MX2007001294A - Polipeptidos modificados que dependen de vitamina k. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a secuencias de ADNc modificadas que codifican polipeptidos que depende de vitamina K, en particular, Factor VII humano, Factor VIIa humano, Factor IX humano y proteina C humana y sus derivados con estabilidad mejorada y vida media de plasma extendida, vectores de expresion recombinante que contiene dichas secuencias de ADNc, celulas huesped transformadas con dichos vectores de expresion recombinante, polipeptidos recombinantes y derivados que tienen actividades biologicas de la proteina tipo silvestre no modificada pero que tienen estabilidad mejorada y procesos para la manufactura de dichas proteinas recombinantes y sus derivados. La invencion tambien cubre un vector de transferencia para usarse en terapia de genes humanos, que comprende dichas secuencias de ADN modificadas.

Description

POLIPEPTIDOS MODIFICADOS QUE DEPENDEN DE VITAMINA K CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a secuencias de ADNc modificadas que codifican polipéptidos que dependen de vitamina K, en particular Factor VII humano, Factor Vlla humano, Factor IX humano y proteína C humana y sus derivados con estabilidad mejorada y vida media de plasma extendida, los vectores de expresión recombinante que contienen dichas secuencias de ADNc, células huésped transformadas con dichos vectores de expresión recombinantes, polipéptidos recombinantes y derivados que tienen actividades biológicas de la proteína tipo silvestre no modificada pero que tienen estabilidad mejorada y procesos para la manufactura de dichas proteínas recombinantes y sus derivados. La invención también cubre un vector de transferencia para usarse en terapia de genes humanos, que comprende dichas secuencias de ADN modificadas .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las proteínas que dependen de la vitamina K se usan para tratar ciertos tipos de hemofilia. Resulta de una deficiencia ligada al cromosoma X del Factor VIII de coagulación sanguínea y afecta casi exclusivamente a hombres con una incidencia entre uno y dos individuos por 10,000. El defecto en el cromosoma X se transmite por mujeres portadoras quienes no son hemofílicas. La manifestación clínica de hemofilia A es una tendencia incrementada al sangrado. Antes de que se introdujera el tratamiento con concentrados de Factor VIII la esperanza de vida media para una persona con hemofilia severa era menor a 20 años. El uso de concentrados de Factor VIII de plasma y después del de las formas recombinantes de FVIII, se mejoró considerablemente la situación para los pacientes hemofílicos incrementando bastante la esperanza de vida media, dando a la mayoría de ellos la posibilidad de vivir una vida más o menos normal. La hemofilia B siendo 5 veces menos prevaleciente que la hemofilia A, es ocasionada por FIX no funcional o faltante y se trata con concentrados de FIX de plasma o una forma recombinante de FIX. Tanto en la hemofilia A como en la hemofilia B, el problema médico más serio para tratar la enfermedad es la generación de anticuerpos contra los factores de reemplazo. Hasta el 30% de todos los pacientes con hemofilia A desarrollan anticuerpos para FVIII. Los anticuerpos para FIX se presentan a un grado menor pero con consecuencias más severas, dado que son menos susceptibles a la terapia de inducción de tolerancia inmune. El modelo actual de coagulación establece que el accionador fisiológico de coagulación, es la formación de un complejo entre el factor de tejido (FT) y Factor VIIA (FVIIa) en la superficie de FT expresando células que normalmente están localizadas afuera de la vasculatura. Esto conduce a la activación de FIX y FX generando finalmente alguna trombina. En un bucle de retroalimentación positiva, la trombina activa FVIII y FIX, el brazo "intrínseco" de la cascada de coagulación sanguínea, amplificando así la generación de FXa, que es necesaria para la generación de la ruptura completa de trombina para lograr la hemostasis completa. Se mostró que administrando concentraciones suprafisiológicas FVIIa, se logró la hemostasis derivando la necesidad de FVIIIa y FlXa. La clonación de ADNc ara FVII (EUA 4,784,950) hizo posible desarrollar un reemplazo recombinante del factor de coagulación derivado de plasma. Este FVIIIa se administró exitosamente por primera vez en 1988 a un paciente con una alta titulación de anticuerpos inhibidores para FVIII. Aunque el número de indicaciones de FVIIa creció de manera estable mostrando un potencial para convertirse en un agente hemostático universal (Erhardtsen, 2002) . FVII es una glicoproteína de una sola cadena con un peso molecular de 50 kDa, que se secreta por células del hígado en el torrente sanguíneo como un cimógeno inactivo de 406 aminoácidos. Contiene 10 residuos de ácido ?-carboxi-glutámico (posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 35) localizados en el dominio de Gla de la proteína. Los residuos de Gla requieren vitamina K para su biosíntesis. C-terminal localizada en el dominio de Gla son dos dominios del factor de crecimiento epidérmico seguidos por un dominio de serina proteasa con tipo de tripsina. Las modificaciones post-traslacionales adicionales de FVII abarca hidroxilación (Asp 63), N- (Asnl45 y Asn322) así como glicosilación tipo 0 (Ser52 y Ser60) . FVII se convierte a su forma activa de FVIIa mediante proteólisis del péptido sencillo unido a Arg 152-Ileí53 que conduce a la formación de dos cadenas de polipéptidos, una cadena ligera N-terminal (17 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa) que se mantienen juntas por un puente de disulfuro. En contraste, otros polipéptidos dependientes de la vitamina K, para el FVII, no se ha descrito ningún péptido de activación que se separa durante la activación. El sitio de separación de Argl52-Ilel53 corresponde por comparación homologa al sitio de separación de activación C-terminal de otros polipéptidos que dependen de vitamina K. Sin embargo, dado que Argl44 también puede constituir un sitio de separación de proteasa, no puede excluirse de FVII en contraste con lo que se piensa actualmente tiene un péptido de activación de 8 aminoácidos entre Argl44 y Argl52. La formación de un puente de sales después de la separación por activación entre Ilel53 y Asp343, es esencial para obtener la conformación activa de FVIIa. La activación de FVII puede lograrse in vitro por FXa, FXIIa, FlXa, FVIIa, FSAP y trombina. Mollerup y otros, (Biotechnol. Bioneg. (1995) 48: 501-505) reportó que también puede ocurrir alguna separación en la cadena pesada en Arg290 y/o Arg315. FVII está presente en plasma en una concentración de 500 ng/ml, 1%, v.gr., 5 ng/ml de FVII está presente como FVIIa. Se encontró que la vida media del plasma de FVII es de aproximadamente 4 horas y que de FVIIa aproximadamente 2 horas. Aunque la vida media de FVIIa de 2 horas es comparativamente largo para un factor de coagulación activado, el cual es, de alguna manera, mayor en el orden de minutos debido a la inhibición irreversible por Serpinas como antitrombina III, sin embargo, esto constituye un severo inconveniente para el uso terapéutico de Fila, dado que conduce a la necesidad de inyecciones i.v. múltiples o infusión continua para lograr la hemostasis dando como resultado costos muy altos de tratamiento e inconveniencia para el paciente. Por el otro lado, dado que FVHa tiene el potencial que será usado como un agente hemostático universal, existe una alta necesidad médica de desarrollar formas de FVHa que tienen vida medio funcional más larga. Se han hecho varios intentos para modificar FVII: Nicolaisen y otros (WO 88 / 10295, 25 de junio de 1987) sugiere que la supresión o modificación de los siguientes aminoácidos de FVII serán estabilizados contra degradación proteolítica: Lys32, Lys38, Lysl43, Arg290, Arg315, Lys316, Lys341, Arg392, Arg396, Arg402, Ile42, y Tyr44. Nicolaison (US 5,580,560, 13 de noviembre, 1989) extiende WO 88/10295 para incluir también mutaciones o supresiones en Arg304, Phe278 y Tyr332 para volver al FVII/FVIIa menos susceptible a proteólisis. Bharad aj y otros, (JBC (1996), 48 págs. 30685- 30691) expresó la mutante FVII Phe328Ser que no activó FX y no mostró actividad amidolítica detectable. Dickinson y otros (PNAS (1996) 93, 14379-14384) propone variantes de FVIIa en las cuales Lysl57, Vall58, Glu296, Met298, Asp334, Ser336 o Lys337 se han reemplazado por Ala. Nelsestuen (WO 99/29/67 23 oct. 1997) modificó el dominio de Gla introduciendo mutaciones en puntos en tal forma que aumenta su afinidad a membranas de fosfolípidos dando como resultado así un FVIIa modificado con actividad específica mejorada. Las mutaciones en puntos propuestas son ProlO, Glyll, Arg28 y Lys32. Nelsestuen (WO 00/66753, 29 de abril de 1999) modificó el dominio de Gla introduciendo mutaciones en puntos en una forma que aumenta su afinidad a las membranas de fosfolípidos dando como resultado así un FVIIa modificado con actividad específica mejorada. Las mutaciones en puntos propuestas son en 5, 9, 11, 12, 29, 33, 34, 35 y/o 36. Kornfelt y otros, (Archiv. Biochem. and Biophys., 363, págs. 43-54) mostró que la oxidación de met298 y Met306 conduce a un régimen de disociación 30% superior de FVIIa-ox de FT y una activación de FX 20% inferior comparado con un FVIIa tipo silvestre. Kemball-Cook y otros, (JBC (1998), 14 pág. 8516-8521) expresó la mutante de FVII GlnlOOArg y mostró que tuvo actividad de coágulos aunque tiene actividad amidolítica comparable con FVIIa tipo silvestre y especula que esto se puede deber a la asociación deteriorada con FT. Lino y otros, Arch. Biochem. Biophys. (1998) 352:182-192 mostraron que la mutación de los sitios de 0-glicosilación Ser-52 y Ser-60 disminuye la actividad coagulatoria de FVIIa interfiriendo posiblemente con la interacción con FT. Ruf y otros, (Biochemistry (1999) 16, págs. 1957-66) mostraron que la mutación Arg36Ala conduce al régimen disminuido de la activación de FX. Iwanaga y otros, (Thromb. Haemost. (suplemento de agosto 1999), 466 extracto 1474) se refieren a una variante de FVII en la cual se suprimen los residuos 316-320 o los residuos 311-322 se reemplazan con los residuos correspondientes de tripsina. Soejima Ken i y otros, (JP2001061479, 24 de agosto de 1999) crearon un FVIIa modificado con actividad específica mejorada separando el grupo de disulfuro entre Cysl59 y Cysl64 o sustituyendo, adicionando o suprimiendo por lo menos una parte de la estructura de bucle de Thr233 a Asp244 o sustituyendo, adicionando o suprimiendo por lo menos una parte de la secuencia de intervención entre Arg304 y Cys329. Pedersen y otros, (US 2003/0096338, 11 de febrero de 2000) reclaman conjugados de FVII y FVIIa con porciones no polipeptídicas incluyendo también azúcares con el objeto de prolongar la vida media de FVIIa. Las reivindicaciones también abarcan la introducción de los sitios de glicosilación tipo N y/u 0 novedosos o la introducción de novedades combinados con la remoción de un sitio de glicosilación tipo N y/u O previamente existentes para obtener glico-conjugados in vivo. Persson y Pisen (US 2003/0170863, 3 de mayo de 2000) mostraron FVIIa modificado en el cual Leu305 o Phe374 habían sido reemplazados por otros aminoácidos. Cuando mucho 20 aminoácidos en el dominio de proetasa (153-406) se reemplazaron en combinación con las mutaciones mencionadas antes. Se describen otras moléculas de FVII modificadas las cuales tienen opcionalmente otros aminoácidos reemplazados en las posiciones 274, 300-304 y 306-312 en combinación con Leu305 y Phe374. Estas modificaciones tienen el efecto de que FVIIa obtendrá espontáneamente una conformación más activa de la que normalmente se debe inducir por FT. Persson y Pisen (US 2003/0104978 y 2003/0100740, 29 de septiembre de 2000) mostraron además otras moléculas de FVIIa modificadas con mutaciones de punto diferentes a las sustituciones de Ala en las posiciones Lysl57, Lys337, Asp334, Ser336, Vall58, Glu296 y Met298. Pingel y Klausen (US 2002/015471 y US 2002/0137673, 02 de octubre de 2000) reclamó una preparación que comprende una pluralidad de FVII o polipéptidos relacionados, que comprenden ciertas relaciones de diferentes glicosilaciones tipo N. Ruf y otros (WC 02/38162, 9 de noviembre de 2000) reclamaron variantes de FVII/FVIIa con las modificaciones Met298Gln, Glu296Ile y Vall58Asn o combinaciones de los mismos conduciendo a una actividad amidolítica superior en ausencia de FT y una afinidad superior a FT. El factor además se modificó para incrementar su estabilidad para modificar los sitios de separaciones similares a tripsina en Lys32, Lys38, Arg290, Arg304, Arg315 y Lys341 y los sitios similares a quimiotripsina en Ile42, Tyr44, Phe278 y Tyr332. Persson (WP 02/077218, 22 de marzo de 2001) enseña mutantes de FVII/FVIIa en las cuales son mutados los aminoácidos 247-260, 393-405 y Pro406, más específicamente R396, Q250 y Pro406, preferiblemente un aminoácido al cual se puede unir un grupo químico con el fin de incrementar la vida media de FVII/FVIIa. Esto puede combinarse con mutaciones que incrementan la actividad de FVII/FVIIa en K157, V158, E296, M298, L305, D334, S336, K337 y F374. Persson y Pisen (US 2003/0100075, 27 de septiembre de 2001) enseñan que Leu305 se localiza en el extremo de una hélice a encontrada en la forma de complejo de FT de FVIIa, que se piensa que es importante para la actividad. En FVIIa libre, esta hélice está distorsionada y por lo tanto posiblemente sea inestable. El reemplazo de Leu305 con otros aminoácidos conduce, de acuerdo con esta invención, conduce a variantes que obtienen la conformación activa que de alguna manera es inducida por FT. Los aminoácidos Lysl57, Lys337, Asp334, Ser336, Vall58, Glu296 y Met298 se localizan en áreas que afectan la formación del puente de sales entre Ilel53 y Asp343. El reemplazo de estos aminoácidos, de acuerdo con la invención, conduce a facilitar la inserción de la terminación N de la proteasa, v.gr., la generación del pueden de sales esencial para la actividad. Persson y Pisen (US 2003/0130191, 2 de noviembre de 2001) enseñan mutantes de FVII/VIIa modificadas adicionalmente con actividad específica incrementada que se sustituyen con otros aminoácidos en las posiciones: 313-329, 364, 366, 373 y 376 así como en las posiciones 330-339. Haaning y otros, (WP 03/093465, 30 de abril de 2002) extendieron la enseñanza de Nelsestuen (modificación del Dominio Gla para aumentar la unión de fosfolípidos) , a saber, una sustitución en ProlO preferiblemente Gln, Lys32 preferiblemente Glu, Asp33 preferiblemente un aminoácido hidrofóbico y preferiblemente Phe, Ala34 preferiblemente un aminoácido cargado negativamente y de preferencia Glu y una inserción de un aminoácido después de Ala3, preferiblemente Tyr con la introducción de sitos de N-glicosilación adicionales . Foncuberta y otros (WP 2004/011675, 25 de julio de 2002) describen variantes alélicas presentes en la naturaleza de FVII que podrían conducir teóricamente a niveles de expresión superior es y función mejorada de FVIIa. No se muestran datos para dichas propiedades mejoradas. De 49, se encontraron dos variantes en exones y esto condujo a una sustitución de los aminoácidos: A294V y R353Q. Persson y Pisen (WP 2004/029090, 25 de septiembre de 2002) mostró que la Phe374 mutante en combinación con algunos otros aminoácidos conduce a un incremento de actividad independiente de FT de FVIIa, a saber, L305V, S314E, K337A y F374Y conducen a un incremento en la actividad amidolítica de FT. Haaning y otros (WP 2004/029091, 30 de septiembre de 2002) modificaron FVII en L39, 142, S43, K62, L65, F71, E82 y F275 en el sitio de unión de FT de FVII/FVIIa incrementando la afinidad de FT. Andersen y otros (WP 2004/083361, 20 de marzo de 2003) modificaron FVII/FVIIa en las posiciones 196 (D196N/K) , 237 (G237L o inserciones GAA GAAA o GAAAA) y 341 (K341N/Q) para incrementar la afinidad a FT. Blajchman y otros (WP 2004/108763, 5 de junio de 2003) modificaron FVII/FVIIa dentro del dominio de FCE basado en un análisis de diferencias entre el dominio de FCE de humano y conejo dado que el Factor Vlla de conejo tiene afinidad superior a FT humano que el Factor Vlla humano. Las mutantes en la posición 53, 62, 74, 75 y 83 se reclaman y muestran por tener superior afinidad al FT humano y potencial hemostático incrementado. Haaning y otros (WC 2004/111242, 19 de junio de 2003) modificaron FVII/FVIIa en las posiciones: 4, 10, 28, 32, 33, 34, 36, 74, 77, 116, preferiblemente A3Y, P10Q, R28F, K32E, D33F, A34L, R36E, K38E, P74S, E77A, E116D. La mutación de R36E ocasiona unión reducida a FT y generación reducida de trombina en análisis dependientes de FT mientras que en los análisis dependientes de PL se mantiene la misma actividad. Johansen y otros (WP 2005/032581, 7 de octubre de 2003) enseñan moléculas híbridas que consisten de un dominio de unión a la membrana de líquidos acoplado a un dominio de actividad de Factor VII acoplado opcionalmente a un agente de formación de volumen, preferencialmente a PEG. Maun y otros, Protein Sci. (2005) 14:1171-80 introdujeron nuevos enlaces de bisulfuro para cerrar la conformación de FVII en un estado activo similar a FT*FVIIa. El análisis cinético de actividad amidolítica reveló que todas las variantes del Factor Vlla solo tuvo actividad específica incrementada comparado con el tipo silvestre, el más grande siendo para las variantes 136:160 y 138:160 con el sustrato S-2765, teniendo incrementos de 670 y 330 veces, respectivamente. Las variantes cerradas con bisulfuro de Factor Vlla no requirieron más FT como un cofactor para actividad máxima en análisis amidolíticos . En presencia de FT soluble, se aumentó la actividad por 20 y 12 veces para las variantes 136:160 y 138:160, respectivamente, comparado con el tipo silvestre.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención proveer polipéptidos que dependen de vitamina K modificados, v.gr., FVII modificado y FVIIa modificado, con una vida media funcional más larga. FVII se refiere a otras proteínas del dominio de Gla como FIX, FX, proteína C, proteína Z, protrombina, GAS6 y proteína S. FVII, FIX, FX y proteína C, están más estrechamente relacionados, en los cuales el dominio de Gla N-terminal es seguido por dos dominios de factor de crecimiento epidérmico (FCE) seguido por el dominio de serina proteasa tipo tripsina. La proteína Z tiene una estructura similar pero un dominio de proteasa nativa. En protrombina, el domino de Gla es seguido por dos dominios de kringle en lugar de dos dominios de FCE seguido entonces por el dominio de proteasa tipo tripsina. En GAS6 y proteína S, el dominio Gla es seguido por 4 dominios de FCE y luego por dos dominios de laminina G en lugar del dominio de proteasa. Es sorprendente la gran diferencia en la vida media de plasma de estas proteínas de plasma estrechamente relacionadas: FVII: 2-4 horas Proteína C: 6-8 horas FIX: 18-30 horas FX: 20-42 horas Proteína S: 24-58 horas Protrombina: 41-72 horas Un subgrupo particular, estrechamente relacionado de estas proteínas comprendió FVII, FIX, FX y proteína C. En la Figura 1, se compara la homología entre FVII, proteína C, FIX y FX de origen humano de otras especies. Las moléculas se conservan en gran parte, la diferencia más sorprendente es dentro del dominio de activación. Para FVII, no se han descrito péptidos de activación. Sin embargo, durante la activación, FVII además de separarse en Argl52, también puede separarse en Argl44, dando como resultado así la liberación de un péptido de activación putativo de 8 aminoácidos conteniendo un sitio de N-glicosilación conservado. Sorprendentemente, la longitud de los péptidos de activación y modificaciones post-traslacionales de los péptidos de activación se correlacionan con la vida media incrementada: TABLA 1 Por lo tanto, la invención se refiere a un método para preparar un polipéptido que depende de vitamina K modificado, que comprende modifica el péptido de activación de un primer polipéptido que depende de vitamina K dado que el polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media incrementada comparado con el primer polipéptido que depende de vitamina K en el cual no se ha modificado el péptido de activación. La invención además se refiere a un método para preparar dicho polipéptido que depende de vitamina K modificado, que comprende modificar el péptido de activación de un primer polipéptido que depende de vitamina K agregando por lo menos parte de un péptido de activación de un segundo polipéptido que depende de vitamina K o reemplazando por lo menos parte de un péptido de activación de un primer polipéptido que depende de vitamina K con por lo menos parte de un péptido de activación de un segundo polipéptido que depende de vitamina K. Los polipéptidos que dependen de vitamina K son un grupo de proteínas que necesitan vitamina K en sus rutas biosintéticas para carboxilar las cadenas laterales de residuos de ácido glutámico de sus precursores de proteína. Los polipéptidos que dependen de vitamina K incluyen, pero no están limitados a, Factor VII, Factor Vlla, Factor IX, Factor IXa, Factor X, Factor Xa, Factor II (Protrombina) , Proteína C, Proteína C de activación, Proteína S, Proteína S activada, GAS6, GAS6 activada, Proteína Z, Proteína Z activada y similares. Además, los polipéptidos que dependen de vitamina K útiles pueden ser tipo silvestre o pueden contener mutaciones. El grado y ubicación de glicosilación u otras modificaciones post-traslacionales pueden variar dependiendo de las células huésped elegidas y la naturaleza del ambiente de las células huésped. Cuando se refiere a secuencias de aminoácidos específicas, las modificaciones post- traslacionales de dichas secuencias son abarcadas en esta solicitud. El "Factor VII/VHa" como se usa en esta solicitud, significa un producto que consiste de la forma no activada (Factor VII) o la forma activada (Factor Vlla) o mezclas de las mismas. El "Factor VII/VHa" dentro de la definición anterior incluye proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos del factor VII/VIla humano nativo. También incluye proteínas con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo N-terminal modificado incluyendo supresiones o adiciones de aminoácidos N-terminales mientras las proteínas retienen sustancialmente la actividad del factor Vlla. El "Factor VII" dentro de la definición anterior también incluye variaciones que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro. El "Factor VII" dentro de la definición anterior además incluye variantes de FVII/FVIIa. Dichas variantes difieren en uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia tipo silvestre. Ejemplos de dichas diferencias pueden incluir truncación de la terminación N y/o C por uno o más residuos de aminoácidos (v.gr., 1 a 10 residuos de aminoácidos), o además de uno o más residuos extra en la terminación N y/o C, v.gr., además de un residuo de metionina en la terminación N, así como sustituciones de aminoácidos conservadoras, es decir, sustituciones realizadas dentro de grupos de aminoácidos con características similares, v.gr., (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoácidos hidrofóbicos, y (6) aminoácidos aromáticos. Ejemplos de dichas sustituciones conservadoras se muestran en la siguiente tabla.

TABLA 2 (1) Alanina Glicina (2) Acido Aspártico Acido Glutámico (3) Asparagina Glutamina Serina Treonina (4) Arginina Histidina Lisina (5) Isoleucina Leucina Metionina Valina (6) Fenilalanina Tirosina Triptofano Las secuencias de aminoácidos de varios polipéptidos que dependen de vitamina K y las secuencias de ADNc que los codifican como se muestra en la siguiente lista: TABLA 3 El primer polipéptido que depende de vitamina K preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de Factor VII, Factor Vlla, Factor IX, Factor IXa, Proteína C y Proteína C activada. Más preferiblemente, el primer polipéptido que depende de vitamina K se selecciona del grupo que consiste de Factor VII humano, Factor Vlla humano, Factor IX humano, Factor IXa humano, Proteína C humana y Proteína C activada de humano. Más preferiblemente, el primer polipéptido que depende de vitamina K es Factor VII humano o Factor Vlla humano. EN una modalidad específica, el primer polipéptido que depende de vitamina K comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos: 3, 6 y 9. El segundo polipéptido que depende de vitamina K es diferente del primer polipéptido que depende de vitamina K. Consecuentemente, el polipéptido que depende de vitamina K modificado obtenible mediante el proceso de a invención comprende por lo menos parte de un péptido de activación que no está presente en la naturaleza, en el primer polipéptido que depende de vitamina K. El segundo polipéptido que depende de vitamina K tiene una vida media de plasma más larga que el primer polipéptido que depende de vitamina K. En otra modalidad, la longitud del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K es mayor que la longitud del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. Preferiblemente, el segundo polipéptido que depende de vitamina K se selecciona del grupo que consiste de Factor IX, Factor X y Protrombina. Más preferiblemente, el segundo polipéptido que depende de vitamina K se selecciona del grupo que consiste de Factor IX humano, Factor X humano y Protrombina humana. En una modalidad especifica, el segundo polipéptido que depende de vitamina K comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID Nos. : 9, 12 y 15. La parte del péptido de activación del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K, que se añade, consiste preferiblemente de por lo menos 8, más preferiblemente de por lo menos 12, aún más preferiblemente de por lo menos 15 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácido del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K. En otra modalidad, la parte del péptido de activación del segundo polipéptido de vitamina K, que se añade, puede consistir de por lo menos 0.15 N aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K, en donde N es el número total de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K. Preferiblemente, la parte del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K consiste de por lo menos 0.5 N, más preferiblemente de por lo menos 0.75 N, más preferiblemente de por lo menos 0.9 N, aún más preferiblemente de por lo menos 0.95 N aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K. En otra modalidad, la parte del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K, que se agrega, consiste de por lo menos (N-x) aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K, en donde N es el número total de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido dependiente de K y en donde x puede ser 7, preferiblemente x es 5, más preferiblemente x es 4,más preferiblemente x es 3, aún más preferiblemente x es 2. También es posible que la parte del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K, que se agrega, consiste de una arte central del péptido de activación, es decir, no comprende cada aminoácido C-terminal o cada aminoácido N-terminal del péptido de activación. Más preferiblemente, el péptido de activación completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K se agrega a la secuencia de aminoácido del primer polipéptido que depende de vitamina K mientras que retiene la especificidad de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. Alternativamente, una variante del péptido de activación completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K se puede agregar a la secuencia de aminoácido del primer polipéptido que depende de vitamina K. Las variantes incluyen péptidos de activación en los que se han agregado, suprimido y/o sustituido de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5, aún más preferiblemente de 1 a 3 aminoácidos. Si únicamente la vida media del zimogen deberá prolongarse en sitios de separación de activación N- o C-terminales del primer polipéptido que depende de vitamina K preferiblemente se retienen en los péptidos de activación variantes. Si también la vida media de la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K deberá prolongarse, se tendrá que suprimir un sitio de separación de activación N- ó C-terminal del primer polipéptido que depende de vitamina K. Preferiblemente, el sitio de separación de activación N- terminal se suprime. Si la vida media de FVIIa deberá prolongarse, preferencialmente los sitios de separación de activación N-terminales deberán suprimirse mientras que preferencialmente los sitios de separación de activación C- ter inales deberán retenerse. La siguiente tabla resume las secuencias de péptidos de activación de varios polipéptidos que dependen de vitamina K.

TABLA 4 El término "péptido de activación" como se usa en la presente, incluye péptidos de activación conocidos y péptidos de activación putativos tales como en el Factor VII. A manera de ejemplo no limitante, cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos se puede agregar a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NC:3 ó 6 aa 1 a 35 de SEC ID NC:18 aa 1 a 34 de SEC ID NC:18 aa 1 a 33 de SEC ID NC:18 [ ] aa 1 a 8 de SEC ID NC:18 aa 1 a 7 de SEC ID NC:18 aa 1 a 6 de SEC ID NC:18 aa 1 a 5 de SEC ID NC:18 aa 2 a 35 de SEC ID NC:18 aa 2 a 34 de SEC ID NC:18 aa 2 a 33 de SEC ID NC:18 [ ] aa 2 a 9 de SEC ID NC:18 aa 2 a 8 de SEC ID NC:18 aa 2 a 7 de SEC ID NO: 18 aa 2 a 6 de SEC ID NO: 18 [ ] aa 3 a 35 de SEC ID NO: 18, aa 3 a 34 de SEC ID NO:lí aa 3 a 33 de SEC ID NO: 18, [ ] aa 3 a 10 de SEC ID NC:18; aa 3 a 9 de SEC ID NC:1¡ aa 3 a 8 de SEC ID NC:18, aa 3 a 7 de SEC ID NC:18, y así sucesivamente. A manera de ejemplo no limitante, cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos se puede agregar a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NP:3, 6 ó 9. aa 1 a 52 de SEC ID NO: 19, aa 1 a 51 de SEC ID NO: 19 aa 1 a 50 de SEC ID NO: 19 [ ] aa 1 a 8 de SEC ID NO: 19 aa 1 a 7 de SEC ID NO: 19 aa 1 a 6 de SEC ID NO: 19 aa 1 a 5 de SEC ID NO: 19 aa 2 a 52 de SEC ID NP:19 aa 2 a 51 de SEC ID NO: 19 aa 2 a 50 de SEC ID NO: 19 [ ] aa 2 a 9 de SEC ID NC:19; aa 2 a 8 de SEC ID NC:19; aa 2 a 7 de SEC ID NO: 19, aa 2 a 6 de SEC ID NO: 19; [ ] aa 3 a 52 de SEC ID NO: 18; aa 3 a 51 de SEC ID NO: 18; aa 3 a 50 de SEC ID NO: 18; [ ] aa 3 a 10 de SEC ID NO: 19; aa 3 a 9 de SEC ID NO: 19; aa 3 a 8 de SEC ID NO: 19; aa 3 a 7 de SEC ID NO: 19; y así sucesivamente. La parte del péptido de activación completa del segundo polipéptido que depende de vitamina K se inserta en la cercanía de la región del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K sin suprimir aminoácidos del primer polipéptido que depende de vitamina K. Por ejemplo, en el caso de que FVII sea el primer polipéptido que depende de vitamina K, la parte del péptido de activación completa del segundo polipéptido que depende de vitamina K puede insertarse entre los aminoácidos 144 y 145, entre los aminoácidos 145-146, entre los aminoácidos 146 y 147, entre los aminoácidos 147 y 148, entre los aminoácidos 148 y 149, entre los aminoácidos 149 y 150, entre los aminoácidos 150 y 151, ente los aminoácidos 151 y 152 o entre los aminoácidos 152 y 153, en donde la numeración se refiere a SEC ID NO: 3. Preferiblemente, la parte de, o el péptido de activación c completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K, se inserta entre los aminoácidos 144 y 145, en donde la numeración se refiere a SEC ID NO: 3. Preferiblemente, el sitio de separación C-terminal y la especificidad de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K se conserva por la inserción. El sitio de separación N- terminal se puede suprimir por la inserción. En otro aspecto, la parte de, o el péptido de activación completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K reemplaza una extensión de aminoácidos en el primer polipéptido que depende de vitamina K. Por ejemplo, en el caso de que FVII sea el primer polipéptido que depende de vitamina K, la parte o el péptido de activación completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K puede reemplazar los aminoácidos 140 a 152 de SEC ID NO: 3. Preferiblemente, el sitio de separación C-terminal y la especificidad de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K se conserva por el reemplazo. El sitio de separación N-terminal puede suprimirse por el reemplazo. El sitio de separación N-terminal puede suprimirse reemplazando ciertos aminoácidos del primer polipéptido que depende de vitamina K con la parte de, o el péptido de activación completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K. Consecuentemente, la parte de, o el péptido de activación completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K puede reemplazar cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 3: aa 140 a 145, aa 141 a 145; aa 142 a 145; aa 143 a 145; aa 144 a 145; aa 145; aa 140 a 144, aa 141 a 144, aa 142 a 144, aa 143 a 144, aa 144. En otra modalidad, los sitios de separación proteolítica en el primer polipéptido que depende de vitamina K, que son N-terminal y C-terminal para la región del péptido de activación se retienen durante la modificación. Por o tanto, se retiene la especificidad de la activación del primer polipéptido que depende de vitamina K.

En otra modalidad, si la vida media del plasma del zimogen debe prolongarse, los sitios de separación de activación N-terminal y C-terminal del segundo polipéptido que depende de vitamina K reemplaza aquellos del primer polipéptido que depende de vitamina K o un sitio de separación de activación N-terminal puede retenerse del primer polipéptido que depende de vitamina K y un sitio de separación de activación C-terminal puede retenerse del segundo polipétido que depende de vitamina K o viceversa. Si la vida media del plasma del polipéptido que depende de vitamina K activado debe estabilizarse, se deberán suprimir un sitio de separación de activación ya sea N-terminal o C-terminal . En el caso de una variante de FVIIa estabilizada se deberá retener el péptido de activación con la cadena ligera N-terminal. Esto implica que el sitio de separación C-terminal deberá retenerse mientras que se deberá suprimir un sitio de separación de activación N-terminal transferido de un polipéptido que depende de vitamina K. También puede ser necesario suprimir el sitio de separación del péptido de activación hipotético en Arg 144. La modificación además puede comprender aparte de la inserción del péptido de activación de un segundo polipéptido que depende de vitamina K o una variante del mismo, la supresión concomitante de por lo menos parte del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K mientras que retiene preferencialmente la especificidad de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. La parte que será suprimida puede consistir de por lo menos 2, preferiblemente por lo menos 4, más preferiblemente por lo menos 6, aún más preferiblemente por lo menos 8 aminoácidos contiguos del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. En otra modalidad, la parte del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K, que se suprime, puede consistir de por lo menos 0.15 N aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K, en donde N es el número total de aminoácidos del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. Preferiblemente, la parte del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K consiste de por lo menos 0.5 N, más preferiblemente de por lo menos 0.75 N, más preferiblemente de por lo menos 0.9 N, aún más preferiblemente de por lo menos 0.95 N aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. En otra modalidad, la parte del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K, que se suprime, consiste de por lo menos (N-x) aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K, en donde N es el número total de aminoácidos del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K, en donde x puede ser 7, preferiblemente x es 5, más preferiblemente x es 4, más preferiblemente x es 3, aún más preferiblemente x es 2. También es posible que la parte del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K, que se suprime, consiste de una parte central del péptido de activación, es decir, no comprende el aminoácido C-terminal o el aminoácido N-terminal del péptido de activación. En una modalidad específica, se suprime el péptido de activación completa del primer polipéptido que depende de vitamina K. Usualmente, la modificación comprende reemplazar por lo menos parte del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K con por lo menos arte del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K. Las modalidades preferidas de las partes del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K y el péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K corresponde a aquellos descritos antes. En una modalidad particular, el péptido de activación completo del primer polipéptido que depende de vitamina K se reemplaza con el péptido de activación completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K o con una variante del péptido de activación completo del segundo polipéptido que depende de vitamina K mientras que retiene los aminoácidos necesarios para retener la especificidad de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. A manera de ejemplo no limitante, la invención abarca la introducción de secuencias del péptido de activación de polipéptidos que dependen de vitamina animal (algunos de los cuales se muestran en la figura 1), tales como factores de protrombina en murinos, caninos, bovinos, porcinos o roedores, así como combinaciones de los mismos. A manera de ejemplo no limitante, la invención abarca la introducción del péptido de activación de FIX o FX en la cercanía del sitio de activación de FVII, así como el reemplazo del péptido de activación de proteína C por el de FIX o FX, así como el reemplazo del péptido de activación de FIX por el de FX. Con el fin de ilustrar la extensión de este aspecto de la invención con la molécula de FVII preferida, la vida media de FVII se incrementa reemplazando simplemente el péptido de activación putativo de 8 aminoácidos completamente por uno de los péptidos de activación tomados de la proteína C, FIX o FX o creando un péptido de activación híbrido agregando los péptidos de activación tomados de la proteína C, FIX o FX desde un aminoácido proximal con terminación amino hasta el péptido de activación de FVII putativo completo. Ctro aspecto de la invención es la variación de la modificación post-trasnacional de estos péptidos de activación transferidos, a manera de ejemplo no limitante, la remoción de los sitios de N-glicosilación en los péptidos de activación transferidos o alternativamente la remoción del sitio de n-glicosilación en el péptido de activación putativo de FVII entre Argl44 y Argl52, puede conducir a disminuir el espacio libre mediado por asialoproteína-receptor del factor de coagulación. En una modalidad de la invención, por lo tanto la modificación comprende modificar sitios de modificación post-trasnacional dentro del péptido de activación. Preferiblemente, la modificación comprende remover por lo menos un sitio de N-glicosilación dentro del péptido de activación. Ptro aspecto de la invención es la prolongación de la vida media del plasma por la transferencia de análogos de los péptidos de activación de las proteínas que dependen de vitamina K que viven más. Un análogo en su sentido más amplio es un inserto que tiene más de 8 aminoácidos continuos o sustituciones conservadoras de estos aminoácidos del péptido de activación de una proteína que depende de vitamina K tipo silvestre de vida más larga mientras conserva sus sitios de separación de activación N-terminal y C-terminal si la vida media del zimógeno del primer polipéptido que depende de vitamina K debe prolongarse o mientras conserve su sitio de separación de activación N- o C-terminal. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son sustituciones realizadas dentro de grupos de aminoácidos con características similares, v.gr., (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos acídicos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoácidos hidrofóbicos y (6) aminoácidos aromáticos. Ejemplos de dichas sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 2. Ctro aspecto de la invención es un método para incrementar es un método para incrementar la estabilidad de un polipéptido que depende de vitamina K, comprendiendo modificar su péptido de activación. Aún otro aspecto de la invención es un método para incrementar la vida media funcional o vida media de plasma de un polipéptido que depende de vitamina K, comprendiendo modificar su péptido de activación. Estos métodos pueden comprender los mismos pasos que el método para producir un polipéptido que depende de vitamina K modificado descrito antes. La invención además se refiere a un polipéptido que depende de vitamina K modificado que se puede obtener mediante un proceso de la invención. El polipéptido que depende de vitamina K modificado puede comprender un péptido de activación modificado, en donde el polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media incrementada comparado con el polipéptido que depende de vitamina K en el cual el péptido no ha sido modificado. Otro aspecto de la invención es un polipéptido que depende de vitamina K modificado que comprende un péptido de activación modificado, dicho péptido de activación modificado comprendiendo por lo menos parte de un péptido de activación de un polipéptido que depende de vitamina K diferente. Alternativamente, el polipéptido que depende de vitamina K modificado pueden comprender un análogo o una variante de un péptido de activación de un polipéptido que depende de vitamina K diferente. Los análogos y variantes son moléculas como se definió antes. Preferiblemente, el polipéptido que depende de vitamina K es un primer polipéptido que depende de vitamina K como se definió antes. El "polipéptido que depende de vitamina K diferente" es un segundo polipéptido que depende de vitamina K como se definió antes. Las modalidades preferidas del polipéptido que depende de vitamina modificado de la invención corresponden a las modalidades preferidas descritas antes con respecto al método de la invención. En otra modalidad, el polipéptido que depende de vitamina K modificado de la invención exhibe una vida media funcional incrementada comparado con la forma no modificada y/o la forma tipo silvestre del polipéptido que depende de vitamina K. La vida media funcional puede determinarse in vitro como se muestra en Lindley y otros (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor Vlla, Clin. Pharmacol Ther. 1994 55:638-648). La vida medida funcional usualmente se incrementa por lo menos un 50%, preferiblemente por lo menos 100%, más preferiblemente por o menos 200%, aún más preferiblemente por lo menos 500% comparado con la forma no modificada y/o el la forma de tipo silvestre del polipéptido que depende de vitamina K. La vida media funcional de la forma de tipo silvestre del Factor VII humano es de aproximadamente 4 horas. La vida media funcional de la molécula de Factor VII modificada de la invención usualmente es de por lo menos aproximadamente 6 horas, preferiblemente por lo menos aproximadamente 10 horas, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 15 horas, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 24 horas. La vida media funcional de la forma tipo silvestre del Factor Vlla humano es de aproximadamente 2 horas. La vida media funcional de la molécula del Factor Vlla modificada de la invención usualmente es de por lo menos aproximadamente 3 horas, preferiblemente por lo menos aproximadamente 5 horas, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 8 horas, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 12 horas.

Generalmente, el polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una estabilidad incrementada comparada con la forma no modificada y/o comparada con la forma de tipo silvestre del polipéptido que depende de vitamina K. Un incremento en estabilidad de las moléculas del Factor VII modificado puede medirse, por ejemplo, como se describió previamente mediante análisis funcionales. El polipéptido que depende de vitamina K modificado de la invención usualmente tiene sustancialmente la misma actividad que la forma de tipo silvestre y/o forma no modificada correspondientes del polipéptido que depende de vitamina K. Una actividad "sustancialmente igual" significa por lo menos aproximadamente 10%, preferiblemente aproximadamente 50%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75%, aún mías preferiblemente por lo menos aproximadamente 100% de la actividad de la forma tipo silvestre y/o forma no modificada correspondientes del polipéptido que depende de vitamina K. La actividad del Factor VII/VHa es la capacidad de convertir el Factor X de sustrato al Factor Xa activo. La actividad de un polipéptido del Factor VII/VHa se puede medir con los análisis descritos en Shaw y otros, 1998, PNAS, Vol. 95, págs. 4229-4234 o como en Gabriel y otros, 2004, Sem. Hematol. Vol 44, Supl. 1, págs 20-24.

La invención además se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido que depende de vitamina K modificado como se describe en esta solicitud. El término "polinucleótido (s) " generalmente se refiere a cualquier poli-ribonucleótido o polidesoxi-ribonucleótido que puede ser ADN o ADN no modificados o ARN o ADN modificado. El polinucleótido puede ser de ADN de una sola hebra o de doble hebra, ARN de una sola hebra o doble hebra. Como se usa en la presente, el término "polinucleótido (s) " también incluye ADNs o ARNs que comprenden una o más bases modificadas y/o bases inusuales, tales como inosina. Se apreciará que se pueden hacer una variedad de modificaciones al ADN y ARN que sirven para muchos fines útiles conocidos por loes expertos en la técnica. El término "polinucleótido (s) " como se emplea en la presente, abarca dichas formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, así como las forma químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo, por ejemplo, células simples y complejas. La persona experta entenderá que, debido a la degeneración del código genético, un polipépitdo dado puede codificarse por diferentes polinucleótidos. La presente invención abarca estas "variantes". Preferiblemente, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido aislado. El término polinucleótido "aislado" se refiere a un polinucleótido que está sustancialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, tales como, y no limitado a, otros ADN y ARN cromosomales y extracromosomales. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar de una célula huésped. Los métodos de purificación de ácidos nucleicos convencionales conocidos por los expertos, se pueden usar para obtener polinucleótidos aislados. El término también incluye polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos químicamente sintetizados. Aún otro aspecto de la invención es un plásmido o vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención. Preferiblemente, el plásmido o vector es un vector de expresión. EN una modalidad particular, el vector es un vector de transferencia para usarse en terapia de genes humanos . Aún otro aspecto de la invención es una célula huésped que comprende un polinucleótido de la invención o un plásmido o vector de la invención. Las células huésped de la invención se pueden emplear en un método para producir un polipéptido que depende de vitamina K modificado, que es parte de esta invención. El método comprende : (a) cultivar células huésped de la invención bajo condiciones de tal manera que se exprese el polipéptido que depende de vitamina K modificado; y (b) recuperar opcionalmente el polipéptido que depende de vitamina K modificado de las células huésped o del medio de cultivo.

Expresión de las variantes propuestas : La producción de proteínas recombinantes a altos niveles en células huésped adecuadas, requiere el ensamble de los ADNc modificados mencionados antes en unidades transcripcionales eficiente junto con elementos reguladores adecuados en un vector de expresión recombinante, que puede propagarse en varios sistemas de expresión de acuerdo con los métodos conocidos por los expertos en la material. Los elementos reguladores transcripcionales eficientes podrían derivarse de virus que tienen células animales como sus huésped naturales o del ADN cromosomal de células animales. Preferiblemente, esta secuencia se deriva de la región de transcripción temprana de Virus de Simio 40, adenovirus, virus de polioma de BK, citomegalovirus humano, o la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous, u otras combinaciones de promoción-mejoradoras incluyendo los genes transcritos fuertemente de manera constitutiva en células animales como beta-actina o GRP78. Con el fin de lograr altos niveles estables de ARNm transcrito de los ADNc, la unidad transcripcional deberá contener en su parte 3' -proximal una región de ADN que codifica una secuencia de poliadenilación de terminación transcripcional. Preferiblemente, esta secuencia se deriva de la región de transcripción temprana de Virus de Simio 40, el gen de beta-globina de conejo, o el gen activador de plasminogeno de tejido humano. Los ADNc entonces se integran en el genoma de una línea de células huésped adecuadas para la expresión del híbrido, proteínas del dominio de Gla modificado, preferiblemente FIX, FX, proteína C, se prefieren más las proteínas del Factor VII. Preferiblemente, esta línea celular deberá ser una línea de células animales de origen vertebrado con el fin de asegurar el doblado correcto, la síntesis del dominio de Gla, formación de unión de disulfuro, glicosilación ligada a asparagina, glicosilación ligada a O, y otras modificaciones post-traslacionales así como la secreción en el medio de cultivo. Ejemplos de otras modificaciones post-traslacionales son O-sulfatación de tirosina, hidroxilación y proceso proteolítico de la cadena de polipéptidos naciente. Ejemplos de las líneas celulares que se pueden usar son células COS de monos, células L de ratón, células C127 de ratón, células BHK-21 de hámster, células 293 de riñon embriónico de humano y preferiblemente células CHO de hámster.

El vector de expresión recombinante que codifica los ADNc correspondientes se puede introducir en una línea de células animales en varias maneras diferentes. Por ejemplo, los vectores de expresión recombinantes pueden crearse de vectores asados en diferentes virus animales. Ejemplos de estos son vectores basados en baculovirus, virus de vaccinia, adenovirus y preferiblemente virus de papiloma de bovinos. Las unidades de transcripción que codifican el ADN correspondiente también se pueden introducir en células animales junto con otro gen recombinante que puede funcionar como un marcador seleccionable dominante en estas células con el fin de facilitar el aislamiento de clones de células específicas que tienen integrado el ADN recombinante en su genoma. Ejemplos de este tipo de genes marcadores seleccionables dominantes son amino glucósido fosfotransferasa Tn5, confiriendo resistencia a geneticina (G418) , higromicina fosfotransferasa, confiriendo resistencia a higromicina, y puromicina acetil transferasa, confiriendo resistencia a puromicina. El vector de expresión recombinante que codifica dicho marcador seleccionable puede residir ya sea en el mismo vector que el que codifica el aDNc de la proteína deseada, o puede codificarse en un vector separado que se introduce y se integra simultáneamente al genoma de la células huésped, dando como resultado con frecuencia una ligadura física hermética entre las diferentes unidades de transcripción. Otros tipos de genes marcadores seleccionables que se pueden usar junto con el ADNc de la proteína deseada se basan en varias unidades de transcripción que codifican dihidrofolato reductasa (dhfr) . Después de la inducción de este tipo de gen en células que carecen de actividad de dhfr endógena, preferiblemente células CHC (DUKX-BH, DG-434) permitirá que se desarrollen en medios que carecen de nucleósidos. Un ejemplo de dicho medio es Ham' s F12 sin hipoxantina, timidina, y glicina. Estos genes de dhfr pueden introducirse junto con las unidades transcripcionales de ADNc del factor de coagulación en células CHO del tipo anterior, ya sea ligado sobre el mismo vector o en diferentes vectores, creando así líneas celulares positivas para dhfr produciendo proteína recombinante. Si las líneas celulares anteriores se desarrollan en presencia del metotrexato inhibidor de dhfr citotóxico, surgirán nuevas líneas celulares resistentes a metotrexato. Estas líneas celulares pueden producir proteína recombinante a un régimen incrementado debido al número amplificado de dhfr ligado y las unidades transcripcionales de la proteína deseada. Cuando se propagan estás líneas celulares en concentraciones crecientes de metotrexato (1-10000 nM) , se pueden obtener nuevas líneas celulares las cuales producen la proteína deseada a un régimen muy alto. Las líneas celulares anteriores que producen la proteína deseada se pueden desarrollar a una gran escala, ya sea en cultivo de suspensión o en varios soportes sólidos. Ejemplos de estos soportes son microportadores basados en matrices de dextrano o colágeno, o soportes sólidos en la forma de fibras huecas o varios materiales de cerámica. Cuando se desarrollan en cultivo de suspensión celular o en microportadores el cultivo de las líneas celulares anteriores pueden llevarse a cabo tanto como un cultivo de lavado como un cultivo de perfusión con producción continua de medio condicionado durante períodos extendidos. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, las líneas celulares anteriores son adecuadas para el desarrollo de un proceso industrial para la producción de las proteínas recombinantes deseadas . La proteína recombinante, que se acumula en la parte media de las células secretoras de los tipos anteriores, pueden concentrarse y purificarse por una variedad de métodos bioquímicos y cromatográficos, incluyendo métodos que utilizan diferencias en tamaño, carga, hidrofobicidad, solubilidad, afinidad específica, etc., entre la proteína deseada y otras sustancias en el medio de cultivo celular. Un ejemplo de dicha purificación es la adsorción de la proteína recombinante a un anticuerpo monoclonal que se inmoviliza en un soporte sólido. Después de la desobrción, la proteína además puede purificarse por una variedad de técnicas cromatográficas basadas en las propiedades anteriores. Se prefiere purificar el polipéptido que depende de vitamina K modificado de la presente invención a una pureza de =80%, más preferiblemente una pureza de =95%, y particularmente se prefiere un estado farmacéuticamente puro que es mayor a 99.9% de pureza con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libres de infecciones y agentes pirogénicos. Preferiblemente, un polipéptido que dependen de vitamina K modificadas aisladas o purificadas de la invención es sustancialmente libre de otros polipéptidos. Las proteínas recombinantes descritas en esta invención se pueden formular en preparaciones farmacéuticas para uso terapéutico. Las proteínas purificadas se pueden disolver en soluciones reguladoras acuosas convencionales, fisiológicamente compatibles, a las cuales se pueden añadir, opcionalmente, excipientes farmacéuticos para proveer preparaciones farmacéuticas. Los diferentes productos de la invención son útiles como medicamentos. Consecuentemente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que depende de vitamina K modificad como se describió en la presente, un polinucleótido de la invención o un plásmido o vector de la invención. El ADN modificado de esta invención también se puede integrar en un vector de transferencia para usarse en terapia de genes humanos. Otro aspecto de la invención es el uso de un polipéptido que depende de vitamina K modificado como se describió en la presente, de un polinucleótido de la invención, de un plásmido o vector de la invención, o de una célula huésped de la invención para la manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno de coagulación sanguínea. Los trastornos de coagulación sanguínea incluyen, pero no están limitados a hemofilia A. Preferiblemente, el tratamiento comprende terapia de genes humanos. La invención también se refiere a un método para tratar a un individuo que sufre de un trastorno de coagulación sanguínea tal como hemofilia A. El método comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficiente del polipéptido que depende de vitamina K modificado como se describe en la presente. En otra modalidad, el método comprende administrar a al individuo una cantidad eficiente del polinucleótido de la invención o de un plásmido o vector de la invención. Alternativamente, el método puede comprender la administración al individuo de una cantidad eficiente de las células huésped de la invención descritas en la presente.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Comparación de homología entre FVII, proteína C, FIX y FX de origen humano y otras especies. Figura 2: Farmacocinética de variantes de FVII con péptidos de activación insertados de polipéptidos que dependen de vitamina K de vida larga.

EJEMPLOS La presente invención además será descrita en mayor detalle en los siguientes ejemplos de la misma. Esta descripción de modalidades específicas de la invención se hará junto con las figuras anexas.

Ejemplo 1: inserción de la secuencia del péptido de activación del factor IX en la secuencia de codificación del factor VII. En este ejemplo, la mayoría del péptido de activación de FIX se inserta en la ubicación respectiva en el ADNc de FVII mientras que conserva el sitio de activación de FVII. Primero, el ADNc de FVII, insertado en el vector de clonación pIRESpuro3 (Becton Dickinson; plásmido designado pFVII-538wt) se preparó para inserción de secuencias de péptido de activación extraño por la introducción de un sitio de restricción, Nhel, entre los aminoácidos Alal46 y Serl47 (la numeración se refiere a SEC ID NO: 3). La mutagénesis dirigida a sitio se llevó a cabo con un equipo de mutagénesis comercialmente disponible (v.gr., Equipo de Mutagénesis Dirigida al Sitio de Cambio Rápido de Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los iniciadores usados para mutagénesis se listan más adelante; las bases mutagénicas se indican en letras negritas.

Iniciador hacia adelante 5'CCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCTAGCAAACCCCAAGGCCG3' (SEC ID NO:21) Iniciador hacia atrás 5'CGGCCTTGGGGTTTGCTAGCATTTCTTTTTTCTAGAATAGG3' (SEC ID NO: 22) El plásmido resultante se designó pFVII-Nhell86. Segundo, los aminoácidos del 165 al 194 del péptido de activación FIX (la numeración se refiere a SEC ID NO: 9) se amplificaron en una construcción de aDNc de FIX por reacción en cadena de polimerasa usando los siguientes iniciadores Iniciador hacia delante 5'GTGGCTAGCGCTGAGACTGTTTTTCCTG3' (SEC ID NO: 23) Iniciador hacia atrás 5'CACGCTAGCTTGGGTGCTTTGAGTGATG3' (SEC ID NO: 24) Ambos iniciadores se agregaron a un sitio de restricción Nhel (subrayados) . El producto de amplificación se digirió con Nhel y se clonó en el pFVII-Nhell86 digerido con Nhel descrito antes. Después de la verificación de la orientación correcta por secuenciación de ADN, se llevaron a cabo dos ciclos de mutagénesis para mutar regresivamente los sitios de Nhel en las secuencias naturales de FVII/FIX. Los iniciadores mutagénicos se indican en seguida: Iniciador hacia adelante 5'CTGAAAAAAGAAATGCTCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGG3' (SEC ID NO: 25) Iniciador hacia atrás 5'CCACATCAGGAAAAACAGTCTCAGCACGAGCATTTCTTTTTTCTAG3' Iniciadores para mutar regresivamente el sitio Nhel en el extremo 3' del inserto: FIX: Iniciador hacia adelante 5' CATCACTCAAAGCACCCAATCAAGCAAACCCCAAGGCCGAATTG3' ( SEC ID NO : 27 ) Iniciador hacia atrás 5' CAATTCGGCCTTGGGGTTTGCTTGATTGGGTGCTTTGAGTGATG3' (SEC ID NO : 28 ) El plásmido de expresión resultante se designó pFVII-552. La secuencia de proteína quimérica madura resultante de FVII/FIX (SEC ID NO: 29) se da enseguida, estando subrayada la secuencia del péptido de activación de FIX insertado. 1 ANAFLEELRP GSLERECKEE QCSFEEAREI FKDAERTKLF WISYSDGDQC 51 ASSPCQNGGS CKDQLQSYIC FCLPAFEGRN CETHKDDQLI CVNENGGCEQ 101 YCSDHTGTKR SCRCHEGYSL LADGVSCTPT VEYPCGKIPI LEKRNARAET 151 VFPDVDYVNS TEAETILDNI TQSTQSSKPQ GRIVGGKVCP KGECPWQVLL 201 LVNGAQLCGG TLINTIWWS AAHCFDKIDN WRNLIAVLGE HDLSEHDGDE 251 QSRRVAQVII PSTYVPGTTN HDIALLRLHQ PWLTDHWP LCLPERTFSE 301 RTLAFVRFSL VSGWGQLLDR GATALELMVL NVPRLMTQDC LQQSRKVGDS 351 PNITEYMFCA GYSDGSKDSC KGDSGGPHAT HYRGTWYLTG IVSWGQGCAT 401 VGHFGVYTRV SQYIEWLQKL MRSEPRPGVL LRAPFP 436 Dependiendo de cuáles secuencias de ADNc se estén usando para clonación, la proteína quimérica también puede contener polimorfismos de FVII y FIX como el polimorfismo del péptido de activación de FIX RAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQS (SEC ID NO: 30) . Con base en el plásmido pFVII-552 se construyó otro plásmido de expresión con diferentes secuencias de transición entre el ADNc del FVII y las secuencias del péptido de activación de FIX. Para eso, se aplicaron dos ciclos de mutagénesis a pFVII-552 como se describió antes. El primer ciclo de aminoácidos suprimidos del 145 al 147 de SEC ID NC: 29 y se usa en los siguientes iniciadores: Iniciador hacia adelante 5'CTATTCTAGAAAAAAGAGCTGAGACTGTTTTTCCTGATG3' (SEC ID NC: 42) Iniciador hacia atrás 5'CATCAGGAAAAACAGTCTCAGCTCTTTTTTCTAGAATAG3' (SEC ID NO: 43) El segundo ciclo de mutagénesis insertó 4 aminoácidos entre los aminoácidos 176 y 177 de SEC ID NO: 29 y utilizó los siguientes iniciadores: Iniciador hacia adelante 5'CAAAGCACCCAATCAAAGCGGAATGCTAGCAAACCCCAAGG3' (SEC ID NO: 44) Iniciador hacia atrás 5'CCTTGGGGTTTGCTAGCATTCCGCTTTGATTGGGTGCTTTG3' (SEC ID NO: 45) El plásmido resultante se llamó pFVII-681. La secuencia de proteína quimérica de FVII/FIC madura resultante (SEC ID NO: 46) se da enseguida, la secuencia del péptido de activación de FIX insertado estando subrayada. 1 ANAFLEELRP GSLERECKEE QCSFEEAREI FKDAERTKLF WISYSDGDQC 51 ASSPCQNGGS CKDQLQSYIC FCLPAFEGRN CETHKDDQLI CVNENGGCEQ 101 YCSDHTGTKR SCRCHEGYSL LADGVSCTPT VEYPCGKIPI LEKRAETVFP 151 DVDYVNSTEA ETILDNITQS TQSKRNASKP QGRIVGGKVC PKGECPWQVL 201 LLVNGAQLCG GTLINTIWW SAAHCFDKID NWRNLIAVLG EHDLSEHDGD 251 EQSRRVAQVI IPSTYVPGTT NHDIALLRLH QPWLTDHW PLCLPERTFS 301 ERTLAFVRFS LVSGWGQLLD RGATALELMV LNVPRLMTQD CLQQSRKVGD 351 SPNITEYMFC AGYSDGSKDS CKGDSGGPHA THYRGTWYLT GIVSWGQGCA 401 TVGHFGVYTR VSQYIEWLQK LMRSEPRPGV LLRAPFP 437 Ejemplo 2: Inserción de la secuencia de péptidos de activación del factor X en la secuencia de codificación del factor VII El péptido de activación de FX se amplificó por PCR en un ADNc de FX clonado usando los siguientes iniciadores, uniendo un sitio de restricción de Nhel (subrayado) .

Iniciador hacia adelante 5'GTGGCTAGCCAGGCCACCAGCAGCAG3' (SEC ID NO: 47) Iniciador hacia atrás 5'GCGGCTAGCATTCCGCTTCTCAGGCTGCGTCTGGTTG3' (SEC ID NO: 48) El fragmento de PCR que contiene el péptido de activación de FX se digiere con Nhel y se liga en el plásmido digerido por Nhel pFVII-Nhell86 (ejemplo 1) . En 2 ciclos subsecuentes de mutagénesis dirigida al sitio como se describió antes, se corrigió la transición entre la secuencia de ADNc de FVII y el péptido de activación de FX. El primer ciclo de mutagénesis se realizó con los siguientes oligonucleótidos: Iniciador hacia adelante : 5' CCTATTCTAGAAAAAAAGAAATGCCCAGGCCACCAGCAGCAGCGG3' ( SEC ID NO : 49 ) Iniciador hacia atrás : 5' CCGCTGCTGCTGGTGGCCTGGGCATTTCTTTTTTCTAGAATAGG3' (SEC ID NO : 50 ) El segundo ciclo de mutagénesis se realizó con los siguientes oligonucleótidos: Iniciador hacia adelante 5'CCTATTCTAGAAAAAAGCGTGGCCCAGGCCACCAGCAGCAGCGGGG3' (SEC ID NO: 51) Iniciador hacia atrás 5'CCCCGCTGCTGCTGGTGGCCTGGGCCACGCTTTTTTCTAGAATAGG3' (SEC ID NO: 52) El plásmido resultante se llamó pFVII-611. La secuencia de proteína quimérica madura resultante de FVII/FX (SEC ID NO: 53) se da mas adelante, siendo subrayada la secuencia del péptido de activación de FX. 1 ANAFLEELRP GSLERECKEE QCSFEEAREI FKDAERTKLF WISYSDGDQC 51 ASSPCQNGGS CKDQLQSYIC FCLPAFEGRN CETHKDDQLI CVNENGGCEQ 101 YCSDHTGTKR SCRCHEGYSL LADGVSCTPT VEYPCGKIPI LEKSVAQATS 151 SSGEAPDSIT WKPYDAADLD PTENPFDLLD PNQTQPEKRN ASKPQGRIVG 201 GKVCPKGECP WQVLLLVNGA QLCGGTLINT IWWSAAHCF DKIKNWRNLI 251 AVLGEHDLSE HDGDEQSRRV AQVIIPSTYV PGTTNHDIAL LRLHQPWLT 301 DHWPLCLPE RTFSERTLAF VRFSLVSGWG QLLDRGATAL ELMVLNVPRL 351 MTQDCLQQSR KVGDSPNITE YMPCAGYSDG SKDSCKGDSG GPHATHYRGT 401 WYLTGIVSWG QGCATVGHFG VYTRVSQYIE WLQKLMRSEP RPGVLLRAPF 451 P 452 Ejemplo 3: Inserción de la secuencia del péptido de activación de Factor X en la secuencia de codificación de Factor IX.

En este ejemplo, el péptido de activación de FX se insertó en la ubicación respectiva en el ADNc FIX conservando el sitio de activación de FIX. Primero, el ADNc de FIX en el vector de clonación pIRESpuro3 (Becton Dickinson) se preparó para la inserción de secuencias de péptido de activación extraño mediante la introducción de dos sitios de restricción: un sitio Xbal entre los aminoácidos Serl61 y Lysl62 y un sitio PinAl entre Thrl92 y Glnl92 (la numeración se refiere a SEC ID NO: 9). La mutagénesis dirigida a sito se realizó con un equipo de mutagénesis comercialmente disponible (v.gr., Equipo de Mutagénesis Dirigida a Sitio de Cambio Rápido de Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los iniciadores usados para mutagénesis se listan enseguida; las bases mutagénicas se indican en letras negritas. Iniciadores mutagénicos para la introducción del sitio Xbal: Iniciador hacia adelante 5'GAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAGACTCACCCGTGCTGAGAC3' (SEC ID NO: 31) Iniciador hacia atrás 5'GTCTCAGCACGGGTGAGTCTAGAAGTTTGTGAAACAGAAACTCTTC3' (SEC ID NO: 32) Los iniciadores mutagénicos para la introducción de sitio de PinAl: Iniciador hacia adelante 5'GGATAACATCACTCAAAGCACGGTTCATTTAATGACTTCACTCGGGTTG3' (SEC ID NO: 33) Iniciador hacia atrás 5'CAACCCGAGTGAAGTCATTAAATGAACCGGTGCTTTGAGTGATGTTATCC3' (SEC ID NO:34) Segundo, los aminoácidos 159 a 213 del péptido de activación FX (los números de referencia se refieren a SEC ID NC:12) se amplificaron por la reacción en cadena de polimerasa usando los siguientes iniciadores añadiendo un sitio Xbal 5' -terminal y PinAl 3' -terminal (subrayado).

Iniciador hacia adelante 5'GTGTCTGAAGGAAGAGGTCAGTGGCCC3' (SEC ID NC: 35) Iniciador hacia atrás 5'CACACCGGTGAGGTTGTTGTCGCCC3' (SEC ID NO: 36) El producto de amplificación se digirió con Xbal y PinAl y se clonó en el ADNc de FIX digerido de Xbal y PinAl modificado como se describió antes. Subsecuentemente se realizaron dos ciclos de mutagénesis para mutar regresivamente los sitios Xbal y PinAl en las secuencias naturales de FIX y FX. Los iniciadores mutagénicos se indican más adelante: Los iniciadores para mutar regresivamente el sitio Xbal en el extremo 5' del inserto FX: Iniciador hacia adelante 5'GAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTCGCAGGAAGAGGTCAGTGG3' (SEC ID NO: 37) Iniciador hacia atrás 5'CCACTGACCTCTTCCTGCGAGAAGTTTGTGAAACAGAAACTC3' (SEC ID NO: 38) Los iniciadores para mutar regresivamente el sitio PinAl en el extremo 3' del primer inserto de FX: Iniciador hacia adelante 5'GCGACAACAACCTCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGGGTTG3' (SEC ID NO: 39) Iniciador hacia atrás 5'CAACCCGAGTGAAGTCATTAAATGATTGGGTGAGGTTGTTGTCGC3' (SEC ID NO: 40) La secuencia de proteína quimérica FIX/FC madura resultante (SEC ID NO: 41) se da en seguida, siendo subrayada la secuencia del péptido de activación de FX insertada. 1 YNSGKLEEFV QGNLERECME EKCSFEEARE VFENTERTTE FWKQYVDGDQ 51 CESNPCLNGG SCKDDINSYE CWCPFGFEGK NCELDVTCNI KNGRCEQFCK 101 NSADNKWCS CTEGYRLAEN QKSCEPAVPF PCGRVSVSQT SRRKRSVAQA 151 TSSSGEAPDS ITWKPYDAAD LDPTENPFDL LDFNQTQPER GDNNLTQSFN 201 DFTRWGGED AKPGQFPWQV VLNGKVDAFC GGSIVNEKWI VTAAHCVETG 251 VKITWAGEH NIEETEHTEQ KR VIRIIPH HNYNAAINKY NHDIALLELD 301 EPLVLNSYVT PICIADKEYT NIFLKFGSGY VSGWGRVFHK GRSALVLQYL 351 RVPLVDRATC LRSTKFTIYN NMFCAGFHEG GRDSCQGDSG GPHVTEVEGT Ejemplo 4: Transfección y expresión de proteínas de FVII y FIX modificadas Los plásmidos de expresión se desarrollaron en E. coli TOP10 (Invitrogen) y se purificaron usando protocolos normales (Qiagen) . Las células de HEK 293 (Invitrogen) se transfectaron usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se desarrollaron en medio libre de suero (Invitrogen 293 Express) en presencia de 50 ng/ml de Vitamina K3 y 4 µg/ml de puromicina. Las poblaciones de células transfectadas se diseminaron por matraces T en botellas giratorias de las cuales el sobrenadante se recuperó para purificación.

Ejemplo 5: Purificación de proteinas de FVII modificadas Las proteínas de FVII se purificaron como se describió en la patente EP 0770625. En resumen, el factor de tejido soluble se acopló covalentemente a perlas de sefarosa por cianuro de bromo. El sobrenadante del cultivo celular conteniendo FVII se cargó en una solución reguladora de calcio 10 mM. Las proteínas no unidas se lavaron con la misma solución reguladora. La elución de las proteínas de FVII unidas se realizó con una solución reguladora de citrato de sodio 100 mM.

Ejemplo 6: Determinación de actividad de FVII y antígeno.

El antígeno de FVII se determinó por un ELISA cuyo desempeño se conoce por los expertos en la materia. En resumen, se incubaron microplacas con 120µl por pozo del anticuerpo de captura (IgG de FVII anti-humano de oveja, Cedarlane CL20030AP, diluido al 1:1000 en Solución Reguladora A [Sigma C3041]) durante la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas tres veces con solución reguladora B (Sigma P3563) , cada pozo se incubó con 200 µl de solución reguladora C (Sigma P3688) durante una hora a temperatura ambiente. Después de otros tres pasos de lavado con solución reguladora B, las diluciones en serie de la muestra de prueba en la solución reguladora B así como diluciones en serie de plasma humano normal (Dade Behring; 50 - 0.5 mU/ml) en la solución reguladora B (volúmenes por pozo: 100 µl) se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado con solución reguladora B, se agregaron a cada pozo 100 µl de una dilución al 1:5000 en solución reguladora B del anticuerpo de detección (IgG de FVII anti-humano de oveja, Cedarlane CL20030K, marcado con peroxidasa) y se incubaron durante otras dos horas a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado con la solución reguladora B, se agregaron por pozo 100 µl de la solución de substrato (TMB, Dade Behring, OUVF) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La adición de 100 µl de solución de detención no diluida (Dade Behring, OSFA) preparó las muestras para su lectura en un lector de microplacas adecuado a una longitud de onda de 450 nm. Las concentraciones de las muestras de prueba luego se calcularon usando la curva normal con plasma humano normal como referencia.

Ejemplo 7: Farmacocinética de proteínas de FVII modificadas Se administraron proteínas de FVII de tipo silvestre y modificadas intravenosamente a ratas CD/Lewis narcotizadas (6 ratas por sustancia) con una dosis de 100 µg/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre de 3 ratas a 5, 30, 60, 120 y 480 minutos y de otras 3 ratas a 15, 45, 90 y 240 minutos después de la aplicación de las sustancias de prueba de la arteria carótida. El contenido del antígeno FVII se cuantificó subsecuentemente por un análisis de ELISA específico para el factor humano VII (véase antes) .Las concentraciones medias de antígeno de FVII para cada grupo se muestran en la Figura 2. La Tabla 5 resume las vidas medias calculadas para las fases alfa y beta de eliminación, por lo que la fase alfa se definió de 5 a 30 minutos y la fase beta de 30 minutos para el último punto del tiempo con concentraciones por arriba del límite de detección del análisis de antígeno. Los cálculos se realizaron de acuerdo con la fórmula en donde k es la inclinación de la línea de regresión.

Los datos muestran claramente el reemplazo del péptido de activación de FVII putativo nativo por un péptido de activación de factores de protrombina de vida larga extendieron significativamente las vidas medias in vivo de las proteínas comparado con la proteína de FVII tipo silvestre.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1.- Un método para preparar un polipéptido que depende de vitamina K modificado que comprende modificar el péptido de activación de un primer polipéptido que depende de vitamina K de manera que el polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media incrementada comparado con el primer polipéptido que depende de vitamina K en el que el péptido de activación no ha sido modificado. 2.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la modificación comprende agregar por lo menos parte del péptido de activación de un segundo polipéptido que depende de vitamina K, o agregar un análogo de dicho péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K. 3.- Un método de acuerdo con la reivindicción 2, en donde la vida media del plasma del segundo polipéptido que depende de vitamina K es mayor que aquel del primer polipéptido que depende de vitamina K no modificado. 4.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde la modificación comprende reemplazar por lo menos parte del péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K con por lo menos parte del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K. 5.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la parte del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K consiste de por lo menos 8 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K. 6.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la modificación comprende reemplazar el péptido de activación completa del primer polipéptido que depende de vitamina K con el péptido de activación completa del segundo polipéptido que depende de vitamina K mientras que conserva la especificidad de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. 1 . - Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la modificación comprende (i) remover el sitio de separación entre la cadena ligera y el péptido de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K o (ii) remover el sitio de separación entre el péptido de activación y cadena pesada del primer polipéptido que depende de vitamina K. 8.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media de plasma incrementada comparado con la forma activa del polipéptido que depende de vitamina K no modificado. 9.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la forma zimógena del polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media de plasma incrementada comparada con la forma zimógena del polipéptido que depende de vitamina K no modificado y en donde el péptido de activación modificado del polipéptido que depende de vitamina K se libera al activar el polipéptido que depende de vitamina K modificado. 10.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la forma activada del polipéptido que depende de la vitamina K modificado tiene una vida media de plasma incrementada comparada con la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K no modificada y en donde el péptido del polipéptido que depende de vitamina K al activar el polipéptido que depende de vitamina K modificado, sigue estando unido covalentemente a la cadena ligera o pesada del polipéptido que depende de vitamina K modificado. 11.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la forma zimógena del polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media de plasma incrementada comparado con la forma zimógena del polipéptido que depende de vitamina K no modificado y en donde el péptido de activación modificada del polipéptido que depende de vitamina K modificada al activar el polipéptido que depende de vitamina K modificado permanece unido covalentemente a cualquiera de la cadena ligera o la cadena pesada del polipéptido que depende de vitamina K modificado. 12.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media de plasma incrementada comparado con la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K no modificada y en donde el péptido de activación modificado del polipéptido que depende de vitamina K modificado se libera al activar el polipéptido que depende de vitamina K modificado. 13.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la modificación comprende modificar sitios de modificación post-trasnacional dentro del péptido de activación. 14.- Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la modificación comprende remover por lo menos un sitio de N-glicosilación dentro del péptido de activación. 15.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el primer polipéptido que depende de vitamina K es el Factor VII o Vlla humano. 16.- Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la secuencia de aminoácido del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 18 y SEC ID NO: 19. 17.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en donde el primer polipéptido que depende de vitamina K es proteína C humana, y la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 18 y SEC ID NO: 19. 18.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en donde el primer polipéptido que depende de vitamina K es Factor IX humano y el péptido de activación del segundo polipéptido que depende de vitamina K tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID NO: 19. 19.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la modificación no altera sustancialmente la especificidad de activación del primer polipéptido que depende de vitamina K. 20.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado que comprende un péptido de activación modificado, en donde el polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media incrementada comparado con el polipéptido que depende de vitamina K en el cual el péptido de activación no tiene que ser modificado. 21.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el péptido de activación modificado comprende por lo menos parte de un péptido de activación de un polipéptido que depende de vitamina K diferente o un análogo de dicho péptido de activación de diferente polipéptido que depende de vitamina K. 22.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con la reivindicación 21, en donde la parte del péptido de activación del diferente que depende de vitamina K consiste de por lo menos 8 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos del péptido de activación del polipéptido que depende de vitamina K diferente. 23.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde el polipéptido que depende de vitamina K modificado se selecciona del grupo que consiste de Factor VII humano modificado, Factor IX humano modificado y Proteína C humana modificada. 24.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el polipéptido que depende de vitamina K modificado es Factor VII humano modificado en el cual por lo menos parte del péptido de activación se ha reemplazado con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 18 y SEC ID NO: 19. 25.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el polipéptido que depende de vitamina K modificado es Proteína C humana modificada en la cual por lo menos parte del péptido de activación se ha reemplazado con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 18 y SEC ID NO: 19. 26.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde el polipéptido que depende de vitamina K modificado es Factor IX modificado en el cual el péptido de activación se ha reemplazado con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID NO: 19. 27.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, en donde el polipéptido que depende de vitamina K modificado carece de un sitio de N-glicosilación dentro de su péptido de activación. 28.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 27, en donde la vida media del polipéptido que depende de vitamina K modificado se incrementa por lo menos un 50% comparado con el polipéptido que depende de vitamina K correspondiente en el cual el péptido de activación no ha sido modificado. 29.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 28, en donde el polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una estabilidad incrementada comparado con el polipéptido que depende de vitamina K correspondiente en el cual el péptido de avivación no ha sido modificado. 30.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 29, el cual tiene actividad coagulante. 31.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 30, caracterizado porque (i) la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K modificado no comprende el péptido de activación modificado y (ii) la forma zimógena del polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media incrementada comparado con la forma zimógena del polipéptido que depende de vitamina K no modificado. 32.- Un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 30, caracterizado porque (i) la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K modificado comprende el péptido de activación modificado, y (ii) la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K modificado tiene una vida media incrementada comparado con la forma activada del polipéptido que depende de vitamina K no modificado. 33.- Un polinucleótido que codifica un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 32. 34.- Un plásmido o vector comprendiendo un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 33. 35.- Un plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 34, el cual es un vector de expresión. 36.- Un vector de acuerdo con la reivindicación 35, el cual es un vector de transferencia para usarse en terapia de genes humanos. 37.- Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 33, o un plásmido o vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36. 38.- Un método para producir un polipéptido que depende de vitamina K modificado, que comprende: -cultivar células huésped de acuerdo con la reivindicación 34, bajo condiciones de tal manera que se expresa el polipéptido que depende de vitamina K modificado; y recuperar opcionalmente el polipéptido que depende de vitamina K modificado de las células huésped o del medio de cultivo. 39.- Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 32, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 33, o un plásmido o vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36. 40.- El uso de un polipéptido que depende de vitamina K modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 32, de un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 33, de un plásmido o vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, o de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 37 para la manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención de un trastorno de coagulación sanguínea. 41.- El uso de acuerdo con la reivindicación .40, en donde el trastoco de coagulación sanguínea es hemofilia A. 42.- El uso de acuerdo con la reivindicación 40 o 41, en donde el tratamiento comprende terapia de genes humanos .