JP2009533364A - 治療用ポリペプチドのインビボでの回収を増大させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明における治療用ポリペプチドとは、ヒト又は動物への適用に際して、予防上の又は治療上の効果を生じることが可能なタンパク質又はポリペプチドである。これらの治療用ポリペプチドは、ヒト又は動物へ、経口的、局所的、非経口的又は他の経路を介して適用される。すなわち、本発明の実施例によって包含される治療用ポリペプチドの特定のクラスは、ある程度までその血漿由来又は組換え型として商業的に入手可能なビタミンK依存性ポリペプチドである。
本発明における回収増大用ポリペプチドとは、修飾されていない治療用ポリペプチドと比較して、治療用ポリペプチドへ融合させることにより、融合体のインビボでの回収を増大させる全てのポリペプチド又はタンパク質である。このような回収増大用ポリペプチドの具体的な例は、アルブミン、その変異体又は断片、及び免疫グロブリン、その変異体又は断片である。
インビボでの回収は、適用後の短い時間(5〜10分間)の後に血流中で検出可能な治療用ポリペプチドの、投与される治療用ポリペプチドの総量に対する割合として定義される。血流中で予測される治療用ポリペプチド濃度の算出の根拠として、1kgあたり40mLの血漿容積が一般的に想定される。
本発明における融合タンパク質又は融合ポリペプチドとは、治療用ポリペプチド又はその変異体をコードする核酸と、回収増大用ポリペプチドをコードする核酸とを含む遺伝子構築体から発現可能なタンパク質であり、この構築体中で、回収増大用ポリペプチドとのペプチド結合によって治療用ポリペプチドが連結されるタンパク質を、該遺伝子構築体が導入される宿主細胞中での発現が生じるようなやり方で、フレームを合わせて両核酸が連結される。場合により、治療用ポリペプチド及び回収増大ポリペプチドは、短いペプチドリンカーによっても連結可能である。
ビタミンK依存性ポリペプチドは、γ−カルボキシル化によって翻訳後修飾され、例えば、血液凝固第II因子(プロトロンビン)、第VII因子、第IX因子、及び第X因子、抗凝血タンパク質C及びS、及びトロンビン標的タンパク質Z、骨タンパク質オステオカルシン、石灰化阻害マトリックスタンパク質、細胞増殖を制御する増殖抑止特異的遺伝子6タンパク質(Gas6)及びその機能が現段階では未知である4つの膜貫通Glaタンパク質(TMGP)を含む。それらのポリペプチドのうち、幾つかは、特定の種類の血友病及び出血性障害を治療するために使用される。血友病Aは、遺伝性出血性障害である。血友病Aは、血液凝固第VIII因子のX染色体連鎖型欠損の結果として生じるものであり、臨床的な徴候は、増大した出血傾向である。この疾病は、血漿由来又は組換え体由来のFVIII濃縮物の注入によって治療される。血友病Bは、非機能性の又は欠損している第IX因子によって生じ、第IX因子の血漿由来又は組換え体態由来の第IX因子濃縮物で治療される。血友病A及び血友病Bの両者において、前記疾病を治療する上で最も深刻な医学上の問題は、補充した因子に対する同種抗体の生成である。血友病A患者全体の約30%までが、第VIII因子に対する抗体を生成させる。第IX因子に対する抗体の頻度は低い。
第VII因子は、分子量50kDaの単鎖糖タンパク質であり、406個のアミノ酸の不活性型酵素前駆体として、肝細胞によって血流中へ分泌される。第VII因子は、ポリペプチドのN末端側Glaドメイン中に局在する10個のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基を含有する。Gla残基は、その生合成のためにビタミンKを必要とする。GlaドメインのC末端側に、2つの上皮増殖因子ドメイン、そしてその後にトリプシン型セリンプロテアーゼドメインが存在する。第VII因子のさらなる翻訳後修飾は、ヒドロキシル化(Asp63)、N型グリコシル化(Asn145及びAsn322)及びO型グリコシル化(Ser52及びSer60)を包含する。
ヒト第IX因子は、分子量57kDaの単鎖糖タンパク質であり、415個のアミノ酸の不活性型酵素前駆体として、肝細胞によって血流中へ分泌される。ヒト第IX因子は、ポリペプチドのN末端側Glaドメイン中に局在する12個のγ−カルボキシ−グルタミン酸残基を含有する。Gla残基は、その生合成のためにビタミンKを必要とする。GlaドメインのC末端側に局在するのは、2つの上皮増殖因子ドメイン及び1つの活性化ペプチド、そしてその後にトリプシン型セリンプロテアーゼドメインが存在する。第IX因子のさらなる翻訳後修飾は、ヒドロキシル化(Asp64)、N型グリコシル化(Asn157及びAsn167)及びO型グリコシル化(Ser53、Ser61、Thr159、Thr169、及びThr172)、硫酸化(Tyr155)、並びにリン酸化(Ser158)を包含する。
IU/kgあたり0.84〜0.86IU/dLの組換え第IX因子(BeneFIX,Genetics Institute)のインビボでの回収は、IU/kgあたり1.17〜1.71IU/dLのモノニン(Mononine)のような血漿由来の第IX因子のインビボでの回収と比べて、血友病B患者において有意に低いことが報告されている(White G.et al.,Semin Hematol 35(Suppl.2):33−38(1998);Ewenstein B.M.et al.,Transfusion 42(2):190−197(2002))。結果として、血友病Bの同等に効率的な治療を達成するために血漿由来の第IX因子と比較して、組換え第IX因子は少なくとも20%多い量が適用される。
(a)哺乳動物細胞において発現可能なアルブミンポリペプチドに連結されたビタミンK依存性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供すること;
(b)生物体において核酸を発現させ、アルブミンポリペプチドに連結されたビタミンK依存性ポリペプチドを生成すること;及び
(c)アルブミンポリペプチドに連結されたビタミンK依存性ポリペプチドを精製すること
を含む。
本発明の目的は、特にヒトアルブミン又はその断片若しくは変異体のような回収増大用ポリペプチドのN末端又はC末端への融合によって、治療用ポリペプチド、特にビタミンK依存性ポリペプチド又はその断片若しくは変異体のインビボでの回収を、非融合型治療用ポリペプチドと比較して増大させる方法を提供することである。本発明の非制限的例として、治療用ポリペプチド、特にビタミンK依存性ポリペプチドの、血清アルブミンのN末端への融合は、場合により、ビタミンK依存性ポリペプチドとアルブミンとの間の介入ペプチドリンカーと共に提供される。
- ビタミンK依存性ポリペプチドアルブミン融合体が発現するような条件下で、本発明の宿主細胞を培養すること;及び
- 場合により、ビタミンK依存性ポリペプチドアルブミン融合体を培地から回収すること、
を含む。
適切な宿主細胞における組換えタンパク質の高レベルの産生は、当業者に公知の方法に従って、多様な発現系において増殖可能な組換え発現ベクター中の適切な調節エレメントとともに、上述の修飾されたcDNAを効率的な転写単位へと組み入れることを必要とする。効率的な転写調節エレメントは、その天然宿主として動物細胞を有するウイルス由来であり得るか、又は動物細胞の染色体DNA由来であり得る。好ましくは、サルウイルス40、アデノウイルス、BKポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、又はラウス肉腫ウイルスの末端反復配列、又はβ−アクチン若しくはGRP78のような動物細胞中で強力に構成的に転写される遺伝子を含む、プロモーターとエンハンサーとの組み合わせが使用可能である。cDNAから転写されたmRNAの安定した高いレベルを達成するために、転写単位は、その3’近位部分において、転写終結−ポリアデニル化配列をコードするDNA領域を含有する。好ましくは、この配列は、サルウイルス40初期転写領域、ウサギβ−グロビン遺伝子、又はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子に由来する。
プライマーWe1303及びWe1304(配列番号1及び2)を使用して、ヒト肝臓cDNAライブラリ(ProQuest,Invitrogen)から、PCRによって、第VII因子をコードする配列を増幅した。プライマーWe1286及びWe1287(配列番号3及び4)を使用したPCRの第2ラウンドの後、得られた断片をpCR4TOPO(Invitrogen)中にクローン化した。そこから、内部XhoI部位が既に欠失されているpIRESpuro3(BD Biosciences)のEcoRI部位中に、第VII因子cDNAをEcoRI断片として組み込んだ。得られたプラスミドをpFVII−659と命名した。
プライマーWe1403及びWe1404(配列番号27及び28)を使用して、ヒト肝臓cDNAライブラリ(ProQuest,Invitrogen)から、PCRによって、第IX因子をコードする配列を増幅した。プライマーWe1405及びWe1406(配列番号29及び30)を使用したPCRの第2ラウンドの後、得られた断片をpCR4TOPO(Invitrogen)中にクローン化した。そこから、内部XhoI部位が既に欠失されている発現ベクターpIRESpuro3(BD Biosciences)のEcoRI部位中に、第IX因子cDNAをEcoRI断片として転移させた。得られたプラスミドをpFIX−496と命名し、第IX因子の野生型のための発現ベクターとした。
プラスミドを大腸菌(E.coli)TOP10(Invitrogen)中で増殖し、標準的なプロトコール(Qiagen)を使用して精製した。リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)を使用してHEK−293細胞に形質移入し、50ng/mLのビタミンK及び4μg/mLのピューロマイシンの存在下で、無血清培地(Invitrogen 293 Express)中で増殖した。フューリンΔTMcDNAの共形質移入を、1:5(pFu−797:個々のpFIX構築体)モル比で実施した。T字型フラスコを通して回転瓶又は小規模発酵槽中へ、形質移入された細胞集団を拡散し、そこから精製のために上清を回収した。
第VII因子又は第VII因子アルブミン融合タンパク質を含有する細胞培養回収物を、20mM Hepes緩衝液(pH7.4)であらかじめ平衡化しておいた2.06mLのQ−セファロースFFカラム上に適用した。その後、Hepesと呼ばれる緩衝液10容積でカラムを洗浄した。20mM Hepes緩衝液中の0〜1.0M NaClの線形勾配を20カラム容積内で実施することによって、結合した第VII因子分子の溶出を達成した。溶出液は、タンパク質濃度0.5〜1g/Lで、適用された第VII因子抗原の約85〜90%を含有した。
Seligsohnら,Blood(1978)52:978−988によって記載されている方法に基づいて、市販の色素生産性検査キット(Chromogenix Coaset FVII)を使用して、第VII因子活性を測定した。
第IX因子又は第IX因子アルブミン融合タンパク質を含有する細胞培養回収物を、50mMトリスxHCl/100mMNaCl緩衝液(pH8.0)であらかじめ平衡化しておいたQ−セファロースFFカラム上に適用した。その後、200mM NaClを含有する平衡化緩衝液で、カラムを洗浄した。塩勾配を実施することによって、結合した第IX因子又は第IX因子融合ポリペプチドの溶出を達成した。カラムクロマトグラフィーによって、ヒドロキシルアパタイト溶離液をさらに精製した。この目的のため、50mMトリスxHCl/100mM NaCl緩衝液(pH7.2)で平衡化しておいたヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーカラムに、Q−セファロースFFの溶離液を負荷した。同一緩衝液でカラムを洗浄し、リン酸塩勾配を使用して、第IX因子又は第IX因子−HASを溶出した。溶出液を透析して、塩濃度を低下させ、生化学的分析に及びインビボでの回収を測定するために使用した。実施例7に記載されているとおり、第IX因子抗原及び活性を測定した。
市販のaPTT試薬を使用して、FIX活性を凝固活性として測定した(Dade Behring,Pathromtin SL及びFIX枯渇血漿)。
上述の組換え第VII因子野生型及び第VII因子アルブミン融合ポリペプチドを、体重1kgあたり100μgの用量で、麻酔をかけたCD/ルイスラット(1物質あたり6匹)に静脈内投与した。検査物質の適用5分後に開始する適切な間隔で、頸動脈から血液試料を採取した。その後、ヒト第VII因子に特異的なELISAアッセイ(上述)によって、第VII因子抗原含有量を定量した。個々のラットの群の平均値を使用して、インビボでの回収を算出した。
上述の市販の組換え第IX因子(BeneFIX、Wyeth、及びrFIX野生型)及び第IX因子−アルブミン融合ポリペプチド(rFIX−L−HSA980/797及びrFIX−L−HSA986/797)を、麻酔したウサギ(1つの物質あたり4匹)及びCD/ルイスラット(1つの物質あたり6匹)にそれぞれ、体重1kgあたり50IUの用量で静脈内投与した。検査物質の適用5分後に開始する適切な間隔で、頸動脈から血液試料を採取した。その後、ヒト第IX因子に特異的なELISAアッセイ(上述)によって、第IX因子抗原含有量を定量した。個々の群の平均値を使用して、5分後のインビボでの回収を算出した。
Claims (15)
- ヒト又は動物において治療用ポリペプチドのインビボでの回収を増大させる方法であって、
a)治療用ポリペプチドが、回収増大用タンパク質と直接的に又はリンカーペプチドを介して融合され、そして
b)インビボでの回収が、非融合型治療用ポリペプチドのインビボでの回収の少なくとも110%まで増大する、
上記方法。 - 回収増大用ポリペプチドが、アルブミン、その変異体又は断片である、請求項1に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、ビタミンK依存性タンパク質を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、第IX因子、第VII因子若しくは第VIIa因子又はそれらの断片若しくは変異体を含む、請求項1〜3に記載の方法。
- 治療用ポリペプチド部分が、アルブミン部分のN末端に融合される、請求項3又は4に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、第VII因子又は第VIIa因子である、請求項5に記載の方法。
- ペプチドリンカーが、アルブミン部分から第VII因子又は第VIIa因子部分を分離することを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- ペプチドリンカーが、翻訳後修飾のための部位の挿入によって修飾されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 翻訳後修飾が、1つ又はそれ以上のAsn−X−Ser/Thr構造のN−グリコシル化部位を含み、Xが、プロリン以外の何れかのアミノ酸を示すことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 第VII因子ポリペプチド部分が、凝固促進活性を有することを特徴とする、請求項6〜9に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、第IX因子である、請求項5に記載の方法。
- ペプチドリンカーが、アルブミン部分から第IX因子部分を分離することを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- ペプチドリンカーが、翻訳後修飾のための部位の挿入によって修飾されることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 翻訳後修飾が、1つ又はそれ以上のAsn−X−Ser/Thr構造のN−グリコシル化部位を含み、Xが、プロリン以外の何れかのアミノ酸を示すことを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 第IX因子ポリペプチド部分が、凝固促進活性を有することを特徴とする、請求項11〜14に記載の方法。
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