ES2575395T3 - Composiciones para la transfección de células - Google Patents
Composiciones para la transfección de células Download PDFInfo
- Publication number
- ES2575395T3 ES2575395T3 ES08800135.9T ES08800135T ES2575395T3 ES 2575395 T3 ES2575395 T3 ES 2575395T3 ES 08800135 T ES08800135 T ES 08800135T ES 2575395 T3 ES2575395 T3 ES 2575395T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dna
- cells
- tlr
- compound
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 87
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 37
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 10
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 73
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 73
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 73
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 claims description 19
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 claims description 15
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- UPAQRWMRKQCLSD-HTIIIDOHSA-N 2,3-dipalmitoyl-S-glycerylcysteine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(CSC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC UPAQRWMRKQCLSD-HTIIIDOHSA-N 0.000 claims description 14
- 108010038122 S-(2,3-bis(palmitoyloxy)propyl)cysteine Proteins 0.000 claims description 14
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 108010084333 N-palmitoyl-S-(2,3-bis(palmitoyloxy)propyl)cysteinyl-seryl-lysyl-lysyl-lysyl-lysine Proteins 0.000 claims 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 124
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 108
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 108
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 9
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 8
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 7
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 7
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 7
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 101100481584 Mus musculus Tlr1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 4
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 4
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 3
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000008228 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 3
- 108010060888 Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 3
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 150000001767 cationic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- DMWMUMWKGKGSNW-OPMCLZTFSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-4-amino-2-[[2-[[(2R)-2-amino-3-[(2R)-2,3-di(hexadecanoyloxy)propyl]sulfanylpropanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](CSC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC DMWMUMWKGKGSNW-OPMCLZTFSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 2
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000202952 Mycoplasma fermentans Species 0.000 description 2
- -1 N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium -hexafluorophosphate Chemical compound 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 2
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108010060804 Toll-Like Receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100039390 Toll-like receptor 7 Human genes 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 108010051618 macrophage stimulatory lipopeptide 2 Proteins 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHKWIGHJGOEUSM-UHFFFAOYSA-N 3h-imidazo[4,5-h]quinoline Chemical class C1=CN=C2C(N=CN3)=C3C=CC2=C1 RHKWIGHJGOEUSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 241000498849 Chlamydiales Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000669402 Homo sapiens Toll-like receptor 7 Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 241000722363 Piper Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 101150082427 Tlr4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010060825 Toll-Like Receptor 7 Proteins 0.000 description 1
- 108010060752 Toll-Like Receptor 8 Proteins 0.000 description 1
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102000008229 Toll-like receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010060889 Toll-like receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008234 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010060812 Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100033110 Toll-like receptor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100033117 Toll-like receptor 9 Human genes 0.000 description 1
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000002153 concerted effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003074 decanoyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006275 endogenous TLR ligand Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002801 octanoyl group Chemical group C(CCCCCCC)(=O)* 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003909 pattern recognition Methods 0.000 description 1
- 108010043655 penetratin Proteins 0.000 description 1
- MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N penetratin Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 MCYTYTUNNNZWOK-LCLOTLQISA-N 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000005134 plasmacytoid dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- LAUTYQLKZCDSJO-JPZSKESBSA-N rev arm Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCC(O)=O)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(N)=O)=CNC2=C1 LAUTYQLKZCDSJO-JPZSKESBSA-N 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000003696 stearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- PBKWZFANFUTEPS-CWUSWOHSSA-N transportan Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 PBKWZFANFUTEPS-CWUSWOHSSA-N 0.000 description 1
- 108010062760 transportan Proteins 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1075—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of amino acids or peptide residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
- A61K2039/622—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier non-covalent binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/855—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from receptors; from cell surface antigens; from cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Compuesto que comprende un péptido ramificado cargado positivamente que comprende al menos cuatro residuos de arginina o al menos cuatro residuos de lisina, en donde el péptido está unido a al menos un ligando del receptor tipo Toll (TLR) que se une a TLR-2 y en donde dicho compuesto es capaz de formar un complejo estable con ADN.
Description
DESCRIPCION
Composiciones para la transfeccion de celulas 5 Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se refiere, en conjunto, al campo de biologfa celular. Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo de transfeccion de celulas, en particular celulas dendnticas, y a un metodo de provocacion de una respuesta inmunitaria. Para este fin, la presente invencion proporciona compuestos
10 que comprenden al menos un grupo cargado positivamente como se define por las reivindicaciones, capaz de unirse a acidos nucleicos, unido a un residuo capaz de interaccionar con uno o mas miembros de la familia del receptor tipo toll (TLR).
Antecedentes de la invencion
15
[0002] Como se usa en la presente memoria, la expresion "derivado de" debe adoptarse que indicando un entero especificado puede obtenerse de una fuente particular, aunque no necesariamente de forma directa de esa fuente.
[0003] Durante toda la memoria, salvo que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende", o variaciones 20 tales como "comprenden" o "que comprende", se entendera que implican la inclusion de una etapa o elemento
indicado o entero o grupo de etapas o elementos o enteros, pero no la exclusion de ninguna otra etapa o elemento o entero o grupo de elementos o enteros.
[0004] Los expertos en la materia apreciaran que la invencion descrita en la presente memoria es susceptible a 25 variaciones y modificaciones diferentes a las descritas espedficamente.
[0005] La presente invencion no debe limitarse en su alcance por los ejemplos especificados descritos en la presente memoria. Se describen en la presente memoria productos, composiciones y metodos funcionalmente equivalentes.
30
[0006] La presente invencion se realiza sin experimentacion excesiva usando, salvo que se indique de otro modo, tecnicas convencionales de biologfa molecular, microbiologfa, virologfa, tecnologfa de ADN recombinante, smtesis de peptidos en solucion, smtesis de peptidos en fase solida, e inmunologfa. Dichos procedimientos se describen, por ejemplo, en los siguientes textos:
35
1. Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Segunda Edicion (1989), Volumenes I, II, y III al completo;
2. DNA Cloning: A6 Practical Approach, Vol. I y II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, todo el texto;
3. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, todo el texto, y 40 particularmente los artmulos en el mismo por Gait, pag. 1-22; Atkinson et al., pag. 35-81; Sproat et al., pag. 83115; y Wu et al., pag. 135-151;
[0007] Referencias a cualquier tecnica anterior en esta memoria no se adopta, y no debe adoptarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta tecnica anterior forme parte del conocimiento general
45 comun en Australia.
[0008] El suministro de moleculas tales como lfpidos, protemas, peptidos, ADN, polisacaridos y/o combinaciones de los mismos (por ejemplo, lipopolisacaridos, lipoprotemas), en celulas es util para una multitud de propositos de investigacion y clmicos. Por ejemplo, para que los investigadores estudien procesos intracelulares tales como la
50 regulacion y expresion genica, las interacciones ADN-protema o interacciones protema-protema, y similares, a menudo es esencial introducir moleculas en celulas, y es deseable hacerlo con una eficacia lo mas alta posible. Actualmente los investigadores suministran moleculas a las celulas, es decir, transfectan celulas, mediante una diversidad de medios con eficacia variable. La eficacia de transfeccion de celulas depende de varios factores incluyendo el tipo de celula, la tasa y fase de division celular, y las propiedades individuales de las moleculas a 55 transfectarse, asf como el uno o mas reactivos de transfeccion.
[0009] Se cree que las vacunas de ADN provocan una respuesta inmunitaria mediante la captacion de ADN por celulas presentadoras de antfgeno tales como celulas dendnticas (DC), que posteriormente expresan el antfgeno codificado por el ADN internalizado y presentan el antfgeno al sistema inmunitario como peptidos en el contexto de
60 moleculas MHC. En modelos de animales pequenos, la administracion de ADN ha sido satisfactoria en la induccion de respuestas inmunitarias protectoras, pero se ha informado de eficacias solamente bajas en ensayos clmicos humanos, requiriendo a menudo altas dosis de ADN para inducir respuestas inmunitarias responses (Kutzler, M.A. y Weiner, D.B. 2004 J Clin Invest, 114(9), 1241-1244). Se han usado adenovirus y retrovirus como vectores para suministro genico, sin embargo, existen cuestiones en relacion a la seguridad de estos vectores para uso en seres 65 humanos use (Buckley, R.H. 2002 Lancet, 360(9341), 1185-1186). Hasta la fecha, la transfeccion de DC con
vectores relativamente seguros, no vfticos, ha demostrado ser diffcil.
[0010] Lau Y. et al. (Lipid-containing mimetics of natural triggers of innate immunity as CTL-inducing influenza vaccines. International Immunity (2006) Vol. 18, N.° 12, 1801-1813) examinaron diferentes estructuras lipfdicas de
5 fuentes bacterianas o no bacterianas acopladas a peptidos que representan epftopos vmcos de influenza reconocidos por celulas T CD8+ y CD4+.
[0011] RiedI P. et al. (Peptides containing antigenic and cationic domains have enhanced, multivalent immunogenicity when bound to DNA vaccines. J. MoL Med (2004), Vol. 82, N.° 2, 144-152) describen estrategias
10 para co-suministrar ADN y vacunas basadas en peptidos de un modo que potencie la inmunogenicidad de ambos componentes de la vacuna de combinacion para celulas T.
[0012] El ADN es una molecula cargada negativamente. Mas espedficamente, los grupos fosfato dentro de la estructura del ADN estan cargados negativamente. Por lo tanto, moleculas cationicas, que tienen una carga positiva
15 neta, pueden adsorber ADN mediante interaccion electrostatica, y son vetftculos potenciales para el ADN. Dichas moleculas cationicas incluyen micropartfculas (Minigo, G. et al. 2007 Vaccine, 25(7), 1316-1327; Mollenkopf, H.J. et al. 2004 Vaccine, 22(21-22), 2690-2695), peptidos (Gratton, J.P. et al. 2003 Nat Med, 9(3), 357-362; Riedl, P. et al. 2006 Methods Mol Med, 127, 159-169), o liposomas (Jiao, X. et al. 2003 Hepatology, 37(2), 452-460; Ewert, K. et al. 2002 J Med Chem, 45(23), 5023-5029). Kawamura et al., 2006, Biochemistry 45, 1116-1127, describen el uso de 20 ciertos peptidos tetramericos para condensar y suministrar ADN plasirftdico a celulas CHO.
[0013] Simplemente transportar ADN a celulas presentadoras de antfgeno, sin embargo, no es suficiente para provocar la transfeccion, y, para dirigir una respuesta espedfica de antfgeno, tambien debe haber captacion del ADN en las celulas del sistema inmunitario. Las celulas presentadoras de antfgeno del sistema inmunitario receptores tipo
25 toll (TLR) sobre su superficie celular, que se unen a una diversidad de ligandos, derivados en gran medida de microorganismos. Por ejemplo, se sabe que TLR-2 se une a lipoprotemas bacterianas, se sabe que TLR-4 se une a lipopolisacaridos bacterianos, se sabe que TLR-6, en asociacion con TLR-1, se une a ftpidos bacterianos diacilados, y TLR-9 se une a ADN CpG. Se ha demostrado que subconjuntos de celulas dendrfticas expresan no menos de nueve de dichos TLR. El acoplamiento de uno o mas TLR sobre la superficie de DC induce rutas de senalizacion 30 celular, que pueden conducir a la maduracion y activacion de DC, que es necesario para la induccion de inmunidad protectora.
[0014] El residuo lipfdico, dipalmitoil-S-gliceril cistema (Pam2Cys), es un analogo sintetico de una lipoprotema bacteriana conocida como MALP-2, derivada de la membrana citoplasmatica de Mycoplasma fermentans. Pam2Cys
35 es un ligando tanto para TLR-2 como para TLR-6 (Okusawa, T. et al., Infect Immun 2004, 72(3), 1657-1665). Vacunas que comprenden Pam2Cys acoplado a epftopos peptfdicos pueden inducir fuertes respuestas humorales y celulares. El acoplamiento de TLR-2 por Pam2Cys acoplado a epftopos peptfdicos provoca la maduracion de DC, la activacion de factores de transcripcion tales como NF-kB, la secrecion de citoquinas proinflamatorias y la migracion final de DC a los ganglios linfaticos de drenaje para activar celulas T vftgenes espedficas de epftopo (Jackson, D.C. 40 et al. 2004 Proc Natl Acad Sci USA, 101(43), 15440-15445; Zeng, W. et al. 2002 J Immunol, 169(9), 4905-4912; Chua, B.Y. et al. 2007 Vaccine, 25(1), 92-101).
Descripcion resumida de la invencion
45 [0015] En el trabajo que ha conducido a la presente invencion, los inventores buscaron producir un medio eficaz de transfeccion de celulas con acidos nucleicos. Tambien se ha buscado producir una vacuna de ADN candidata que aborde celulas presentadoras de antfgeno, en particular celulas dendrfticas, para provocar respuestas inmunitarias tanto humores como celulares en un sujeto.
50 [0016] En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto que comprende un peptido ramificado cargado positivamente, que comprende al menos cuatro residuos de arginina o al menos cuatro residuos de lisina, unidos a al menos un ligando de TLR, que se une a TLR-2 y en el cual dicho compuesto es capaz de formar un complejo estable con otro ADN.
55 [0017] En un segundo aspecto, la descripcion proporciona un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un peptido ramificado cargado positivamente, que comprende al menos cuatro residuos de arginina o al menos cuatro residuos de lisina, unidos a al menos un ligando de TLR, que se une a TLR-2, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente. En un tercer aspecto, se proporciona el uso de un compuesto o un complejo como se ha 60 descrito anteriormente en la fabricacion de un reactivo para la transfeccion de celulas.
[0018] Se describe adicionalmente un metodo de transfeccion que comprende poner en contacto una celula que expresa un TLR con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con 65 el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente.
[0019] Se describe en la presente memoria tambien un metodo para generar una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado
5 positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antigeno o un epttopo del mismo.
[0020] Se describe adicionalmente un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto celulas transfectadas con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en
10 el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epttopo del mismo.
[0021] Tambien se describe un metodo de represion de la expresion de un gen en una celula que expresa un TLR, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende
15 dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, en el cual el acido nucleico se selecciona entre el grupo que consiste en: ARNip; ARNhc; ADN que codifica ARNip; y ADN que codifica ARNhc; y esta dirigido contra el gen.
20 [0022] Se describe adicionalmente usos de un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR en: la fabricacion de una vacuna para la induccion de una respuesta inmunitaria en un sujeto; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto con una anormalidad o deficiencia genetica; y la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece expresion aberrante o indeseada de otro modo de un gen.
25
Breve descripcion de los dibujos
[0023]
30 La Figura 1 es una representacion diagramatica de las diversas construcciones peptfdicas fluorescentes sintetizadas. Abreviaturas; R, arginina; K, lisina; L, lineal; FL, fluorescema o carboxilfluorescema.
La Figura 2 es una representacion fotografica de un analisis en gel de agarosa de interacciones de R4 y ADN. Se incubaron cantidades variables (10, 1, 0,5 o 0,1 |jg) de R4 con 1 |jg de (A) plasmido pEGFP-N1 o (B) plasmido
35 pCI-HA durante 30 minutos a 37 °C. Las muestras despues se ejecutaron en un gel de agarosa al 1 % que contema tincion de gel de ADN SYBR-Safe de modo que el ADN pudiera visualizarse en luz UV.
La Figura 3 muestra lecturas de absorbancia a 260 nm de soluciones que contienen R4 y ADN.
40 Se incubaron cantidades crecientes de R4 con 10 jg de plasmido pCI-HA durante 30 minutos a 37 °C en un volumen total de 100 jl de agua. (A) Se centrifugaron las muestras a 9300 g para sedimentar cualquier complejo insoluble y se midieron las lecturas de absorbancia de los sobrenadantes recogidos a 260 nm (barras grises claras). Tambien se midieron las lecturas de absorbancia de sobrenadantes de lavado despues de resuspender las muestras sedimentadas con 100 jl de agua (barras grises oscuras). (B) Los sobrenadantes y sobrenadantes
45 de lavado tambien se ejecutaron en un gel de agarosa al 1 % que contema tincion de gel de ADN SYBR-Safe para detectar la presencia de ADN en estas muestras.
La Figura 4 es una representacion grafica de la transfeccion de celulas D1 con plasmido pEGFP-N1 y regulacion positiva de la expresion de MHC Clase II en celulas D1. Se cultivaron celulas D1 (4x105), derivadas de
50 esplenocitos BALB/c, a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % con 1 jg de plasmido pEGFP-N1 pre-incubado con 3 jg de R4 o R4(S2Pam2Cys) durante 30 minutos a 37 °C, o con una relacion 3:1 de FUGENE® a ADN plasmfdico durante 45 minutos a temperatura ambiente. Despues de 2 dfas, se recogieron las celulas y se determino la fluorescencia verde por citometna de flujo (A). Las celulas tambien se tineron con anticuerpo anti- MHC Clase II murino (IA/E) conjugado con fluorocromo antes del analisis por citometna de flujo (B). Se considero
55 que las celulas que expresaban altos niveles de NHC Clase II eran maduras (partes sombreadas del histograma) mientras que expresan niveles bajos se consideraron inmaduras (no sombreadas). El porcentaje de celulas en esta categona tambien se indica con cada panel como un promedio y desviacion tfpica obtenida por analisis de muestras por triplicado.
60 La Figura 5 es una representacion grafica de la transfeccion de celulas D1 usando mezclas de diferente relacion de reactivo de transfeccion a ADN. Se cultivaron celulas D1 (4x105) derivadas de esplenocitos BALB/c durante 48 horas, a 37 °C en CO2 al 5 %, con 1 jg de plasmido pCI-HA pre-incubado con relaciones diferentes de R4 o R4(S2Pam2Cys) durante 30 minutos a 37 °C, o con diferentes relaciones de FUGENE® durante 45 minutos a temperatura ambiente. Las celulas despues se recogieron y se tineron con un anticuerpo anti-HA (clon E2.6) que
65 se detecto con un anticuerpo de cabra anti-Ig murina conjugado con FITC antes del analisis por citometna de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
flujo.
La Figura 6 es una representacion grafica de la transfeccion de celulas dendnticas derivadas de monocitos (MoDC) humanos con plasmidos, pEGFP-N1 y pCI-HA. Se cultivaron celulas dendnticas derivadas de monocitos (2x105) a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % con 1 |jg de plasmido pEGFP-N1 pre-incubado con 3 |jg de R4 o R4(S2Pam2Cys) durante 30 minutos a 37 °C, o con una relacion 3:1 de FUGENE® a ADN plasirndico durante 45 minutos a temperatura ambiente. Despues de 2 d^as, las celulas se recogieron y se determino la protema fluorescente verde en celulas transfectadas con el plasmido pEGFP-N1 por citometna de flujo (A). Para celulas transfectadas con el plasmido pCI-HA, se uso un anticuerpo anti-HA conjugado con fluorocromo para detectar la expresion superficial de protema HA (B).
La Figura 7 es una representacion grafica de niveles de transfeccion de protema fluorescente verde en dos lmeas celulares diferentes usando mezclas de diferente relacion de reactivo de transfeccion a ADN. Se sub- cultivo la lmea de celulas epiteliales de pulmon humano A549 (A) o la lmea celular de macrofagos alveolares pulmonares murinos MH-S (B) a una concentracion de 2x105 celulas/ml en ausencia o presencia de plasmido que codifica protema fluorescente verde en complejo con diferentes diluciones de R4, R4Pam2Cys o FUGENE durante 48 horas a 37 °C y CO2 al 5 %. Se determino la eficacia de transfeccion midiendo la fluorescencia de celulas en un citometro de flujo.
La Figura 8 es una representacion grafica de los niveles de anticuerpo espedfico de HA en ratones no inmunizados, y en ratones inmunizados con complejos de R4Pam2Cys y aDn, o virus de la influenza. Se inoculo a ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) por via subcutanea en la base de la cola en el dfa 0 y 28 con 50 jg de plasmfdico de ADN que comprendfa ADN que codifica hemaglutinina de la influenza, solo en complejo con R4(S2Pam2Cys) a relaciones molares de 1:3 o 1:5. Como control positivo, los ratones tambien se inmunizaron por via intranasal con virus PR8 dividido (3 jg/raton). Los ratones no inmunizados sirvieron como controles negativos. Se obtuvieron sueros de ratones 14 dfas despues de la ultima inoculacion y se realizo ELISA para detectar la presencia de anticuerpos espedficos para el virus PR8 de la influenza.
La Figura 9 es una representacion grafica de las cantidades de celulas T CD8+ productoras de IFN-y, espedficas de antfgeno inducidas en el bazo (A) y los ganglios linfaticos inguinales (B) de ratones inmunizados con complejos R4Pam2Cys y ADN. Se inoculo a ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) por via subcutanea en la base de la cola con 20 jg de plasmido de ADN que codificaba nucleoprotema de la influenza sola o en complejo con R4(S2Pam2Cys) a relaciones molares 1:1, 1:2 o 1:5 de NH3+:PO4". La formacion de complejos se consiguio anadiendo lentamente almuotas de 10 jl de una solucion que contema R4(S2Pam2Cys) a una solucion de ADN cada 2 minutos durante un periodo total de 1 hora. Todos los inoculantes se disolvieron en NaCl 0,7 M. Se retiraron los bazos y los ganglios linfaticos inguinales de los ratones 7 o 10 dfas despues de las inmunizaciones y se realizo tincion de citoquinas intracelulares para detectar la presencia de celulas T CD8+ que secretaban IFN-y espedficas para nucleoprotema-147-155. Cada barra representa la media y error tfpico de dos ratones.
Descripcion detallada de la invencion
[0024] Sorprendentemente, los inventores han encontrado que los compuestos de la presente invencion forman un complejo estable con ADN. El ADN se une a la parte cationica del compuesto y este complejo se dirige, mediante la parte de ligando de TLR del compuesto, a celulas que expresan receptores que reconocen el ligando, por ejemplo, celulas presentadoras de antfgeno tales como DC.
[0025] Una ventaja proporcionada por los compuestos de la presente invencion es que son capaces de abordar celulas que expresan tLr. Como resultado de la union a TLR, los compuestos de la presente invencion se internalizan y tambien inducen rutas de senalizacion mediadas por TLR. En particular, la union de TLR-2 por la parte Pam2Cys de los compuestos de la presente invencion, causa maduracion de DC, provocando la migracion de las DC a ganglios linfaticos y presentacion eficaz de antfgeno a linfocitos T.
[0026] En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente que comprende al menos cuatro residuos de arginina y al menos cuatro residuos de lisina, unidos a al menos un ligando de TLR, que se une a TLR-2 y en el cual dicho compuesto es capaz de formar un complejo estable con otro ADN. En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invencion comprenden dicho grupo cargado positivamente unido covalentemente a al menos uno de dichos ligandos de TLR.
[0027] En un segundo aspecto, la presente invencion proporciona un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente que comprende al menos cuatro residuos de arginina y al menos cuatro residuos de lisina, unidos a al menos un ligando de TLR, que se une a TLR-2 en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente.
[0028] En un tercer aspecto, se proporciona el uso de un compuesto o un complejo como se ha descrito
5
anteriormente en la fabricacion de un reactivo para transfeccion de celulas.
[0029] Se describe adicionalmente un metodo de transfeccion que comprende poner en contacto una celula que expresa un TLR con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con
5 el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente.
[0030] Se describe en la presente memoria tambien un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de tLr, en el cual el
10 acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epttopo del mismo.
[0031] Se describe adicionalmente un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto celulas transfectadas con un complejo que comprende acido nucleico y un
15 compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epttopo del mismo.
[0032] Tambien se describe un metodo de represion de la expresion de un gen en una celula que expresa un TLR, 20 que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende
dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, en el cual el acido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: ARNip; ARNhc; ADN que codifica ARNip; y ADN que codifica ARNhc; y esta dirigido contra el gen.
25
[0033] Se describen adicionalmente usos de un compuesto que comprende dicho grupo cargado positivamente unido a al menos uno de dichos ligandos de TLR en: la fabricacion de una vacuna para la induccion de una respuesta inmunitaria en un sujeto; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto con una anormalidad o deficiencia genetica; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece
30 expresion aberrante o indeseada de otro modo de un gen.
[0034] La presente invencion proporciona compuestos como se define por las reivindicaciones que comprenden dicho grupo cargado positivamente unido a al menos un ligando de TLR que se une a TLR-2. La union del ligando de TLR al TLR provoca la captacion del compuesto por una celula que expresa el TLR; y/o senalizacion mediante la
35 ruta de senalizacion mediada por TLR.
[0035] El termino "TLR" como se usa en la presente memoria hace referencia a uno o mas receptores tipo toll, que pueden definirse como una clase de receptores unidos a membrana que se unen a moleculas estructuralmente conservadas derivadas de microbios. Hasta ahora se han identificado trece TLR, de TLR-1 a TLR-13, y se estima
40 que la mayona de las especies de mairnfero tienen entre 10 y 15 tipos de receptores tipo toll. (Du, X. et al. 2000. Eur. Cytokine Netw. 11:362-371; Chuang, T.H., y Ulevitch, R.J. 2000. Eur. Cytokine Netw. 11:372-378; Tabeta, K. et al. 2004 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101:3516-3521). Los TLR son un tipo de receptor de reconocimiento de patron (PRR) y sus ligandos se conocen colectivamente como patrones moleculares asociados a patogeno (PAMP).
45 [0036] Un "ligando de TLR" como se usa en la presente memoria significa una molecula que se une selectiva o preferentemente a un TLR. Ejemplos de ligandos de TLR incluyen elementos conservados en patogenos e incluyen: lipopolisacaridos de superficie celular bacteriana (LPS), lipoprotemas, lipopeptidos y lipoarabinomanano; protemas tales como flagelina de flagelos bacterianos; ARN bicatenario de virus o los motivos CpG no metilados de ADN bacteriano y vmco; y otros ciertos ARN y ADN. Tambien se han identificado ligandos endogenos de TLR, incluyendo 50 fibrinogeno, protemas de choque termico (HSP), y ADN.
[0037] La Tabla 1 enumera los TLR actualmente conocidos por expresarse en celulas dendnticas, junto con sus ligandos correspondientes.
- Tabla 1. Receptores tipo toll expresados por DC
- Familia
- Receptor Ligando Referencias
- Receptores tipo toll
- TLR-1 lfpidos bacterianos triacilados (TLR-1 y 2) (Takeuchi 2002)
- TLR-2 peptidoglucano, zimosano de levadura, lipoprotemas bacterianas (Schwandner 1999, Ozinsky 2000, Takeuchi 2000, Schjetne 2003)
- TLR-3 ARN bicatenario (Alexopoulou 2001)
- TLR-4 LPS, hsp60 y hsp70 (Poltorak 1998, Chow 1999, Asea 2002, Bulut 2002, Flusebye 2006)
- Familia Receptor TLR-5
- Ligando flagelina Referencias (Hayashi 2001)
- TLR-6
- L^pidos bacterianos diacilados (TLR-2 y 6) (Morr 2002, Okusawa 2004)
- TLR-7
- compuestos de imidazoquinolina (Hemmi2 002)
- TLR-8
- ARN monocatenario (Heil 2004)
- TLR-9
- ADN CpG (Flemmi 2000, Takeshita 2001)
- TLR-10
- aun a descubrir (Flacher 2006)
- TLR-11
- aun a descubrir (Pepper 2008)
Abreviaturas: CpG, citosina fosfato guanina; hsp, protema de choque termico; LPS, lipopolisacarido; ARN, acido ribonucleico
[0038] Un compuesto ejemplar de la presente invencion es un peptido cationico unido al lipopeptido "Pam2Cys". Un experto en la materia entendena que el termino "lipopeptido" significa cualquier composicion de materia que comprenda uno o mas residuos lipfdicos y una o mas secuencias de aminoacido que estan conjugadas. "Pam2Cys"
5 (tambien conocido como dipalmitoil-S-gliceril-cistema o S-[2,3 bis(palmitoiloxi) propil] cistema se ha sintetizado (Metzger, J. W. et al. 1995. J Pept Sci 1:184) y corresponde al residuo lfpido de mAlP-2, un lipopeptido activador de macrofagos aislado de Mycoplasma fermentans (Sacht, G. et al. 1998. Eur J immunol 28:4207; Muhiradt, P. F. et al. 1998. infect immun 66:4804; Muhiradt, P. F. et al. 1997. J Exp Med 185: 1951). Pam2Cys es conocido por ser un ligando de TLR-2.
10
[0039] Pam2Cys tiene la estructura de Formula (I):
15 [0040] Otros residuos lipfdicos que pueden usarse para abordar TLR de superficie celular incluyen palmitoilo, miristoilo, estearoilo, lauroilo, octanoilo, o decanoilo. Grupos preferidos incluyen Pam2Cys, PamaCys, Ste2Cys, Lau2Cys, y Oct2Cys.
[0041] Los grupos cargados positivamente de la presente invencion incluyen, aunque sin limitacion, los 20 compuestos cationicos enumerados en la Tabla 2 y los compuestos policationicos descritos en el documento US 6.689.478 y el documento US 4.035.558.
_______Tabla 2. Compuestos cationicos________________
Compuestos cationicos Referencias
Penetratina Tat 48-60 de VIH Rev 34-50 de VIH Transportano
Peptidos de oligoarginina (lineales y ramificados) Peptidos de oligolisina (lineales y ramificados)
Pirrocoricina
Peptido modelo anfipatico de alfa-helice Polilisina
Protamina (por ejemplo, protamina de salmon)
(Christiaens 2004) (Fawell 1994)
(Futaki 2001)
(Pooga 1998)
(Buschle 1997, Mitchell 2000)
(Otvos 2004)
(Oehike 1998)
(Wagner 1990) (Wagner 1990)
- Compuestos cationicos
- Referencias
- FL17 ([(Me2NCH2CHOHCH2)n]n+Cln)
- (Billingham 1997)
- Magnafloc 1697 ([(CH2CHCH2N(Me)2CH2CHCH2)n]n+Cln)
- (Billingham 1997)
[0042] Como los acidos nucleicos, debido a los grupos fosfato dentro de la estructura de los acidos nucleicos, son moleculas con carga negativa neta, se unen por los grupos cargados positivamente de los compuestos de la presente invencion, mediante interaccion electroestatica, para formar un complejo estable.
5
[0043] Segun la invencion, el grupo cargado positivamente es un peptido ramificado que comprende al menos cuatro residuos de arginina o lisina.
[0044] Debe entenderse que referencias a un "acido nucleico" deben entenderse como una referencia tanto a 10 acido desoxirribonucleico (ADN) como a acido ribonucleico (ARN), incluyendo ADN bicatenario, ARN bicatenario,
ADN monocatenario, ARN monocatenario, moleculas de ARN interferente pequeno (ARNip), triplex, cuadruplex y cualquier molecula de acido nucleico de multiples hebras (multiplex), tubridos de acido nucleico tales como acidos peptidonucleicos (PNA), una molecula que comprende tanto bases de acido desoxirribonucleico como bases de acido ribonucleico, y cualquier variante nucleotfdica.
15
[0045] En un aspecto, las moleculas de acido nucleico se proporcionan como "plasmidos". Referencias a "plasmidos" deben entenderse como una referencia a una molecula de acido nucleico que se puede transmitir a una celula hospedadora y puede experimentar replicacion en la celula hospedadora. La molecula de acido nucleico no debe limitarse, sin embargo, a plasmidos, sino que puede ser cualquier molecula de acido nucleico, incluyendo ADN
20 o ARN vmco.
[0046] Un experto en la materia apreciana que la transfeccion de celulas con acidos nucleicos es util para muchas aplicaciones de investigacion y clmicas. Referencias a "transfeccion" deben entenderse como referencia a un procedimiento por el cual se introducen moleculas exogenas, incluyendo acidos nucleicos, en celulas.
25
[0047] Muchas aplicaciones de investigacion requieren transfeccion de celulas. Actualmente, los investigadores introducen moleculas en celulas, es decir, transfectan celulas, por una diversidad de medios con eficacia variable. Estan actualmente disponibles varios reactivos de transfeccion para los investigadores, incluyendo FUGENE. Sin embargo, la eficacia de transfeccion de celulas depende de, por ejemplo, el tipo de celula, la tasa y fase de division
30 celular, y las propiedades individuales tanto de las moleculas a transfectar como del uno o mas reactivos de transfeccion.
[0048] Los compuestos de la presente invencion son particularmente utiles para la transfeccion de celulas que expresan TLR. Por lo tanto, celulas que expresan de forma natural TLR o celulas que se han transfectado de forma
35 estable para expresar un TLR, sea el receptor completo o un receptor modificado que carece del dominio de senalizacion intracelular, pueden transfectarse con acidos nucleicos en complejo con los compuestos de la presente invencion.
[0049] Una "celula" debe entenderse como cualquier celula en la cual se suministra una molecula de acido 40 nucleico mediante los compuestos de la presente invencion. La celula puede ser una celula in vitro, in vivo o ex vivo.
La celula puede aislarse o formar parte de los organismos o tejidos de un animal vivo. Una celula tambien puede ser un microorganismo tal como bacterias, levaduras, hongos, mohos, parasitos, algas y similares. Una celula tambien puede ser una celula animal cultivada o lmea celular, o una celula artificial.
45 [0050] Referencias a "aislado", en terminos de las celulas de ciertas realizaciones de la presente invencion, deben entenderse como una referencia a material que se ha retirado de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si fuera de origen natural). Por ejemplo, una celula presente en el tejido de un organismo vivo no esta aislada, pero la misma celula, cuando se separa de algunas o todas las celulas coexistentes en el sistema natural, esta aislada.
50 [0051] Un aspecto de la descripcion proporciona compuestos, que pueden formar un complejo estable con acidos nucleicos mediante interaccion electrostatica entre el grupo cargado positivamente y el acido nucleico cargado negativamente. Los compuestos de la presente invencion proporcionan un medio para dirigir acidos nucleicos a celulas que expresan TLR-2.
55 [0052] La presente invencion proporciona compuestos como se define por las reivindicaciones, que pueden formar un complejo estable con ADN mediante interaccion electrostatica entre el peptido cationico y el ADN cargado negativamente. Dichos compuestos proporcionan un medio de direccionamiento del ADN a celulas que expresan TLR, por ejemplo, celulas presentadoras de antfgeno, y mas particularmente DC.
60 [0053] Se describe adicionalmente un metodo de transfeccion que comprende poner en contacto una celula que
expresa un TLR con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente unido a al menos un residuo que se une a un TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente.
5 [0054] Tambien se describe un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente unido a al menos un residuo que se une a un tLr, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epttopo del mismo.
10
[0055] Se describe en el contexto de la presente invencion un metodo de generacion de una respuesta inmunitaria contra un antigeno, que comprende administrar a un sujeto celulas transfectadas con un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que comprende un grupo cargado positivamente unido a al menos un residuo que se une a un TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido
15 nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico codifica el antfgeno o un epftopo del mismo.
[0056] El contacto de las DC con compuestos de la presente invencion puede provocar la maduracion o activacion de DC, que se indica por un aumento en la expresion de MHC Clase II de superficie celular. Por lo tanto, compuestos que comprenden un ligando de TLR pueden ser utiles no solamente para abordar DC, sino tambien
20 para su activacion mediante TLR y moleculas de senalizacion cadena abajo tales como MyD88.
[0057] Por consiguiente, los compuestos de la presente invencion son utiles para activar DC. Para que las celulas dendnticas induzcan una respuesta inmunitaria, primero deben activarse de modo que expresen las moleculas necesarias de adhesion y co-estimuladoras para migrar a los ganglios linfaticos y activar linfocitos T. Compuestos
25 que comprenden ligandos de TLR en complejo con ADN son particularmente utiles para activar DC, y cuando el ADN codifica una protema, las DC transfectadas presentan fragmentos peptfdicos de la protema codificada por el ADN traducido a celulas inmunitarias, invocando de ese modo una respuesta inmunitaria celular y humoral. En otras palabras, los compuestos de realizaciones particulares de la presente invencion cuando estan en complejo con ADN, son utiles para enfoques de vacunacion con ADN.
30
[0058] Referencias a "vacunacion con ADN" como se usa en la presente memoria significan referencias a la administracion de ADN a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria contra la protema codificada por el mismo. Los compuestos de la presente invencion pueden administrarse directamente a un sujeto por cualquier via, incluyendo, aunque sin limitacion: intravenosa; intranasal; intramuscular; oral; rectal y similares.
35
[0059] Referencias a "respuesta inmunitaria" como se usa en la presente memoria significan una referencia a la accion concertada de linfocitos, celulas presentadoras de antfgeno, celulas fagocfticas, granulocitos, y macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o el hugado (incluyendo anticuerpos, citoquinas, y complemento) que provoca dano selectivo en, destruccion de, o eliminacion desde el organismo humano de
40 patogenos invasores, celulas o tejidos infectados con patogenos, celulas cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales.
[0060] Referencias a "respuesta de linfocitos T" como se usa en la presente memoria significan una referencia al componente de la respuesta inmunitaria dependiente de linfocitos T (es decir, la proliferacion y/o diferenciacion de
45 linfocitos T en linfocitos T auxiliares, citolfticos citotoxicos, o supresores, la provision de senales por linfocitos T auxiliares a linfocitos B que causan o evitan la produccion de anticuerpos, la eliminacion de celulas diana espedficas pro linfocitos T citotoxicos, y la liberacion de factores solubles tales como citoquinas que modulan la funcion de otras celulas inmunitarias).
50 [0061] "Paciente", "sujeto", o "mairnfero" se usan de forma intercambiable y hacen referencia a marnfferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, asf como animales experimentales tales como conejos, ratas y ratones, y otros animales. Los animales incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamfferos y no mamfferos, tales como ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, y reptiles.
55 [0062] Ademas de su uso en vacunacion con ADN, los compuestos de la presente invencion son utiles para otras varias aplicaciones clmicas. Por ejemplo, tratamientos para enfermedades autoinmunitarias o cancer pueden requerir transfeccion de celulas autologas, tales como celulas madre hematopoyeticas (HSC) o celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC). Dichas celulas pueden recogerse de un sujeto, cultivarse in vitro, diferenciarse opcionalmente en DC por metodos bien conocidos en la tecnica, y/o transfectarse con acido nucleico, y
60 posteriormente infundirse de nuevo en el sujeto. En algunos casos, el acido nucleico codifica un antfgeno de vacuna y las celulas transfectadas pueden estar pretendidas para invocar una respuesta inmunitaria. En otros aspectos, el acido nucleico puede codificar una citoquina o un tolerogeno antigenico.
[0063] En otro aspecto, se describe un metodo de represion de la expresion de un gen en una celula que expresa
65 un TLR, que comprende administrar a un sujeto un complejo que comprende acido nucleico y un compuesto que
comprende un grupo cargado positivamente unido a un ligando de TLR, en el cual el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica entre el acido nucleico y el grupo cargado positivamente, y en el cual el acido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: ARNip; ARNhc; ADN que codifica ARNip; y ADN que codifica ARNhc; y en el cual el ARNip o ARNhc esta dirigido contra el gen.
5
[0064] "Tratar" o "tratamiento" incluyen la administracion de las composiciones, compuestos o agentes descritos en la presente memoria para prevenir o retardar la aparicion de los smtomas, complicaciones, o indicios bioqmmicos de una enfermedad, aliviar o mejorar los smtomas o detener o inhibir el desarrollo adicional de la enfermedad, afeccion, o trastorno (por ejemplo, una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria).
10 "Tratar" se refiere adicionalmente a cualquier indicio de exito en el tratamiento o mejora o prevencion de la enfermedad, afeccion, o trastorno (por ejemplo, una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria), incluyendo cualquier parametro objetivo o subjetivo tal como mitigacion; remision; disminucion de los smtomas o hacer que la afeccion patologica sea mas tolerable al paciente; ralentizacion en la tasa de degeneracion o deterioro; o hacer que el punto final de degeneracion sea menos debilitante. El tratamiento o mejora 15 de los smtomas puede basarse en parametros objetivos o subjetivos; incluyendo los resultados de un examen por un medico. Por consiguiente, el termino "tratar" incluye la administracion de los compuestos o agentes descritos en la presente memoria para prevenir o retardar, aliviar, o detener o inhibir el desarrollo de los smtomas o afecciones asociados con una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria. La expresion "efecto terapeutico" se refiere a la reduccion, eliminacion, o prevencion de la enfermedad, smtomas de la enfermedad, o 20 efectos secundarios de la enfermedad en el sujeto. "Tratar" o "tratamiento" usando los metodos que incluyen prevenir la aparicion de los smtomas en un sujeto que puede estar en riesgo aumentado de una enfermedad infecciosa, inflacion, o una enfermedad autoinmunitaria pero que no experimenta o muestra smtomas, inhibir los smtomas de una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria (ralentizacion o detencion de su desarrollo), proporcionar alivio de los smtomas o efectos secundarios de una enfermedad infecciosa, inflacion 25 o una enfermedad autoinmunitaria (incluyendo tratamiento paliativo), y aliviar los smtomas de una enfermedad infecciosa, inflamacion, o una enfermedad autoinmunitaria (causar regresion). El tratamiento puede ser profilactico (para prevenir o retardar la aparicion de la enfermedad, o para prevenir la manifestacion de smtomas clmicos o subclmicos de la misma) o supresion terapeutica o alivio de los smtomas despues de la manifestacion de la enfermedad o afeccion.
30
[0065] Tambien se describen en la presente usos de compuestos que comprenden un grupo cargado positivamente unido a un ligando de TLR en: la fabricacion de una vacuna para la induccion de una respuesta inmunitaria en un sujeto; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto con una anormalidad o deficiencia genetica; la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un sujeto que padece una expresion
35 aberrante o indeseada de otro modo de un gen; y en la fabricacion de un reactivo para la transfeccion de celulas.
[0066] Los compuestos y los metodos expuestos en la presente memoria pueden usarse tanto para aplicaciones medicas como para aplicaciones veterinarias. Tfpicamente, el producto se usa en seres humanos, pero tambien puede usarse en otros mairnferos. Los terminos "paciente" y "sujeto" pretenden indicar un individuo mamffero, y asf
40 se usan durante toda la memoria y en las reivindicaciones. Las aplicaciones principales de la invencion implican pacientes o sujetos humanos, pero la invencion puede aplicarse a animales de laboratorio, de granja, de zoologico, salvajes, mascotas o de competicion.
[0067] Debena apreciarse que los expertos en la materia pueden introducir cualquier combinacion de grupo 45 cargado positivamente y ligando de TLR que beneficie a la aplicacion deseada.
[0068] La presente invencion se describira ahora adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos:
Ejemplo 1
50
Sintesis de peptidos cationicos
[0069] Se sintetizaron construcciones de peptido ramificado usando residuos de lisina para proporcionar los puntos de ramificacion de un molde estructural. Dependiendo de la cantidad de puntos de ramificacion presentes en
55 la estructura, se produjeron estructuras di o tetracationicas (Figura 1). Estas construcciones ramificadas se sintetizaron sobre resina de PEG-S RAM (Rapp Polymere, Tubingen, Alemania; factor de sustitucion 0,27 mmol/g). Primero se acoplo Fmoc-lisina(Mtt)-OH (Novabiochem, Laufelfingen, Suiza) a la resina en un exceso de 4 veces con cantidades equimolares de O-benzotriazol-N,N,N,N',N'-tetrametil-uronio-hexafluorofosfato (HBTU; Novabiochem, Darmstadt, Alemania), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y un exceso molar de 1,5 veces de diisopropiletilamina (DIPEA; 60 Sigma, Castle Hill, Australia). Se realizo acilacion durante 40 minutos y se confirmo la reaccion completa por el ensayo de acido trinitrobencilsulfonico (TNBSA) (21). La retirada del grupo protector Fmoc sobre el grupo a-amino se consiguio con diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (Sigma, Steinheim, Alemania) al 2,5 % y Fmoc-lisina (Fmoc)-OH (Auspep, Melbourne, Australia) acoplado de modo que despues de la retirada de los grupos Fmoc, se expusieran dos grupos amino primarios para actuar como puntos de ramificacion. Se uso dimetilformamida (DMF; Auspep, 65 Melbourne, Australia) para lavar la resina entre cada etapa de acilacion y desproteccion. Posteriormente se
acoplaron aminoacidos a un exceso molar de 4 veces y se realizo acilacion durante 60 minutes. Para el ensamblaje de construcciones tetravalentes, se realizo una ronda adicional de acilacion durante 60 minutes usando Fmoc- lisina(Fmoc)-OH para producir cuatro puntos de ramificacion. Para posibilitar el ligamiento quimioselectivo de un grupo que contema un aminoacido a una construccion tetravalente de arginina (R4), se inserto cistema en el 5 extremo C-terminal de la construccion para producir R4-Cys. Para la conjugacion de carboxifluorescema en construcciones de peptido ramificado, no se retiraron los grupos Fmoc N-terminales despues de la ultima reaccion de acilacion. En su lugar, el grupo protector Mtt presente en el grupo £-amino en la lisina C-terminal se retiro por tratamiento con TFA al 1 % en diclorometano (Ajax Finechem, Seven Hills, Australia). Despues se acoplo 5(6)- carboxifluorescema (Fluka BioChemika, Suiza) al grupo £-amino expuesto usando un exceso de 4 veces en la 10 presencia de cantidades equimolares de HOBt, HBTU y un exceso molar de 1,5 veces de DIPEA durante 18 horas en la oscuridad. Despues de la acilacion, la resina se lavo con DMF y se retiraron los grupos Fmoc N-terminales. Todos los peptidos se escindieron del soporte en fase solida y los grupos protectores de cadena lateral simultaneamente. La pureza de los peptidos se evaluo por cromatograffa analttica en fase inversa usando una columna Vydac C4 (4,6 mm x 250 mm) o una columna C8 (4,6 mm x 250 mm) instalada en un sistema de 15 cromatograffa de HPLC Waters 3. Se uso un caudal de 1 ml/min usando TFA al 0,1 % en H2O y TFA al 0,1 % en acetonitrilo como disolvente limitante para revelar los cromatogramas. Cuando fue necesario, los peptidos se purificaron usando un sistema de HPLC Waters o GBC semi-preparativo y una columna Vydac C4 semi-preparativa (10 mm x 300 mm) a un caudal de 2,5 ml/min. La estimacion del contenido de peptido se determino por espectrofotometna UV en el cual se determino la absorbancia de peptidos fluoresceinados a 496 nm y la 20 concentracion se calculo usando un coeficiente de extincion molar de 83.000 M'1cm'1. Se muestran en la Figura 1 esquemas de las construcciones de peptido ramificado fluoresceinado sintetizadas.
[0070] Para la lipidacion de peptidos, se ensamblaron residuos lipfdicos acoplando N-fluorenilmetoxicarbonil-S- (2,3-dihidroxipropil)-cistema (Fmoc-Dhc-OH) a un exceso de 4 veces en presencia de cantidades equivalentes de 25 HOBt y DICI en DCM al 50 % en DMF sobre el grupo £-amino de la lisina C-terminal. La acilacion se realizo durante 40 minutos y se repitio hasta que se confirmo el acoplamiento satisfactorio usando el ensayo de acido trinitrobencenosulfonico. La lipidacion de los dos grupos hidroxi del peptido-Fmoc-Dhc unido a resina se realizo durante una noche usando una solucion que contema una cantidad equimolar de DMAP, un exceso de 10 veces de acido graso y un exceso de 12 veces de DICI.
30
Ejemplo 2
Retardo de la migracion de ADN por R4
35 [0071] Para investigar la asociacion entre el peptido R4 ramificado y ADN, se incubo una cantidad constante de plasmido de ADN pEGFP-N1 o pCI-HA, que codifica protema fluorescente verde y protema HA de influenza respectivamente, con cantidades variables de R4 y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa (Figura 2).
[0072] Aumentando la cantidad de R4 en cada muestra, puedo afectarse a la migracion del ADN. Fue evidente 40 retardo parcial de la migracion del plasmido de ADN hacia el anodo, visualizado por fluorescencia con bromuro de
etidio, cuando se usaron 0,1-0,5 |jg de R4 mientras que las muestras de ADN incubadas con cantidades mayores de R4 se movieron a una velocidad mas lenta. El retardo total de la migracion del ADN se consiguio cuando estaban presentes 10 jg de R4, evidenciado por la aparicion de una banda de ADN en el origen. Esta banda, sin embargo, apareda bastante debil, lo que sugiere que habfa poco ADN en esta muestra. Esto puede deberse a: R4 inhibe la 45 union de bromuro de etidio al ADN; y/o la interaccion entre R4 y ADN provoca la formacion de un complejo insoluble que difunde en el tampon de electroforesis en lugar de migrar a traves del gel de agarosa. Estos resultados sugieren que los grupos amino y guanidina de R4 cargados positivamente son capaces de neutralizar los grupos fosfato cargados negativamente dentro de la estructura de ADN para retardar su capacidad de migrar hacia el anodo.
50 Ejemplo 3
Formacion de complejos R4-ADN
[0073] Para confirmar la union de R4 a ADN, se determino la cantidad de ADN en el sobrenadante de mezclas 55 centrifugadas que conteman cantidades crecientes de R4 y ADN midiendo la absorbancia a 260 nm (Figura 3). La
capacidad de R4 para precipitar ADN en la solucion por neutralizacion de su carga resultana en menos ADN en la solucion y por lo tanto indicana una asociacion entre los dos. Se descubrio que la cantidad de ADN en el sobrenadante centrifugado no variaba drasticamente cuando se incubaba con 0,1 jg a 5 jg de R4. Sin embargo, se produjo una ligera disminucion cuando se usaban 7,5 jg de R4 y no se detecto ADN en soluciones que conteman 60 mas que esta cantidad. Este resultado indica que la cantidad de R4 presente es proporcional a la precipitacion de ADN en la solucion. Tambien se tomaron lecturas de absorbancia en el sobrenadante de lavado usado para resuspender cualquier material insoluble centrifugado. La presencia de poco ADN en estas muestras sugiere que los precipitados de R4-ADN son estables y que el ADN no es probable que se disocie de este complejo.
65 [0074] El analisis de gel de agarosa (Figura 3B) demuestra que las bandas de ADN eran evidentes en muestras de
11
sobrenadante que conteman 1-7,5 |jg de R4 pero no en muestras que conteman 10 o 15 |jg de R4. El retardo de la migracion del ADN tambien es evidente en muestras que contienen 1 jg o mas de R4.
Ejemplo 4
5 Transfeccion de DC con R4(S2Pam2Cys)-ADN
[0075] Para determinar si las construcciones R4 o R4(S2Pam2Cys) eran capaces de inducir la expresion de ADN transfectado, se transfecto una lmea DC murina, D1, con el plasmido pEGFp usando R4 o R4(S2Pam2Cys) (Figura 4A). Los niveles de expresion de protema fluorescente verde (GFP) en estas celulas se compararon con los niveles
10 en celulas D1 que se transfectaron usando el reactivo de transfeccion disponible en el mercado FUGENE®.
[0076] No se observo fluorescencia en celulas no tratadas, en celulas tratadas con ADN solamente y en celulas tratadas con R4 junto con ADN. Sin embargo, las celulas transfectadas con R4(S2Pam2Cys) y ADN expresaron GFP a un nivel comparable con el nivel de expresion observado en celulas transfectadas con pEGFP y el reactivo
15 FUGENE®.
[0077] Tambien se descubrio que los cultivos celulares D1 comprendfan dos poblaciones celulares distintas que eran MHC Clase IIlow o MHC Clase IIhigh, correspondientes a celulas inmaduras y maduras, respectivamente (Figura 4B). Aproximadamente el 4 % de las celulas D1 no tratadas eran MHC Clase IIhigh. El tratamiento con ADN solo o
20 junto con R4 no altero apreciablemente la expresion de MHC Clase II en celulas D1. Las celulas D1 tratadas con ADN y FUGENE® comprendfan aproximadamente el 36 % de celulas MHC Clase IIhigh, y celulas D1 tratadas con R4(S2Pam2Cys) y ADN comprendfan aproximadamente un 82 % de celulas MHC Clase IIhig .
[0078] Tambien se investigo la eficacia de transfeccion usando mezclas de diferentes relaciones de reactivo de 25 transfeccion a ADN incubando celulas D1 con cantidades crecientes (0,1, 1 o 3 jg) de R4, R4(S2Pam2Cys) o
FUGENE® pre-incubadas con una cantidad constante (1 jg) de plasmido pCI-HA (Figura 5). Se determino la expresion de protema HA de influenza en la superficie celular usando un anticuerpo espedfico para HA. En el caso en que se uso R4(S2Pam2Cys) o FUGENE®, la eficacia de transfeccion, indicada por el porcentaje de celulas que expresaban protema HA en superficie, fue proporcional a la cantidad de agente de transfeccion usando. La 30 excepcion a esto fue cuando se empleo R4. Aqrn, aunque los niveles de expresion de HA eran inferiores a aquellos inducidos por mezclas de ADN que conteman R4(S2Pam2Cys) o FUGENE®, la transfeccion parecio ser optima cuando habfa una relacion igual peso a peso de R4 a ADN. Se descubrio que una relacion mayor, sin embargo, era perjudicial para la eficacia de transfeccion.
35 [0079] A todas las relaciones examinadas, se descubrio que R4(S2Pam2Cys) era superior a FUGENE® en la induccion de la expresion de antfgeno. El porcentaje maximo de celulas que se transfectaban usando R4(S2Pam2Cys) y ADN fue del 60 % a una relacion 3:1. En comparacion, solo aproximadamente el 30 % de las celulas HA positivas se detecto cuando se usaba una relacion equivalente de FUGENE® a ADN.
40 Ejemplo 5
Transfeccion de celulas dendnticas derivadas de monocitos humanos (MoDC)
[0080] Se investigo la capacidad de R4(S2Pam2Cys) de potenciar la transfeccion de celulas dendnticas derivadas 45 de monocitos humanos (MoDC). En un experimento en el cual se transfectaron MoDC con el plasmido pEGFP (Figura 6A), solamente R4(S2Pam2Cys) fue eficaz en inducir la expresion de GFP. La transfeccion de celulas con pEGFP mas FUGENE® o R4 fue relativamente ineficaz, con niveles de transfeccion en estas celulas similares a los de tratadas con el plasmido solamente. Este resultado se repitio en experimentos en el cual se transfectaron MoDC con el plasmido pCI-HA junto con cada uno de los reactivos de transfeccion (Figura 6B).
50
Ejemplo 6
Transfeccion de lmeas celulares no DC con R4(S2Pam2Cys)-ADN
55 [0081] Para investigar si construcciones de R4 o R4(S2Pam2Cys) en complejo con ADN eran capaces de transfectar lmeas celulares no DC, se transfecto la lmea celular de epitelio pulmonar humano A549 y la lmea celular de macrofagos alveolares pulmonares murinos MH-S con el plasmido pEGFP usando R4 o R4(S2Pam2Cys) (Figura 7A y 7B). La lmea celular de epitelio pulmonar humano A549 (A) o la lmea celular de macrofagos alveolares pulmonares murinos MH-S (B) se cultivaron a una concentracion de 2 x 105 celulas/ml en ausencia o presencia de 60 plasmido que codificaba protema fluorescente verde en complejo con diferentes diluciones de R4, R4(S2Pam2Cys) o FUGENE® durante 48 horas a 37 °C y CO2 al 5%. Se determino la eficacia de transfeccion midiendo la fluorescencia de las celulas en un citometro de flujo. Se ha informado de que estas dos lmeas celulares, en otros estudios, expresan TLR-2 (Oshilcawa 2003, Slevogt 2007). Se observo poca o ninguna fluorescencia en celulas A549 o MH-S no tratadas y en celulas tratadas con R4 junto con ADN. Sin embargo, las celulas A549 o MH-S transfectadas con o 65 R4(S2Pam2Cys) y ADN expresaron GFP a un nivel comparable, sino mayor, al nivel de expresion observado en
celulas transfectadas con el plasmido pEGFP y el reactivo FUGENE®.
Ejemplo 7
5 Produccion de anticuerpos especificos en ratones inmunizados con R4(S2Pam2Cys)-ADN
[0082] Se evaluo la capacidad de R4(S2Pam2Cys) en complejo con ADN de inducir anticuerpos. Se inocularon ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) por v^a subcutanea en la base de la cola en el dfa 0 y 28 con 50 |jg de plasmido de ADN que comprendfa ADN que codifica hemaglutinina de influenza, solo o en complejo con
10 R4(S2Pam2Cys) a relaciones molares de 1:3 o 1:5. Como control positivo, los ratones tambien se inmunizaron por via intranasal con virus PR8 dividido (3 jg/raton). Ratones no inmunizados sirvieron como controles negativos. Se obtuvieron sueros de los ratones 14 dfas despues de la ultima inoculacion y se realizo ELISA para detectar la presencia de anticuerpos espedficos para el virus PR8 de influenza. Se midieron los anticuerpos anti-HA en suero por ELISA. No se detectaron anticuerpos espedficos de HA en ratones no inmunizados o "vfrgenes" pero se 15 detectaron niveles sustanciales de anticuerpos que podfan unirse al virus de la influenza en ratones inmunizados con dos dosis de R4(S2Pam2Cys) y ADN mezclados a relaciones molares de 1:3 y 1:5 (Figura 8).
Ejemplo 8
20 Induccion de celulas T CD8+ IFN-Y-positivas, especificas de nucleoprotema de influenza en ratones inmunizados con R4(S2Pam2Cys) ADN
[0083] Se evaluo la capacidad de R4(S2Pam2Cys) en complejo con ADN de inducir respuestas inmunitarias mediadas por celulas. Se inocularon ratones BALB/c (6-8 semanas de edad) por via subcutanea en la base de la
25 cola con 20 jg de plasmido de ADN que codifica nucleoprotema de influenza solo o en complejo con R4(S2Pam2Cys) a relaciones molares NH3+:PO4" de 1:1, 1:2 o 1:5. Se consiguio la formacion de complejos anadiendo lentamente almuotas de 10 jl a una solucion que contema R4(S2Pam2Cys) a una solucion de ADN cada 2 minutos durante un periodo total de 1 horas. Todos los inoculantes se disolvieron en NaCl 0,7 M. Se retiraron los bazos y ganglios linfaticos inguinales de los ratones 7 o 10 dfas despues de las inmunizaciones y se realizo tincion de citoquinas 30 intracelulares para detectar la presencia de celulas T CD8+ secretoras de IFN-y espedficas para nucleoprotemaw- 155. Cada barra representa la media y el error tfpico de dos ratones.
[0084] Se detectaron niveles solamente muy bajos de celulas T CD8+ activadas en los bazos y ganglios linfaticos inguinales de ratones inoculados con ADN en solitario (Figuras 9A y 9B respectivamente) y no se detectaron en
35 ratones vfrgenes. La administracion de complejos que conteman relaciones diferentes de R4(S2Pam2Cys) a ADN, sin embargo, indujo celulas T CD8+ productoras de IFN-y espedficas de NP detectables en el bazo 7 dfas despues de la inmunizacion (Figura 9A). Se detectaron niveles particularmente altos de celulas T CD8+ activadas tanto en ganglios linfaticos como en bazos de ratones inoculados con una relacion 1:1 de R4(S2Pam2Cys) a ADN (Figuras 9A y 9B).
40
Bibliografia
[0085]
45 Alexopoulou L., Holt A. C., MedzhitovR. y Flavell R. A. (2001) Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature 413 (6857): 732-738
Asea A., Rehli M., Kabingu E., Boch J. A., Bare O., Auron P. E., Stevenson M. A. y Calderwood S. K. (2002) Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. J 50 Biol Chem 277 (17): 15028-15034
Billingham J., Breen C., Rawson J. O., Yarwood J., Mann B.E. (1997) Adsorption of polycations on clays: A comparative in situ study using 133Cs and 23Na solution phase NMR. Journal of Colloid and Interface Science 193:183-189 55
Bulut Y., Faure E., Thomas L., Karahashi H., Michelsen K. S., Equils O., Morrison S. G., Morrison R. P. y Arditi M. (2002) Chlamydial heat shock protein 60 activates macrophages and endothelial cells through Toll-like receptor 4 and MD2 in a MyD88-dependent pathway. J Immunol 168 (3): 1435-1440
60 Buschle M, Schmidt W, Zauner W, Mechtler K, Trska B, Kirlappos H, et al. (1997) Transloading of tumor antigen- derived peptides into antigen-presenting cells. Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):3256-3261
Chow J. C., Young D. W., Golenbock D. T., Christ W. J. y Gusovsky F. (1999) Toll-like receptor-4 mediates lipopolysaccharide-induced signal transduction. J Biol Chem 274 (16): 10689-10692 65
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Christiaens B, Grooten J, Reusens M, Joliot A, Goethals M, Vandekerckhove J, Prochiantz A, Rosseneu M. (2004) Membrane interaction and cellular internalization of penetratin peptides. Eur J Biochem. 271 (6): 11871197
Fawell S, Seery J, Daikh Y, Moore C, Chen LL, Pepinsky B, et al. (1994) Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc Natl Acad Sci U S A 91(2):664-668
Flacher V, Bouschbacher M, Verronese E, Massacrier C, Sisirak V, Berthier-Vergnes O, de Saint-Vis B, Caux C, Dezutter-Dambuyant C, Lebecque S, Valladeau J. (2006) Fluman Langerhans cells express a specific TLR profile and differentially respond to viruses and Gram-positive bacteria. J Immunol. 177(11):7959-7967
Futaki S, Suzuki T, Ohashi W, Yagami T, Tanaka S, Ueda K, et al. (2001) Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem 276(8):5836-5840
Flayashi F., Smith K. D., Ozinsky A., Flawn T. R., Yi E. C., Goodlett D. R., Eng J. K., Akira S., Underhill D. M. y Aderem A. (2001) The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 410 (6832): 1099-1103
Fleil F., Flemmi FI., Flochrein FI., Ampenberger F., Kirschning C., Akira S., Lipford G., Wagner FI. y Bauer S. (2004) Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science 303 (5663): 1526-1529
Flemmi FI., Kaisho T., Takeuchi O., Sato S., Sanjo FI., Floshino K., Floriuchi T., Tomizawa FI., Takeda K. y Akira S. (2002) Small anti-viral compounds activate immune cells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway. Nat Immunol 3 (2): 196-200
Flemmi FI., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo FI., Matsumoto M., Floshino K., Wagner FI., Takeda K. y Akira S. (2000) A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408 (6813): 740-745
Flusebye FI, Flalaas O, Stenmark FI, Tunheim G, Sandanger O, Bogen B, Brech A, Latz E, Espevik T. (2006) Endocytic pathways regulate Toll-like receptor 4 signaling and link innate and adaptive immunity. EMBO J. 25(4):683-692
Mitchell DJ, Kim DT, Steinman L, Fathman CG, Rothbard JB. (2000) Polyarginine enters cells more efficiently than other polycationic homopolymers. J Pept Res 56(5):318-325
Morr M., Takeuchi O., Akira S., Simon M. M. y Muhlradt P. F. (2002) Differential recognition of structural details of bacterial lipopeptides by toll-like receptors. Eur J Immunol 32 (12): 3337-3347
Oehike J, Scheller A, Wiesner B, Krause E, Beyermann M, Klauschenz E, et al. (1998) Cellular uptake of an alphahelical amphipathic model peptide with the potential to deliver polar compounds into the cell interior non- endocytically. Biochim Biophys Acta 1414(1-2):127-139
Okusawa T., Fujita M., Nakamura J., Into T., Yasuda M., Yoshimura A., Flara Y., Flasebe A., Golenbock D. T., Morita M., Kuroki Y., Ogawa T. y Shibata K. (2004) Relationship between structures and biological activities of mycoplasmal diacylated lipopeptides and their recognition by toll-like receptors 2 and 6. Infect Immun 72 (3): 1657-1665
Oshikawa K, Sugiyama Y. (2003) Regulation of toll-like receptor 2 and 4 gene expression in murine alveolar macrophages. Exp Lung Res 29(6):401-412
Otvos L, Jr., Cudic M, Chua BY, Deliyannis G, Jackson DC. (2004) An insect antibacterial peptide-based drug delivery system. Mol Pharm 1(3):220-232
Ozinsky A., Underhill D. M., Fontenot J. D., Hajjar A. M., Smith K. D., Wilson C. B., Schroeder L. y Aderem A. (2000) The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U S A 97 (25): 13766-13771
Pepper M, Dzierszinski F, Wilson E, Tait E, Fang Q, Yarovinsky F, Laufer TM, Roos D, Hunter CA. (2008) Plasmacytoid dendritic cells are activated by Toxoplasma gondii to present antigen and produce cytokines. J Immunol. 2008 180(9):6229-6236
Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M. Y., Van Huffel C., Du X., Birdwell D., Alejos E., Silva M., Galanos C., Freudenberg M., Ricciardi-Castagnoli P., Layton B. y Beutler B. (1998) Defective LPS signaling in C3H/HeJ and
14
5
10
15
20
25
C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science 282 (5396): 2085-2088
Pooga M, Hallbrink M, Zorko M, Langel U. (1998) Cell penetration by transportan. Faseb J 12(1):67-77
Schjetne K. W., Thompson K. M., Nilsen N., Flo T. H., Fleckenstein B., Iversen J. G., Espevik T., y Bogen B. (2003) Cutting edge: link between innate and adaptive immunity: Toll-like receptor 2 internalizes antigen for presentation to CD4+ T cells and could be an efficient vaccine target. J Immunol 171:32-36
Schwandner R., Dziarski R., Wesche H., Rothe M. y Kirschning C. J. (1999) Peptidoglycan-and lipoteichoic acid- induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. J Biol Chem 274 (25): 17406-17409
Slevogt H, Seybold J, Tiwari KN, Hocke AC, Jonatat C, Dietel S, Hippenstiel S, Singer BB, Bachmann S, Suttorp N, Opitz B. (2007) Moraxella catarrhalis is internalized in respiratory epithelial cells by a trigger-like mechanism and initiates a TLR2- and partly NODI-dependent inflammatory immune response. Cell Microbiol 9(3):694-707
Takeshita F, Leifer CA, Gursel I, Ishii KJ, Takeshita S, Gursel M, Klinman DM. (2001) Cutting edge: Role of Tolllike receptor 9 in CpG DNA-induced activation of human cells. J Immunol. 167(7):3555-3558
Takeuchi O., Kaufmann A., Grote K., Kawai T., Hoshino K., Morr M., Muhlradt P. F. y Akira S. (2000) Cutting edge: preferentially the R-stereoisomer of the mycoplasmal lipopeptide macrophage-activating lipopeptide-2 activates immune cells through a toll-like receptor 2- and MyD88-dependent signaling pathway. J Immunol 164 (2): 554-557
Takeuchi O., Sato S., Horiuchi T., Hoshino K., Takeda K., Dong Z., Modlin R. L. y Akira S. (2002) Cutting edge: role of Toll-like receptor 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins. J Immunol 169 (1): 10-14
Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beug, H., Birnstiel M. L. (1990) Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414
Claims (10)
- REIVINDICACIONES1. Compuesto que comprende un peptido ramificado cargado positivamente que comprende al menos cuatro residuos de arginina o al menos cuatro residuos de lisina, en donde el peptido esta unido a al menos un ligando del 5 receptor tipo Toll (TLR) que se une a TLR-2 y en donde dicho compuesto es capaz de formar un complejo estable con ADN.
- 2. Compuesto segun la reivindicacion 1, en donde el ligando de TLR se selecciona del grupo que consiste en: Pam2Cys, Pam3Cys, Ste2Cys, Lau2Cys, y Oct2Cys.10
- 3. Complejo que comprende un acido nucleico y un compuesto segun la reivindicacion 1, en donde el acido nucleico se asocia con el compuesto por interaccion electrostatica.
- 4. Uso de un compuesto o complejo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la fabricacion de un reactivo 15 para la transfeccion de celulas.
- 5. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el compuesto es un peptido ramificado cationico unido a la lipoprotema Pam2Cys, en el cual Pam2Cys tiene la estructura (I):20H------NH------CH—-COOHch2sch2H3C —(CH2}14-----CO-------O------CHHjC—{CH2)14——CO—O-----CH2
- 6. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 o la reivindicacion 5, en donde el peptido ramificado es R4, representado por la estructura:25
imagen1 - 7. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2 o la reivindicacion 5, en donde el peptido ramificado es K4, representado por la estructura:30
imagen2 - 8. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el ligando de TLR-2 es Pam2Cys y el peptido ramificado es R4, representado por la estructura:
imagen3 - 9. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el ligando de TLR-2 es Pam2Cys y el peptido ramificado es K4, representado por la estructura:
imagen4 - 10. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el compuesto es un compuesto de formula I:
imagen5 10 11. Compuesto segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde el compuesto es un compuesto de formula II:imagen6 5
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AU2007905530 | 2007-10-09 | ||
AU2007905530A AU2007905530A0 (en) | 2007-10-09 | A Method of Transfection and Compositions Therefor | |
AU2007905536A AU2007905536A0 (en) | 2007-10-09 | A Method of Transfection | |
AU2007905536 | 2007-10-09 | ||
PCT/AU2008/001501 WO2009046498A1 (en) | 2007-10-09 | 2008-10-09 | A method of transfection and compositions therefor |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2575395T3 true ES2575395T3 (es) | 2016-06-28 |
Family
ID=40548887
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES08800135.9T Active ES2575395T3 (es) | 2007-10-09 | 2008-10-09 | Composiciones para la transfección de células |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9089508B2 (es) |
EP (1) | EP2200638B1 (es) |
JP (1) | JP5743315B2 (es) |
AU (1) | AU2008310313C1 (es) |
CA (1) | CA2702154C (es) |
DK (1) | DK2200638T3 (es) |
ES (1) | ES2575395T3 (es) |
WO (1) | WO2009046498A1 (es) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2009344150B2 (en) * | 2009-04-09 | 2014-10-09 | Innavac Pty Ltd | Immunogenic composition and uses thereof |
WO2010115229A1 (en) | 2009-04-09 | 2010-10-14 | The University Of Melbourne | Immunogenic composition and uses thereof |
US9676819B2 (en) * | 2010-09-22 | 2017-06-13 | Innavac Pty Ltd | Immunostimulatory method |
DE102011018499A1 (de) | 2011-04-23 | 2012-10-25 | Emc Microcollections Gmbh | Topische Nanopartikel-Vakzine zur Immunstimulation der dendritischen Zellen in der Haut |
EP2812434B1 (en) * | 2012-02-09 | 2018-03-28 | Bavarian Nordic A/S | Agonists and antagonists of toll-like receptor (tlr) 13 |
EP2674170B1 (en) | 2012-06-15 | 2014-11-19 | Invivogen | Novel compositions of TLR7 and/or TLR8 agonists conjugated to lipids |
EP2732825B1 (en) | 2012-11-19 | 2015-07-01 | Invivogen | Conjugates of a TLR7 and/or TLR8 agonist and a TLR2 agonist |
EP2769738B1 (en) | 2013-02-22 | 2016-07-20 | Invivogen | Conjugated TLR7 and/or TLR8 and TLR2 polycationic agonists |
WO2020257870A1 (en) | 2019-06-26 | 2020-12-30 | Ena Therapeutics Pty Ltd | Novel molecules |
WO2023028649A1 (en) * | 2021-08-31 | 2023-03-09 | Ena Respiratory Pty Ltd | Allergy treatment |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ518999A (en) * | 1999-11-19 | 2002-12-20 | Csl Ltd | Vaccine compositions |
JP2004501657A (ja) * | 2000-06-28 | 2004-01-22 | マックス−デルブルック−セントラム フュール モレクラーレ メディツィン | トランスフェクション効率の改良方法 |
CN1688605B (zh) | 2002-08-12 | 2011-01-12 | 昆士兰医学研究所理事会 | 包含辅助t细胞和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)表位的新免疫原性脂肽 |
CN1688606A (zh) * | 2002-08-12 | 2005-10-26 | 昆士兰医学研究所理事会 | 含有辅助t细胞和b细胞表位的新的免疫原性脂肽 |
US20060002941A1 (en) * | 2004-01-23 | 2006-01-05 | Vievax Corp. | Compositions comprising immune response altering agents and methods of use |
EP2460533A3 (en) * | 2004-10-18 | 2014-01-08 | Globeimmune, Inc. | Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection |
EP1666056A1 (en) * | 2004-12-06 | 2006-06-07 | Bestewil Holding B.V. | Cancer vaccine vesicles |
US8420102B2 (en) * | 2006-03-07 | 2013-04-16 | Vaxinnate Corporation | Compositions that include hemagglutinin |
WO2010115229A1 (en) * | 2009-04-09 | 2010-10-14 | The University Of Melbourne | Immunogenic composition and uses thereof |
-
2008
- 2008-10-09 AU AU2008310313A patent/AU2008310313C1/en active Active
- 2008-10-09 EP EP08800135.9A patent/EP2200638B1/en active Active
- 2008-10-09 WO PCT/AU2008/001501 patent/WO2009046498A1/en active Application Filing
- 2008-10-09 DK DK08800135.9T patent/DK2200638T3/en active
- 2008-10-09 JP JP2010528245A patent/JP5743315B2/ja active Active
- 2008-10-09 ES ES08800135.9T patent/ES2575395T3/es active Active
- 2008-10-09 CA CA2702154A patent/CA2702154C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-10-09 US US12/682,415 patent/US9089508B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2702154A1 (en) | 2009-04-16 |
AU2008310313B2 (en) | 2014-08-07 |
WO2009046498A1 (en) | 2009-04-16 |
EP2200638A4 (en) | 2012-03-21 |
JP5743315B2 (ja) | 2015-07-01 |
DK2200638T3 (en) | 2016-06-06 |
US9089508B2 (en) | 2015-07-28 |
JP2010539992A (ja) | 2010-12-24 |
AU2008310313C1 (en) | 2015-02-12 |
US20100310595A1 (en) | 2010-12-09 |
EP2200638B1 (en) | 2016-03-16 |
EP2200638A1 (en) | 2010-06-30 |
AU2008310313A1 (en) | 2009-04-16 |
CA2702154C (en) | 2017-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2575395T3 (es) | Composiciones para la transfección de células | |
JP7179896B2 (ja) | 細胞透過性ペプチド、カーゴ、及びtlrペプチドアゴニストを含む新規複合体 | |
CA2884677C (en) | Cell penetrating peptides derived from the epstein barr virus, compositions and methods thereof | |
ES2407994T3 (es) | Utilización de ligando Flt3 para reforzar las respuestas inmunológicas en la inmunización con ARN | |
JP5775451B2 (ja) | インフルエンザを処置するための組成物および方法 | |
ES2655687T3 (es) | Composiciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades causadas por HPV | |
WO2011101332A1 (en) | Compositions based on the fibronectin extracellular domain a for the treatment of melanoma | |
US20230090311A1 (en) | Self-assembling, self-adjuvanting system for delivery of vaccines | |
WO2020182901A1 (en) | Nucleic acid vaccination using neo-epitope encoding constructs | |
CN108601951A (zh) | 用于治疗的免疫调节组合物 | |
EP1680446B1 (en) | Compositions comprising melittin-derived peptides and methods for the potentiation of immune responses against target antigens | |
EP4076507A1 (en) | Nucleic acid vaccination using neo-epitope encoding constructs | |
US20230109142A1 (en) | Corona virus vaccine | |
under Rule | wo 2011/101332 Ai II II II Iiii I1 1 11III III II |