KR20230165372A - 링커를 갖는 고정된 트랜스포좀을 사용한 태그먼트화 - Google Patents

링커를 갖는 고정된 트랜스포좀을 사용한 태그먼트화 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 고체 지지체에 결합된 트랜스포좀 복합체를 사용하여 핵산(예를 들어, DNA)을 단편화 및 태그화시키기 위한 방법 및 조성물을 비롯한, 표적 핵산을 처리하기 위한 방법, 조성물, 및 키트에 관한 것이다.

Description

링커를 갖는 고정된 트랜스포좀을 사용한 태그먼트화 {Tagmentation Using Immobilized Transposomes With Linkers}
임의의 우선권 출원에 대한 참고에 의한 포함
본 출원은 2017년 2월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/461,620호에 대한 우선권 이익을 주장하며, 이것은 이의 전문이 참고로 포함된다.
서열목록에 대한 참조
본 개시내용은 전자 포맷의 서열 목록을 포함한다. 서열 목록은 2017년 2월 20일자로 생성되고, 대략 7KB 크기인, 파일명 ILLINC-398WO_Sequence_Listing.txt로서 제공된다. 서열 목록의 전자 포맷에서의 정보는 이의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 개시내용은 고체 지지체 상에 고정된 트랜스포좀 복합체(transposome complex)를 사용하여 핵산(예를 들어, DNA)을 단편화(fragmenting) 및 태그화(tagging)시키기 위한 방법 및 조성물을 비롯한, 핵산을 처리하기 위한 방법, 조성물, 및 키트에 관한 것이다.
핵산 샘플의 차세대 서열결정(NGS)을 위한 현재 프로토콜은 DNA 또는 RNA를 단편화된, 서열결정 가능한 템플레이트의 라이브러리로 전환시키는 샘플 제조 공정을 일상적으로 사용한다. 샘플 제조 방법은 단편화를 달성하기 위해서 종종 다수의 단계, 물질 이송제, 고비용 장비가 요구되고, 따라서 종종 어렵고, 지루하고, 고비용이고, 비효율적이다.
한 접근법에서, 트랜스포좀-기반 방법을 사용하여 핵산 단편 라이브러리를 제조할 수 있는데, 여기서는 2개의 트랜스포존(transposon) 단부 서열, 태그 서열에 연결된 것 하나 및 트랜스포사제(transposase)가 트랜스포좀 복합체를 형성한다. 트랜스포좀 복합체를 사용하여 용액 중에서 표적 핵산을 단편화 및 태그화시켜 서열결정기-준비된 태그먼트화된 라이브러리(sequencer-ready tagmented library)를 생성한다. 트랜스포좀 복합체는 예컨대, 두 단부 서열 중 하나의 5' 단부에서 첨부된 바이오틴을 통해서 고체 표면 상에 고정될 수 있다. 고정된 트랜스포좀의 사용은 핸즈-온(hands-on) 및 전체 라이브러리 제조 시간, 비용 및 시약 요건을 감소시키고, 샘플 투입물 요건을 감소시키고, 비정제된 또는 저등급 샘플을 라이브러리 제조를 위한 출발점으로서 사용하는 것을 가능하게 함으로써 용액-상 접근법보다 상당한 이점을 제공한다. 고체 표면 상에 트랜스포좀을 고정시켜 균일한 단편 크기 및 라이브러리 수율을 생성하기 위한 예시적인 전위(transposition) 절차 및 시스템은 특허 제WO2014/108810호 및 제WO2016/189331호에 기술되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
PCT 공개 제WO2016/189331호 및 제US 2014/093916A1호에 기술된 특정 비드-기반 태그먼트화(tagmentation) 방법에서, 트랜스포좀은 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 사용하여 자성 비드에 결합된다. 이 프로토콜의 후속 PCR 증폭 단계 동안, 바이오틴-스트렙타비딘 결합이 열 변성에 의해서 파괴되어, 이에 의해서 바이오틴일화된 태그먼트화 생성물이 용액 중으로 방출된다. 관심 서열을 갖는 앰플리콘 또는 표적 앰플리콘은 바람직한 경우, 예를 들어, 혼성화 캡처에 의해서 풍부해지고, 서열결정될 수 있다.
그러나, 고정된 트랜스포좀을 사용한 태그먼트화에 의해서 제조된 라이브러리가 일반적인 혼성화 캡처 방법을 사용하여 게놈의 특정 영역에 풍부해지는 경우, 용액 기반 트랜스포좀 접근법을 사용하여 생성된 라이브러리의 풍부화와 비교할 때 더 낮은 판독물 풍부화가 게놈 내의 특정 영역에 대해서 달성될 수 있다.
또한, 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체의 안정성은 트랜스포좀 복합체를 지지체에 연결하기 위해서 사용되는 링커 작제물에 따라서 달라진다. 복합체가 저장 시에 또는 라이브러리 제조 동안 지지체로부터 제거되면, 생성된 라이브러리의 품질 및 효율이 영향을 받는다. 따라서, 개선된 안정성을 갖는 고정된 트랜스포좀 복합체 및 태그먼트화된 라이브러리 제조의 개선된 효율성 및 결국 생성된 라이브러리를 위한 증가된 판독물 풍부화를 나타내는 연관된 방법에 대한 요구가 존재한다. 생성된 라이브러리를 위한 판독물 풍부화를 개선시킬 조성물 및 방법에 대한 요구가 또한 존재한다.
본 개시내용은 변형된 링커 및 구성요소 정렬을 갖는 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체에 관한 것이다. 본 개시내용은 이러한 변형된 복합체를 사용하여 서열결정-준비된(sequencing-ready) 핵산 라이브러리를 생산하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 고체 지지체 상의 트랜스포좀 복합체를 사용하여 DNA를 단편화 및 태그화시키기 위한 방법 및 조성물을 비롯한, 핵산을 처리하기 위한 방법, 조성물, 및 키트에 관한 것이다.
본 개시내용은 트랜스포사제, 제1 트랜스포존, 및 제2 트랜스포존을 포함하는 트랜스포좀 복합체를 제공하며, 여기서, 제1 트랜스포존은 (a) 제1 트랜스포존 단부 서열을 포함하는 3' 부분 및 (b) 제1 트랜스포존 단부 서열의 5' 단부에서 제1 어댑터 서열을 포함하고, 제2 트랜스포존은 제1 트랜스포존 단부 서열의 적어도 일부에 상보성인 제2 트랜스포존 단부 서열을 포함한다. 전형적으로, 제1 트랜스포존 단부 서열 및 제2 트랜스포존 단부 서열은 함께 어닐링되어, 트랜스포사제에 의해서 인식된 이중 가닥 트랜스포존 단부 서열을 형성하고, 이들의 조합물이 기능성 트랜스포좀 복합체를 형성한다.
일부 양상에서, 트랜스포좀 복합체는 제1 트랜스포존(및 따라서 복합체)을 고체 지지체에 연결할 수 있는 절단 가능한 링커를 포함한다. 이러한 양상에서, 절단 가능한 링커의 제1 단부는 제1 어댑터 서열의 5' 단부에 부착되고, 일부 양상에서, 절단 가능한 링커의 제2 단부는 친화성 요소에 부착된다. 친화성 요소는 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 결합할 수 있다. 일부 양상에서, 친화성 요소는 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 결합하여, 고체 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체를 제공한다. 이러한 복합체는 5'-링커 트랜스포좀 복합체 및 고체 지지체-결합된 5'-링커 트랜스포좀 복합체이다.
다른 양상에서, 트랜스포좀 복합체는 제2 트랜스포존(및 따라서 복합체)을 고체 지지체에 연결할 수 있는 3' 링커를 포함한다. 이러한 양상에서, 링커의 제1 단부는 제2 트랜스포존의 3' 단부에 부착되고, 링커의 제2 단부는 친화성 요소에 부착된다. 친화성 요소는 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 결합할 수 있다. 일부 양상에서, 친화성 요소는 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 결합하여, 고체 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체를 제공한다. 일부 양상에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 이러한 복합체는 3'-링커 트랜스포좀 복합체 및 고체 지지체-결합된 3'-링커 트랜스포좀 복합체이다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 변형된 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 일부 양상에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존을 포함하고, 여기서 제1 트랜스포존은 (a) 제1 트랜스포존 단부 서열을 포함하는 3' 부분 및 (b) 제1 트랜스포존 단부 서열의 5' 단부에서 제1 어댑터 서열을 포함하고, 제2 트랜스포존은 제1 트랜스포존 단부 서열의 적어도 일부에 상보성이고, 이에 어닐링된 제2 트랜스포존 단부 서열을 포함하고, 여기서 절단 가능한 링커의 제1 단부는 제1 어댑터 서열의 5' 단부에 부착되고, 일부 양상에서, 절단 가능한 링커의 제2 단부는 친화성 요소에 부착된다.
다른 양상에서, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존을 포함하고, 여기서 제1 트랜스포존은 (a) 제1 트랜스포존 단부 서열을 포함하는 3' 부분 및 (b) 제1 트랜스포존 단부 서열의 5' 단부에서 제1 어댑터 서열을 포함하고, 제2 트랜스포존은 제1 단부 서열의 적어도 일부에 상보성이고, 이에 어닐링된 제2 트랜스포존 단부 서열을 포함하고, 여기서 링커의 제1 단부는 제2 트랜스포존의 3' 단부에 부착되고, 링커의 제2 단부는 친화성 요소에 부착된다. 일부 양상에서, 링커는 절단 가능한 링커이다.
3'-링커 트랜스포좀 복합체의 일부 실시형태에서, 친화성 요소 및 링커는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하기 화학식 (I), (I'), (Ia), (Ib), (Ic), (I(a)), (I(b)) 또는 (I(c))의 구조를 갖는다. 일부 양상에서, 친화성 요소는 제2 트랜스포존의 3' 단부에 공유 연결되고, 여기서 친화성 요소 및 링커는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는다:
식 중,
AE는 친화성 요소이고;
Y는 C2-6알킬렌이고;
X1은 O, NR1, 또는 S이고;
여기서, R1은 H 또는 C1-10 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 정수이고;
X2는 O, CH2, 또는 S이고;
Ra는 H 또는 -OH이고;
Z는, Ra가 H인 경우에는 존재하지 않거나, 또는 Ra가 H 또는 OH인 경우에는 CH2이고;
여기서 제2 트랜스포존에 대한 연결 지점을 표시한다.
일부 양상에서, 본 명세서에 기술된 링커는 5' 링커인데, 여기서 화학식 (I)에서 포스페이트기는 제1 트랜스포존의 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서의 말단 포스페이트기이다. 일부 양상에서, 본 명세서에 기술된 링커는 3' 링커인데, 여기서 화학식 (I)에서 포스페이트기는 제2 트랜스포존 올리고뉴클레오타이드의 3' 하이드록실, 예컨대, 3' 말단 뉴클레오타이드에 연결된다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 이중 가닥 표적 핵산으로부터 태그화된 핵산 단편의 라이브러리를 생성시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 표적을 본 명세서에 기술된 바와 같은 고체 지지체에 결합된 트랜스포좀 복합체와 함께 인큐베이션시키는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 방법은 표적을, 표적이 단편화되고 제1 트랜스포존의 3' 단부가 표적 단편의 5' 단부에 연결되어 복수의 5' 태그화된 표적 단편을 생산하는 조건 하에서 고정된 트랜스포좀 복합체로 처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 트랜스포좀 복합체가 사용된다.
일부 실시형태에서, 방법은 5' 태그화된 표적 단편 중 하나 이상을 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 5' 태그화된 표적 단편 또는 이의 증폭 산물 중 하나 이상을 서열결정하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, 본 개시내용의 일부 추가적인 실시형태는 태그화된 핵산 단편의 라이브러리를 생성시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은,
상부에 고정된 본 명세서에 기술된 트랜스포좀 복합체를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 및
고체 지지체를, 표적 핵산을 복수의 표적 단편으로 단편화시키고, 제1 트랜스포존의 3' 단부를 표적 단편의 5' 단부에 연결시켜 복수의 5' 태그화된 표적 단편을 제공하기에 충분한 조건 하에서 이중 가닥 표적 핵산과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 5' 태그화된 표적 단편을 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기술된 방법에 의해서 생산된 5' 태그화된 표적 단편의 라이브러리를 제공한다.
본 개시내용은 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드, 트랜스포좀 복합체, 및 고체 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체의 제조 방법을 추가로 제공한다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 트랜스포사제를, 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존으로 처리하는 단계를 포함한다. 고체 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체의 제조 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 트랜스포좀 복합체를, 친화성 요소를 친화성 결합 파트너와 (공유적으로 또는 비공유적으로) 결합시키기에 충분한 조건 하에서 친화성 결합 파트너를 포함하는 고체 지지체와 함께 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
본 명세서에 기술된 조성물 및 방법의 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 2개의 집단을 포함하는데, 여기서 각각의 집단 내의 제1 어댑터 서열은 상이하다.
도 1은 트랜스포좀 복합체의 실시형태를 비드 표면에 부착하는 방법의 예시적인 단계를 도시한 도면.
도 2는 유동 셀(flow cell) 상의 클러스터 형성을 통한 비드 표면 상에서의 예시적인 태그먼트화 공정의 개략도.
도 3은 비드 표면 상에 고정된 트랜스포좀 복합체를 사용하여 DNA를 단편화 및 태그화시키고, 그 다음 오프 타깃 판독물의 오염으로 이어지는 표적을 풍부화시키는 예시적인 단계를 도시한 도면.
도 4는 효소적으로 절단 가능한 링커를 사용하여 비드 표면 상에 고정된 트랜스포좀 복합체를 사용하여 DNA를 단편화 및 태그화시키고, 그 다음 표적 풍부화하는 방법의 예시적인 단계를 도시한 도면.
도 5A는 태그먼트화 및 후속 증폭을 위해서 고체 표면에 부착된 트랜스포존 서열의 바이오틴일화된 5' 단부의 예를 나타낸 도면.
도 5B는 태그먼트화 및 후속 증폭을 위해서 고체 표면에 부착된 트랜스포존 서열의 바이오틴일화된 3' 단부의 예를 나타낸 도면.
도 6A는 2개의 상이한 3'-바이오틴일화된 링커를 갖는 트랜스포좀 복합체를 사용한 스트렙타비딘 비드-기반 고체-상 태그먼트화로부터의 라이브러리 효율을 비교한 도면.
도 6B은 동일한 복합체의 비-노화된 배취로부터 제조된 샘플 라이브러리(대조군)와 비교한, 4개월 동안 노화시킨 후 화학식 (I(a))의 3'-바이오틴일화된 링커를 갖는 트랜스포좀 복합체를 사용한 스트렙타비딘 비드-기반 고체-상 태그먼트화로부터 제조된 샘플 라이브러리의 가속화 안정성 데이터를 나타낸 도면.
도 6C는 비-노화된 복합체로부터 제조된 샘플 라이브러리(대조군)와 비교한, 4개월 및 8개월 동안 노화시킨 후 화학식 (I(c))의 3'-바이오틴일화된 링커를 갖는 트랜스포좀 복합체로부터 제조된 샘플 라이브러리의 가속화 안정성 데이터를 나타낸 도면.
도 7A는 비드가 3'-바이오틴일화된 링커를 통해서 이에 결합된 고정된 트랜스포좀 복합체를 포함하는 스트렙타비딘 비드-기반 고체-상 라이브러리 제제를 사용하여 복합체 밀도의 함수로서의 DNA 분자의 표적 삽입물 크기를 나타낸 도면.
도 7B는 활동항진성(Tn5 트랜스포사제 및 3'-바이오틴일화된 링커를 포함하는 고정된 트랜스포좀 복합체를 갖는 스트렙타비딘 비드를 사용하고, 100nM의 복합체 밀도를 사용하여 SPRI 조건의 함수로서 DNA 분자의 표적 삽입물 크기를 나타낸 선 차트.
도 7C는 활동항진성(hyperactive) Tn5 트랜스포사제 및 3'-바이오틴일화된 링커를 포함하는 고정된 트랜스포좀 복합체를 갖는 스트렙타비딘 비드를 사용하고, 600nM의 복합체 밀도를 사용하여 SPRI 조건의 함수로서 DNA 분자의 표적 삽입물 크기를 나타낸 선 차트.
종종 차세대 서열결정(NGS) 응용에서 사용하기 위해서 게놈 핵산으로부터 단편화된 핵산의 라이브러리가 생성된다. 본 개시내용은 고정된 전위성(transpositional) 라이브러리 제조 방법을 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 고정된 전위성 라이브러리 제조 방법은 다른 라이브러리 제조 방법에 비해서 신속하고, 전체 또는 비정제된 샘플(예컨대, 혈액, 객담, 세포 추출물, 등) 및 정제된 샘플(예컨대, 정제된 게놈 핵산) 둘 모두로부터 라이브러리를 제조하는 데 효과적이다. 일반적으로, 트랜스포좀은 공유 또는 비-공유 결합 파트너, 예를 들어, 친화성 요소 및 친화성 결합 파트너를 사용하여 기재(substrate), 예컨대, 슬라이드 또는 비드 상에 고정되어 있다(도 1). 예를 들어, 트랜스포좀 복합체는 트랜스포좀 복합체에 부착된 바이오틴일화된 링커를 통해서 스트렙타비딘-코팅된 비드 상에 고정되어 있다. 표적 핵산은 고정된 트랜스포좀 복합체에 의해서 포획되고, 핵산은 단편화 및 태그화된다("태그먼트화"). 태그화된 단편은 증폭되고, 관심 앰플리콘은 (예를 들어, 혼성화 프로브를 통해서) 임의로 포획되고, 태그화된 단편은 서열결정된다.
라이브러리 제조를 위해서 고체 지지체-연결된 트랜스포좀 복합체를 사용하는 것은 라이브러리 제조 공정에 도입되는 샘플 투입물의 표준화에 대한 필요성 및 풍부화 또는 서열결정 단계 전에 라이브러리 산출물의 표준화에 대한 필요성을 감소시킨다. 또한 이러한 복합체는, 다양한 샘플 투입물 농도가 사용되는 경우에도, 용액-상 방법에 비해서 보다 일관된 삽입물 크기를 갖는 라이브러리를 생산한다. 그러나, 바이오틴일화된 링커를 갖는 특정 트랜스포좀 복합체가 안정성을 감소시켰다는 것을 발견하였다. 또한, 특정 지지체-결합된 복합체 구성은 오프-타깃 산물을 생산하고; 특히 5' 태그화된 표적 단편의 앰플리콘의 혼성화 및 포획은 고정된 핵산과 여전히 혼성화된 핵산의 단편에 의해서 오염될 수 있다(도 3). 이러한 비효율성은 시약 및 서열결정 장비 또는 오프-타킷 단편을 갖는 유동 셀 공간 및 서열결정 데이터의 낭비를 초래할 수 있다. 본 출원은 라이브러리 품질 문제를 해결하고, 오프-타깃 포획을 감소시키기 위한 다양한 트랜스포좀 복합체 및 개선된 화학적 안정성을 나타내는 변형된 링커를 갖는 복합체를 개시한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 수득된 핵산 라이브러리는 임의의 적합한 핵산 서열결정 플랫폼을 사용하여 서열결정되어 표적 서열의 핵산 서열을 결정할 수 있다. 일부 면에서, 관심 서열은 1종 이상의 선천적 장애 또는 유전적 장애, 병원성, 항생제 내성, 또는 유전자 변형과 상관관계가 있거나 이와 연관된다. 서열결정을 사용하여 짧은 텐덤 반복부, 단일 뉴클레오타이드 다형성(polymorphism), 유전자, 엑손, 암호 영역, 엑솜 또는 이의 부분의 핵산 서열을 결정할 수 있다. 이와 같이, 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물은 암 및 질환 진단, 예후 및 치료학, DNA 핑거프린팅 응용(예를 들어, DNA 데이터뱅킹, 범죄 케이스워크), 메타게놈(metagenomic) 연구 및 발견, 애그리게놈(agrigenomic) 응용, 및 병원체 식별 및 모니터링(이들로 제한되지 않음)에 유용한 서열결정 가능한 라이브러리를 생성시키는 것에 관한 것이다.
트랜스포사제-매개된 단편화 및 태그화의 사용에 의해서 표적 핵산, 예컨대, DNA를 차세대 서열결정에 대해서 준비된 어댑터-변형된 템플레이트로 변형시키는 데 필요한 단계의 수가 최소화될 수 있다. 본 명세서에서 "태그먼트화"라 지칭되는 이러한 공정은 종종 특정 목적을 위해서 설계된 임의적인 추가 서열과 함께, 단일 가닥 어댑터 서열 및 이중 가닥 트랜스포존 단부 서열 영역을 포함하는 트랜스포존 쌍과 복합체화된 트랜스포사제 효소를 포함하는 트랜스포좀 복합체에 의한 표적 핵산의 변형을 포함한다. 태그먼트화는 표적 핵산의 동시 단편화 및 듀플렉스(duplex) 핵산 단편의 두 가닥의 5' 단부에 대한 어댑터의 결찰을 초래한다. 트랜스포좀 복합체가 지지체-결합된 경우, 생성된 단편은 태그먼트화 반응 후에 고체 지지체에 결합된다(5' 연결된 트랜스포좀 복합체의 경우에는 직접 또는 3' 연결된 트랜스포좀 복합체의 경우에는 혼성화를 통해서).
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 참고된 모든 특허, 출원, 공개 출원 및 다른 간행물은 달리 언급되지 않는 한 이들의 전문이 참고로 포함된다. 본 명세서에서 용어에 대해서 복수의 정의가 존재하는 경우, 달리 언급되지 않는 한 이 섹션에서의 것을 따른다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 문맥이 달리 명백하게 의미하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 분광학, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학 재조합 DNA 기술 및 약리학의 종래의 방법이 사용된다. "또는" 또는 "및"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 추가로, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "포함하다", "포함한다" 및 "포함하였다"의 사용은 제한이 아니다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 접속구에서든 또는 청구범위 본문에서든, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 개방형 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 이 용어는 구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 이해되어야 한다. 공정과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 이 공정이 적어도 언급된 단계를 포함하지만, 추가적인 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 그 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징부 또는 구성요소를 포함하지만, 또한 추가적인 특징부 또는 구성요소를 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 섹션 제목은 단지 조직화 목적을 위해서이며, 기술된 발명 주제를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
화학 용어
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알킬"은 완전히 포화된 선형 또는 분지형 탄화수소 쇄를 지칭한다(즉, 어떠한 이중 또는 삼중 결합도 함유하지 않음). 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다(그것이 본 명세서에 나타날 때는 언제든, 수치 범위, 예컨대, "1 내지 20"은 주어진 범위 내의 각각의 정수를 지칭하고; 예를 들어, "1 내지 20개의 탄소 원자"는 알킬기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등에서 20개까지(이 값 포함)의 탄소 원자로 이루어질 수 있다는 것을 의미하지만, 본 정의는 또한 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 용어 "알킬"의 경우를 포괄한다. 알킬기는 또한 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알킬일 수 있다. 알킬기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬일 수 있다. 알킬기는 "C1-4 알킬" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 단지 예의 방식에 의해서, "C1-6 알킬"은 알킬 쇄 내에 1 내지 6개의 탄소 원자가 존재하는 것을 나타내고, 즉, 이 알킬 쇄는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, sec-부틸, 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실, 등을 포함하지만, 어떠한 방식으로든 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알콕시"는 화학식 -OR(식 중, R은 상기에 정의된 바와 같은 알킬임), 예컨대, "C1-9 알콕시", 예컨대, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시(아이소프로폭시), n-부톡시, 아이소-부톡시, sec-부톡시, 및 tert-부톡시(이들로 제한되지 않음) 등을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아릴"은 고리 골격 내에 탄소 만을 함유하는 방향족 고리 또는 고리계(즉, 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)를 지칭한다. 아릴이 고리계인 경우, 그 계 내의 모든 고리는 방향족이다. 아릴기는 6 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 용어 "아릴"의 상황을 포괄한다. 일부 실시형태에서, 아릴기는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴기는 "C6-10 아릴", "C6 또는 C10 아릴", 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 아릴기의 예는 페닐, 나프틸, 아줄렌일, 및 안트라센일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"아르알킬" 또는 "아릴알킬"은 치환기로서, 알킬렌기를 통해서 연결된 아릴기, 예컨대, 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필 및 나프틸알킬을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌, "C7-14 아르알킬" 등이다. 몇몇 경우에, 알킬렌기는 저급 알킬렌기(즉, C1-6 알킬렌기)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "카보사이클릴"은 고리계 골격 내에 탄소 원자 만을 함유하는 비-방향족 환식 고리 또는 고리계를 지칭한다. 카보사이클릴이 고리계인 경우, 2개 이상의 고리는 융합되거나, 브릿징되거나 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 카보사이클릴은 임의의 포화도를 가질 수 있되, 단 고리계 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니다. 따라서, 카보사이클릴은 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 및 사이클로알카인일을 포함한다. 카보사이클릴기는 3 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 용어 "카보사이클릴"의 상황을 포괄한다. 카보사이클릴기는 또한 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 카보사이클릴일 수 있다. 카보사이클릴기는 또한 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 카보사이클릴일 수 있다. 카보사이클릴기는 "C3-6 카보사이클릴" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 카보사이클릴 고리의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥센일, 2,3-다이하이드로-인덴, 바이사이클[2.2.2]옥탄일, 아다만틸, 및 스피로[4.4]노난일을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Ca 내지 Cb" 또는 "Ca-b"(식 중, "a" 및 "b"는 정수임)는 명시된 기 내의 탄소 원자의 수를 지칭한다. 즉, 그 기는 "a" 내지 "b"(이들 값 포함)개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, "C1 내지 C4 알킬" 또는 "C1-4 알킬"기는 1 내지 4개의 탄소를 갖는 모든 알킬기, 즉, CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, (CH3)2CH-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(CH3)- 및 (CH3)3C-를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공유 부착된" 또는 "공유 결합된"은 원자들 간의 전자쌍의 공유를 특징으로 하는 화학 결합의 형태를 지칭한다. 예를 들어, 공유 부착된 중합체 코팅은 다른 수단, 예를 들어, 접착 또는 정전기 상호작용을 통해서 표면에 부착된 것과 비교할 때, 기재의 작용화된 표면과 화학 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다. 표면에 공유 부착된 중합체는 또한 공유 부착, 예를 들어, 공유 부착 이외의 수단, 예를 들어, 물리적 흡착을 통해서 결합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
용어 "할로겐" 또는 "할로"는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 원소 주기율표의 칼럼 7의 방사성-안정성 원자, 예를 들어, 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘 중 임의의 하나를 의미하며, 플루오린 및 염소가 바람직하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "헤테로아릴"은 고리 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉 탄소가 아닌 원소, 예컨대, 비제한적으로 질소, 산소 및 황을 함유하는 방향족 고리 또는 고리계(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)를 지칭한다. 헤테로아릴이 고리계인 경우, 계 내의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴기는 5 내지 18개의 고리 원자(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 비롯한, 고리 골격을 구성하는 원자의 수)를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 용어 "헤테로아릴"의 상황을 포괄한다. 일부 실시형태에서, 헤테로아릴기는 5 내지 10개의 고리 원자 또는 5 내지 7개의 고리 원자를 갖는다. 헤테로아릴기는 "5 내지 7원의 헤테로아릴", "5 내지 10원의 헤테로아릴", 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 헤테로아릴 고리의 예는 퍼릴, 티엔일, 프탈라진일, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 아이속사졸릴, 아이소티아졸릴, 트라이아졸릴, 티아다이아졸릴, 피리딘일, 피리다진일, 피리미딘일, 피라진일, 트라이아진일, 퀴놀린일, 아이소퀴놀린일, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤조티아졸릴, 인돌릴, 아이소인돌릴, 및 벤조티엔일포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 고리 골격 내에 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 비방향족 환식 고리 또는 고리계를 의미한다. 헤테로사이클릴은 융합되거나, 브릿징되거나 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 헤테로사이클릴은 임의의 포화도를 가질 수 있되, 단 고리계 내의 적어도 하나의 고리는 방향족이 아니다. 헤테로원자(들)가 고리계 내의 비방향족 또는 방향족 고리 중 어느 하나에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴기는 3 내지 20개의 고리 원자(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 비롯한, 고리 골격을 구성하는 원자의 수)를 가질 수 있지만, 본 정의는 또한 어떠한 수치 범위도 지정되지 않은 용어 "헤테로사이클릴"의 상황을 포괄한다. 헤테로사이클릴기는 또한 3 내지 10개의 고리 원자를 갖는 중간 크기 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴기는 또한 3 내지 6개의 고리 원자를 갖는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴기는 "3 내지 6원의 헤테로사이클릴" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 바람직한 6원의 단환식 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는 O, N 또는 S 중에서 1 내지 3개까지로부터 선택되고, 바람직한 5원의 단환식 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는, N, 또는 S로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자로부터 선택된다. 헤테로사이클릴 고리의 예는 아제핀일, 아크리딘일, 카바졸릴, 시놀린일, 다이옥솔란일, 이미다졸린일, 이미다졸리딘일, 모폴린일, 옥시란일, 옥세판일, 티에판일, 피페리딘일, 피페라진일, 다이옥시피페라진일, 피롤리딘일, 피롤리돈일, 피롤리디논일, 4-피페리돈일, 피라졸린일, 피라졸리딘일, 1,3-다이옥신일, 1,3-다이옥산일, 1,4-다이옥신일, 1,4-다이옥산일, 1,3-옥사티안일, 1,4-옥사티인일, 1,4-옥사티안일, 2H-1,2-옥사진일, 트라이옥산일, 헥사하이드로-1,3,5-트라이아진일, 1,3-다이옥솔릴, 1,3-다이옥솔란일, 1,3-다이티올릴, 1,3-다이티올란일, 아이소옥사졸린일, 아이속사졸리딘일, 옥사졸린일, 옥사졸리딘일, 옥사졸리디논일, 티아졸린일, 티아졸리딘일, 1,3-옥사티올란일, 인돌린일, 아이소인돌린일, 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로피라진일, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라진일, 테트라하이드로-1,4-티아진일, 티아모폴린일, 다이하이드로벤조퓨란일, 벤즈이미다졸리딘일, 및 테트라하이드로퀴놀린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 치환된 기는 또 다른 원자 또는 기에 대한 하나 이상의 수소 원자가 교환된 비치환된 모체 기로부터 유래된다. 달리 나타내지 않는 한, 기가 "치환된" 것으로 간주되는 경우, 그 기는 C1-C6 알킬, C1-C6 알켄일, C1-C6 알카인일, C1-C6 헤테로알킬, C3-C7 카보사이클릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), C3-C7-카보사이클릴-C1-C6-알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 3 내지 10원의 헤테로사이클릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 3 내지 10원의 헤테로사이클릴-C1-C6-알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 아릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 아릴(C1-C6)알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 5 내지 10원의 헤테로아릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 5 내지 10원의 헤테로아릴(C1-C6)알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 임의로 치환됨), 할로, 사이아노, 하이드록시, C1-C6 알콕시, C1-C6 알콕시(C1-C6)알킬(즉, 에터), 아릴옥시, 설프하이드릴(머캅토), 할로(C1-C6)알킬(예를 들어, -CF3), 할로(C1-C6)알콕시(예를 들어, -OCF3), C1-C6 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미노(C1-C6)알킬, 나이트로, O-카밤일, N-카밤일, O-티오카밤일, N-티오카밤일, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카복시, O-카복시, 아실, 사이아네이토, 아이소사이아네이토, 티오사이아네이토, 아이소티오사이아네이토, 설핀일, 설폰일, 설포, 설피노, 설폰에이트, 및 옥소(=O)로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 기를 의미한다. 기가 "임의로 치환된" 것으로서 기술된 경우에는 언제나, 그 기는 상기 치환기로 치환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드), 예컨대, 트랜스포존 단부 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(올리고뉴클레오타이드)를 통해서 지지체에 고정된다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 트랜스포존 서열의 단부에 첨부된 링커를 통해서, 예를 들어, 트랜스포사제 효소를 고체 지지체에 커플링시킴으로써 고정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 트랜스포사제 효소 및 트랜스포존 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드) 둘 모두는 고체 지지체에 고정된다. 고체 지지체에 대한 분자(예를 들어, 핵산, 효소)의 고정을 지칭하는 경우, 용어 "고정된", "붙은" 및 "부착된"이 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 이 용어 모두는 분명하게 또는 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 직접 또는 간접, 공유 또는 비공유 부착을 포함하도록 의도된다. 본 개시내용의 특정 실시형태에서, 공유 부착이 바람직할 수 있지만, 일반적으로 요구되는 것 모두는 분자(예를 들어 핵산, 효소)가, 예를 들어, 핵산 증폭 및/또는 서열결정이 필요한 응용에서, 지지체를 사용하도록 의도되는 조건 하에서 지지체에 고정되거나 부착되어 유지되는 것이다. 일부 예에서, 비드 기반 태그먼트화에서, 트랜스포좀은 리간드쌍, 예를 들어, 친화성 요소 및 친화성 결합 파트너를 통해서 비드 표면에 결합될 수 있다.
트랜스포좀 및 트랜스포사제
예를 들어, NEXTERA(상표명) XT 및 FLEX DNA 샘플 제조 키트(일루미나, 인크.(Illumina, Inc.))에 예시된 바와 같은 트랜스포존 기반 기술이 단편화 DNA를 위해서 이용될 수 있는데, 여기서 표적 핵산, 예컨대, 게놈 DNA는 표적을 동시에 단편화 및 태그화("태그먼트화")하는 트랜스포좀 복합체로 처리됨으로써, 단편의 단부에서 독특한 어댑터 서열로 태그화된 단편화된 핵산 분자의 집단을 생성한다.
전위 반응은 하나 이상의 트랜스포존이 무작위 부위 또는 대부분의 무작위 부위에서 표적 핵산 내에 삽입되는 반응이다. 전위 반응에서의 구성요소는 트랜스포사제(또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 핵산을 단편화 및 태그화할 수 있는 다른 효소, 예컨대, 인터그라제(integrase)), 및 효소에 결합된 이중 가닥 트랜스포존 단부 서열 및 2개의 트랜스포존 단부 서열 중 하나에 부착된 어댑터 서열을 포함하는 트랜스포존 요소를 포함한다. 이중 가닥 트랜스포존 단부 서열 중 하나의 가닥은 표적 핵산의 하나의 가닥으로 이송되고, 상보성 트랜스포존 단부 서열 가닥은 이송되지 않는다(즉, 비-이송된 트랜스포존 서열). 어댑터 서열은 필요에 따라서 또는 바람직한 경우 하나 이상의 기능성 서열(예를 들어, 프라이머 서열)을 포함할 수 있다.
"트랜스포좀 복합체"는 적어도 하나의 트랜스포사제 효소 및 트랜스포존 인식 서열로 구성된다. 이러한 일부 시스템에서, 트랜스포사제는 트랜스포존 인식 서열에 결합하여 전위 반응을 촉매작용할 수 있는 기능성 복합체를 형성한다. 일부 양상에서, 트랜스포존 인식 서열은 이중 가닥 트랜스포존 단부 서열이다. 트랜스포사제, 또는 인터그라제는 표적 핵산 내의 트랜스포사제 인식 부위에 결합하고, 표적 핵산 내에 트랜스포존 인식 서열을 삽입한다. 이러한 일부 삽입 사건에서, 트랜스포존 인식 서열의 하나의 가닥(또는 단부 서열)은 표적 핵산으로 이송되어, 또한 절단 사건을 초래한다. 본 개시내용의 트랜스포사제와 함께 사용하기 위해서 쉽게 개작될 수 있는 예시적인 전위 절차 및 시스템은 예를 들어, PCT 공개 제WO10/048605호, 미국 특허 공개 제2012/0301925호, 미국 특허 공개 제2012/13470087호, 또는 미국 특허 공개 제2013/0143774호에 기술되어 있고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 제공된 특정 실시형태와 함께 사용될 수 있는 예시적인 트랜스포사제는 하기를 포함한다(또는 하기에 의해서 암호화된다): Tn5 트랜스포사제(문헌[Reznikoff et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000, 266, 729-734] 참고), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)(애질런트(Agilent)에 의해서 특징규명되고, 슈어셀렉트(SureSelect) QXT 제품으로 사용되는 트랜스포사제), MuA 트랜스포사제 및 R1 및 R2 단부 서열을 포함하는 Mu 트랜스포사제 인식 부위(Mizuuchi, K., 세포, 35: 785, 1983; Savilahti, H, et al., EMBO J., 14:4893, 1995), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Tn552(Colegio, O. et al., J. Bacteriol., 183:2384-8, 2001; Kirby, C. et al., Mol. Microbiol., 43:173-86, 2002), Ty1(Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22:3765-72, 1994 및 PCT 공개 제WO95/23875호), 트랜스포존 Tn7(Craig, N.L., Science, 271:1512, 1996; Craig, N.L., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204:27-48, 1996), Tn/O 및 IS10(Kleckner N. et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204:49-82, 1996), 마리너(Mariner) 트랜스포사제(Lampe, D.J. et al., EMBO J., 15:5470-9, 1996), Tc1(Plasterk, R.H., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 204:125-43, 1996), P 요소(Gloor, G.B., Methods Mol. Biol., 260:97-114, 2004), Tn3(Ichikawa & Ohtsubo, J. Biol. Chem., 265:18829-32, 1990), 박테리아 삽입 서열(Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:1-26, 1996), 레트로바이러스(Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2525-9, 1989), 및 호모의 레트로트랜스포존(Boeke & Corces, Ann. Rev. Microbiol. 43:403-34, 1989). 추가 예는 IS5, Tn10, Tn903, IS911, 및 트랜스포사제 패밀리 효소의 조작된 버전(Zhang et al., (2009) PLoS Genet. 5:e1000689. Epub Oct. 16; Wilson C. et al. (2007) J. Microbiol. Methods 71:332-5)을 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법은 또한 트랜스포사제의 조합물 및 뿐만 아니라 단일 트랜스포사제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 Tn5, MuA, 또는 비브리오 하베이 트랜스포사제, 또는 이들의 활성 돌연변이체이다. 다른 실시형태에서, 트랜스포사제는 Tn5 트랜스포사제 또는 이들의 활성 돌연변이체이다. 일부 실시형태에서, Tn5 트랜스포사제는 활동항진성 Tn5 트랜스포사제(예를 들어, 레즈니코프(Reznikoff) 등의 PCT 공개 제WO2001/009363호, 미국 특허 제5,925,545호, 제5,965,443호, 제7,083,980호, 및 제7,608,434, 및 문헌[Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem. 273:7367, 1998] 참고), 또는 이들의 활성 돌연변이체이다. 일부 양상에서, Tn5 트랜스포사제는 본 명세서에 참고로 포함된 PCT 공개 제WO2015/160895호에 기술된 바와 같은 Tn5 트랜스포사제이다. 일부 실시형태에서, Tn5 트랜스포사제는 융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Tn5 트랜스포사제 융합 단백질은 융합된 연장 인자 Ts(Tsf) 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, Tn5 트랜스포사제는 야생형 서열에 대해서 아미노산 54, 56, 및 372에서 돌연변이를 포함하는 활동항진성 Tn5 트랜스포사제이다. 일부 실시형태에서, 활동항진성 Tn5 트랜스포사제는 융합 단백질이고, 임의로 여기서 융합된 단백질은 연장 인자 Ts(Tsf)이다. 일부 실시형태에서, 인식 부위는 Tn5-타입 트랜스포사제 인식 부위이다(Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367, 1998). 다른 실시형태에서, 활동항진성 Tn5 트랜스포사제와 함께 복합체를 형성하는 트랜스포사제 인식 부위가 사용된다(예를 들어, EZ-Tn5(상표명) 트랜스포사제, 에피센트레 바이오테크놀로지스(Epicentre Biotechnologies), 위스콘신주 매디슨 소재).
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 트랜스포사제의 2개의 분자의 이량체이다. 일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 동종이량체인데, 여기서 트랜스포사제의 2개의 분자는 각각 동일한 유형의 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존에 결합된다(예를 들어, 각각의 단량체에 결합된 2개의 트랜스포존의 서열은 동일함, "동종이량체"를 형성함). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법은 트랜스포좀 복합체의 2개의 집단을 사용한다. 일부 실시형태에서, 각각의 집단 내의 트랜스포사제는 동일하다. 일부 실시형태에서, 각각의 집단 내의 트랜스포좀 복합체는 동종이량체인데, 여기서 제1 집단은 각각의 단량체에서 제1 어댑터 서열을 갖고, 제2 집단은 각각의 단량체에서 상이한 어댑터 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 Tn5 트랜스포사제이다. 일부 실시형태에서, 트랜스포사제 복합체는 제1 단량체 및 제2 단량체를 포함하는 트랜스포사제(예를 들어, Tn5 트랜스포사제) 이량체를 포함한다. 각각의 단량체는 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존을 포함하는데, 여기서 제1 트랜스포존은 이의 3' 단부 및 제1 어댑터 서열(여기서 이량체의 각각의 단량체에서 어댑터 서열은 동일하거나 또는 상이함)에서 제1 트랜스포존 단부 서열을 포함하고, 제2 트랜스포존은 제1 트랜스포존 단부 서열에 적어도 부분적으로 상보성인 제2 트랜스포존 단부 서열을 포함한다. 5' 절단 가능한 링커 양상의 일부 실시형태에서, 제1 트랜스포존은 이의 5' 단부에서 친화성 요소에 연결된 절단 가능한 링커를 포함한다. 3' 링커 양상의 일부 실시형태에서, 제2 트랜스포존은 이의 3' 단부에서 친화성 요소에 연결된 링커(임의로 절단 가능함)를 포함한다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 각각의 단량체로부터의 하나의 트랜스포존은 친화성 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 그러나, 두 단량체 중 단지 하나가 친화성 요소를 포함한다.
어댑터 서열
본 명세서에 기술된 방법의 실시형태 중 임의의 것에서, 제1 트랜스포존은 제1 어댑터 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 어댑터는, 프라이머 서열 및 2차 어댑터 서열을 포함하는 2차 어댑터 담체를 사용하여 본 명세서에 기술된 바와 같이 태그화된 단편에 첨가된다. 어댑터 서열은 만능 서열, 프라이머 서열, 인덱스 서열, 포획 서열, 바코드 서열(예를 들어, 계수 또는 오류 보정을 위함), 절단 서열 서열, 서열결정-관련된 서열, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 기능성 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 어댑터 서열은 프라이머 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 어댑터 서열은 프라이머 서열 및 인덱스 또는 바코드 서열을 포함한다. 프라이머 서열은 또한 만능 서열일 수 있다. 본 개시내용은 사용될 수 있는 어댑터 서열의 유형에 제한되지 않으며, 통상의 기술자는 라이브러리 제조 및 차세대 서열결정을 위해서 사용될 수 있는 추가 서열을 인식할 것이다.
태그먼트화 반응에 의해서 핵산 단편의 5' 단부로 이송되는 어댑터 서열(예를 들어, 제1 어댑터 서열(들))은 예를 들어, 만능 서열을 포함할 수 있다. 만능 서열은 2개 이상의 핵산 단편에 공통적인 뉴클레오타이드 서열의 영역이다. 임의로, 2개 이상의 핵산 단편은 또한 서열 차이의 영역을 갖는다. 복수의 핵산 단편의 상이한 구성원으로 존재할 수 있는 만능 서열은 만능 서열에 상보성인 단일 만능 프라이머를 사용하여 다수의 상이한 서열의 복제 또는 증폭을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법은 트랜스포좀 복합체의 2개의 집단을 사용한다. 일부 실시형태에서, 각각의 집단은 상이한 프라이머 서열을 갖는 어댑터 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 집단은 A14 프라이머 서열을 포함하고, 제2 집단은 B15 프라이머 서열을 포함한다.
친화성 요소 및 친화성 결합 파트너
친화성 요소는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 친화성 결합 파트너에 공유적으로 또는 비공유적으로 결합시키는 데 사용될 수 있는 모이어티이다. 일부 양상에서, 친화성 요소는 트랜스포좀 복합체 상에 존재하고, 친화성 결합 파트너는 고체 지지체 상에 존재한다.
일부 실시형태에서, 친화성 요소는 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너에 비공유 결합되거나 또는 결합될 수 있어서, 트랜스포좀 복합체를 고체 지지체에 비공유적으로 부착한다. 이러한 실시형태에서, 친화성 요소는 예를 들어, 바이오틴이거나 또는 이를 포함하고, 친화성 결합 파트너는 아비딘 또는 스트렙타비딘이거나 이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 친화성 요소/결합 파트너 조합물은 ITC/항-FITC, 다이곡시게닌/다이곡시게닌 항체, 또는 햅텐/항체이거나 또는 이를 포함한다. 추가로 적합한 친화성 쌍은 다이티오바이오틴-아비딘, 이미노바이오틴-아비딘, 바이오틴-아비딘, 다이티오바이오틴-석신일화된 아비딘, 이미노바이오틴-석신일화된 아비딘, 바이오틴-스트렙타비딘, 및 바이오틴-석신일화된 아비딘을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 친화성 요소는 화학 반응을 통해서 친화성 결합 파트너에 결합할 수 있거나 또는 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너와의 반응에 의해서 공유 결합되어, 트랜스포좀 복합체를 고체 지지체에 공유적으로 부착한다. 일부 양상에서, 친화성 요소/결합 파트너 조합물은 아민/카복실산(예를 들어, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 조건 하에서 표준 펩타이드 커플링 반응을 통해서 결합함, 예컨대, EDC 또는 NHS-매개된 커플링)이거나 또는 이를 포함한다. 두 구성요소의 반응이 친화성 요소 및 결합 파트너를 아마이드 결합을 통해서 연결한다. 대안적으로, 친화성 요소 및 결합 파트너는 2개의 클릭(click) 파트너(예를 들어, 아자이드/알카인, 이것은 반응하여 트라이아졸 링키지를 형성함)일 수 있다.
절단 가능한 링커
2개의 분자 엔티티를 연결하는 결합을 파괴하는 능력은, 제1 혼성화 동안 다양한 오프 타깃 포획물에서 게놈을 생성시킬 가능성을 방해하는, 오프 타깃 혼성화 산물의 포획을 감소시키기에 효과적인 툴일 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 결합을 통해서 함께 연결된 2개의 작용성 헤드를 갖는 분자이다. 2개의 작용성 헤드는 링커를 다른 모이어티에 부착하는 기능을 하며; 이 경우, 절단 가능한 링커는 제1 트랜스포존의 5' 단부 서열을 친화성 요소에 연결한다. 이의 절단 조건 및 생물학적 응용에 따라서 분류된 절단 가능한 링커의 개요는 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Wagner et al., Bioorg. Med. Chem. 20, 571-582 (2012)]에 열거되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 절단 가능한 링커는 화학적 또는 물리적 수단, 예컨대, 예를 들어, 광분해, 화학적 절단, 열적 절단 또는 효소적 절단을 통해서 절단될 수 있는 링커이다. 일부 실시형태에서, 절단은 생화학적, 화학적, 효소적, 친핵성, 환원 감응제(sensitive agent) 또는 다른 수단에 의해서 일 수 있다.
일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 다양한 수단에 의해서 단편화될 수 있는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 절단 가능한 링커는 제한 엔도뉴클레아제 부위; RNAse로 절단 가능한 적어도 하나의 리보뉴클레오타이드; 특정 화학 작용제(들)의 존재 하에서 절단 가능한 뉴클레오타이드 유사체; 퍼아이오데이트(예를 들어)로의 처리에 의해서 절단 가능한 다이올 링키지; 화학적 환원제로 절단 가능한 다이설파이드기; 광화학적 절단에 적용될 수 있는 절단 가능한 모이어티; 및 펩티다제 효소 또는 다른 적합한 수단에 의해서 절단 가능한 펩타이드를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 제2012/0208705호 및 제2012/0208724호, 및 PCT 공개 제WO 2012/061832호 참고, 이들 각각은 이들의 전문이 참고로 포함됨).
광-절단 가능한(PC) 링커는 다양한 검정을 위해서 다양한 응용, 예컨대, 광절단-유도된 정제, 단백질 조작, 화합물 및 생물분자의 광-활성화뿐만 아니라 광절단 가능한 매스 태그화에서 사용되어 왔다. PC 링커는 특정 파장(300 내지 350㎚)의 UV 광에 의해서 절단 가능한 광분해성(photolabile) 작용기를 함유할 수 있다. PC 링커는 적절한 스펙트럼 범위 내의 UV 광에 노출되는 경우 절단될 수 있는 예를 들어, 10-원자 단위를 포함할 수 있다. 이러한 광-절단 가능한 링커 및 포스프아미다이트 시약은 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA technologiesL IDT)), 암버젠(Ambergen), 및 글렌 리서치(Glen Research)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 광-절단 가능한 뉴클레오타이드 조성물의 사용은 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제7,057,031호, 제7,547,530호, 제7,897,737호, 제7,964,352호, 및 제8,361,727호에 상세하게 기술되어 있다.
일부 실시형태에서, 절단은 절단 가능한 뉴클레오타이드 또는 핵염기를 절단 가능한 링커 내에 혼입함으로써 효소적으로 매개된다. 이러한 핵염기 또는 뉴클레오타이드 모이어티의 예는 우라실, 우리딘, 8-옥소-구아닌, 잔틴, 하이포잔틴, 5,6-다이하이드로우라실, 5-메틸사이토신, 티민-이량체, 7-메틸구아노신, 8-옥소-데옥시구아노신, 잔토신, 이노신, 데옥시이노신, 다이하이드로우리딘, 브로모데옥시우리딘, 우리딘, 5-메틸사이티딘, 데옥시우리딘, 5,6-다이하이드록시티민, 티민 글리콜, 5-하이드록시-5-메틸히단톤, 우라실 글리콜, 6-하이드록시-5,6-다이하이드로티민, 메틸 타트론일 우레아(1,2), 또는 아베이직(abasic) 부위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 완전한 절단을 허용하기 위한 충분한 수의 절단 가능한 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 1 내지 10개의 절단 가능한 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 적어도 하나의 절단 가능한 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 절단 가능한 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 하나 이상의 우라실 뉴클레오타이드 및 임의로 다른 표준 DNA 염기를 포함한다. 일부 실시형태에서, PCR 이후에 추가적인 효소적 단계가 절단 가능한 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 위치에서 절단 가능한 링커를 절단한다. 이러한 효소의 예는 우라실 DNA 글리코실라제(UDG, 또한 우라실-N-글리코실라제 또는 UNG라고도 지칭됨), 폼아미도피리미딘 DNA 글리코실라제(Fpg), RNaseH, 엔도(Endo) III, 엔도 IV, 엔도 V, 엔도 VIII, Klenow, 또는 아피라제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 핵산 및 AP 뉴클레아제에서 우라실 염기를 절단하는 효소를 포함하는 효소의 블렌드가 사용된다. 효소의 유효 농도는 0.025U/㎕ 내지 10U/㎕ 범위일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 효소의 블렌드는 우라실 DNA 글리코실라제 및 엔도 IV이다. 본 명세서에 기술된 방법에서 사용하기 위한 상업적인 효소 믹스는 UDEM(에피센트레 바이오테크놀로지스)을 포함한다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 효소의 블렌드는 우라실 DNA 글리코실라제 및 엔도 VIII(USER(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 또는 우라실 글리비지 시스템(Uracil Cleavage System)(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))으로서 상업적으로 입수 가능함). 절단은 예를 들어, 핵산 정제, 예컨대, 포획되지 않은 작은 올리고뉴클레오타이드를 남길 비드-기반 방법을 사용한 표적 핵산의 정제 동안 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방법에 의해서 제거될 수 있는 짧은 올리고뉴클레오타이드 상에 5' 친화성 요소(예를 들어, 바이오틴 모이어티)를 남긴다. 절단은 친화성 요소(예를 들어, 바이오틴)와 5' 태그화된 표적 단편 사이의 연결을 파괴한다. 바람직한 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 트랜스포존 듀플렉스의 트랜스포존 단부 서열의 5' 단부에 인접하고, 이것에 부착되어 있다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 바이오틴에 연결되어 있다. 다른 실시형태에서, 바이오틴은 스트렙타비딘 코팅된 비드 상에 부착되어 있다.
3' 링커를 갖는 트랜스포좀 복합체 및 트랜스포존
다른 양상에서, 링커는 제2 트랜스포존의 3' 단부에 연결되는데, 여기서 링커는 고체 지지체에 제2 트랜스포존을 연결할 수 있다. 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존이 트랜스포좀 복합체의 부분인 경우, 링커는 복합체를 고체 지지체에 연결하도록 기능한다. 이러한 양상에서, 링커의 제1 단부는 제2 트랜스포존의 3' 단부에 부착되고, 링커의 제2 단부는 친화성 요소에 부착된다. 친화성 요소는 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너에 (공유적으로 또는 비공유적으로) 결합할 수 있다. 일부 양상에서, 친화성 요소는 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너에 (공유적으로 또는 비공유적으로)에 결합되어, 고체 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체를 제공한다. 일부 양상에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 이러한 복합체는 3'-링커 트랜스포좀 복합체 및 지지체-결합된 3'-링커 트랜스포좀 복합체이다. 일부 실시형태에서, 친화성 요소는 바이오틴이고, 친화성 결합 파트너는 스트렙타비딘이다.
일 실시형태에서, 링커는 제2 트랜스포존의 3' 단부에 공유 부착된다. 일부 실시형태에서, 링커는 제2 트랜스포존 단부 서열의 3' 단부에 공유 부착된다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 링커는 제2 트랜스포존의 3' 단부 하이드록시기에 공유적으로 그리고 직접 부착되고, 따라서 -O- 링키지를 형성할 수 있거나, 또는 또 다른 기, 예컨대 포스페이트 또는 에스터를 통해서 공유 부착될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기술된 링커는 제2 트랜스포존의 포스페이트기 또는 예를 들어 포스페이트기를 통해서 3' 하이드록실에 공유 부착된 제2 트랜스포존 단부 서열에 공유 부착되고, 따라서 -O-P(O)3- 링키지를 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 트랜스포좀 복합체는 링커를 통해서 고체 지지체에 고정된다. 일부 이러한 실시형태에서, 친화성 요소는 바이오틴이고, 고체 지지체는 스트렙타비딘을 포함한다. 일부 추가 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이거나 이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 비드는 상자성 비드이다.
일부 실시형태에서, 링커 및 친화성 요소는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는다:
식 중,
AE는 친화성 요소이고;
Y는 C2-6알킬렌이고;
X1은 O, NR1, 또는 S이고;
여기서 R1은 H 또는 C1-10 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6로 이루어진 군으로부터의 정수이고;
X2는 O, CH2, 또는 S이고;
Ra는 H 또는 -OH이고;
Z는, Ra가 H인 경우에는 존재하지 않거나, 또는 Ra가 H 또는 OH인 경우에는 CH2이고;
식 중, 는 제2 트랜스포존에 대한 연결 지점을 나타낸다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, AE는 임의로 치환된 바이오틴 또는 아미노기이다. 다른 실시형태에서, AE는 임의로 치환된 바이오틴이다. 이러한 실시형태에서, 바이오틴은 C1-4알킬로 임의로 치환된다. 다른 실시형태에서, AE는 바이오틴이다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, Y는 C2-6알킬렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 C2-5알킬렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 C2-4알킬렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 C2-3알킬렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 비분지형 알킬렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 C2알킬렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 C3알킬렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 C4알킬렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 에틸렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 프로필렌이다. 다른 실시형태에서, Y는 부틸렌이다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, X1은 NR1이고, 식 중, R1은 H 또는 C1-10알킬이다. 일부 이러한 실시형태에서, R1은 H이다. 일부 실시형태에서, R1은 C1-3알킬이다. 다른 실시형태에서, X1은 O이다. 다른 실시형태에서, X1은 S이다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, n은 1이다. 다른 실시형태에서, n은 2이다. 다른 실시형태에서, n은 3이다. 다른 실시형태에서, n은 4이다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, X2는 CH2이다. 일부 다른 실시형태에서, X2는 O이다. 다른 실시형태에서, X2는 S이다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, Ra는 H이다. 다른 실시형태에서, Ra는 -OH이다.
화학식 (I)의 일부 실시형태에서, Z는 존재하지 않고, Ra는 H이다. 일부 실시형태에서, Z는 CH2이고, Ra는 H이다. 일부 실시형태에서, Z는 CH2이고, Ra는 OH이다.
일부 실시형태에서, 링커 및 친화성 요소는 화학식 (I')의 구조를 갖는다:
식 중, AE, Y, X1, n, X2는 화학식 (I)에 대해서 본 명세서에 기술된 바와 같이 정의되며, Z는 존재하지 않거나 또는 CH2이다.
일부 실시형태에서, 링커 및 친화성 요소는 하기 화학식 (Ia)의 구조를 갖는다:
식 중, X1, n, X2, Ra, 및 Z는 화학식 (I)에 대해서 본 명세서에 기술된 바와 같이 정의된다. 일부 실시형태에서, Ra는 H이다.
일부 실시형태에서, 링커 및 친화성 요소는 화학식 (Ib)의 구조를 갖는다:
식 중, AE는 본 명세서에서 화학식 (I)에 대해서 정의된 바와 같고; n은 1 또는 2이다.
화학식 (Ib)의 일부 양상에서, AE는 임의로 치환된 바이오틴 또는 아미노기이다. 일부 실시형태에서, AE는 바이오틴이다.
일부 실시형태에서, 링커 및 친화성 요소는 하기 화학식 (Ic)의 구조를 갖는다:
식 중, AE는 본 명세서에서 화학식 (I)에 대해서 정의된 바와 같고; X2는 O 또는 CH2이고; n은 1 또는 2이고; Z는 존재하지 않거나 또는 CH2이다.
화학식 (Ic)의 일부 실시형태에서, AE는 임의로 치환된 바이오틴 또는 아미노기이다. 일부 실시형태에서, AE는 바이오틴이다. 일부 실시형태에서, X2는 O이다. 일부 실시형태에서, X2는 CH2이다. 일부 실시형태에서, n은 1이다. 일부 실시형태에서, n은 2이다. 일부 실시형태에서, Z는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, Z는 CH2이다. 일부 실시형태에서, n은 1이고, X2는 O이고, Z는 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, n은 1이고, X2는 CH2이고, Z는 CH2이다.
일부 실시형태에서, 링커 및 친화성 요소는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 구조를 갖는다:
일부 실시형태에서, 링커 및 친화성 요소는 구조 (I(c))를 갖는다.
일부 실시형태에서, 어댑터 서열은 프라이머 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프라이머 서열은 A14 또는 B15 프라이머 서열이다. 일부 실시형태에서, 프라이머 서열은 P5 프라이머 서열 또는 P7 프라이머 서열이다. 일부 실시형태에서, 트랜스포사제는 이량체인데, 각각의 단량체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 어댑터 서열을 갖는 트랜스포존 듀플렉스에 결합되어 있고, 여기서 각각의 단량체 내의 어댑터 서열은 동일하다. 트랜스포사제가 이량체인 실시형태에서, 단량체 중 하나 또는 둘 모두는 트랜스포좀 복합체를 고체 지지체에 연결하는 링커를 포함한다. 각각의 단량체는 어댑터 서열을 갖는 제1 트랜스포존을 포함한다.
고체 지지체
용어 "고체 표면", "고체 지지체", 및 다른 문법적 등가물은 트랜스포좀 복합체의 부착에 적절하거나 또는 적절하도록 변형될 수 있는 임의의 물질을 지칭한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 인식될 바와 같이, 가능한 기재의 수는 다수이다. 가능한 기재는 유리 및 변형되거나 작용화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스타이렌 및 스타이렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, TEFLON 등), 다당류, 나일론 또는 나이트로셀룰로스, 세라믹, 수지, 실리카 또는 실리카-기반 물질, 예컨대, 규소 및 변형된 규소, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 광학 섬유 번들, 비드, 상자성 비드, 및 다양한 다른 중합체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 이러한 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 링커를 통해서 고체 지지체 상에 고정되어 있다. 일부 추가의 실시형태에서, 고체 지지체는 관, 플레이트의 웰, 슬라이드, 비드, 또는 유동 셀, 또는 이들의 조합물이거나 또는 이들을 포함한다. 일부 추가의 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이거나 이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 비드는 상자성 비드이다.
본 명세서에 제시된 방법 및 조성물에서, 트랜스포좀 복합체는 고체 지지체에 고정되어 있다. 다른 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이다. 적합한 비드 조성물은 플라스틱, 세라믹, 유리, 폴리스타이렌, 메틸스타이렌, 아크릴 중합체, 상자성 물질, 토리아 졸(thoria sol), 탄소 흑연, 이산화티타늄, 라텍스 또는 가교-연결된 덱스트란, 예컨대, 세파로스(Sepharose), 셀룰로스, 나일론, 가교-연결된 마이셀 및 TEFLON, 뿐만 아니라 고체 지지체에 대해서 본 명세서에 개략된 임의의 다른 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 미소구체는 자성 미소구체 또는 비드, 예를 들어 상자성 입자, 구체 또는 비드이다. 비드는 구체일 필요는 없고; 불규칙 입자가 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 비드는 다공성일 수 있다. 비드 크기는 나노미터, 예를 들어, 100㎚, 내지 밀리미터, 예를 들어, 1㎜ 범위이고, 약 0.2마이크로미터 내지 약 200마이크로미터의 비드가 바람직하고, 약 0.5 내지 약 5마이크로미터가 특별하게 바람직하지만, 일부 실시형태에서 더 작거나 더 큰 비드가 사용될 수 있다. 비드는 친화성 결합 파트너로 코팅될 수 있고, 예를 들어 비드는 스트렙타비딘 코팅될 수 있다. 일부 실시형태에서 비드는 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드, 예를 들어, 디나비즈 마이원(Dynabeads MyOne) 스트렙타비딘 C1 비드(써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 카탈로그 # 65601), 스트렙타비딘 마그네스피어 상자성 입자(Streptavidin MagneSphere Paramagnetic particle)(프로메가(Promega) 카탈로그 #Z5481), 스트렙타비딘 자성 비드(NEB 카탈로그 # S1420S) 및 맥스비드(MaxBead) 스트렙타비딘(압노바(Abnova) 카탈로그 # U0087)이다. 고체 지지체는 또한 슬라이드, 예를 들어 트랜스포좀 복합체가 상부에 고정될 수 있도록 변형된 유동 셀 또는 다른 슬라이드일 수 있다.
일부 실시형태에서, 친화성 결합 파트너는 1000 내지 약 6000p㏖/㎎, 또는 약 2000 내지 약 5000p㏖/㎎, 또는 약 3000 내지 약 5000p㏖/㎎, 또는 약 3500 내지 약 4500p㏖/㎎의 밀도로 고체 지지체 또는 비드 상에 존재한다.
다른 실시형태에서, 고체 표면은 샘플 관의 내부 표면이다. 일례에서, 샘플 관은 PCR 관이다. 또 다른 실시형태에서, 고체 표면은 포획막이다. 일례에서, 포획막은 바이오틴-포획막(예를 들어, 프로메가 코퍼레이션으로부터 입수 가능함)이다. 또 다른 예에서, 포획막은 여과지이다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, 고체 지지체는 예를 들어, 분자, 예컨대, 폴리뉴클레오타이드에 대한 공유 부착을 허용하는 반응성 기를 포함하는 중간체 물질의 층 또느느 코팅의 적용에 의해서, 작용되된 불활성 기재 또는 매트릭스(예를 들어, 유리 슬라이드, 중합체 비드 등)로 구성된다. 이러한 지지체의 예는 불활성 기재, 예컨대 유리 상에 지지된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤, 특별하게는 국제 특허 제WO2005/065814 및 US2008/0280773호(이들의 내용은 이들의 전문이 본 명세서에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 태그먼트화된 DNA 라이브러리의 작제를 위해서 DNA를 고체 표면 상에 태그먼트화(단편화 및 태그화)시키기 위한 방법은 국제 특허 제WO2016/189331호 및 제US2014/0093916A1호(이것은 본 명세서에 이들의 전문이 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
본 개시내용의 일부 추가 실시형태는 본 명세서에 기술된 바와 같이 상부에 고정된 트랜스포좀 복합체를 포함하는 고체 지지체에 관한 것이며, 여기서 링커 및 친화성 요소는 본 명세서에 기술된 바와 같이 화학식 (I), (I'), (Ia), (Ib), (Ic), (I(a)), (I(b)) 또는 (I(c))의 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 트랜스포좀 복합체는 친화성 요소를 통해서 고체 지지체에 고정된다. 일부 이러한 실시형태에서, 고체 지지체는 친화성 결합 파트너로서 스트렙타비딘을 포함하고, 친화성 요소는 바이오틴이다. 일부 추가 실시형태에서, 고체 지지체는 비드이거나 이를 포함한다. 다른 실시형태에서, 비드는 상자성 비드이다.
일부 실시형태에서, 트랜스포좀 복합체는 특정 밀도 또는 밀도 범위로 고체 지지체, 예컨대, 비드 상에 고정된다. 비드 상의 복합체의 밀도는 그 용어가 본 명세서에서 사용된 바와 같이 고정화 반응 동안 용액 중의 트랜스포좀 복합체의 농도를 지칭한다. 복합체 밀도는 고정화 반응이 정량적이라고 가정한다. 복합체가 특정 밀도로 형성되면, 그 밀도는 표면-결합된 트랜스포좀 복합체의 배취에 대해서 일정하게 유지된다. 생성된 비드를 희석할 수 있고, 희석된 용액 중의 복합체의 생성된 농도는 비드에 대해서 제조된 밀도를 희석 배수에 의해서 나눈 것이다. 희석된 비드 스톡은 이의 제조로부터 복합체 밀도를 유지하지만, 그 복합체는 희석된 용액 중에서 더 낮은 농도로 존재한다. 희석 단계는 비드 상의 복합체의 밀도를 변화시키지 않고, 따라서 삽입물(단편) 크기가 아니라 라이브러리 수율에 영향을 준다. 일부 실시형태에서, 밀도는 약 5nM 내지 약 1000nM, 또는 약 5 내지 150nM, 또는 약 10nM 내지 800nM이다. 다른 실시형태에서, 밀도는 약 10nM, 또는 약 25nM, 또는 약 50nM, 또는 약 100nM, 또는 약 200nM, 또는 약 300nM, 또는 약 400nM, 또는 약 500nM, 또는 약 600nM, 또는 약 700nM, 또는 약 800nM, 또는 약 900nM, 또는 약 1000nM이다. 일부 실시형태에서, 밀도는 약 100nM이다. 일부 실시형태에서, 밀도는 약 300nM이다. 일부 실시형태에서, 밀도는 약 600nM이다. 일부 실시형태에서, 밀도 는 약 800nM이다. 일부 실시형태에서, 밀도는 약 100nM이다. 일부 실시형태에서, 밀도는 약 1000nM이다.
일부 실시형태에서, 고체 지지체는 비드 또는 상자성 비드이고, 각각의 비드에 결합된 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 또는 60,000개 초과의 트랜스포좀 복합체가 존재한다.
고체 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체의 상이한 밀도는 상이한 길이(예를 들어, 상이한 삽입물 크기)의 단편을 생성한다. 예를 들어, 도 7A, 7B, 및 7C에 나타낸 바와 같이, 복합체 밀도의 변경은 삽입물 크기의 변경으로 이어진다. 삽입물 크기는 약 50bp 내지 약 1000bp, 또는 약 100 내지 약 600bp, 또는 약 175 내지 약 200bp, 또는 약 500bp일 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오타이드 및 고정된 트랜스포좀 복합체의 제조 방법
본 개시내용은 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오타이드, 트랜스포좀 복합체, 및 고체 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체의 제조 방법을 추가로 제공한다. 일부 양상에서, 이러한 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이 트랜스포사제를 복합체를 형성하기에 적합한 조건 하에서 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존으로 처리하는 단계를 포함한다. 고체 지지체-결합된 트랜스포좀 복합체의 제조 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 트랜스포좀 복합체를, 친화성 요소를 (공유적으로 또는 비공유적으로) 친화성 결합 파트너와 결합시키기에 충분한 조건 하에서 친화성 결합 파트너를 포함하는 고체 지지체와 함께 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태는 변형된 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법이다. 일부 양상에서, 친화성 요소에 연결된 링커를 갖는 변형된 올리고뉴클레오타이드의 제조 방법은 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 본 명세서에서 고려되는 특정 방법은 제1 반응성 작용기(L-FG1)를 포함하는 링커(또는 절단 가능한 링커) 시약을 제2 반응성 작용기(N-FG2)를 포함하는 뉴클레오타이드와 반응시키는 단계를 포함하는데, 이에 의해서 제1 반응성 작용기와 제2 반응성 작용기가 반응하여 링커와 뉴클레오타이드 사이에 공유 결합(CB)을 갖는 링커-뉴클레오타이드 생성물(L-(CB)-N)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 링커 시약은 AE 모이어티(AE-링커-FG1)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커 시약은 링커 구조의 일부를 포함하고, AE는 제2 커플링 반응을 통해서 설치되어 완전 AE-링커 구조를 생성시킨다.
제1 반응성 작용기는 예를 들어, 카복실, 활성화된 카복실(예컨대, 에스터, NHS 에스터, 아실 할라이드, 무수물 등), 아지도, 알카인, 폼일, 또는 아미노일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 반응성 작용기는 활성화된 카복실, 바람직하게는 NHS 에스터이다.
제2 반응성 작용기는 뉴클레오타이드 상의 임의의 적합한 위치에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 반응성 작용기는 자연 치환기 대신에, 또는 테더, 예컨대, 알킬렌 또는 헤테로알킬렌기, 또는 뉴클레오타이드 하이드록실의 경우에는 포스페이트기를 통해서 이에 첨부된 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실 위치 또는 5' 포스페이트 위치에 존재한다. 일부 실시형태에서, 제2 반응성 작용기는 C2-10-알킬아미노기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 반응성 작용기는 헥실아미노기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 반응성 작용기는 -OP(O)3-(CH2)6-NH2이다. 일부 실시형태에서, 제2 반응성 작용기는 포스페이트 테더를 통해서 뉴클레오타이드의 3' 하이드록실을 통해서 뉴클레오타이드에 연결된다.
변형된 뉴클레오타이드는 링커에 부착하기 전에 올리고뉴클레오타이드의 부분일 수 있는데, 이 경우 뉴클레오타이드는 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부에 존재할 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오타이드에 먼저 부착되고, 변형된 뉴클레오타이드는 표준 수단에 의해서 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 데 출발 물질로서 사용된다.
일부 실시형태에서, 화학식 (I)의 링커는 뉴클레오타이드, 예컨대, 사이티딘의 3' 위치에 연결된다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오타이드의 제조 방법은 화학식 (II)의 화합물을 화학식 (III)의 화합물과 반응시켜 [화학식 (I)]-뉴클레오타이드의 화합물을 형성하는 단계를 포함한다:
식 중, AE, Y, n, X2, Ra, 및 Z는 본 명세서에 정의된 바와 같고;
-C(O)X3은 활성화된 에스터, 예컨대, 에스터, 아실 할라이드, 에스터 무수물, 또는 NHS 에스터이고;
X4는 -OH 또는 -NH2기이다.
일부 실시형태에서, 화학식 (II)의 화합물은 AE-(CH2)4C(O)-O-NHS이고, 화학식 (III)의 화합물은 H2N-(CH2)6-OP(O)(O-)O-뉴클레오타이드이고, 생성물은 AE-(CH2)4C(O)-NH-(CH2)6-OP(O)(O-)O-뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 포스페이트는 뉴클레오타이드, 예컨대, 사이티딘의 3' 하이드록실기에서 연결된다. 일부 실시형태에서, [화학식 (I)]-뉴클레오타이드(또는 AE-(CH2)4C(O)-NH-(CH2)6-OP(O)(O-)O-뉴클레오타이드)의 화합물을 추가 뉴클레오타이드와 반응시켜 [화학식 (I)]-올리고뉴클레오타이드(또는 AE-(CH2)4C(O)-NH-(CH2)6-OP(O)(O-)O-올리고뉴클레오타이드)를 형성한다. 일부 실시형태에서, 제2 트랜스포존은 [화학식 (I)]-올리고뉴클레오타이드(또는 AE-(CH2)4C(O)-NH-(CH2)6-OP(O)(O-)O-올리고뉴클레오타이드)이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 기술된 변형된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 트랜스포좀 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 본 명세서에 정의된 바와 같은, 트랜스포사제, 제1 트랜스포존, 및 제2 트랜스포존을 혼합하여(여기서 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존 단부 서열은 서로에 어닐링됨) 트랜스포좀 복합체를 형성하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존 중 하나는 친화성 요소를 포함한다(제1 트랜스포존의 경우에는 5' 단부에서; 제2 트랜스포존의 경우에는 3' 단부에서). 일부 실시형태에서, 방법은 친화성 요소를, 친화성 결합 파트너를 포함하는 고체 지지체에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 결합은 트랜스포좀 복합체의 형성 전 또는 후에 수행될 수 있다.
서열결정 단편의 제조 - 태그화된 단편의 증폭
일부 양상에서 표적 핵산으로부터 서열결정 단편을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이 상부에 고정된 본 명세서에 기술된 트랜스포좀 복합체를 포함하는 고체 지지체를 제공하는 단계; 고체 지지체를, 표적 핵산을 단편화시키고 제1 트랜스포존을 단편의 5' 단부에 결찰시키기 위한 조건 하에서 표적 핵산과 접촉시킴으로써 단편이 고체 지지체 상에 고정되게 하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, 방법은 단편화된 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단편 조건은 표적 핵산을 단편화 및 태그화시키기 위해서 트랜스포좀 복합체를 사용함으로써 태그먼트화에 적합한 조건이다.
본 명세서에 기술된 방법의 일부 실시형태에서, 단편화 및 태그화 이후에, 방법은 5' 태그화된 표적 단편으로부터 트랜스포사제를 제거하여 비-복합체화된 5' 태그화된 표적 단편을 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 트랜스포사제의 제거는 화학적 조건 하에서, 예컨대, 변성제, 예컨대 소듐 도데실 설페이트(SDS)로의 처리로 성취될 수 있다. 이러한 방법은 5' 태그화된 표적 단편의 완전히 듀플렉싱된 버전을 생성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 완전 듀플렉스를 생성시키는 단계는 5' 태그화된 표적 단편으로부터 어닐링된(그러나 결찰되지 않음) 제2 트랜스포존(AE-링커-제2 트랜스포존)을 제거하는 단계 및 5' 태그화된 표적 단편을 연장시켜 완전히 듀플렉싱된 5' 태그화된 표적 단편을 생성시키는 단계를 포함할 수 있다. 생성시키는 단계는, 예를 들어, 비-복합체화된 5' 태그화된 표적 단편을 제2 트랜스포존을 선택적으로 변성시키기에 충분한 온도까지 가열하여, 단편의 남아있는 듀플렉스 영역을 무손상 상태로 유지되게 함으로써 달성될 수 있다. 연장시키는 단계는 dNTP 및 적합한 중합효소의 존재 하에서 성취될 수 있다. 대안적으로, 생성시키는 단계는, 비-복합체화된 5' 태그화된 표적 단편을 단일 뉴클레오타이드(dNTP) 및 중합효소의 존재 하에서 인큐베이션킴으로써 하나의 반응으로 성취될 수 있다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션시키는 단계는 어닐링된 제2 트랜스포존을 변성시키고, 남아있는 듀플렉스를 연장시키기에 충분한 하나 이상의 온도에서 가열하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 중합효소는 가닥-이동 중합효소인데, 이것은 제2 트랜스포존을 제거하고, 남아있는 듀플렉스를 연장시켜 완전히 듀플렉싱된 5' 태그화된 표적 단편을 생성하는 작용을 한다. 적합한 중합효소는 KAPA HiFi, Pfu, 및 유사한 효소를 포함한다. 적합한 중합효소는 가닥-이동 중합효소, 예컨대, Bst, Bsu Vent, Klenow, 및 유사한 효소를 포함한다.
일부 양상에서, 방법은 완전히 듀플렉싱된 5' 태그화된 표적 단편을 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 증폭시키는 단계는 임의의 적합한 증폭 방법, 예컨대, 중합효소 쇄 반응(PCR), 롤링 서클 증폭(RCA), 또는 다중 전위 증폭(MDA)에 의해서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 증폭시키는 단계는 PCR에 의해서 수행된다. 일부 실시형태에서, 증폭시키는 단계 및 연장시키는 단계는 중합효소의 존재 하에 dNTP와의 반응에 의해서, 하나의 반응 단계로 수행된다.
일부 실시형태에서, 증폭시키는 단계는 완전히 듀플렉싱된 5' 태그화된 표적 단편에 하나 이상의 2차 어댑터 서열을 첨가하여 서열결정 단편을 형성하기 위해서 제공된다. 증폭시키는 단계는 각각의 단부에서 프라이머 서열을 포함하는 완전히 듀플렉싱된 5' 태그화된 표적 단편을, 표적 단편을 증폭시키고 2차 어댑터 담체(또는 이의 보체)를 혼입시키기에 충분한 조건 하에서 2차 어댑터 담체, 단일 뉴클레오타이드, 및 중합효소와 함께 인큐베이션시킴으로써 성취되며, 여기서 2차 어댑터 담체는 프라이머 서열 및 2차 어댑터 서열에 대한 보체를 포함한다.
일부 실시형태에서, 2차 어댑터 담체는 프라이머 서열, 인덱스 서열, 바코드 서열, 정제 태그, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 어댑터 담체는 프라이머 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 어댑터 담체는 인덱스 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 어댑터 담체는 인덱스 서열 및 프라이머 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 완전히 듀플렉싱된 5' 태그화된 표적 단편은 각각의 단부에서 상이한 프라이머 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 각각의 2차 어댑터 담체는 2개의 프라이머 서열 중 하나에 대한 보체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2개의 프라이머 서열은 A14 프라이머 서열 및 B15 프라이머 서열이다.
일부 실시형태에서, 복수의 2차 어댑터는 증폭에 의해서 첨가된다. 일부 실시형태에서, 2차 어댑터 담체 각각은 2개의 프라이머 서열 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 어댑터 담체 각각은 복수의 인덱스 서열 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 2차 어댑터 담체는 P5 프라이머 서열을 갖는 2차 어댑터 및 P7 프라이머 서열을 갖는 2차 어댑터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열결정 단편은 유동 셀 상에 침착된다. 일부 실시형태에서, 서열결정 단편은 유동 셀 또는 표면에 그래프팅된 상보성 프라이머에 혼성화된다. 일부 실시형태에서, 서열결정 단편의 서열은 어레이 서열결정 또는 차세대 서열결정 방법, 예컨대 합성에 의한 서열결정(sequencing-by-synthesis)에 의해서 검출된다.
P5 및 P7 프라이머가 다양한 일루미나 플랫폼 상에서의 서열결정을 위해서, 일루미나, 인크.에 의해서 판매되는 상업적인 유동 셀의 표면 상에서 사용된다. 프라이머 서열은 전문이 참고로 본 명세서에 포함된 미국 특허 공개 제2011/0059865 A1호에 기술되어 있다. 5' 단부에서 말단화된 알카인일 수 있는 P5 및 P7 프라이머의 예는 하기 및 이의 유도체를 포함한다:
일부 예에서, P7 서열은 G* 위치에서 변형된 구아닌, 예를 들어, 8-옥소-구아닌을 포함한다. 다른 예에서, *은 G*과 인접한 3' A 간의 결합이 포스포로티오에이트 결합이라는 것을 나타낸다. 일부 예에서, P5 및/또는 P7 프라이머는 비자연 링커를 포함한다. 임의로, P5 프라이머 및 P7 프라이머 중 하나 또는 둘 모두눈 폴리 T 테일을 포함할 수 있다. 폴리 T 테일은 상기에 나타낸 서열의 5' 단부에, 예를 들어, 5' 염기와 말단 알카인 단위 사이에 일반적으로 위치되지만, 몇몇 경우에는 3' 단부에 위치될 수 있다. 폴리 T 서열은 임의의 수, 예를 들어, 2 내지 20개의 T 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. P5 프라이머 및 P7 프라이머는 예로서 제공되지면, 임의의 적합한 증폭 프라이머가 본 명세서에 제공된 예에서 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
일부 실시형태에서, 방법의 증폭시키는 단계는 PCR 또는 등온 증폭을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법의 증폭시키는 단계는 PCR을 포함한다.
도면의 설명
도 1은 트랜스포좀 복합체를 제조하고, 이것을 제1 트랜스포존의 5' 단부에 연결된 친화성 요소를 통해서 고체 표면(예컨대, 비드)에 부착하는 방법의 예시적인 단계를 도시한다. 이러한 예에서, 어닐링된 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존의 2개의 집단(130a 및 130b)(트랜스포존 단부 서열을 포함하는 어닐링된 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 포함하는 올리고뉴클레오타이드)이 존재하며, 여기서 각각의 집단에서 제1 트랜스포존은 5' 단부에서 2개의 어댑터 서열 중 하나 및 친화성 요소(110, 여기서 *은 친화성 요소를 나타냄), 예컨대, 바이오틴을 포함한다. 예를 들어, 2개의 어댑터 서열(예를 들어, 프라이머 서열 예컨대, A14 및 B15)을 포함하는 복수의 바이오틴일화된 제1 트랜스포존 및 제2 트랜스포존이 생성된다. 도시된 바와 같이, 템플레이트 핵산으로 이송될 듀플렉스 트랜스포존 서열의 가닥은 제1 트랜스포존인데, 이것은 친화성 요소(예를 들어, 바이오틴)를 갖는다. 단계(115)에서, 올리고뉴클레오타이드의 각각의 집단(130a 및 130b)은 전형적으로는 별개의 반응으로, 트랜스포사제 단량체, 예컨대, Tn5(135)와 복합체화되어, 각각 상이한 어댑터 서열(예를 들어, 프라이머 서열 예컨대, A14 and B15)을 갖는 트랜스포좀 복합체(140)의 2개의 개별 집단을 생성한다. 복합체의 2개의 집단이 형성된 후, 이것은 이러한 예에서 기재, 비드 상에 고정된다(120). 일부 실시형태에서, 2개의 집단은 고정화 이전에 조합되어, 각각의 집단으로부터 복합체를 포함하는 고체 표면 또는 비드를 생성한다. 다른 실시형태에서, 2개의 집단은 별개로 고정되어, 각각 2개의 복합체 유형 중 하나를 포함하는 2개의 고체 표면 또는 비드를 생성한다. 트랜스포좀 복합체 형성 이후에, 트랜스포좀(140)은 친화성 결합 파트너, 예컨대, 스트렙타비딘으로 코팅된 표면(145)에 결합된다.
도 2는 본 명세서에 기술된 5' 링커 전략을 사용한 트랜스포좀의 고정화 이후에 비드 표면 상에서의 태그먼트화 및 라이브러리 제조 공정(200)을 예시한다. 공정(200)에는 트랜스포좀(140)이 상부에 결합된 비드(205)가 도시되어 있다. DNA(210)가 비드의 샘플에 첨가된다. DNA(210)가 트랜스포좀(140)과 접촉할 때, DNA는 태그먼트화(단편화 및 태그화)되어 트랜스포좀(140)을 통해서 비드(205)에 결합된다. 결합되고, 태그먼트화된 DNA는 PCR 증폭되어 비드-무함유 앰플리콘(215)의 풀을 생성시킬 수 있다. PCR 단계를 사용하여 2차 어댑터 서열, 예컨대, 프라이머 서열(예를 들어, P5 및 P7)을 혼입할 수 있다. 앰플리콘(215)은 예를 들어, 유동 셀 표면 상의 상보성 프라이머에 대한 그래프팅에 의해서 또는 이것에 대한 혼성화에 의해서 유동 셀(220)의 표면으로 이송될 수 있다. 클러스터 생성 프로토콜(예를 들어, 브릿지 증폭 프로토콜 또는 클러스터 생성을 위해서 사용될 수 있는 임의의 다른 증폭 프로토콜)을 사용하여 유동 셀의 표면 상에 복수의 클러스터(225)를 생성시킬 수 있다. 클러스터는 태그먼트화된 DNA의 클론성 증폭 산물이다. 클러스터는 이제 서열결정 프로토콜에서 다음 단계를 위해서 즉시 사용된다. 비드 표면 상에서의 태그먼트화 공정의 예는 전문이 참고로 포함된 PCT 공개 제WO2016/189331호에 상세하게 기술되어 있다.
도 3은 5' 연결된 트랜스포좀 복합체를 사용하는 경우 일어날 수 있는 사건을 도시한다. 단계(300)은 게놈 DNA(315)와 함께 비드(305) 상에 고정된 트랜스포좀 복합체(140)의 태그먼트화 공정, 그 다음 비-표적 핵산의 포획을 포함하는 후속 증폭 및 표적 풍부화를 도식적으로 도시한다. 태그먼트화된 게놈 DNA의 고정된 라이브러리를 (310)에 도시한다. 상부에 태그먼트화된 DNA를 갖는 스트렙타비딘-코팅된 포획 비드를 예를 들어, 5% SDS, 100mM 트리스-HCl pH7.5. 100mM NaCl, 및 0.1% 트윈(Tween) 20을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 세척하여(320), 트랜스포좀 복합체로부터 트랜스포사제를 변성시킬 수 있다. 이어서 세척 단계 이후에 스트렙타비딘 코팅된 상자성 입자(예를 들어, 비드)의 자성 포획을 통해서 상청액을 제거할 수 있고, 고정된 태그먼트화된 라이브러리를 포함하는 포획 비드를 보유할 수 있고, 100mM 트리스-HCl pH7.5. 100mM NaCl, 0.1% 트윈 20을 사용하여 추가로 세척할 수 있다. 결합된 올리고뉴클레오타이드를 (330)에서 연장시켜 완전 상보성을 갖는 결합된 듀플렉스를 형성한다.
(340)에서, 열 사이클링 통해서 표적 증폭을 진행시켜 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해서 태그먼트화된 DNA를 증폭시킨다. 예를 들어, 효율적인 증폭을 위해서 필요한 PCR 시약(예를 들어, 최소한 PCR 완충액, 데옥시-뉴클레오타이드, 2가 양이온 및 DNA 중합효소를 포함하는 혼합물) 및 첨가제의 용액을 비드-함유 용액에 첨가할 수 있고, 포획 비드에 결합된 태그먼트화된 DNA를 통상의 기술자에게 공지된 방법인, 열 사이클링(예를 들어, 10회 열 사이클)에 의해서 증폭시킬 수 있다. (350)에서, 증폭된 태그먼트화된 DNA를 정제 칼럼(예를 들어, 지모(Zymo) 스핀 칼럼)을 사용하여 임의로 정제하고, 용리시킬 수 있다. 증폭된 태그먼트화된 DNA를 또한 SPRI 또는 앰퓨어(Ampure) XP 비드(베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 사용하여 임의로 정제할 수 있으며, 정제 방법은 본 개시내용에 대한 제한이 아니다.
단계(360)에서, 태그먼트화된 라이브러리를 NEXTERA 래피드 캡처 인리치먼트 프로토콜(Rapid Capture enrichment protocol)(일루미나)에 기술된 바와 같은 프로토콜 또는 임의의 다른 표적 포획 방법을 사용하여 풍부하게 할 수 있다. 라이브러리 프렙의 초기로부터의 바이오틴일화된 게놈 단편이 증폭후 혼합물(370)에 존재하고, 이것은 표적 풍부화 동안 전체 게놈 혼성화 프로브로서 제공된 바이오틴일화된 표적 프로브(380)와 경쟁할 수 있다. 이 단계에서 이러한 바이오틴일화된 게놈 단편의 존재는 풍부화의 효율을 훼손시킬 수 있다. 추가로, 중합효소 프라이밍 및 태그먼트화 반응에서 소모되지 않은 유리 바이오틴일화된 어댑터의 연장에 의해서 PCR 증폭 동안 바이오틴일화된 게놈 단편이 생성될 수 있어서, 표적 풍부화 단계에 추가적은 오프-타깃 포획 프로브를 첨가할 수 있다.
본 개시내용은 이러한 문제에 대한 몇몇 해결책을 제공한다. 본 명세서에 기술된 한 접근법에서, 하나 이상의 절단 가능한 링커가 제1 트랜스포존의 어댑터 서열과 친화성 요소 사이에 포함된다. 태그먼트화가 완결되고, 태그먼트화된 핵산이 증폭된 후, 절단 가능한 링커는 절단되어, 바이오틴일화된 부분을 방출시키고, 오프 타킷 포획을 최소화 또는 제거한다. 이러한 변형은 다른 비드-기반 태그먼트화 방법에 비해서 오프-타깃 포획을 극적으로 그리고 놀랍게 감소시키고, 풍부화를 개선시킨다. 두 번째로, 친화성 요소가 제2 트랜스포존의 3' 단부로 이동되고, 임의로 절단 가능한 링커를 통해서 부착된다.
도 4는 절단 가능한 링커를 사용하여 고체 표면 상에 고정된 트랜스포좀 복합체를 사용하여 DNA를 단편화 및 태그화하는 방법(400)의 단계를 도식적으로 도시한다. 도 4와 관련하여, 단계(410, 420, 430, 440, 및 450)는, 증폭후 혼합물(470) 중에 존재하는 바이오틴일화된 게놈 단편이 절단 가능한 링커(예를 들어, 하나 이상의 우라실을 포함하는 링커)을 함유하는 것을 제외하고는, 도 3(각각 310, 320, 330, 340, 및 350)에 대해서 기술된 바와 같다. 단계(460)에서, 바이오틴은 적절한 절단제를 사용하여 링커를 절단함으로써 게놈 단편으로부터 절단된다. 우라실 예의 경우에, 절단은 우라실 절단 효소(예를 들어, 에피센트레(Epicentre)로부터의 우라실 DNA 엑시젼 믹스(Uracil DNA Excision Mix), 예를 들어)를 사용하여 성취될 것이다. 풍부화 단계(480) 동안, 오프-타깃 게놈 단편은 더 이상 바이오틴일화되지 않기 때문에, 바이오틴일화된 표적 프로브(490)와 같이 포획되지 않는다. 이러한 방식에서, 이 방법은 절단 가능한 링커가 없는 5' 연결된 접근법과 비교하는 경우 오프-타깃 포획을 감소시키고, 표적 풍부화의 효율을 증가시킨다.
5' 단부에서 친화성 요소, 예컨대, 바이오틴을 포함하는 어댑터 서열을 사용한 비드-기반 태그먼트화 접근법을 도 5A에 도시한다. 간략하면, 어댑터 올리고뉴클레오타이드(501 및 502)의 2개의 유형의 5' 단부에서 친화성 요소를 사용하여 트랜스포좀의 2개의 집단을 표면에 부착한다(예를 들어, 하나는 A14 어댑터 서열을 갖고, 하나는 B15 어댑터 서열을 가짐). ME 및 ME'는 트랜스포존 단부 서열이다. 태그먼트화 사건은 표적 핵산, 예컨대, 게놈 DNA으로부터 5' 태그화된 단편을 생성한다. 도시된 바와 같이 단편 중 일부는 하나의 가닥의 5' 단부에서 A14를 포함하고, 단편의 나머지 가닥의 5' 단부에서 B15를 포함한다. 단편은 임의로, 2차 어댑터 담체의 존재 하에서, 증폭, 예컨대, PCR에 의해서 연장 및/또는 반응되어, 완전 듀플렉스 또는 앰플리콘(임의로 2차 어댑터(예를 들어, 하단 이미지에 나타낸 바와 같은 프라이머 서열, 예컨대, P5 및 P7 및/또는 인덱스 서열 )를 포함함)을 제조한다. 바이오틴/스트렙타비딘이 사용되는 경우, 친화성 결합은 PCR 동안 파괴되어, 용액 중에 바이오틴일화된 단편 앰플리콘이 남는데, 이것은 후속 풍부화 노력을 복잡하게 할 수 있다. 대안적으로, 도 5B에서, 친화성 요소 및 링커의 부착이 제2 트랜스포존 상에서 3' 위치로 변화된다. 이 경우, 친화성 요소 및 링커는 상보성 트랜스포존 단부 서열(503)(ME' 서열)의 3' 단부에 부착된다. 이러한 구성에서, 제1 트랜스포존(501 및 502)은 친화성 요소를 포함하지 않는다. 이러한 공정을 사용하면, 태그먼트화 사건이 비-표지 단편화된 게놈 DNA를 생성하는데, 이는 제1 트랜스포존(이것은 친화성 요소가 결핍됨)이 단편으로 이송되고, 친화성 요소는 제1 트랜스포존에 대한 제2 트랜스포존의 혼성화에 의해서만 연결되기 때문이다. 어댑터 서열 A14-ME, ME, B15-ME, ME', A14, B15, 및 ME를 하기에 제공한다:
표적 핵산
표적 핵산은 DNA, RNA, cDNA 등을 포함하는 임의의 유형일 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 정제된 핵산을 비롯한, 다양한 정제 상태로 존재할 수 있다. 그러나, 핵산은 완전히 정제될 필요가 없거나 전혀 정제될 필요가 없고, 생물학적 샘플, 예를 들어, 원 샘플(raw sample) 용해물, 체액, 혈액, 혈장, 또는 혈청의 부분일 수 있거나, 또는 단백질, 다른 핵산 종, 다른 핵산 구성요소 및/또는 임의의 다른 오염물과 달리 혼합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생체내에서 발견되는 것과 대략 동일한 비율로 존재하는, 핵산(예컨대, DNA), 단백질, 다른 핵산 종, 다른 세포 구성요소, 및/또는 임의의 다른 오염물의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 구성요소는 무손상 세포에서 발견되는 것과 동일한 비율로 발견된다. 본 명세서에 제공된 방법은 핵산 또는 DNA가 태그먼트화 공정을 통해서 고체 지지체에 결합하는 것을 가능하게 하기 때문에, 다른 오염물은 태그먼트화가 일어난 후 고체 지지체를 세척함으로써 제거될 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어, 조 세포 용해물 또는 전체 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 언급된 방법에서 고체 지지체에 적용된 조 세포 용해물은 다른 세포 구성요소로부터 핵산을 단리하는 데 전통적으로 사용되는 분리 단계 중 하나 이상에 적용될 필요가 없다.
따라서, 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 임의의 공급원으로부터의 정제된 핵산뿐만 아니라, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 점액, 객담, 소변, 정액, 뇌척수액, 기관지 흡인물, 대변, 및 침연된 조직, 또는 이의 용해물, 또는 핵산 또는 DNA 물질을 포함하는 임의의 다른 생물학적 시편에서 발견되는 바와 같은 비정제된 핵산을 포함할 수 있다. 표적 핵산은 조직 샘플, 종양 샘플, 암 세포, 또는 생검 샘플로부터 유래될 수 있다.
표적 핵산은 종의 혼합물로부터의 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 포유동물(예컨대, 인간, 개, 고양이, 소, 돼지, 양 또는 다른 가축), 또는 다른 종, 예컨대, 어류, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 고세균으로부터 유래될 수 있다. 핵산은 환경 샘플, 예컨대, 토양 또는 물로부터 유래될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산은 DNA이다. 이러한 일 실시형태에서, DNA는 이중 가닥이다. 일부 추가 실시형태에서, 이중 가닥 DNA는 게놈 DNA를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 표적 핵산은 RNA 또는 이의 유도체, 또는 cDNA이다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플(원 샘플 또는 추출물)은 본 명세서에 기술된 태그먼트화 방법 이전에 표적 핵산을 정제하도록 가공된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 원 샘플 또는 원 샘플 용해물(예를 들어, 혈액 또는 타액)이다. 일부 실시형태에서, 처리 방법은 원 샘플, 원 샘플 용해물, 또는 가공전 샘플(예를 들어, 혈액 또는 타액 샘플)을 제공하는 단계, 샘플을 용해 완충액 및 프로테이나제 K와 혼합하는 단계, 혼합물을 인큐베이션시켜 샘플 중에서 세포를 용해시키는 단계, 및 세포로부터 DNA를 방출시켜, 본 명세서에 기술된 태그먼트화 방법을 위한 표적 핵산(들)을 제공하는 단계를 포함한다.
원 샘플 또는 원 샘플 용해물, 예컨대, 혈액 중의 구성요소, 또는 가공전 샘플, 예컨대, 오라젠(Oragene) 수집관에 수집된 타액 중의 첨가제는 태그먼트화 반응을 저해할 수 있다. 따라서, 본 명세서에는 이러한 문제를 해결하기 위한 원 샘플, 원 샘플 용해물, 또는 가공전 샘플을 처리하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 원 샘플, 원 샘플 용해물, 또는 가공전 샘플(예를 들어, 혈액 또는 타액 샘플)을 제공하는 단계, 샘플을 용해 완충액, 프로테이나제 K, 및 DNA 정제 비드(예를 들어, SPRI 비드, 카복실기를 포함하는 비드, 여기서 비드는 임의로 자성 비드임)와 혼합하는 단계, 혼합물을 인큐베이션시켜 샘플 중에서 세포를 용해시키는 단계, 및 세포로부터 DNA를 방출시켜 DNA 정제 또는 SPRI 비드 상에 DNA를 포획하는 단계, 및 혼합물로부터의 포획된 DNA를 포함하는 비드를 분리하는 단계를 포함한다. 분리하는 단계는 상청액 중에 존재하는 잠재적인 태그먼트화 저해제를 제거하기 위해서 제공된다. 방법은 포획된 DNA를 포함하는 비드를 세척하는 단계 및 비드로부터 DNA를 용리시켜 표적 핵산(들)을 제공하는 단계를 임의로 추가로 포함한다.
서열결정 방법
본 명세서에 제공된 방법 중 일부는 핵산을 분석하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 표적 핵산의 템플레이트 핵산의 라이브러리를 제조하는 단계, 템플레이트 핵산의 라이브러리로부터 서열 데이터를 수득하는 단계, 및 표적 핵산의 서열 표현을 조립하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 합성에 의한 서열결정(SBS)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 차세대 서열결정 워크플로에서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해서 생산된 핵산 라이브러리와 함께 사용하기 위해서 쉽게 개작될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템, 검출 플랫폼은 예를 들어, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], 국제 특허 제WO 04/018497호; 미국 특허 제US 7,057,026호; 국제 특허 제WO 91/06678호; 국제 특허 제WO 07/123744호; 미국 특허 제US 7,329,492호; 제US 7,211,414호; 제US 7,315,019호; 제US 7,405,281호, 및 제US 2008/0108082호에 기술되어 있고, 이들 각각은 참고로 본 명세서에 포함된다.
일부 SBS 실시형태는 뉴클레오타이드를 연장 생성물 내에 혼입할 때 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양상자의 검출을 기반으로 하는 서열결정은 이온 토런트(Ion Torrent)(미국 코네티컷주 길포드 소재, 라이프 테크놀로지스 자회사)로부터 상업적으로 입수 가능한 전기 검출기 및 연관된 기술 또는 미국 특허 제 US 2009/0026082 A1호; 제US 2009/0127589 A1호; 제US 2010/0137143 A1호; 또는 제US 2010/0282617 A1호(이들 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기술된 서열 결정 방법 및 시스템을 사용할 수 있다.
또 다른 유용한 서열결정 기술은 나노포어(nanopore) 서열결정이다(예를 들어, 문헌[Deamer et al. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer et al. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li et al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003)] 참고, 이들의 개시내용은 참고로 본 명세서에 포함됨). 본 명세서에 기술된 방법은 사용된 서열결정 장비의 임의의 특정 유형에 제한되지 않는다.
실시예
하기 실시예는 본 명세서에 제공된 본 개시내용을 기술하기 위해서 제공되지만, 이를 제한하지 않는다.
실시예 1: 효소적으로 절단 가능한 뉴클레오타이드를 갖는 링커를 사용한 고체 표면 상에서의 태그먼트화
올리고뉴클레오타이드의 2개의 세트(서열번호 9 내지 11(변형된 A14-ME) 중 임의의 하나 및 서열번호 12 내지 14(변형된 B15-ME) 중 임의의 하나로서 표현됨, 이들 둘 모두는 19 염기 모자이크 단부(ME) 서열(서열번호 8, 소문자로 나타냄)에 걸쳐서 염기 쌍을 이룸)를 상보성 모자이크 단부 서열(ME'; 서열번호 5)과 어닐링함으로써 트랜스포존을 형성하였다. 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 대한 후속 표면 결합이 가능하도록 서열번호 9 내지 서열번호 14로 표현된 올리고뉴클레오타이드를 5' 바이오틴일화하였다. 각각의 바이오틴일화된 올리고뉴클레오타이드 50μM를 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA, 및 25mM NaCl의 존재 하에서 50μM의 ME(서열번호 5)와 배합하고, 95℃에서 10분 동안 가열하고, 2시간 동안 실온까지 냉각시킴으로써 어닐링된 트랜스포존을 제조하였다. 이어서, 어닐링된 트랜스포존을 2μM 의 최종 농도에서 트랜스포사제 효소와 혼합하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
절단 가능한 뉴클레오타이드 모이어티를 갖는 절단 가능한 링커 서열의 예를 서열번호 9 내지 14에 제공한다. 서열번호 9 내지 14로 표지된 서열은 19 염기 모자이크 단부(ME) 서열(소문자로 나타냄) 및 판독물 1 및 판독물 2 서열 A14 및 B15(이탤릭체로 나타냄)를 포함한다. 서열번호 9 및 서열번호 12로 표지된 서열은 일련의 티민 잔기(볼드체) 이후에 3개의 우라실 뉴클레오타이드(밑줄)를 포함한다. 유사하게, 서열번호 10 및 서열번호 13으로 표지된 서열은 일련의 티민 잔기의 3개의 우라실 뉴클레오타이드 3'를 포함한다. 서열번호 11 및 서열번호 14는 일련의 티민 잔기 이후에 하나의 우라실 뉴클레오타이드를 함유한다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 티민 잔기는 절단 가능한 링커의 부분이고, 트랜스포존 및/또는 어댑터 서열의 5'에 존재하는 절단 가능한 모이어티에 바이오틴을 연결하기 위해서 제공된다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 1 내지 10개의 절단 가능한 우라실 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 적어도 하나의 절단 가능한 우라실 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 절단 가능한 우라실 뉴클레오타이드를 포함한다. 서열번호 8은 19 염기 모자이크 단부(ME) 서열이고, 서열번호 5는 이의 보체이다
트랜스포좀을 형성한 후, 트랜스포좀을 스트렙타비딘-코팅된 비드에 부착하였다. 이어서 비드를 HT1 완충액(일루미나) 중의 트랜스포좀의 희석된 용액으로 세척하였다. HT1은 비드에 대한 바이오틴-스트렙타비딘 결합을 위해서 필요한 높은 염을 함유한다. 혼합기 상에서 1시간 동안 혼합하면서 비드 및 트랜스포좀을을 인큐베이션시켰다. 혼합 후에, 비드를 15% 글리세롤 및 다른 완충제(예를 들어 트리스)를 함유하는 저장 완충액 중에 재현탁시켰다.
다음으로, 태그먼트화를 수행하였다. 예를 들어, 태그먼트화 용액을 고정된 트랜스포좀을 함유하는 샘플에 첨가하고, 55℃에서 약 15분 동안 인큐베이션시켰다. 태그먼트화 반응물은 DNA(예를 들어, 약 50pg 내지 5㎍의 DNA) 및 태그먼트화 완충액을 포함하였다. 일례에서, 태그먼트화 완충액은 태그먼트화 반응을 수행하는 데 필요한 구성요소를 포함하며, 예를 들어 완충액은 미국 특허 제9,080,211호, 제9,085,801호, 및 제9,115,396호(이들 각각은 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 10mM 트리스 아세테이트(pH 7.6), 5mM 마그네슘 아세테이트, 및 10% 다이메틸폼아마이드를 포함한다. 태그화된 DNA 단편의 고정된 라이브러리를 생성시켰다.
실시예 2: 태그먼트화 DNA의 PCR 증폭 및 효소적 절단
실시예 1에 기술된 바와 같이, 상부에 태그먼트화된 DNA를 갖는 스트렙타비딘-코팅된 포획 비드를, 5% SDS, 100mM 트리스-HCl(pH7.5), 100mM NaCl, 및 0.1% 트윈 20을 포함하는 세척 완충액을 사용하여 세척(예를 들어, 3회)하여, 트랜스포좀 복합체로부터의 트랜스포사제 효소를 변성시켰다. 세척 단계 이후에 스트렙타비딘-코팅된 상자성 입자(예를 들어, 비드)의 자성 포획을 통해서 상청액을 제거하고, 고정된 태그먼트화 라이브러리를 포함하는 비드를 보유시켰고, 100mM 트리스-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 및 0.1% 트윈 20을 사용하여 추가로 세척하였다.
예를 들어, NEM 믹스(NEXTERA 래피드 캡처(Rapid Capture) 키트, 일루미나)를 첨가하고, 72℃에서 3분 동안 인큐베이션시킴으로써 DNA 단편의 갭 충전(ME' 서열의 5' 단부와 단편의 3' 단부 사이의 갭을 충전하기 위해서)(예를 들어, 도 5B 참고)을 수행하였다.
써모사이클링을 통한 표적 증폭을 수행하여 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해서 태그먼트화된 DNA를 증폭시켰다. 효율적인 증폭을 위해서 필요한 PCR 시약(예를 들어, 최소한 PCR 완충액, 데옥시뉴클레오타이드, 2가 양이온 및 DNA 중합효소를 포함하는 마스터믹스(예를 들어, NEM 믹스(NEXTERA 래피드 캡처 키트, 일루미나)) 및 첨가제의 용액을 비드에 첨가하였고, 비드에 결합된 태그먼트화된 DNA를 열 사이클링(예를 들어, 10회 열 사이클)에 의해서 증폭시켰다.
증폭된 태그먼트화된 DNA를 함유하는 상청액을 반응 챔버로부터 꺼내고, 새로운 반응 챔버(예를 들어, 관, 웰 등)로 이송하였다. 증폭된 단편 혼합물을 절단 가능한 링커 내의 염기를 절단하는 1종 이상의 효소로 처리하였다. 다수의 공지된 뉴클레오타이드 골격-파괴 효소 중 임의의 하나를 사용하여 오프 타깃 산물을 소화시켜 게놈에 대한 오프 타킷 혼성화를 예방하였다. 적합한 효소의 예는 우라실 DNA 글리코실라제(UDG, 또한 UNG라 지칭됨), 폼아미도-피리미딘 DNA 글리코실라제(Fpg), RNAseH, 엔도 IV, 엔도 VIII, Klenow, 또는 아피라제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
증폭된 태그먼트화된 DNA를 SPRI 또는 앰퓨어 XP 비드(베크만 쿨)를 사용하여 정제할 수 있으며, 정제 방법은 본 개시내용에 대한 제한이 아니다. 태그먼트화된 라이브러리를 NEXTERA 래피드 캡처 인리치먼트 프로토콜(일루미나)에 기술된 바와 같은 프로토콜 또는 임의의 다른 표적 포획 방법을 사용하여 풍부하게 할 수 있다. 풍부해진 DNA 라이브러리는 이제 서열결정을 위해서 준비된 것이다.
실시예 3: 우라실을 함유하는 절단 가능한 링커의 효소적 절단을 사용한 판독물 풍부화
간략하면, 50ng의 NA12878 게놈 DNA(코리엘 인스티튜트(Coriell Institute))를 시험된 각각의 조건을 위해서 사용하였다. 대조군 반응으로서, DNA를 태그먼트화시키고, 제조사의 설명서에 따라서 NEXTERA 래피드 캡처 인리치먼트(일루미나) 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제조 및 풍부화시켰다. 우라실-함유 절단 가능한 링커 서열번호 9 및 서열번호 13을 사용하였다.
간략하면, 각각의 50㎕의 반응물은 5X 태그먼트화 완충액, 50ng DNA, 서열번호 9 및 서열번호 13에 기술된 절단 가능한 우라실 링커를 갖는 트랜스포좀-접합된 다이날(Dynal) 상자성 비드(라이프 테크놀로지스) 250nM, 5㎕를 함유하였다. 반응물을 55℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 그 다음 스탑 태그먼트(Stop Tagment: ST) 완충액 15㎕를 첨가하고, 이어서 실온에서 추가로 5분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 자석 상에 놓고, 상청액을 제거하였다. 비드를 50㎕ NEM(일루미나) 중에 재현탁시키고, 72℃에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 그 다음 10℃까지 냉각시켰다. 샘플을 자석 상에 놓고, 상청액을 제거하고, HT2 세척 완충액(일루미나) 중에서 세척하였다.
EPM 40㎕, 인덱스 프라이머 각각(예를 들어, P5'-인덱스-A14' 및 P7'-인덱스-B15') 10㎕ 및 물을 첨가함으로써 PCR 반응물을 제조하였다. 하기와 같이 PCR 증폭을 수행하였다: 3분 동안 72℃; 30초 동안 98℃ 그 다음 10초 동안 98℃의 10회 사이클; 30초 동안 65℃; 60초 동안 72℃. PCR 산물을 USER 효소 믹스(1U/㎕ - NEB 부분 번호 M5505L) 5㎕로 처리하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 그 다음 제조사의 설명서에 따라서 SPRI-기반(고체 상 가역적 고정화) 상자성 앰퓨어 XP 비드(베크만 쿨터 카탈로그 번호 A63880)을 사용하여 크기 선택하였다. 먼저, 100㎕의 USER-처리된 PCR 산물을 55㎕의 물 및 105㎕의 상자성 비드와 혼합하였다. 샘플을 자석에서 떨어뜨려서 5분 동안, 자석 상에서 5분 동안 정치시키고, 그 다음 상청액을 제2 크기 선택물(250㎕ 상청액 + 30㎕ 상자성 비드)로 제거하였다. 비드를 80% 에탄올 중에서 세척하고, 공기 건조시키고, 25㎕ RSB(일루미나) 중에 용리시켰다.
제조사의 설명서(일루미나)에서와 같이 NEXTERA 래피드 캡처 인리치먼트 키트의 프로토콜에 따라서 TruSight One 프로브 패널(일루미나)을 사용하여 USER 효소-처리되고, 크기-선택된 샘플의 풍부화를 수행하였다. 샘플을 제조사의 설명서(일루미나)에 따라서 HiSeq 2500 상에서 서열결정하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 기존의 용액 기반 태그먼트화 및 풍부화(예를 들어, NEXTERA 래피드 캡처)는 70% 판독물 풍부화를 초래하였다. 효소 절단 처리하지 않고 링커를 함유하는 우라실을 통해서 비드에 부착된 트랜스포좀을 사용하는 경우, 판독물 풍부화 %는 45%로 상당히 낮았다. 그러나, 링커 내의 우라실을 효소적 처리를 통해서 절단하는 경우, 풍부화는 67%까지 증가되었고, 이에 의해서 풍부화가 비-고정된 또는 용액 기반 태그먼트화 및 풍부화의 수준까지 회복된다.
실시예 4: 우라실 링커의 효소적 절단을 사용한 6-플렉스 및 12-플렉스 엑솜 풍부화, 및 우라실 링커의 효소적 절단을 사용하지 않은 6-플렉스 및 12-플렉스 엑솜 풍부화
하기 실시예는 효소적 절단을 사용하지 않은 2개의 티민 및 3개의 우라실(2T3U)의 링커 및 효소적 절단을 사용한 것(2T3U+ENZ)과 비교한, 5개의 티민(5T)의 링커를 사용한 엑솜 풍부화 실험을 TruSeq 래피드 엑솜 키트(일루미나)와 비교하여 나타낸다.
실험 절차는, 7.5㎕ 트랜스포좀 고정된 비드를 사용하고, 갭 충전 단계를 생략한 것을 제외하고는 실시예 3에 대해서 기술된 바와 같았다. TruSeq 래피드 엑솜 키트(일루미나)를 사용하여 풍부화를 수행하였다. 제조사의 설명서(일루미나)에 따라서 HiSeq 2500 상에서 서열결정을 수행하였다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 효소적 절단을 사용한 2T3U 링커 만이 TruSeq 래피드 엑솜 키트(일루미나)를 사용한 용액 기반 NEXTERA 또는 5T 잔기를 사용한 표준 표면 기반 태그먼트화와 대등한 풍부화 매트릭스를 나타내었다.
실시예 5: 5' 바이오틴일화된 어댑터 올리고뉴클레오타이드 방법 및 3' 바이오틴일화된 어댑터 올리고뉴클레오타이드 방법의 비교
특정 비드-기반 태그먼트화 접근법은 도 5A에 나타낸 바와 같이 5' 단부에서 바이오틴일화된 어댑터 서열을 사용한다. 간략하면, 5' 바이오틴일화된 어댑터 올리고뉴클레오타이드(501 및 502)는 트랜스포좀을 표면에 부착한다. 태그먼트화 사건을 5' 바이오틴일화된, 단편화된 전체 게놈 DNA를 생성하는데, 이것은 후속 풍부화 단계를 오염시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 도 5B에 도시된 바와 같이, 바이오틴의 부착을 상보성 가닥(제2 트랜스포존) 상에서 3' 위치로 변화시켜 트랜스포좀을 표면에 부착한다. 간략하면, 올리고뉴클레오타이드(501 및 502)는 바이오틴이 존재하지 않는다. 본 실시예에서, 바이오틴은 상보성 가닥(ME' 서열) 상의 트랜스포존 단부 서열(503)에 부착된다. 이러한 구성에서, 태그먼트화 사건은 바이오틴-무함유 게놈 DNA 단편을 생성한다.
추가의 또 다른 실시형태에서, 링커는 3' 올리고뉴클레오타이드(503)와 바이오틴 사이에 존재한다. 이것은 고체 표면 상에서 일어날 수 있는 전위 활성도에 대한 임의의 입체 장애를 감소시키는 것을 도울 수 있다.
하기 실시예는 서열결정 라이브러리의 제조 시에 화학식 (I(a))의 링커(글리세롤-유형 링커)를 갖는 3' 바이오틴일화된 올리고뉴클레오타이드를 사용한 것을 나타낸다. 대조군 반응으로서, DNA를 태그먼트화시키고, 제조사의 설명서(일루미나)에 따라서, NEXTERA 래피드 캡처 인리치먼트 프로토콜에 따라서 라이브러리를 제조 및 풍부화하였다. 태그먼트화된 증폭된 DNA를 제조사의 제안된 프로토콜에 따라서 엑솜 패널을 사용하는 엑스젠 락다운(Xgen Lockdown) 혼성화 포획 키트 프로토콜(인테그레이티드 DNA 테크놀로지스, IDT)을 사용하여 풍부화시킨 것을 제외하고는, 실시예 3에 기술된 실험 프로토콜에 따랐다. 기본적으로, 모두가 최적의 풍부화보다 낮게 관찰되었는데, 그 이유는 엑스젠 락다운 키트와 함께 공급된 제안된 만능 블로킹 올리고뉴클레오타이드에 대한 대체품으로서 차선 블로킹 올리고뉴클레오타이드를 사용하였기 때문이었다. 그러나, 실험의 초점은 최적의 블로킹 프로브를 요구하지 않으며, 실험의 초점은 단지 측정 가능한 변화를 관찰하는 능력이다. 이러한 차선 블로킹 올리고뉴클레오타이드는 실험의 초점에 영향을 주는 것으로 예측되지 않는다.
표 3에서 인지되는 바와 같이, 우라실 링커 + 효소 절단을 사용한 5' 바이오틴은 대조군 및 3' 바이오틴(링커가 있는 것 또는 없는 것)에 비해서 상당히 더 낮은 풍부화를 나타내었다. 우라실 링커 + 효소 절단 방법과 함께 5' 바이오틴을 사용한 경우 더 낮은 판독물 풍부화는 효소 믹스에 의한 불완전한 절단의 결과일 수 있다. 3' 연결부를 사용한 실험은 용액-기반 대조군에 대등한 판독물 풍부화를 달성함을 보여주었다.
실시예 6: 작은 삽입물(150 내지 200bp)을 위한 P 바이오틴일화된 비드의 제조
단계 1. 트랜스포존 어닐링
A14-ME 및 B15-ME 각각을 ME'-링커-바이오틴 올리고(하기에 논의된 바와 같이 제조)에 어닐링시켜, 2개의 이중 가닥복합체를 생성하였는데, 이들 모두는 트랜스포사제에 의해서 특이적으로 인식되는 모자이크 단부(ME) 및 2차 어댑터를 첨가하기 위해서 PCR에서 사용되는 A14 또는 B15 서열을 갖는다. A14-ME, B15-ME, 및 ME' 올리고를 200nM로 재현탁시켰다. 96-웰 PCR 플레이트에서, 하기 표 4에 나타낸 제제를 2개의 웰(1개의 웰은 A14:ME'용이고, 1개의 웰은 B15-ME'용임) 내에 첨가하였다. 웰 플레이트를 써모싸이클러에 95℃에서 10분 동안 넣고, 이어서 써모싸이클러로부터 꺼내고, 실온에서 2시간 동안 벤치 상에 놓았다.
단계 2. 트랜스포좀 형성
Tn5 트랜스포사제를 상기 어닐링된 트랜스포존에 첨가하여 A14-ME/ME'-링커-바이오틴 및 B15-ME/ME'-링커-바이오틴 복합체를 함유하는 트랜스포좀 복합체를 형성하였다. 상기 단계로부터 제조된 어닐링된 올리고를 사용하여 96-웰 PCR 플레이트에서 하기 반응을 설정하였다. A14-ME용으로 1개의 웰 및 B15-ME용으로 1개의 웰이 존재하였다. 각각의 웰을 써모싸이클러에서 밤새 37℃에서 인큐베이션시켜, 트랜스포좀 복합체의 2개의 집단을 제공하였고; 이어서 2개의 웰의 내용물을 함께 혼합하였다. 혼합 단계 후에, 약 220uL를 제거하고, 또 다른 웰에 첨가하였다. 표준 저장 완충액 약 220uL를 첨가하였다(총 440uL).
단계 3. 스트렙타비딘 비드 적재
바이오틴 링키지를 함유하는 상기에 형성된 트랜스포좀 복합체를 스트렙타비딘 비드에 첨가하였다. 비드 상의 복합체의 밀도를 조정하여 태그먼트화 산물에서 삽입물 크기를 제어할 수 있다. 스트렙타비딘 비드를 잘 혼합하였다. 스트렙타비딘 비드 약 200uL를 1.5㎖ 관에 넣고, 관 자석 상에 놓았다. 비드를 1㎖ HT1로 2회 세척하고, 이어서, 비드를 재현탁시키고, 세척 사이에 회전시켰다. 제2 세척 후, 비드를 600uL의 HT1을 사용하여 완전히 재현탁시켰다. 상기에 제조된 트랜스포좀 복합체 400uL을 HT1이 있는 관에 첨가하였다. 혼합물을 회전식 혼합기 상에서 1시간 동안 혼합하고, 자석 상에 놓고, 상청액을 제거하였다. 혼합물을 15% 표준 저장 완충액 500uL 중에 재현탁시켰다. 비드를 1000nM 트랜스포좀 복합체의 존재 하에서 적재하고, 생성된 1000nM 밀도 복합체를 용액 중의 400nM의 농도로 희석시키고, 저장하였다. 따라서, 스톡 용액은 400nM 농도로 희석된, 1000nM의 복합체 밀도를 갖는 비드를 포함하였다. 희석 단계는 비드 상의 복합체의 밀도를 변화시키지 않고, 스톡 용액 중의 복합체의 최종 농도 만을 변화시킨다.
단계 4. 태그먼트화
비드-적재된 트랜스포좀을 사용함으로써 DNA 샘플을 태그먼트화시켜 단편을 제조하여 절단하고, 트랜스포존 서열을 DNA 샘플에 첨가하였다. 96 웰 PCR 플레이트에서, 5x Mg 태그먼트화 완충액(10uL), DNA(50ng 초과; 10uL), dH2O(20uL), 및 트랜스포좀 비드(단계 3에서와 같이 제조됨; 10uL)를 배합하였다. 혼합물을 잘 혼합하고, 55℃에서 5분 동안, 그 다음 2분 동안 20℃에서 인큐베이션시켰다. SDS로의 처리에 의해서 트랜스포사제 효소를 불활성화시킴으로써 태그먼트화 공정을 중단시켰다. 10㎕의 SDS를 첨가하고, 상기 단계로부터의 반응 혼합물과 잘 혼합하였다. 이어서 혼합물을 실온에서 벤치 상에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 자석 교반기 상에 놓았다. 용액이 투명해지면, 상청액을 제거하였다.
단계 5. 태그먼트화 중단 세척
SDS를 비드로부터 세척하여 PCR을 위한 샘플을 제조하였다. 태그먼트화를 중단시킨 후 반응 혼합물을 자석으로부터 제거하고, 100uL의 세척 완충액을 첨가하였다. 샘플을 20초 동안 1600rpm에서 보텍싱하였다. 이어서 그것을 다시 자석 교반기 상에 놓고, 용액이 투명해지면, 상청액을 제거하였다. 세척 단계를 총 3회 반복하였다. 세척이 완결되면, 모든 상청액을 제거하고, 자석 교반기로부터 샘플을 제거하였다.
단계 6. PCR
단계 5로부터의 샘플을 A14 및 B15 및 첨가된 2차 어댑터를 인식하는 프라이머와 함께 PCR-증폭시켰다. 프라이머는 또한 인덱스 서열 및 서열결정 프라이머(P5 및 P7)를 포함한다. 표 6에 나타낸 마스터 믹스를 각각의 샘플 웰에 첨가하였다. 비드를 마스터 믹스 중에 재현탁시키고, 표 7에 나타낸 프로그램을 사용하는 써모싸이클러에 넣었다. 이 단계를 제공하여 비-이송된/바이오틴일화된 가닥을 제거하고, 연장시키고, 증폭시켜 P5 및 P7 모두를 하나의 공정으로 도입하였다.
샘플을 써모싸이클러로부터 꺼내고, 자석 교반기 상에 놓았다. 이어서, 45㎕의 샘플을 PCR 플레이트로부터 MIDI 플레이트로 옮겼다. 77uL의 물을 MIDI 플레이트 샘플에 첨가하고, 88㎕의 앰퓨어 SPRI 비드를 각각의 샘플/물에 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 자석 교반기에 놓았다. 용액이 투명해지면, 200㎕의 샘플을 동일한 MIDI 플레이트 상의 새로운 웰에 첨가하였다. 20㎕의 앰퓨어 SPRI 비드를 첨가하고, 샘플을 잘 혼합하고, 실온에서 5분 동안 정치시켰다. 이어서 그것을 자석 교반기 상에 다시 놓았다.
용액이 투명해지면, 상청액을 제거 및 폐기하였다. 플레이트를 자석 교반기 상에 정치시키고, 펠릿을 휘젓지 않으면서 200㎕의 80% 에탄올을 첨가하였다. 에탄올을 나중에 제거하였다. 에탄올 세척 단계를 추가로 총 2회 반복하였다. 세척을 완결한 후, 플레이트를 교반기 상에 놓아두면서, 임의의 과량의 에탄올을 피펫으로 제거하였다. 샘플을 실온에서 5분 동안 건조시켰다. 27㎕의 물을 첨가하고, 잘 혼합하였다. 샘플을 실온에서 2분 동안 정치시키고, 다시 자석 교반기 상에 놓았다. 25㎕의 샘플을 깨끗한 플레이트로 옮기고, -20℃에서 저장하였다.
실시예 7. A14-ME 및 B15-ME 트랜스포존
A14-ME 및 B15-ME 트랜스포존을 각각 3' 바이오틴을 함유하는 ME'에 어니링하였다. 3' 바이오틴을 ME'에 커플링시켜 3'-(I(a)) 및 3'-(I(c)) 링커를 형성하였다. 어닐링 반응은 NaCl 완충액을 사용하여 25㎕ 부피로 진행하였다. 생성된 이중 가닥 트랜스포존 각각을 밤새 반응으로 37℃에서 트랜스포사제와 복합체화시켰다. 트랜스포좀 복합체를 형성한 후, A14 및 B15 트랜스포좀 복합체를 함께 동일 부피로 혼합하고, 300nM의 농도로 스트렙타비딘 비드 상에 적재하여 300nM의 밀도로 결합된 복합체를 생성하였다. 비드에 부착한 후, (I(a)) 및 (I(c)) 300nM 밀도 혼합물을 120nM의 농도로 추가로 희석시켰다. 따라서, 비드는 여전히 300nM 밀도를 갖지만, 복합체는 희석된 용액 중에 120nM의 농도로 존재한다. 희석 단계는 비드 상의 복합체의 밀도를 변경하지 않기 때문에, 삽입물 크기가 아닌 라이브러리 수율에 영향을 미친다.
생성된 두 유형의 비드-연결된 트랜스포좀, 3'-(I(a)) 및 3'-(I(c))을 25℃에서 28일 및 56일 동안 저장하였다. 아레니우스식(Arrhenius equation)은 이것이 4(28일)개월 및 8(56일)개월로 가속화될 것이라고 추정한다. 가속화 노화를 끝낸 후, 두 유형의 비드-연결된 트랜스포좀을 상기에 논의된 바와 같이 태그먼트화 및 라이브러리 제조 단계를 통해서 취하여 트랜스포좀의 활성도를 평가하였다.
비드-연결된 트랜스포좀 복합체를 마그네슘 기반 완충액과 함께 gDNA에 첨가하고, 55℃에서 5분 동안 정치시켰다. 완결 후, SDS 완충액을 반응에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 혼합물을 자석 교반기 상에 놓고, NaCl 및 트리스 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후, 인덱스 서열을 포함하는 2차 어댑터 담체를 갖는 PCR 마스터 믹스를 비드에 첨가하고, 완전히 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 PCR 증폭시켜 추가적인 앰플리콘을 생성하였다. PCR 후, SPRI 클린업을 수행하여 여분의 담체를 제거하였다. 샘플을 바이오어날라이저(BioAnalyzer) 상에서 구동시켜 활성도(라이브러리 제조 방법의 수율)를 측정하였다. 도 6A에 나타낸 바와 같이, 화학식 (I(a))(3'-(I(a)); 글리세롤 링커)의 3'-바이오틴일화된 링커를 갖는 트랜스포좀 복합체를 사용한 스트렙타비딘 비드-기반 고체-상 태그먼트화로부터의 라이브러리 수율과 화학식 (I(c))(3'-(I(c)); 헥실 링커)의 3'-바이오틴일화된 링커를 갖는 것에 대한 수율을 비교하였다. 링커 3'-(I(c))는 상당한 라이브러리 수율을 제공하였다. 링커 3'-(I(a))는 더 낮은 수율을 제공하였지만, 여전히 서열결정 가능한 수율을 제공하였다. 도면 내의 LSC 선은 임의적인 규격 하한값이었다.
도 6B는 4개월(25℃에서 28일 동안의 가속화 저장 조건) 동안 노화 후 3'-(I(a)) 링커를 갖는 트랜스포좀 복합체를 사용한 스트렙타비딘 비드-기반 고체-상 태그먼트화로부터 제조된 샘플 라이브러리의 가속화 안정성 데이터를, 4℃에서 28일 동안의 동일한 링커의 비-노화 대조군으로부터 제조된 샘플 라이브러리와 비교한 것을 도시한다. 도 6C는 4개월 및 8개월(25℃에서 28일 및 56일 동안의 가속화 저장 조건) 동안 노화 후 3'-(I(c)) 링커를 갖는 트랜스포좀 복합체로부터 제조된 샘플 라이브러리의 가속화 안정성 데이터를, 각각 4℃에서 28일 및 56일 동안 동일한 링커의 비-노화된 대조군으로부터 제조된 샘플 라이브러리와 비교하여 나타낸다.
실시예 8. A14-ME 및 B15-ME 트랜스포존
A14-ME 및 B15-ME 트랜스포존을 각각 3' 바이오틴을 함유하는 ME'에 어닐링하였다. 3' 바이오틴을 3'-(I(c)) 링커를 통해서 ME'에 커플링시켰다. 어닐링 반응은 NaCl 완충액을 사용하여 25㎕ 부피로 수행하였다. 생성된 이중 가닥 트랜스포존을 각각 밤새 반응으로 37℃에서 트랜스포사제에 부착하였다. 트랜스포좀 복합체를 형성한 후, A14 및 B15 트랜스포좀 복합체를 함께 동일 부피로 혼합하고, 다양한 밀도(10nM 내지 800nM)로 스트렙타비딘 비드 상에 적재하였다.
다양한 밀도의 비드-연결된 트랜스포좀을 마그네슘 기반 완충액과 함께 gDNA에 첨가하고, 55℃에서 5분 동안 정치시켰다. 완결 후, SDS 완충액을 반응에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 혼합물을 자석 교반기 상에 놓고, NaCl 및 트리스 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 후, 인덱스 서열을 포함하는 2차 어댑터 담체를 갖는 PCR 마스터 믹스를 비드에 첨가하고, 완전히 재현탁시켰다. 이어서, PCR 반응을 샘플 샘플 상에서 수행하여 단편을 증폭시켰다. PCR 후, 다양한 SPRI 비에서 SPRI 크기 선택을 수행하여 상이한 삽입물 크기를 생성하였다. 샘플을 BA 및 HiSeq 2500 래피드 아웃풋(Rapid Output) 상에서 구동시켜 활성도를 측정하였다.
도 7A는 스트렙타비딘 비드-기반 고체-상 라이브러리 제제를 사용하여 DNA 분자의 표적 삽입물 크기를 비드 밀도의 함수로서 나타내는데, 여기서 비드는 3'-(I(c))를 통해서 비드에 결합된 고정된 트랜스포좀 복합체를 포함한다. 도 7B는 활동항진성 Tn5 트랜스포사제 및 3'-(I(c)) 링커를 포함하는 고정된 트랜스포좀 복합체를 갖는 스트렙타비딘 비드를 사용하고, 100nM의 복합체 밀도를 사용하여 SPRI 조건의 함수로서 DNA 분자의 표적 삽입물 크기를 나타내고: 도 7C는 활동항진성 Tn5 트랜스포사제 및 3'-(I(c)) 링커를 포함하는 고정된 트랜스포좀 복합체를 갖는 스트렙타비딘 비드를 사용하고, 600nM의 복합체 밀도를 사용하여 SPRI 조건의 함수로서 DNA 분자의 표적 삽입물 크기를 나타낸다.
실시예 9. 혈액 및 타액을 위한 통합된 추출 프로토콜
새로운 전혈을 플렉스 라이시스 리에이전트(Flex Lysis Reagent) 키트(일루미나, 카탈로그 번호 20015884)를 사용하여 가공하였다. 새로운 전혈을 EDTA 수집관 내에 수집하고, 가공 전에 4℃에서 저장하였다. 각각의 샘플에 대해서 하기 부피를 혼합함으로써 용해 마스터 믹스를 제조하였다: 7㎕의 혈액 용해 완충액, 2㎕의 프로테이나제 K, 및 31㎕의 뉴클레아제-무함유 물. 각각의 샘플에 대해서, 10㎕의 혈액, 40㎕의 용해 마스터 믹스, 및 20㎕의 SPRI 비드를 96-웰 PCR 플레이트의 하나의 웰에 첨가하고, 용액을 10회 피펫팅함으로써 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고, 가열되는 뚜겅이 있는 열 싸이클러 상에서 10분 동안 56℃에서 열 인큐베이션시켰다. 이어서 플레이트를 플레이트 자석 상에 5분 동안 놓고, 상청액을 폐기하고, 150㎕의 80% 에탄올을 첨가하였다. 자석 상에서 30초 동안 인큐베이션시킨 후, 에탄올을 폐기하고, 플레이트를 자석으로부터 제거하였다. 비드를 30㎕ 물 중에 재현탁시켰고, 이것은 라이브러리 제조를 위해서 준비된 것이다.
타액을 오라젠 DNA 타액 수집관(DNA 제노테크(Genotek), 카탈로그 번호 OGR-500, OGD-510)에서 수집하고, 이것은 적어도 1시간 동안 50℃에서 인큐베이션시켜 세포를 용해시키고, 그 후 보텍싱에 의해서 철저히 혼합하였다. 각각의 샘플에 대해서, 20㎕의 물 및 30㎕의 타액을 96-웰 PCR 플레이트의 하나의 웰에 첨가하고, 피펫팅에 의해서 서서히 혼합하였다. 이어서, 20㎕의 SPRI 비드를 샘플 웰에 첨가하고, 용액을 10회 피펫팅함으로써 비드를 철저히 혼합하였다. 플레이트를 5분 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후 플레이트 자석 상에 5분 동안 놓았다. 상청액을 제거하고, 150㎕의 80% 에탄올을 비드 펠릿에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 자석 상에 30초 동안 정치시킨 후, 에탄올을 제거하고, 이어서 자석으로부터 플레이트를 제거하였다. 비드를 30㎕의 물 중에 재현탁시켰고, 이것은 라이브러리 제조를 위해서 준비된 것이다.
다수의 실시형태가 기술되어 있다. 그러나, 다양한 변형이 행해질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시형태가 하기 청구범위의 범주에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ILLUMNA, INC. ILLUMINA CAMBRIDGE LIMITED <120> TAGMENTATION USING IMMOBILIZED TRANSPOSOMES WITH LINKERS <130> WO/2018/156519 <140> PCT/US2018/018824 <141> 2018-02-20 <150> US 62/461620 <151> 2017-02-21 <160> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 primer <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga gauctacac 29 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 primer <400> 2 caagcagaag acggcatacg agat 24 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A14-ME adaptor sequence <400> 3 tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B15-ME adaptor sequence <400> 4 gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acag 34 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ME' adaptor sequence <400> 5 ctgtctctta tacacatct 19 <210> 6 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A14 adaptor sequence <400> 6 tcgtcggcag cgtc 14 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B15 adaptor sequence <400> 7 gtctcgtggg ctcgg 15 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ME adaptor sequence <400> 8 agatgtgtat aagagacag 19 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified A14-ME #1 <400> 9 tttttttttt uuuacactcg tcggcagcgt cagatgtgta taagagacag 50 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified A14-ME #2 <400> 10 ttuuutcgtc ggcagcgtca gatgtgtata agagacag 38 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified A14-ME #3 <400> 11 ttttutcgtc ggcagcgtca gatgtgtata agagacag 38 <210> 12 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified B15-ME #1 <400> 12 tttttttttt uuugtctcgt gggctcggag atgtgtataa gagacag 47 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified B15-ME #2 <400> 13 ttuuugtctc gtgggctcgg agatgtgtat aagagacag 39 <210> 14 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified B15-ME #3 <400> 14 ttttugtctc gtgggctcgg agatgtgtat aagagacag 39

Claims (13)

  1. 다음을 포함하는 트랜스포솜 복합체:
    a. 트랜스포사제,
    b. 제1 트랜스포존으로서,
    i. 제1 트랜스포존 말단 서열을 포함하는 3' 부분; 및
    ii. 제1 트랜스포존 말단 서열의 5' 말단에 제1 어댑터 서열;을 포함하는, 제1 트랜스포존,
    c. 제1 트랜스포존 말단 서열의 적어도 일부에 상보적인 제2 트랜스포존 말단 서열을 포함하는 제2 트랜스포존; 및
    d. 하나 이상의 광절단 가능하거나 효소적으로 절단 가능한 뉴클레오티드를 포함하는 절단 가능한 링커로서, 상기 절단 가능한 링커는 제2 트랜스포존의 3' 말단에 부착된 제1 말단 및 친화성 요소에 부착된 제2 말단을 갖는, 절단 가능한 링커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 친화성 요소가 고체 지지체 상의 친화성 결합 파트너에 결합할 수 있는, 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 고체 지지체가 튜브, 플레이트의 웰, 슬라이드, 비드 또는 플로우셀인, 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비드는 상자성 비드인, 복합체.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 요소가 비오틴이고 상기 친화성 결합 파트너가 스트렙타비딘인, 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어댑터 서열이 범용 서열, 프라이머 서열, 또는 시퀀싱 관련 서열을 포함하는 것인, 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포사제가 Tn5 트랜스포사제인, 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Tn5 트랜스포사제가 야생형 Tn5 트랜스포사제, 과활성(hyperactive) Tn5 트랜스포사제, 또는 이의 돌연변이체인, 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포사제가 정제 태그에 접합되어 있는, 복합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 트랜스포존 말단 서열 및 제2 트랜스포존 말단 서열은 각각 ME(서열번호 8) 및 ME'(서열번호 5)인, 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 광절단 가능하거나 효소적으로 절단 가능한 뉴클레오티드가 우라실, 우리딘, 8-옥소-구아닌, 잔틴, 하이포잔틴, 5,6-다이하이드로우라실, 5-메틸시토신, 티민-이량체, 7-메틸구아노신, 8-옥소-데옥시구아노신, 잔토신, 이노신, 다이하이드로우리딘, 브로모데옥시우리딘, 우리딘 또는 5-메틸시티딘으로부터 독립적으로 선택되는, 복합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 광절단 가능하거나 효소적으로 절단 가능한 뉴클레오티드가 우라실인, 복합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 광절단 가능하거나 효소적으로 절단 가능한 뉴클레오티드를 포함하는, 복합체.
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102607830B1 (ko) 2017-02-21 2023-12-01 일루미나, 인코포레이티드 링커를 갖는 고정된 트랜스포좀을 사용한 태그먼트화
CN111655848A (zh) 2017-11-21 2020-09-11 阿瑞玛基因组学公司 在核酸模板中保留空间邻位邻接性和分子邻接性
EP3788171B1 (en) * 2018-05-03 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company High throughput multiomics sample analysis
WO2020144373A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 Illumina Cambridge Limited Complex surface-bound transposome complexes
TW202043486A (zh) 2019-01-29 2020-12-01 美商伊路米納有限公司 定序套組
TW202045709A (zh) 2019-01-29 2020-12-16 美商伊路米納有限公司 流體槽
TW202100247A (zh) 2019-01-29 2021-01-01 美商伊路米納有限公司 流通槽
US20220127597A1 (en) 2019-02-14 2022-04-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Haplotagging - haplotype phasing and single-tube combinatorial barcoding of nucleic acid molecules using bead-immobilized tn5 transposase
CN112888791A (zh) 2019-04-29 2021-06-01 伊鲁米那股份有限公司 通过快速温育和核酸富集来鉴定和分析微生物样本
US20220127596A1 (en) 2019-07-12 2022-04-28 lllumina Cambridge Limited Nucleic Acid Library Preparation Using Electrophoresis
CN110734908B (zh) * 2019-11-15 2021-06-08 福州福瑞医学检验实验室有限公司 高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒
CA3145540A1 (en) * 2020-01-27 2021-08-05 Illumina, Inc. Kit, system, and flow cell
WO2021154648A2 (en) * 2020-01-27 2021-08-05 Illumina, Inc. Kit, system, and flow cell
KR20230041725A (ko) * 2020-08-06 2023-03-24 일루미나, 인코포레이티드 비드-연결된 트랜스포좀을 사용한 rna 및 dna 시퀀싱 라이브러리의 제작
AU2021329302A1 (en) * 2020-08-18 2023-02-16 Illumina Cambridge Limited Sequence-specific targeted transposition and selection and sorting of nucleic acids
CN112176421A (zh) * 2020-09-22 2021-01-05 上海英基生物科技有限公司 一种rna建库的方法
EP4232600A2 (en) 2020-10-21 2023-08-30 Illumina, Inc. Sequencing templates comprising multiple inserts and compositions and methods for improving sequencing throughput
CN112795563A (zh) * 2021-03-23 2021-05-14 上海欣百诺生物科技有限公司 生物素化的转座体在回收CUT&Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法
IL307195A (en) 2021-03-29 2023-11-01 Illumina Inc Improved methods of library preparation
MX2023010495A (es) 2021-03-30 2023-09-18 Illumina Inc Metodos mejorados de preparacion de genoteca y adn complementarios isotermicos.
CA3211172A1 (en) * 2021-03-31 2022-10-06 Illumina, Inc. Methods of preparing directional tagmentation sequencing libraries using transposon-based technology with unique molecular identifiers for error correction
WO2022256227A1 (en) * 2021-06-01 2022-12-08 The Regents Of The University Of California Methods for fragmenting complementary dna
WO2022256228A1 (en) * 2021-06-01 2022-12-08 The Regents Of The University Of California Method for producing a population of symmetrically barcoded transposomes
WO2023122755A2 (en) * 2021-12-23 2023-06-29 Illumina Cambridge Limited Flow cells and methods
CN116891532A (zh) * 2022-04-06 2023-10-17 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种基于生物素:亲合素的二抗:转座酶复合物及其在检测蛋白质与dna相互作用中的应用
WO2023204594A1 (ko) * 2022-04-19 2023-10-26 서울대학교산학협력단 태그멘테이션을 이용한 벡터 삽입위치 검출 및 클론 정량 방법
WO2023225095A1 (en) * 2022-05-18 2023-11-23 Illumina Cambridge Limited Preparation of size-controlled nucleic acid fragments
WO2023230552A2 (en) * 2022-05-26 2023-11-30 Illumina, Inc. Preparation of long read nucleic acid libraries
WO2024024583A1 (ja) * 2022-07-25 2024-02-01 東洋紡株式会社 次世代シーケンサー解析等のための断片化及びタグメント化方法
WO2024050304A1 (en) * 2022-08-29 2024-03-07 Illumina, Inc. Preparation and use of blocked substrates

Family Cites Families (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
US5677170A (en) 1994-03-02 1997-10-14 The Johns Hopkins University In vitro transposition of artificial transposons
US5925545A (en) 1996-09-09 1999-07-20 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US5965443A (en) 1996-09-09 1999-10-12 Wisconsin Alumni Research Foundation System for in vitro transposition
US5964443A (en) 1997-08-13 1999-10-12 Cipa - Usa, Inc. Mounting bracket system for a rearview mirror
WO2001009363A1 (en) 1999-08-02 2001-02-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutant tn5 transposase enzymes and method for their use
AU2001282881B2 (en) 2000-07-07 2007-06-14 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
EP1354064A2 (en) 2000-12-01 2003-10-22 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
JP3750020B2 (ja) 2000-12-07 2006-03-01 学校法人慶應義塾 Ｃ末端修飾タンパク質およびその製造方法、ならびに、ｃ末端修飾タンパク質の製造に用いる修飾剤および翻訳テンプレート、ならびに、ｃ末端修飾タンパク質を用いたタンパク質相互作用の検出方法
US7057031B2 (en) 2001-07-13 2006-06-06 Ambergen, Inc. Nucleotide compositions comprising photocleavable markers and methods of preparation thereof
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
EP2607369B1 (en) 2002-08-23 2015-09-23 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
WO2004093645A2 (en) 2003-04-17 2004-11-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Tn5 transposase mutants and the use thereof
EP3175914A1 (en) 2004-01-07 2017-06-07 Illumina Cambridge Limited Improvements in or relating to molecular arrays
US7608434B2 (en) 2004-08-04 2009-10-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Mutated Tn5 transposase proteins and the use thereof
US7315019B2 (en) 2004-09-17 2008-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of optical confinements and uses thereof
GB0427236D0 (en) 2004-12-13 2005-01-12 Solexa Ltd Improved method of nucleotide detection
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
EP3722409A1 (en) 2006-03-31 2020-10-14 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
WO2008051530A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US7897737B2 (en) 2006-12-05 2011-03-01 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
GB2457851B (en) 2006-12-14 2011-01-05 Ion Torrent Systems Inc Methods and apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
JP5794572B2 (ja) 2008-10-24 2015-10-14 エピセンター テクノロジーズ コーポレイションＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 核酸を修飾するためのトランスポゾン末端組成物及び方法
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2635679B1 (en) 2010-11-05 2017-04-19 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
US8829171B2 (en) 2011-02-10 2014-09-09 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2458157B1 (fr) 2010-11-30 2015-10-14 Techspace Aero S.A. Abradable de virole intérieure de stator
ES2762866T3 (es) 2011-01-28 2020-05-26 Illumina Inc Reemplazo de nucleótidos por bibliotecas doblemente etiquetadas y direccionales
CN103443338B (zh) 2011-02-02 2017-09-22 华盛顿大学商业化中心 大规模平行邻接作图
US9005935B2 (en) 2011-05-23 2015-04-14 Agilent Technologies, Inc. Methods and compositions for DNA fragmentation and tagging by transposases
WO2013085918A1 (en) 2011-12-05 2013-06-13 The Regents Of The University Of California Methods and compostions for generating polynucleic acid fragments
NO2694769T3 (ko) 2012-03-06 2018-03-03
US9644199B2 (en) * 2012-10-01 2017-05-09 Agilent Technologies, Inc. Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
AU2013382098B2 (en) 2013-03-13 2019-02-07 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
EP3017063B1 (en) * 2013-07-03 2017-04-05 Illumina, Inc. Sequencing by orthogonal synthesis
DK3083994T3 (da) * 2013-12-20 2021-09-13 Illumina Inc Bevarelse af genomisk konnektivitetsinformation i fragmenterede genomiske DNA-prøver
US20170009288A1 (en) * 2014-02-03 2017-01-12 Thermo Fisher Scientific Baltics Uab Method for controlled dna fragmentation
AU2015247779B2 (en) 2014-04-15 2021-06-24 Illumina, Inc. Modified transposases for improved insertion sequence bias and increased DNA input tolerance
US10577603B2 (en) * 2014-06-30 2020-03-03 Illumina, Inc. Methods and compositions using one-sided transposition
ES2726149T3 (es) * 2014-09-12 2019-10-02 Mgi Tech Co Ltd Oligonucleótido aislado y su uso en la secuenciación de ácidos nucleicos
WO2016058127A1 (zh) * 2014-10-14 2016-04-21 深圳华大基因科技有限公司 一种转座酶打断核酸并加接头的方法和试剂
RU2709655C2 (ru) * 2014-10-17 2019-12-19 Иллумина Кембридж Лимитед Транспозиция с сохранением сцепления генов
EP3256604B1 (en) * 2015-02-10 2020-03-25 Illumina, Inc. Methods and compositions for analyzing cellular components
WO2016189331A1 (en) * 2015-05-28 2016-12-01 Illumina Cambridge Limited Surface-based tagmentation
KR102607830B1 (ko) 2017-02-21 2023-12-01 일루미나, 인코포레이티드 링커를 갖는 고정된 트랜스포좀을 사용한 태그먼트화

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