LU82673A1 - Homogenes fibroblasten-interferon und dessen herstellung - Google Patents
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Description
\ 1 * *** _ F.Hoffmann-La Roche & Co.Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz RAN 4100/14 5 10 Homogenes Fibroblasten-Interferon und dessen Herstellung 15 Die vorliegende Erfindung betrifft Human-Fibroblasten-
Interferon als homogenes Protein und ein Verfahren zu dessen Herstellung durch eine Kombination von Affinitäts-Chromatographie und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
20
Seit seiner Entdeckung durch Isaacs und Lindenmann im Jahre 1957, hat das Interferon, sowohl aus Leukozyten wie aus Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen von Forschern in der ganzen Welt erfolgreich widerstanden, 25 es als homogenes Peptid in solchen Mengen zu isolieren, die eine Charakterisierung und Bestimmung seiner spezifischen biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben. Während verschiedene Autoren beanspruchen, Mäuseoder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt zu 30 haben, werden von ihnen keine der klassischen Beweise für die Homogenität von Proteinen geliefert oder Eigenschaften der angeblich reinen Verbindungen beschrieben.
Die Anwendung von HPLC zur Reinigung von Proteinen ist 35 allgemein bekannt. In der Literatur sind insbesondere Säulentypen für die Ionenaustausch- und Ausschluss-Chromatographie
Mez/ 25.6.80 * - 2 - zur Reinigung von Proteinen beschrieben (z.B. Regnier und Noel, J. Chromatog. Sei. _1_4, 316 [1976] und Chang et al., Anal. Biochem. 4_8, 1839 [1976]). In der Umkehrphasen-Chromatographie wurde z.B. Lichrosorb RP-18 (Säulen auf 5 der Basis von Octadecyl-modifiziertem Si02) erfolgreich zur Reinigung von Peptiden, wie 3-Endorphin, verwendet [siehe z.B. Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei.
USA, 21/ 4969-72 (1977)].
10 Es ist ferner bekannt, dass man die Affinitäts-
Chromatographie zur Reinigung von Human-Fibroblasten-Interferon heranziehen kann. So beschreiben Davey et al., J. Biol. Chem. 251, 7620 (1976), die Verwendung von Concanavalin A-Sepharose 4B bei der Herstellung von ge-15 reinigtem Human-Fibroblasten-Interferon. Jankowski et al., Biochemistry JJ5, 5182 ( 1976), verwenden Blau Dextran-Sepharose zu dem gleichen Zweck. Schliesslich gelingt gemäss US-Patent 4.172.071 (de Maeyer et al.) die Reinigung verschiedener roher Lösungen von Leukozyten- und Fibro-20 blasten-lnterferon durch Affinitätschromatographie an einer Blau Dextran-Sepharose-Säule, wobei Präparate mit g einer spezifischen Aktivität zwischen 1 und 5 x 10 internationale Interferon-Einheiten erreicht werden. Zusätzliche Reinigungsschritte werden nicht offenbart, und die 25 erhaltenen Interferon-Präparate sollen noch einen hohen Anteil an Produkten mit Interferon-ähnlicher Aktivität enthalten und lediglich zu einem grossen Teil von verunreinigenden Proteinen befreit sein.
30 Das erfindungsgemässe, verbesserte Verfahren zur Her stellung von Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes Protein betrifft eine Kombination von Affinitäts-Chromatographie und HPLC und ist dadurch gekennzeichnet, dass man 35 A. eine wässrige Lösung von Human-Fibroblasten-Interferon in unreinem Zustand auf eine Affinitäts-Chromatographie-Säule gibt, an der das Interferon adsorbiert wird, das Interferon eluiert und es in bestimmten Fraktionen des Elua- Ä - 3 - tes in höherer Reinheit erhält und B. die erhaltenen Interferon-Fraktionen unter HPLC-Be-dingungen über eine oder mehrere mit einem Puffer äquili-5 brierte Chromatographie-Säule(n) auf der Basis einer
Cyclohexyl-, Phenyl-, Diphenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder Cyanopropylgruppen-enthaltenen SiC^-Matrix schickt, wobei das Interferon adsorbiert wird, und es jeweils mit einem Gradienten von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln in 10 einem gepufferten sauren wässrigen System eluiert, so dass das Interferon in Form eines einzigen ausgeprägten Peaks in bestimmten Fraktionen des Eluats erhalten wird.
Für die Affinitäts-Chromatographie-Stufe des vorlie-15 genden Verfahrens kann Concanavalin A-Sepharose 4B oder Blau Dextran-Sepharose verwendet werden, wobei letztere bevorzugt ist, im Hinblick auf wesentlich höhere Ausbeuten und ein stabileres Endprodukt.
20 Für die Durchführung der Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Concanavalin A-Sepharose 4B kann die folgende allgemeine Arbeitsvorschrift angegeben werden: (a) 20-30 Säulenvolumina rohen Human-Fibroblasten-Inter- 25 ferons (spezifische Aktivität etwa 10^ Einheiten/mg) in Eagle's Minimalmedium, enthaltend 5% fötales Kälberserum, ^ werden auf eine Concanavalin A-Sepharose 4B-Säule bei einer Durchflussrate von 30-60 cm/Stunde gepumpt; 30 (b) es wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PPK) vom pH 7,2 gewaschen; (c) es wird mit PPK-0,1M a-Methylmannosid (a-MM) gewaschen und 35 (d) es wird mit PPK-0,1M a-MM, enthaltend 50% Ethylenglykol (V/V), eluiert.
·* Λ - 4 -
Das nach Schritt (d) erhaltene gereinigte Interferon 7 weist eine spezifische Aktivität von etwa 10 Einheiten/mg auf bei einer Ausbeute von etwa 10-30¾.
5 Für die Durchführung der Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Blau Dextran-Sepharose kann die folgende allgemeine Arbeitsvorschrift angegeben werden: (a) 10-40 Säulenvolumina eines Kultur-Ueberstandes (1-3 x 104 Einheiten/ml, 0,2-1 mg Protein/ml) werden durch Zusatz von gesättigter NaCl-Lösung auf einen Gehalt von , 1,25M NaCl eingestellt und auf die Säule gepumpt bei einer linearen Durchflussrate von 20-40 cm/Stunde; 15 (b) die Säule wird mit 5-15 SäulenVolumina von IM NaCl/ 0,02-0,05M Phosphat und dann mit 5-15 Säulenvolumina von IM NaCl/0,02-0,05M Phosphat, enthaltend 15% (V/V) Ethylenglykol (pH 7,2) gewaschen und 20 (c) Interferon wird mit IM NaCl/0,02-0,05M Phosphat, enthaltend 50% (V/V) Ethylenglykol (pH 7,2) eluiert.
Das erhaltene Interferon hat eine spezifische Aktivität g von etwa 3 x 10° Einheiten/mg und kann in diesem Schritt ' 25 in einer Ausbeute von etwa 80% erhalten werden.
Die in der Affinitäts-Chromatographie verwendete Blau
Dextran-Sepharose kann durch Kupplung von Blau Dextran (an Dextran gekoppeltes Cibacron Blau F3GA) an CNBr-akti-30 vierte Sepharose 4B bei pH 9,5 erhalten werden.
Dieses Kupplungsverfahren ist, genauso wie das Waschen und Altern des Harzes und die Beladung und Elution der Säule, von entscheidender Bedeutung, um maximale Aus-beuten und ein hochreines Human-Fibroblasten-Interferon zu erhalten.
*1» - 5 -
Stammt das Interferon aus einem Serum-freien Medium, so wird seine Reinigung durch ein- oder zweimalige Passage durch eine Blau Sepharose-4B-Säule und Elution mit einer gepufferten wässrigen Lösung von Ethylenglykol (30-50%, 5 V/V, pH 7.2) erreicht.
Zur weiteren Reinigung des Interferons wird es nach der Affinitäts-Chromatographie ein- bzw. mehrmaliger präparativer HPLC mit hoher Auflösung und hoher Ausbeute unter-10 worfen. Für die HPLC werden Säulen auf der Basis einer porösen SiC^-Matrix, an die Cyclohexyl-, Octyl-, Octadecyl-, Phenyl-, Diphenyl- oder Cyanopropylgruppen gebunden sind, verwendet. Mittels dieser Säulen, die nacheinander und unter verschiedenen pH-Bedingungen sowie mit unterschied-15 liehen Gradienten des organischen Elutionsmittels verwendet werden können, kann das Human-Fibroblasten-Interferon bis zur Homogenität gereinigt werden. Homogenität des Interferons ist dann gegeben, wenn bei der Natriumdodecylsulfat (NaDodSO^)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ein einziges 20 Band erhalten wird, eine konstante spezifische Aktivität erreicht ist und bei der HPLC ein einzelner Peak erhalten wird, mit übereinstimmenden Aktivitäts- und Protein-Banden.
Die Chromatographie-Säulen auf der Basis einer un- 25 regelmässig geformten, völlig porösen Si09-Matrix (Partikel-
-5 L
grosse etwa 10μ, Porengrösse etwa 10 mm)die Cyclohexyl-, Octyl-, Octadecyl-, Phenyl- oder Cyanopropylgruppen enthält, sind im Handel erhältlich. Ein geeignetes HPLC-System ist in US-Patent Nr. 4,116,046 (Stanley Stein) beschrieben.
30
Gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren wird die durch die Affinitäts-Chromatographie gereinigte Lösung des Human-Fibroblasten-Interferons in einem wässrigen Puffer vom pH 4-8 über die Si02~Säule geschickt. Ein für diesen Zweck 35 bevorzugter Puffer ist ein Gemisch aus Pyridin/Ameisen-säure/Wasser (8:8:84, V/V). Gewöhnlich wird unter Druck ♦ - 6 - vorzugsweise im Bereich von 3,4 bis etwa 340 atm. gearbeitet. Das an die Säule gebundene Interferon wird anschliessend in selektiver Weise eluiert unter Verwendung eines wässrigen Puffergemisches mit einem Gradienten eines mit 5 Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels. Als geeignete, mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel kommen vor allem Alkanole wie n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, tert.-Butanol, Ethanol und Methanol in Frage. Besonders geeignet für die Elution von Human-Fibroblasten-Interferon 10 ist ein Gemisch aus Propanol und Butanol.
Das Eluat wird in üblicher Weise fraktioniert und der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wird ständig durch hochempfindliche Monitore registriert. Ein für diesen 15 zweck geeignetes System haben Bohlen et al., Anal. Bio-chem. 6J7, 438 ( 1975) t beschrieben (vgl. , auch US-Patent Nr. 3,876,881).
Die Wahl des für die HPLC geeignetsten Harzes hängt 20 von der Herkunft und Reinheit des Human-Fibroblasten-Interferons ab. Material, das von einer Concanavalin A-Sepharose-Säule stammt, wird zweckmäsigerweise durch HPLC an einer Cyclohexyl-modifizierten SiC^-Säule und anschliessend an einer Octyl-modifizierten Sio2~Säule bis zur Homo-25 genität gereinigt. Andererseits wird Material, das von einer Blau Dextran-Säule stammt, mittels ein- oder mehrmaliger Passagen durch eine Octyl-modifizierte Si02-Säule oder mittels Passage durch eine Octyl-modifizierte sowie eine Cyanopropyl-modifizierte Si02~Säule und schliesslich, sofern notwendig, eine Diphenyl-modifizierte Si02~Säule bis zur Homogenität gereinigt. Stammt das Material aus einem Serum-freien Präparat und wird die Affinitäts-Chromatographie an einer Blau Sepharose-4B-Säule durchgeführt, so genügt eine einmalige Passage durch eine Octyl-modifzierte Si02-Säule, um Homogenität zu erreichen.
ψ - 7 -
Im Hinblick auf die Empfindlichkeit von Human-Fibro-blasten-Interferon gegenüber organischen Lösungsmitteln, wie Propanolen, Butanol oder 2-Methoxyethanol, bei neutralem pH, wurde die Chromatographie bei sauren pH-Werten 5 durchgeführt. Da Human-Fibroblasten-Interferon hydrophober ist als Leukozyten-Interferon und da ferner andere, mehr hydrophobe Proteine in den teilweise gereinigten Fibro-blasten-Inferon-Praparaten vorliegen, bewährte sich ein Gemisch aus Propanol und Butanol als Elutionsmittel in 10 der HPLC an den verwendeten Umkehrphasen am besten. Die Verwendung dieses Gemisches erlaubte es, den Gehalt an organischem Lösungsmittel zu begrenzen und dadurch weniger Artefakte im Eluat zu erhalten.
15 Das gemäss vorliegender Erfindung erhaltene homogene
Human-Fibroblasten-Interferon wurde nach der jeweils letzten HPLC-Säule in Form eines einzelnen Peaks isoliert und lieferte ein einzelnes enges Band bei der NaDodSO^-Polyacrylamid-Gelelektrophorse in Gegenwart von 2-Mercapto-20 ethanol. Die Extraktion des Gels lieferte einen einzigen Peak antiviraler Aktivität, der mit der Proteinbande übereinstimmte. Jeder übliche Assay zur Bestimmung von Human-Fibroblasten-Interferon-Aktivität kann zu diesem Zweck verwendet werden.
25
Das Molekulargewicht des homogenen Human-Fibroblasten-Interferons, bestimmt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese, betrug etwa 20500. Die spezifische Aktivität des gereinig- g ten Materials war etwa 4 x 10 Einheiten/mg.
30
Die folgende N-terminale Partialsequenz konnte an einer Probe von homogenem Human-Fibroblasten-Interferon 1 5 festgestellt werden: Met -Ser-Tyr-Asn-Leu -Leu-Gly-Phe- 10 15 19
Leu-Gin -Arg-Ser-Ser-Asn-Phe -Gin-...-Gln-Lys -...
Interferone besitzen antivirale, Antitumor-, wachstumshemmende- und immunsupressive Aktivität. Diese Aktivitäten konnten sogar in klinischem Massstab festgestellt werden 35 ψ m - 8 - • g bei Verabreichung von 1-10 x 10 Einheiten/Tag mit relativ unsauberen Präparaten, die weniger als 1% Human-Interferon enthielten. Das gereinigte homogene Human-Fibroblasten-Interferon der vorliegenden Erfindung kann in der gleichen 5 Weise ,wie bereits von Interferon-Präparaten bekannt, verwendet werden »unter Anpassung der Dosierung an den gesteigerten Reinheitsgrad.
Die Verfahrens- und Produktaspekte der vorliegenden 10 Erfindung werden durch die folgenden Beispiele illustriert. Alle in Einheiten/ml oder Einheiten/mg angegebenen Interferon-Titer beziehen sich auf einen Standard für Human-Leukozyten-Interferon (GO23-901-527) des US National Institutes of Health.
15 20 25 30 35 s - 9 -
Beispiel 1
Concanavalin A-Affinitäts-Chromatographie g 50 ml Concanavalin A-Sepharose 4B (äquilibriert mit PPK vom pH 7,2, enthaltend Ο,ΙΜ α-ΜΜ) wurde in eine 50 ml Polypropylen-Säule mit einer Polyethylenfritte gepackt.
7
Es wurde mit 1,25 1 roher Interferon-Lösung (2 x 10 Ein- 4 heiten, spezifische Aktivität 2 x-10 Einheiten/mg) bei ^ einer Durchflussrate von 180 ml/Stunde (35,5 cm/Stunde) beladen. Die Säule wurde dann mit 150 ml PPK und mit 600 ml PPK, enthaltend 0,IM a-MM, gewaschen..Das Interferon wurde schliesslich mit dem obigen Puffer, enthaltend 50% (V/V)
Ethylenglykol, eluiert. Ausbeute 9% (1,8 x 10^ Einheiten, 15 7 spezifische Aktivität etwa 1 x 10 Einheiten/mg). Bei einer grösseren Bandbreite des Peaks werden unter Ein- g
Schluss weiterer Fraktionen 15% Ausbeute erhalten (3x10 g
Einheiten, spezifische Aktivität 2-4 x 10 Einheiten/mg).
20
HPLC
120 ml des Eluates der Concanavalin A-Sepharose 4B-6 6 Säule (2,5 x 10 Einheiten, etwa 2-4 x 10 Einheiten/mg) wurden bei einer Durchflussrat'e von 0,4-0,8 ml/Min. direkt 25 auf eine 4,6 x 300 mm-Saule auf der Basis einer Cyclo-hexylgruppen enthaltenden SiC^-Matrix (Chromegabond 10μ), die vorher mit einem Gemisch von Pyridin/Ameisensäure/lso-propanol/Wasser (8:8:20:64; V/V; Puffer A) äquilibriert wurde, gegeben, wobei der maximale Druck unter 306 atm.
30 gehalten wurde. Das für die HPLC verwendete System entsprach im wesentlichen dem von Bohlen et al. (Anal. Bio-chem. 6_7, 438 [1975]) beschriebenen.
Bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,4 ml/Min.
35 wurde der folgende Gradient, ausgehend vom Puffer A, für Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/ Wasser, 8:8:25:20:39, V/V) verwendet: 0-25% B, 32 Min.; 25-60% B, 225 Min.,; 60-100% B, 63 Min. Es wurden Fraktio- 4 - 10 -9 nen zu 2,0 ml gesammelt. Die vereinigten Fraktionen 26-29 g (2 x 10 Einheiten) wurden mit 4 ml Pyridin/Ameisensäure verdünnt und direkt auf eine 4,6 x 300 mm-Säule auf der Basis einer Octylgruppen enthaltenden SiC^-Matrix 5 (ehromegabond 10 μ) gegeben. Es wurde unter den für die
Cyclohexylsäule angegebenen Bedingungen eluiert. Die spezifische Aktivität im Zentrum des Aktivitäts-Peaks war etwa g 4 x 10 Einheiten/mg bei einer Gesamtausbeute an gereinigtem Human-Fibroblasten-Interferon von 10^ Einheiten.
10
Das an einer Concanavalin A-Säule gereinigte Interferon wird bei der HPLC an einer Cyclohexylgruppen- bzw. einer Octylgruppen-tragenden Säule sehr nahe beim Haupt-Peak eluiert. Wird bei der HPLC zuerst an der Octyl-Säule 15 chromatographiert, so wird das Interferon direkt vor dem Haupt-Peak eluiert, während es bei Verwendung einer Cyclo-hexyl-Säule als erster Säule unmittelbar nach dem Haupt-Peak eluiert wird.
20 Proben des HPLC-gereinigten Human-Fibroblasten-Inter- ferons wurden an 12,5 oder 15% NaDodSO^-Polyacrylamid-Gel in Tris/Glycinpuffer der Elektrophorese unterworfen (1 ug Protein). Nach Anfärbung mit Coomassie Blau wurde ein einziges Band erhalten. Durch Assay auf antivirale Aktivs vität wurde festgestellt, dass das Maximum dieser Aktivität im Zentrum der gefärbten Bande lag. Das Molekulargewicht wurde mit etwa 20500 bestimmt unter Verwendung von Rinderserumalbumin, Chymotrypsin, Cytochrom C und Ribonucléase als Vergleichssubstanzen. Die relative Beweglichkeit der 30
Human-Fibroblasten-Interferon-Bande war nicht von der Anwesenheit von Mercaptoethanol in der Probe abhängig.
Beispiel 2
Herstellung der Blau Dextran-Sepharose 4B-Säule 50 g bepackte Sepharose 4B wurde mit 1 1 Wasser gewaschen und nochmals in 50 ml destilliertem Wasser suspen- 4 - 11 - diert. Es wurden 15 g fein verteiltes CNBr unter leichtem Rühren zugesetzt und der pH-Wert auf 11 + 0,2 durch tropfenweise Zugabe von ION NaOH eingestellt. Die Temperatur wurde durch Zugabe von Eis auf 20 + 5°C gehalten. Nach 5 15-20 Minuten wurde mit einem Volumen Eiswasser versetzt und die Suspension auf einem Büchner-Trichter nochmals mit 5 Volumina 0,0IN HCl gewaschen.
Das aktivierte Harz wurde sofort in 50 ml 0,4M Natrium-10 .carbonatpuffer (pH 9,5), enthaltend 1,00 g gelöstes Blau Dextran, suspendiert und über Nacht bei 4eC in einer Rundbodenflasche geschüttelt. Es wurde mit 10 Volumina IM NaCl, 2 Volumina 50% (V/V) Ethylenglykol, enthaltend IM NaCl und 0,05M Natriumphosphat (pH 7,2), gewaschen, über Nacht 15 in 50% (V/V) Ethylenglykol stehengelassen, mit einem Volumenteil 80%igem (V/V) Ethylenglykol und 5 Volumina Gibco No. 11 Minimalmedium (MEM) gewaschen und in diesem Medium über Nacht bei 50°C aufbewahrt. Nach nochmaligem Waschen mit 3 Volumina 80%igem (V/V) wässrigem Ethylengly-20 kol, enthaltend IM NaCl, und anschliessend mit 2 Volumina MEM wurde das Harz in MEM aufgeschlämmt und in eine Säule übergeführt.
Affinitäts-Chromatographie 25
Ein Gemisch aus 1,5 1 rohem Human-Fibroblasten-Inter-feron (2 x 104 Einheiten/ml; 1 mg Protein/ml; spezifische Aktivität 2 x 104 Einheit.en/mg Protein) und 0,27 Volumina gesättigter NaCl-Lösung (etwa 6,3M) wurde auf eine 50 ml-Polypropylen-Säule mit einer Polyethylen-Fritte, enthaltend 35 ml Blau Dextran-Sepharose 4B, bei einer Durchflussrate von 100 ml/Stunde (20 cm/stnde) gegeben. Die Säule wurde nacheinander mit 200 ml IM NaCl, enthaltend 0,05M Natrium-phosphatpuffer (pH 7.,2) und 500 ml IM NaCl, enthaltend 0,05M Natriumphosphat (pH 7,2) und 75 ml Ethylenglykol, gewaschen und schliesslich mit 500 ml IM NaCl, enthaltend 0,05M Natriumphosphat (pH 7,2) und 250 ml Ethylenglykol eluiert. Etwa 90% des Interferons wurde in einem einzigen 4 - 12 -
Peak zusammen mit dem Durchbruch des 50% Ethylenglykol enthaltenden Lösungsmittels eluiert. Die spezifische Aktivität im Peak-Maximum, mit dem mehr als 50% des gesamten Inter- 7 ferons eluiert wurde, lag bei 1 x 10 Einheiten/mg.
5
HPLC
(A) 125 ml von der Blau Dextran-Sepharose 4B-Säule eluierte 7 7
Interferon-Lösung (3 x 10 Einheiten; 1 x 10 Einheiten/mg) 10 wurden auf eine 4,6 x 300 mm Säule auf der Basis einer Octylgruppen enthaltenden SiC^-Matrix (Chromegabond 10 u) prä-äquilibriert mit IM NaCl/50% (V/V) Ethylenglykol, gepumpt. Bei einer Durchflussrate von 0,45 ml/Min. wurde, ausgehend von Puffer A (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/ 15 n-Butanol/Wasser, 8:8:20:3,3:60,7, V/V), der folgende
Gradient beim Uebergang zu Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/ Isopropanol/n-Butanol/Wasser, 8:8:25:20:39, V/V) eingehalten: 0-25% B, 30 Min.; 25-55% B, 190 Min.; 55-100% B, 20 Min.; 100% B, 60 Min. Die Interferon-Aktivität stimmte 20 im wesentlichen überein mit einem einzigen Protein-Peak in den Fraktionen 18-23 (jede Fraktion enthielt 1,5 ml Elutionsflüssigkeit).
(B) Bei Applikation von etwa einem Viertel der in Stufe 25 (A) applizierten Menge an der gleichen Säule unter den für die Cyclohexyl-Säule in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen, stimmte die Interferon-Aktivität mit einem Protein-Peak in den Fraktionen 24-26 überein.
30 (C) Unter den gleichen Bedingungen hinsichtlich Beladung, Gradient und Durchflussmenge wie in (A) und den gleichen Puffern A und B wie in (B) an einer Octylgruppen-enthal-tenden Säule (9,6 x 500 mm, Chromegabond), so dass 1/9 der Beladung pro Kolonnenvolumen resultierte, wurde eine 35 bessere Trennqualität erreicht.
- 13 - (D) Das Material, das die höchste spezifische Aktivität g (4 x 10 Einheiten/mg) aus Verfahrensschritt (A) enthielt, wurde rechromatographiert an einer Cyanopropylgruppen-ent-haltenden Säule unter Verwendung von Pyridin/Ameisensäure/ 5 Wasser (8:8:84, V/V) und einem einstündigen Gradienten bezüglich n-Propanol (0-40%, V/V), bei einer Durchflussrate von 0,3 ml/Min. Es wurde ein symmetrischer Hauptpeak erhalten.
10 NaDodSO^-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Elektrophorese wie in Beispiel 1 beschrieben von
Interferonproben, die in den Verfahrensschritten (A), (B) und (C) erhalten wurden, lieferte eine Hauptbande vom 15
Molekulargewicht 20500, die im Assay auf Interferon-Aktivität mit der Mitte des Aktivitätspeaks übereinstimmte.
Eine zweite Bande, die ein Molekulargewicht von etwa 10500 aufwies und 20-50¾ des gesamten Materials, bezogen auf die Färbungsintensität, enthielt, variierte von Probe zu Probe 20 und besass keine antivirale Aktivität. Wenn die Proben nicht mit Mercaptoethanol behandelt wurden, wurde eine Bande mit einem Molekulargewicht von 40000 beobachtet, die aber nur untergeordnete Aktivität aufwies. Die Aminosäureanalysen der Banden mit den Molekulargewichten 20000 25 und 40000 unterschieden sich nicht, während die Analyse derjenigen Bande, die ein Molekulargewicht von 10000 auf-' wies, sehr deutlich differierte.
Die Elektrophorese einer gemäss Verfahren (D) erhaltenen Interferon-Probe lieferte ein Molekulargewicht g von etwa 20500 und eine spezifische Aktivität von 4 x 10 Einheiten/mg. Die Aminosäureanalyse dieses homogenen Peptids lieferte nach 24-stündiger Hydrolyse in 6N HCl die folgenden, auf Leucin mit 25,0 bezogenen Werte: 35 - 14 -
Asx 15,4+0,2 Ala 11,8+0,4 Tyr 9,6 + 0,2 Thr* 7,8 + 0,3 Cys n. best. Phe 7,3 + 0,1
Ser* 7,7 + 0,2 Val 6,9 + 0,1 His 4,5 + 0,1
Glx 24,1 + 0,4 Met 2,8 + 0,4 Lys 11,6 + 0,4 5 Pro 2,8 + 0,4 Ile 8,7 + 0,1 Arg 8,8 + 0,4
Gly 4,9 + 0,3 Leu 25,0 Trp n. best.
* korrigierter Wert n.best. nicht bestimmt 10
Beispiel 3
Blau Dextran-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie 15 (a) 51 Kulturüberstand, enthaltend 19400 Einheiten/ml
Fibroblasten-Interferon, wurden durch ein 0,3 μ Filter filtriert und dann auf eine Säule mit 275 ml Blau Dextran-Sepharose gegeben. Der Ueberstand wurde vorher durch Zugabe von 1350 ml einer gesättigten Lösung von NaCl 20 (6,3M) auf 1,25M NaCl eingestellt und auf die Säule bei einer Durchflussrate von 360 ml/Stunde gepumpt. Etwa 4-6% des Interferons passierten die Säule ohne adsorbiert zu werden.
25 (b) Die Säule wurde dann bei einer Durchflussrate von 420 ml/Stunde mit 1300 ml einer wässrigen Lösung, die 15% (V/V) Ethylenglykol, IM NaCl und 0,02M Natriumphosphat (pH 7,2) enthielt, gewaschen. Etwa 1% des adsorbierten Interferons wurden von der Säule eluiert.
30 (c) Das Interferon wurde dann bei einer Durchflussrate von 420 ml/Stunde mit einer wässrigen Lösung, die 50% (V/V) Ethylenglykol, IM NaCl und 0,02M Natriumphosphat (pH 7,2) enthielt, eluiert. Mit den ersten 200 ml des Eluates wurde 35 wenig Interferon eluiert. Das meiste Interferon wurde mit den nächsten 300 ml des Eluats eluiert, wie die folgende Tabelle zeigt: * - 15 - *
Fraktion Fraktion Protein Interferon- Spez. Aktivität
No. Volumen [pg/ml] Titer [Einh./mg] __[ml]___[Einh./ml]__ 1 200 n.best. 122 - 5 2 50 43 3.8 x 105 9,02 x 106 3 50 82 11,64x 105 1,42 x 107 4 50 63 7,72 x 105 1,23 x 107 5 50 62 1,94 x 105 3,13 x 106 6 50 49 9,7 x 104 1,97 x 106 10 7 50 41 3,64x 104 8,87 x 105
Es wurden insgesamt 114¾ der eingesetzten Interferon-Aktivität wiedergefunden.
15 HPLC
Die Fraktionen 2-6 der Blau Dextran-Sepharose-Kolonne 7 (250 ml; 13 x 10 Einheiten; spezifische Aktivität 8,12 x 10b Einheiten/mg) wurden auf eine Säule (9,5 x 500 mm) 20 auf der Basis einer Octylgruppen-enthaltenden Si02-Matrix bei einer Durchflussrate von 4 ml/Min. gepumpt. Während 12 Minuten wurde Puffer A (Pyridin/Ameisensäure/2-Propanol/ n-Butanol/Wasser, 8:8:20:2,5:61,5, V/V), bei einer Durchflussrate von 2 ml/Min., durch die Säule gepumpt. Anschlies-25 send wurde mit dem folgenden Gradienten bezüglich Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/l-Propanol/n-Butanol/Wasser, 8:8:25:25:34, V/V), bei einer Durchflussrate von 1,25 ml/Min., eluiert: 0-20% B, 18 Min.; 20-29% B, 57 Min.; 29% B isokratisch während 27 Min.; 29-30% B, 3 Min.; 30 30-100% B, 36 Min.; 100% B, 54 Min.
Die Interferon-Aktivität wurde im isokratischen Bereich des Gradienten eluiert und zwar gemeinsam mit einem Peak der mit einem Fluorescamin-Monitor-System nachge- g 35 wiesen wurde. 45 x 10 Einheiten Interferon (Ausbeute 35%) g mit einer spezifischen Aktivität von 2 x 10 Einheiten/mg wurden im Pool zusammengefasst (50 ml). Nach zweimonatiger Aufbewahrung bei -20°C in verschlossenem Polypropylen-
P
- 16 -
Ampullen war die Aktivität auf 10% des Wertes nach HPLC zurückgegangen. Proteinverlust trat nicht ein.
Dieser 50 ml-Pool (spezifische Aktivität etwa 0,2 x g 5 10 Einheiten/mg) wurde mit 1 ml Thiodiglykol und 20 ml n-Propanol versetzt. Mittels Assay wurden für dieses Ge- g misch insgesamt 4,26 x 10° Einheiten festgestellt. Dem Gemisch wurden 100 ml 0,1% Triton X-100/0,3% Thiodiglykol zugesetzt. Dieses Gemisch, das gemäss Assay insgesamt 10 5,1 x 10^ Einheiten enthielt, wurde innerhalb von 30
Minuten auf eine Säule auf der Basis einer CN-Gruppen- * —»6 enthaltenden SiC^-Matrix (4,6 x 250 mm, 5 μ/8 x 10 mm,
Spherisorb), äquilibriert mit einem Gemisch von Pyridin/ Ameisensäure/Wasser (8:8:84, V/V, Puffer A), bei einer 15 Durchflussrate von 1,5 ml/Stunde, gepumpt. Der folgende Gradient bezüglich Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/n-Pro-panol/Wasser, 8:8:50:34, V/V) bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/Min. wurde eingestellt: 0-25% B, 30 Min.; 25-50% B, 210 Min. Die Interferon-Aktivität wurde mit dem einzigen g 20 festgestellten Peak eluiert. Es wurden 4,2 x 10 Einheiten (82%) in drei 1 ml-Fraktionen wiedergefunden.
Dieser Pool, der 69% des gesamten, auf die erste CN-Säule aufgegebenen Proteins darstellt, wurde mit 2 ml 0,1% 25 Triton X-100 vermischt und nochmals auf die gleiche CN-Säule aufgegeben. Es wurde mit dem gleichen Gradienten in der halben Zeit eluiert. Die gesamte Aktivität (11,75 x
C
10 Einheiten; Ausbeute 280%) wurde in einem einzigen Peak eluiert.
30
Die die Interferon-Aktivität von der zweiten CN-Säule enthaltenden Fraktionen (4 ml) wurden auf eine 4,6 x 250 mm-Säule auf der Basis einer Diphenylgruppen-enthaltenden SiC^-Matrix, die vorher mit einem zweistündigen linearen 35 Gradienten von Puffer A zu Puffer B (gleiche Puffer wie für die CN-Säule) vorbehandelt und mit Puffer A äquilibriert war, bei einer Durchflussrate von 1,5 ml/Min. gepumpt.
- 17 -
Es wurde der folgende Gradient bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/Min. verwendet: 0-25% B, 22 Min.; 25-50%, 98 Min. Der zweite Peak, der eluiert wurde als das Gradient-Instrument 33% Puffer B anzeigte, stimmte mit dem 5 Interferon-Aktivitäts-Peak überein. Es wurden insgesamt
C
2,6 x 10 Einheiten (22%) und 40 ug Protein mit diesem Peak eluiert.
Die Diphenylgruppen-tragende SiC^-Säule wurde folgen-10 dermassen hergestellt: -2 -5
SiC>2 (10 mm, 10 mm Porengrösse) wurde in 6N HCl (10:1, V/G) während 24 Stunden unter gelegentlichem Schütteln eingeweicht. Es wurde dann mit Wasser neutral ge-15 waschen und anschliessend durch Waschen mit Aceton und
Methanol das Wasser entfernt. Nach Trocknen unter vermindertem Druck über Nacht wurde die Kieselsäure (10 g) in 100 ml trockenem Toluol, das 10 ml Dichlordiphenylsilan enthielt, 6 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die so modifizierte 20 Kieselsäure wurde zunächst mit 200 ml Toluol gewaschen und anschliessend in einem Soxhlet-Extraktor nacheinander mit 250 ml Toluol, Aceton und Methanol jeweils während 8 Stunden behandelt. Schliesslich erfolgte Behandlung mit Tri- methylchlorsilan in der vorstehend angegebenen Weise.
25
Je 3 g Trägermaterial wurden dann in 10,7 ml Chloroform und 2,3 ml n-Butanol suspendiert und in 4,6 x 250 mm-Säulen aus rostfreiem Stahl unter einem Druck von 340 atm. gefüllt. Die Säulen wurden anschliessend mit 75 ml Etha-nol gewaschen.
Aminosäureanalysen der Mittelfraktion des erhaltenen Interferon-Peaks nach Hydrolyse in 5,7N HCl lieferten die folgenden Ergebnisse: 35 > 4 - 18 -
Asx 15,4 17,6 17,95 15,2 Thr* 7.8 8,6 8,4 7,3 Ser* 7.7 8,3 9,1 9,9 Glx 24,1 21,1 21,4 n.b. Pro 5 2,8 n.b. n.b. 3,36 Gly 4.9 6,9 6,6 7,4 Ala 11,8 10,7 10,7 9,9 Cys n.b. 3,96 3,4 n.b. Val 6.9 7,84 8,2 6,9 Met 10 2,8 4,5 4,5 3,7 Ile 8.7 8,6 8,9 7,8 Leu 25,0** 25** 25** 25** Tyr 9,6 10,3 9,0 8,1 Phe 7,3 9,5 9,8 9,0 His 15 4,5 7,5 6,9 6,1 Lys 11,6 12,3 11,8 11,25 Arg 8.8 11,25 10,6 8,8 Trp n.b. n.b. n.b. 2,93 24 Std. 24 Std. 48 Std. 24 Std.
20 TGS TGS TGS TGS
TGS Thioglykolsäure * unkorrigierter Wert ** Bezugswert 25 n.b. nicht bestimmt
Hexosaminanalyse nach 6-, 14- und 24-stündiger Hydrolyse des Interferons mit 5,7N HCl, enthaltend 0,02% Thioglykolsäure, bei 110°C, unter Verwendung der Mittel-20 fraktion des Interferon-Peaks von der Diphenylsäule lieferte 3 Glucosaminreste pro Molekül. Es wurde weder Galactosamin noch Mannosamin gefunden.
Die Endgruppenbestimmung wurde mit einer 90 pMol-35 Probe aus der Mittelfraktion des Interferon-Peaks von der Diphenylsäule durchgeführt und ergab Met als N-termina-le Aminosäure.
- 19 - 150 pMol-Proben sowohl von Fibroblasten- wie von Leuko-zyten-Interferon wurden dem tryptischen Abbau unterworfen und anschliessend chromatographiert. Es wurden in den beiden Proben keine identischen Peptidfragmente gefunden.
5
Durch Sequenzierung einer 1,25 nMol-Probe von Fibro-blasten-Interferon wurde Met als N-terminale Aminosäure bestätigt, wie auch die von Hunkapillar und Hood, Biochemistry 1_7, 2124 (1978), berichtete Sequenz 3-10, nämlich 3 10 10 Tyr -Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln . Sequenzierung einer weiteren 5,9 nMol-Probe von Fibroblasten-Interferon lieferte die folgende N-terminale Aminosäuresequenz : 1 C i Λ H~N-Met -Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln -Arg- Δ 15 19
Ser-Ser-Asn-Phe -Gin-....-Gln-Lys . .
15
Beispiel 4
Rohes Interferon wurde aus menschlichen Fibroblasten (Zell-Linie GM 2504A) gewonnen. Das rohe Material wurde IM 20 bezüglich Natriumchlorid durch Zugabe gesättigter Natriumchloridlösung gemacht. Dieses Material wurde durch eine Säule von Blau Sepharose-4B (Volumen 20-25 ml, Durchmesser 2,5 cm, Durchflussmenge 2,5 ml/Min.) gegeben. Während des Beladens wurde das Rohmaterial mit Eis gekühlt. Nach der 25 Beladung wurde die Säule mit 250 ml der folgenden Lösung (2,5 ml/Min.) gewaschen: ; 30% Ethylenglykol, IM NaCl, 50 mM Na2HP04 (pK 7,2).
Schliesslich wurde das Interferon bei einer Durchfluss-30 rate von 2,5 ml/Min. mit 250 ml der folgenden Lösung eluiert: 50% Ethylenglykol, IM NaCl, 50 mM Na2HPC>4 (pH 7,2).
Typische Ergebnisse des Assays waren: 20 5% Aktivität im Durchfluss 10% Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung 85% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung » - 20 -
Die Fraktionen des Interferon-Peaks aus der ersten Blau Sepharose-Säule wurden zusammengefasst und mit der folgenden Lösung auf einen Ethylenglykolgehalt von 10% (V/V) gebracht: 5 2M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2).
Dieses Material wurde auf eine Blau Sepharose-Säule gegeben ( Volumen 20-25 ml, 2,5 cm Durchmesser, Durchflussrate 2,5 ml/Min). Es wurde mit 250 ml einer Lösung, ent-10 haltend 2M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2) und 30% (V/V)
Ethylenglykol gewaschen und eluiert mit einer Losung, enthaltend 2M NaCl, 50 mM Na2HP04 (pH 7,2) und 50% (V/V) Ethylenglykol.
15 Typische Ergebnisse des Interferon-Assays waren: 10% Aktivität im Durchfluss 30% Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung 60% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung.
20 HPLC
Zunächst wurde die Probe aus dem 50%igen (V/V) Ethylenglykol-Eluat von Blau Sepharose untersucht. Es folgten Proben, die zweimal über die Blau Sepharose-Säule gegeben 25 wurden, in welchen Fällen die 30%igen oder die 50%igen Ethylenglykol-Eluate verwendet werden konnten.
Es wurde eine 25 x 0,46 cm-Säule auf der Basis einer durch Octylgruppen modifizierten Si02~Matrix (Lichrosorb 30 RP-8) verwendet. Die Säule wurde zunächst mit Wasser gewaschen und dann mit dem Eluat der Blau Sepharose-Säule beladen. Vor die Pumpe wurde eine Mischkammer (5 ml) geschaltet. Es wurde bei einer Durchflussrate von 22 ml/Std. mit dem folgenden stufenweisen Gradienten von n-Propanol, 35 bei einem konstanten, durch IM Ameisensäure/0,8M Pyridin gewährleisteten pH von 4,2 gearbeitet: I .
ί » - 21 - 0% 10 Min.; 30% 40 Min.; 32% 40 Min.
Schliesslich wurde die Säule mit 60%igem n-Propanol gewaschen und vor der nächsten Verwendung mit IM Ameisen-5 säure und 0,8M Pyridin äquilibriert.
Das Interferon wurde mit dem 32%igen n-Propanol-Eluat (zwischen 80 und 90 Minuten) eluiert. Dieses Material war homogen aufgrund der NaDodSO^-Acrylamid-Gelelektrophorese 10 (Färbung mit Coomassie Blau oder vorheriger Markierung der Probe mit Fluram).
Aminosäureanalysen (24-stündige Hydrolyse, 0,2% TGS, 5,7N HCl) wurde an neun verschiedenen Proben aus vier unterschiedlichen Präparaten durchgeführt. Die mittlere Aminosäurezusammensetzung, bezogen auf einen Leucinwert von 22,0, geht aus der folgenden Tabelle hervor:
Asx 15,1 + 0,7 Met 4,5 + 0,7 2° Thr1 7,0 + 0,5 Ile 9,4+0,1
Ser1 7,5 + 0,5 Leu 22,0
Gly 22,2+0,5 Tyr 8,8+0,2
Pro nicht best. Phe 8,0 + 0,3
Cys 3,0 + 0,3 His 4,5 + 0,1 25 Gly 6,9+0,7 Lys 11,0+0,6
Ala 7,4 + 1,0 Arg 11,9 + 0,7
Val 5,7 + 0,5 Trp nicht best.
unkorrigierter Wert 30
Basierend auf den zu verschiedener Zeit durchgeführten Analysen verschiedener Proben, die durch unterschiedliche, in diesem und den vorangehenden Beispielen beschriebenen Verfahren erhalten wurden (24-stündige Hydrolyse in 6N HCl 35 mit 0,2% Thioglykolsäure, TGS), weist homogenes Human-Fibroblasten-Interferon die folgende Aminosäurezusammensetzung auf (+ 15%): fr * - 22 -
Asx 15,1 Gly 6,9 Tyr 8,8
Thr* 7,0 Ala 7,4 Phe 8,0
Ser* 7,5 Val 5,7 His 4,5
Glx 22,2 Met 4,5 Lys 11,0 5 Pro 3,0 Ile 9,4 Arg 11,9
Cys 3,0 Leu** 22,0 Trp 3,0 * unkorrigierter Wert ** Bezugswert 10
Beispiel 5
Homogenes Human-Fibroblasten-Interferon (1,5 mg) mit 0 einer spezifischen Aktivität von 4 x 10 Einheiten/mg wurde 15 in 25 ml 5%igem normalem Human-Serumalbumin gelöst. Die Lösung wurde durch ein bakteriologisches Filter filtriert und auf 100 aseptische Ampullen verteilt. Jede Ampulle enthielt 6 x 10^ Einheiten reines Interferon, das sich für die parenterale Applikation eignet. Die Ampullen werden bis 20 zum Gebrauch vorzugsweise in der Kälte (bei -20°C) aufbewahrt.
25 30 35
Claims (16)
1. Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes Protein, gekennzeichnet durch 5 g (a) eine spezifische Aktivität von etwa 4 x 10 Einhei-ten/mg; (b) ein Molekulargewicht von etwa 20500 gemäss Natrium- , w dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; (c) die folgende relative Aminosäurezusammensetzung ( + 15%) basierend auf 24-stündiger Hydrolyse in 6.0N HCl, enthaltend 0,2% Thioglycolsäure (bezogen auf einen Wert für Leucin von 22,0): Asx 15.1 Gly 6.9 Tyr 8.8 Thr* 7.0 Ala 7.4 Phe 8.0 Ser* 7.5 Val 5.7 His 4.5 20 'Glx 22.2 Met 4.5 Lys 11.0 Pro 3.0 Ile 9.4 Arg 11.9 Cys 3.0 Leu 22.0 Trp 3.0 * unkorrigierter Wert 25 (d) die Aminosäure-Teilsequenz H?N-Met^-Ser-Tyr-Asn-Leu^-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln^-Arg-Ser- Z 15 19 Ser-Asn-Phe -Gin-....-Gln-Lys -... und 30 (e) höchstens 3 Glucosaminreste, 0 Galaktosamin- und 0 Mannosaminreste pro Molekül.
2. Human-Fibroblasten-Interferon gemäss Anspruch 1 zur Behandlung viraler und neoplastischer Erkrankungen. 35
3. Verfahren zur Herstellung von Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes Protein, dadurch gekennzeichnet, £ fc-
24. DS 4100/14 ► dass man A. eine wässrige Lösung von Human-Fibroblasten-Interferon in unreinem Zustand auf eine Affinitäts-Chromatographie-
4. Verfahren zur Herstellung von Human-Fibroblasten- Interferon als homogenes Protein, dadurch gekennzeichnet,, dass man A. eine wässrige Losung von Human-Fibroblasten-Interferon 25 in unreinem Zustand auf eine Affinitäts-Chromatographie- tr Säule gibt, an der das Interferon adsorbiert wird, das c Interferon eluiert und es in besimmten Fraktionen des Eluates in höherer Reinheit erhält und 30 b. die erhaltenen Interferon-Fraktionen unter HPLC-Be-dingungen über eine oder mehrere mit einem Puffer äquilibrierte Chromatographie-Säule(n) auf der Basis einer Cyclohexyl-, Phenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder Cyanopro-pylgruppen-enthaltenden Si02~Matrix schickt, wobei das Inter-35 feron adsorbiert wird, und jeweils mit einem Gradienten von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln in einem gepufferten sauren wässrigen System eluiert, so dass das Interferon in Form eines einzigen ausgeprägten Peaks in bestimmten Frak- JL u ' - 25 - DS 4100/14 > tionen des Eluats erhalten wird.
5 Sepharose und die HPLC zuerst an einer Cyclohexylgruppen-enthaltenden SiC^-Säule mit steigendem n-Butanol-Gradienten in einem Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/2-Propanol/ n-Butanol/Wasser und anschliessend an einer Octylgruppen-enthaltenden SiC^-Säule unter den gleichen Bedingungen „ 10 durchgeführt wird.
5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitäts-Chromatographie an Concanavalin A-
5 Säule gibt, an der das Interferon adsorbiert wird, das Interferon eluiert und es in bestimmten Fraktionen des Eluates in höherer Reinheit erhält und B. die erhaltenen Interferon-Fraktionen unter HPLC-Be-10 dingungen über eine oder mehrere mit einem Puffer äquilibrierte Chromatographie-Säule(n) auf der Basis einer Cyclohexyl-, Phenyl-, Diphenyl-, Octyl-, Octadecyl- oder ' Cyanopropylgruppen-enthaltenden siC^-Matrix schickt, wobei das Interferon adsorbiert wird, und jeweils mit einem 15 Gradienten von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln in einem gepufferten sauren wässrigen System eluiert, so dass das Interferon in Form eines einzigen ausgeprägten Peaks in bestimmten Fraktionen des Eluats erhalten wird.
6. Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, " dass bei der HPLC die Ausgangszusammensetzung des als Elutionsmittel verwendeten Gemischs 8:8:20:0:64, V/V, und 15 dessen Endzusammensetzung 8:8:25:20:39, V/V, ist.
7. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Affinitäts-Chromatographie an Blau Dextran Sepharose und die HPLC an einer Octylgruppen-enthaltenden SiC^- 20 säule mit steigendem n-Butanol-Gradienten in einem Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/2-Propanol/n-Butanol/Wasser durchgeführt wird.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, 25 dass bei der HPLC die Ausgangszusammensetzung des als » Elutionsmittel verwendeten Gemischs 8:8:20:3,3:60,7, V/V, ! und dessen Endzusammensetzung 8:8:25:20:39, V/V, ist.
9. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die von der Octylgruppen-enthaltenden Si02-Säule eluierten, vereinigten Interferon-aktiven Fraktionen anschliessend an einer Cyclopropylgruppen-enthaltenden S1O2-Säule rechromatographiert werden mit steigendem n-Propanol-Gradienten in einem Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/ n-Propanol/Wasser.
10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die AusgangsZusammensetzung des als Elutions- t- l
26. DS 4100/14 ·» mittel verwendeten Gemischs 8:8:0:84, V/V, und dessen Endzusammensetzung 8:8:40:44, V/V, ist.
11. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekenn- 5 zeichnet, dass bei der HPLC die Ausgangszusammensetzung des als Elutionsmittel verwendeten Gemischs 8:8:20:0:64, V/V, und dessen Endzusammensetzung 8:8:25:20:39, V/V, ist.
12. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekenn-zeichnet, dass die von der Cyclopropylgruppen-enthaltenden SiC^-Säule eluierten, vereinigten Interferon-aktiven Frak- : tionen an der gleichen Säule rechromatographiert und an schliessend an einer Diphenylgruppen-enthaltenden SiC^-Säule chromatographiert werden. 15
13. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das rohe Human-Fibroblasten-Interferon aus einem serumfreien Präparat stammt, die Affinitäts-Chromatographie an Blau Sepharose 4B und die HPLC an einer Octyl- 20 w gruppen-enthaltenden SiC^-Saule mit einem Gemisch aus Pyridin/ Ameisensäure/n-Propanol/Wasser und diskontinuierlichem, stufenförmigem n-Propanol-Gradienten durchgeführt wird.
14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekenn- ος ° zeichnet, dass folgender n-Propanol-Gradient (V/V) eingehalten wird: 10 Minuten 0%, 40 Minuten 30% und 40 Minuten 32%, wobei das Interferon zwischen der 80. und 90. Minute eluiert wird. 3Π
15. Pharmazeutische Präparate auf der Basis eines homogenen Human-Fibroblasten-Interferons.
16. Die Verwendung von homogenem Human-Fibroblasten-Interferon zur Behandlung viraler und neoplastischer Er-krankungen. * * *
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