JP5191740B2 - 免疫学的に活性な組成物 - Google Patents
免疫学的に活性な組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5191740B2 JP5191740B2 JP2007553350A JP2007553350A JP5191740B2 JP 5191740 B2 JP5191740 B2 JP 5191740B2 JP 2007553350 A JP2007553350 A JP 2007553350A JP 2007553350 A JP2007553350 A JP 2007553350A JP 5191740 B2 JP5191740 B2 JP 5191740B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- composition
- protein
- pathogen
- antigen
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55583—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6087—Polysaccharides; Lipopolysaccharides [LPS]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(1)少なくとも1つの病原体関連分子パターンと、
(2)場合により、少なくとも1つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
(3)組成物を生物に送達することにより防御免疫を誘導するのに有効な、少なくとも1つの担体と
を含む組成物である。
(a)少なくとも1種類の病原体関連分子パターンと、
(b)少なくとも1つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
(c)組成物を生物に送達することにより寛容性を誘導するのに有効な、少なくとも1つの担体と
を含む組成物である。
(1)TLR1受容体アゴニストと、
(2)TLR2受容体アゴニストと、
(3)TLR3受容体アゴニストと、
(4)TLR4受容体アゴニストと、
(5)TLR5受容体アゴニストと、
(6)TLR6受容体アゴニストと、
(7)TLR7受容体アゴニストと、
(8)TLR8受容体アゴニストと、
(9)TLR9受容体アゴニストと、
(10)NOD−1アゴニストと、
(11)NOD−2アゴニストと、
(12)DC−SIGNと、
(13)L−SIGNと、
(14)マンノース受容体と
からなる群から選択される。
(1)ヘパリン吸着を行うステップと、
(2)免疫親和性選択を行うステップと、
(3)場合により、免疫活性ペプチドを生成するため、免疫親和性選択により単離された1種類のタンパク質又は複数のタンパク質のタンパク質分解を行うステップと
を含む。免疫親和性選択は、当技術分野でよく知られた方法、例えば、G.T.Hermansonら、「固定化親和性リガンド技術(Immobilized Affinity Ligand Techniques)」(Academic Press,Inc.、サンディエゴ、1992年)に記載された方法により行うことができるが、他の方法もまた、当技術分野において既知である。
(1)補体結合抗体の補体タンパク質への結合を行うステップと、
(2)タンパク質抗原の免疫親和性選択に前記抗体を使用するステップと、
(3)場合により、単離されたタンパク質抗原のタンパク質分解を行うステップと
を含む。
微粒子の選択
1〜10μm範囲のアガロース微粒子は、Sterogene Bioseparations,Inc.(カールスバッド、CA)により生成され、Saturn DigiSizer 5200(Micromeritis Instrument Corp)により試験された。図1に示されたデータは、粒子分布が、75%は5μm未満、24%は5〜10μm、1%は10μm超であることを示している。
マイコプラズマ・ガリセプティカム(MG)の培養
マイコプラズマ成長培地0.1mlに、M.ガリセプティカム(K781R−16P)の凍結乾燥形態を添加し、37℃のインキュベーターの培地1.5mLに入れた。マイコプラズマの増殖を、色の変化(ピンクからオレンジ又は黄色)により、又は寒天プレートにプレーティングしコロニーをチェックしてモニターした。大量(10〜15L)のマイコプラズマ培養物は、感染培養物を新鮮培地に移して成長させた。続いて、培養物を5500rpmで30分間遠心分離した。上清のOD280が0.2未満になるまで、PBSによりペレットの洗浄を行った(5500rpmで20分間)。ペレットを、20mLのPBSで再懸濁した。
MG抗原精製のための免疫親和性カラムの製造
ステップ1:
抗M.ガリセプティカム鶏血清64mlに、脱イオン(DI)水128mLをガラスビーカー中で添加した。溶液のpHを、氷酢酸で4.5に調節した。溶液を、急速に攪拌したが、飛沫又は発泡しないように注意した。CAP−8沈殿溶液(Sterogene Bioseparations,Inc.、カールスバッド、CA)を、10分間勢いよく振盪した。続いて、CAP−8沈殿溶液64mlを計り分け、1〜2分間の攪拌により形成されたボルテックスの側壁にゆっくり添加した。次いで、攪拌速度を、溶液を動かすだけの速さまで落とした。溶液を室温で30分間攪拌し、次いで、適当な大きさにした遠心チューブに移し、沈殿物を5500rpmで15分間遠沈した。上清を容器にデカントし、ペレットを20mMの酢酸ナトリウム20mL、pH4.8バッファで1回洗浄した。上清を、0.22μmシリンジフィルターで濾過した。
SP Thruput Plusカチオン交換樹脂(Sterogene Bioseparations,Inc.、カールスバッド、CA)を、3ベッドボリュームの1M NaOHで10分間懸濁し、次いで、DI水で中性になるまで洗浄した。続いて、10ベッドボリュームの0.5M 酢酸ナトリウム、pH4.8で洗浄し、次いで、20ベッドボリュームのDI水で洗浄した。樹脂を、15ベッドボリュームの20mM 酢酸ナトリウム、pH4.8と平衡化し、20mM 酢酸、pH4.8パッキングバッファを用いてカラムに充填した。ステップ1の上清を、3mL/分の流速でカラムに充填し、カラムを20mM 酢酸ナトリウム、pH4.8バッファで洗浄した。フロースルー及び洗浄液を合わせた。20mM 酢酸ナトリウム、pH4.8に対するOD280を測定した。カラムを50mM リン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8.0バッファ、及び測定したOD280溶離剤で溶出した。
Actigel ALD活性化樹脂(Sterogene Bioseparations,Inc.、カールスバッド、CA)20mlに、精製した抗M.ガリセプティカム鶏IgG溶液を10mg/mLで添加し、続いて10.5mLの1M シアノ水素化ホウ素ナトリウム(ALD Coupling Solution、Sterogene Bioseparations,Inc.、カールスバッド、CA)を添加した。懸濁液を、20時間、2〜8℃で静かに混合し、続いてDI水で大規模洗浄した。樹脂をPBS中に、pH7.0、2〜8℃で貯蔵した。
MG抗原の精製
ステップ1:
洗浄したMG濃縮物20mlに、0.2gのMega−10界面活性剤を添加し、20時間室温で混合した。20時間のインキュベーション後、懸濁液に1mLのTriton−X100も添加し、室温でさらに1時間混合を続けた。続いて、5,000rpmで10分間遠沈した。上清をペレットから分離し、200mlのPBS、pH7.2を上清に添加した。MGタンパク質溶液は、2〜8℃で5日間保管した。
20mLベッドボリュームの抗MG鶏IgG−Actigelカラムを、5ベッドボリュームのPBS、pH7.2で流速3mL/分にて平衡化した。MGタンパク質溶液を、カラムに8〜15mL/分で充填した。フロースルーを別のボトルに回収した。カラムを、10ベッドボリュームのPBS、pH7.2で流速8〜15mL/分にて洗浄し、次いで、20〜40mLの0.1M クエン酸、pH2.5で同じ流速にて溶出した。溶出液のpHは、2MのTrisで直ちに7.2に調整した。全抗原を吸着するため、この精製を、カラムのフロースルーにより少なくとも5回繰り返した。全溶出液を合わせて、粉糖により透析バッグで一晩、2〜8℃で濃縮した。濃縮液を、5LのPBS、pH7.2に対して2〜8℃で一晩透析した。ブラッドフォードタンパク質分析を行い、血清アルブミンを基準として精製抗原の濃度を判定した。
活性化アガロース微粒子
粒子を2つの異なる方法で活性化した。第一の活性化方法は、Sterogene Bioseparations,Inc.(カールスバッド、CA)により、きわめて安定したリガンド結合を提供する市販の専用アルデヒドリンケージケミストリー(aldehyde linkage chemistry)を用いて行われた。この化学反応の別の利点は、固定化の再現性の高さにある。この専用アルデヒドケミストリーは、さまざまなリガンドの連続固定化を可能にする。
MG抗原と微粒子のカップリング
カップリング反応は、精製抗原のアミノ基及び微粒子のアルデヒド基又はCNBr活性化基の間で起こる。アルデヒド活性化粒子を用いる場合、カップリングは、実施例3で記載したカップリング試薬、シアノ水素化ホウ素ナトリウムにより媒介された。抗原を、10μg/0.2mL及び50μg/0.2mL微粒子の濃度で固定化した。
結合樹脂は、LAL水中で2〜8℃にて貯蔵した。ブラッドフォードタンパク質分析を用いて上清の非結合タンパク質を測定した。
マイコプラズマ膜の調製及びカップリング
濃縮マイコプラズマ抗原3.0mLに、80mLの加圧滅菌DI水を添加し、攪拌棒で37℃にて1時間混合した。溶液を、5000rpmで30分間遠心分離し、ペレットを、加圧滅菌水で2回洗浄した。ペレットを、10mLのPBSでもどした。1.5mLのCNBr活性化微粒子に、0.1M NaHCO3、pH8で1:3に希釈した0.5mLの精製ペレットを添加した。溶液を、2〜8℃で20時間、静かに混合した。上清を遠心分離により分離し、樹脂を10ベッドボリュームのDI水で洗浄した。結合樹脂は、LAL水中で2〜8℃にて貯蔵した。ブラッドフォードタンパク質分析を用いて上清の非結合タンパク質を測定した。
NOD1受容体活性剤と微粒子のカップリング
2μg/0.2mL樹脂におけるペプチドグリカン(PG)を、0.1M NaHCO3中で溶解し、実施例6により調製したCNBr活性化微粒子に添加した。2〜8℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるLAL用水で完全に洗浄した。
TLR3活性剤と微粒子のカップリング
10μg/0.2mLビーズにおけるPoly I:Cを、実施例6により、0.1M NaHCO3中でpH8にてCNBr活性化微粒子に固定化した。2〜8℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるLAL用水で完全に洗浄した。
TLR4活性剤と微粒子のカップリング
2μg/0.2mL樹脂における細菌のリポ多糖類を、0.1M NaHCO3中でpH8にて溶解し、実施例6によりCNBr活性化微粒子に固定化した。2〜8℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるLAL用水で完全に洗浄した。
TLR5活性剤と微粒子のカップリング
2μg/0.2mL樹脂におけるフラジェリンを、0.1M NaHCO3中でpH8にて溶解し、実施例6によりCNBr活性化微粒子に固定化した。2〜8℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるLAL用水で完全に洗浄した。
TLR1及びTLR6活性剤と微粒子のカップリング
2μg/0.2mL樹脂におけるマイコプラズマMALP−2含有表面抗原を、0.1M NaHCO3中でpH8にて溶解し、実施例6によりCNBr活性化微粒子に固定化した。2〜8℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるLAL用水で完全に洗浄した。
TLR7/TLR8活性剤と微粒子のカップリング
2μg/0.2mL樹脂における一本鎖RNA又は抗ウイルス性イミダゾキノリンイミキモド(Aldara)を、0.1M NaHCO3中でpH8にて溶解し、実施例6によりCNBr活性化微粒子に固定化した。2〜8℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるLAL用水で完全に洗浄した。
TLR9活性剤と微粒子のカップリング
10μg/0.2mL樹脂におけるCpG DNAを、0.1M NaHCO3中でpH8にて溶解し、実施例6によるCNBr活性化微粒子に固定化した。2〜8℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるLAL用水で完全に洗浄した。
組合せPAMP認識受容体アゴニスト分子組成物の微粒子への固定化
NOD1アゴニスト並びにTLRアゴニスト4及び9を、それぞれ2μg/0.2mL樹脂、10μg/0.2mL樹脂及び2μg/0.2mL樹脂において、0.1M NaHCO3中でpH8にて混合し、実施例6によるCNBr活性化微粒子に固定化した。2〜8℃で一晩反応するままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂はLAL用水で完全に洗浄し、同じLAL用水に2〜8℃で貯蔵した。
組合せPAMP認識受容体アゴニスト分子組成物を伴うMG抗原の微粒子への固定化
MG抗原を、実施例6に記載の条件下で1時間結合させた。続いて、実施例13に記載のTLRアゴニスト混合物を添加し、2〜8℃で一晩反応が進むままにした。上清は、遠心分離により分離し、樹脂は、貯蔵培地でもあるLAL用水で完全に洗浄した。
動物試験I
結果は、3つの実験の平均である。
G1〜G5 曝露前に微粒子ワクチン組成物により治療
G1=微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療のみ、及び曝露
G2=M.ガリセプティカム親和性精製抗原(10μg/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G3=受容体アゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌(E.coli))+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G4=M.ガリセプティカム親和性精製抗原(10μg/投与)及び受容体アゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌(E.coli))+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、並びに曝露
G5=M.ガリセプティカム膜(107/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療
G6〜G7 曝露後に微粒子ワクチン組成物により治療
G6=曝露、並びにM.ガリセプティカム親和性精製抗原(10μg/投与)及び受容体アゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌(E.coli))+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による曝露後の経口治療
G7=曝露、及び受容体アゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌(E.coli))+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による曝露後の経口治療
G8及びG9 陽性及び陰性対照群
G8=曝露及び未治療
G9=非曝露及び未治療
1日目:群G1〜G9を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、並びにM.ガリセプティカム及びM.シノビエの有無を確認するため、ELISAアッセイ、PCR、並びにM.ガリセプティカム及びM.シノビエの培養用に、鶏10羽を屠殺した。
0日目、G1〜G5の鶏を、異なるワクチン組成物(0.2mL/1mL PBS/鶏)で治療した。用量は上記に記載されている。G6〜G7を、曝露後15日目に治療した。
14日目、8群の鶏G1〜G8を、約8.0 log10 CFU/mlのウイルス価で、M.ガリセプティカム毒性R株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物10mlを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を0.22立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、10mlの新鮮なM.ガリセプティカムR株培養物を、1気圧下、約100秒間スプレーし、鶏を20分間曝露した。(実験室では、この方法により幾つかの実験で好成績が得られた)。
28日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、MGに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管:0=浸出液なし、1=わずかな発赤及び少量の浸出液、2=粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢:0=病変なし、1=漿液性浸出液、2=フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、3=漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢、4=多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜:0=浸出液なし、1=漿液性浸出液、2=フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、3=漿液性−線維性浸出液
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天(MA)にプレーティングし、5%CO2インキュベーターで37℃にてインキュベートした。2、4、及び7日目に、次いで、1週間間隔で最大3週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをPCRで試験し、M.ガリセプティカム及びM.シノビエを同定した。
MG曝露に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、粒子プラス受容体アゴニスト(G3、G6 p<0.001)、粒子プラス精製抗原(G2、p<0.001)及び精製抗原プラス受容体アゴニスト(G4、G6 p<0.001)で治療した群では、対照(G8)未治療、曝露群及び粒子のみによる治療群(G1)に比べて、病変スコアの大幅な低下が記録された。しかし、粒子プラス精製抗原又は粒子プラス精製抗原プラス受容体アゴニストでは、これらが曝露前に投与された場合、曝露後投与に比べて好成績が得られた。G5を、粒子に固定化したM.ガリセプティカム膜で治療した場合、幾つかのケースの病変は、曝露群自体より顕著であった。このことから、M.ガリセプティカム膜によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
マイコプラズマは、非ワクチン接種の、感染した対照鶏の内臓から再分離されることができる。非ワクチン接種対照群(G8、p<0.01)及び粒子のみによる治療群(G1、p<0.001〜0.01)又は粒子プラス受容体アゴニスト治療群(G3、G7 p<0.05)と比べて、再分離率(呼吸器+内臓からの)の著しい低下が、受容体アゴニストの有無にかかわらず、粒子プラス精製抗原治療群(G2、G4、G6)で認められた。しかし、粒子プラス受容体アゴニスト治療群(G3、G6)及び対照群(G8)の間には、再分離率の著しい低下(p<0.05)があった。実験群の呼吸管(気管、肺、気嚢)又は他の内臓(肝臓、脾臓、腎臓及び心臓)からのマイコプラズマの再分離率を比較した場合、類似する結果が得られた。G5を、粒子に固定化したM.ガリセプティカム膜で治療した場合、幾つかのケースで臓器からのM.ガリセプティカムの再分離率は、曝露群自体よりも高かった。このことから、M.ガリセプティカム膜によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
各群の血清学的応答は、実験の最後に違いが見られた。非治療の、曝露群(G8)の応答は、粒子のみによる治療群(G1)と違わなかった。同時に、粒子のみによる治療群(G1)に比べ、有意に強い応答が、粒子プラス精製抗原及びPRRアゴニスト治療群(G4)で見られた(p<0.05)。粒子プラス精製抗原治療群(G2)に比べ、PRRを加えた場合(G4、G6)、有意に高い血清学的応答が見られた(p<0.05)。抗原及びPRRを伴う粒子を曝露前(G4)又は曝露後(G6)に使用した場合、血清学的結果の間に有意差は見られなかった。
M.ガリセプティカムは、気管、気嚢及び肺のコロニー形成を伴う著しい炎症を、気嚢及び腹膜で引き起こすことができる。マイコプラズマも、内臓からしばしば検出されうる。本発明者らは、異なるPRRアゴニスト分子と共に共有結合で固定化された免疫親和性精製抗原を有する、微生物のサイズ範囲(<5μm)の微粒子からなる、新しいタイプの「病原体模倣」免疫学的活性組成物を開発した。
親和性精製MG抗原を、先の実施例に記載されたように調製した。精製抗原を、固定化前に以下の処理のため3群に分けた。
抗原53.6ml(約1.5mg)に、2.5単位の酵素を添加し、37℃で一晩インキュベートした。翌日、混合物を、冷却し固定化したマンナンカラム(5mL)に通過させ、フロースルーを回収した。この試料をEndoH抗原と命名した。
抗原53.6mL(約1.5mg)に、固体過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度が15mMになるまで添加し、混合後1時間冷却した。2倍モル過剰でグリセリンを添加し、試料をさらに1時間インキュベートした。PBSに対し透析を一晩行った。透析した試料を過ヨウ素酸塩(PJ)抗原と命名した。
精製抗原(53.6mL中約1.5mg)を、2mL固定化ConAカラムに通過させた。フロースルーを回収した。この試料をConAフロースルーと命名した。結合抗原を、50mM TRIS、pH9.5中で1M アルファ−メチルマンノグルコシドにより溶出した。この試料をConA溶出と命名した。
抗原の特性を表2に示す。
*EndoH処理では、処理した抗原の初期量は、2.51mgであった。(この製剤53.6ml、及び0.0246mg/mlの先のM.ガリセプティカム製剤40.3ml)
動物試験II
結果は、3つの実験の平均である。3日齢のヒヨコ(M.ガリセプティカム(MG)及びM.シノビエ(M.Synoviae)(MS)が認められず、ELISAでMG及びMS母性抗体が検出されない)を、ワクチン接種した。各群を鶏10羽とした。実験14日目に、鶏をM.ガリセプティカムRlow株に曝露した。試験は、28日目に終了した。
各群は、以下のように設定した。
G1=非曝露及び未治療
G2=曝露及び未治療
曝露前2週間に治療
G3=M.ガリセプティカム親和性精製抗原(10μg/投与)及びTLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、並びに曝露
G4=M.ガリセプティカム親和性精製抗原(50μg/投与)及びTLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、並びに曝露
G5=M.ガリセプティカム親和性精製ConA吸着抗原(10μg)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G6=M.ガリセプティカム親和性精製EndoH分解抗原(10μg)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G7=M.ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原(10μg)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G8=M.ガリセプティカム親和性精製ConA吸着抗原(10μg)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G9=M.ガリセプティカム親和性精製ConA吸着抗原(50μg)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G10=M.ガリセプティカム親和性精製EndoH分解抗原(10μg)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G11=M.ガリセプティカム親和性精製EndoH分解抗原(50μg)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G12=M.ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原(10μg)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G13=M.ガリセプティカム親和性精製過ヨウ素酸塩酸化抗原(50μg)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G14=M.ガリセプティカム親和性精製EndoH分解抗原(10μg)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)プラスアミノグアニジン(腹腔内)による7日間の経口治療、及び曝露
G15=ビーズ上のM.ガリセプティカム抗原ConA溶出を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
1日目:群G1〜G15を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、及びマイコプラズマの有無を確認するため、ELISAアッセイ、PCR、並びにM.ガリセプティカム及びM.シノビエの培養用に、鶏10羽を屠殺した。
14日目:群G2〜G15の曝露
14日目、14群の鶏G2〜G15を、約8.0 log10 CFU/mlのウイルス価で、M.ガリセプティカム毒性R株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物10mlを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を0.22立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、10mlの新鮮なM.ガリセプティカムR株培養物を、1気圧下、約100秒間スプレーし、鶏を20分間曝露した。(実験室では、この方法により幾つかの実験で好成績が得られた)。
28日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、MGに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管:0=浸出液なし、1=わずかな発赤及び少量の浸出液、2=粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢:0=病変なし、1=漿液性浸出液、2=フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、3=漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢壁、4=多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜:0=浸出液なし、1=漿液性浸出液、2=フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、3=漿液性−線維性浸出液
結果を表3に示す。
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天(MA)にプレーティングし、5%CO2インキュベーターで37℃にてインキュベートした。2、4、及び7日目に、次いで、1週間間隔で最大3週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをPCRで試験し、M.ガリセプティカム及びM.シノビエを同定した。
MG曝露後に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、精製抗原プラスTLRでワクチン接種した群(このうち最も良好な群は、ConAカラム著減抗原(G9)であった)は、対照未治療、曝露群に比べて、病変スコア及び再分離率の大幅な低下が記録された。しかし、ConA溶出抗原画分G15では、病変スコアは高く、再分離率は陽性対照群と同じであった。このことから、このM.ガリセプティカム抗原画分によるワクチン接種は、病原体による曝露に対する適切な免疫応答を妨げ、免疫抑制を引き起こし、より著明な感染をもたらすという結論に至る。
これらの実験の結果は、免疫抑制抗原の親和性精製抗原プールからの除去が、ワクチン組成物の防御効果を著しく改善したことを示している。さらに、抗原における転写後修飾を含有する糖の化学修飾又は酵素分解もまた、防御免疫の改善をもたらした。
親和性精製MG抗原を、先の実施例に記載されたように調製した。精製抗原を、固定化前に以下の処理のため3群に分けた。
抗原27mL(約0.65mg)に、8mLの1M NaOH及び10mgのペンタデカン酸を添加し、溶液を、70℃で45分間静かに攪拌した。次いで、pHを8.0に調節し、沈殿物を、3,000rmpで5分間、遠心分離により除去した。この試料を脱アシル化抗原と命名した。
これは、実施例18よりストリンジェントな反応を意図したものである。抗原25mL(約0.6mg)に、固体過ヨウ素酸ナトリウムを最終濃度が80mMになるまで添加し、混合後2.5時間、室温で保管した。次いで、2倍のモルアクセス(molar access)でグリセリンを添加し、試料をさらに1時間インキュベートした。PBSに対し透析を一晩行った。透析した試料を過ヨウ素酸塩抗原と命名した。
動物試験III
結果は、3つの実験の平均である。3日齢のヒヨコ(M.ガリセプティカム(MG)及びM.シノビエ(M.Synoviae)(MS)が認められず、ELISAでMG及びMS母性抗体が検出されない)を、ワクチン接種した。各群を鶏10羽とした。実験14日目に、鶏をM.ガリセプティカムRlow株に曝露した。試験は、28日目に終了した。
G1=非曝露及び未治療
G2=曝露及び未治療
曝露前2週間に治療:
G3=M.ガリセプティカム親和性精製、ConA吸着抗原(10μg/投与)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G4=M.ガリセプティカム親和性精製、脱アシル化抗原(10μg/投与)+TLRアゴニスト(10μg細菌DNA(大腸菌)+2μg大腸菌LPS及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G5=M.ガリセプティカム親和性精製、ConA吸着抗原(10μg)+TLRアゴニスト(25μg poly I:C+10μg細菌DNA+2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
G6=M.ガリセプティカム親和性精製、過ヨウ素酸塩処理された脱アシル化抗原(10μg)+TLRアゴニスト(10μg poly I:C+10μg細菌DNA、及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
曝露後1日目に治療:
G7=M.ガリセプティカム親和性精製ConA吸着抗原(10μg)+TLRアゴニスト(25μg poly I:C+10μg細菌DNA、及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療
G8=M.ガリセプティカム親和性精製、過ヨウ素酸塩処理された脱アシル化抗原(10μg)+TLRアゴニスト(25μg poly I:C+10μg細菌DNA、及び2μgペプチドグリカン/投与)を伴う微粒子(0.2mL/鶏)による経口治療、及び曝露
1日目:群G1〜G9を設定。実験鶏が、母性抗体陰性であること、及びマイコプラズマの有無を確認するため、ELISAアッセイ、PCR、並びにM.ガリセプティカム及びM.シノビエの培養用に、鶏10羽を屠殺した。
14日目、9群の鶏G2〜G9を、約8.0 log10 CFU/mlのウイルス価で、M.ガリセプティカム毒性R株の新鮮ブロス培養物により曝露した。この新鮮ブロス培養物10mlを、スプレー法でこれらの群それぞれに投与した。簡単には、鶏を0.22立方メートルの隔離ユニットに入れた。次いで、10mlの新鮮なM.ガリセプティカムR株培養物を、1気圧下、約100秒間スプレーし、鶏を20分間曝露した。
28日目、実験研究の最後に、全群を安楽死させた。各鶏を剖検し、MGに関連した肉眼病変を採点した。気管、左右の胸気嚢及び腹膜における浸出液の有無を記録した。病変は、以下の方式により採点した。
気管:0=浸出液なし、1=わずかな発赤及び少量の浸出液、2=粘膜の発赤、浸出液
左右の気嚢:0=病変なし、1=漿液性浸出液、2=フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、3=漿液性、線維性浸出液、わずかに肥厚した気嚢壁、4=多量の線維性浸出液、きわめて肥厚した気嚢壁
腹膜:0=浸出液なし、1=漿液性浸出液、2=フィブリン小片を伴う漿液性浸出液、3=漿液性−線維性浸出液
結果を表4に示す。
剖検実験の間、気管、胸気嚢、肝臓、肺、脾臓、腎臓及び心臓を綿棒で無菌採取した。綿棒からの物質を、次いでマイコプラズマ寒天(MA)にプレーティングし、5%CO2インキュベーターで37℃にてインキュベートした。2、4、及び7日目に、次いで、1週間間隔で最大3週間、プレートのマイコプラズマを観察した。陽性コロニーをPCRで試験し、M.ガリセプティカム及びM.シノビエを同定した。
MG曝露後に、重大な病変を気嚢及び腹膜に認めた。しかし、処理された精製抗原プラスTLR群でワクチン接種した群で、病変スコア及び再分離率の大幅な低下が記録され、全群は同程度の結果であり、対照未治療曝露群に比べ、脱アシル化抗原(G4)が最も良かった。感染後にワクチン接種した群では、ConA処理抗原プラスTLR3、4、9が最も良い結果をもたらした。感染後であっても、この組成物により防御免疫を得ることは可能であるように思われる。
これらの実験の結果は、免疫抑制回避抗原又は抗原決定基の親和性精製抗原プールからの除去又は遮断が、ワクチン組成物の防御効果を著しく改善したことを示している。さらに、抗原における転写後修飾(N−グリコシル化)を含有する糖の除去及び化学修飾もまた、防御免疫の改善をもたらした。さらに、抗原の脂質部分が、化学的に除去され、又は遮断されたことも、著しい免疫防御効果につながった。
インビトロ試験
TNF−α分泌を、末梢血から調製したPBMCで測定し、ペプチドグリカン(PepG)(Sigma、セントルイス、MI)、細菌CpG DNA(KM Biomedicals、オーロラ、OH;リムルス変形細胞溶解物アッセイ(Limulus Amoebocyte lysate assay)で測定したLPS<0.2EU/ml)、又は両方により処理した。TNF−αを、5時間のインキュベーション後、培養上清からELISAにより測定した。
末梢血単核細胞を、健常なボランティアからの末梢血のフィコール分離により調製した。単核細胞を、1.5ml RPMI−1640(Irvine Scientific,Irvine、CA)で106細胞/mlの濃度でプレーティングし、100 U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mMグルタミン及び3%ウシ胎仔血清を補充し、微粒子0.15mL(滅菌PBS中)と共に18時間インキュベートした。微粒子は、ConAにより露出された(Con A−stripped)又は過ヨウ素酸ナトリウム処理された抗原のほか、以下のグラフに示されたTLRアゴニスト2、3、4及び9を含有した。ビーズの調製は、実施例19に記載されている。
免疫モジュレーター微粒子に対する細胞性応答の特徴をさらに明らかにするため、本発明者らは、樹状細胞をこうした微粒子に曝露した。本発明者らは、MHC I及びMHC II分子、並びに共刺激分子CD80及びCD86のアップレギュレーションを観察した。どちらかのPRRアゴニストの組合せが存在することは、処理18時間後の樹状細胞表面におけるMHC IIの増加を測定するのに必要と思われる。細胞表面のMHCの存在は、動的過程であるため、細胞表面のMHC分子の増加を観察するには、ConA Agビーズでは異なるインキュベーション時間が必要となる可能性がある。MHCは、T細胞への抗原提示を可能にし、CD86は、T細胞のCD28と相互作用する。樹状細胞による同時の抗原提示、及びB7共刺激リガンド(CD80及びCD86など)相互作用は、T細胞活性化をもたらす。これらインビトロでのデータは、樹状細胞変異の顕著な特徴であり、先天性及び適応免疫の誘導を必要とする変化を、微粒子が誘導することを示している。
ヘパリン結合タンパク質のMGからの精製
M.ガリセプティカムを、実施例2に記載の通りに成長させ、濃縮し洗浄したマイコプラズマを、実施例4のステップ1に開示の通りに不活化した。簡単には、MG膜粗タンパク質75mLに、0.75Mega−10を添加し、溶液を室温で20時間混合した。続いて、3.75mlのTriton X−100を溶液に添加し、室温でさらに1時間混合した。溶液を5,000rpmで10分間遠沈し、上清をペレットから分離した。次いで、Trisバッファ75ml(20mM Tris、0.1M NaCl、pH7.2)を上清に添加した。Heparin−Actigelカラムを、5ベッドボリュームのTrisバッファにより流速3ml/分で平衡化した。MGタンパク質溶液をカラムに流速8〜15ml/分で充填し、フロースルーを別のボトルに回収した。カラムを、10ベッドボリュームのTrisバッファにより流速8〜15ml/分で洗浄し、2M NaCl含有Trisバッファにより流速8〜15ml/分で溶出した。カラムを10ベッドボリュームのTrisバッファで洗浄後、MGタンパク質溶液をカラムに再び加え、上述した通りに溶出を繰り返した。溶出物をプールし、3,500MWカットオフ透析チューブ法により、Trisバッファに対し透析した。タンパク質アッセイを行い、溶出したタンパク質濃度を判定した。
中和血清からのIgGの精製及び免疫親和性カラムの製造
ワクチン接種した、中和鶏血清からのIgG大量精製及びActigel ALDへの固定化を実施例3により行った。
免疫親和性カラムに結合したヘパリン結合MGタンパク質のトリプシン消化
精製MGタンパク質2mgを、2mlの免疫親和性カラムに添加し、15分間結合させた。カラムを、10mlのTrisバッファB(50mM Tris、pH7.5、0.1M NaCl)で洗浄した。トリプシン溶液(TrisバッファB中20μg/ml)を添加し、スラリーを37℃で1時間、静かに攪拌した。フラグメント及び遊離酵素をTrisバッファBで洗い流し、結合したペプチドを0.1Mのクエン酸、pH2.5で溶出した。溶出物を続いてcc.NH4OHで中和、濃縮し、C−18逆相スピンカラム(Pierce)精製し、ペプチド組成物をMALDI−TOFで分析した。
ヘパリンカラムに結合したヘパリン結合MGタンパク質のトリプシン消化
精製MGタンパク質2mgを、2mlのHeparin Actigelカラムに添加し、1時間結合させた。カラムを、10mlのTrisバッファBで洗浄した。トリプシン溶液(TrisバッファB中20μg/ml)を添加し、スラリーを37℃で1時間、静かに攪拌した。フラグメントをTrisバッファBで洗い流し、結合したペプチドを1MのNaClを含有するTrisバッファBで溶出した。溶出物を濃縮し、C−18逆相スピンカラム(Pierce)で精製し、ペプチド組成物をMALDI−TOFで分析した。
C1qタンパク質の精製及び固定化
C1qの精製を、McKay,EJ「さまざまな動物種由来血漿C1qを精製するための簡単な2段階手順(A simple two−step procedure for the purification of plasma C1q from different animal species)」、Immunol Letters、1981年3:303〜308頁の方法により行った。精製したC1qを、米国特許第5,801,063号に記載された本発明者らの手順の適応により、Aminogel(Sterogene Bioseparations,Inc.、カールスバッド、CA)に3mg/mlで固定化した。
補体結合IgGの精製及び固定化
実施例24により精製されたポリクローナル中和抗体を、固定化C1qの10mlカラムに加え、TrisバッファBで平衡化し、30分間結合させた。非結合抗体を、10ベッドボリュームのTrisバッファBで洗浄して除去し、結合抗体を、1M NaClを含有する同じバッファで溶出した。精製されたIgGを、続いてActigel ALDに3mg/mlで固定化した。
免疫親和性カラムに結合した補体活性化MGタンパク質のトリプシン消化
M.ガリセプティカムを、実施例2に記載の通りに成長させ、濃縮し洗浄したマイコプラズマを、実施例4のステップ1に開示の通りに不活化した。固定化した補体活性化抗体の10mLカラムに、MG溶解物30mlを3ml/分で加えた。カラムを、20ベッドボリュームのTrisバッファBにより流速8ml/分で洗浄し、非特異的吸着タンパク質を除去した。トリプシン溶液(TrisバッファB中20μg/ml)を添加し、スラリーを37℃で1時間、静かに攪拌した。フラグメントをTrisバッファBで洗浄して除去し、結合したペプチドを0.1Mのクエン酸、pH2.5で溶出した。溶出物を続いてcc.NH4OHで中和、濃縮し、C−18逆相スピンカラム(Pierce)で精製し、ペプチド組成物をMALDI−TOFで分析した。
抗原ペプチドエピトープ及びマルチエピトープペプチドの合成
抗原ペプチドをFMOC方法により合成した。
ワクチンのための防御抗原ペプチドの確認
抗原ペプチドを、ワクチン接種した鶏の中和血清と混合し、固定化したヘパリンに対する結合阻害を競合ELISAにより判定した。ペプチド試料を、ELISAプレートのウェルに吸着した。続いて、ウェルを、ブロッキング溶液でブロックし、免疫及び非免疫対照抗血清を、続いてウェルに添加し、一晩4℃でインキュベートした。非特異的タンパク質を、洗浄液で除去した後、100μg/mlのビオチン標識ヘパリンを添加し、ブロッキングバッファ中で1時間希釈した。非結合ヘパリンを、3回、各10分間洗浄した後、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを添加し、ブロッキングバッファ中で1時間、1:3,000に希釈した。過剰な結合体を、3回、各10分間、洗浄バッファで洗浄して除去し、3,3’−ジアミノベンジジン溶液を添加して発色させた。シグナルは、中和抗体の存在に反比例する。
病原体抗原タンパク質のバイオインフォマティクス解析は、高い抗原能のエピトープの同定をもたらすこともできる。こうした解析は、これまでにM.ガリセプティカムMGAタンパク質について行われている。抗原領域を、直鎖塩基モチーフの文脈でさらに解析した。こうした抗原性の高い予測直鎖モチーフは、以下の配列である:MHC Iエピトープ 10−merは、LLAKKTDKSV(SEQ ID NO:4)、MHC II 15−merは、LLAKKTDKSVSPAQAS(SEQ ID NO:5)である。これらの領域は、SYFPEITHI法(www.syfpeithi.de)により同定した。これは、直鎖塩基モチーフは、実際に抗原性向の高いスポットの内側に含まれていることを示す。バイオインフォマティクス解析は、J.Pevsner、「バイオインフォマティクス及び機能ゲノミクス(Bioinformatics and Functional Genomics)」、(Wiley−Liss、Hoboken、N.J.、2003年)に記載されたものなど、当技術分野で周知の方法により、当技術分野で周知のデータマイニング及びマッチング並びに配列比較のためのデータベース及びコンピュータ解析法を用いて、行うことができる。
抗原エピトープ抗体の精製
精製抗原ペプチドを、末端ビオチン標識で合成する。ビオチン標識ペプチドを、1mg/ml濃度でAvidin Actigel(Sterogene Bioseparations,Inc.、カールスバッド、CA)に固定化する。ワクチン接種した鶏由来の中和抗血清を、飽和濃度で添加し、非特異的結合タンパク質を、リン酸緩衝液生理食塩水(PBS)、pH7.2で洗浄して除去した。特異的抗体は、Actisep Elution Medium(Sterogene Bioseparations,Inc.、カールスバッド、CA)で溶出する。
本発明は、例えば、免疫応答を誘導する、防御免疫応答を誘発する、又は寛容性を誘発するなどの目的に合わせることのできる、改善された免疫調節組成物及び方法を提供する。これらの組成物は、安定であり、免疫応答に所望の効果をもたらすため、幅広い免疫原及び標的分子により調製することができる。これら組成物は、このような物質の非経口投与の追加となる投与経路を提供する。これらは、免疫原及び標的分子の時期尚早の分解又は放出を防止する。粒子は、粒子と粘膜との相互作用を改善し、取り込みを促すことができる固有の粘膜接着特性を有する。これらは、追加のアジュバントを必要としない。
Claims (50)
- 防御免疫を誘導する免疫学的に活性な組成物であって、
(a)少なくとも1種類の病原体関連分子パターンと、
(b)少なくとも1つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープと、
(c)前記組成物を生物に送達することにより防御免疫を誘導するのに有効な担体と
を含み、該担体が微粒子アガロースであり、該少なくとも1種類の病原体関連分子パターンと、少なくとも1つの免疫活性な抗原又は抗原エピトープが単一のアガロース微粒子担体に共有結合している、上記組成物。 - 少なくとも1つの免疫活性な抗原エピトープが、エスケープエピトープではない、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド、タンパク質、組換えペプチド若しくはマルチペプチド、組換えタンパク質、脂質、炭水化物からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性モチーフを有する、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記ペプチド又はタンパク質は、免疫調節モチーフを有し、前記免疫調節モチーフは、本来は疎水性であり、モチーフに結合した別の分子を有し、該別の分子は、受容体と相互作用することができる、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後修飾を有する、請求項1に記載の組成物。
- 転写後調節が、炭水化物及び/又は脂質部分を含む、請求項6に記載の組成物。
- 転写後調節が、末端マンノシル化を含む、請求項6に記載の組成物。
- 免疫調節の末端マンノシル化物質が、酸化ステップ、酵素処理及び糖特異的親和性結合からなる群から選択されるステップにより免疫防御組成物から著減した、請求項8に記載の組成物。
- 転写後調節が、脂質部分を含み、前記脂質部分は、脱脂により除去される、請求項7に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、免疫調節性転写後修飾を有さない、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性ペプチド又はタンパク質は、N−グリコシル化及び/又はリポイル化が可能なアミノ酸配列を有さない、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性タンパク質又はペプチドは、細胞表面侵入受容体を結合可能なアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、前記免疫活性なタンパク質又はペプチドは、細胞表面グリコサミノグリカン(GAG)を結合可能なアミノ酸配列を有する、請求項1又は2に記載の組成物。
- アミノ酸配列が、本来多塩基性であり、かつ、アミノ酸が、一般式XBBXBX、XBBBXXBX、BBXXBBBXXBB、BBBXXB、BXBXB、BBB、BXBXXXBXB、又はBXBXXXXXBXBを有し、ここで、Bは塩基性アミノ酸であり、Xはいずれか他のアミノ酸である、請求項14に記載の組成物。
- GAG結合アミノ酸配列が、病原体が細胞表面に結合するのを干渉可能なペプチド又はタンパク質に対する抗体を産生するのに使用される、請求項14に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、病原体が細胞の侵入受容体と結合するのを干渉することが可能なエピトープに対する抗体を産生するのに使用される、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、病原体がGAGを介して細胞表面又は侵入受容体に結合するのを干渉することが可能なエピトープに対する抗体を産生するのに使用される、請求項1に記載の組成物。
- 多塩基性アミノ酸配列が、侵入受容体の遮断を標的にする、請求項15に記載の組成物。
- 病原体が細胞表面に結合するのを干渉する抗体が、グリコサミノグリカン(GAG)又は結果的に免疫回避をもたらす受容体といった、侵入受容体を遮断する多塩基性アミノ酸配列に対する抗体である、請求項16に記載の組成物。
- 侵入受容体が、DC−SIGNである、請求項20に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原ペプチド又はタンパク質が、ヘパリン及びこの類似体からなる群から選択されるGAGを結合可能なアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原ペプチド又はタンパク質が、単独又は抗体と併用して、補体活性化活性を有する、請求項14に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、単一のマルチペプチドに合体される複数のペプチドである、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、補体を結合及び活性化することが可能な抗体を誘導するのに使用される、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、T細胞エピトープ及びB細胞エピトープのいずれか又は両方を含む、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、N−グリコシル化及び/又はリポイル化配列が宿主におけるこれらの受容体と結合するのを干渉することができる抗体を誘発することが可能であり、該受容体が、DC−SIGN及びL−SIGN受容体からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 免疫活性な抗原エピトープが、ペプチド又はタンパク質であり、N−グリコシル化及び/又はリポイル化配列が宿主におけるこれらの受容体と結合するのを干渉し、IL−10産生を防止又は低減することができる抗体を誘発することが可能な、請求項1に記載の組成物。
- 病原体関連分子パターンが、
(a)TLR1受容体アゴニストと、
(b)TLR2受容体アゴニストと、
(c)TLR3受容体アゴニストと、
(d)TLR4受容体アゴニストと、
(e)TLR5受容体アゴニストと、
(f)TLR6受容体アゴニストと、
(g)TLR7受容体アゴニストと、
(h)TLR8受容体アゴニストと、
(i)TLR9受容体アゴニストと、
(j)NOD−1アゴニストと、
(k)NOD−2アゴニストと、
(l)DC−SIGNと、
(m)L−SIGNと、
からなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。 - 微粒子アガロース担体が、狭いサイズ分布範囲を有する微粒子を含む、請求項1に記載の組成物。
- 微粒子アガロース担体が、多孔性である微粒子を含む、請求項1に記載の組成物。
- 微粒子アガロース担体が、直径10μm未満である微粒子を含む、請求項1に記載の組成物。
- 微粒子アガロース担体が、直径5μm未満である微粒子を含む、請求項32に記載の組成物。
- 対象における免疫応答を誘発するのに有用な医薬の製造のための、単一のアガロース微粒子担体と各々共有結合している少なくとも1つの免疫活性な抗原エピトープ及び少なくとも1つの病原体認識(PR)受容体アゴニストを含む組成物の使用であって、前記アガロース微粒子担体の微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記使用。
- 組成物が、1つを超える病原体認識受容体アゴニストを含む、請求項34に記載の使用。
- 病原体又は病原体の一部が、IL−10を誘導することができるタンパク質又は受容体と結合するのを干渉することができるエピトープ遮断により、防御免疫が生じる、請求項34に記載の使用。
- 1つを超える免疫活性な抗原エピトープ及び1つを超えるパターン認識受容体アゴニストが、単一のアガロース微粒子担体と共有結合している、請求項1に記載の組成物。
- 1つを超える免疫活性な抗原エピトープが、T細胞エピトープ及びB細胞エピトープの両方を含む、請求項37に記載の組成物。
- 1つを超えるパターン認識受容体アゴニストが、単一のアガロース微粒子担体と共有結合している、請求項1に記載の組成物。
- 少なくとも1つの病原体に対する防御免疫応答を誘発するのに有用な医薬の製造のための、単一のアガロース微粒子担体と各々共有結合している1つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープと、PR受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の使用であって、前記アガロース微粒子担体の微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、免疫応答が、Th1若しくはTh2応答又は両方の組合せを含み、かつ、該医薬が、単回又は複数回投与することができるように適用される、上記使用。
- 少なくとも1つの病原体に対する防御免疫応答を誘発するための医薬の製造のための、単一のアガロース微粒子担体と各々共有結合している1つ又は複数の免疫活性な抗原エピトープ(免疫学的回避機構に関与する抗原を除く)と、PR受容体アゴニストの組合せとを含む組成物の使用であって、前記アガロース微粒子担体の微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にあり、かつ、該医薬が、単回又は複数回投与することができるように適用される、上記使用。
- 病原体が、マイコプラズマである、請求項41に記載の使用。
- マイコプラズマが、マイコプラズマ・ガリセプティカム(Mycoplasma gallisepticum)である、請求項42に記載の使用。
- 免疫応答が、病原微生物におけるグリコサミノグリカン結合要素を干渉する、請求項34、40又は41に記載の使用。
- 免疫応答が、病原体に感染した細胞を排除する、請求項34、40又は41に記載の使用。
- 実質的に病原体がいない動物を作製するのに有用な医薬の製造のための、単一のアガロース微粒子担体と各々共有結合している少なくとも1つの免疫活性な抗原エピトープ、及び少なくとも1つの病原体認識(PR)受容体アゴニストを含む組成物の使用であって、前記アガロース微粒子担体の微粒子が、病原体よりも小さい又は同じサイズ範囲にある、上記使用。
- 組成物により誘導される免疫応答が、病原性微生物の標的細胞への侵入を干渉する、請求項46に記載の使用。
- 組成物により誘導される免疫応答が、病原性微生物におけるグリコサミノグリカン結合要素を干渉する、請求項46に記載の使用。
- 動物が、家禽及び哺乳類からなる群から選択される、請求項46に記載の使用。
- 動物が、家禽であって、鶏である、請求項49に記載の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64816505P | 2005-01-28 | 2005-01-28 | |
US60/648,165 | 2005-01-28 | ||
PCT/US2006/003349 WO2006081576A2 (en) | 2005-01-28 | 2006-01-30 | Immunologically active compositions |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008529976A JP2008529976A (ja) | 2008-08-07 |
JP2008529976A5 JP2008529976A5 (ja) | 2009-03-12 |
JP5191740B2 true JP5191740B2 (ja) | 2013-05-08 |
Family
ID=36741156
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007553350A Expired - Fee Related JP5191740B2 (ja) | 2005-01-28 | 2006-01-30 | 免疫学的に活性な組成物 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9138467B2 (ja) |
EP (1) | EP1861117A4 (ja) |
JP (1) | JP5191740B2 (ja) |
KR (2) | KR101415864B1 (ja) |
CN (3) | CN107261127A (ja) |
AU (2) | AU2006207891C1 (ja) |
BR (1) | BRPI0607254A2 (ja) |
CA (1) | CA2606349C (ja) |
IL (1) | IL184907A (ja) |
MX (1) | MX2007009177A (ja) |
NZ (1) | NZ560543A (ja) |
RU (1) | RU2461390C2 (ja) |
WO (1) | WO2006081576A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200707249B (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2010239463B2 (en) * | 2009-04-20 | 2016-12-08 | Galenbio, Inc. | Compositions for transfection of biomolecules into cells |
WO2014039978A2 (en) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | Szathmary Dr Susan | Vaccine to prevent mycoplasmal infection in waterfowl |
CN105518447B (zh) * | 2013-09-09 | 2018-01-16 | 株式会社岛津制作所 | 肽片段的制备方法及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒、以及分析方法 |
CN107407666A (zh) * | 2015-03-09 | 2017-11-28 | 株式会社岛津制作所 | 使用质谱分析的单克隆抗体的检测方法 |
CN107407665A (zh) * | 2015-03-10 | 2017-11-28 | 株式会社岛津制作所 | 用于检测单克隆抗体的样品调制用试剂盒 |
US20230053449A1 (en) | 2018-10-31 | 2023-02-23 | Novartis Ag | Dc-sign antibody drug conjugates |
RU2743363C1 (ru) * | 2020-06-03 | 2021-02-17 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ тестирования иммунологической толерантности у животных |
RU2752967C1 (ru) * | 2021-02-10 | 2021-08-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) | Способ индукции антигенассоциированного иммунного ответа |
WO2023010117A1 (en) * | 2021-07-30 | 2023-02-02 | William Marsh Rice University | Identification of pro- and anti-inflammatory lipids relating to immune response to medical implants |
Family Cites Families (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5603960A (en) * | 1993-05-25 | 1997-02-18 | O'hagan; Derek T. | Preparation of microparticles and method of immunization |
US5801063A (en) * | 1995-05-09 | 1998-09-01 | Grandics; Peter | Device and process for the biospecific removal of heparin |
JPH11255664A (ja) | 1998-03-10 | 1999-09-21 | Ajinomoto Co Inc | 経口投与用免疫増強剤 |
US6521431B1 (en) * | 1999-06-22 | 2003-02-18 | Access Pharmaceuticals, Inc. | Biodegradable cross-linkers having a polyacid connected to reactive groups for cross-linking polymer filaments |
US20030232055A1 (en) * | 2000-07-31 | 2003-12-18 | Ruslan Medzhitov | Innate immune system-directed vaccines |
US20020061312A1 (en) * | 2000-07-31 | 2002-05-23 | Ruslan Medzhitov | Innate immune system-directed vaccines |
US20060142202A1 (en) * | 2000-12-08 | 2006-06-29 | 3M Innovative Properties Company | Compositions and methods for targeted delivery of immune response modifiers |
US20030175287A1 (en) * | 2001-01-03 | 2003-09-18 | Yale University | Innate immune system-directed vaccines |
RU2197248C2 (ru) * | 2001-03-20 | 2003-01-27 | Травкин Олег Викторович | Лекарственный препарат, обладающий иммуномоделирующим, иммунокоррегирующим, противопаразитарным, противосклеротическим, противовирусным, противобактериальным, противогрибковым, противовоспалительным и противоопухолевым действием, и способ его приготовления |
JP2004536585A (ja) * | 2001-05-09 | 2004-12-09 | エール・ユニバーシティ | トル/インターロイキン−1受容体アダプタータンパク質(tirap) |
WO2003028661A2 (en) | 2001-10-03 | 2003-04-10 | Chiron Corporation | Adjuvanted meningococcus compositions |
FR2832410B1 (fr) * | 2001-11-19 | 2004-04-02 | Pasteur Institut | Antigene mycobacterien recombinant de type hemagglutinine de liaison a l'heparine methylee, procedes de preparation et compositions immunogenes comprenant un tel antigene |
AU2002361682A1 (en) * | 2001-12-14 | 2003-06-30 | Elizabeth Kopp | Innate immune system-directed vaccines |
MXPA01013257A (es) | 2001-12-18 | 2003-06-25 | Arturo Jimenez Bayardo | Suspension oftalmica de rofecoxib para el tratamiento de la inflamacion y el dolor ocular. |
EP1573030A2 (en) * | 2002-01-09 | 2005-09-14 | Yale University | Irak-m is a negative regulator of toll-like receptor signaling |
US20030224388A1 (en) * | 2002-01-09 | 2003-12-04 | Flavell Richard A. | RIP2: a mediator of signaling in the innate and adaptive immune systems |
SI1478327T1 (sl) * | 2002-02-22 | 2015-08-31 | Meda Ab | Metoda za zmanjšanje in zdravljenje imunosupresije, inducirane z UV-B |
CN1440812A (zh) * | 2002-02-27 | 2003-09-10 | 上海中信国健药业有限公司 | 一种使用cd137结合激动剂增强免疫应答的方法 |
US20060121460A1 (en) * | 2002-04-19 | 2006-06-08 | Yale University | Toll-like receptor 11 |
JP4860923B2 (ja) * | 2002-08-15 | 2012-01-25 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 免疫刺激性組成物、および免疫応答の刺激方法 |
EP2572715A1 (en) * | 2002-12-30 | 2013-03-27 | 3M Innovative Properties Company | Immunostimulatory Combinations |
US8426457B2 (en) * | 2003-03-13 | 2013-04-23 | Medicis Pharmaceutical Corporation | Methods of improving skin quality |
CA2518082C (en) * | 2003-03-13 | 2013-02-12 | 3M Innovative Properties Company | Methods for diagnosing skin lesions |
WO2004091500A2 (en) * | 2003-04-10 | 2004-10-28 | 3M Innovative Properties Company | Delivery of immune response modifier compounds |
US20040265351A1 (en) * | 2003-04-10 | 2004-12-30 | Miller Richard L. | Methods and compositions for enhancing immune response |
RU2245142C1 (ru) * | 2003-07-14 | 2005-01-27 | Лимонов Виктор Львович | Иммуномодулятор |
AU2004266657B2 (en) * | 2003-08-14 | 2009-07-02 | 3M Innovative Properties Company | Lipid-modified immune response modifiers |
US8961477B2 (en) * | 2003-08-25 | 2015-02-24 | 3M Innovative Properties Company | Delivery of immune response modifier compounds |
JP2007504145A (ja) * | 2003-08-25 | 2007-03-01 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 免疫刺激性の組み合わせおよび治療 |
CA2537763A1 (en) * | 2003-09-05 | 2005-03-17 | 3M Innovative Properties Company | Treatment for cd5+ b cell lymphoma |
WO2005030133A2 (en) * | 2003-09-22 | 2005-04-07 | Yale University | Treatment with agonists of toll-like receptors |
CA2543685A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-12 | 3M Innovative Properties Company | Neutrophil activation by immune response modifier compounds |
FR2863890B1 (fr) * | 2003-12-19 | 2006-03-24 | Aventis Pasteur | Composition immunostimulante |
US20050158325A1 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-21 | 3M Innovative Properties Company | Immunomodulatory combinations |
WO2005067500A2 (en) * | 2003-12-30 | 2005-07-28 | 3M Innovative Properties Company | Enhancement of immune responses |
WO2005077408A2 (en) * | 2004-02-06 | 2005-08-25 | Vaxinnate Corporation | Compositions of pamps and listeria monocytogenes and methods of use |
CN101426524A (zh) * | 2004-04-28 | 2009-05-06 | 3M创新有限公司 | 用于粘膜接种疫苗的组合物和方法 |
US20060045886A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Kedl Ross M | HIV immunostimulatory compositions |
WO2006026394A2 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-09 | 3M Innovative Properties Company | Method of eliciting an immune response against hiv |
WO2006029223A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Children's Medical Center Corporation | Method for stimulating the immune response of newborns |
US9107813B2 (en) | 2004-11-15 | 2015-08-18 | Derek T. O'Hagan | Immunogenic compositions containing anthrax antigen, biodegradable polymer microparticles, and polynucleotide-containing immunological adjuvant |
DK1951299T3 (da) | 2005-11-04 | 2012-04-02 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Influenzavacciner indeholdende kombinationer af partikelformige adjuvanser og immunforstærkere |
JP5806444B2 (ja) | 2005-12-02 | 2015-11-10 | ノバルティス アーゲー | 免疫原性組成物で使用するためのナノ粒子 |
JP2009527572A (ja) | 2006-02-24 | 2009-07-30 | ノバルティス アーゲー | 免疫原性組成物に使用するための生分解性ポリマーおよびカチオン性多糖を含むミクロ粒子 |
-
2006
- 2006-01-30 US US11/814,355 patent/US9138467B2/en active Active
- 2006-01-30 AU AU2006207891A patent/AU2006207891C1/en not_active Ceased
- 2006-01-30 CN CN201710316568.8A patent/CN107261127A/zh active Pending
- 2006-01-30 ZA ZA200707249A patent/ZA200707249B/xx unknown
- 2006-01-30 RU RU2007131397/10A patent/RU2461390C2/ru active
- 2006-01-30 CN CN201610091220.9A patent/CN105749264A/zh active Pending
- 2006-01-30 CA CA2606349A patent/CA2606349C/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-30 WO PCT/US2006/003349 patent/WO2006081576A2/en active Application Filing
- 2006-01-30 BR BRPI0607254-2A patent/BRPI0607254A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-01-30 JP JP2007553350A patent/JP5191740B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-01-30 KR KR20127013421A patent/KR101415864B1/ko active IP Right Grant
- 2006-01-30 CN CNA2006800104428A patent/CN101370518A/zh active Pending
- 2006-01-30 EP EP06719946A patent/EP1861117A4/en not_active Ceased
- 2006-01-30 KR KR20077019701A patent/KR20070114727A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-01-30 MX MX2007009177A patent/MX2007009177A/es active IP Right Grant
- 2006-01-30 NZ NZ560543A patent/NZ560543A/en not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-07-29 IL IL184907A patent/IL184907A/en active IP Right Grant
-
2011
- 2011-02-14 AU AU2011200618A patent/AU2011200618B2/en not_active Ceased
-
2015
- 2015-08-24 US US14/833,454 patent/US9603917B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ZA200707249B (en) | 2010-08-25 |
AU2011200618A1 (en) | 2011-03-03 |
WO2006081576A2 (en) | 2006-08-03 |
AU2006207891A1 (en) | 2006-08-03 |
IL184907A (en) | 2017-11-30 |
CN101370518A (zh) | 2009-02-18 |
IL184907A0 (en) | 2007-12-03 |
AU2006207891C1 (en) | 2011-09-01 |
EP1861117A4 (en) | 2009-12-09 |
WO2006081576A3 (en) | 2008-10-16 |
KR20120137346A (ko) | 2012-12-20 |
CA2606349C (en) | 2019-03-05 |
EP1861117A2 (en) | 2007-12-05 |
RU2007131397A (ru) | 2009-03-10 |
JP2008529976A (ja) | 2008-08-07 |
KR101415864B1 (ko) | 2014-07-09 |
NZ560543A (en) | 2012-01-12 |
BRPI0607254A2 (pt) | 2009-08-25 |
AU2006207891A2 (en) | 2009-07-16 |
CN107261127A (zh) | 2017-10-20 |
KR20070114727A (ko) | 2007-12-04 |
RU2461390C2 (ru) | 2012-09-20 |
CA2606349A1 (en) | 2006-08-03 |
AU2006207891B2 (en) | 2010-12-16 |
US9603917B2 (en) | 2017-03-28 |
US9138467B2 (en) | 2015-09-22 |
US20110117204A1 (en) | 2011-05-19 |
MX2007009177A (es) | 2008-03-10 |
CN105749264A (zh) | 2016-07-13 |
AU2011200618B2 (en) | 2012-12-13 |
US20150359870A1 (en) | 2015-12-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9603917B2 (en) | Immunologically active compositions | |
Nevagi et al. | Polyglutamic acid-trimethyl chitosan-based intranasal peptide nano-vaccine induces potent immune responses against group A streptococcus | |
JP4947506B2 (ja) | 粘膜体表面に接触させてワクチン抗原を包含する物質の効果を調節する新規非抗原性粘膜アジュバント処方 | |
KR101342641B1 (ko) | 폴리감마글루탐산-키토산 나노입자를 함유하는 면역보강제 조성물 | |
EP2271661B3 (en) | Derivatives of muramylpeptide | |
EA023397B1 (ru) | Комбинированные вакцины с синтетическими наноносителями | |
JP2010105968A (ja) | カチオン性ナノゲルを用いる粘膜ワクチン | |
EP0789590B1 (en) | Chitosan induced immunopotentiation | |
Marasini et al. | Poly-L-lysine-coated nanoparticles are ineffective in inducing mucosal immunity against group a streptococcus | |
Kimoto | Development of a safe and effective novel synthetic mucosal adjuvant SF-10 derived from physiological metabolic pathways and function of human pulmonary surfactant | |
US20240148864A1 (en) | Polysaccharide adjuvants for virus vaccines | |
Szathmáry | Immunomodulation of pathogen-host interactions | |
SU1540831A1 (ru) | Способ стимул ции специфического иммунитета к вирусу гриппа у животных | |
Flannigan | Characterization of adjuvant properties of microparticulate beta-glucan |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090116 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090116 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110729 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111028 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111129 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120424 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120824 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20121101 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130104 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130130 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5191740 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160208 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |