CN1062604C - 氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法。该方法先将混旋蛋氨酸乙酰化制成乙酰混旋蛋氨酸备用，再采用具有高活性的动物内脏提取物氨基酸酰化酶做酶源，在10-41℃，保温40-110小时，对混旋蛋氨酸进行拆分，然后用活性炭脱色、浓缩、冷却、加入CH3OH在0-6℃下搅拌结晶，分离结晶，干燥得左旋蛋氨酸产品。本法收率相对于混旋蛋氨酸的一次拆分理论收得量的99.0%以上。酶源易得，成本低。
Description
本发明涉及氨基酰化水解酶法拆分混旋蛋氨酸(D，L-Met)制备左旋蛋氨酸(L-Met)1-2-氨基-4-(甲硫基)丁酸的方法，及氨基酰化水解酶的获取。
氨基酸是构成生物体蛋白质的主要成份，是维持生命的基本物质，而L-蛋氨酸是人体八种必需氨基酸中的一种，对人体的健康起着重要作用。已被广泛用于医药卫生的生化研究，以及氨基酸大输液，食品添加剂，日用化妆品等领域。
混旋蛋氨酸对映异物体中，右型和左型二者除了在使平面偏振光发生不同方向相同角度偏转这一点上的差异外，其它物理、化学性质一般条件下没有差异，因此分离出右型体和左型体是十分困难的，传统的化学拆分法，利用D溴代樟脑磺酸铵与混旋蛋氨酸衍生盐的方法形成非对映体的盐，利用其溶解度的差异，从而达到混旋蛋氨酸拆分的目的，该法要消耗大量的天然樟脑，使用大量的Br、氯磺酸、氯仿等腐蚀性强的化工原料，生产周期长、毒副作用大，而且天然樟脑短缺，生产成本高，因此工业法生产左旋蛋氨酸受到了极大的限制。
特许公报，昭41-22380，昭42-1534公开了氨基酰化水解酶法生产左旋蛋氨酸的工艺，采用米曲酶，用小麦麸-谷壳得到的种曲溶解后的承液外加[Co(H2O)6]3119mg/l，与0.17M浓度的乙酰混旋蛋氨酸底物在pH7.0、37℃下作用，以二乙胺乙基作载体，在填充有DEAE纤维的层析柱上，让粗酶液流出通过，流出液减压浓缩过滤得到晶体产品，滤液再用乙醇重结晶，此法优点效率较高，产率67％，菌体培养条件及成本低，酶可反复使用，缺点酶底反应慢，需150小时以上，固化过程中酶失活较高，回收D-乙酰蛋氨酸工序复杂。
特许公报昭48-23915公开了一种氨基酰化水解酶法拆分DL-Met生产L-Met工艺，利用含产谷氨酸棒状杆菌的培养液直接与浓度为0.006M乙酰混旋蛋氨酸底物反应，在pH6.8，温度37℃下反应24小时，反应终止液加热，冷却离心除菌体杂蛋白，上清液经强酸性阳离子柱，流出液为D-乙酰蛋氨酸，柱子用水茚净后，氨水洗脱、浓缩冷却结晶得产品，该方法的优点是效率高，产率64％，单位时间产量相对较高，操作较易，直接使用菌体可省工序和载体，缺点纯度不高，菌体培养成本高，要用肉汁、蛋白冻、葡萄糖培养基培养，回收D-乙酰蛋氨酸工序复杂。
本发明的目的是提供一种氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸新方法，该方法所用的氨基酸酰化酶(E，C、3、5、1、14)具有高活性，易得，生产成本低。
仅L型酰化氨基酸水解
本发明的氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法步骤是：
(1)将乙酰混旋蛋氨酸加去离子水配兑成0.4-1.0mol/L的底物。用NaOH溶液调PH到2-9，优选PH3.8-8，过滤，按3000ml底物液加100-150ml CoCl225×10-4mol/L的溶液。
(2)取氨基酰化水解酶，按17000-20000u/1M乙酰混旋蛋氨酸的比例加入到上述过滤所得底物中，在10-41℃，优选20-38℃，保持40-110小时，进行混旋蛋氨酸拆分。
(3)折分液升温到80-90°，加入活性炭脱色，过滤。
(4)脱色过滤液在70-80℃浓缩到原液体积的1/20-1/30后冷却，
(5)冷却液中加入CH3OH，其量为底物蛋氨酸重量的6-8倍，搅拌，于0-6℃下结晶3-6小时，离心分离，干燥得产品左旋蛋氨酸。
上述所用的乙酰混旋蛋氨酸的配制按如下步骤进行：
(1)取1份重量的混旋蛋氨酸，加入到有2份重量冰醋酸的反应釜中，边加入边搅拌，
(2)再往反应釜中滴加0.9份重量的醋酐，同时搅拌，待放热反应完毕，此时可蒸馏回收醋酸，
(3)冷却，同时加入2份重量的水，放置冷却≥20小时进行结晶；
(4)结晶分离、洗涤、干燥得m、p114-115℃乙酰混旋蛋氨酸原料。
上述所用的氨基酰化水解酶，即氨基酸酰化酶(E、C、3、5、1、14)是按下述方法制得的：
(1)取1份重量的新鲜动物内脏置于高速捣碎机中在0-6℃下磨成细浆，置于容器中；
(2)往细浆中加入2-3份重量0.05-0.1M浓度的磷酸钠盐缓冲液，在0-5℃下搅拌浸提30-40min；
(3)浸提液混合置于冷冻离心机中于转速3000rpm，温度0-5℃下离心沉降≥20min，收得蛋白浓度为40-45mg/ml，酶活力为1860-3890u/ml上清液；
(4)将所得上清液用0.05-0.1M浓度磷酸钠盐缓冲液调PH到3-8，然后再置于冷冻离心机中在转速3000rpm，温度0-5℃下离心沉降≥20min，收集其上清液；
(5)将(4)所得上清液用0.05-0.1M浓度的磷酸钠盐缓冲液调PH到3-8，收得蛋白浓度为11-28mg/ml，酶活力1950-3380u/ml的上清液；
(6)往(5)所得上清液中按每份内脏重量的1/4-1/2重量加入(NH4)2SO4粉末，存于冰柜中盐析8-20小时；
(7)盐析液置于冷冻离心机中于转速4000rpm，温度0-5℃下离心沉降≥20min，得盐折沉降物；
(8)盐析沉降物用去离子水使其完全溶解，并装入市售透析膜制成的袋中于0-5℃下透析≥12小时，经常更换去离子水，到检查透析液中无SO4 2-离子时止；
(9)盐析所得透析酶液用浓度为0.05 0.1M的磷酸钠盐缓冲液配成蛋白浓度为8-10mg/ml，酶活力为23000-25000u/ml的酶液，置于冰柜中备用。
所用浓度为0.05-0.1M的磷酸钠盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠溶液配制成的缓冲液。
本发明的优点是效率高、收率78％，酶来源广，成本低；直接拆分，不需固化，产品与副产品分离回收工序简单。不足的是酶只能使用一次。
实施例1乙酰混旋蛋氨酸(D，L-N-AC-Met)的合成
将150kg混旋蛋氨酸加入到有300kg冰醋酸的反应釜中，边加边搅拌至完全溶解，再滴加135kg醋酐，同时搅拌，因反应放热，温度上升，待放热反应完毕(此时蒸馏回收冰醋酸)，冷却，同时加入300kg水，放置冷却20小时以上结晶，离心分离、洗涤、于燥得190kg产品，一般可得185.6-193.8kg乙酰混旋蛋氨酸产品，收率为90-94％，m、p114-115℃的乙酰混旋蛋氨酸产品贮存备用。
实施例2 氨基酰化水解酶的制取
将1份(100-200g)新鲜动物内脏置高速捣碎机中磨成细浆，置于1000ml烧杯中，加入2-3倍细浆重量的0.05M浓度的磷酸钠盐缓冲液，在0-5℃温度下搅拌浸提30-40min，然后将其混合液置于冷冻离心机中于转速3000rpm，温度0℃-5℃，离心沉降20min，收集上清液320ml，取样测得蛋白浓度41.4mg/ml，酶活力1860-3890u/ml，再将其上清液用0.05M浓度的磷酸钠盐缓冲液调pH到3-8，然后再置于冷冻离心机中在转速3000rpm、温度0℃-5℃内离心沉降20min，收集其上清液，再用上述缓冲液调pH到3-8，收集上清液195ml，取样测蛋白浓度为11-28mg/ml，收集测得酶活力在1950-3380u/ml。
在所得195ml的上清液中加入化学纯(NH4)2SO4粉末48g进行盐析，存放于冰柜中8小时以上。将盐析液置于冷冻离心机中在转速4000rpm，0-5℃温度离心沉降20min，得到盐析沉降物18g。然后将其装入市售透析膜制成的透析袋中，放入去离子水中于0-5℃透析12-24小时，经常更换去离子水，检查透析液无SO2- 4离子时透析完毕，用0.06M浓度的磷酸钠盐缓冲液配得酶液38ml，取样测蛋白浓度9.48mg/ml，酶活力24400u/ml，将酶液置于冰柜中备用。
实施例3
氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸生产例1。
取D、L-N-AC-Met(乙酰混旋蛋氨酸)100kg，加去离子水1000kg、NaOH2.5kg，过滤于拆分釜中，滤液pH-5.5，加入3500mlCoCl25×10-4mol/l溶液，取氨基酰化水解酶加入底物中，其加酶量为20000u／1M乙酰混旋蛋氨酸，在26-40℃拆分40-110小时，因拆分放热使温度升到80-90℃，加入1kg活性炭脱色，其脱色液在70-80℃浓缩到1/30体积，加入700kg CH3OH。搅拌，于0-6℃结晶3-6小时，离心分离母液、脱水，烘干得左旋蛋氨酸产品35.90kg、收率99.2％(相对于混旋蛋氨酸的一次拆分理论收得量)。
实施例4
氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸生产例2。
取乙酰混旋蛋氨酸200kg，加去离子水2000kg、NaOH4.5kg，过滤于拆分釜中，滤液pH-4，加入7000mlCoCl25×10-4ml/l溶液，取氨基酰化水解酶加入底物中。其中酶量为17000u/1M乙酰混旋蛋氨酸，在26-40℃拆分40-110小时，因拆分反应放热。使温度升80-90℃。加入活性炭2kg脱色，其脱色液在70-80℃浓缩到原体积的1/20体积，加1500kgCH3OH，搅拌、于0-6℃温度下结晶3-6小时。离心分离母液，脱水、烘干得左旋蛋氨酸产品71.64kg，收率99.0％，(相对于混旋蛋氨酸的一次拆分理论收得量)。
Claims (6)
1、一种氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸制左旋蛋氨酸的方法，其特征步骤是：
(1)将乙酰混旋蛋氨酸加去离子水配兑成0.4-1.0mol/L的底物溶液，用NaOH溶液调pH到2-9，过滤于拆分釜中按每3000ml过滤底液加100-150mlCoCl25×10-4mol/L的溶液，
(2)取氨基酰化水解酶按17000-20000u/M乙酰混旋蛋氨酸比例加入上述过滤液底物中，在10-4℃保温40-110小时进行混旋蛋氨酸拆分，
(3)拆分液升温到80-90°加入活性炭脱色，过滤，
(4)脱色过滤液在70-80℃浓缩到原液体积的1／20-1／30后冷却，
(5)加入CH3OH，其量为底物重量6-8倍，搅拌，于0-6℃下结晶3-6小时，离心分离，干燥得产品。
2、如权利要求1所述的制取左旋蛋氨酸的方法，其特征是底物溶液用NaOH溶液调pH到3.8-8。
3、如权利要求1所述的制取左旋蛋氨酸的方法，其特征是过滤底物中加入氨基酰化水解酶后，在温度20-38℃保温40-110小时进行混旋蛋氨酸拆分。
4、如权利要求1所述制取左旋蛋氨酸的方法，其特征是所述的乙酰混旋蛋氨酸的配制步骤如下：
(1)取1份重量的混旋蛋氨酸，加入到有2份重量冰醋酸的反应釜中，边加入边搅拌，
(2)往(1)中滴加0.9份重量的醋酐，同时搅拌，待放热反应完毕，
(3)冷却，同时加入2份重量的水，放置冷却20小时以上进行结晶，
(4)结晶分离、洗涤、干燥得m、p114-115℃乙酰混旋蛋氨酸产品。
5、如权利要求1所述的制取左旋蛋氨酸的方法，其特征是所述的氨基酰化水解酶，按如下步骤制得的，
(1)取1份重量的新鲜动物内脏在0-6℃下蘑成细浆，置于容器中，
(2)向细浆中加入2-3份重量0.05-0.1M浓度的磷酸钠盐缓冲液，在0-5℃下搅拌浸提30-40min，
(3)浸提液混合置于冷冻离心机中于转速3000rpm，温度0-5℃下离心沉降≥20min，收得蛋白浓度为40-45mg/ml，酶活力为1860-3890u/ml上清液，
(4)将(3)所得上清液用0.05-0.1M浓度的磷酸钠盐缓冲液调pH到3-8，然后再置于冷冻离心机中在转速3000rpm，温度0-5℃下离心沉降≥20min收集其上清液，
(5)将(4)所得上清液用0.05-0.1M浓度的磷酸钠盐缓冲液调pH到3-8，收得蛋白浓度为11-28mg/ml，酶活力1950-3380u/ml的上清液，
(6)往(5)所得上清液中按每份内脏重量的1/4-1/2重量加入(NH4)2SO4粉末，存于冰柜中盐析-20小时，
(7)盐析液置于冷冻离心机中于转速4000rpm，温度0-5℃下离心沉降≥20min，得盐析沉降物，
(8)盐析沉降物用去离子水溶解并装入市售透析膜制成的袋中，于0-5℃下透析≥12小时，经常更换去离子水，检查透析液中无SO4 -2离子时止。
(9)盐析所得透析酶液用0.05-0.1M浓度的磷酸钠盐缓冲液配成蛋白浓度为8-10Mg/ml，酶活力为23000-25000u/ml的酶液，置于冰柜中备用。
6、如权利要求5所述的制取左旋蛋氨酸的方法，其特征是所述的氨基酰化水解酶的制取中所用的浓度为0.05-0.1M的磷酸钠盐缓冲液为磷酸氢二钠与磷酸二氢钠溶液配制成的缓冲液。
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