HU204558B - Process for producing acyl-amino-acid-racemase and l- or d- amino-acids - Google Patents
Process for producing acyl-amino-acid-racemase and l- or d- amino-acids Download PDFInfo
- Publication number
- HU204558B HU204558B HU884415A HU441588A HU204558B HU 204558 B HU204558 B HU 204558B HU 884415 A HU884415 A HU 884415A HU 441588 A HU441588 A HU 441588A HU 204558 B HU204558 B HU 204558B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- amino acid
- acyl
- streptomyces
- ifo
- enzyme
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Adornments (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A leírás terjedelme: 20 oldal (ezen belül 5 lap ábra)
HU 204558 Β
A találmány az új acil-aminosav-racemáz-enzimmel, ennek előállításával és alkalmazásával foglalkozik;
Az a reakció, amellyel optikailag aktív N-acil-aamino-karbonsavakat (ezeket ezután N“-aciI-aminosavaknak nevezzük) racemizálnak optikailag inaktív DLN-acií-aminosavakká, fontos reakció, amelyet optikailag aktív aminosavak előállítására alkalmaznak.
A DL-N“-acil-aminosavak ismert előállítási eljárásai optikailag aktív Na-acil-aminosavak racemizálására korlátozódnak fizikai vagy kémiai módszerekkel, erőteljes körülmények között; így pl. a kiindulási anyagot az ekvivalensnél kisebb mennyiségű ecetsavanhidriddel együtt ecetsavval melegítik [Biochem. Z. 203,280 (1929)3; a kiindulási anyagot nagy mennyiségű ecetsavanhidriddel együtt szobahőmérsékleten kezelik [J. Am. Chem. Soc. 54,1630, (1932)]; a kiindulási anyagot pl. foszforsav-íriészterrel vagy kis szénatomszámú zsírsavval egy oldószerben melegítik (18 402/1976 számú vizsgált, publikált japán szabadalmi bejelentés); az optikailag aktív N“-acil-aminosavat közvetlenül mintegy 160 °C hőmérsékletre melegítik nitrogéngázáramban (126 058/1986 számú nem vizsgált, publikált japán szabadalmi bejelentés); a kiindulási anyagot katalitikus mennyiségű dehidrálószerrel együtt 130 °C hőmérséklet fölé melegítik aromás szénhidrogén jelenlétében (165 354/86 számú nem vizsgált, publikált japán szabadalmi bejelentés).
A D-N°-acil-aminosav racemizálását amino-acilázzal kombinálva alkalmazzák, hogy optikailag aktív L-aaminosavakat kapjanak. így amino-aciláz katalitikus tevékenysége segítségével az olcsó DL-Na-acű-aminosav kiindulási anyag átalakul L-a-aminosawá és D-Na-acilaminosawá, amelyek fizikai tulajdonságaik különbözősége alapján szétválaszthatók és egyenként izolálhatők. Ezután a fizikai vagy kémiai racemizálő módszerek bár- I melyike alkalmazható, hogy a D-N“-acil-aminosav átalakuljon a DL-N°-acil-aminosav kiindulási anyaggá, amely újból kezelhető amino-acilázzal. Ezt az eljárást ismételve a DL-Nc-acil-aminosavat teljes egészében át lehet alakítani az optikailag aktív L-a-aminosavvá. Ennek a mód- 1 szemek azonban vagy egy nagy hátránya. Az L-a-aminosavat és N-acil-aminosavat az amino-acilázzal végzettreakció után el kell választani egymástól. A D-Na-acil-aminosavhoz vezető racemizálási eljárást szintén erőteljes kémiai vagy fizikai körülmények közt kell végezni szí- 4 lárd fonnában végzett izolálás után.
Ha ezt a racemizálást D-Nc-acil-aminosavra nézve szelektíven érhetnénk el egy optikailag aktív aminosav jelenlétében olyan körülmények között, hogy az amino-aciláz ne inaktiválódjék (közel semleges vizes ol- 5 dat, szobahőmérsékleten, normál nyomáson), az ilyen szelektív racemizálás az amino-acilázzal együtt 100%os átalakítást tenne lehetővé a DL-Ntt-acil-aminosavból kiindulva egy lépésben a kívánt L-a-aminosav-termék előállítására nézve mindenféle szeparálás! lépés nélkül. 5 Mellőzhetők lennének az elkülönítési és racemizálő eljárások, amelyek feltétlenül szükségesek a technika eddigi állása szerint, és a hatékonyság nagymértékben növekedne az optikailag aktív aminosavakhoz vezető előállítási eljárásokban. 61
Szelektív racemizálást azonban semmiféle körülmények közt nem lehet elérni a technika állása szerinti körülmények között. Elérésének egyik módja az, hogy olyan enzimet vagy racemizálő szert találjuk, amely 5 olyan szelektivitással bír, hogy az optikailag aktív N“acil-aminosavat racemizálja, de nem hat a megfelelő optikailag aktív α-aminosavra. Eddig azonban nem ismertek fel olyan enzimet vagy racemizálószert, amely ilyen katalitikus tevékenységet mutatna. Jól ismert, hogy vannak olyan enzimek, amelyek nem hatnak az N“-acil-aminosavra, de hatnak az optikailag aktív aaminosavra, hogy racemizálják azt; ezek azok, amelyeket aminosav-racemázoknak neveznek [pl. Biochem. Biophys. Rés. Comm. 35, 363 (1969)]. Nyilvánvaló 5 azonban, hogy ezek az aminosav-racemázok nem használhatók erre a célra.
Vizsgálataink során azt találtuk, hogy van olyan természetben előforduló enzim, amely nem hat az optikailag aktív aminosavakra, de hat optikailag aktív Na0 acil-aminosavakra, ezeket a megfelelő enantiomorfokká alakítja; ezt az enzimet acil- aminosav-racemáznak nevezzük. Kidolgoztunk tehát egy eljárást optikailag aktív α-aminosavak előállítására DL- Na-acil-aminosavakból acil-aminosav-racemáz segítségével.
A találmány tárgya eljárás acil-aminosav-racemázenzim előállítására, amelyre jellemző, hogy
- (I) általános képletű D-N-acil-a-aminokarbonsavakat - ahol X jelentése acilcsoport, amely valamely adott esetben helyettesített karbonsavból származik,
R jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú 1-6 szénatomos alkilcsoport, hidroxil-, 1-3 szénatomos alkil-tio-, tiol-, fenil-, hidroxi-fenil-, indolilcsoporttal helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport, amino-, karboxil-, guanidinil- vagy imidazolilcsoporttal ) helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoport, és * aszimmetriás szénatomot jelöl - a megfelelő, (I) általános képletű L-N-acil-a-aminokarbonsavakká ahol X, R és * jelentése a fenti - alakít,
- (!) általános képletű L-N-acil-a-aminokarbonsava1 kát - ahol X, R és * jelentése a fenti - a megfelelő, (I) általános képletű D-N-acil-a-aminokarbonsavakká - ahol X, R és * jelentése a fenti - alakít,
- a D-a-aminosavak L-a-aminosavakká alakítása nélkül és
- az L-a-aminosavak D-a-aminosavakká alakítása nélkül.
A találmány értelmében egy, az említett enzimet termelni képes mikroorganizmust tenyésztünk valamely tenyésztő tápközegben az említett enzim felhalmozódásáig, majd az enzimet a tenyészléből kívánt esetben kinyerjük. A találmány tárgya továbbá eljárás optikailag aktív D- vagy L-aminosavak előállítására, amely abból áll, hogy DL-Na-acil-aminosavat acilaminosav-racemázzal érintkeztetünk D- vagy L-anűno-aciláz jelenlétében.
A fenti Na-acil-aminosavnál és α-aminosavnál az α-aminosav lehet természetes típusú vagy nem természetes típusú. Nem számít ezzel kapcsolatban az sem, hogy az α-aminosav semleges, bázisos vagy savas jellegű-e.
HU 204558 Β így pl. a fenti N°-acil-aminosavat az (I) általános képlet szemlélteti, ahol X jelentése acilcsoport, amely valamely adott esetben helyettesített karbonsavból származik, R jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú 1-6 szénatomos alkilcsoport, hidroxil-, 1-3 szénatomos alkil-tio-, tiol-, fenil-, hidroxi-fenil-, indolilcsoporttal helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport, amino-, karboxil-, guanidinil- vagy imidazolilcsoporttal helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoport, és * aszimmetriás szénatomot jelöl.
Az X acilcsoport az N“-acil-aminosavnál lehet karbonsav eredetű acilcsoport, pl. alkanoil-, benzoil- vagy aril-alkanoil-csoport. Ezek az acilcsoportok rendelkezhetnek legalább egy szubsztituenssel (pl. halogénatom, 1-3 szénatomos alkil-, 1-3 szénatomos alkoxi- vagy nitrocsoport). Az alkanoilcsoportra példák lehetnek az 1-3 szénatomos alkanoilcsoportok, pl. formil-, acetil-, propionil- és klór-acetil-csoport. A benzoilcsoportra példák lehetnek a benzoil- és p-klór-benzoil-csoport. Az aril-alkanoil-csoportra példák lehetnek a fenil-(l—3 szénatomos alkanoil)-csoportok, pl. a fenil-acetil- és fenil-propionil-csoport.
Az (I) képletnél az R lehet 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely lehet egyenes szénláncú vagy elágazó szénláncú, 1-3 szénatomos alkilcsoport, amely hidroxi-, 1-3 szénatomos alkil-tio-, merkapto-, fenil-, hidroxi-fenilvagy indolilcsoporttal van szubsztituálva, vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport, amely amino-, karboxil-, guanidilvagy imidazolilcsoporttal van szubsztituálva.
Acil-aminosav-racemáz-termelű mikroorganizmusokat pl, azzal az eljárással lehet találni, amelyet a későbbiekben ismertetünk. A természetes forrásokból izolált mikroorganizmusokat vagy a törzsgyűjteményekből rendelkezésre álló mikroorganizmusokat standard módszerrel tenyésztjük (olyan anyagot adunk a tápközeghez, ha szükséges, amely indukálja az említett enzimet, vagy amely elősegíti az említett enzim termelését, pl. az említett enzimszubsztrátumot vagy ennek fémsóját adjuk a tápközeghez); az egyes így kapott tenyészetekből a sejteket kinyerjük; a sejteket, miután pufferrel stb. mostuk, ha szükséges, foszfátpuffer-oldatban (pH 7) szuszpendáljuk, ahol a foszfátpuffer megfelelő mennyiségű N-acetil-D-metionint és magnézium-szulfátot is tartalmaz; és a szuszpenziót 30 °C hőmérsékleten egy éjszakán át rázatjuk. Miután a sejteket eltávolítottuk ebből a reakcióközegből, adott mennyiségű L-amino-acilázt, és ha szükséges, kobaltkloridot adunk a felülúszóhoz, és a reakciót 37 °C hőmérsékleten több órán át végezzük, amely után a reakciókeveréket vékonyréteg-kromatográfiás (TLC) elemzésnek vetjük alá (n-butanol:ecetsav:víz=3:l:l). Azt a reakcióközeget, amely ninhidrinreakcióval metioninfoltot mutat, kiválasztjuk, ezután ezt a metionin mennyiségére vizsgáljuk meg ninhidrinreakcióval és/vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával. A metionin-pozitív reakcióközegekhez D-aminosavoxidáz-oldatot adunk, és reagáltatjuk 30 °C hőmérsékleten 20 órán át, hogy elbontsuk a D-metionint; ezután minden egyes reakciókeverékhez ismét alkalmazzuk a ninhidrinreakciót, a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát és/vagy a biológiai mérésben Pediococcus acidilacti ATCC 8042-t alkalmazva [I Bioi. Chem. 777,533 (1949)], hogy meghatározzuk a maradék metionint, vagyis az L-metionint a reakciókeverékben. Azok a törzsek, amelyek L-metionint juttatnak a reakcióközegbe, képesek L-metionint termelni N-acetil-Dmetioninból; ezeknek a törzseknek tehát acil-aminosav-racemázt és/vagy aminosav-racemázt kell termelniük.
Az L-metionin-pozitív törzseket azután ismét tenyésztjük a fenti körülmények között és sejtszuszpenziót készítünk. Az egyes szuszpenziókhoz N-acetil-Dmetionin helyett L-metionint adunk, és a reakciót ugyanúgy folytatjuk, mint fentebb. A sejtek eltávolítása után a reakciókeveréket megvizsgáljuk D-metionin mennyiségére kolorimetriás módszerrel, D-aminosavoxidázt, peroxidázt, fenolt és 4-amino-antipirint alkalmazva [Clin. Chem. 20, 470 (1974)], és a D-metioninnegatív törzseket kiválasztjuk.
Más D-N-acil-aminosavakat is alkalmazhatunk az itt alkalmazott N- acetil-D-metionin helyett. Acil-aminosav-racemázt termelő mikroorganizmusokat kaphatunk az így szelektált törzsekkel, amelyek nem mutatnak aminosav-racemáz-aktivitást, és amelyek D-N“-acilaminosavból a megfelelő L-a-aminosavat állítják elő.
Az ezzel a módszerrel eddig talált N-acil-aminosavracemázt termelő mikroorganizmusokat az 1. táblázatban mutatjuk be.
1. táblázat
| Acil-aminosav-racemáz-termelő mikroorganizmus | L-metionin termelése N-acetil-D-metioninból (25 mmól/1) | D-metionintermelése L-metioninból (25 mmól/1) |
| Streptomyces sp. Y-53 | 12,7 mmól/1 | 0 mmól/1 |
| (FERMP-9518) | ||
| Actinomadura roseoviolacea | 1,2 | 0 |
| (IFO-14098) | ||
| Actinomyces aureomonopodiales | 1,6 | 0 |
| (IFO-13020) | ||
| Jensenia canicruria | 2,1 | 0 |
(IFO-13914)
HU 204558 Β
| Acil-aminosav-racemáz- -termelőmikroorganizmus | L-metionin termelése N-acetil-D-metioninból (25 mmól/1) | D-metionintermelése L-metioninból (25 mmól/1) |
| Amycolatopsis orientalis | 1,4 | 0 |
| (EFQ-12806) Sebekia benihana | 3,9 | 0 |
| (EFO-14309) Streptomyces coelescens | 4,2 | 0 |
| (IFO-13378) Streptomyces celluloflavus | 3,2 | 0 |
| (IFO-I3780) Streptomyces alboflavus | 2,9 | 0 |
| (IFO-13196) Streptomyces aureocirculatus | 2,3 | 0 |
| (IFO-13018) | ||
| Streptomyces diastatochromogenes | 1,8 | 0 |
| (IFO-13389) Streptomyces spectabilis | 2,8 | 0 |
| (EFO-13424) Streptomyces tuirus | 3,8 | 0 |
| (IFO-13418) Streptomyces griseoaurantiacus | 2,7 | 0 |
(IFO-13381) . Bár az 1. táblázatban felsorolt acil-aminosav-racemázt termelő mikroorganizmusok váratlan módon az Actynomycetesek közé tartoznak, bármely olyan mikroorganizmust, amely akár Actynomycetes, baktérium, gomba, élesztő vagy termőtestes gombát, alkalmazhatunk a találmány szerinti eljárásban, amennyiben ez acil-aminosav-racemázt termel.
A földből Arashiyamánál (Kyoto, Japán) izolált egyik acil-aminosav-racemázt termelő mikroorganizmus (az 1. táblázatban Streptomyces sp. Y-53) mikrobiológiai jellemzőit az alábbiakban mutatjuk be.
(a) Morfológia
A spóraképző hifák monopodiális elágazásokat mutatnak, és horgokat, hurkokat és ritkán elsődleges spirálokat (2-3 fordulat) képeznek [Retinaculum-Apertum (RA)]. Az érett spőraláncoknak több, mint 10 spórája van lánconként, és a spórák hengeres formát mutatnak (0,7-0,9*1,1-1,5 pm) sima felszínnel. Mozgó elemek, speciális szervek vagy szerkezetek nem figyelhetők meg. Ez a törzs LL-diamino-pimelinsavat tartalmaz sejtfalkomponensként és nem tartalmaz jellemző cu35 korkomponenst (L sejtfaltípus).
(b) Tenyésztési jellemzők
Az Y-53 törzs tenyésztési jellemzőit különböző tápközegeken a 2. táblázatban mutatjuk be. A 2. táblázatban jelzett színeket úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk ezeket a „Color Harmony Manual” színes csíkjaival (4. kiadás, Container Corporation of America).
2. táblázat
Tenyésztési jellemzők különböző tápkőzegeken
| Tápkőzeg | Növekedés | Alégmicélium színe | A szubsztrátummicélium színe | Atápkőzegbe diffundálható pigment | |
| 1. | Szacharóz- -nitrát-agar | gyenge | ezűstszürke (3fe) | fátyolos szürke (2 fe) | nincs |
| 2. | Glükóz-aszpa- ragin-agar | jó | szürke (d) | fátyolos barnától (2 li) DK barnáig (3 ni) | barna |
| 3. | Glicerin-aszpa- ragin-agar | közepes | könnyű szürkétől szürkéig (d) | szürkés cserszínű (2 ig) | gyenge barna |
| 4. | Szervetlen só-keményítő-agar | jó | fátyolos szürke (2 fe) | mustár-cserszínűtől (2 lg) | gyenge barna |
fátyolos barnáig (2 ni)
HU 204 558 Β
| Tápközeg | Növekedés | A légmicélium színe | A szubsztrátummicélium színe | A tápközegbe diffundálható pigment | |
| 5. | Tirozin-agar | jó | könnyű | DK barna (3 ni) | gesztenyebarna (4 ni) |
| 6. | Nutrient-agar | jó | nincs | könnyű elefántcsont (2 ca) | nincs |
| 7. | Elesztőkivonat- -malátakivonat-agar | jó | fátyolos szürke (2 fe) | DK barna (2 pn) | DK barna (2pn) |
| 8. | Zabliszt-agar | közepes | fátyolos szürke | fátyolos cserszínűtől (2 ge) a szürkés cserszínűig (2 ig) | gyenge barna |
(c) Fiziológiai tulajdonságok (1) Hőmérsékleti tartomány a növekedéshez: 14 °C-37 °C között (optimális hőmérséklet a növekedéshez: 20 °C-30 °C között) élesztőkivonat-malátakivonat agaron (2) Zselatinfolyósítás: pozitív (3) Keményítőhidrolízis: pozitív (4) Zsírtalanított tej koagulációja: negatív Zsírtalanított tej peptonizációja: pozitív (5) Melanoidképzés: negatív (d) Szénforrás-hasznosítás: pozitív: glükóz, xilóz, ramnóz kétséges: fruktóz negatív: arabinóz, szacharóz, raffinóz, mannit, inozit
A fenti mikrobiológiai jellemzők alapján az Y-53 törzs a Streptomyces nemzetségbe tatozik; így Streptomyces sp. Y-53 törzsnek nevezzük. Az Y-53 törzs deponálva van az Institute of Fermentation-nál, Osakában, IFO-14596 deponálási számon, valamint deponálva van a Fermentation Research Institute-nál (FRI) is (Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japán) FERM BP-1889 deponálási számon; ez utóbbi deponálás és tárolás az FRI-nél a Budapesti Szerződés szabályai szerint történt.
Megjegyezzük, hogy a találmány szerinti eljárásban alkalmazható az Y-53-ból van az 1. táblázatból származó más acil-aminosav-racemázt termelő mikroorganizmusból származó mutánsok vagy zigóták bármelyike, amelyeket sejtfűziós technikákkal állíthatunk elő, és transzformánsok bármelyike, amelyeket úgy kaphatunk meg, hogy megfelelő gazdamikroorganizmusba ezen törzsek génjeinek egy részét (amely az acil-aminosav-racemázt kódoló területet tartalmazza) beiktatjuk, amennyiben termel acil-aminosav-racemázt.
A fentebb említett mikroorganizmusok tenyésztéséhez való tápközeg lehet folyékony vagy szilárd, amennyiben tartalmazza azokat a tápanyagforrásokat, amelyeket a szóban foigó törzs hasznosítani tud, és amelyek elősegítik az acil-aminosav-racemáz termelését. A tömeges tenyésztéshez a folyékony tápközeg az előnyös.
A tápközegekhez alkalmazható anyagok olyanok, amelyeket általában alkalmaznak mikroorganizmusok tenyésztésére, tehát szénforrások, nitrogénforrások és szervetlen tápanyagok. Szénforrásként pl. glükóz, glicerin, dextrin, keményítő, melasz, valamint állati és növényi olajok szolgálhatnak. Nitrogénforrásként pl. szójaliszt, kukoricalekvár, gyapotmagliszt, húskivonat, pepton, élesztőkivonat, ammónium-szulfát, nátriumnitrát és karbamid szolgálhat. Ezeken kívül, ha szükséges, nátriumsók, káliumsók, kalciumsók, magnéziumsók, mangánsók és más sók adhatók a tápközeghez.
A tenyésztést végre lehet hajtani stacioner tenyészetben, rázott tenyészetben vagy süllyesztett, levegőztetett tenyészetben. A tömeges kezeléshez a levegőztetett, süllyesztett tenyésztés az előnyös. A-tenyésztési hőmérséklet 15 és 37 °C közötti, előnyösen 20 és 37 °C közötti tartományban lehet. A tápközeg pH-ját előnyösen az 5 és 9 közti tartományban tartjuk. A tenyésztést 18 óra és 4 nap közti időtartamon át végezzük, és akkor állítjuk le, amikor a felgyülemlett acil-aminosav-racemáz-mennyisége eléri a maximumot.
Az acil-aminosav-racemáz tenyészetből történő kinyerésére a tenyészetet először centrifugálással vagy más eljárással sejtekre és fermentlére frakcionáljuk és - ha az említett enzim a sejtekben van - a sejteket valamely sejtszétzúzó módszerrel szétzúzzuk, pl. lizáló enzimes kezeléssel, ultrahangos kezeléssel, francia préskezeléssel vagy Dyna-Míll őrlőmalmos kezeléssel vagy ezek kombinációjával, hogy ilyen módon az enzimet oldatba visszük. Amikor az említett enzim a tenyészet szúr létében van jelen, a tenyészet szűrletét közvetlenül felhasználhatjuk a következő tisztítási lépéshez.
Az említett enzim tisztításához, akár szolubilizált állapotban, akár a tenyészet szúrletében van, ismert enzimtisztítási módszerek kombinációit lehet alkalmazni, pl. kisózási módszereket, ammónium-szulfáton stb. alkalmazva; anioncserélő kromatográfiát, pl. dietilamino-etil-cellulózt alkalmazva; kationcserélő kromatográfíát, karboxi-metil-cellulózt stb. alkalmazva; gélszűrést, pl. dextrángélt alkalmazva, hidrofób kromatográfiát, valamely hidrofób gyantát alkalmazva; és affinitáskromatográfiát alkalmazva; ezekkel az eljárásokkal acil-aminosav-racemáz standard mintákat kaphatunk a célnak megfelelő mértékű tisztítással.
HU 204558 Β
A találmány szerinti eljárással kapott acil-aminosavracemáz az alábbi fizikokémiai jellemzőkkel bír.
1. Hatás
Az említett enzim az L-N“-acil-aminosavat a megfelelő D-N°-acil-amínosavvá, míg a D-Na-acil-aminosavat, a megfelelő L-Na-acil-aminosavvá alakítja. Ennek megfelelőén tehát az enzim a következő egyenlettel bemutatott reverzibilis reakciót katalizálja:
L-N“-acil-aminosav^D-Na-acil-anunosav
2. Szubsztrátfajlagosság
Amint az alábbi 3. táblázatban látható, az enzim optikailag aktív N“-acil-aminosvakra hat, de nem hat a megfelelő optikailag aktív a-aminosavakra.
Meg kell jegyeznünk, hogy a 3. táblázatban levő relatív aktivitásokat a 3. fejezetben leírt enzimaktivitás-meghatározási módszerrel határozzuk meg, olyan értékekkel, amelyek az adott szubsztrátnak megfelelő termelt α-aminosavak talált mennyiségét (mmól/1) képviselik, a termelt metionin mennyiségének alapján számítva, ezt véve 100-nak. Amikor a szubsztrát L-N°acil-aminosav, D-amino-acilázt, amelyet Y-53 törzs termel, alkalmazunk L-amino-aciláz helyett. Amikor a szubsztrát optikailag aktív aminosav, a reakciőközeget, D- vagy L-aminosav oxidázos kezelés után (mindkettő a Sigma Co. terméke) nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának vetjük alá, annak igazolására, hogy a szubsztrát optikai enantiomerje képződött.
3. táblázat
| Szubsztrátum | Relatív aktivitás | Szubsztrátum | Relatív aktivitás |
| N-acetil-D-metionin | 100 | N-acetil-L-metionin | 100 |
| N-formil-D-metionin | 40 | N-fonnil-L-metíonin | 63 |
| N-acetil-D-alanin. | 33 | N-acetil-L-alanin | 21 |
| N-benzoil-D-alanin | 14 | N-benzoil-L-alanin | ND |
| N-acetil-D-Ieucin | 37 | N-acetil-L-Ieucin | 74 |
| N-acetil-D-fenil-alanin | 64 | N-acetíl-L-fenil-alanin | 84 |
| N-klór-acetil-D-fenil- | 90 | N-klór-acetil-L-fenil- | 112 |
| -alanin | -alanin | ||
| N-acetil-D-triptofán | 10 | N-acetil-L-triptofán | 8 |
| N-acetil-D-valm. | 35 | N-acetil-L-valin | 19 |
| N-klór-acetil-D-valin | 80 | N-klőr-acetil-L-valin | 105 |
| N-acetil-D-allo-izoleucin | 33 | N-acetil-L-allo-izoleucin | ND |
| D-metionin | 0 | L-metionin | 0 |
| D-alanin | 0 | L-alanin | 0 |
| D-leucin | 0 | L-leucin | 0 |
| D-fenil-alanin | 0 | L-fenil-alanin | 0 |
| D-triptofán | 0 | L-triptofán | 0 |
| D-valin | 0 | L-valin | 0 |
ND=nem határoztuk meg
3. Az enzimaktivitás meghatározásának módszere
Az acil-aminosav-racemáz reverzibilis reakciót katalizál. Ez azt jelenti, hogy amikor szubsztrátként DN“-acil-aminosavat használunk, az L-Na-acil-aminosav termelődik és gyülendik fel a reakció előrehaladtával, amely az említett enzim másik szubsztrátjává válik, és így szintén az enzim tevékenységének tárgya lesz, és átalakul D-N°-aciI-aminosavvá, vagyis az eredeti szubsztráttá. A valódi reakciósebesség meghatározásához a reakcióterméket azonnal más vegyületekké kell átalakítani és így kizárni a reakciórendszerből.
Ebből a célból fölös mennyiségben adunk a reakciórendszerbe L- vagy D-amino-acilázt, attól függőén, hogy a tennék L- vagy D-N“-acil-aminosav, mivel így lehetővé válik, hogy a kialakult tennék dezacilezési reakciója egyidejűleg végbemenjen, és meghatározható legyen a ténylegesen felhalmozott L- vagy D-aminosav mennyisége; ezt az értéket (mól/1) tekintjük egyenértékűnek a termelt L- vagy D-N“-acil-aminosav mennyiségével.
Az enzimaktivitásokat egy kevert reakciórendszer segítségével határozzuk meg, amely 50 μΐ enzimoldatot, 40 pl szubsztrátoldatot, 10 pl L-amino-aciláz-oldatot és 400 pl 50 mmól/1 trisz-HCl-puffert (pH 7,5) tartalmaz. Enzimoldatként olyan oldatot alkalmazunk, amelyet acil-aminosav standard minta feloldásával készítünk trisz-HCl-pufferben (pH 7,5) 0,2-1 egység/ml koncentrációban; L-amino-aciláz-oldatként olyan oldatot alkalmazunk, amelyet L-amino-aciláz standard minta feloldásával készítünk trisz-HCl-pufferben (pH 7,5) 8-40 egység/ml koncentrációban (kereskedelmi forgalomban levő tennék, pl. az, amelyet a Sigma Co. állít elő, alkalmazható, de a találmány szerinti eljárásban az Y-53 törzsből kivont és tisztított L-amino-acilázt alkalmazzuk).
A fenti oldatokat a következő sorrendben összekeverjük egymással: trisz-HCl-puffer, szubsztrátoldat, Lamino-aciláz-oldat és enzimoldat, a reakció 30 °C hőmérsékleten az enzimoldat hozzáadásával beindul. A
HU 204558 Β reakciót 120 percig folytatjuk, amikor az enzimoldat aktivitása kicsiny, vagy 10 percig, amikor az aktivitás nagy, és a reakciót úgy állítjuk le, hogy a mintát 100 ’C hőmérsékleten 3 percig hőkezeljük.
Az enzimaktivitások meghatározásához a reakciórendszerben termelt metionin mennyiségét nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával határozzuk meg (HPLC); azt az enzimaktivitást, amely 1 μτηόΐ/perc metionin termelésének felel meg, fejezzük ki 1 egységként. Amikor a metionin y mmól/1 koncentrációban keletkezik a reakciórendszerben x perc reakcióidő alatt, az enzim aktivitását (a egység) 50 μΐ oldatban a következő képlettel számítjuk ki:
4. Az optimális pH az enzimaktivitáshoz és az optimális pH-tartomány az enzim stabilitásához.
vagy 4 órás reakciót hajtunk végre a fentebb leírt enzimaktivitás-meghatározás módszerével, de nátriumacetát-HCl-pufferokat (pH 4,0; 5,0), kálium-primer foszfát-nátrium-szekunder foszfátpufferokat (pH 6,0; 7,0; 8,0); kálium-primer foszfát-nátrium-borát-pufferokat (pH 6,3; 7,8; 8,3; 9,0) és nátrium-karbonát-nátriumborát-pufferokat (pH 9,2; 10,0; 10,9) alkalmazunk a trisz-HCl-puffer (pH 7,5) helyett, és a relatív aktivitást az egyes oldatokban a termelt metionin mennyiségének hányadosából számoljuk ki.
Az 1. ábra mutatja a relatív enzimaktivitásokat a megfelelő pH-értékű oldatokban, amikor a reakciót 2 órán át folytatjuk; az 1. ábrából megtudható, hogy a pH optimuma mintegy 8.
A 2. ábra bemutatja a növekedés mértékét a termelt metionin mennyiségében, amikor a reakcióidőt 2 óráról 4 órára növeljük.
Azt lehet mondani, hogy az enzim stabil ilyen körülmények között, mivel a 4 órás reakció olyan mennyiségben szolgáltat metionint, amely mintegy kétszerese annak, amelyet a 2 órás reakcióban kapunk. A 2. ábrából az is megismerhető, hogy az acil-amino- racemáz stabil pH 6 és 9 között.
5. A megfelelő hőmérséklettartomány az enzimtevékenységhez
Az N-acil-D-metioninból termelt L-metionin menynyiségét a reakcióhőmérséklet függvényében határozzuk meg az enzimaktivitás-meghatározás standard módszerével (amelyet a 3. fejezetben írtunk le), a hőmérsékletként 25, 30, 35, 40, 50, 60 vagy 70 ’C-ot alkalmazva. Az alkalmazott enzim mennyisége növekszik, és a reakcióidő 5 perc. A kapott eredményeket a 3. ábrában mutatjuk be. Amint ez a 3. ábrából nyilvánvaló, az enzimtevékenységhez alkalmas hőmérséklettartomány 30 és 50 ’C között van.
ő. A különböző hőmérsékletek hatása az enzimaktivitásra
Az enzimoldatot 30 perces, 30, 35, 40, 50, 60 vagy 70 ’C hőmérsékleten végzett hőkezelés után megvizsgáljuk maradék aktivitásra az aktivitás-meghatározás standard módszereivel. Az eredményeket a 4. ábrán, a feketén pontozott görbével mutatjuk be.
Amint ebből a görbéből nyilvánvaló, az enzim 40 ’C hőmérséklet alatt stabil, de 50 ’C fölött inaktiválódik. A hőkezelést ugyanolyan körülményeket alkalmazva hajtjuk végre, mint fentebb, de 1 mmól/1 kobaltiont is adunk az enzimoldathoz, és a maradék akvitást méqük; a kapott eredmények különböznek attól, mint amelyeket a Co”mentes körülmények között kaptunk. A hozzáadott Co” jelenlétében kapott eredményeket a 4. ábrán a fehéren pontozott görbével mutatjuk be; ebből megismerhető, hogy az enzim Co” jelenlétében 50 ’C hőmérséklet alatt stabil, és 60 ’C hőmérsékleten inaktiválódik.
7. A fémionok befolyása
Kontrollként fémsómentes oldatokat alkalmazva reakciót végzünk az enzimaktivitás meghatározásnak azzal a módszerével, amelyet a 3. fejezetben írtunk le, de a szubsztrátoldathoz adott 12,5 mmól/1 (a reakciókeverék végső koncentrációjában 1 mmól/1) kobalt-kloridot elhagyjuk és helyette 12,5 mmól/1 vagy 125 mmól/I (a reakciókeverék végső koncentrációjában 1 mmól/1 vagy 10 mmól/1) különböző fémsót vagy EDTA-t adunk hozzá, és a fémionok befolyását vizsgáljuk az enzimaktivitásra. Meg kell jegyeznünk, amint a korábbi kísérletekben beigazolódott, hogy az ezekben a kísérletekben alkalmazott L-amino-acilázra ezek az adalékok nem hatnak. Az eredményeket a 4. táblázatban adjuk meg. A 4. táblázatban az enzimaktivitásokat relatív aktivitásokban adjuk meg azoknak az értékeknek az alapján, melyeket adalékok nélkül kapunk, ezt tekintve 100-nak.
4. táblázat
A fémionok befolyása az enzimaktivitásokra
| Adalék | Az adalék koncentrációja | |
| 1 mmól/1 | 10 mmól/1 | |
| Semmi | 100 | 100 |
| LiCI | 100 | 120 |
| NaCl | 100 | 130 |
| KC1 | 110 | 130 |
| MgSO4«7H2O | 890 | 1350 |
| CaCl2 | 95 | 100 |
| SiC12«6H2O | 94 | 110 |
| BaCl2«2H2O | 85 | 120 |
| A12(SO4)3«16H2O | 79 | 0 |
| CrCl3«6H2O | 96 | 100 |
| MnSO4«7H2O | 780 | 1050 |
| FeSO4’7H2O | 100 | 560 |
| CoCl2.6H2O | 2100 | 140 |
| NiSO4«6H2O | 460 | 0 |
| CuSO4«5H2O | 0 | 0 |
| ZnSO4«7H2O | 810 | 80 |
| NaMoO4«2H2O | 96 | 0 |
| SI1SO4 | 92 | 100 |
| PbCl2 | 78 | 100 |
| EDTA | 68 | 0 |
HU 204558 Β
Amint a 4. táblázatból látható, az említett enzim jelentősen aktiválódik többféle fémion bizonyos korlátozott koncentráciőtartományán belül. A kobaltionnak jelentős aktiváló hatása van kis koncentrációknál (1 mmól/1 körül), de alig aktiválja az enzimet 10 mmől/l-nél. A cinkionok és nikkelionok hasonló tendenciát képviselnek. A magnéziumionok esetében az aktiváló hatás 10 mmól/1nél nagyobb, mint 1 mmól/l-nél. Amangánionokés a kétértékű vasionok hasonló tendenciát képviselnek. A vizsgált fémionok közül a rézionok jelentős gátlóhatást mutatnak. Az alnmíniumionok és a molibdénionok szintén gátolják az enzimaktivitást 10 mmól/l-nél. Az EDTA-nak jelentős gátlóhatása van 10 mmól/l-nél,
8. Molekulatömeg
Az enzim molekulatömege mintegy 200 000 dalton. Az 5. táblázatban felsorolt utolsó tisztítási lépés után, a
2. példa szerűit kapott enzim molekulatömegét poliakrilamid gélelektroforézissel határozzuk meg Davis módszere szerint [Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 404 (1964)] az alábbi körülmények között: poliakrilamidgélként PAG 4/15 lemezt alkalmazunk, amely a Daiichi Pure Chemicals Co., Japán, terméke; az áramerősség (konstans feszültség mellett) 30 mA, és az alkalmazott idő 2 őrá. Az enzim molekulatömegét mozgékonyságok összehasonlítása alapján becsüljük meg a mintaenzim és standard fehérjék között.
Az enzimalegység molekulatömegét azonos módszerrel mérjük, SDS- PAG 4/20 lemezt (Daiichi Pure Chemicals, Co., Japán) alkalmazva nátrium-dodecilszulfát (SDS) jelenlétében azonos körülmények között. Az alegység molekulatömege mintegy 40 000 dalton.
9. Izoelektromos pont
Az izoelektromos pont 4,8, agaróz elektroforézissel meghatározva amfolithordozőn. A meghatározáshoz az elektroforézist állandó feszültséget (2 V) biztosító forrásnál végezzük 2,5 órán át, 2117 Multiphor H, LK13 elektroforézisegységet és Pharmalyte-t alkalmazva (Pharmacia, Svédország); a pH 3 és 10 között van.
A találmány szerinti acil-amino-racemáz, amikor Lamino-acilázzal vagy D-amino-acilázzal együtt alkalmazzuk, képes optikailag aktív L-a-aminosavat vagy optikailag aktív D-a-aminosavat képezni egy lépésben olcsó DL-Na-acil-aminosavból. í
Az L-amino-acilázt könnyen elő lehet állítani ismert módszerekkel, de kereskedelmi forgalomban levő- termék is alkalmazható. A D-amino-acilázzal kapcsolatban beszámoltak arról, hogy ezt Streptomyces nemzetségbe tartozó baktériumok (japán vizsgált közzétételi £ iratok, 126 969/1987 és 126 976/1987 számon) Pseudomonas nemzetségbe tartozó baktériumok [Natúré, 170, 888 (1952); japán vizsgált közzétételi irat 31 477/1985 számon], és Alcaligenes nemzetségbe tartozó baktériumok [Proceedings of the Annual Meeting of 5 the Agricultural Chemical Society of Japan, 691. oldal (1987)] termelik. Ezen kívül a találmány szerinti acilaminosav-racemázt termelő mikrooiganzimusok nemcsak acil-antinosav-racemázt, hanem D-amino-acilázt és/vagy L-amino-acilázt is termelnek. 6
Ennek megfelelőén egy optikailag aktív a-aminosav előállítására DL-Na-acil-aminosavbóI, mint kiindulási anyagból, a különböző tisztítási fokú, találmány szerinti eljárással előállított acil-aminosav-racemáz-minták 5 közül olyan mintát választunk, ki, amely megfelel a felhasználás céljának és módjának. Amikor pl. L-aaminosavat szándékozunk előállítani, a kiválasztott standard enzimmintát és a kereskedelmi forgalomban kapható vagy megfeleld L-amino-acilázt termelő mik10 roorganizmusból elkülönített L-amino-acilázt együtt vagy külön-külön reagáltatjuk DL-N“-acil-aminosavval. Amikor a kiindulási anyagnak gyakorlatilag 100%a átalakult L-a-aminosawá, a reakciót leállítjuk és a kívánt L-a-aminosavat kinyerjük a reakciókeverékből. 5 Az átalakulást fordított fázisú nagy sebességű folyadékkromatográfiával követjük.
A megfelelő standard mintának ki kell elégítenie azt a követelményt, hogy ha a cél az L-aminosav előállításában való felhasználás, D-amino-acilázt nem tartal0 mazhat. Azokban az esetekben, ahol az enzimet immobilizált állapotban bioreaktorként alkalmazzuk, a standard minta lehet maga az enzimet tartalmazó sejttömeg, vagy lehet bezárásos módszerrel immobilizált sejtmentes kivonat.
Az acil-aminosav-racemáz standard mintaként, amelyeket a találmány szerinti eljárásban optikailag aktív aminosavak termelési eljárásához alkalmazhatunk abban az esetben, ha az acil-aminosav-racemáz-tennelő mikroorganizmus nem tennél sem L-amino-acilázt, sem D-amino-acilázt, használhatjuk mikroorganizmusok tenyésztett sejtjeit, feldolgozott termékeiket és a sejtekből kivont és különbözőmértékben tisztított standardmintákat.
Amikor L-amino-acilázt vagy D-amino-acilázt is ) termelő acil-aminosav-racemáz-termelő mikroorganizmusokat alkalmazunk, pontosan ugyanolyan módon használhatjuk az eljárást L-a-aminosav vagy D-a-amínosav előállítására, mint a fentebb említett mikroorganizmusok esetében. Abban az esetben nem szükséges
I külön hozzáadni L-amino-acilázt vagy D-amino-acilázt, amikor az együtt termelt L-amino-aciláz vagy D-amino-aciláz aktivitása sokkal erősebb, mint az acilaminosav-racemáz aktivitása.
Amikor az acil-aminosav-racemáz-termelő mikroorganizmus termel mind L-aminosav-aciíázt, mind Daminosav-acilázt is, lehet mutációs eljárásokkal, rutinmódszerekkel indukálni olyan törzset, amelyből hiányzik a D-aminosav-aciláz vagy L-aminosav-aciláz, hogy L-aminosavat, illetve D-aminosavat állítsunk elő. Különböző tisztaságú termékeket is lehet alkalmazni, amelyek a tenyésztett sejtekből a standard enzimmintákig terjedhetnek.
Meg kell jegyeznünk, hogy a tennék, ha tenyésztett sejt vagy sejtmentes kivonat, tartalmazhat egy olyan enzimet, amely elbontja a kívánt aminosavat; ebben az esetben az aminosavbontó aktivitást meg kell szüntetni. Amikor a mikroorganizmus nem aminosav-aciláz hiányos törzs, akkor ezt nehéz közvetlenül sejtes formában alkalmazni optikailag aktív α-aminosav előállítására, de a mikroorganizmust alkalmazhatjuk az egyik
HU 204558 Β vagy mindkét aminosav-aciláz inaktiválása után, ha ez az acil-aminosav-racemázra nem hat, ez történhet pl. hőkezeléssel vagy inhibitorok hozzáadásával stb. Acilaminosav-racemáz standard mintája készítéséhez egy olyan sejtből, amely együtt termel L- és D-aminosavacilázt is, először az acil-aminosav-racemázt vonjuk ki a tenyésztett sejtekből, ezután a kívánt aminosav termelésében zavaró aminosav-acilázt elkülönítjük és eltávolítjuk, és ha szükséges megfelelő tisztítási eljárást is végzünk, hogy a standard mintát előállítsuk.
Amikor L- vagy D-a-aminosavat állítunk elő acilaminosav-racemáz és L- vagy D-aminosav-aciláz segítségével, ezekhez az alábbi eljárásokat alkalmazzuk (1) acil-aminosav-racemáz standard mintáját és Lvagy D-aminosavat feloldunk pH 6-9 közti pufferben, amely megfelelő mennyiségű DL-Na-acil-aminosav kiindulási anyagot és Co” vagy más fémionokat tartalmaz, ezt az oldatot megfelelő hőmérsékleten állni hagyjuk, amíg a reakció teljessé nem válik; vagy (2) acil-aminosav-racemáz standard mintáját és Lvagy D-aminosav-acilázt együtt vagy külön-külön immobilizálunk ismert módszerekkel, ezeket egy vagy több lépésben reakcióedénybe töltve bioreaktort alakítunk ki, és pH 6 és 9 közötti, DL-N“-acil-aminosavat és Co” vagy más fémionokat tartalmazó puffért engedünk át a reaktoron, vagy (3) a két enzimet egy ultraszűrő membránnal kettéosztott reakcióedény rekeszeinek egyikében feloldjuk, a kiindulási anyag oldatát hozzáadjuk, és az ultraszárő membránon átjutott terméket kinyerjük. Minden esetben kívánatos, hogy a reakciókeverék sterilezve legyen és olyan aszeptikusán legyen kezelve, ahogyan csak lehetséges.
Mivel az így kapott végső reakciókeverék csak a kívánt optikailag aktív aminosav és acilcsoportok hidrolízisével kialakuló szerves savat tartalmazza, a kívánt aminosav könnyen kinyerhető hagyományos módszerekkel.
Az alábbiakban megadjuk a rajzok rövid leírását.
Az 1. ábra az acil-aminosav-racemáz pH-függését mutatja be.
A 2. ábra az acil-aminosav-racemáz segítségével termelt metionin mennyiségét mutatja különböző pH-értékeknél, relatív értékekben kifejezve a 4 órás reakciónál (Γ )), a 2 órás reakciónál (VfffÁ) kapott mennyiséghez viszonyítva, amely utóbbit 1-nek tekintünk.
A 3. ábra a reakcióhőmérséklet és az acil-aminosavrecemáz enzimaktivitása közötti kapcsolatot mutatja.
A 4. ábra az acil-aminosav-racemáz hőstabilitását mutatja be.
Példák
l.példa
Acil-aminosav-racemáz előállítása
BBL Trypticase szójatápközeget (amely a Becton Dickinson Co.-nál kapható) és 0,1% N-acetil-D-metionint tartalmazó tápközeget (pH-7,0) 20 ml-es részletekben 200 ml-es Erlenmeyer-lombikokba osztunk, és 120 °C hőmérsékleten 20 percig sterilizáljuk. Eközben a Streptomyces sp. Y-53 törzset, folyékony tápközegben végzett tenyésztés után, fagyasztást körülmények (-80 ’C) között tároljuk, és amikor szükséges, oltó inokulumként alkalmazzuk.
A fenti tápközeg 30 lombikjához a fagyasztott, oldatban levő mikroorganizmust aszeptikusán inokuláljuk 0,7 ml/Iombik mennyiségben, majd két napig rázott tenyészetben, 28 ’C hőmérsékleten tenyésztve oltótenyészeteket készítünk. Az egyes oltótenyészeteket azután átvisszük 500 ml-es, azonos tápközeget tartalmazó lombikba, 1 ml/lombik mennyiségben, és 42 órán át rázó tenyésztésnek vetjük alá 28 ’C hőmérsékleten. A lombikok tartalmát összegyűjtjük, és a sejteket centrifugálással (4 ’C, 10 000 fordulat/perc, 15 perc) kinyeqük. A sejteket fiziológiás konyhasóoldattal mossuk, és így 216 g nedves sejtet kapunk. A következő munkafolyamatokat mind alacsony hőmérsékleten, 4 ’C alatt végezzük.
A 216 g nedves sejtet szuszpendáljuk 1150 mmól/1 foszfátpufferben (pH=7,0), és Dyno Mill sejtzúzóban (amely a Willy A. Bachofen cég terméke) szétzúzzuk a sejteket. Az alkalmazott üveggyöngy átmérője 0,ΙΟ,2 mm, és az áramlási sebesség 60 ml/perc. A feldolgozott folyadékot 4 ’C hőmérsékleten 10 000 fordulat/percnél 20 percig centrifugáljuk, így 1700 ml sejtmentes kivonatot kapunk. Ennek az extraktumnak az acil-aminosav-racemáz-aktivitása 4,9 egység, és fajlagos akivitása 0,52 milliegység/mg fehérje. Az összefehérje mennyiségét Bio-Rad fehérjemeghatározási módszerrel határozzuk meg.
2. példa
Acil-aminosav-racemáz tisztítása
Az 1. példában kapott 1700 ml sejtmentes kivonathoz 300 g ammónium-szulfátot adunk apró részletekben, miközben a keveréket hűtjük és kevertetjük. A teljes mennyiség hozzáadása után a kevertetést további 30 percig folytatjuk és a keveréket 4 ’C hőmérsékleten, 10 000 fordulat/percnél 30 percen át centrifugáljuk, így 1660 ml tiszta felülúszót kapunk.
Az 1660 ml felülúszót TSKHW65C oszlopra (4,8 αη·300 cm) adszorbeáljuk, ahol ez az oszloptöltet a Tosoh Co., Japán terméke, és 50 mmól/1 foszfátpufferral (pH 7,0, amely 30% telített ammóniumszulfátot tartalmaz) van kiegyensúlyozva, és az oszlopot 1000 ml fenti foszfátpufferral mossuk, ami után a fehérjekomponenst olyan foszfátpufferral eluáljuk, amely nem tartalmaz ammónium-szulfátot, és a kívánt enzim aktivitását mutató eluátumfrakciókat összegyűjtjük. Az így kapott 330 ml aktív frakcióhoz 128 g ammónium-szulfátot adunk apróbb részletekben, miközben a frakciót kevertetjük és hűtjük. Az így létrejött csapadékot 10 000 fordulat/percnél 30 percen át végzett centrifugálással összegyűjtjük. Ezt a csapadékot 50 ml 50 mmól/1- es foszfátpufferben (pH 7,0) feloldjuk Sephadex G25 oszlopon (Pharmacia, Svédország) átbocsátva sómentesítjük. Az így kapott nyers enzimoldatot DEAE Toyopearl 650 M (Tosoh Co., Japan) oszlopra (4,8 cm*30 cm) adszorbeáljuk, amely oszlop 50 mmól/1 foszfátpufferral van kiegyensúlyozva. Az oszlopot 1000 ml azonos puffer9
HU 204558 Β ral mossuk, amely után azonos, de 0,2 mól/1 NaCl-ot is tartalmazó pufferral eluáljuk, így 340 ml aktív frakciót kapunk. Ehhez az aktív frakcióhoz 133 g ammőnium-szulfátot adunk. Az így létrejött csapadékot centrifugálással összegyűjtjük (4 ’C; 10 000 fordulat/perc, 30 perc), és feloldjuk 30 ml pufferben. Az oldatot Sephadex G5 oszlopon kereszülbocsátva sőmentesítjűk, és így 59 ml nyers enzimoldatot kapunk. A nyers enzimoldatot DEAE-SPW oszlopra (Tosoh Co., Japán, 2,15 cm átmérő· 15 cm) adszorbeáljuk, amely oszlop azonos pufferral van kiegyensúlyozva, és preparatív nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának vetjük alá (a berendezés: HLC 837 modell, Tosoh Co., Japán), az eluálást lineárisan növekvő NaCI-koncenírációval végezve 0 és 0,5 mól/Iiter között. Az eluálási sebesség 4 ml/perc. A 32 és 36 perc közt eluált frakciókat kinyerjük, így 16 ml aktív frakciót kapunk. Az acil-aminosav-racemáz-aktivitás ebben a frakcióban mintegy 7,2 egység, és a fajlagos aktivitás mintegy 63 milliegység/mg fehérje. A fajlagos aktivitás mintegy 122-szer akkora, mint a sejtmentes kivonaté.
Ezt az aktív frakciót ismét betápláljuk TSKG300SW oszlopra (Tosoh Co., Japán; 5,5 cm átmérő*60 cm), amely 50 mmól/1 foszfátpufferral van kiegyensúlyozva, és gélszűrést hajtunk végre 1 ml/perc áramlási sebességnél, és az aktív frakciót elkülönítetten fogjuk fel. Mivel ez a frakció egyetlen csíkot mutat poliakrilamid gélelektroforézisben, úgy ítéljük meg, hogy az acil-aminosav-racemáz csaknem tisztított állapotban van. Ez a frakció 1,2 egység acil-aminosav-racemáz-aktivitást tartalmaz 2,8 egység/mg fehérje fajlagos aktivitással.
Az acil-aminosav-racemáz teljes aktivitásait, ősszfehérje-tartalmait és fajlagos aktivitásait a frakciók fel- i dolgozási folyamataival kapcsolatban, valamint a megfelelő mintaoldat térfogataival kapcsolatban az 5. táblázatban mutatjuk be.
5. táblázat Az enzim tisztítása
| Eljárás | Térfoga (ml) | t Teljes aktivitás (egység) | Teljes fehérje (mg) | Fajlagos aktivitás (m egység/mg) |
| Sejtmentes kivonat | 1700 | 4,86 | 9699 | 0,52 |
| HW65C oszlop | 330 | 3,43 | 1617 | 2,0 |
| DEAE Toyopearl | 59 | 4,75 | 708 | 6,7 |
| oszlop | ||||
| DEAE 5PW oszlop | 16 | 7,22 | 113 | 63,5 |
| G3000SW oszlop | 8 | 1,23 | 0,43 | 2870 |
szer mossuk 0,8% NaCl-oldattal; így 300 nedves sejtet kapunk.
A nedves sejteket Dyno-Mill (sejtzúzó berendezés) segítségével szétzúzzuk azonos módon, mint az 1. pél5 dában, és centrifúgálást (10 000 fordulat/perc, 20 perc) hajtunk végre, így 1680 ml felülúszót kapunk. Ez a felülúszó 21 egység acil-aminosav-racemázt, 315 egység L-amino-acilázt és 75 egység D-amino-acilázt tartalmaz. Ehhez a felülúszóhoz 30%-os telítettségig am10 mónium-szulfátot adunk, és az így létrejött csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A centrifugálás felülúszőfrakciójához további ammőnium-szulfátot adunk 60%-os telítettségig, és az így létrejött csapadékot centrifugálással kinyerjük. Az így kapott csapadékot 5 feloldjuk 5 mmól/1 foszfátpufferban (pH 7,0), és gélszűréssel sómentesítjük, azonos pufferral kiegyensúlyozott Sephadex G25-öt alkalmazva. A kapott oldatot ioncserélőkromatográfiának vetjük alá.
mmól/1 foszfápufferral (pH 7,0) kiegyensúlyoi zott DEAE Toyopearl 650 M oszlopra (oszloptérfbgat: 700 ml) felvittük a fenti sómentesített oldatot (490 ml), és mossuk 2 I ugyanolyan foszfátpufferral, hogy ezzel kimossuk a nem adszorbeálható komponenseket. Ebből a mosásból 114 egység D-amino-acilázt nyerünk ki. Ennek a DEAE Toyopearl 650 M oszlopnak van acil-aminosav-racemáz (mintegy 20 egység) és L-amino-aciláz (mintegy 900 egység) aktivitása, viszonylag erősen adszorbeálva az oszlophoz, és ezek nem eluálódnak csak akkor, ha több, mint 0,2 mólos sót tartalmazó oldatot bocsátunk keresztül az oszlopon.
Miközben a fenti oszlopot 30 ’C hőmérsékleten tartjuk, olyan 20 mmől/literes, 0,5% N-acetil-DL-metionint és I mmól/1 kobalt-kloridot tartalmazó foszfátpuffert áramoltatunk keresztül az oszlopon 30 ml/óra áramlási sebességgel. 3 liter átfolyó folyadékot gyűjtünk és átengedünk IR 120 kationcserélő gyantán, amely után csökkentett nyomáson addig koncentráljuk, amíg száraz és szilárd nem lesz. A kapott maradékot, miután, kétszer mostuk 10 ml hideg abszolút alkohollal, feloldjuk 100 ml forrővízben, és a kristályokat, amelyek a lehűlés során elkülönülnek, szűréssel összegyűjtjük. Ezenkívül alkoholt adunk hozzá cseppenként a szűriethez, és ezt a keveréket egy éjszakán át állni hagyjuk. Az elkülönült kristályokat összegyűjtjük és megszárítjuk, így 9,6 g L-metionint kapunk. Az olvadáspont 280-281 ’C, [a]??= -8,2’ (c-1% víz), kitermelés: 82,0%.
Ez a termék tökéletesen azonos viselkedésű, mint azok a standard L-metionin-minták, amelyeket nagy teljesítményű folyadékkromatográfiánál és vékonyréteg-kromatográfíánál alkalmazunk. Ezenkívül ez a termék, amikor standard mintával együtt olvasztjuk, nem mutat csökkenést az olvadáspontban.
3. példa
L-Metionin előállítása
Azonos módon, mint az 1. példában, Streptomyces sp. Y-53 törzset tenyésztünk 10 liter tápkőzegben. A 42 órás tenyésztéssel kapott sejteket összegyűjtjük és egy- 60
4, példa
L-valin előállítása ml oltótenyésztő tápközegbe, amely 1,5% glicerint, 1,0% peptont, 1% élesztőkivonatot, 0,5% NaCl-ot, 0,25% K2HPO4-ot, 0,25% MgSO4«7H2O-ot és 0,05%
HU 204558 Β
N-acetil-DL-metionint tartalmaz (pH 7,0) 200 ml-es Erlenmeyer-lombikban, 0,7 ml, 1. példa szerint készített törzstenyészetet inokulálunk, és az így kialakult tenyészeteket forgó rázógépen (200 fordulat/perc) tenyésztjük 28 ’C hőmérsékleten 18 órán át. Az így létrejött tenyészet 1 ml-ét ávisszük egy 200 ml-es Erlenmeyer-lombikba, amely 0,5% glicerint, 1,0% peptont, 0,5% NaCl-ot, 0,25% K2HPO4-ot és 0,05% Nacetil-DL-metionint tartalmaz (pH 7,0). A tenyésztést olyan körülmények között végezzük, ahogyan ezt fentebb említettük. Az alábbi eljárásokat 0 és 4 °C hőmérséklet közt végezzük.
liter tenyészléből sejteket nyerünk ki centrifugálással (10 000 fordulat/perc, 15 perc) és mossuk 0,85%-os vizes NaCl-oldattal. A mosott sejteket (385 g, nedves súly) szuszpendáljuk 1 liter 50 mmól/literes foszfátpufferben (pH 7,0), és szétzúzzuk Dyno-Mill berendezésben (Willy A. Bachofen AG) az alábbi körülmények között az üveggyöngyök átmérője 0,1 és 0,2 mm között van; a sejtszuszpenzió áramlási sebessége 60 ml/perc; a fordulatszáma 3000/perc. A szétzúzott sejteket centrifugálással eltávolítjuk (10 000 fordulat/perc, 20 perc). A kapott felülúszóban (1280 ml) 75 egység acil-aminosav-racemázaktivitás és 1500 egység L-amino-aciláz-aktivitás van. A sejtmentes kivonathoz (1280 ml) 500 g (NH^SCh-ot adunk azonos módon, ahogyan a 2. példában leírtuk, a 60%-os telítettség eléréséig. A keletkezett csapadékot centrifugálással (10 000 fordulat/perc, 30 perc) összegyűjtjük és feloldjuk 600 ml 50 mmól/literes foszfátpufferben (pH 7,0). Az enzimoldatot cellulózzsákban dializáljuk azonos pufferral szemben 18 órán át. A sómentesített enzimoldatot 50 mmól/1 foszfátpufferral (pH 7,0) kiegyensúlyozott DEAE-Toyopearl 650 M (Tosoh Co., Japán) oszlopra (3 cm»30 cm) vittünk. Az oszlopot 1000 ml azonos pufferral, továbbá 1000 ml 20 mmól/l-es trisz-HCl-pufferral (pH 7,5) mostuk, amely 1 mmól/1 CoCh-ot is tartalmaz.
Az ezen az oszlopon adszorbeált acil-aminosav-racemáz és L-amino-aciláz teljes aktivitások értékei: 43, illetve 800 egység. Miközben a fenti oszlopot 28 °C hőmérsékleten tartjuk 2000 ml 20 mmól/1 trisz-HClpuffert (pH 7,5), amely 0,5% N-klór-acetil-D- valint, mmól/1 CoCl2-ot és 1 g/ml dihidrosztreptomicin-szulfátot tartalmaz, bocsátunk át az oszlopon 60 ml/óra áramlási sebességnél. A reakció befejezése után az oszlopot mossuk 500 ml 20 mmól/l-es trisz-HCl-pufferral (pH 7,5), amely 1 mmól/1 CoCl2-ot tartalmaz. Az eluátumot összegyűjtjük és nagy teljesítményű folyadékkromatográfíával elemezzük. N-klór-acetil-D-valint egyáltalán nem mutatunk ki ebben az oldatban. Miután az eluátumot vákuumban koncentráltuk, hideg etanolt adunk hozzá. A kapott kicsapott fehér, szilárd anyagot szűréssel összegyűjtjük, hideg etanollal mossuk, és kis mennyiségű viz-etanolban feloldjuk. 4 °C hőmérsékleten állni hagyva színtelen leveles kristályokat kapunk. A kristályokat szűréssel összegyűjtjük és szárítjuk. A kitermelés 4,5 g, 74,3%. Az olvadáspont 315 °C (bomlik). [a]23- +6,4° (c-1; H2O). Ezeknek a kristályoknak a mintaoldata ugyanolyan retenciós időt és Rrértéket mutat, mint a standard L-valinminta a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiában, illetve vékonyrétegkromatográfiában.
5. példa
Aminosav-aciláz és acil-aminosav-racemdz elegyének alkalmazása
Egy QAE Toyopearl 550 C jelű oszlopra (gyantatérfogat: 10 ml, az oszlop átmérője: 13 mm, hossza: 76 mm) 25,2 egység D-aminosav-acilázt, majd 30 egység acil-aminosav-racemázt adszorbeáltatunk. Az oszlopot 30 °C-on tartjuk, és 25 mmól/1 N-acetil-DLmetíonint és 2 mmól/1 kobalt-kloridot tartalmazó 50 mmól/l-es Trisz-HCl-puffert (pH-7,5) áramoltatunk át rajta 1,0 ml/óra átfolyási sebességgel. 50 ml eluátumot összegyűjtünk, és vákuumban bepároljuk, majd hideg etanolt adunk hozzá. A kapott fehér csapadékot leszűrjük, hideg etanollal mossuk, és kis mennyiségű vizes etanolban feloldjuk. 4 °C-on állni hagyjuk, és a kivált kristályokat összegyűjtjük, megszárítjuk, így 151 mg D-metionint kapunk (kitermelés: 81,2%), [a]23= +8,1° (c=l%, víz).
Claims (6)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás új acil-aminosav-racemáz-enzim előállítására, amelyre az jellemző, hogy- (I) általános képletű D-N-acil-a-aminokarbonsavakat - ahol X jelentése acilcsoport, amely valamely adott esetben helyettesített karbonsavból származik, R jelentése egyenes vagy elágazó szénláncú 1-6 szénatomos alkilcsoport, hídroxil-, 1-3 szénatomos alkil-tio-, tiol-, fenil-, hidroxi-fenil- vagy indolilcsoporttal helyettesített 1-3 szénatomos alkilcsoport, amino-, karboxil-, guanidinil- vagy imidazolilcsoporttal helyettesített 1-4 szénatomos alkilcsoport, és * aszimmetriás szénatomot jelöl - a megfelelő, (I) általános képletű L-N-acil-a-aminokarbonsavakká ahol X, R és * jelentése a fenti - alakít,- (I) általános képletű L-N-acil-a-aminokarbonsavakat - ahol X, R és * jelentése a fenti - a megfelelő, (I) általános képletű D-N-acil-a-aminokarbonsavakká - ahol X, R és * jelentése a fenti - alakít,- a megfelelő D-a-aminosavak L-a-aminosavakká alakítása nélkül és- a megfelelő L-a-aminosavak D-a-aminosavakká alakítása nélkül, azzal jellemezve, hogy valamely Streptomyces sp.Y-53 (FERM P-9518), Actinomadura roseoviolacea (IFO-14098), Actinomyces aureomonopodiales (IFO13020), Jensenia canicruria (IFO-13914), Amycolatopsis orientalis (IFO-12806), Sebekia benihana (IFO14309), Streptomyces coelescens (IFO-13378), Streptomyces celluloflavus (EFO-13780), Streptomyces alboflavus (IFO-13196), Streptomyces aureocirculatus (TFO-13018), Streptomyces diastatochromogenes (IFO13389), Streptomyces spectabilis (EFO-13424), Streptomyces tuirus (IFO-13418) vagy Streptomyces griseoaurantiacus (IFO-13381) fajhoz tartozó törzset megfelelő tápközegen - adott esetben fémionok jelenlétében 11HU 204558 Β tenyésztünk az enzim felhalmozódásáig, majd az enzimet kívánt esetben kinyeqük,
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, szubsztrátként olyan (I) általános képletű vegyületet átalakító enzim előállítására, ahol X jelentése 1-3 szénatomos alkanoilvagy adott esetben halogénatommal, 1-3 szénatomos alkil-, 1-3 szénatomos alkoxi- és/vagy nitrocsoporttal helyettesített benzoilcsoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelő törzseket fermentáljuk.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést fémionok jelenlétében végezzük.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést kobaltionok jelenlétében végezzük.
- 5. Eljárás aminosav-aciláztés az 1. igénypont szerinti eljárással előállított acil-aminosav-racemázt tartalmazó enzimelegy előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely Streptomyces sp. Y-53 (FERM P-9518), Actinomadura roseoviolacea (IFO-14098), Actinomyces aureomonopodiales QFO-13020), Jensenia canicruria (IFO13914), Amycolatopsis orientalis (IFO-12806), Sebekia benihana (IFO-14309), Streptomyces coelescens (IFO13378), Streptomyces celluloflavus (IFO-13780), Streptomyces alboflavus (IFO-13196), Streptomyces aureocirculatus (IFO-13018), Streptomyces diastatochromogenes (IFO-13389), Streptomyces spectabilis (IFO13424), Streptomyces tuirus (IFO-13418) vagy Streptomyces griseoaurantiacus (IFO-13381) fajhoz tartozó törzset megfelelő tápkőzegben - adott esetben fémionok jelenlétében- tenyésztünk az enzimelegy felhalmozódásáig, majd az enzimelegyet kívánt esetben kinyerjük.
- 6. Eljárás optikailag aktív, D- vagy L-aminosavak előállítására, azzal jellemezve, hogy DL-N-acil-a-aminosavakat az 1. igénypont szerinti eljárással előállított acil-aminosav-racemázzal D- vagy L-aminosav-aciláz jelenlétében vagy valamely, az 5. igénypont szerinti eljárással előállított enzimeleggyel, reagáltatunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20848487 | 1987-08-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT47317A HUT47317A (en) | 1989-02-28 |
| HU204558B true HU204558B (en) | 1992-01-28 |
Family
ID=16556926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU884415A HU204558B (en) | 1987-08-21 | 1988-08-19 | Process for producing acyl-amino-acid-racemase and l- or d- amino-acids |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4981799A (hu) |
| EP (1) | EP0304021B1 (hu) |
| KR (1) | KR970000185B1 (hu) |
| CN (1) | CN1034183C (hu) |
| AT (1) | ATE88753T1 (hu) |
| DE (1) | DE3880585T2 (hu) |
| DK (1) | DK462488A (hu) |
| HU (1) | HU204558B (hu) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE105562T1 (de) * | 1989-02-28 | 1994-05-15 | Suntory Ltd | Trehalostatin und seine herstellung. |
| CA2038202A1 (en) * | 1990-09-14 | 1992-03-15 | Masaharu Tokuyama | Dna and use thereof |
| US5525501A (en) * | 1990-09-14 | 1996-06-11 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA Fragment encoding acylamino acid racemase |
| ES2095926T5 (es) * | 1990-11-02 | 2001-02-16 | Novartis Ag | Cyclosporins. |
| US5206162A (en) * | 1991-10-17 | 1993-04-27 | National Science Council Of Republic Of China | Process for making D-aminoacylase |
| US5194383A (en) * | 1991-11-21 | 1993-03-16 | National Science Council Of Republic Of China | Process for making L-aminoacylase |
| US5252216A (en) * | 1992-03-24 | 1993-10-12 | Smithkline Beecham Corporation | Protein purification |
| JP3333969B2 (ja) * | 1992-10-08 | 2002-10-15 | 株式会社林原生物化学研究所 | Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途 |
| PL185541B1 (pl) * | 1995-12-20 | 2003-05-30 | Aventis Pharmaceuticals | Sposób wytwarzania N-acetylo-(L)-4-cyjanofenyloalaniny i N-acetylo-(L)-p-amidynofenyloalaninocykloheksyloglicyno-beta-(3-N-metylopirydynio)-alaniny |
| CN1062604C (zh) * | 1998-04-27 | 2001-02-28 | 湖北省八峰药化股份有限公司 | 氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法 |
| CA2347079A1 (en) * | 1998-10-20 | 2000-04-27 | Chirotech Technology Limited | Aminoacylase and its use in the production of d-aminoacids |
| DE19935268A1 (de) * | 1999-07-27 | 2001-02-08 | Degussa | N-Acetylaminosäureracemase |
| US6664083B2 (en) | 2000-03-01 | 2003-12-16 | Daichel Chemical Industries, Ltd. | Methods for racemizing N-acylamino acids and producing optically active amino acids |
| DE10050124A1 (de) * | 2000-10-11 | 2002-04-25 | Degussa | Verwendung der Acetylaminosäureracemase aus Amycolatopsis orientalis Racemisierung von Carbamoylaminosäuren |
| DE10050123A1 (de) * | 2000-10-11 | 2002-04-25 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren |
| CN101200513A (zh) | 2006-12-12 | 2008-06-18 | 中国石油天然气股份有限公司 | 一种柔性聚合物颗粒及其制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1417060A (en) * | 1972-10-19 | 1975-12-10 | Ajinomoto Kk | Racemization of optically active n-acyl amino acids |
| DE3435095C2 (de) * | 1984-09-25 | 1986-07-24 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Racemisierung von N-Acetyl-D(L)-α-aminocarbonsäuren |
| JPS6255097A (ja) * | 1985-09-04 | 1987-03-10 | Nitto Chem Ind Co Ltd | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| DE3712539A1 (de) * | 1986-07-24 | 1988-02-11 | Ruetgerswerke Ag | Verfahren zur mikrobiellen herstellung von l-alpha-aminosaeuren |
-
1988
- 1988-08-03 US US07/227,882 patent/US4981799A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-17 AT AT88113315T patent/ATE88753T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-08-17 EP EP88113315A patent/EP0304021B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-08-17 DE DE8888113315T patent/DE3880585T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-18 DK DK462488A patent/DK462488A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-08-19 CN CN88106108A patent/CN1034183C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1988-08-19 HU HU884415A patent/HU204558B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-08-20 KR KR1019880010620A patent/KR970000185B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3880585D1 (de) | 1993-06-03 |
| KR890003948A (ko) | 1989-04-19 |
| CN1034183C (zh) | 1997-03-05 |
| HUT47317A (en) | 1989-02-28 |
| EP0304021A3 (en) | 1990-06-20 |
| EP0304021A2 (en) | 1989-02-22 |
| KR970000185B1 (ko) | 1997-01-06 |
| DK462488A (da) | 1989-02-22 |
| CN1035320A (zh) | 1989-09-06 |
| ATE88753T1 (de) | 1993-05-15 |
| EP0304021B1 (en) | 1993-04-28 |
| DE3880585T2 (de) | 1993-08-12 |
| US4981799A (en) | 1991-01-01 |
| DK462488D0 (da) | 1988-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100247853B1 (ko) | D-알파-아미노산의 제조방법 | |
| HU204558B (en) | Process for producing acyl-amino-acid-racemase and l- or d- amino-acids | |
| US6514742B1 (en) | D-aminoacylases, method for producing the same, and method for producing D-amino acids using the same | |
| US4774179A (en) | Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound | |
| US3763000A (en) | Enzymatic production of cephalexin | |
| EP1616945A1 (en) | Process for producing D-N-carbamoyl-alpha-amino acids | |
| US5215897A (en) | Process for producing L-amino acids | |
| JP2712331B2 (ja) | アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途 | |
| JP4300289B2 (ja) | 加水分解又は脱水縮合酵素、及び当該酵素の生産方法、並びに当該酵素を用いたアミドの合成方法 | |
| US6030823A (en) | D-aminoacylase | |
| JP4139773B2 (ja) | 新規なアミド加水分解酵素遺伝子 | |
| US6333176B1 (en) | Process for obtaining microorganisms containing peptide amidase, microorganisms obtained therewith, peptide amidases contained in them and use thereof | |
| EP0159866B1 (en) | Process for production of l-amino acids | |
| JPH0822228B2 (ja) | アミノ酸アミド加水分解酵素及びその使用 | |
| JP2902112B2 (ja) | Ｄ―α―アミノ酸の製造法 | |
| JP5096911B2 (ja) | ５−置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ−カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法 | |
| US5902736A (en) | Process for the production of D-α-amino acids by hydrolysis of the corresponding N-carbamyl derivative | |
| JPS6319158B2 (hu) | ||
| JP3024176B2 (ja) | Ｌ―アミノアシラーゼａ | |
| JP3415218B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 | |
| JP2674078B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 | |
| JPH01277499A (ja) | Ｌ−α−アミノ酸の製造法 | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| JPS6363377A (ja) | シユウドモナス属ｎｓ３０３菌及びｌ−アミノ酸の製法 | |
| JPH0622789A (ja) | 光学活性なｄ−アミノ酸の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |