DE3782276T2

DE3782276T2 - Interleukin-2 induziertes antineoplastisches peptid.

Info

Publication number: DE3782276T2
Application number: DE8787304883T
Authority: DE
Inventors: Ingegerd Hellstrom; Karl Eric Hellstrom; Daniel R Twardzik
Original assignee: Oncogen LP
Current assignee: Oncogen LP
Priority date: 1986-06-04
Filing date: 1987-06-03
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2007-06-04
Also published as: IL82734A; AU612575B2; JPS6322100A; DE3782276D1; IL82734A0; EP0248642A3; AU7378087A; EP0248642B1; CA1320906C; ATE81591T1; EP0248642A2; ES2052562T3; GR3006212T3

Description

Obwohl das Immunsystem anscheinend in seinem Programm anzugreifender und zu zerstörender fremder Zellen auch neoplastische Zellen enthält, ist die steigende Häufigkeit maligner Erkrankungen, die einen Eingriff von außen notwendig machen, ein Zeichen für die Grenzen des natürlichen Schutzes. Obwohl die Chemotherapie gezeigt hat, daß sie das Leben vieler Tumorpatienten verlängern und in vielen Fällen Heilung herbeiführen kann, umfaßt jedoch die Chemotherapie allein oder in Verbindung mit Bestrahlung heroische Maßnahmen. Die Arzneimittel und die Bestrahlung haben häufig starke Nebenwirkungen, die eine Suppression des Immunsystems verursachen, sowie eine Anfälligkeit gegenüber opportunistischen Infektionen, Haarausfall, Müdigkeit und eine beträchtlich verminderte Funktionsfähigkeit.
Es wurde kürzlich gezeigt, daß Tumor-Nekrose-Faktor- Cachexin spezifische antineoplastische Wirksamkeit aufweist. Auch von anderen natürlich vorkommenden in Säugetier-Wirten erzeugten Verbindungen wurde gefunden, daß sie neoplastische Zellen im Vergleich zu normalen Zellen vorzugsweise hemmen. Es wurde nicht aufgeklärt, wie der Körper diese Verbindungen verwendet, um Neoplasien unter Kontrolle zu halten. Wahrscheinlich ist mehr als eine Verbindung beteiligt.
Es ist bekannt, daß Natural Killer Zellen zur Tötung von Tumorzellen wirksam sind. Der spezielle Mechanismus, über den diese Zellen das Wachstum und die Vermehrung von Tumorzellen regulieren, ist unbekannt. Es würde sehr interessant sein zu begreifen, wie Natural Killer Zellen ihre zytotoxische Wirksamkeit ausüben und ob einzelne Verbindungen isoliert werden können, die in Verbindung mit dem natürlichen Immunsystem zur Verstärkung des natürlichen Schutzes zur Vernichtung von neoplastischen Zellen eingesetzt werden können.
Hinweise darauf, daß Lymphozyten mit krebshemmender Wirksamkeit in vitro auch in vivo eine derartige Wirksamkeit aufweisen und Tumorregression herbeiführen können, wurden von Hellstrom et al., Proc. 8th Canadian Cancer Conf. (1969) 425- 442 berichtet. Rosenberg und Mitarbeiter im National Cancer Institute fanden, daß IL-2 stimulierte Lymphozyten (LAK-Zellen) das Wachstum von Tumorzellen hemmen können. Siehe zum Beispiel Rosenberg et al., New England J.Med. (1985) 313:1485-1492; Rosenberg, J.Natl.Cancer Inst. (1985) 75:595-603; Rayner et al., J.Natl.Cancer Inst. (1985) 75:67-75; Lafreniere und Rosenberg, Cancer Res. (1985) 3735-3741; Ettinghausen et al., J. Immunol. (1985) 135:3623-3635; und Shu und Rosenberg, J. Immunol. (1985) 135:2895-2903.
Ein säurestabiles Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von etwa 15 bis 22 Kilodalton (kD) wird aus Interleukin-2-aktivierten T-Lymphozyten gewonnen. Das Polypeptid kann mit Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von saurem wässrigem Acetonitril als Eluiermittel gereinigt werden. Es zeigt sich, daß das Polypeptid eine bevorzugte Hemmwirkung auf neoplastische Zellen aufweist.
Es werden neuartige säurestabile Polypeptide angegeben, die aus Interleukin-2-aktivierten T-Lymphozyten isoliert werden können. Die neuartigen Polypeptide haben ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 15 bis 22 kD, bestimmt mittels TSM250 HPLC größentrennender Chromatographie unter Bedingungen, die einer Aggregation entgegenwirken, d. h. 40% Acetonitril und niedriger pH-Wert, 0,05% Trifluoressigsäure. Die neuartigen Polypeptide werden von einer Umkehrphasen-HPLC C&sub1;&sub8;u-Bondapak- Säule mit 42-43% (unkorrigiert) Acetonitril in 0,05% wässriger Trifluoressigsäure, pH 1,9 eluiert.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen finden sich in T-Zellen verschiedener Säugetiergattungen, einschließlich Maus, Primaten, Mensch, Rind, Ratte oder Kaninchen.
Erythrozytenfreie Lymphozyten aus peripherem Blut können in einem geeigneten Medium mit IL-2 kombiniert werden, wobei im allgemeinen etwa 1-5·10&supmin;³ Einheiten IL-2 pro Zelle eingesetzt werden bei einer zellulären Konzentration von etwa 10&sup5;-10&sup8; Zellen pro ml. Das die T-Zellen und das IL-2 enthaltende Nährmedium kann sodann bei mäßigen Temperaturen von etwa 20 bis 38ºC in Luft mit einer erhöhten Kohlendioxidkonzentration von etwa 5% Kohlendioxid längere Zeit inkubiert werden, üblicherwiese nicht länger als fünf Tage, üblicherweise 3 Tage.
Nichthaftende Zellen können aus der Zellsuspension durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Die Zellen sind hauptsächlich T-Zellen und zeigen eine dunkle körnige Färbung, während nicht mit Interleukin vorbehandelte Kulturen diese Färbung nicht aufweisen.
Quelle der Lymphozyten kann jede Quelle für Lymphozyten aus peripherem Blut sein, wie etwa Milz oder Lymphknoten. Die spezielle Quelle ist nicht von entscheidender Bedeutung, Splenozyten können gut verwendet werden.
Die zellulären Peptide können aus den mit IL-2 behandelten T-Lymphozyten (LAK, Lymphozyten-aktivierte Killerzellen) unter Verwendung von saurer Äthanolextraktion solubilisiert werden. (Roberts et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1980) 77:3-93). Nach der Extraktion und dem Zentrifugieren können die überstehenden Flüssigkeiten vereinigt werden und die Lösung bis zu einem pH- Wert im Bereich 5 bis 5,5 teilweise neutralisiert und der Ammoniumacetat-Puffer zugesetzt werden, wodurch sich ein Niederschlag bildet, der entfernt wird. Die überstehende Flüssigkeit wird hierauf mit kaltem wasserfreiem Äther und kaltem Äthanol bei niedriger Temperatur (etwa -20ºC) vereinigt und der entstehende Niederschlag abgetrennt.
Eine weitere Reinigung kann durch Verwendung von Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie erreicht werden (Marquardt und Todaro, J.Biol.Chem. (1982) 257:5220). Zur Gradienten-Eluierung kann wässriges saures Acetonitril verwendet werden und die eluierten Peptide können durch Isolierung der einzelnen Fraktionen verfolgt werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide, Fragmente davon, die physiologische Wirksamkeit aufweisen, und Analoge, die sich in der Aminosäurezahl um weniger als 5%, üblicherweise um weniger als 2% und vorzugsweise um weniger als 1% unterscheiden und ihre physiologische Wirksamkeit beibehalten, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Fragment haben zumindest immunologische Wirksamkeit, da sie mit dem natürlich vorkommenden Peptid kreuzreaktiv sind. Die Fragmente betragen üblicherweise mindestens 8 Aminosäuren, im speziellen üblicherweise mindestens 12 Aminosäuren und möglicherweise 30 Aminosäuren oder mehr. Analoge können konservative oder nicht konservative Substitutionen, Deletionen, Insertionen aufweisen oder können mit einer großen Zahl verschiedener Peptide oder Proteine konjugiert sein. Unter konservativer Substitution ist zu verstehen der Ersatz einer Aminosäure durch eine andere, wobei die sterischen und polaren Verhältnisse nicht wesentlich verändert wurden. Beispiele für konservative Substitutionen sind G,A; V,I,L; S,T; D,E; N,Q; K,L; und F,W,Y. Nicht konservative Substitutionen betragen üblicherweise weniger als 2%, im speziellen üblicherweise weniger als 1% und können auf 1 bis 5 Aminosäuren beschränkt sein.
Die erfindungsgemäßen Peptide können mit einer großen Zahl verschiedener Proteine verbunden sein, die als Immunogene dienen können, um die Produktion von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen die erfindungsgemäßen Proteine zu ermöglichen. Die immunogenen Proteine sind im allgemeinen von einer anderen Gattung als die erfindungsgemäßen Peptide (heterolog) und größer als etwa 30 kD. Beispiele für immunogene Proteine umfassen Rinder-Serumalbumin, Hämocyanin von Fissurella (Keyhole Limpet), β-Globulin und Sojatrypsin-Inhibitor. Verfahren zur Konjugation zweier Peptide, bei denen bifunktionelle Verbindungen wie Glutaraldehyd, Maleindibenzoesäure, Methyldithioessigsäure verwendet werden können, sind wohlbekannt. Die Verfahren zur Immunisierung eines Wirbeltier-Wirts zur Produktion von spezifischen Antikörpern sind wohlbekannt und brauchen hier nicht behandelt zu werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch auf andere Weise als durch Lymphokin-Aktivierung von Killerzellen hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide können gemäß konventionellen Verfahren synthetisiert werden, wobei es eine große Zahl verschiedener Syntheseverfahren und Vorrichtungen gibt.
Andererseits können die erfindungsgemäßen Peptide hergestellt werden, indem ein Gen, das ein Fragment oder das gesamte natürlich vorkommende Peptid exprimiert, in einen Wirt eingeschleust wird, wo das Gen unter der regulativen Kontrolle transkriptioneller Start- und Endbereiche liegt, die im Wirt funktionell sind. Es werden eine große Zahl verschiedener Wirte verwendet, unter anderem Bakterien wie E.coli, B.subtilis, Hefe, Fadenpilze oder andere einzellige Mikroorganismen, Säugetierzellen wie Mäusezellen, Affenzellen oder menschliche Zellen. In der Literatur wurden verschiedene Expressionskonstrukte beschrieben, die auf Gene, die die erfindungsgemäßen Peptide exprimieren, vorteilhaft angewendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in vitro und als Arzneimittel in vivo angewendet werden, die erfindungsgemäßen Verbindungen können verwendet werden zur Hemmung der Vermehrung von Tumorzellen in Zellgemischen. Somit können die erfindungsgemäßen Verbindungen in Kulturen verwendet werden, bei denen eine Mischung normaler und neoplastischer Zellen von den neoplastischen Zellen befreit werden soll. Beispielsweise Situationen umfassen unter anderem die Entfernung von Knochenmark von einem Säugetier-Wirt zur Entfernung neoplastischer Zellen und Rückführung des Knochenmarks in den Wirt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können verwendet werden zur Verminderung der Wachstumsgeschwindigkeit von Tumoren in vitro.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in vivo allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen verwendet werden um die Vermehrung neoplastischer Zellen zu hemmen, indem die erfindungsgemäßen Verbindungen in die Blutbahn, subkutan, intraläsional, intraperitoneal oder intramuskulär injiziert werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in diagnostischen Prüfungen eingesetzt werden, die in kommpetitiven Assays zur Erkennung der natürlich vorkommenden Verbindung in physiologischen Flüssigkeiten oder Zellen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch verwendet werden zur Titerbestimmung von Rezeptoren auf die erfindungsgemäßen Verbindungen, um die Wahrscheinlichkeit eines Ansprechens auf die erfindungsgemäßen Verbindungen zu ermitteln.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in üblicher Weise zum Bestandteil einer Rezeptur gemacht werden, in physiologisch brauchbaren Flüssigkeiten wie destilliertes Wasser, Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung, je nach der Verwendung der natürlich vorkommenden Verbindung oder Analogen oder Fragmenten davon.
Die natürlich vorkommende Verbindung kann in einer Reinheit von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, im speziellen mindestens 30% und wünschenswerterweise 90% oder höher erhalten werden. Die Verbindung kann erhalten werden frei von Zellbestandteilen wie Bruchstücken, Membranen, Organellen, anderen zellulären Proteinen, und ähnlichem. Es können Zusammensetzungen erhalten werden mit Aktivitäten wie im experimentellen Teil beschrieben von mindestens etwa 100-200 mg, vorzugsweise mindestens etwa der Hälfte der maximalen Hemmung von 5·10&sup4; Tumorzellen je 10 mg Polypeptid pro ml.
Das Antineoplastin mit mindestens 90% Reinheit und einer minimalen Aktivität gegen selektierte Tumorzellen von Lungen-, Kolon- oder Brustkrebs kann das Wachstum von 50% der Zellen bei 10-100 ng pro Milliliter hemmen, wie im Wachstums-Hemmtest bestimmt.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung.

Experimenteller Teil

Material und Methoden

Herstellung von Lymphokin-aktivierten Killerzellen (LAK)

Weiblichen G57BL Mäusen wurde aseptisch die Milz entfernt und diese mit einem "loose dounce" mazeriert. Die mazerierte Milz wurde sodann durch ein 100 mesh Myrtex Sieb getrieben und 5 min bei 1500 UpM zentrifugiert. Die roten Blutkörperchen wurden durch Resuspendierung in Tris-gepufferter Ammoniumchloridlösung lysiert. (90 ml 0,16 m NH&sub4;Cl gemischt mit 10 ml 09,17 m Tris- HCl pH 7,65; mit verdünnter HCl auf pH 7,2 eingestellt). Die Zellen wurden zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in dieser Lösung belassen und hierauf die entsprechenden Zellen durch Zentrifugieren in einer Lösung von fötalem Kälberserum isoliert. Die Zubereitung wurde dreimal mit 50 ml Hankßs Balanced Salt Solution gewaschen. Etwa 5·10&sup7; Zellen wurden sodann in einen 75 ml Gewebskulturkolben verbracht, der enthielt 17 500 Einheiten rekombinantes IL-2 (Cetus Corp.)
- RPMI 1640
- 10% fötales Kälberserum
- 0,03% Glutamin
- Streptomycin (100 ug/ml)
- Penicillin (100 Einheiten/ml)
- 0,1 mMol nicht essentielle Aminosäuren
- 1 pMol Natriumpyruvat
- 5·10&supmin;&sup5; m 2-Mercaptoäthanol
- Gentamycin (5 ug/ml)
- Fungizon (0,5 ug/ml)
und die Zellen wurden drei Tage lang bei 37ºC in einer 5% co&sub2; Atmosphäre inkubiert. Die Kolben wurden hierauf geschüttelt und die Zellsuspension (nichthaftende Zellen) wurde 10 min bei Raumtemperatur bei 1500 UpM zentrifugiert. Die erhaltene Zubereitung enthielt hauptsächlich T-Zellen, wie durch Expression des Theta-Antigens gezeigt. Die Zellen nahmen eine dunkle körnige Farbe an im Vergleich zu identischen Kontrollzellen, die nicht mit IL-2 behandelt worden waren, und dienten als Quelle für das Antineoplastin. E=Extraktionsverfahren
Unter Verwendung eines sauren Äthanol-Extraktionsverfahrens (Roberts et al., siehe oben) wurden Peptide aus LAK- Zellen solubilisiert. Die Zellen wurden in einer Lösung (4 ml/g: 4ºC) homogenisiert, die 375 ml 95%iges (v/v) Äthanol und 7,5 ml konzentrierte HCl mit 33 mg Phenylmethylsulfonylfluorid und 56 Trypsin-Hemmeinheiten Aprotinin aus Rinderlunge als Proteasehemmer enthielt. Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf 6 ml/g gebracht und durch sanftes Rühren mit einem Magnetrührer bei 4º über Nacht extrahiert und danach zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden vereinigt und mit konz. Ammoniumhydroxid auf pH 5,2 eingestellt. Der Lösung wurde 1 ml 2 m Ammoniumacetatpuffer, pH 5,2, je 100 ml Extrakt zugefügt. Es bildete sich ein Niederschlag, der durch Zentrifugieren abgetrennt wurde und die überstehende Flüssigkeit wurde mit 4 Volumsteilen kaltem wasserfreiem Äther und 2 Volumsteilen kaltem Äthanol (-20ºC) gemischt und 24 hrs stehen gelassen. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und bis zur Trockene lyophilisiert.

Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie

Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie wurde wie früher beschrieben (Marquardt und Torado, siehe oben) durchgeführt. Die Trennungen wurden erreicht unter Verwendung einer u- Bondapak C&sub1;&sub8;-Säule (10 mm Teilchengröße, 0,39 x 30 cm, Water® Associates, Milford, CT). Die mobile Phase war 0,05%ige wässrige Trifluoressigsäure und der Modifikator für die mobile Phase war Acetonitril, das 0,045% Trifluoressigsäure enthielt. Der Gradient betrug 0 bis 60% Acetonitril nach 2 hrs bei einer Laufgeschwindigkeit von 1,5 ml/min. Für die bei 42-43% Acetonitril aus einer C&sub1;&sub8;u-Bondapak-Säule eluierten Peptide wurde das Molekulargewicht unter Verwendung von zwei TSK250 Säulen (Biorad®) in Tandemanordnung, geeicht mit bekannten Polypeptidstandards, bestimmt.
Das Produkt besitzt ein scheinbares Molekulargewicht von 15 bis 22 kD bei Bestimmung mit TSK250 HPLC größentrennender Chromatographie (45% Acetonitril, 0,05% Trifluoressigsäure). Das Produkt wurde aus einer C&sub1;&sub8;u-Bondapak-Säule bei 42-43% (unkorrigierter Wert) Acetonitril in 0,05% wässriger Trifluoressigsäure, pH 1,9, eluiert. Es zeigte sich, daß das Produkt säurestabil war, da nach einer Behandlung bei niedrigem pH nur ein minimaler Aktivitätsverlust auftrat. Die Wirksamkeit des Antineoplastins als zytostatisches Mittel gegen Tumore wurde wie folgt bestimmt:
Wachstums-Hemmtest. Der Tumorwachstums-Hemmtest war eine Modifikation des früher beschriebenen Tests (Iwata et al., Cancer Research (1985) 45,:2689-2694). Tumorzellen wurden auf Gewebskulturplatten mit% Vertiefungen (Nunc®167008) in 50 ul vollständigem Medium bei einer Dichte von 1·10J4 Zellen/Vertiefung als Subkultur übertragen. Aliquote Teile der Säulenfraktionen, die auf Wirksamkeit geprüft werden sollten, wurden in sterile 12·75 mm Röhrchen (Falcon®2058), die 50 H¹ einer 1 mg/ml Lösung von Rinderserumalbumin (Sigma®A-6003) in 1 m Essigsäure enthielten, übergeführt und lyophilisiert. Unmittelbar vor dem Test wurde die lyophilisierte Probe in 200 ul vollständigem Medium resuspendiert und in Dreifachbestimmung geprüft, indem 50 ul der resuspendierten Probe in jede Vertiefung eingebracht wurden. Die Zellen wurden 72 hrs lang bei 37ºC in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% CO&sub2; - 95% Luft inkubiert und hierauf 24 hrs mit 100 H¹ voll ständigem Medium, das (I dUdr (1 Ci/ml) (Amersham M IM.355V) enthielt, inkubiert. Die Einschichtkulturen wurden einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, 10 min in Methanol fixiert und 30 min lang an der Luft getrocknet. Das von den Zellen aufgenommene [¹²&sup5;I] dUdr wurde in 200 ul 1 m NaOH solubilisiert und 1 hr bei 65ºC inkubiert. Die Proben wurden mit Titertec® Stopfen absorbiert und die Stopfen gezählt. Tabelle 1 Zielspezifität von IL-2 induziertem Antineoplastin Ziel ¹²&sup5;I-Deoxyuridin (cpm) aufgenommen je Vertiefung Kontrolle IL-2 induziert Prozent Hemmung Menschliches Adenokarzinom (A549) Menschliches Melanom (A375) Menschliches Melanom (A2058) Menschlicher glatter Muskel Fibroblast aus menschlicher Vorhaut
Die Werte sind Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen; das IL-2 induzierte Antineoplastin wurde durch HPLC teilweise gereinigt und stellt eine Menge von etwa 100 ng Protein pro Milliliter Kultur dar. Die Zelldichte betrug 1·10&sup4; Zellen je Test. Das IL-2 induzierte Antineoplastin wurde am Tag 1 zugesetzt; die Vertiefungen wurden am Tag 4 mit radioaktivem Tracer gepulst und die Menge an aufgenommenem ¹²&sup5;I-Deoxyuridin wurde wie früher beschrieben bestimmt (Iwata, siehe oben).
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß durch Induktion von T- Lymphozyten, insbesondere Natural Killer Zellen, unter Verwendung eines Lymphokins wie IL-2 ein neuartiges natürliches Produkt erhalten werden kann. Das erhaltene Produkt zeigte zytostatische Wirksamkeit, die spezifisch gegen neoplastische Zellen gerichtet ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können somit zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, die als Diagnostikum auf die Anwesenheit der erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, was ein Hinweis sein kann auf die Anwesenheit neoplastischer Zellen in einem Wirt, die Aktivität des Immunsystems, insbesondere der T-Zellen oder im speziellen der Natural Killer Zellen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können sowohl allein als auch in Kombination mit anderen neoplastische Zellen hemmenden Mitteln zur Verminderung der Proliferation neoplastischer Zellen in vitro und in vivo eingesetzt werden.

Claims

1. Zusammensetzung enthaltend Antineoplastin von mindestens 10% Reinheit, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Lymphokin-Aktivierung von T-Zellen induziert werden kann, mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 15 bis 22 kD, bestimmt mittels größentrennender Chromatographie unter Bedingungen, die einer Aggregation entgegenwirken und mit Elution aus einer C&sub1;&sub8;u-Bondapak-Säule mit 42-43% Acetonitril und 0,05% wässriger Trifluoroessigsäure bei pH 1,9; oder biologisch wirksame Fragmente davon.

2. Antineoplastin von mindestens 10% Reinheit, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Lymphokin-Aktivierung von T-Zellen induziert werden kann, mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 15 bis 22 kD, bestimmt mittels größentrennender Chromatographie unter Bedingungen, die einer Aggregation entgegenwirken und mit Elution aus einer C&sub1;&sub8;u-Bondapak-Säule mit 42-43% Acetonitril und 0,05% wässriger Trifluoroessigsäure bei pH 1,9; oder biologisch wirksame Fragmente davon.

3. Antineoplastin von mindestens 90% Reinheit und einer minimalen Aktivität auf ausgewählte Tumorzellen von Lungen-, Kolon- oder Brustkrebs, welches das Wachstum von 50% der Zellen bei 10-100 ng pro Milliliter, bestimmt mittels Wachstums-Hemmtest, hemmen kann.

4. Verfahren zur Hemmung der Proliferation neoplastischer Zellen in vitro, umfassend den Kontakt dieser Zellen mit einer das Wachstum hemmenden Menge einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Rezeptur zur Hemmung der Proliferation neoplastischer Zellen, enthaltend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einer das Wachstum neoplastischer Zellen hemmenden Menge in einer physiologisch verwendbaren Trägersubstanz.

6. Antikörper, spezifisch auf eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der gegen ein Immunogen hergestellt wurde, welches die Zusammensetzung gebunden an ein immunogenes Protein enthält.

7. Immunogen, enthaltend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, kovalent gebunden an ein heterologes Protein von mindestens 30 kD.

8. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend:

Züchten von T-Zellen in einem Nährmedium, das eine wachstumsfördernde Menge an Lymphokin enthält, über einen Zeitraum, der zur Proliferation der T-Zellen ausreicht;

Ernten des T-Zellen;

Lysieren der Zellen; und

Trennen der Zusammensetzung von anderen zellulären Bestandteilen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die T-Zellen Natural- Killer-Zellen sind und das Lymphokin IL-2 ist.

10. Säurestabiles Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 15 bis 22 kD, bestimmt mittels größentrennender Chromatographie unter Bedingungen, die einer Aggregation entgegenwirken und mit Elution aus einer C&sub1;&sub8;u- Bondapak-Säule mit 42-43% Acetonitril und 0,05% wässriger Trifluoroessigsäure bei pH 1,9; und isolierbar aus Lymphokinaktivierten, z. B. Interleukin-2-aktivierten, T-Lymphozyten; oder biologisch wirksame Fragmente davon.

11. Verfahren zur Herstellung einer pharmzeutischen Zubereitung umfassend das Mischen einer Zusammensetzung enthaltend Antineoplastin von mindestens 10% Reinheit dadurch gekennzeichnet, daß es durch Lymphokin-Aktivierung von T-Zellen induziert werden kann, mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 15 bis 22 kD, bestimmt mittels größentrennender Chromatographie unter Bedingungen, die einer Aggregation entgegenwirken und mit Elution aus einer C&sub1;&sub8;u-Bondapak-Säule mit 42-43% Acetonitril und 0,05% wässriger Trifluoroessigsäure bei pH 1,9; oder biologisch wirksame Fragmente davon mit einer physiologisch verwendbaren Trägersubstanz.

12. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers spezifisch auf eine Zusammensetzung enthaltend Antineoplastin von mindestens 10% Reinheit, das durch Lymphokin-Aktivierung von T- Zellen induziert werden kann, mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 15 bis 22 kD, bestimmt mittels größentrennender Chromatographie unter Bedingungen, die einer Aggregation entgegenwirken und mit Elution aus einer C&sub1;&sub8;u-Bondapak- Säule mit 42-43% Acetonitril und 0,05% wässriger Trifluoroessigsäure bei pH 1,9; oder biologisch wirksame Fragmente davon, wobei das Verfahren darin besteht, daß ein Antikörper gegen ein Immunogen hergestellt wird, das die Zusammensetzung an ein immunogenes Protein gebunden enthält.

13. Verfahren zur Herstellung eines Immunogens enthaltend eine Zusammensetzung enthaltend Antineoplastin von mindestens 10% Reinheit, das durch Lymphokin-Aktivierung von T-Zellen induziert werden kann, mit einem scheinbaren Molekulargewicht im Bereich von 15 bis 22 kD, bestimmt mittels größentrennender Chromatographie unter Bedingungen, die einer Aggregation entgegenwirken und mit Elution aus einer C&sub1;&sub8;u-Bondapak-Säule mit 42-43% Acetonitril und 0,05% wässriger Trifluoroessigsäure bei pH 1,9; oder biologisch wirksame Fragmente davon, wobei das Verfahren darin besteht, daß die Zusammensetzung an ein heterologes Protein von mindestens 30 kD gebunden wird.