformidad con el ejemplo 6. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL la cual también es el medio para almacenamiento.
EJEMPLO 12 Acoplamiento del activador TLR1 y TLR6 a las micropartículas El antígeno mícoplasmal de superficie que contiene MALP-2 a 2 µg/0.2 mL de resina se disolvió en NaHC03 0.1 M a pH 8 y se inmovilizó en las micropartículas activadas por CNBr de conformidad con el ejemplo 6. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL la cual también es el medio para almacenamiento.
EJEMPLO 13 Acoplamiento del activador TLR7/TLR8 a las micropartículas El ARN de cadena sencilla o imiquimod imidazoquinolina antiviral (Aldara) a 2 µg/0.2 mL de resina se disolvió en NaHC03 0.1 M a pH 8 y se inmovilizó en las micropartículas activadas por CNBr de conformidad con el ejemplo 6. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL la cual también es el medio para almacenamiento.
EJEMPLO 14 Acoplamiento del activador TLR9 a las micropartículas El ADN CpG a 10 µg/0.2 mL de resina se disolvió en NaHC03 0.1 M a pH 8 y se inmovilizó en las micropartículas activadas por CNBr de conformidad con el ejemplo 6. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL la cual también es el medio para almacenamiento.
EJEMPLO 15 Inmovilización de las composiciones de molécula combinatorial agonista del receptor para reconocimiento PAMP a las micropartículas El agonista NOD1 y los agonistas TLR 4 y 9 se mezclaron juntos a 2 µg/0.2 mL de resina, 10 µg/0.2 ml de resina y 2 µg/0.2 mL de resina, respectivamente en NaHCO3 0.1 M a pH 8 y se inmovilizaron en las micropartículas activadas por CNBr de conformidad con el ejemplo 6. La reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL y se almacenaron en la misma a 2-8°C EJEMPLO 16 Inmovilización del antígeno MG ¡unto con las composiciones de la molécula combinatorial agonista del receptor para reconocimiento PAMP a las micropartículas Los antígenos MG se acoplaron bajo las condiciones descritas en el ejemplo 6 por 1 hora. Subsecuentemente, se añadió la mezcla del agonista TLR descritas bajo el ejemplo 13 y la reacción se dejó proceder durante toda la noche a 2-8°C. El sobrenadante se separó mediante centrifugación y la resina se lavó extensivamente con agua grado LAL la cual también es el medio para almacenamiento.
EJEMPLO 17 Estudios animales I Los resultados son el promedio de 3 experimentos. Se vacunaron pollos de tres días de edad (libres de M. gallisepticum (MG) y M. synoviae (MS), y sin anticuerpos maternos MG y MS a ser detectados por ELISA). En cada grupo había 10 pollos. A los 14 días de experimentación, los pollos se probaron con la cepa R?ow de M. gallisepticum.
El estudio se terminó a los 28 días. Los grupos se establecieron como sigue: Tratamiento G1-G5 con composiciones de vacuna con micropartícula antes de la prueba - G1 = solamente oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) y probados - G2 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno de M. gallísepticum purificado por afinidad (10 µg/dosis) y probado - G3 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con agonistas del receptor (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado - G4 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno de M. gallisepticum purificado por afinidad (10 µg/dosis) y agonistas del receptor (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado - G5 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con membrana de M. gallisepticum (107/dosis) Tratamiento G6-G7 con composiciones de vacuna con micropartículas después de la prueba - G6 = probado y oralmente tratado después de la prueba con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno de M. gallisepticum purificado por afinidad (10 µg/dosis) y agonistas del receptor (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) - G7 = probado y oralmente tratado después de la prueba con micropartículas (0.2 mL/pollo) con agonistas del receptor (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptídoglicano/dosis) Controles positivos y negativos a G8 y G9 - G8 = probado y no tratado - G9 = no probado y no tratado Línea temporal Día -1 : Establecimiento de los grupos G1-G9. Se sacrificaron 10 pollos para ensayo de ELISA, PCR y cultivo de M. gallisepticum y M. synoviae para confirmar que los pollos experimentales son negativos a los anticuerpos maternos y a la presencia de M. gallisepticum y M. synoviae. Día 0: Vacunación de G1-G5 antes de la prueba. Día 14: Prueba de los grupos G1-G8. Día 15: Vacunación de los grupos G6-G7 después de la prueba. Día 28: G1-G9. Eutanasia, necropsia, y siembra para el aislamiento de M. gallisepticum (MG) a partir de órganos especificados, tráquea, saco aéreo y pulmón. Se llevó a cabo el examen histológico de la tráquea y del pulmón. Días D14 y D28: Los pollos se licuaron con el objeto de obtener suero a ser evaluado para anticuerpos específicos a MG utilizando una prueba de aglutinación de placa con suero (SPA) y bloqueo por ELISA.
Al D-1 un total de 90 pollos criados para asarse a la parrilla de un día de edad se colocaron en uno de ocho grupos (10 aves/grupo). Se registraron los pesos corporales individuales de los pollos. Los pollos se colocaron de tal manera que su peso corporal promedio en cada grupo no fuera marcadamente diferente. Cada una de las aves fue identificada mediante marcas coloreadas y números en el ala de conformidad con el tratamiento y se registró el peso corporal en la forma apropiada.
Tratamiento Al día 0, los pollos de G1-G5 se trataron con diferentes composiciones de la vacuna, 0.2 mL en 1 mL de PBS por animal. Las dosis se describieron anteriormente. G6-G7 se trataron al día 15, después de la prueba.
Prueba Al día 14, ocho grupos de animales G1-G8 se probaron utilizando un cultivo de caldo fresco de la cepa R virulenta de M. gallisepticum, a un título de aproximadamente 8.0 log™ UFC/ml. Se administraron 10 ml de este cultivo de caldo fresco a cada uno de estos grupos utilizando una técnica de aspersión. Brevemente, las aves se colocaron en una unidad de aislamiento de 0.22 metros cúbicos. Luego se asperjaron diez ml del cultivo fresco cepa R de M. gallisepticum, bajo una presión de 1 atmósfera, por aproximadamente una duración de 100 segundos y los pollos se dejaron expuestos por 20 minutos. (En el laboratorio, se han obtenido resultados exitosos en varios experimentos utilizando esta técnica).
Eutanasia y patología Al D28, al término del estudio experimental, todos los grupos fueron sacrificados. Cada ave se sometió a necropsia y se evaluó para lesiones macroscópicas asociadas con MG. Se registró la presencia de exudado en la tráquea, sacos aéreos torácicos izquierdo y derecho y peritoneo. Las lesiones se evaluaron de conformidad con el siguiente sistema: En la tráquea: 0 = sin exudado, 1 = enrojecimiento ligero y pequeña cantidad de exudado, 2 = enrojecimiento de la membrana mucosa, exudado. Sacos aéreos izquierdo y derecho: 0 = sin lesión, 1 = exudado seroso, 2 = exudado seroso con pequeñas piezas de fibrina, 3 = exudado seroso, fibrinoso, pared del saco aéreo ligeramente más gruesa, 4 = porciones de exudado fibrinoso, pared del saco aéreo mucho más gruesa. Peritoneo: 0 = sin exudado, 1 = exudado seroso, 2 = exudado seroso con pequeñas piezas de fibrina, 3 = exudado seroso-fibrinoso.
Aislamiento de MG Durante el examen de la necropsia, se tomaron muestras de manera aséptica de la tráquea, sacos aéreos torácicos, hígado, pulmón, bazo, riñon y corazón utilizando hisopos. Los materiales a partir de los hisopos se sembraron entonces sobre agar para micoplasma (MA) y se incubaron a 37°C en una incubadora con 5% de CO2. Se observaron las placas para micoplasma a los días 2, 4, y 7, y luego a intervalos semanales por un máximo de tres semanas. Las colonias positivas se evaluaron mediante PCR para identificar M. gallisepticum y M. synoviae.
Necropsia De manera subsecuente a la prueba con MG, se reconocieron las lesiones patológicas significativas en el saco aéreo y en el peritoneo. Sin embargo, se registró una reducción significativa en las evaluaciones de la lesión en los grupos tratados con partículas más agonistas del receptor (G3, G6 p<0.001 ), partículas más antígeno purificado (G2, p<0.001 ) y antígeno purificado más agonistas del receptor (G4, G6 p<0.001 ) en comparación con el grupo probado con el control (G8) no tratado, así como el grupo solamente tratado con las partículas (G1 ). Sin embargo, se obtuvieron mejores resultados con las partículas más el antígeno purificado o con las partículas más el antígeno purificado más los agonista del receptor si se administran antes de la prueba cuando se comparan con la administración después de la prueba. Cuando G5 se trató con la membrana de M. galliseptícum inmovilizada en las partículas, en algunos casos las lesiones patológicas fueron más pronunciadas que en el grupo prueba. Esto lleva a la conclusión de que la vacunación con la membrana de M. gallisepticum previno la respuesta inmune adecuada en contra de la prueba con el patógeno, ocasionando la supresión inmune y permitiendo una infección más pronunciada.
Re-aislamiento del micoplasma El micoplasma se puede re-aislar frecuentemente a partir de los órganos internos de los pollos control infectados, no vacunados. Se observó reducción significativa en la relación de re-aislamíento (a partir de órganos respiratorios + órganos internos) en grupos tratados con partículas más antígeno purificado con o sin agonistas del receptor (G2, G4, G6) en comparación con el grupo control no vacunado (G8, p<0.01 ) y con el grupo tratado solamente con las partículas (G1 , P<0.001 -0.01 ) o con el grupo tratado con la partícula más los agonistas del receptor (G3, G7 p<0.05). Sin embargo, hubo una disminución significativa en la relación de re-aislamiento (p<0.05) entre el grupo tratado con partículas más los agonistas del receptor (G3, G6) y el control (G8). Se obtuvieron resultados similares cuando se comparó la relación de re-aislamiento del micoplasma a partir del tracto respiratorio (tráquea, pulmón, saco aéreo) o a partir de otros órganos internos (hígado, bazo, riñon y corazón) de los grupos experimentales. Cuando G5 se trató con la membrana de M. gallisepticum inmovilizada a las partículas, la relación de re-aislamiento de M. gallisepticum a partir de los órganos en algunos casos fue mayor que en el grupo de prueba. Esto lleva a la conclusión de que la vacunación con la membrana de M. gallisepticum previno la respuesta inmune adecuada en contra de la prueba con el patógeno y ocasionó la supresión inmune y permitió una infección más pronunciada. Los resultados se muestran en el cuadro 1.
CUADRO 1 Resultados serológicos La respuesta serológica de los grupos fue diferente al término del experimento. La reacción del grupo probado, no tratado (G8) no difiere del grupo solamente tratado con las partículas (G1 ). Al mismo tiempo, fue evidente una reacción significativamente más fuerte en el grupo tratado con partículas más antígeno purificado más agonistas PRR (G4) (p<0.05) en comparación con el grupo tratado solamente con las partículas (G1 ). En comparación con el grupo tratado con las partículas más el antígeno purificado (G2), si se añadía PRR (G4, G6) se evidenciaba una respuesta serológica significativamente mayor (p<0.05). No hubo una diferencia significativa entre los resultados serológicos sí las partículas con el antígeno y PRR se utilizaban antes (G4) o después (G6) de la prueba.
Discusión M. gallisepticum puede ocasionar una inflamación significativa en el saco aéreo y en el peritoneo la cual se acompaña por la colonización de la tráquea, saco aéreo y los pulmones. El micoplasma también se puede detectar frecuentemente a partir de los órganos internos. Los inventores han desarrollado un tipo novedoso de composiciones inmunológicamente activas "que imitan al patógeno" que consisten de micropartículas en el intervalo de tamaño de los microorganismos (<5 µm), que tienen antígenos purificados por inmunoafinidad covalentemente inmovilizados junto con diferentes moléculas agonistas PRR.
Los resultados de los inventores muestran que las partículas sin ninguna modificación no estimulan ninguna respuesta inmune. Las partículas solas no protegen a los pollos de la peritonitis y de la inflamación de los sacos aéreos ocasionada por M. gallisepticum ni previenen la colonización de los órganos por micoplasma. Cuando las partículas se revistieron con el agonista PRR sin antígeno, la respuesta serológica a la prueba con micoplasma no se vio afectada. Sin embargo, la colonización de los órganos con micoplasma se redujo y las evaluaciones de lesiones patológicas se redujeron. Esto confirma las observaciones in vitro de los inventores con respecto a que los agonistas PRR estimulan o mejoran la respuesta inmune innata que lleva a una protección incrementada. Sin embargo, la cantidad de modulador inmune aplicada no fue capaz de proteger completamente al animal de una dosis masiva de prueba con una cepa altamente patogénica. Esto también se sabe para la respuesta inmune innata puesto que típicamente es insuficiente para superar las dosis masivas de los patógenos. Sin embargo, los datos indican, que este modulador inmune novedoso posiblemente podría proteger al animal de una menor dosis de prueba. Cuando se añadió el antígeno purificado a las partículas revestidas con agonistas PRR, se mejoró la respuesta serológica específica a micoplasma. La colonización de los órganos se redujo significativamente y disminuyeron las evaluaciones de las lesiones patológicas. Este efecto fue más pronunciado cuando la vacuna se introdujo mucosalmente y antes de la prueba, pero se evidenció un efecto positivo similar cuando la vacuna se administró mucosalmente después de la prueba. Una observación interesante fue que las concentraciones en incremento del antígeno (hasta 50 µg/dosis) disminuirían de hecho los efectos protectores de la vacuna. Esto sugiere la presencia de componentes inmunosupresores en el antígeno purificado por afinidad. Para identificar dichos componentes y eliminar sus efectos se diseñó un ensayo novedoso en animal (véase a continuación). Después de la vacunación, antes de la prueba, los pollos vacunados se examinaron diariamente para evaluar la seguridad de la vacuna. Los pollos se encontraron clínicamente sanos, no mostraron efectos laterales a partir de la vacuna. El consumo de forraje y agua de las aves no cambió en comparación con los grupos no vacunados. Los animales que se sometieron a necropsia durante el curso del ensayo no mostraron signos de inflamación o cambio en el tamaño/peso del órgano. La vacuna pareció ser segura.
EJEMPLO 18 Se preparó el antígeno MG purificado por afinidad como se describió en los ejemplos previos. El antígeno purificado se dividió en tres grupos para los siguientes tratamientos antes de la inmovilización. 1. Digestión con endoqlicosidasa H A 53.6 ml de los antígenos (aproximadamente 1.5 mg) se le añadieron 2.5 Unidades de enzima y se incubaron a 37°C durante toda la noche. Al siguiente día la mezcla se pasó a través de una columna enfriada de mannano inmovilizado (5 mL) y se recolectó el flujo a través. Esta muestra se designó Antígenos Endo H. 2. Tratamiento con peryodato A 53.6 ml de los antígenos (aproximadamente 1.5 mg) se le añadió peryodato de sodio sólido hasta una concentración final de 15 mM y después de la mezcla se mantuvo en enfriamiento por 1 hora. Se añadió glicerina en un exceso molar de dos veces y la muestra se incubó por otra hora. La diálisis en contra de PBS se llevó a cabo durante toda la noche. La muestra dializada se designó Antígenos de Peryodato (PJ). 3. Remoción de los antígenos para unión a ConA Los antígenos purificados (aproximadamente 1.5 mg en 53.6 ml) se pasaron a través de una columna de ConA inmovilizada de 2 mL. Se recolectó el flujo a través. Esta muestra se designó flujo a través ConA. Los antígenos unidos se eluyeron con alfa-metil mannoglucósido 1 M en TRIS 50 mM, pH 9.5. Esta muestra se designó elución ConA.
Tratamiento con antígeno Las características de los antígenos se muestran en el cuadro 2.
CUADRO 2 *para el tratamiento con Endo H, la cantidad inicial de antígenos tratados fue de 2.51 mg (53.6 ml de esta preparación y 40.3 ml de una preparación previa de M. gallisepticum a 0.0246 mg/ml).
EJEMPLO 19 Estudios animales II Los resultados son el promedio de 3 experimentos. Se vacunaron pollos de tres días de edad (libres de M. gallisepticum (MG) y M. synoviae (MS), y sin anticuerpos maternos MG y MS a ser detectados por ELISA). En cada grupo había 10 pollos. A los 14 días de experimentación, los pollos se probaron con la cepa R|0W de M. gallisepticum. El estudio se terminó a los 28 días. Los grupos se establecieron como sigue: G1 = no probado y no tratado G2 = probado y no tratado Tratado dos semanas antes de la prueba: G3 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno de M. gallísepticum purificado por afinidad (10 µg/dosis) y agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado G4 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno de M. gallísepticum purificado por afinidad (50 µg/dosis) y agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado G5 = oralmente tratado con mícropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallisepticum adsorbido a ConA purificado por afinidad (10 µg) y probado G6 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno de M. gallisepticum digerido con Endo H purificado por afinidad (10 µg) y probado G7 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallisepticum oxidado con peryodato purificado por afinidad (10 µg) y probado G8 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallísepticum adsorbido a ConA purificado por afinidad (10 µg) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado G9 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallísepticum adsorbido a ConA purificado por afinidad (50 µg) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosís) y probado G10 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallisepticum digerido con Endo H purificado por afinidad (10 µg) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado G11 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallísepticum digerido con Endo H purificado por afinidad (50 µg) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado G12 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallisepticum oxidado con peryodato purificado por afinidad (10 µg) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado G13 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallísepticum oxidado con peryodato purificado por afinidad (50 µg) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglícano/dosis) y probado G14 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallisepticum digerido con Endo H purificado por afinidad (10 µg) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) más aminoguanidina (i.p.) por 7 días y probado G15 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallisepticum del eluído ConA en lechos y probado Línea temporal Día -1 : Establecimiento de los grupos G1-G15. Se sacrificaron 10 pollos para ensayo de ELISA, PCR y cultivo de M. gallisepticum y M. synoviae para confirmar que los pollos experimentales son negativos a los anticuerpos maternos y a la presencia del micoplasma. Día 0: Vacunación de G3-G14 antes de la prueba. Día 14: Prueba de los grupos G2-G15. Día 28: G1-G15. Eutanasia, necropsia, y siembra para el aislamiento de M. gallisepticum (MG) a partir de órganos especificados, tráquea, saco aéreo y pulmón. Se llevó a cabo el examen histológico de la tráquea y del pulmón.
Días D14 y D28: Los pollos se licuaron con el objeto de obtener suero a ser evaluado para anticuerpos específicos a MG utilizando una prueba de aglutinación de placa con suero (SPA) y bloqueo por ELISA. Al D-1 un total de 150 pollos criados para asarse a la parrilla de un día de edad se colocaron en uno de 15 grupos (10 aves/grupo). Se registraron los pesos corporales individuales de los pollos. Los pollos se colocaron de tal manera que su peso corporal promedio en cada grupo no fuera marcadamente diferente. Cada una de las aves fue identificada mediante marcas coloreadas y números en el ala de conformidad con el tratamiento y se registró el peso corporal en la forma apropiada.
Prueba Al día 14, catorce grupos de animales G2-G15 se probaron utilizando un cultivo de caldo fresco de la cepa R virulenta de M. galliseptícum, a un título de aproximadamente 8.0 logio UFC/ml. Se administraron diez ml de este cultivo de caldo fresco a cada uno de estos grupos utilizando una técnica de aspersión. Brevemente, las aves se colocaron en una unidad de aislamiento de 0.22 metros cúbicos. Luego se asperjaron diez ml del cultivo fresco cepa R de M. galliseptícum, bajo una presión de 1 atmósfera, por aproximadamente una duración de 100 segundos y los pollos se dejaron expuestos por 20 minutos. (En el laboratorio, se han obtenido resultados exitosos en varios experimentos utilizando esta técnica).
Eutanasia y patología Al D28, al término del estudio experimental, todos los grupos fueron sacrificados. Cada ave se sometió a necropsia y se evaluó para lesiones macroscópicas asociadas con MG. Se registró la presencia de exudado en la tráquea, sacos aéreos torácicos izquierdo y derecho y peritoneo. Las lesiones se evaluaron de conformidad con el siguiente sistema: En la tráquea: 0 = sin exudado, 1 = enrojecimiento ligero y pequeña cantidad de exudado, 2 = enrojecimiento de la membrana mucosa, exudado. Sacos aéreos izquierdo y derecho: 0 = sin lesión, 1 = exudado seroso, 2 = exudado seroso con pequeñas piezas de fibrina, 3 = exudado seroso, fibrinoso, pared del saco aéreo ligeramente más gruesa, 4 = porciones de exudado fibrinoso, pared del saco aéreo mucho más gruesa. Peritoneo: 0 = sin exudado, 1 = exudado seroso, 2 = exudado seroso con pequeñas piezas de fibrina, 3 = exudado seroso-fibrinoso.
Resultados Los resultados se muestran en el cuadro 3.
CUADRO 3 Aislamiento de MG Durante el examen de la necropsia, se tomaron muestras de manera aséptica de la tráquea, sacos aéreos torácicos, hígado, pulmón, bazo, riñon y corazón utilizando hisopos. Los materiales a partir de los hisopos se sembraron entonces sobre agar para micoplasma (MA) y se incubaron a 37°C en una incubadora con 5% de CO2. Se observaron las placas para micoplasma a los días 2, 4, y 7, y luego a intervalos semanales por un máximo de tres semanas. Las colonias positivas se evaluaron mediante PCR para identificar M. galliseptícum y M. synoviae.
Necropsia y re-aislamiento De manera subsecuente a la prueba con MG, se reconocieron las lesiones patológicas significativas en el saco aéreo y en el peritoneo. Sin embargo, se registró una reducción significativa en las evaluaciones de la lesión y se registraron las relaciones de re-aislamiento en los grupos vacunados con el antígeno purificado tratado más los grupos TLR, el mejor de los cuales fue el antígeno agotado de la columna Con A (G9) en comparación con el grupo control no tratado, probado. Sin embargo, con la fracción G15 del antígeno eluído con Con A, la evaluación de la lesión del patógeno fue elevada y la relación de re-aislamiento fue la misma que con el control positivo. Esto lleva a la conclusión de que la vacunación con esta fracción del antígeno de M. gallísepticum previno la respuesta inmune apropiada en contra de la prueba con el patógeno, ocasionando la supresión inmune y permitiendo una infección más pronunciada.
Discusión Los resultados de estos experimentos muestran que la remoción de los antígenos supresores inmunes a partir del agrupamiento del antígeno purificado por afinidad tiene efectos protectores marcadamente mejorados de la composición de vacuna. Además, la modificación química o degradación enzimática de las modificaciones post-transcripcionales que contienen azúcar en los antígenos también lleva a una inmunidad protectora mejorada.
Contrariamente, los inventores también han encontrado que la administración de los antígenos supresores inmunes aislados acoplada a las micropartículas lleva a la supresión inmune y al desarrollo de tolerancia al patógeno. De esta manera, los inventores han demostrado que las características adecuadas del antígeno pueden modificar la respuesta inmune ya sea hacia una protección o hacia una tolerancia. Ambas tienen una gran importancia en el desarrollo de métodos racionales para modular las respuestas inmunes. Subsecuentemente, los inventores han decidido dirigir determinantes antigénicos de superficie adicionales implicados en el desarrollo de las respuestas inmunes.
EJEMPLO 20 Se preparó el antígeno MG purificado por afinidad como se describió en los ejemplos previos. El antígeno purificado se dividió en tres grupos para los siguientes tratamientos antes de la inmovilización. 1. Desacilación del antígeno MG A 27 ml de los antígenos (aproximadamente 0.65 mg) se le añadieron 8 mL de NaOH 1 M y 10 mg de ácido pentadecanóico y la solución se agitó suavemente a 70°C por 45 minutos. El pH se ajustó entonces a 8.0 y el precipitado se removió mediante centrifugación a 3,000 rpm por 5 minutos.
Esta muestra se designó Antígenos Desacílados. 2. Tratamiento con pervodato Se pretendía que ésta fuera una reacción más severa que aquélla del ejemplo 18. A 25 ml de los antígenos (aproximadamente 0.6 mg) se le añadió peryodato de sodio sólido hasta una concentración final de 80 mM y después de la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente por 2.5 horas. Luego se añadió glicerina en un exceso molar de dos veces y la muestra se incubó por otra hora. La diálisis en contra de PBS se llevó a cabo durante toda la noche. La muestra dializada se designó Antígenos de Peryodato.
EJEMPLO 21 Estudios animales lll Los resultados son el promedio de 3 experimentos. Se vacunaron pollos de tres días de edad (libres de M. gallisepticum (MG) y M. synoviae (MS), y sin anticuerpos maternos MG y MS a ser detectados por ELISA). En cada grupo había 10 pollos. A los 14 días de experimentación, los pollos se probaron con la cepa R|0 de M. gallisepticum. El estudio se terminó a los 28 días. Los grupos se establecieron como sigue: G1 = no probado y no tratado G2 = probado y no tratado Tratado 2 semanas antes de la prueba: G3 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno de M. gallisepticum purificado por afinidad (10 µg/dosis) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado G4 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno desacilado de M. gallisepticum purificado por afinidad (10 µg/dosis) + agonistas TLR (10 µg de ADN bacteriano, E. coli + 2 µg de LPS de E. coli y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado G5 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallisepticum adsorbido a ConA purificado por afinidad (10 µg) + agonistas TLR (25 µg de poli l:C + 10 µg de ADN bacteriano y 2 µg de peptidoglicano/dosís) y probado G6 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con el antígeno de M. gallisepticum tratado y desacilado con peryodato, purificado por afinidad (10 µg) + agonistas TLR (10 µg de poli l:C + 10 µg de ADN bacteriano, y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado Tratado 1 día después de la prueba: G7 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallisepticum adsorbido a Con A, purificado por afinidad (10 µg) + agonistas TLR (25 µg de poli l:C + 10 µg de ADN bacteriano, y 2 µg de peptidoglicano/dosis) G8 = oralmente tratado con micropartículas (0.2 mL/pollo) con antígeno de M. gallísepticum tratado con peryodato y desacilado, purificado por afinidad (10 µg) + agonistas TLR (25 µg de poli l:C + 10 µg de ADN bacteriano, y 2 µg de peptidoglicano/dosis) y probado Línea temporal Día -1 : Establecimiento de los grupos G1-G9. Se sacrificaron 10 pollos para ensayo de ELISA, PCR y cultivo de M. gallisepticum y M. synoviae para confirmar que los pollos experimentales son negativos a los anticuerpos maternos y a la presencia del micoplasma. Día 0: Vacunación de G3-G6 antes de la prueba. Día 14: Prueba de los grupos G2-G9. Día 15: Vacunación de G7-G9 subsecuente a la prueba. Día 28: G1-G9. Eutanasia, necropsia, y siembra para el aislamiento de M. gallisepticum (MG) a partir de órganos especificados, tráquea, saco aéreo y pulmón. Se llevó a cabo el examen histológico de la tráquea y del pulmón. Días D14 y D28: Los pollos se licuaron con el objeto de obtener suero a ser evaluado para anticuerpos específicos a MG utilizando una prueba de aglutinación de placa con suero (SPA) y bloqueo por ELISA. Al D-1 un total de 90 pollos criados para asarse a la parrilla de un día de edad se colocaron en uno de 9 grupos (10 aves/grupo). Se registraron los pesos corporales individuales de los pollos. Los pollos se colocaron de tal manera que su peso corporal promedio en cada grupo no fuera marcadamente diferente. Cada una de las aves fue identificada mediante marcas coloreadas y números en el ala de conformidad con el tratamiento y se registró el peso corporal en la forma apropiada.
Prueba Al día 14, nueve grupos de anímales G2-G9 se probaron utilizando un cultivo de caldo fresco de la cepa R virulenta de M. gallisepticum, a un título de aproximadamente 8.0 log-?0 UFC/ml. Se administraron diez ml de este cultivo de caldo fresco a cada uno de estos grupos utilizando una técnica de aspersión. Brevemente, las aves se colocaron en una unidad de aislamiento de 0.22 metros cúbicos. Luego se asperjaron diez ml del cultivo fresco cepa R de M. galliseptícum, bajo una presión de 1 atmósfera, por aproximadamente una duración de 100 segundos y los pollos se dejaron expuestos por 20 minutos.
Eutanasia y patología Al D28, al término del estudio experimental, todos los grupos fueron sacrificados. Cada ave se sometió a necropsia y se evaluó para lesiones macroscópicas asociadas con MG. Se registró la presencia de exudado en la tráquea, sacos aéreos torácicos izquierdo y derecho y peritoneo. Las lesiones se evaluaron de conformidad con el siguiente sistema: En la tráquea: 0 = sin exudado, 1 = enrojecimiento ligero y pequeña cantidad de exudado, 2 = enrojecimiento de la membrana mucosa, exudado.
Sacos aéreos izquierdo y derecho: 0 = sin lesión, 1 = exudado seroso, 2 = exudado seroso con pequeñas piezas de fibrina, 3 = exudado seroso, fibrinoso, pared del saco aéreo ligeramente más gruesa, 4 = porciones de exudado fibrinoso, pared del saco aéreo mucho más gruesa. Peritoneo: 0 = sin exudado, 1 = exudado seroso, 2 = exudado seroso con pequeñas piezas de fibrina, 3 = exudado seroso-fibrinoso.
Resultados Los resultados se muestran en el cuadro 4.
CUADRO 4 Aislamiento de MG Durante el examen de la necropsia, se tomaron muestras de manera aséptica de la tráquea, sacos aéreos torácicos, hígado, pulmón, bazo, riñon y corazón utilizando hisopos. Los materiales a partir de los hisopos se sembraron entonces sobre agar para micoplasma (MA) y se incubaron a 37°C en una incubadora con 5% de CO2. Se observaron las placas para micoplasma a los días 2, 4, y 7, y luego a intervalos semanales por un máximo de tres semanas. Las colonias positivas se evaluaron mediante PCR para identificar M. gallisepticum y M. synoviae.
Necropsia y re-aislamiento De manera subsecuente a la prueba con MG, se reconocieron las lesiones patológicas significativas en el saco aéreo y en el peritoneo. Sin embargo, se registró una reducción significativa en las evaluaciones de la lesión y se registraron las relaciones de re-aislamiento en los grupos vacunados con el antígeno purificado tratado más los grupos TLR, todos los grupos produjeron resultados comparables, el antígeno desacilado (G4) fue el mejor en comparación con el grupo control no tratado, probado. En los grupos vacunados después de la infección, el antígeno tratado con Con A más TLR 3, 4, 9 produjo los mejores resultados. Parece que es posible lograr una inmunidad protectora incluso después de la infección con esta composición.
Discusión Los resultados de estos experimentos muestran que la remoción o bloqueo de los antígenos de escape supresores inmunes o determinantes antigénicos a partir del agrupamiento del antígeno purificado por afinidad tiene efectos protectores marcadamente mejorados de la composición de vacuna. Además, la remoción de y la modificación química de las modificaciones post-transcripcionales que contienen azúcar (N-glicosilacíón) en los antígenos también lleva a una inmunidad protectora mejorada. Además, las porciones lipídicas en los antígenos se removieron químicamente o se bloquearon lo que también llevó a marcados efectos inmunes protectores. Los inventores han demostrado de nuevo que con modificaciones adecuadas del antígeno es posible modificar la respuesta inmune hacia la protección. Esto tiene una gran importancia en el desarrollo de métodos racionales para modular las respuestas inmunes. Subsecuentemente, los inventores han desarrollado un sistema in vitro para reproducir las respuestas inmunes respectivas en el cultivo de tejidos. Dicho sistema puede tener un valor pronóstico de manera que se produce la respuesta inmune por la composición inmunológicamente activa y así se puede acortar el ciclo de desarrollo del producto.
EJEMPLO 22 Estudios in vitro Se midió la secreción de TNF-a en PBMC preparadas a partir de sangre periférica y se trataron con peptidoglicano (PepG) (Sigma, St Louis, Ml), ADN CpG bacteriano (KM Bíomedicals, Aurora, OH; LPS < 0.2 UE/ml medido mediante el ensayo con lisado de amebocito de Limulus), o ambos. El TNF-a se midió mediante ELISA a partir del sobrenadante de cultivo después de 5 horas de incubación. El factor tisular (TF) en monocitos, representativo del sistema inmune innato, se evaluó a partir de los cultivos correspondientes de PBMC utilizados para el análisis de TNF-a. TF se extrajo a partir de las células adherentes con Tritón-X100 como se recomienda por el fabricante para el ELISA de TF (equipo Imubind, American Diagnostica, Greenwich, CT). Los resultados se muestran en las figuras 2A y 2B (los números después de P y D, respectivamente, indican las concentraciones de PepG y ADN bacteriano en µg/ml respectivamente; de izquierda a derecha, estos son P3+D15, P3+D5, P3+D1.5, P1 +D15, P1+D5, P1+D1.5, P0.3+D15, P0.3+D5, y P0.3+D1.5). El TNF-a secretado por PBMC (figura 2A) y el factor tisular (figura 2B) después del tratamiento con PepG (barra blanca), o ADN CpG bacteriano (barra negra), o ambos simultáneamente a la misma concentración como cuando se añaden solos (barra sombreada). Los números después de P y D, respectivamente, indican las concentraciones de PepG y ADN bacteriano en µg/ml respectivamente. P<0.05 para TNF-a y TF, cuando las comparaciones se realizaron entre la suma de los efectos de PepG (3 ó 1.5 µg/mL) y ADN CpG solo en todas las concentraciones evaluadas, y cuando PepG y el ADN bacteriano se añadieron juntos; prueba t de Student (n=4). Este es un experimento representativo de tres. Los presentes resultados demostraron la inducción concomitante de TNF-a y TF por PepG y el ADN bacteriano en PBMC, y un efecto sinergístíco entre las dos moléculas. Esto podría incluir los efectos directos en las rutas de señalización comunes cascada abajo, o los efectos indirectos mediados por los compuestos secretados después de la acción de PepG o el ADN bacteriano. El TNF-a es un mediador temprano importante de las respuestas del hospedero a los pirógenos y es el único mediador endógeno capaz de activar todo el espectro de la cascada de respuestas metabólicas, hemodinámícas, tisulares y de cítoquinas del choque séptico. Los efectos sinergísticos del ADN bacteriano y del PepG tienen implicaciones para la patogénesis de la sepsis, en donde cada molécula, aunque se encuentra presente a bajas concentraciones in vivo, probablemente amplifica el efecto de otra molécula, como se hipotetizó previamente.
Demostración de la inducción in vitro de las diferentes respuestas Th1 y Th2 mediante diferentes composiciones de partícula Las células mononucleares de sangre periférica se prepararon mediante separación en Ficoll de la sangre periférica a partir de voluntarios sanos. Las células mononucleares se sembraron a una densidad de 106 células/ml en 1.5 ml de RPMI-1640 (Irvine Scientific, Irvine, CA), suplementado con 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, glutamina 2M y 3% de suero de ternera fetal, y se incubaron con 0.15 mL de micropartículas (en PBS estéril) por 18 horas. Las micropartículas contenían antígenos a los que se les eliminó la Con A o que fueron tratados con peryodato de sodio así como los agonistas TLR 2, 3, 4 y 9 como se indica en la gráfica a continuación. La preparación de los lechos se describe en el ejemplo 19. Los resultados se muestran en la figura 3 (barra gris, TNF-a x 100, barra negra, IL-10) y en la figura 4, en donde se muestran las relaciones de TNF-a/IL-10. El análisis de la relación de TNF-a e IL-10 demostró que el antígeno carente de Con A co-inmobilizado con TLR 2, 4, 9 produjo la respuesta Th1 más marcada que se encontró que correlacionaba con los resultados in vivo (véase el ejemplo 19). Esta composición produjo de manera consistente el mayor efecto protector a la prueba micoplasmal en los animales.
EJEMPLO 23 Para caracterizar adicionalmente la respuesta celular a la micropartícula inmunomoduladora, los inventores expusieron las células dendríticas a dichas micropartículas. Los inventores han observado una sobre-regulación de las moléculas MHC I y MHC II y de la molécula coestimulante CD80 y CD86. La presencia de cualquier combinación del agonista PRR parece ser necesaria para medir un incremento en MHC II en la superficie de las células dendríticas después de 18 horas de tratamiento. Puesto que la presencia de MHC en la superficie de las células es un proceso dinámico, se puede necesitar un tiempo de incubación diferente con lechos de ConA Ag para observar un incremento en las moléculas MHC en la superficie celular. MHC permite la presentación de los antígenos a las células T y CD86 ¡nteractúa con CD28 en las células T. La presentación concomitante del antígeno por las células dendríticas y la interacción del ligando co-estimulante de B7 (tales como CD80 y CD86) resulta en la activación de la célula T. Estos datos in vitro indican que las micropartículas inducen cambios que son marcas distintivas de la maduración de las células dendríticas y que se requieren para la inducción de la inmunidad innata y adaptativa. La expresión de MHC I y MHC II así como de CD80 y CD86 en la superficie de las células dendríticas se determinó después de 18 horas de exposición a diferentes preparaciones de micropartícula: micropartículas control (control) a las cuales no se inmovilizado ningún antígeno o agonista PRR, y las micropartículas a las cuales los antígenos de M. gallisepticum carentes de antígenos de unión a ConA se inmovilizaron (ConA Ag) con o sin las siguientes combinaciones del agonista PRR: 1 ) PepG, LPS, ADN bacteriano (ADN bact) (ConA Ag + PRR 2, 4, 9) o 2) poli l:C, LPS, ADN bacteriano (ConA Ag + PRR 3, 4, 9). La inducción de MHC-II y de CD86 en las células dendríticas se muestra en la figura 5. Los resultados muestran el efecto de las mícropartículas sobre la secreción de TNF-a por las DCs. Las micropartículas control no indujeron una secreción detectable de TNF-a en el medio condicionado. Los otros tres tipos de micropartículas (antígenos de M. gallisepticum después de la carencia de los antígenos de unión a ConA y de los antígenos similares que coinmovilizaron con PepG, LPS, ADN bacteriano y poli l:C) indujeron una cantidad significativa de TNF-a por las DCs, en comparación con las micropartículas control. De manera interesante, la presencia de los compuestos bacterianos como inmunomoduladores generó menos TNF-a en comparación con los antígenos solos. Estos resultados indican que las micropartículas interactúan con las DCs y son capaces de activar los receptores TLRs y NOD para generar una respuesta fisiológica de conformidad con el efecto conocido de estas moléculas sobre las células del sistema inmune. Los inventores han demostrado que las micropartículas se pueden dirigir hacia las DCs.
EJEMPLO 24 Purificación de las proteínas de unión a heparina a partir de MG M. gallisepticum se creció como se describió en el ejemplo 2, y el micoplasma concentrado y lavado se inactivo como se describió en el paso 1 del ejemplo 4. Brevemente, a 75 ml de la proteína de membrana MG sin purificar se le añadió 0.75 Mega-10 y la solución se mezcló por 20 horas a temperatura ambiente. Subsecuentemente, se añadieron 3.75 ml de Tritón X-100 a la solución y se mezcló por otra hora a temperatura ambiente. La solución se centrifugó a 5,000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante se separó a partir del concentrado. Posteriormente, se añadieron 75 ml de regulador de pH con Tris (Tris 20 mM, NaCI 0.1 M, pH 7.2) al sobrenadante. La columna de Heparina-Actigel se equilibró con 5 volúmenes del lecho de regulador de pH con Tris a una velocidad de flujo de 3 ml/minuto. La solución de la proteína MG se cargó sobre la columna a una velocidad de flujo de 8-15 ml/minuto y el flujo a través se recolectó en una botella separada. La columna se lavó con 10 volúmenes del lecho de regulador de pH con Tris a una velocidad de flujo de 8-15 ml/minuto y se eluyó con un regulador de pH con Tris que contenía NaCI 2M a una velocidad de flujo de 8-15 ml/minuto. Después de lavar la columna con 10 volúmenes del lecho de regulador de pH con Tris, la solución de la proteína MG se re-aplicó a la columna y se repitió la elución como se mencionó anteriormente. Las eluciones se agruparon y se dialízaron en contra de regulador de pH con Tris utilizando un tubo para diálisis con límite de 3,500 de PM. El ensayo de proteína se llevó a cabo para determinar la concentración de las proteínas eluídas.
EJEMPLO 25 Purificación de la IgG a partir del suero neutralizante y preparación de la columna de inmunoafinidad La purificación en masa de IgG a partir de los sueros de pollo vacunados, neutralizados y la inmovilización en Actigel ALD se llevaron a cabo de conformidad con el ejemplo 3.
EJEMPLO 26 Digestión tríptica de las proteínas MG de unión a heparina unidas a una columna de inmunoafinidad Dos mg de la proteína MG purificada se añadieron a una columna de inmunoafinidad de 2 ml y se dejaron unir por 15 minutos. La columna se lavó con 10 ml de regulador de pH B con Tris (Tris 50 mM, pH 7.5, NaCI 0.1 M). Se añadió solución de tripsina, 20 µg/ml en regulador de pH B con Tris, y la pasta aguada se agitó suavemente por 1 hora a 37°C. Los fragmentos y la enzima libre se lavaron con regulador de pH B con Tris y los péptidos unidos se eluyeron con citrato 0.1 M, pH 2.5. El eluído se neutralizó subsecuentemente con NH4OH cc, se concentró y se purificó en una columna para centrifugación de fase reversa C-18 (Pierce) y se analizó mediante MALDI-TOF para composición del péptido.
EJEMPLO 27 Digestión tríptica de las proteínas MG de unión a heparina unidas a una columna de heparina Dos mg de proteína MG purificada se añadieron a 2 ml de columna de Heparina Actigel y se dejaron unir por 1 hora. La columna se lavó con 10 ml de regulador de pH B con Tris. Se añadió la solución de tripsina, 20 µg/ml en regulador de pH B con Tris, y la pasta aguada se agitó suavemente por 1 hora a 37°C Los fragmentos se lavaron con regulador de pH B con Tris y los péptidos unidos se eluyeron con regulador de pH B con Tris que contenía NaCI 1 M. El eluído se concentró y se purificó en una columna para centrifugación de fase reversa C-18 (Pierce) y se analizó mediante MALDI-TOF para composición del péptido.
EJEMPLO 28 Purificación e inmovilización de la proteína C1q La purificación de C1q se llevó a cabo siguiendo el método de McKay, EJ: A simple two-step procedure for the purification of plasma C1q from different animal specíes. Immunol Letters 1981 , 3: 303-308. C1q purificada se inmovilizó en Aminogel (Sterogene Bioseparations, Inc., Carlsbad CA) a 3 mg/ml mediante adaptación del procedimiento de los inventores descrito en la patente de E.U.A. 5,801 ,063.
EJEMPLO 29 Purificación e inmovilización de la IgG de unión al complemento Los anticuerpos policlonales neutralizantes purificados de conformidad con el ejemplo 24 se aplicaron a una columna de 10 ml de C1q inmovilizada, equilibrada en regulador de pH B con Tris y se dejaron unir por 30 minutos. Los anticuerpos no unidos se removieron mediante lavado con 10 volúmenes del lecho de regulador de pH B con Tris y los anticuerpos unidos se eluyeron con el mismo regulador de pH que contenía NaCI 1 M. La IgG purificada se inmovilizó subsecuentemente a Actigel ALD a 3 mg/ml.
EJEMPLO 30 Digestión tríptica de las proteínas MG activadoras del complemento unidas a una columna de inmunoafinidad M. gallisepticum se creció como se describió en el ejemplo 2, y el micoplasma concentrado y lavado se inactivo como se describió en el paso 1 del ejemplo 4. A una columna de 10 ml de anticuerpo inmovilizado activador del complemento, se le aplicaron 30 ml de lisado MG a 3 ml/minuto. La columna se lavó con 20 volúmenes del lecho de regulador de pH B con Tris a una velocidad de flujo de 8 ml/minuto para remover las proteínas no específicamente adsorbidas. Se añadió la solución de tripsina, 20 µg/ml en regulador de pH B con Tris, y la pasta aguada se agitó suavemente por 1 hora a 37°C. Los fragmentos se removieron mediante lavado con regulador de pH B con Tris y los péptidos unidos se eluyeron con citrato 0.1 M, pH 2.5. El eluído se neutralizó subsecuentemente con NH4OH cc, concentrado y purificado en una columna para centrifugación de fase reversa C-18 (Pierce) y se analizó mediante MALDI-TOF para composición peptídica. Se muestra que un ejemplo de un péptido ¡nmunológicamente activo tiene la siguiente composición: Lys-Leu-Ala-Leu-Thr-Ser-Glu-lle-Thr-Glu-Glu-lle-Tyr-Pro-Ser-Ala-Pro-Lys-Val-Ser-Arg-Lys-GIn-Arg-Gly-Val-His-Gly-Phe-Ser-Glu-Pro-Thr-Ser (SEQ ID NO: 1 ). De manera importante, este péptido contiene el dominio de unión a GAG/heparina de Arg-Lys-GIn-Arg. Otra secuencia útil es Leu-Leu-Ala-Lys-Lys-Thr-Asp-Lys-Ser-Val-Ser-Pro-Gln-Ala-Ser-Leu-Thr (SEQ ID NO: 2). Estas secuencias se pueden conectar medíante un péptído enlazador que contiene sitios de escisión para las endoproteinasas. Un ejemplo de dicha secuencia enlazadora es LIKFRSN (Leu-lle-Lys-Phe-Arg-Ser-Asn) (SEQ ID NO: 3). Otras secuencias enlazadoras se conocen en la técnica.
EJEMPLO 31 Síntesis de los epítopes del péptido antigénico y péptidos con múltiples epítopes Los péptidos antigénícos se sintetizaron mediante el método FMOC.
EJEMPLO 32 Confirmación de los péptidos antigénicos protectores para la vacuna Los péptidos antígénícos se mezclaron con los sueros neutralizantes de pollos vacunados y se determinó la inhibición de la unión a la heparina inmovilizada mediante un ELISA competitivo. Se adsorbió una muestra peptídica a los pozos de las placas para ELISA. Subsecuentemente, los pozos se bloquearon con la solución para bloqueo y los anti-sueros inmunes y no inmunes control se añadieron subsecuentemente dentro de los pozos y se incubaron durante toda la noche a 4°C. Las proteínas no específicas se removieron mediante una solución para lavado seguido por la adición de heparina marcada con biotina a 100 µg/ml diluida en el regulador de pH para bloqueo por 1 hora. Después de los lavados en 3 ocasiones por 10 minutos cada uno de la heparina no unida, se añadió peroxídasa marcada con estreptavidina diluida a una relación de 1 :3,000 en regulador de pH para bloqueo por 1 hora. Se removió el exceso de conjugado mediante lavados en 3 ocasiones por 10 minutos cada uno con regulador de pH para lavado y se desarrolló el color mediante la adición de una solución de 3,3'-diamínobencidina. La señal es inversamente proporcional a la presencia de los anticuerpos neutralizantes.
EJEMPLO 33 El análisis bioinformático de las proteínas antigénicas de los patógenos también puede llevar a la identificación de epítopes con altos potencíales antigénicos. Dicho análisis se ha llevado a cabo para la proteína MGA de M. gallísepticum. Las regiones antigénícas se analizaron adicionalmente en el contexto de motivos básicos lineales. Un ejemplo de dicho motivo lineal pronosticado altamente antigénico es la secuencia: un epítope MHC I de 10 elementos es LLAKKTDKSV (SEQ ID NO: 4), mientras que una MHC II de 15 elementos es LLAKKTDKSVSPAQAS (SEQ ID NO: 5). Estos dominios se identificaron por el método SYFPEITHI (www.syfpeithi.de). Esto demuestra que los motivos básicos lineales se incluyen de hecho dentro de sitios de alta propensión antigénica. El análisis bioinformático se puede llevar a cabo mediante técnicas conocidas en la técnica tales como aquellas descritas en J. Pevsner, "Bioinformatícs and functional Genomics" (Wiley-Liss, Hoboken, N.J., 2003), utilizando bases de datos y técnicas de análisis por computadora para extracción de datos y coincidencia y comparación de las secuencias conocidas en la técnica.
EJEMPLO 34 Purificación de los anticuerpos anti-epítope Los péptidos antigénícos identificados se sintetizan con una marca de biotina terminal. Los péptidos marcados con biotina se inmovilizaron a una concentración de 1 mg/ml de Avídina Actígel (Sterogene Bioseparatíons, Inc., Carlsbad CA). Los anticuerpos neutralizantes a partir de pollos vacunados se añadieron a una concentración de saturación y las proteínas no específicamente unidas se removieron medíante lavado con solución salina con pH regulado con fosfato (PBS), pH 7.2. El anticuerpo específicamente unido se eluyó con medio para elución Actisep (Sterogene Bioseparations, Inc., Carlsbad CA).
Ventajas de la invención La presente invención provee composiciones mejoradas moduladoras inmunes y métodos que pueden ser adaptados, por ejemplo, para inducir una respuesta inmune, para producir una respuesta inmune protectora, o para producir tolerancia. Estas composiciones son estables y se pueden preparar con un amplio intervalo de inmunógenos y moléculas objetivo con el objeto de producir el efecto deseado en la respuesta inmune. Estas proveen rutas de administración que se encuentran además de la administración parenteral para dichos agentes. Estos previenen la degradación prematura o liberación de los inmunógenos y moléculas objetivo. Las partículas tienen propiedades mucoadhesivas intrínsecas que pueden mejorar su interacción con las membranas mucosales y facilitar la toma. Estas no requieren adyuvantes adicionales. Los métodos y composiciones de conformidad con la presente invención utilizan el papel de la N-glicosilación (manosilación) en el escape inmune para prevenir que ocurra el escape inmune mediante la eliminación de los epítopes de escape apropiados a partir de las composiciones que se pretenden utilizar como vacunas. Estos también utilizan la identificación de los motivos de unión lineal de glicosaminoglicano/heparina y los métodos para interferir con dicha unión. Los métodos y composiciones de conformidad con la presente invención utilizan adicionalmente un método que se ha desarrollado para identificar epítopes que activan el complemento. Adicíonalmente, los métodos y composiciones de conformidad con la presente invención utilizan el descubrimiento de que el uso de varios agonistas TLR mejora en gran medida la respuesta inmune. Todos los antígenos y agonistas TLR se pueden dirigir a una célula particular en el sistema linfoide mucosal. Otro aspecto mejorado de la invención es el uso de epítopes sintéticos de la célula T y de la célula B en una partícula única. Las invenciones descritas de manera ilustrativa en la presente invención se pueden practicar adecuadamente en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no específicamente descritos en la presente invención. Por lo tanto, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. se deben leer de manera expansiva y sin limitación. Adicíonalmente, los términos y expresiones empleados en la presente invención han sido utilizados como términos de descripción y no de limitación, y no se pretende el uso de dichos términos y expresiones para excluir cualquier equivalente del futuro que se muestre y describa o cualquier porción de los mismos, y se reconoce que diversas modificaciones son posibles dentro del alcance de la invención reclamada. Por lo tanto, se debe entender que aunque la presente invención ha sido específicamente descrita por las modalidades preferidas y características opcionales, se puede recurrir a la modificación y variación de las invenciones descritas en la presente invención por aquellos expertos en la técnica, y que dichas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de las invenciones aquí descritas. Las invenciones se han descrito de manera amplia y genérica en la presente invención. Cada una de las especies y agrupamientos subgenéricos más estrechos que caen dentro del alcance de la descripción genérica también forman parte de estas invenciones. Esto incluye la descripción genérica de cada invención con una condición o limitación negativa removiendo cualquier material sujeto a partir del género, sin importar si o no los materiales escindidos residieron específicamente en éste. Además, en donde se describen las características o aspectos de una invención en términos del grupo Markush, aquellos expertos en la técnica reconocerán que le invención también se describe así en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.
También se debe entender que se pretende que la descripción anteriormente mencionada sea ilustrativa y no restrictiva. Muchas modalidades serán evidentes a aquellos expertos en la técnica después de la revisión de la descripción anteriormente mencionada. Por lo tanto, el alcance de la invención se debe determinar no con referencia a la descripción precedente, sino más bien se debe determinar con referencia a las reivindicaciones anexas, junto con el alcance total de los equivalentes intitulados por dichas reivindicaciones. Las descripciones de todos los artículos y referencias, incluyendo publicaciones de patente, se incorporan en la presente invención como referencias.

Claims (106)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una composición inmunológicamente activa para inducir inmunidad protectora, la composición comprendiendo: (a) al menos un patrón molecular asociado al patógeno; (b) opcionalmente, al menos un antígeno inmune activo o epítope antígénico; y (c) al menos un vehículo efectivo para administrar la composición a un organismo de manera que se induce así la inmunidad protectora.
2.- La composición inmunológícamente activa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende al menos un antígeno inmune activo o epítope antigénico.
3.- Una composición inmunológícamente activa para inducir tolerancia, la composición comprendiendo: (a) al menos un patrón molecular asociado al patógeno; (b) al menos un epítope antígénico inmune activo; y (c) al menos un vehículo efectivo para administrar la composición a un organismo de manera que se induce así la tolerancia.
4.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque al menos un epítope antigénico inmune activo no es un epítope de escape.
5.- La composición de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo es un péptido, proteína, un péptido recombinante o multi-péptido, una proteína recombinante, lípido, carbohidrato, ácido nucleico u otra molecular bioactiva o una combinación de cualquiera de éstas.
6.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína y en donde el péptído o proteína posee motivos moduladores inmunes.
7.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antígénico inmune activo es un péptido o proteína y en donde el péptído o proteína posee motivos inmunomoduladores que son hidrófobos en naturaleza y tienen moléculas adicionales unidas a ellos.
8.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antígénico inmune activo es un péptido o proteína y en donde el péptído o proteína posee motivos que son hidrófobos en naturaleza y tienen moléculas adicionales unidas a ellos, las cuales interactúan con el receptor.
9.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antígénico inmune activo es un péptido o proteína y en donde el péptido o proteína posee modificaciones post-transcripcíonales moduladoras inmunes.
10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque las modificaciones post-transcripcíonales incluyen porciones carbohidrato y/o lípido.
11.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque las modificaciones post-transcripcionales contienen manosilación terminal.
12.- La composición de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque las sustancias terminalmente manosíladas moduladoras inmunes carecen de la composición protectora inmune.
13.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque las sustancias inmunes activas terminalmente manosiladas son agotadas a partir de la composición por un paso oxidativo.
14.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque las sustancias inmunes activas terminalmente manosiladas son agotadas a partir de la composición mediante tratamiento enzimático.
15.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque las sustancias inmunes activas termínalmente manosiladas son agotadas a partir de la composición mediante unión por afinidad específica al azúcar.
16.- La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque las modulaciones post-transcripcíonales incluyen porciones lipídicas y en donde las porciones lipídicas se remueven mediante delipidación.
17.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína y en donde el péptido inmune activo o proteína no tiene modificaciones post-transcripcionales moduladoras inmunes.
18.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína y en donde el péptido inmune activo o proteína no posee secuencias de aminoácidos capaces de llevar a cabo N-glicosílación y/o lípoilación.
19.- La composición de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína y en donde la proteína inmune activa o péptido posee secuencias de aminoácidos capaces de unirse a los receptores de entrada a la superficie celular.
20.- La composición de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizada además porque el epítope antígénico inmune activo es un péptido o proteína y en donde la proteína inmune activa o péptido posee secuencias de aminoácidos capaces de unirse a los glicosaminoglicanos de superficie celular (GAGs).
21.- La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque las secuencias de aminoácidos son polibásicas en naturaleza. 22.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque las secuencias de aminoácidos tienen la fórmula general de XBBXBX, XBBBXXBX, BBXXBBBXXBB, BBBXXB,
BXBXB, BBB, BXBXXXBXB, o BXBXXXXXBXB en donde B es un aminoácido básico y X es cualquier otro aminoácido.
23.- La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque las secuencias de aminoácidos para unión a GAG se utilizan para generar anticuerpos al péptído o proteína que son capaces de interferir con la unión del patógeno a las superficies celulares.
24.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo se utiliza para generar anticuerpos al epítope capaces de interferir con la unión del patógeno a los receptores de entrada a la célula.
25.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo se utiliza para generar anticuerpos al epítope capaces de interferir con la unión del patógeno a través de los GAGs a las superficies celulares.
26.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo se utiliza para generar anticuerpos al epítope capaces de interferir con la unión del patógeno a través de los GAGs a los receptores de entrada.
27.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque las secuencias de aminoácidos polibásicos dirigen el bloqueo de un receptor de entrada.
28.- La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque los anticuerpos a las secuencias de aminoácidos polibásicos bloquean un receptor de entrada.
29.- La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el receptor de entrada es un glicosaminoglícano (GAG).
30.- La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el receptor de entrada es un receptor que resulta en el escape inmune.
31.- La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el receptor de entrada es un DC-SEÑAL.
32.- La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque el péptido antigénico inmune activo o proteína posee secuencias de aminoácidos capaces de unirse a un GAG seleccionado a partir del grupo que consiste de heparina y sus análogos.
33.- La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque el péptido antigénico inmune activo o proteína posee actividad para activación del complemento, sola o en combinación con anticuerpos.
34.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antígénico inmune activo es una pluralidad de péptidos que se combinan en un multi-péptído particular.
35.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo se utiliza para inducir anticuerpos capaces de interferir con la entrada dentro de la célula.
36.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo se utiliza para inducir anticuerpos capaces de unirse y activar el complemento
37.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo incluye cualquier o ambos epítopes de la célula T y epítopes de la célula B.
38.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína y es capaz de inducir anticuerpos que pueden interferir con la unión de las secuencias de N-glicosilación y/o lipoílación a sus receptores en el hospedero.
39.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antígénico inmune activo es un péptido o proteína y es capaz de inducir anticuerpos que pueden interferir con la unión de las secuencias de N-glicosilación y/o lipoilación a D-SEÑAL, R-SEÑAL o a receptores similares en el hospedero.
40.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el epítope antigénico inmune activo es un péptido o proteína y es capaz de inducir anticuerpos que pueden interferir con la unión de las secuencias de N-glicosilación y/o lipoilación a sus receptores en el hospedero y previenen o reducen la producción de IL-10.
41.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizada además porque el patrón molecular asociado al patógeno se selecciona a partir del grupo que consiste de: (a) un agonista del receptor TLR 1 ; (b) un agonista del receptor TLR 2; (c) un agonista del receptor TLR 3; (d) un agonista del receptor TLR 4; (e) un agonista del receptor TLR 5; (f) un agonista del receptor TLR 6; (g) un agonista del receptor TLR 7; (h) un agonista del receptor TLR 8; (i) un agonista del receptor TLR 9; (j) un agonista NOD-1 ; (k) un agonista NOD-2; (I) DC-SEÑAL; (m) L-SEÑAL; y (n) un receptor de mannosa.
42.- La composición de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque el patrón molecular asociado al patógeno es un agonista NOD-1 o un agonista NOD-2 y el agonista NOD-1 o agonista NOD-2 se selecciona a partir del grupo que consiste de peptidoglicano bacteriano y un derivado de peptidoglicano bacteriano.
43.- Un método para identificar péptidos inmunes activos capaces de inducir anticuerpos que pueden interferir con la unión del receptor de entrada de los patógenos que comprende los pasos de: (a) llevar a cabo la adsorción de GAG; (b) llevar a cabo la selección por inmunoafínidad; y (c) opcionalmente, llevar a cabo la digestión proteolítica de una proteína o proteínas aisladas mediante selección por ¡nmunoafinidad para generar los péptidos inmunes activos.
44.- Un método para identificar péptidos inmunes activos capaces de inducir anticuerpos que se pueden identificar con la unión a glicosaminoglicano de patógenos que comprende los pasos de: (a) llevar a cabo la adsorción de GAG; (b) llevar a cabo la selección por inmunoafinidad; y (c) opcionalmente, llevar a cabo la digestión proteolítíca de una proteína o proteínas mediante selección por inmunoafinidad para generar los péptidos inmunes activos.
45.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque el paso de llevar a cabo la adsorción de GAG se lleva a cabo mediante la realización de la adsorción de heparina.
46.- Un método para identificar péptidos inmunes activos que son motivos de entrada capaces de interferir con la unión a glicosaminoglícano de patógenos que comprende los pasos de: (a) llevar a cabo la adsorción de heparina; (b) llevar a cabo la selección por inmunoafinidad; y (c) analizar los datos de secuencia utilizando un método de análisis bioinformático utilizando motivos lineales polibásicos para la identificación de motivos de entrada.
47.- Un método para la identificación de proteínas inmunes activas y/o péptidos capaces de inducir anticuerpos que activan el complemento que comprende los pasos de: (a) llevar a cabo la unión de los anticuerpos que se fijan al complemento a una proteína del complemento; (b) utilizar los anticuerpos para selección por inmunoafinidad de los antígenos proteicos; y (c) opcionalmente, llevar a cabo la digestión proteolítíca de los antígenos proteicos aislados.
48.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , 2, o 3, caracterizada además porque las moléculas están presentes como una mezcla.
49.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , 2, o 3, caracterizada además porque las moléculas están químicamente enlazadas.
50.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , 2, o 3, caracterizada además porque las moléculas están químicamente enlazadas en la forma de una partícula.
51.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , 2, o 3, caracterizada además porque las moléculas están químicamente incorporadas dentro de un vehículo.
52.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , 2, o 3, caracterizada además porque el vehículo es una partícula.
53.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , 2, o 3, caracterizada además porque el vehículo es una micropartícula.
54.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque las micropartículas tienen un estrecho intervalo de distribución de tamaño.
55.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque las mícropartículas son porosas.
56.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque las mícropartículas son menores de aproximadamente 10 µm de diámetro.
57.- La composición de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada además porque las micropartículas son menores de aproximadamente 5 µm de diámetro.
58.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque las micropartículas están hechas de un polímero.
59.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque las micropartículas están hechas de un biopolímero.
60.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque los epítopes antigénicos inmunes activos no están covalentemente unidos a las micropartículas.
61.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque los epítopes antígénicos inmunes activos están covalentemente unidos a las micropartículas.
62.- El uso de una composición que comprende al menos un epítope antígénico inmune activo y al menos un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociado con micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o tienen el mismo intervalo de tamaño que un patógeno, para la elaboración de un medicamento útil para inducir una respuesta inmune en un sujeto.
63.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde la composición comprende más de un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno.
64.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde se reducen los números del patógeno en los animales infectados o el patógeno es eliminado.
65.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde se bloquea la entrada del patógeno dentro de las células.
66.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde los epítopes incorporados pueden generar bloqueo del anticuerpo (neutralización).
67.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 66, en donde el bloqueo del anticuerpo (neutralización) puede activar el complemento.
68.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde el bloqueo de los epítopes, que puede interferir con la unión del patógeno o partes de un patógeno a una proteína o receptor que puede inducir IL-10, produce inmunidad protectora.
69.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde el bloqueo de los epítopes resulta en producción reducida de IL-10.
70.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde el medicamento es útil para eliminar una infección establecida.
71.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque más de un epítope antígénico inmune activo y más de un agonista del receptor para reconocimiento del patrón se asocian con las micropartículas.
72.- La composición de conformidad con la reivindicación 71 , caracterizada además porque más de un epítope antígénico inmune activo incluye cualquier o ambos epítopes de la célula T y epítopes de la célula B.
73.- La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque más de un agonista del receptor para reconocimiento del patrón se asocia con las micropartículas.
74.- El uso de una composición que comprende al menos un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociado con micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o tienen el mismo intervalo de tamaño que un patógeno, para la elaboración de un medicamento útil para inducir una respuesta inmune en un sujeto.
75.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 62 o 74, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable vía una ruta mucosal.
76.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 62 o 74, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable vía una ruta parenteral.
77.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 62 o 74, en donde el medicamento está adaptado para ser adminístrable vía una ruta dermal.
78.- El uso de una composición que comprende uno o más epítopes antigénicos inmunes activos y una combinación de agonistas del receptor PR asociados con micropartículas, para la elaboración de un medicamento útil para inducir una respuesta inmune protectora a al menos un patógeno, en donde dichas micropartículas son más pequeñas que o tienen el mismo intervalo de tamaño que el patógeno, la respuesta inmune comprende respuestas Th1 o Th2 o una combinación de ambas y en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en una dosis particular o en múltiples dosis.
79.- El uso de una composición que comprende uno o más epítopes antigénicos inmunes activos, excluyendo antígenos que participan en mecanismos de escape inmunológíco, y una combinación de agonistas del receptor PR asociados con mícropartículas, para la elaboración de un medicamento útil para inducir una respuesta inmune protectora a al menos un patógeno, en donde dichas micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que el patógeno y en donde el medicamento está adaptado para ser adminístrable en una dosis particular o en múltiples dosis.
80.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 79, en donde el patógeno es un patógeno intracelular.
81.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 79, en donde el patógeno puede ocasionar infección latente.
82.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 79, en donde el patógeno es un micoplasma.
83.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 82, en donde el micoplasma es un micoplasma de pollo.
84.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 83, en donde el micoplasma es Mycoplasma gallisepticum.
85.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, 74, 78, o 79, en donde la respuesta inmune interfiere con los elementos de unión al receptor de entrada en un microorganismo patogénico.
86.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, 74, 78, o 79, en donde la respuesta inmune interfiere con los elementos de unión a glícosaminoglicano en un microorganismo patogénico.
87.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, 74, 78, o 79, en donde la respuesta inmune elimina las células infectadas con el patógeno.
88.- El uso de una composición que comprende uno o más agentes inmunes activos y un agonista del receptor PR asociados con micropartículas, para la elaboración de un medicamento útil para inducir una respuesta inmune tolerante a una molécula, proteína, o patógeno, en donde las micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que el patógeno y la respuesta inmune comprende una respuesta Th reg, y en donde el medicamento está adaptado para ser administrable en una dosis particular o en múltiples dosis.
89.- El uso de una composición que comprende uno o más epítopes antígénicos inmunes activos y una combinación de un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociados con micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que un patógeno, para la elaboración de un medicamento útil para inducir tolerancia a un agente inmunológicamente activo, en donde la respuesta inmune comprende la inducción de una respuesta reguladora o subregulación de las funciones inmunes o el escape inmune.
90.- El uso de una composición que comprende uno o más epítopes antigénicos inmunes activos y una combinación de un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociados con micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que un patógeno, para la elaboración de un medicamento útil para inducir tolerancia a un agente inmunológicamente activo en donde la respuesta inmune resulta en un incremento en la producción de IL-10.
91.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 89, en donde la composición incluye un epítope antígénico inmune activo que tiene una porción hidrófoba.
92.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 91 , en donde la porción hidrófoba es una porción que contiene lípido.
93.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 89, en donde la composición incluye un epítope antígénico inmune activo que tiene una porción hidrófoba que tiene otras moléculas unidas a ésta.
94.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 93, en donde la porción inmunológicamente activa que contiene lípido se une a las micropartículas independientemente del epítope antigénico inmune activo.
95.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 92, en donde la porción inmunológicamente activa que contiene lípido tiene constituyentes de carbohidrato.
96.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 95, en donde los constituyentes de carbohidrato son el resultado de la N-glicosilación.
97.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 90, en donde el epítope antigénico inmune activo comprende motivos incluyendo al menos un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de asparagina, treonina y serina en donde los motivos son los motivos Asp-X-Ser o Asp-X-Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina.
98.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 90, en donde el epítope antigénico inmune activo comprende motivos incluyendo al menos un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de asparagina, treonina y serina en donde los motivos son los motivos Asp-X-Ser o Asp-X-Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina y los motivos están bloqueados por el anticuerpo.
99.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 90, en donde el epítope antigénico inmune activo comprende motivos incluyendo al menos un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de asparagina, treonina y serina en donde los motivos son los motivos Asp-X-Ser o Asp-X-Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina, y en donde el epítope es un epítope de escape que no se utiliza en una formulación de vacuna.
100.- El uso de una composición que comprende al menos un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociado con micropartículas, en donde las mícropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que un patógeno, para la elaboración de un medicamento útil para producir un animal sustancialmente libre de patógeno.
101.- El uso de una composición que comprende al menos un epítope antígénico inmune activo y al menos un agonista del receptor para reconocimiento del patógeno (PR) asociado con micropartículas, en donde las micropartículas son más pequeñas que o se encuentran en el mismo intervalo de tamaño que un patógeno, para la elaboración de un medicamento útil para producir un animal sustancialmente libre de patógeno.
102.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 100 o 101 , en donde una respuesta inmune inducida por la composición interfiere con una entrada de un microorganismo patogénico dentro de una célula objetivo.
103.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 100 o 101 , en donde una respuesta inmune inducida por la composición interfiere con los elementos de unión a glicosaminoglícano en un microorganismo patogénico.
104.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 100 o 101 , en donde el animal es un ave de corral.
105.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 104, en donde el animal es un pollo.
106.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 100 o 101 , en donde el animal es un mamífero.
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