JP7164276B2 - リンカーを用いた固定化トランスポソームを使用するタグメンテーション - Google Patents
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Description
本出願は、2017年2月21日に出願された米国仮特許出願番号第62/461,620号に基づく優先権の利益を主張しており、この仮特許出願は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
本開示は、電子フォーマットの配列表を含む。この配列表は、2017年2月20日に作成されたサイズが約7KBのILLINC-398WO_Sequence_Listing.txtと題するファイルとして提供される。この配列表の電子形式中の情報は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
分野
本開示は、核酸を処理するための方法、組成物、およびキット(固体支持体上に固定化されたトランスポソーム複合体を使用して、核酸(例えば、DNA)をフラグメント化およびタグ化するための方法および組成物を含む)に関する。
本開示は、改変されたリンカーおよび構成要素の配置を有する支持体に結合したトランスポソーム複合体に関する。本開示は、このような改変された複合体を使用して、配列決定する準備ができた核酸ライブラリーを生成するための方法および組成物を提供する。
本開示は、核酸を処理するための方法、組成物、およびキット(固体支持体上のトランスポソーム複合体を使用してDNAをフラグメント化およびタグ化するための方法および組成物を含む)に関する。
を有し、ここで:
AEは、親和性エレメントであり;
Yは、C2-6アルキレンであり;
X1は、O、NR1、またはSであり;
ここでR1は、HまたはC1-10アルキルであり;
nは、1、2、3、4、5、および6からなる群より選択される整数であり;
X2は、O、CH2、またはSであり;
Raは、Hまたは-OHであり;そして
Zは、RaがHである場合に非存在であるか、またはRaがHまたはOHである場合にCH2であり;
ここで
は、上記第2のトランスポゾンへの接続点のマークである。
固体支持体であって、上記固体支持体に固定化された本明細書に記載されるトランスポソーム複合体を含む固体支持体を提供する工程;および
上記固体支持体と、二本鎖標的核酸とを、上記標的核酸を複数の標的フラグメントにフラグメント化し、そして上記第1のトランスポゾン3’末端を上記標的フラグメントの5’末端に繋げるために十分な条件下で接触させて、複数の5’タグ化標的フラグメントを提供する工程、
を包含する。
フラグメント化した核酸のライブラリーはしばしば、次世代配列決定(NGS)適用における使用のためにゲノム核酸から作られる。本開示は、固定化転移ライブラリー調製法のための方法、組成物、およびキットを提供する。上記固定化転移ライブラリー調製法は、他のライブラリー調製法と比較して迅速であり、かつグロスサンプルまたは非精製サンプル(例えば、血液、喀痰、細胞抽出物など)および精製サンプル(例えば、精製されたゲノム核酸)の両方からライブラリーを調製するにあたって有効である。一般に、トランスポソームは、共有結合または非共有結合の結合パートナー(例えば、親和性エレメントおよび親和性結合パートナー)を使用して、基材(例えば、スライドまたはビーズ)上に固定化される(図1)。例えば、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム複合体に結合したビオチン化リンカーを通じて上記ストレプトアビジン被覆ビーズ上に固定化される。その標的核酸は、その固定化トランスポソーム複合体によって捕捉され、その核酸は、フラグメント化およびタグ化される(「タグメンテーション」)。そのタグ化されたフラグメントは、増幅され、目的のアンプリコンは、必要に応じて、捕捉され(例えば、ハイブリダイゼーションプローブを介して)、そのタグ化されたフラグメントは、配列決定される。
本明細書で使用される場合、「アルキル(alkyl)」とは、完全に飽和した(すなわち、二重結合も三重結合も含まない)直線状または分枝状の炭化水素鎖をいう。そのアルキル基は、1~20個の炭素原子を有し得る(本明細書で現れる場合は常に、数値範囲(例えば、「1~20(1 to 20)」とは、その所定の範囲の中の各整数に言及する;例えば、「1~20個の炭素原子(1 to 20 carbon atoms)」とは、そのアルキルが、1個の炭素原子、2個の炭素原子、3個の炭素原子など、20個を含めて20個までの炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「アルキル」の存在もまた、網羅する)。アルキル基はまた、1~9個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキルであってもよい。アルキル基はまた、1~6個の炭素原子を有する低級アルキルであり得る。そのアルキル基は、「C1-4アルキル」または類似の呼称として指定され得る。例示に過ぎないが、「C1-6アルキル」は、アルキル鎖の中に1~6個の炭素原子が存在し、すなわち、そのアルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、およびt-ブチルからなる群より選択されることを意味する。代表的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、決してこれらに限定されない。
トランスポゾンベースの技術は、例えば、NEXTERATM XTおよびFLEX DNAサンプル調製キット(Illumina, Inc.)の作業フローに例示されるように、DNAをフラグメント化するために利用され得、ここで標的核酸(例えば、ゲノムDNA)は、標的を同時にタグ化およびフラグメント化(「タグメンテーション(tagmentation)」)するトランスポソーム複合体で処理され、それによって、フラグメントの末端で特有のアダプター配列でタグ化されたフラグメント化核酸分子の集団を作り出す。
本明細書で記載される方法の実施形態のうちのいずれかにおいて、第1のトランスポゾンは、第1のアダプター配列を含む。いくつかの実施形態において、二次アダプターは、二次アダプターキャリアを使用して、本明細書で記載されるとおりのタグ化フラグメントに付加され、二次アダプターキャリアは、プライマー配列および二次アダプター配列を含む。アダプター配列は、ユニバーサル配列、プライマー配列、インデックス配列、捕捉配列、バーコード配列(例えば、計数またはエラー矯正のために使用される)、切断配列、配列決定関連配列、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1またはこれより多くの機能的配列を含み得る。いくつかの実施形態において、アダプター配列は、プライマー配列を含む。他の実施形態において、アダプター配列は、プライマー配列およびインデックス配列またはバーコード配列を含む。プライマー配列はまた、ユニバーサル配列であり得る。本開示は、使用され得るアダプター配列のタイプに限定されず、当業者は、ライブラリー調製および次世代配列決定のために有用であり得るさらなる配列を認識する。
親和性エレメントは、本明細書で使用される場合、共有結合により、または非共有結合により、親和性結合パートナーに結合するために使用され得る部分である。いくつかの局面において、親和性エレメントは、トランスポソーム複合体上にあり、親和性結合パートナーは、固体支持体上にある。
2つの分子実態を連結する結合を壊す能力は、最初のハイブリダイゼーションの間にゲノムワイドオフターゲット捕捉を生じる可能性を崩壊させて、オフターゲットハイブリダイゼーション生成物の捕捉を低減する有効なツールであり得る。本明細書で定義される場合、切断可能なリンカーは、切断可能な結合を通じて一緒に繋がれる2つの機能的先端(head)を有する分子である。この2つの機能的先端は、そのリンカーを他の部分に結合するように働く;この場合、切断可能なリンカーは、第1のトランスポゾン配列の5’末端を親和性エレメントに接続する。切断可能なリンカーの切断条件および生物学的適用に従って分類されるそれらリンカーの概観は、Wagnerら, Bioorg. Med. Chem. 20, 571-582 (2012)(これは本明細書に参考として援用される)によって列挙される。
他の局面において、リンカーは、第2のトランスポゾンの3’末端に接続され、ここでそのリンカーは、第2のトランスポゾンを固体支持体に接続し得る。第1のおよび第2のトランスポゾンが、トランスポソーム複合体の一部である場合、リンカーは、その複合体を固体支持体に接続するように働く。このような局面において、リンカーの第1の末端は、第2のトランスポゾンの3’末端に結合され、リンカーの第2の末端は、親和性エレメントに結合される。親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに(共有結合により、または非共有結合により)結合し得る。いくつかの局面において、親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに(共有結合により、または非共有結合により)結合され、固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を提供する。いくつかの局面において、リンカーは、切断可能なリンカーである。これらの複合体は、3’-リンカートランスポソーム複合体および支持体に結合した3’-リンカートランスポソーム複合体である。いくつかの実施形態において、親和性エレメントは、ビオチンであり、親和性結合パートナーは、ストレプトアビジンである。
を有し、ここで:
AEは、親和性エレメントであり;
Yは、C2-6アルキレンであり;
X1は、O、NR1、またはSであり;
ここでR1は、HまたはC1-10アルキルであり;
nは、1、2、3、4、5、および6からなる群より選択される整数であり;
X2は、O、CH2またはSであり;
Raは、Hまたは-OHであり;そして
Zは、RaがHである場合に非存在であるか、またはRaがHもしくはOHである場合にCH2であり;
ここで
は、第2のトランスポゾンへの接続点のマークである。
を有し、ここでAE、Y、X1、n、X2は、式(I)に関して本明細書で記載されるとおりに定義され、Zは、非存在であるかまたはCH2である。
を有し、ここでX1、n、X2、Ra、およびZは、式(I)に関して本明細書で記載されるとおりに定義される。いくつかの実施形態において、Raは、Hである。
を有し、ここでAEは、式(I)に関して本明細書で定義されるとおりであり;X2は、OまたはCH2であり;nは、1または2であり;そしてZは、非存在であるか、またはCH2である。
用語「固体表面(solid surface)」、「固体支持体(solid support)」および他の文法的等価物は、トランスポソーム複合体の結合に適切であるか、または適切であるように改変され得る任意の材料に言及する。当業者によって認識されるように、可能な基材の数は複数である。可能な基材としては、ガラスおよび改変または官能化されたガラス、プラスチック(アクリル物質、ポリスチレンならびにスチレンおよび他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、TEFLON(登録商標)などが挙げられる)、ポリサッカリド、ナイロンまたはニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカまたはシリカベースの材料(ケイ素および改変ケイ素を含む)、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、ビーズ、常磁性ビーズ、および種々の他のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示は、本明細書に記載されるとおりの、改変されたオリゴヌクレオチド、トランスポソーム複合体、および固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を調製するための方法をさらに提供する。いくつかの局面において、このような方法は、トランスポザーゼを、本明細書で記載されるとおりの第1のおよび第2のトランスポゾンで、複合体を形成するために適した条件下で処理する工程を包含する。固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を調製するための方法は、本明細書で記載されるとおりのトランスポソーム複合体を、親和性結合パートナーを含む固体支持体とともに、親和性エレメントが親和性結合パートナーと(共有結合により、または非共有結合により)結合するために十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。
ここでAE、Y、n、X2、Ra、およびZは、本明細書で定義されるとおりであり;
-C(O)X3は、活性化エステル(例えば、エステル、アシルハライド、エステル無水物、またはNHSエステル)であり;そして
X4は、-OHまたは-NH2基である、
式(II)の化合物と式(III)の化合物とを反応させて、[式(I)]-ヌクレオチドの化合物を形成する工程を包含する。
いくつかの局面において、標的核酸から配列決定フラグメントを調製するための方法が提供され、上記方法は、本明細書で記載されるとおりの固体支持体上に固定化された本明細書に記載されるトランスポソーム複合体を含む固体支持体を提供する工程;その固体支持体と標的核酸とを、その標的核酸をフラグメント化し、第1のトランスポゾンをそのフラグメントの5’末端に連結する条件下で接触させる工程を包含し、それによって、そのフラグメントは、固体支持体上に固定化される。いくつかの局面において、その方法は、そのフラグメント化された核酸を増幅する工程をさらに包含する。ある実施形態において、そのフラグメント条件は、トランスポソーム複合体を使用して、その標的核酸をフラグメント化およびタグ化することによって、タグメンテーションするために適した条件である。
P5: AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(配列番号1)
P7: CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT(配列番号2)
およびこれらの誘導体を含む。
図1は、トランスポソーム複合体を調製し、これを固体表面(例えば、ビーズ)に、第1のトランスポゾンの5’末端に連結した親和性エレメントを通じて付着させるための方法の例示的工程を図示する。この例において、アニールした第1のおよび第2のトランスポゾン(トランスポゾン末端配列を含むアニールされた二本鎖領域および一本鎖領域を含むオリゴヌクレオチド)の2つの集団(130aおよび130b)(ここで各集団において、第1のトランスポゾンは、2種のアダプター配列のうちの一方および5’末端における親和性エレメント(110、ここで*は、親和性エレメントを示す)(例えば、ビオチン)を含む)、例えば、2種のアダプター配列(例えば、A14およびB15のようなプライマー配列)を含む複数のビオチン化された第1のおよび第2のトランスポゾンが、生成される。示されるように、テンプレート核酸に移される二重鎖トランスポゾン配列の鎖は、第1のトランスポゾンであり、これは親和性エレメント(例えば、ビオチン)を有する。工程115において、オリゴヌクレオチドの各集団(130aおよび130b)は、トランスポザーゼモノマー(例えば、Tn5(135))と代表的には別個の反応において複合体化されて、トランスポソーム複合体(140)の2種の別個の集団を作り、各々は、異なるアダプター配列(例えば、A14およびB15のようなプライマー配列)を有する。複合体の2つの集団が形成された後、それらは、基材(この例では、ビーズ)上に固定化される(120)。いくつかの実施形態において、その2つの集団は、固定化の前に合わされ、各集団からの複合体を含む固体表面またはビーズを生じる。他の実施形態において、その2つの集団は、別個に固定化され、2種の固体表面またはビーズを生じ、各々は、2種の複合体タイプの内の一方を含む。トランスポソーム複合体形成の後、トランスポソーム140は、親和性結合パートナー(例えば、ストレプトアビジン)で被覆された表面145に結合される。
A14-ME: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′ (配列番号3)
B15-ME: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3′ (配列番号4)
ME’: 5′-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-3’ (配列番号5)
A14: 5′-TCGTCGGCAGCGTC-3′ (配列番号6)
B15: 5′-GTCTCGTGGGCTCGG-3’ (配列番号7)
ME: AGATGTGTATAAGAGACAG (配列番号8)
標的核酸は、DNA、RNA、cDNAなどを含む任意のタイプであり得る。例えば、その標的核酸は、精製された核酸を含め、種々の精製状態にあり得る。しかし、その核酸は、完全に精製する必要もまたは精製する必要も全くなく、生物学的サンプルの一部(例えば、生のサンプル溶解物、体液、血液、血漿または血清)であり得るか、またはさもなければタンパク質、他の核酸種、他の細胞構成要素、および/または任意の他の夾雑物質と混合され得る。いくつかの実施形態において、その生物学的サンプルは、適切にはインビボで見出されるものと同じ割合で存在する、核酸(例えば、DNA)、タンパク質、他の核酸種、他の細胞構成要素、および/または任意の他の夾雑物質の混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態において、その構成要素は、無傷の細胞において見出されるものと同じ割合で見出される。本明細書で提供される方法は、核酸またはDNAがタグメンテーションプロセスを通じて固体支持体に結合されることを可能にすることから、他の夾雑物質は、タグメンテーションが起こった後に、その固体支持体を洗浄することによって除去され得る。その生物学的サンプルは、例えば、粗製細胞溶解物または全細胞を含み得る。例えば、本明細書で示される方法において固体支持体に適用される粗製細胞溶解物は、核酸を他の細胞構成要素から単離するために旧来から使用される分離工程のうちの1またはこれより多くに供されている必要はない。
本明細書で提供される方法のうちのいくつかは、核酸を分析するための方法を包含する。このような方法は、標的核酸のテンプレート核酸のライブラリーを調製する工程、配列データをテンプレート核酸のライブラリーから得る工程、およびその標的核酸の配列表示をアセンブリする工程を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、合成時配列決定(SBS)が挙げられるが、これらに限定されない次世代配列決定作業フローにおいて使用され得る。本開示の方法によって生成される核酸ライブラリーとともに使用するのに容易に適合され得る、例示的なSBS手順、流体システム、および検出プラットフォームは、例えば、Bentleyら, Nature 456:53-59 (2008)、WO 04/018497;US 7,057,026;WO 91/06678;WO 07/123744;US 7,329,492;US 7,211,414;US 7,315,019;US 7,405,281、およびUS 2008/0108082(これらの各々は、本明細書に参考として援用される)に記載される。
トランスポゾンを、2セットのオリゴヌクレオチド(配列番号9~11のうちのいずれか1種(改変されたA14-ME)および配列番号12~14のうちのいずれか1種(改変されたB15-ME)として表される)をアニールすることによって形成し、それらはともに、19塩基のモザイク末端(ME)配列(配列番号8、小文字で示される)にわたって、相補的異なモザイク末端配列(ME’;配列番号5)と塩基対を形成する。配列番号9~配列番号14によって表されるオリゴヌクレオチドを、5’ビオチン化して、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズへのその後の表面結合を可能にした。そのアニールしたトランスポゾンを、50μMの各ビオチン化オリゴヌクレオチドと50μMのME’(配列番号5)とを、10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、および25mM NaClの存在下で合わせることによって調製し、95℃において10分間加熱し、室温へと2時間にわたって冷却した。次いで、そのアニールしたトランスポゾンをトランスポザーゼ酵素と最終濃度2μMにおいて混合し、37℃で一晩インキュベートした。
タグメンテーションDNAをストレプトアビジン被覆捕捉ビーズ上に有するストレプトアビジン被覆捕捉ビーズ(実施例1に記載されるとおり)を、5% SDS、100mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl、および0.1% Tween 20を含む洗浄緩衝液を使用して洗浄し(例えば、3回)、それによって、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼ酵素を変性した。その上清を、ストレプトアビジン被覆常磁性粒子(例えば、ビーズ)の磁性捕捉を介する洗浄工程後に除去し、固定化したタグメンテーションライブラリーを含むビーズを保持し、さらに、100mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl、および0.1% Tween 20を使用して洗浄した。
簡潔には、50ngのNA12878ゲノムDNA(Coriell Institute)を、試験される各条件に使用した。コントロール反応として、DNAを、タグメンテーションし、ライブラリーを調製し、製造業者の推奨に従ってNEXTERA Rapid Capture Enrichment(Illumina)プロトコル後に富化した。ウラシル含有切断可能リンカーである配列番号9および配列番号13を使用した。
以下の実施例は、TruSeq Rapid Exome Kit(Illumina)と比較して、2個のチミンと3個のウラシル(2T3U)のリンカーと比較して、酵素による切断なしおよび酵素による切断ありで(2T3U+ENZ)、5個のチミン(5T)のリンカーを使用するエキソーム富化実験を示す。
ある種のビーズベースのタグメンテーションアプローチは、図5Aに示されるとおりの5’末端においてビオチン化されているアダプター配列を使用する。簡潔には、その5’ビオチン化アダプターオリゴヌクレオチド501および502は、トランスポソームを表面に結合する。そのタグメンテーション事象は、5’ビオチン化し、フラグメント化した全ゲノムDNAを作り、それは、その後の富化工程を夾雑し得る。一実施形態において、ビオチンの結合を、図5Bに示されるように、トランスポソームを表面に結合するために、相補鎖(第2のトランスポゾン)上の3’位に変更する。簡潔には、そのオリゴヌクレオチド501および502は、ビオチンを含まない。この例では、ビオチンを、相補鎖(ME’配列)上のトランスポゾン末端配列503に結合する。この構成において、そのタグメンテーション事象は、ビオチンなしのゲノムDNAフラグメントを作る。
工程1.トランスポゾンのアニール
A14-MEおよびB15-MEを各々、ME’-リンカー-ビオチンオリゴ(以下で考察される調製物)にアニールしたところ、2種の二本鎖複合体が生じ、両方とも、トランスポザーゼによって特異的に認識されるモザイク末端(ME)および二次アダプターを付加するためにPCRにおいて使用されるA14またはB15配列を有した。そのA14-ME、B15-ME、およびME’オリゴを、200nMへと再懸濁した。96ウェルPCRプレートにおいて、以下の表4に示される調製物を、2個のウェルに添加した(1個のウェルは、A14:ME’、および1個のウェルは、B15-ME’)。そのウェルプレートを、サーマルサイクラーの中に10分間、95℃で入れ、次いで、サーマルサイクラーから出し、室温のベンチに2時間置いた。
Tn5トランスポザーゼを上記のアニールしたトランスポゾンに添加したところ、A14-ME/ME’-リンカー-ビオチンおよびB15-ME/ME’-リンカー-ビオチン複合体を含むトランスポソーム複合体を形成した。先の工程から調製したアニールしたオリゴを使用して、96ウェルPCRプレートにおいて以下の反応を設定した。A14-ME用に1個のウェルおよびB15-ME用に1個のウェルであった。各ウェルを、サーマルサイクラーの中で37℃において一晩インキュベートし、トランスポソーム複合体の2つの集団を提供した;次いで、その2個のウェルの内容物を一緒に混合した。混合工程の後、約220μLを除去し、別のウェルに添加した。約220μLの標準貯蔵緩衝液(合計440μL)を添加した。
ビオチン連結を含む上記で形成したトランスポソーム複合体を、ストレプトアビジンビーズに付加した。そのビーズ上の複合体の密度は、タグメンテーション生成物における挿入物サイズを制御するために調整され得る。そのストレプトアビジンビーズを、十分混合した。約200μLのストレプトアビジンビーズを、1.5mlチューブの中に入れ、チューブ磁石上に置いた。そのビーズを、1mL HT1で2回洗浄し、次いで、そのビーズを再懸濁し、洗浄の間にスピンダウンした。2回目の洗浄の後に、そのビーズを600μLのHT1で十分に再懸濁した。400μLの上記で作製したトランスポソーム複合体を、HT1入りのチューブに添加した。その混合物をロータリーミキサーで1時間混合し、磁石上に置き、その上清を除去した。その混合物を、500μLの15% 標準貯蔵緩衝液中で再懸濁した。そのビーズを、1000nM トランスポソーム複合体の存在下で装填し、その得られた1000nM 密度複合体を、溶液中400nMの濃度に希釈して貯蔵した。従って、そのストック溶液は、複合体密度1000nMを有するビーズを含み、400nM 濃度へと希釈した。この希釈工程は、ビーズ上の複合体の密度を変化させるのではなく、ストック溶液中の複合体の最終濃度のみを変化させる。
DNAサンプルを、タグメンテーションして、ビーズ装填トランスポソームを使用することによってフラグメントを作製し、トランスポゾン配列を切断しそのDNAサンプルに添加した。96ウェルPCRプレートにおいて、5×Mgタグメンテーション緩衝液(10μL)、DNA(>50ng; 10μL)、dH2O(20μL)、およびトランスポソームビーズ(工程3におけるとおり調製;10μL)を合わせた。その混合物を十分に混合し、55℃において5分間、続いて、2分間、20℃においてインキュベートした。そのタグメンテーションプロセスを、SDSでの処理によるトランスポザーゼ酵素の不活性化によって停止した。10μLのSDSを添加し、上記の工程からの反応混合物と十分に混合した。次いで、その混合物をベンチ上で5分間、室温においてインキュベートし、磁性撹拌機上に置いた。その溶液が一旦透明になった後、その上清を除去した。
そのSDSを、ビーズから洗い流して、PCR用のサンプルを調製した。その反応混合物を、タグメンテーションを停止した後に、磁石から外し、100μLの洗浄緩衝液を添加した。そのサンプルを、20秒間、1600rpmにおいてボルテックスにかけた。次いで、それを磁性撹拌機上に再び置き、その溶液が一旦透明になった後、その上清を除去した。その洗浄工程を合計で3回反復した。その洗浄が一旦完了した後、全ての上清を除去し、そのサンプルを磁性撹拌機から外した。
工程5からのサンプルを、A14およびB15を認識するプライマーとともにPCR増幅し、二次アダプターを添加した。そのプライマーはまた、インデックス配列および配列決定プライマー(P5およびP7)を含んだ。表6に示されるマスターミックスを、各サンプルウェルに添加した。そのビーズを、マスターミックス中で再懸濁し、表7に示されるプログラムを使用してサーモサイクラーの中に置いた。この工程は、移されない/ビオチン化された鎖を除去し、伸長し、そしてP5およびP7全てを1プロセスで導入するために増幅するように働いた。
A14-MEおよびB15-MEトランスポゾンを、3’ビオチンを含むME’に各々アニールした。その3’ビオチンを、ME’にカップリングして、3’-(I(a))および3’-(I(c))リンカーを形成した。そのアニーリング反応物は、NaCl緩衝液を使用して、25μL容積にあった。その得られた二本鎖トランスポゾンを、トランスポザーゼと、37℃において一晩の反応で各々複合体化した。トランスポソーム複合体を形成した後、そのA14およびB15トランスポソーム複合体を等容積で一緒に混合し、ストレプトアビジンビーズ上に濃度300nMで装填し、密度300nMで結合した複合体を得た。一旦ビーズに結合した後、その(I(a))および(I(c))の300nM 密度の混合物を、濃度120nMへとさらに希釈した。従って、そのビーズは、300nM 密度をなお有するが、その複合体は、希釈溶液中に濃度120nMで存在する。その希釈工程は、ビーズ上の複合体の密度を変化させないので、ライブラリー収量には影響を及ぼすが、挿入物サイズには影響を及ぼさない。
A14-MEおよびB15-MEトランスポゾンを、3’ビオチンを含むME’に各々アニールした。その3’ビオチンを、3’-(I(c))リンカーを通じてME’にカップリングした。そのアニーリング反応物は、NaCl緩衝液を使用して、25μL容積にあった。その得られた二本鎖トランスポゾンを、トランスポザーゼに、37℃において一晩の反応で各々結合させた。トランスポソームを形成した後、そのA14およびB15トランスポソーム複合体を等容積で一緒に混合し、ストレプトアビジンビーズ上に種々の密度(10nM~800nM)で装填した。
新鮮な全血を、Flex Lysis Reagentキット(Illumina,カタログ番号20015884)を使用して加工処理した。新鮮な全血をEDTA収集チューブへと集め、加工処理する前に4℃において貯蔵した。溶解マスターミックスを、各サンプルに関して以下の容積を混合することによって調製した:7μlのBlood Lysis Buffer、2μlのプロテイナーゼK、および31μlのヌクレアーゼ非含有水。各サンプルに関して、10μlの血液、40μlの溶解マスターミックス、および20μlのSPRIビーズを、96ウェルPCRプレートの1ウェルに添加し、その溶液を10回ピペッティングすることによって混合した。そのプレートをシールし、10分間、56℃において加熱したふた付きのサーマルサイクラーでインキュベートした。次いで、そのプレートを、板状の磁石の上に5分間置き、その上清を廃棄し、150μlの80% エタノールを添加した。30秒間磁石上でインキュベートした後、そのエタノールを廃棄し、そのプレートを磁石から外した。そのビーズを30μlの水の中で再懸濁すると、ライブラリー調製の準備ができた。
Claims (41)
- (i)トランスポザーゼ、
(ii)以下:
(a)第1のトランスポゾン末端配列を含む3’部分;および
(b)該第1のトランスポゾン末端配列の5’末端において第1のアダプター配列
を含む第1のトランスポゾン;
(iii)該第1のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的な第2のトランスポゾン末端配列を含む第2のトランスポゾン;ならびに
(iv)該第2のトランスポゾンの3’末端に結合する第1の末端と、親和性エレメントに結合する第2の末端とを含む、リンカー、
を含み、前記リンカーおよび親和性エレメントは、式(I)の構造:
を有し、ここで:
AEは、該親和性エレメントであり;
Yは、C2-6アルキレンであり;
X1は、O、NR1、またはSであり;
ここでR1は、HまたはC1-10アルキルであり;
nは、1~6の整数であり;
X2は、O、CH2、またはSであり;
Raは、Hまたは-OHであり;そして
Zは、RaがHであるときに非存在であるか、またはRaがHもしくはOHであるときにCH2であり;
ここで
は、該第2のトランスポゾンへの接続点のマークである、トランスポソーム複合体。 - 式(I)中のホスフェート基は、前記第2のトランスポゾンの末端ヌクレオチドの3’ヒドロキシルに接続される、請求項1に記載の複合体。
- AEは、必要に応じて置換されたビオチンもしくはアミノ基を含むか、または必要に応じて置換されたビオチンもしくはアミノ基である、請求項1または2に記載の複合体。
- AEは、ビオチンである、請求項3に記載の複合体。
- Yは、C2-6アルキレン、C2-5アルキレン、C2-4アルキレン、またはC2-3アルキレンである、請求項1~4のいずれか1項に記載の複合体。
- Yは、エチレン、プロピレン、またはブチレンである、請求項5に記載の複合体。
- X1は、NR1であり、そしてここでR1は、HまたはC1-10アルキルである、請求項1~6のいずれか1項に記載の複合体。
- R1は、Hである、請求項7に記載の複合体。
- nは、1または2である、請求項1~8のいずれか1項に記載の複合体。
- X2は、CH2である、請求項1~9のいずれか1項に記載の複合体。
- X2は、Oである、請求項1~9のいずれか1項に記載の複合体。
- Raは、Hであり、Zは、非存在である、請求項1~11のいずれか1項に記載の複合体。
- Raは、Hであり、Zは、CH2である、請求項1~11のいずれか1項に記載の複合体。
- Raは、-OHであり、Zは、CH2である、請求項1~11のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記トランスポザーゼは、Tn5トランスポザーゼである、請求項1~18のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記Tn5トランスポザーゼは、野生型Tn5トランスポザーゼもしくは活性亢進Tn5トランスポザーゼ、またはその変異体であり、ここで該トランスポザーゼは、精製タグに必要に応じて結合体化される、請求項19に記載の複合体。
- 前記第1のトランスポゾン末端配列および前記第2のトランスポゾン末端配列は、MEおよびME’であり、MEがAGATGTGTATAAGAGACAG(配列番号8)であり、ME’が5’-phos-CTGTCTCTTATACACATCT-3’(配列番号5)である、請求項19または20に記載の複合体。
- 前記第1のアダプター配列は、プライマー配列を含む、請求項1~21のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記第1のアダプター配列は、A14またはB15を含み、A14が5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(配列番号6)であり、B15が5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’(配列番号7)である、請求項22に記載の複合体。
- 少なくとも2つの複合体を含む混合物であって、前記混合物は、請求項22に記載の第1の複合体であって、前記第1のアダプター配列が第1のプライマー配列を含む、第1の複合体と、請求項22に記載の第2の複合体であって、前記第1のアダプター配列が第2のプライマー配列を含む、第2の複合体とを含む、混合物。
- 前記第1のプライマー配列は、A14を含み、前記第2のプライマー配列は、B15を含み、A14が5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(配列番号6)であり、B15が5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’(配列番号7)である、請求項24に記載の混合物。
- 第1のトランスポゾンおよび第2のトランスポゾンを含む改変されたオリゴヌクレオチドであって、ここで該第1のトランスポゾンは、(a)第1のトランスポゾン末端配列を含む3’部分、および(b)該第1のトランスポゾン末端配列の5’末端において第1のアダプター配列を含み、該第2のトランスポゾンは、該第1のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的でありかつこれにアニールされる第2のトランスポゾン末端配列を含み、そしてここでリンカーの第1の末端は、該第2のトランスポゾンの3’末端に結合され、該リンカーの第2の末端は、親和性エレメントに結合され、該リンカーおよび親和性エレメントは、請求項1に記載の式(I)、請求項15に記載の式(I’)、請求項16に記載の式(Ia)、請求項17に記載の式(Ib)もしくは式(Ic)、または請求項18に記載の式(I(a))、式(I(b))、もしくは式(I(c))の構造を有する、改変されたオリゴヌクレオチド。
- 前記親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに結合され、それによって、前記複合体は、該固体支持体に結合される、請求項1~23のいずれか1項に記載の複合体、または請求項24に記載の混合物。
- 前記親和性エレメントは、ビオチンであり、前記親和性結合パートナーは、ストレプトアビジンである、請求項27に記載の複合体または混合物。
- 前記固体支持体は、ビーズまたは常磁性ビーズである、請求項27または28に記載の複合体または混合物。
- タグ化核酸フラグメントのライブラリーを二本鎖標的核酸から生成するための方法であって、該方法は、該標的核酸を、請求項27~29のいずれか1項に記載の結合した複合体とともに、該標的核酸を複数の標的フラグメントへとフラグメント化し、そして前記第1のトランスポゾンの3’末端を該標的フラグメントの5’末端に繋ぐために十分な条件下でインキュベートして、複数の5’タグ化標的フラグメントを生成する工程を包含する方法。
- 前記5’タグ化標的フラグメントのうちの1またはこれより多くを増幅する工程をさらに包含する、請求項30に記載の方法。
- 前記増幅する工程は、完全二重鎖化した5’タグ化標的フラグメントを生成および/または増幅することを包含する、請求項31に記載の方法。
- 前記増幅することは、各末端にプライマー配列を含む少なくとも1つの完全二重鎖化した5’タグ化標的フラグメントを、二次アダプターキャリア、単一のヌクレオチド、およびポリメラーゼとともに、該標的フラグメントを増幅し、該二次アダプターキャリアを組み込むために十分な条件下でインキュベートする工程であって、ここで該二次アダプターキャリアは、該プライマー配列に対する相補体および二次アダプター配列を含む工程を包含し、それによって、配列決定フラグメントのライブラリーを生成する、請求項31または32に記載の方法。
- 前記二次アダプターキャリアは、プライマー配列、インデックス配列、バーコード配列、精製タグ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記二次アダプターキャリアは、インデックス配列およびプライマー配列を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記完全二重鎖化した5’タグ化標的フラグメントは、各末端において異なるプライマー配列を含み、必要に応じて、ここで該異なるプライマー配列は、A14およびB15であり、A14が5’-TCGTCGGCAGCGTC-3’(配列番号6)であり、B15が5’-GTCTCGTGGGCTCGG-3’(配列番号7)である、請求項32~35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記二次アダプターキャリアは各々、2種のプライマー配列のうちの一方および複数のインデックス配列のうちの1種を含み、必要に応じてここで該2種のプライマー配列は、P5プライマー配列およびP7プライマー配列であり、P5がAATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(配列番号1)であり、P7がCAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT(配列番号2)である、請求項34~36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フラグメントは、フローセルまたは固体支持体にグラフト化された相補的プライマーにハイブリダイズされる、請求項30~37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記5’タグ化標的フラグメントまたはその増幅生成物のうちの1またはこれより多くを配列決定する工程さらに包含する、請求項30~38のいずれか1項に記載の方法。
- 固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を調製するための方法であって、該方法は、トランスポザーゼを、請求項26に記載の改変されたオリゴヌクレオチドで、トランスポソーム複合体において該トランスポザーゼおよび改変されたオリゴヌクレオチドを結合するために十分な条件下で処理する工程を包含する方法。
- 前記トランスポソーム複合体を、親和性結合パートナーを含む固体支持体とともに、前記親和性エレメントが該親和性結合パートナーと結合するために十分な条件下でインキュベートする工程をさらに包含する、請求項40に記載の方法。
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