KR20230129172A - 타가토스를 생산하기 위한 바실러스 서브틸리스 유전자조작된 박테리아 및 타가토스 제조 방법 - Google Patents
타가토스를 생산하기 위한 바실러스 서브틸리스 유전자조작된 박테리아 및 타가토스 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
타가토스를 생산하기 위한 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아 및 타가토스 제조 방법이 제공되며, 상기 유전자 조작된 박테리아는 개별 발현 또는 공동 발현되는 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제, 내열성 포스포글루코뮤타제, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 구축을 포함한다. 상기 유전자 조작된 박테리아를 이용하여 전분을 타가토스로 효과적으로 전환시킬 수 있다. 상기 방법은 기존의 타가토스 생산 방법에 비해 전세포 재활용에 적합하고 안전 성능이 높으며 수율이 높고 생산 공정이 간단하며 비용이 낮고 대규모 제조가 쉬운 등의 이점이 있다.
Description
본 발명은 생체공학 기술 분야에 관한 것으로, 특히 타가토스를 생산하는 유전자 조작된 박테리아 및 타가토스 제조 방법에 관한 것이다.
타가토스(Tagatose)는 자연적으로 존재하는 희귀한 단당류로, 갈락토스(galactose)의 케토스(ketose) 형태이고 과당의 에피머(epimer)이다. 타가토스의 단맛 특성은 자당과 유사하나 칼로리는 자당의 3분의 1에 불과하여 저칼로리 감미제로 불리운다. 천연 타가토스는 주로 요구르트, 분유 등의 유제품에 존재한다. 타가토스는 매우 신선하고 순수한 당도를 제공하고 맛의 특징은 과당과 비슷하다. 연구에 따르면 타가토스는 저칼로리, 저혈당지수, 충치 방지, 산화 방지, 프리바이오틱스(Prebiotics), 장 기능 개선, 면역 조절, 프로드러그(Prodrug) 등의 중요한 생리적 특성을 가지고 있어, 식품, 음료, 의약, 건강 관리 등 분야에 널리 적용될 수 있으며 거대한 경제적 가치를 가진다(Oh D-K: Tagatose: properties, applications, and biotechnological processes. App. Microbiol. Biotechnol. 2007, 76:1-8).
2001년, 미국 식품의약국(FDA)은 타가토스의 안전성을 확인하고 이를 GRAS(Generally Regarded As Safe) 제품으로 승인하였다. FDA는 2002년 12월에 타가토스를 치아 친화적 성분으로서 승인하고 2003년 10월에 이를 감미제로서 식품 및 음료 업계 및 의약 분야에 사용할 수 있도록 식품첨가물로 승인하였다. 2001년, 국제연합식량농업기구 및 세계보건기구 합동 식품첨가물 전문가 위원회(JECFA)는 타가토스를 식품첨가물로 사용할 수는 새로운 저칼로리 감미제로 추천하여 식품첨가물로서 사용할 수 있다. 2004년 제63차 회의에서 타가토스의 1일 섭취 허용량(ADI)을 제한할 필요가 없다고 밝혔고 "지정되지 않은” ADI를 JECFA에서 배치할 수 있는 식품 성분의 가장 안전한 목록에 배정하였다. 한국, 호주(오스트레일리아 및 뉴질랜드) 및 유럽 연합은 각각 2003년, 2004년 및 2005년에 타가토스의 본 지역 출시를 승인하였고, 그 중 2005년 12월에 유럽 연합에서 타가토스를 어떠한 사용 제한도 없는 새로운 식품 성분으로 공식 승인하였다. 중국에서도 2014년 5월에 타가토스를 새로운 식품 원료로 승인하였다. 현재, 타가토스는 전 세계 30여 개국 및 WHO/FAO와 국제식품규격위원회의 승인을 받았고 이의 1일 섭취 허용량 및 사용 용도를 제한하지 않는다.
타가토스의 생산 방법은 주로 화학 합성법 및 생물 전환법이 있다. 일반적으로 갈락토스를 원료로 사용하여 화학적 방법 또는 생물 전환을 통한 이성질체화 반응에 의해 형성된다. 화학 합성법은 가용성 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염을 촉매로 사용하여 갈락토스가 알칼리성 조건에서 타가토스를 생성하고 금속 수산화물-타가토스 복합체를 형성하도록 촉진한 후 산으로 중화시켜 타가토스를 얻는 것이다. 화학적 방법은 에너지 소비가 높고 생성물이 복잡하며 정제가 어렵고 부반응이 많으며 화학적 오염이 발생된다. 생물학적 방법은 갈락티톨(galactitol) 또는 갈락토스를 사용하여 효소 또는 미생물의 촉매 작용 하에 상응하는 기질을 타가토스로 전환시키는 것이다. 갈락티톨은 가격이 높고 공급원이 제한되어 산업화 생산 원료로 사용하기에 적합하지 않다. 현재 타가토스의 주요 생산 방법은 갈락토스의 이성질체화, 탈염, 탈색, 분리, 농축, 결정화 등의 단계를 거쳐 순수 타가토스를 제조하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 갈락토스가 타가토스로 완전히 전환되지 못하고 최종 생성물이 갈락토스와 타가토스의 혼합물이므로 타가토스 분리 공정이 복잡하고 전환율이 낮으며 분리 비용이 높은 동시에 원료인 갈락토스의 가격이 저렴하지 않아 궁극적으로 타가토스의 생산 비용이 높은 단점이 존재한다.(Rhimi M, Aghajari N, Juy M, Chouayekh H, Maguin E, Haser R, Bejar S: Rational design of Bacillus stearothermophilus US100l-arabinose isomerase: Potential applications for d-tagatose production. Biochim. 2009, 91:650-653. Oh H-J, Kim H-J, Oh D-K: Increase in d-tagatose production rate by site-directed mutagenesis of l-arabinose isomerase from Geobacillus thermodenitrificans. Biotechnol. Lett. 2006, 28:145-149. Bosshart A, Hee CS, Bechtold M, Schirmer T, Panke S:Directed divergent evolution of a thermostable D-tagatose epimerase towards improved activity for two hexose substrates. ChemBioChem 2015,16:592-601.)
한국 CJ 회사에서 과당으로부터 타가토스로의 전환을 케토헥소키나제(ketohexokinase), 아돌라아제(aldolase), 피타아제(phytase)를 포함하는 다중 효소로 촉매화하는 기술을 발명하였지만(Oh DK, HONG SH, Lee SH: Aldolase, aldolase mutants and tagatose using the same production methods and compositions for production. WO2015016544A1), 과당으로부터 과당-6-인산(Fructose-6-phosphate)을 생산하려면 ATP에 의한 과당의 기질 인산화가 필요한데, 고가의 ATP 첨가로 인해 타가토스의 생산 비용이 높아지므로 산업화 생산 가치가 없다(TW107111500, US20160186162A1). 한국 CJ 회사는 과당을 타가토스로 전환시키기 위해 헥수론산 C4-에피머라아제(Hexuronate C4-epimerase)를 발굴 및 변형시켰지만(CN105431541B, CN109415715A), 변형된 헥수론산 C4-에피머라아제의 효소 활성이 매우 낮으므로 산업화 적용 가치가 없다. 또한, 한국 CJ 회사는 새로운 공급원의 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 (tagatose-6-phosphate phosphatase)를 발굴하고 이를 전분, 말토덱스트린(maltodextrin) 및 자당 등의 기질로부터 타가토스로의 전환 및 생산에 적용하였지만(WO2018004310A1, CN 109790524 A), 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 효소 활성이 매우 낮아 현 단계에서 산업화 적용 가치가 없다.
중국과학원 텐진산업생명공학연구소는 저렴한 옥수수 전분, 말토덱스트린, 자당 등을 원료로 사용하여 타가토스의 체외 다중 효소 합성을 위한 새로운 경로를 구축하여 기존 타가토스의 생산 공정을 근본적으로 변화시켰다(CN106399427A). 이를 바탕으로 중국과학원 텐진산업생명공학연구소는 저렴한 옥수수 전분, 셀룰로오스, 말토덱스트린, 자당 등을 원료로 사용하여 전세포(whole-cell)의 촉매 작용에 의해 타가토스를 제조하는 방법(CN107988286A)을 개시하였는 바, 해당 공정은 다중 효소 정제 공정 단계를 줄여 생산 비용 및 환경 오염을 줄이고 타가토스의 수율을 높였다. 그러나 상기 방법에서 건효소(key enzyme)의 발효 및 생산 숙주는 대장균BL21(DE3)인데, 대장균은 식품 제제 생산에 관련된 효소의 생산 균주로서 산업화 생산에 적합하지 않을 뿐만 아니라 체외 효소의 분리 정제 단계가 번거롭고 효소의 회수 및 재이용률이 낮으며 재활용이 어려워 더 이상의 생산 비용 절감이 불가능하므로 산업화 고농도 생성물의 대량 생산에 대한 적용을 구현할 수 없다.
따라서, 전세포 재활용이 가능하고, 안전 성능이 높으며, 수율이 높고, 생산 공정이 간단하며, 비용이 낮고, 높은 기질 농도의 투입 및 타가토스의 높은 생성물 생산에 적합하여 타가토스를 대규모로 제조하기 쉬운 새로운 방법의 개발이 시급하다.
기존 다중 효소 촉매 작용에 의한 타가토스 제조 방법에서 존재하는 문제, 예를 들어 대장균이 식품 제제의 산업화 생산에 불리하고 정제 단계가 번거로우며 효소의 회수 재이용률이 낮고 재활용이 어려우며 저농도 기질 전분의 투입 등의 문제에 대하여, 본 발명의 주요 목적은 바실러스 서브틸리스의 전세포의 촉매 작용에 의해 고농도 전분으로부터 고농도 타가토스를 제조 및 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
먼저, 본 발명은 타가토스를 생산하기 위한 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아를 제공하고, 이는 알파-글루칸 포스포릴라제(α-Glucan phosphorylase) 유전자, 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase) 유전자, 포스포글루코스 이성질화효소(phosphoglucose isomerase) 유전자, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제tagatose-6-phosphate epimerase) 유전자 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제(tagatose-6-phosphate phosphatase) 유전자를 공동 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아이거나, 또는 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자, 포스포글루코뮤타제 유전자, 포스포글루코스 이성질화효소 유전자, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자를 각각 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아의 혼합물이다.
상기 기술적 해결수단의 원리는 관련 촉매화 경로를 충분히 이용하여 살아있는 세포 수준에서 발현하고 효과적인 촉매 반응을 구현하는 것으로, 이는 무기인의 존재 하에서 기질 전분을 알파-글루칸 포스포릴라제에 의해 중간체 글루코스-1-인산(glucose-1-phosphate, G1P)으로 전환시키고; 중간체 글루코스-1-인산(G1P)을 포스포글루코뮤타제에 의해 또 다른 중간체 글루코스-6-인산(glucose-6-phosphate, G6P)으로 위치 이동시키며; 중간체 글루코스-6-인산(G6P)을 포스포글루코스 이성질화효소에 의해 또 다른 중간체 과당-6-인산(Fructose-6-phosphate, F6P)으로 위치 이동시키고; 중간체 과당-6-인산(F6P)을 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제에 의해 또 다른 중간체 타가토스-6-포스페이트(tagatose-6-phosphate, T6P)으로 이성질체화하며; 중간체 타가토스-6-포스페이트(T6P)을 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제에 의해 인산기를 제거하여 타가토스(Tagatose)를 생성하는 것을 포함한다.
Bacillus subtilis 168, DB104, WB800, WB600, SCK6, 1A751, ATCC6051a, ATCC6051 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 바실러스 서브틸리스 균주는 모두 본 발명의 출발 균주로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 바실러스 서브틸리스 출발 균주는 WB800, WB600, SCK6, 1A751 등과 같이 프로테아제(protease)가 녹아웃(Knockout)된 바실러스 서브틸리스 균주이다. 보다 바람직하게는, 상기 바실러스 서브틸리스 출발 균주는 SCK6이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아는 알파-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코스 이성질화효소, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 공동 발현하는 발현 벡터를 포함하거나, 또는 알파-글루칸 포스포릴라제의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아, 포스포글루코뮤타제의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아, 포스포글루코스 이성질화효소의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아의 혼합물이다.
바람직하게는, 상기 각 효소는 내열성인데, 즉 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제, 내열성 포스포글루코뮤타제, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제이다. 비내열성의 상온 효소에 비해, 내열성 효소의 사용은 균주를 불활성화하는 측면에서 이점이 있는 바, 즉 후자는 발효 종료 후 가열 처리의 방식을 통해 균주를 불활성화시킬 수 있음과 동시에 타가토스 합성 관련 효소는 활성을 유지함으로써 불활성화된 균주를 혼합하여 타가토스 생산에 사용할 수 있어 산업적 적용에 더 적합하다. 상온의 관련 효소를 사용할 경우, 발효 생산이 종료된 후 균체를 파쇄하고 효소를 정제하는 단계를 통해 순수한 효소를 얻어야만 타가토스 생산을 위한 관련 효소를 얻을 수 있다.
구체적으로, 상기 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제는 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상 또는 80℃ 이상에서 전분을 글루코스-1-인산(G1P)으로 인산화하는 기능을 갖는 효소를 의미한다. 보다 바람직하게는, 상기 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제는 Geobacillus kaustophilus, Geobacillus stearothermophilus, Thermotoga maritima, Pseudothermotoga thermarum, Thermococcus kodakarensis, Archaeoglobus fulgidus, Thermoanaerobacter indiensis, Dictyoglomus thermophilum, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Clostridium thermocellum, Caldilinea aerophila, Pyrococcus furiosus, Thermus thermophilus, Methanothermobacter marburgensis, Archaeoglobus profundus 등과 같은 호열성 미생물로부터 유래되거나; 또는 상기 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제의 아미노산 서열은 상기 호열성 미생물로부터 유래된 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 가진다. 보다 더 바람직하게는, 상기 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제는 Thermococcus kodakarensis로부터 유래된다.
구체적으로, 내열성 포스포글루코뮤타제는 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상 또는 80℃ 이상에서 글루코스-1-인산(G1P)을 글루코스-6-인산(G6P)으로 위치 이동시키는 기능을 가지는 효소를 의미한다. 보다 바람직하게는, 상기 내열성 포스포글루코뮤타제는 Geobacillus kaustophilus, Geobacillus stearothermophilus, Thermotoga maritima, Pseudothermotoga thermarum, Thermococcus kodakarensis, Archaeoglobus fulgidus, Thermoanaerobacter indiensis, Dictyoglomus thermophilum, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Clostridium thermocellum, Caldilinea aerophila, Pyrococcus furiosus, Thermus thermophilus, Methanothermobacter marburgensis, Archaeoglobus profundus 등과 같은 호열성 미생물로부터 유래되거나; 또는 상기 내열성 포스포글루코뮤타제의 아미노산 서열은 상기 호열성 미생물로부터 유래된 내열성 포스포글루코뮤타제와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 가진다. 보다 더 바람직하게는, 상기 내열성 포스포글루코뮤타제는 Thermococcus kodakarensis로부터 유래된다.
구체적으로, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소는 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상 또는 80℃ 이상에서 글루코스-6-인산(G6P)을 과당-6-인산(F6P)으로 위치 이동시키는 기능을 가지는 효소를 의미한다. 보다 바람직하게는, 상기 내열성 포스포글루코스 이성질화효소는 Geobacillus kaustophilus, Geobacillus stearothermophilus, Thermotoga maritima, Pseudothermotoga thermarum, Thermococcus kodakarensis, Archaeoglobus fulgidus, Thermoanaerobacter indiensis, Dictyoglomus thermophilum, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Clostridium thermocellum, Caldilinea aerophila, Pyrococcus furiosus, Thermus thermophilus, Methanothermobacter marburgensis, Archaeoglobus profundus 등과 같은 호열성 미생물로부터 유래되거나; 또는 상기 내열성 포스포글루코스 이성질화효소의 아미노산 서열은 상기 호열성 미생물로부터 유래된 내열성 포스포글루코스 이성질화효소와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 가진다. 보다 더 바람직하게는, 상기 내열성 포스포글루코스 이성질화효소는 Thermus thermophilus로부터 유래된다.
구체적으로, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상 또는 80℃ 이상에서 과당-6-인산(F6P)을 타가토스-6-포스페이트(T6P)으로 이성질체화하는 기능을 가지는 효소를 의미한다. 보다 바람직하게는, 상기 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는 Geobacillus kaustophilus, Geobacillus stearothermophilus, Thermotoga maritima, Pseudothermotoga thermarum, Thermococcus kodakarensis, Archaeoglobus fulgidus, Thermoanaerobacter indiensis, Dictyoglomus thermophilum, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Clostridium thermocellum, Caldilinea aerophila, Pyrococcus furiosus, Thermus thermophilus, Methanothermobacter marburgensis, Archaeoglobus profundus 등과 같은 호열성 미생물로부터 유래되거나; 또는 상기 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제의 아미노산 서열은 상기 호열성 미생물로부터 유래된 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 가진다. 보다 더 바람직하게는, 상기 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는 Thermoanaerobacter indiensis로부터 유래된다.
구체적으로, 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상 또는 80℃ 이상에서 타가토스-6-포스페이트(T6P)의 인산기를 제거하여 타가토스(Tagatose)를 생산하는 기능을 가지는 효소를 의미한다. 보다 바람직하게는, 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는 Geobacillus kaustophilus, Geobacillus stearothermophilus, Thermotoga maritima, Pseudothermotoga thermarum, Thermococcus kodakarensis, Archaeoglobus fulgidus, Thermoanaerobacter indiensis, Dictyoglomus thermophilum, Caldicellulosiruptor kronotskyensis, Clostridium thermocellum, Caldilinea aerophila, Pyrococcus furiosus, Thermus thermophilus, Methanothermobacter marburgensis, Archaeoglobus profundus 등과 같은 호열성 미생물로부터 유래되거나; 또는 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 아미노산 서열은 상기 호열성 미생물로부터 유래된 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 가진다. 보다 더 바람직하게는, 상기 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는 Archaeoglobus fulgidus로부터 유래된다.
따라서, 본 발명은 상기 유전자 조작된 박테리아에 사용되는 발현 벡터를 제공하고, 상기 발현 벡터는 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자, 포스포글루코뮤타제 유전자, 포스포글루코스 이성질화효소 유전자, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자를 포함하며, 이러한 유전자들을 공동 발현할 수 있다.
당업자는 본 발명에 관련된 벡터 및 유전자 조작된 박테리아는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통해 제조될 수 있음을 이해할 수 있는 바, 예를 들어 재조합 DNA 기술를 통해 구축하여 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자, 포스포글루코뮤타제 유전자, 포스포글루코스 이성질화효소 유전자, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자, 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자를 얻고, 재조합 발현 벡터를 구축한 후, 공지된 방법으로 바실러스 서브틸리스에 형질도입하여 유전자 조작된 박테리아를 얻는다.
보다 바람직하게는, 상기 벡터는 프로모터(promoter), 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자, 내열성 포스포글루코뮤타제 유전자, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소 유전자, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전 및 터미네이터(Terminator)를 포함한다. 상기 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제를 발현하는 벡터는 프로모터, 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자, 터미네이터를 포함하고; 상기 내열성 포스포글루코뮤타제를 발현하는 벡터는 프로모터, 내열성 포스포글루코뮤타제 유전자, 터미네이터를 포함하며; 상기 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 포함하는 벡터는 프로모터, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자, 터미네이터를 포함하고; 상기 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 발현하는 벡터는 프로모터, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자, 터미네이터를 포함하며; 상기 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 벡터는 프로모터, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자, 터미네이터를 포함한다.
당업자는 당업계에 공지된 다양한 프로모터가 모두 본 발명의 프로모터로 사용될 수 있고, P43 프로모터, Pylb 프로모터, PamyL 프로모터, Plaps 프로모터, PhpaII 프로모터, PamyE 프로모터, Pgrac 프로모터, PsacB 프로모터, PsigX 프로모터, PaprE 프로모터, PgroES 프로모터 등을 포함하나 이에 한정되지 않음을 이해할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 프로모터는 PhpaII 프로모터와 Pylb 프로모터가 직렬 연결된 것을 선택한다. 당업계에 공지된 다양한 터미네이터 또한 본 발명의 터미네이터로 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 유전자 조작된 박테리아에서의 내인성 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제(uracil phosphoribosyltransferase) 유전자, 및/또는 α-아밀라아제(α-amylase) 유전자, 및/또는 포자 형성 RNA 중합효소 σF인자 유전자, 및/또는 서팩틴 합성효소 서브유닛 3 유전자는 비활성화 또는 녹아웃된다. 가장 바람직하게는, 상기 유전자 조작된 박테리아에서의 내인성 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제 유전자, α-아밀라아제 유전자, 포자 형성 RNA 중합효소 σF인자 유전자, 및 서팩틴 합성효소 서브유닛 3 유전자는 모두 비활성화 또는 녹아웃된다. 여기서 상기 유전자의 비활성화 또는 녹아웃은 유전자 조작된 박테리아로부터 타가토스를 생산하는 효율을 추가로 향상시킬 수 있는데, 구제적인 이유는 다음과 같은 바, 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제 유전자의 비활성화 또는 녹아웃은 흔적 없는 유전자 조작 시스템을 구축할 수 있고, 그 후의 유전적 조작(즉 유전자 녹아웃)은 흔적 없는 조작이 가능하며 저항성 유전자 등의 외인성 유전자 도입이 없고; α-아밀라아제 유전자의 비활성화 또는 녹아웃은 균주의 외인성 전분 이용 경로를 차단하며 타가토스를 생산하는 기질 전분이 균주에 의해 탄소원 대사로서 이용되는 것을 방지할 수 있고; 포자 형성 RNA 중합효소 σF인자 유전자의 비활성화 또는 녹아웃은 균종의 대사를 타가토스 합성에 관련된 이종 단백질 합성 및 발현으로 유도할 수 있으며, 동시에 포자를 형성하지 않고 균주의 발효를 제어할 수 있으며; 서팩틴 합성효소 서브유닛 3 유전자의 비활성화 또는 녹아웃은 균체를 발효 및 생산할 때 보다 쉽게 제어하고 너무 많은 기포를 생성하지 않을 수 있다. 따라서, 상기 4개의 유전자의 비활성화 또는 녹아웃은 유전자 조작된 박테리아가 타가토스를 생성하는데 더 유리할 수 있으므로 바람직한 실시형태이다.
당업계 공지된 방법을 통해 내인성 유전자의 비활성화 또는 녹아웃을 구현하는데, 바람직하게는 유전자 편집 방법을 사용하여 구현한다.
본 발명은 상기 유전자 조작된 박테리아의 전세포의 촉매 작용에 의한 전분으로부터 타가토스로의 제조 및 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은,
상기 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아를 발효시켜 전세포를 얻는 단계 (1);
단계 (1)에서 얻은 바실러스 서브틸리스의 전세포를 세포막 투과성 처리하여 투과성 전세포를 얻는 단계 (2); 및
단계 (2)에서 얻은 투과성 전세포의 촉매 작용에 의해 전분으로부터 타가토스를 제조하되, 공동 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아는 직접 촉매 작용에 사용되고, 각 효소를 각각 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아는 혼합하여 촉매 작용에 사용되는 단계 (3)을 포함한다.
바람직하게는, 단계 (2)에서 얻은 바실러스 서브틸리스 투과성 전세포를 고정화 처리하여 고정화 전세포 또는 고정화 전세포 혼합물을 얻은 후 촉매 작용에 사용하는 단계를 더 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 단계 (1)의 상기 전세포 제조는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행된다. 발효에는 외인성 단백질 발현에 적합한 임의의 배지를 사용할 수 있는데, LB 배지, SR 배지, TB 배지 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
바람직한 실시형태에서, 단계 (2)에서, 상기 세포막 투과성 처리는 공지된 방법을 사용할 수 있는데, 열처리, 유기 용매 첨가 및/또는 계면활성제 첨가 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 여기서, 유기 용매는 아세톤(acetone), 아세토니트릴(acetonitrile) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(Cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB), Tween-80 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 세포막 투과성 처리는 열처리이다. 세포막을 투과성 처리하는 목적은 세포외의 전분이 세포막을 통해 세포 내로 들어갈 수 있도록 하는 것이다.
여기서 바람직하게는, 상기 열처리의 온도는 45-100℃이고; 보다 바람직하게는, 열처리의 온도는 70-80℃이다. 바람직하게는, 열처리 시간은 10-100분이며; 보다 바람직하게는, 열처리 시간은 50-70분이다. 바람직하게는, 열처리시 세포 농도는 OD600=10-300이고; 보다 바람직하게는, 세포 농도는 OD600=30-150이다. 동시에, 상기 열처리는 완충액이 없는 시스템 또는 완충액 시스템에서 진행될 수 있고; 바람직하게는, 상기 열처리는 완충액 시스템에서 진행되며, 상기 완충액은 HEPES 완충액, 인산염 완충액, Tris 완충액, 아세테이트 완충액 등일 수 있다. 여기서, 인산염 완충액의 예로는 인산나트륨(sodium phosphate) 완충액, 인산칼륨(potassium phosphate) 완충액 등이 있다.
구체적인 실시형태에서, 촉매화된 반응 시스템에서, 기질 전분의 농도는 50-300 g/L이고; 보다 바람직하게는, 기질 전분의 농도는 100-200 g/L이다. 바람직하게는, 이의 반응 조건은 pH 5.0-8.0, 40-80℃에서 0.5-96시간 동안 반응하는 것이고; 보다 바람직하게는 pH 6.5-7.5, 45-75℃에서 12-60시간 동안 반응하는 것이며; 가장 바람직하게는 pH 7.5, 60-70℃에서 12-96시간 동안 반응하는 것이다. 상기 촉매화는 완충액이 없는 시스템 또는 완충액 시스템에서 진행될 수 있고; 바람직하게는, 완충액 시스템에서 진행되며, 상기 완충액은 HEPES 완충액, 인산염 완충액, Tris 완충액, 아세테이트 완충액 등일 수 있다. 여기서, 인산염 완충액의 예로는 인산나트륨 완충액, 인산칼륨 완충액 등이 있다.
바람직하게는, 각 효소를 각각 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아의 투과성 전세포의 혼합물은 (0.1-10):(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10)의 비율로 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 포스포글루코뮤타제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 투과성 전세포를 혼합한 것이고; 보다 바람직하게는 (0.5-5):(0.5-5):(0.5-5):(0.5-5):(0.5-5), 가장 바람직하게는 1:1:1:1:1로 혼합한 것이다.
구체적인 실시형태에서, 상기 투과성 전세포의 고정화 처리 방법에서, 인산나트륨 또는 인산칼륨 완충액으로 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제, 내열성 포스포글루코뮤타제, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 공동 발현하는 투과성 전세포를 재현탁하고, 적당량의 무기질토를 첨가하여 균일하게 교반한다. 폴리에틸렌이민(Polyethyleneimine) 수용액을 첨가하여 실온 조건에서 응집시킨 후, 가교제를 첨가하여 가교시킨다. 그 후 흡인 여과하여 필터 케이크층을 얻고, 탈이온수로 필터 케이크를 세척한 후 압축하여 과립으로 제조하고 건조시켜 고정화 전세포를 얻는다.
상기 고정화 투과성 전세포의 혼합물에 대한 처리 방법에서, 각각 인산나트륨 또는 인산칼륨 완충액으로 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 포스포글루코뮤타제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 투과성 전세포를 재현탁하고, 적당량의 무기질토를 첨가하여 균일하게 교반한다. 폴리에틸렌이민 수용액을 첨가하여 실온 조건에서 응집시킨 후, 가교제를 첨가하여 가교시킨다. 그 후 흡인 여과하여 필터 케이크층을 얻고, 탈이온수로 필터 케이크를 세척한 후 압축하여 과립으로 제조하고 건조시켜 고정화 전세포를 얻는다.
여기서, 상기 무기질토는 몬모릴로나이트(montmorillonite), 규조토, 고령토 및 벤토나이트(bentonite) 등을 포함하나 이에 한정되지 않고, 바람직하게는, 상기 무기질토는 규조토이며; 상기 가교제는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 트리하이드록시메틸포스핀(trihydroxymethylphosphine), N,N-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-Methylenebisacrylamide), 에피클로로히드린(epichlorohydrin), 제니핀(genipin) 등을 포함하나 이에 한정되지 않고, 바람직하게는, 상기 가교제는 글루타르알데히드이다.
기존 기술에 비해, 본 발명은 다음과 같은 유익한 효과를 가진다.
(1) 본 발명은 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제, 내열성 포스포글루코뮤타제, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 전세포의 촉매 작용을 최초로 이용하여 전분으로부터 타가토스를 생산함으로써, 간단하고 대규모 타가토스 제조가 쉬운 새로운 방법을 개발하였다.
(2) 바실러스 서브틸리스는 일반적으로 안전하다고 인정되는(Generally Recognized As Safe, GRAS) 식품급 미생물로 내독소를 생성하지 않는다. 더 나아가, α-아밀라아제 코딩 유전자의 녹아웃은 그 후의 기질 전분의 촉매화 적용에 유리하고; 포자 형성 RNA 중합효소 σF인자의 코딩 유전자의 녹아웃은 그 후의 타가토스를 생산하기 위한 기질의 전환에서 유전자 조작된 균주의 발효 및 생산의 적용에 유리하며; 서팩틴 합성효소 서브유닛 3의 코딩 유전자의 녹아웃은 그 후의 타가토스를 생산하기 위한 기질의 전환에서 유전자 조작된 균주의 발효 및 생산의 적용에 유리하다.
(3) 바람직한 실시형태에서, 다양한 내열성 효소를 사용하면 타가토스의 제조는 비교적 높은 온도에서 진행될 수 있음으로써, 기질 전분의 용해도를 향상시킬 수 있고, 기존 기술에 비해, 본 발명은 비교적 높은 기질 농도 하에 타가토스의 제조를 구현할 수 있으므로 생산 효율을 향상시키고 생산 비용을 더욱 절감하는 데 유리하다.
(4) 본 발명의 방법에서 타가토스의 전환 반응은 완충액이 없는 시스템 또는 완충액 시스템에서 진행될 수 있고, 탄소원, 질소원, 무기염 및 항생제를 포함하는 배지를 사용할 필요가 없으므로 한편으로는 생산 비용을 절감하는 데 유리하고 다른 한편으로는 타가토스 생성물의 분리 및 정제에 유리하다.
도 1은 본 발명의 전세포의 촉매 작용에 의한 전분으로부터 타가토스로의 생산의 사시도이다.
도 2는 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-aGP의 맵이다.
도 3은 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-PGM의 맵이다.
도 4는 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-PGI의 맵이다.
도 5는 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-TPE의 맵이다.
도 6은 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-TPP의 맵이다.
도 7은 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP의 맵이다.
도 8은 반응 시간에 따른 타가토스 생산량의 변화 과정 그래프이다.
도 9는 공동 발현하는 유전자 조작된 균주의 고정화에 의해 생산된 타가토스의 생산량 추세도이다.
도 10은 개별 발현하는 유전자 조작된 균주의 고정화에 의해 생산된 타가토스의 생산량 추세도이다.
도 2는 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-aGP의 맵이다.
도 3은 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-PGM의 맵이다.
도 4는 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-PGI의 맵이다.
도 5는 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-TPE의 맵이다.
도 6은 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-TPP의 맵이다.
도 7은 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP의 맵이다.
도 8은 반응 시간에 따른 타가토스 생산량의 변화 과정 그래프이다.
도 9는 공동 발현하는 유전자 조작된 균주의 고정화에 의해 생산된 타가토스의 생산량 추세도이다.
도 10은 개별 발현하는 유전자 조작된 균주의 고정화에 의해 생산된 타가토스의 생산량 추세도이다.
본 발명에서 채택된 기술적 해결수단 및 이의 효과를 추가로 설명하기 위해, 아래 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 기술적 해결수단을 추가로 설명한다. 그러나 상기 실시예는 예시적이고 바람직한 실시예일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 전제 하에 본 발명의 기술적 해결수단의 세부사항 및 형태를 수정 또는 대체할 수 있으나, 이러한 수정 또는 대체는 모두 본 발명의 보호 범위에 포함된다.
실시예 1: 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 SCK8의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-upp-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 바실러스 서브틸리스 Bacillus subtilis 168로부터 유래된 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제 코딩 유전자 upp 유전자 서열(NCBI-ProteinID: NP_391570)에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 upp 유전자의 업스트림 500 bp의 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻은 다음, simple cloning 연결 방식(You, C., Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 78(5), 1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11)을 사용하여 통합 벡터 pSS로 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-upp-FR을 얻었다.
(2) 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 SCK8의 구축
바실러스 서브틸리스 균주 SCK6 슈퍼 컴피턴트 세포(200μl)를 제조하고(Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. P. (2011). Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microb. Biotechnol., 4(1), 98-105. doi:10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x), 재조합 통합 벡터 pSS-upp-FR(1μg)을 바실러스 서브틸리스 균주 SCK6 슈퍼 컴피턴트 세포(200μl)와 균일하게 혼합한 다음 37℃의 진탕배양기에서 90분 동안 소생시킨 후, 박테리아 용액을 클로람페니콜(5 μg/mL)이 포함된 고체 LB 배지(효모추출물 5 g/L, 펩톤 10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 14-16시간 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 선별하여 콜로니 PCR 검증을 진행하였고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편 및 2000 bp의 DNA 단편의 두 가닥 밴드(여기서, 1000 bp의 DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-upp-FR에서 upp 코딩 유전자의 업-다운스트림 상동성 암(arm)의 단편 크기이고, 2000 bp의 DNA 단편의 크기는 게놈에 upp 코딩 유전자의 업스트림 상동성 암, upp 코딩 유전자 및 upp 코딩 유전자의 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편 크기임)는 양성 클론이다.
양성 클론을 선별하여 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지로 옮겨 8-12시간 동안 배양한 다음, 200μl의 박테리아 용액을 취해 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 멸균수로 재현탁하고 5-플루오로우라실(5-FU) 최소 염 배지(Minimal Salt Medium) 고정 플레이트(40% 글루코스 20.0 mL/L, 4% 글루타민 50.0 mL/L, 0.5% 트립토판 10.0 mL/L, 1% 비타민B1 1.0 mL/L, 20mM 5-플루오로우라실 500μL/L, 10Х최소 염(Minimal Salt) 100.0 mL/L, 1000Х미량 원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지에서 배양하는 것을 통해 양성 형질전환체가 분자 내 상동 재조합이 발생하도록 촉진하고, 5-FU 최소 염 배지를 통해 선별 및 배양하여 upp 녹아웃된 표적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU 최소 염 배지 고정 플레이트에서 몇 개의 콜로니를 선별하여 다시 콜로니 PCR 검증을 진행하였고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만을 가진 형질전환체는 양성 클론이다. 형질전환체를 PCR로 시퀀싱하여 정확성을 검증하고 정확한 균주, 즉 upp 유전자 녹아웃된 바실러스 서브틸리스 재조합 유전자 조작된 균주, 즉 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제의 효소 활성이 없는 바실러스 서브틸리스 재조합 유전자 조작된 균주를 저장하여 SCK8로 명명하였다.
실시예 2: 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 SCK8-ST1의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-amyE-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 바실러스 서브틸리스 Bacillus subtilis 168로부터 유래된 α-아밀라아제의 코딩 유전자 amyG 유전자 서열(NCBI-ProteinID: NP_388186)에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 amyG 유전자의 업스트림 500 bp의 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻은 다음, simple cloning 연결 방식(You, C., Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 78(5), 1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11)을 사용하여 통합 벡터 pSS로 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-amyE-FR을 얻었다.
(2) 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 SCK8-ST1의 구축
바실러스 서브틸리스 균주 SCK8 슈퍼 컴피턴트 세포(200μl)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-amyE-FR(1μg)을 바실러스 서브틸리스 균주 SCK8 슈퍼 컴피턴트 세포(200μl)와 균일하게 혼합한 다음 37℃의 진진탕배양기에서 90분 동안 소생시킨 후, 박테리아 용액을 클로람페니콜(5 μg/mL)이 포함된 고체 LB 배지(효모추출물 5 g/L, 펩톤 10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 14-16시간 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 선별하여 콜로니 PCR 검증을 진행하였고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편 및 2000 bp의 DNA 단편의 두 가닥 밴드(여기서, 1000 bp의 DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-amyE-FR에서 amyE 코딩 유전자의 업-다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp의 DNA 단편의 크기는 게놈에 amyE 코딩 유전자의 업스트림 상동성 암, amyE 코딩 유전자 및 amyE 코딩 유전자의 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편 크기임)는 양성 클론이다.
양성 클론을 선별하여 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지로 옮겨 8-12시간 동안 배양한 다음, 200μl의 박테리아 용액을 취해 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 멸균수로 재현탁하고 5-FU 최소 염 배지 고정 플레이트(40% 글루코스 20.0 mL/L, 4% 글루타민 50.0 mL/L, 0.5% 트립토판 10.0 mL/L, 1% 비타민B1 1.0 mL/L, 20mM 5-플루오로우라실 500μL/L, 10Х최소 염 100.0 mL/L, 1000Х미량 원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지에서 배양하는 것을 통해 양성 형질전환체가 분자 내 상동 재조합이 발생하도록 촉진하고, 5-FU 최소 염 배지를 통해 선별 및 배양하여 amyE 녹아웃된 표적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU 최소 염 배지 고정 플레이트에서 몇 개의 콜로니를 선별하여 다시 콜로니 PCR 검증을 진행하였고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만을 가진 형질전환체는 양성 클론이다. 형질전환체를 PCR로 시퀀싱하여 정확성을 검증하고 정확한 균주, 즉 amyG 유전자 녹아웃된 바실러스 서브틸리스 재조합 유전자 조작된 균주, α-아밀라아제의 효소 활성이 없는 바실러스 서브틸리스 재조합 유전자 조작된 균주를 저장하여 SCK8-ST1로 명명하였다.
실시예 3: 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 SCK8-ST2의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-spoIIAC-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 바실러스 서브틸리스 Bacillus subtilis 168로부터 유래된 포자 형성 RNA 중합효소 σF인자의 코딩 유전자 spoIIAC 유전자 서열(NCBI-ProteinID: NP_390226)에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 포자 형성 spoIIAC 유전자의 업스트림 500 bp의 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻은 다음, simple cloning 연결 방식(You, C., Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 78(5), 1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11)을 사용하여 통합 벡터 pSS로 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-spoIIAC-FR을 얻었다.
(2) 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 SCK8-ST2의 구축
바실러스 서브틸리스 균주 SCK8-ST1 슈퍼 컴피턴트 세포(200μl)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-spoIIAC-FR(1μg)을 바실러스 서브틸리스 균주 SCK8-ST1 슈퍼 컴피턴트 세포(200μl)와 균일하게 혼합한 다음 37℃의 진탕배양기에서 90분 동안 소생시킨 후, 박테리아 용액을 클로람페니콜(5 μg/mL)이 포함된 고체 LB 배지(효모추출물 5 g/L, 펩톤 10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 14-16시간 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 선별하여 콜로니 PCR 검증을 진행하였고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편 및 2000 bp의 DNA 단편의 두 가닥 밴드(여기서, 1000 bp의 DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-spoIIAC-FR에서 spoIIAC 코딩 유전자의 업-다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp의 DNA 단편의 크기는 게놈에 spoIIAC 코딩 유전자의 업스트림 상동성 암, spoIIAC 코딩 유전자 및 spoIIAC 코딩 유전자의 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편 크기임)는 양성 클론이다.
양성 클론을 선별하여 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지로 옮겨 8-12시간 동안 배양한 다음, 200μl의 박테리아 용액을 취해 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 멸균수로 재현탁하고 5-FU 최소 염 배지 고정 플레이트(40% 글루코스20.0 mL/L, 4% 글루타민 50.0 mL/L, 0.5% 트립토판 10.0 mL/L, 1% 비타민 B1 1.0 mL/L, 20mM 5-플루오로우라실 500μL/L, 10Х최소 염 100.0 mL/L, 1000Х미량 원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지에서 배양하는 것을 통해 양성 형질전환체가 분자 내 상동 재조합이 발생하도록 촉진하고, 5-FU 최소 염 배지를 통해 선별 및 배양하여 spoIIAC 녹아웃된 표적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU 최소 염 배지 고정 플레이트에서 몇 개의 콜로니를 선별하여 다시 콜로니 PCR 검증을 진행하였고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만을 가진 형질전환체는 양성 클론이다. 형질전환체를 PCR로 시퀀싱하여 정확성을 검증하고 정확한 균주, 즉 포자 형성 spoIIAC 유전자 녹아웃된 바실러스 서브틸리스 재조합 유전자 조작된 균주, 즉 포자 형성 RNA 중합효소 σF인자 활성이 없는 바실러스 서브틸리스 재조합 유전자 조작된 균주를 저장하여 SCK8-ST2로 명명하였다.
실시예 4: 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 SCK8-ST3의 구축
(1) 재조합 통합 벡터 pSS-srfAC-FR의 구축
KEGG 데이터베이스에서 바실러스 서브틸리스 Bacillus subtilis 168로부터 유래된 서팩틴 합성효소 서브유닛 3 코딩 유전자 srfAC 유유전자 서열(NCBI-ProteinID: NP_388233)에 따라 프라이머를 설계하고, PCR 증폭을 통해 srfAC 유전자의 업스트림 500 bp의 상동성 단편 및 다운스트림 500 bp의 상동성 단편을 얻은 다음, simple cloning 연결 방식 (You, C., Zhang, X. Z., & Zhang, Y. H. (2012). Simple cloning via direct transformation of PCR product (DNA Multimer) to Escherichia coli and Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 78(5), 1593-1595. doi:10.1128/AEM.07105-11)을 사용하여 통합 벡터 pSS로 구축하여 재조합 통합 벡터 pSS-srfAC-FR을 얻었다.
(2) 바실러스 서브틸리스 재조합 균주 SCK8-ST3의 구축
바실러스 서브틸리스 균주 SCK8-ST2 슈퍼 컴피턴트 세포(200μl)를 제조하고, 재조합 통합 벡터 pSS-srfAC-FR(1μg)을 바실러스 서브틸리스 균주 SCK8-ST2 슈퍼 컴피턴트 세포(200μl)와 균일하게 혼합한 다음 37℃의 진탕배양기에서 90분 동안 소생시킨 후, 박테리아 용액을 클로람페니콜(5 μg/mL)이 포함된 고체 LB 배지(효모추출물 5 g/L, 펩톤 10 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 14-16시간 동안 배양하였다.
클로람페니콜 저항성 플레이트에서 성장한 양성 단일 교차 형질전환체 콜로니를 선별하여 콜로니 PCR 검증을 진행하였고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편 및 2000 bp의 DNA 단편의 두 가닥 밴드(여기서, 1000 bp의 DNA 단편의 크기는 벡터 pSS-srfAC-FR에서 srfAC 코딩 유전자의 업-다운스트림 상동성 암의 단편 크기이고, 2000 bp의 DNA 단편의 크기는 게놈에 srfAC 코딩 유전자의 업스트림 상동성 암, srfAC 코딩 유전자 및 srfAC 코딩 유전자의 다운스트림 상동성 암을 포함하는 단편 크기임)는 양성 클론이다.
양성 클론을 선별하여 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지로 옮겨 8-12시간 동안 배양한 다음, 200μl의 박테리아 용액을 취해 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 멸균수로 재현탁하고 5-FU 최소 염 배지 고정 플레이트(40% 글루코스20.0 mL/L, 4% 글루타민 50.0 mL/L, 0.5% 트립토판 10.0 mL/L, 1% 비타민 B1 1.0 mL/L, 20mM 5-플루오로우라실 500μL/L, 10Х최소 염 100.0 mL/L, 1000Х미량 원소 1.0 mL/L)에 도포하여 37℃의 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양하였다. 이 단계의 목적은 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지에서 배양하는 것을 통해 양성 형질전환체가 분자 내 상동 재조합이 발생하도록 촉진하고, 5-FU 최소 염 배지를 통해 선별 및 배양하여 srfAC 녹아웃된 표적 형질전환체를 얻는 것이다.
5-FU 최소 염 배지 고정 플레이트에서 몇 개의 콜로니를 선별하여 다시 콜로니 PCR 검증을 진행하였고, PCR 증폭을 통해 얻은 1000 bp의 DNA 단편만을 가진 형질전환체는 양성 클론이다. 형질전환체를 PCR로 시퀀싱하여 정확성을 검증하고 정확한 균주, 즉 srfAC 유전자 녹아웃된 바실러스 서브틸리스 재조합 유전자 조작된 균주, 즉 서팩틴 합성효소 서브유닛 3 효소 활성이 없는 바실러스 서브틸리스 재조합 유전자 조작된 균주를 저장하여 SCK8-ST3로 명명하였다.
실시예 5: 재조합 벡터의 구축
(1) pMA5-Pylb-aGP의 구축
본 실시예에서 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제는 Thermococcus kodakarensis로부터 유래된다. 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 코딩 유전자 agp 서열(NCBI-ProteinID: BAD85595)은 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.를 통해 합성하고 일반 플라스미드에 연결하였다. 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 코딩 유전자 agp 유전자는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 얻었다. 프라이머는 299-F: 5´-AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatggtgaacgtttccaatgccgttg-3´ 및 300-R: 5´-gcttgagctcgactctagaggatcctcagtcaagtcccttccacttgacca-3´을 사용하였고; pMA5-Pylb 선형 백본은 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 얻었다. 프라이머는 301-F: 5´-tggtcaagtggaagggacttgactgaggatcctctagagtcgagctcaagc-3´ 및 302-R: 5´-caacggcattggaaacgttcaccatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´을 사용하였고;
모든 프라이머는 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.에서 합성하였다. 유전자의 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성한 후, 94℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. PCR 반응으로 얻은 생성물은 각각 0.8%의 아가로스 젤 전기영동으로 결과를 분석하였다. 젤 이미징 시스템의 이미징으로 단편의 크기가 정확한 것을 확인한 후, DNA 정제 및 회수 키트(TIANGEN BIOCHEMICAL TECHNOLOGY CO., LTD., 중국)를 사용하여 재조합 발현 벡터의 구축을 위한 표적 단편을 회수하였다.
그 후, POE-PCR을 사용하여 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자 단편 및 pMA5-Pylb 벡터 백본을 조립하였다. POE-PCR 시스템은 다음과 같은 바, 정제 후의 pMA5-Pylb 선형 백본 200ng; 정제 후의 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자 단편131ng; 2ХPrimeSTAR MAX DNA Polymerase(TAKARA BIOTECHNOLOGY (DALIAN) CO., LTD., 중국) 25μL이고, 50μL가 되도록 물을 첨가하였다. POE-PCR의 조건은 98℃에서 2분 동안 변성한 후, 98℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 3.5분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. 염화칼슘법으로 연결 생성물을 컴피턴트 E.coli Top10로 형질전환시키고, 형질전환체를 선별하여 콜로니 PCR 및 이중 효소 분해(double enzyme digestion) 동정을 진행하며, 2-3개의 양성 형질전환체를 선택하여 추가 검증을 위해 시퀀싱하였고, 시퀀싱 결과는 pMA5-Pylb-aGP 재조합 공동 발현 벡터가 성공적으로 얻어졌음을 보여주며, 플라스미드 맵은 도 2에 도시된 바와 같다.
(2) pMA5-Pylb-PGM의 구축
본 실시예에서 내열성 포스포글루코뮤타제는 Thermococcus kodakarensis로부터 유래된다. 내열성 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자pgm 서열(NCBI-ProteinID: BAD85297)은 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.를 통해 합성하고 일반 플라스미드에 연결하였다. 내열성 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm은 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 게놈 DNA로부터 얻었다. 프라이머는 327-F: 5´-AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatgggcaaactgtttggtaccttcg-3´ 및 328-R: 5´-agcttgagctcgactctagaggatccTTAacctttcagtgcttcttccagc-3´을 사용하였고; pMA5-Pylb 선형 백본은 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 얻었다. 프라이머는 329-F: 5´-gctggaagaagcactgaaaggtTAAggatcctctagagtcgagctcaagct-3´ 및 330-R: 5´-cgaaggtaccaaacagtttgcccatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´을 사용하였고;
모든 프라이머는 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.에서 합성하였다. 유전자의 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성한 후, 94℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. PCR 반응으로 얻은 생성물은 각각 0.8%의 아가로스 젤 전기영동으로 결과를 분석하였다. 젤 이미징 시스템의 이미징으로 단편의 크기가 정확한 것을 확인한 후, DNA 정제 및 회수 키트(TIANGEN BIOCHEMICAL TECHNOLOGY CO., LTD., 중국)를 사용하여 재조합 발현 벡터의 구축을 위한 표적 단편을 회수하였다.
그 후, POE-PCR을 사용하여 내열성 포스포글루코뮤타제 유전자 단편 및 pMA5-Pylb 벡터 백본을 조립하였다. POE-PCR 시스템은 다음과 같은 바, 정제 후의 pMA5-Pylb 선형 백본 200ng; 정제 후의 내열성 포스포글루코뮤타제 유전자 단편 131ng; 2ХPrimeSTAR MAX DNA Polymerase(TAKARA BIOTECHNOLOGY (DALIAN) CO., LTD., 중국) 25μL이고, 50μL가 되도록 물을 첨가하였다. POE-PCR의 조건은 98℃에서 2분 동안 변성한 후, 98℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 3.5분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. 염화칼슘법으로 연결 생성물을 컴피턴트 E.coli Top10로 형질전환시키고, 형질전환체를 선별하여 콜로니 PCR 및 이중 효소 분해 동정을 진행하며, 2-3개의 양성 형질전환체를 선택하여 추가 검증을 위해 시퀀싱하였고, 시퀀싱 결과는 pMA5-Pylb-PGM 재조합 공동 발현 벡터가 성공적으로 얻어졌음을 보여주며, 플라스미드 맵은 도 3에 도시된 바와 같다.
(3) pMA5-Pylb-PGI의 구축
본 실시예에서 내열성 포스포글루코스 이성질화효소는 Thermus thermophilus로부터 유래된다. 내열성 포스포글루코스 이성질화효소 코딩 유전자 pgi 서열(NCBI-ProteinID: AAS82052)은 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.를 통해 합성하고 일반 플라스미드에 연결하였다. 내열성 포스포글루코스 이성질화효소 코딩 유전자 pgi는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 게놈 DNA로부터 얻었다. 프라이머는 331-F: 5´-AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTATGCTGCGTCTGGATACTCGCTTTC-3´ 및 332-R: 5´-agcttgagctcgactctagaggatccTTAACCAGCCAGGCGTTTACGAGTC-3´을 사용하였고; pMA5-Pylb 선형 백본은 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 얻었다. 프라이머는 333-F: 5´-GACTCGTAAACGCCTGGCTGGTTAAggatcctctagagtcgagctcaagct-3´ 및 334-R: 5´-GAAAGCGAGTATCCAGACGCAGCATACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´을 사용하였고;
모든 프라이머는 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.에서 합성하였다. 유전자의 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성한 후, 94℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. PCR 반응으로 얻은 생성물은 각각 0.8%의 아가로스 젤 전기영동으로 결과를 분석하였다. 젤 이미징 시스템의 이미징으로 단편의 크기가 정확한 것을 확인한 후, DNA 정제 및 회수 키트(TIANGEN BIOCHEMICAL TECHNOLOGY CO., LTD., 중국)를 사용하여 재조합 발현 벡터의 구축을 위한 표적 단편을 회수하였다.
그 후, POE-PCR을 사용하여 내열성 포스포글루코스 이성질화효소 유전자 단편 및 pMA5-Pylb 벡터 백본을 조립하였다. POE-PCR 시스템은 다음과 같은 바, 정제 후의 pMA5-Pylb 선형 백본 200ng; 정제 후의 내열성 포스포글루코스 이성질화효소 유전자 단편 131ng; 2ХPrimeSTAR MAX DNA Polymerase(TAKARA BIOTECHNOLOGY (DALIAN) CO., LTD., 중국) 25μL이고, 50μL가 되도록 물을 첨가하였다. POE-PCR의 조건은 98℃에서 2분 동안 변성한 후, 98℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 3.5분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. 염화칼슘법으로 연결 생성물을 컴피턴트 E.coli Top10로 형질전환시키고, 형질전환체를 선별하여 콜로니 PCR 및 이중 효소 분해 동정을 진행하며, 2-3개의 양성 형질전환체를 선택하여 추가 검증을 위해 시퀀싱하였고, 시퀀싱 결과는 pMA5-Pylb-PGI 재조합 공동 발현 벡터가 성공적으로 얻어졌음을 보여주며, 플라스미드 맵은 도 4에 도시된 바와 같다.
(4) pMA5-Pylb-TPE의 구축
본 실시예에서 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는 Thermoanaerobacter indiensis로부터 유래된다. 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 코딩 유전자 tpe 서열(NCBI-ProteinID: B044_RS0101530)은 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.를 통해 합성하고 일반 플라스미드에 연결하였다. 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 코딩 유전자tpe는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 게놈 DNA로부터 얻었다. 프라이머는 335-F: 5´- AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatgaaagtttggctggttggtgcct-3´ 및 324-R: 5´-agcttgagctcgactctagaggatccTTAtttcaggttgctataccattct-3´을 사용하였고; pMA5-Pylb 선형 백본은 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 얻었다. 프라이머는 325-F: 5´-agaatggtatagcaacctgaaaTAAggatcctctagagtcgagctcaagct-3´ 및 326-R: 5´-aggcaccaaccagccaaactttcatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´을 사용하였고;
모든 프라이머는 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.에서 합성하였다. 유전자의 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성한 후, 94℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. PCR 반응으로 얻은 생성물은 각각 0.8%의 아가로스 젤 전기영동으로 결과를 분석하였다. 젤 이미징 시스템의 이미징으로 단편의 크기가 정확한 것을 확인한 후, DNA 정제 및 회수 키트(TIANGEN BIOCHEMICAL TECHNOLOGY CO., LTD., 중국)를 사용하여 재조합 발현 벡터의 구축을 위한 표적 단편을 회수하였다.
그 후, POE-PCR을 사용하여 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자 단편 및 pMA5-Pylb 벡터 백본을 조립하였다.POE-PCR 시스템은 다음과 같은 바, 정제 후의 pMA5-Pylb 선형 백본 200ng; 정제 후의 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자 단편 131ng; 2ХPrimeSTAR MAX DNA Polymerase(TAKARA BIOTECHNOLOGY (DALIAN) CO., LTD., 중국) 25μL이고, 50μL가 되도록 물을 첨가하였다. POE-PCR의 조건은 98℃에서 2분 동안 변성한 후, 98℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 3.5분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. 염화칼슘법으로 연결 생성물을 컴피턴트 E.coli Top10로 형질전환시키고, 형질전환체를 선별하여 콜로니 PCR 및 이중 효소 분해 동정을 진행하며, 2-3개의 양성 형질전환체를 선택하여 추가 검증을 위해 시퀀싱하였고, 시퀀싱 결과는 pMA5-Pylb-TPE 재조합 공동 발현 벡터가 성공적으로 얻어졌음을 보여주며, 플라스미드 맵은 도 5에 도시된 바와 같다.
(5) pMA5-Pylb-TPP의 구축
본 실시예에서 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는 Archaeoglobus fulgidus로부터 유래된다. 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 코딩 유전자tpp 서열(NCBI-ProteinID: AAB90791)은 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.를 통해 합성하고 일반 플라스미드에 연결하였다. 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 코딩 유전자tpp는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 게놈 DNA로부터 얻었다. 프라이머는 339-F: 5´- AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTATGTTCAAGCCGAAAGCGATCGCGG-3´ 및 340-R: 5´-agcttgagctcgactctagaggatccTTAACGCAGCAGGCCCAGAAACTG-3´을 사용하였고; pMA5-Pylb 선형 백본은 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 얻었다. 프라이머는 341-F: 5´- CAGTTTCTGGGCCTGCTGCGTTAAggatcctctagagtcgagctcaagct-3´ 및 342-R: 5´- CCGCGATCGCTTTCGGCTTGAACATACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´을 사용하였다.
모든 프라이머는 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.에서 합성하였다. 유전자의 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성한 후, 94℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. PCR 반응으로 얻은 생성물은 각각 0.8%의 아가로스 젤 전기영동으로 결과를 분석하였다. 젤 이미징 시스템의 이미징으로 단편의 크기가 정확한 것을 확인한 후, DNA 정제 및 회수 키트(TIANGEN BIOCHEMICAL TECHNOLOGY CO., LTD., 중국)를 사용하여 재조합 발현 벡터의 구축을 위한 표적 단편을 회수하였다.
그 후, POE-PCR을 사용하여 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자 단편 및 pMA5-Pylb 벡터 백본을 조립하였다. POE-PCR 시스템은 다음과 같은 바, 정제 후의 pMA5-Pylb 선형 백본 200ng; 정제 후의 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자 단편 131ng; 2ХPrimeSTAR MAX DNA Polymerase(TAKARA BIOTECHNOLOGY (DALIAN) CO., LTD., 중국) 25μL이고, 50μL가 되도록 물을 첨가하였다. POE-PCR의 조건은 98℃에서 2분 동안 변성한 후, 98℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 3.5분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. 염화칼슘법으로 연결 생성물을 컴피턴트 E.coli Top10으로 형질전환시키고, 형질전환체를 선별하여 콜로니 PCR 및 이중 효소 분해 동정을 진행하며, 2-3개의 양성 형질전환체를 선택하여 추가 검증을 위해 시퀀싱하였고, 시퀀싱 결과는 pMA5-Pylb-TPP 재조합 공동 발현 벡터가 성공적으로 얻어졌음을 보여주며, 플라스미드 맵은 도 6에 도시된 바와 같다.
(6) pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP의 구축
본 실시예에서 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제는 Thermococcus kodakarensis로부터 유래되고; 내열성 포스포글루코뮤타제는 Thermococcus kodakarensis로부터 유래되며; 내열성 포스포글루코스 이성질화효소는 Thermus thermophilus로부터 유래되고; 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제는 Thermoanaerobacter indiensis로부터 유래되며; 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는 Archaeoglobus fulgidus로부터 유래된다. 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 코딩 유전자 agp(NCBI-ProteinID: BAD85595)는 PCR을 통해 얻고, 프라이머는 350-F: 5´- AGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTatggtgaacgtttccaatgccgttg-3´ 및 351-R: 5´- cgaaggtaccaaacagtttgcccatTTTGAATTCCTCCTTTtcagtcaagtcccttccacttgacc-3´을 사용하였으며; 내열성 포스포글루코뮤타제 코딩 유전자 pgm(NCBI-ProteinID: BAD85297)은 PCR을 통해 얻고, 프라이머는 352-F: 5´- ggtcaagtggaagggacttgactgaAAAGGAGGAATTCAAAatgggcaaactgtttggtaccttcg-3´ 및 353-R: 5´- GAAAGCGAGTATCCAGACGCAGCATTTTGAATTCCTCCTTTTTAacctttcagtgcttcttccagc-3´을 사용하였으며; 내열성 포스포글루코스 이성질화효소 코딩 유전자 pgi(NCBI-ProteinID: AAS82052)는 PCR을 통해 얻고, 프라이머는 354-F: 5´- gctggaagaagcactgaaaggtTAAAAAGGAGGAATTCAAAATGCTGCGTCTGGATACTCGCTTTC-3´ 및 355-R: 5´- TTTTCAGCGGATGTTCGGTGTTCATTTTGAATTCCTCCTTTTCAACCAGCCAGGCGTTTACGAGTC-3´을 사용하였으며; 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 코딩 유전자 tpe(NCBI-ProteinID: B044_RS0101530)는 PCR을 통해 얻고, 프라이머는 356-F: 5´- GACTCGTAAACGCCTGGCTGGTTGAAAAGGAGGAATTCAAAATGAACACCGAACATCCGCTGAAAA-3´ 및 357-R: 5´- ACCGCGATCGCTTTCGGCTTGAACATTTTGAATTCCTCCTTTttaAATCAGTTTGAATTCACCGCTG-3´을 사용하였으며; 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 코딩 유전자 tpp(NCBI-ProteinID: AAB90791)는 PCR을 통해 얻고, 프라이머는 358-F: 5´- CAGCGGTGAATTCAAACTGATTtaaAAAGGAGGAATTCAAAATGTTCAAGCCGAAAGCGATCGCGGT-3´ 및 359-R: 5´- gcttgagctcgactctagaggatccTTAACGCAGCAGGCCCAGAAACTGCA-3´을 사용하였으며; pMA5-Pylb 선형 백본은 PCR을 통해 얻고, 프라이머는 360-F: 5´- TGCAGTTTCTGGGCCTGCTGCGTTAAggatcctctagagtcgagctcaagc-3´ 및 361-R: 5´- caacggcattggaaacgttcaccatACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCT-3´을 사용하였다.
모든 프라이머는 SUZHOU GENEWIZ BIOTECHNOLOGY CO.,LTD.에서 합성하였다. 유전자의 PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 변성한 후, 94℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 1분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. PCR 반응으로 얻은 생성물은 각각 0.8%의 아가로스 젤 전기영동으로 결과를 분석하였다. 젤 이미징 시스템의 이미징으로 단편의 크기가 정확한 것을 확인한 후, DNA 정제 및 회수 키트(TIANGEN BIOCHEMICAL TECHNOLOGY CO., LTD., 중국)를 사용하여 재조합 발현 벡터의 구축을 위한 표적 단편을 회수하였다.
그 후, POE-PCR을 사용하여 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자 단편, 내열성 포스포글루코뮤타제 유전자 단편, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자 단편, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자 단편 및 pMA5-Pylb벡터 백본을 조립하였다. POE-PCR 시스템은 다음과 같은 바, 정제 후의 pMA5-Pylb 선형 백본 200ng; 정제 후의 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자 단편 131ng, 내열성 포스포글루코뮤타제 유전자 단편 131ng, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소 유전자 단편 131ng, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자 단편 131ng, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자 단편 131ng; 2ХPrimeSTAR MAX DNA Polymerase(TAKARA BIOTECHNOLOGY (DALIAN) CO., LTD., 중국) 25μL이고, 50μL가 되도록 물을 첨가하였다. POE-PCR의 조건은 98℃에서 2분 동안 변성한 후, 98℃에서 15초 동안 변성, 58℃에서 15초 동안 어닐링, 72℃에서 3.5분 동안 연장, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 연장하는 매개변수에 따라 30회 순환하는 것이다. 염화칼슘법으로 연결 생성물을 컴피턴트 E.coli Top10로 형질전환시키고, 형질전환체를 선별하여 콜로니 PCR 및 이중 효소 분해 동정을 진행하며, 2-3개의 양성 형질전환체를 선택하여 추가 검증을 위해 시퀀싱하였고, 시퀀싱 결과는 pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP 재조합 공동 발현 벡터가 성공적으로 얻어졌음을 보여주며, 플라스미드 맵은 도 7에 도시된 바와 같다.
실시예 6: 재조합 유전자 조작된 박테리아의 구축
구축된 재조합 발현 벡터 pMA5-Pylb-aGP, pMA5-Pylb-PGM, pMA5-Pylb-PGI, pMA5-Pylb-TPE, pMA5-Pylb-TPP, pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP를 각각 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아 SCK8-ST3로 형질전환시키고, LB 시험관에서 밤새 배양하며, 플라즈마 추출 키트로 플라즈마를 추출하고, 정확한 클론 SCK8-ST3/pMA5-Pylb-aGP, SCK8-ST3/pMA5-Pylb-PGM, SCK8-ST3/pMA5-Pylb-PGI, SCK8-ST3/pMA5-Pylb-TPE, SCK8-ST3/pMA5-Pylb-TPP 및 SCK8-ST3/pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP을 저장하였다.
실시예 7: 재조합 유전자 조작된 박테리아의 전세포의 제조
각각 재조합 유전자 조작된 박테리아 SCK8-ST3/pMA5-Pylb-aGP, SCK8-ST3/pMA5-Pylb-PGM, SCK8-ST3/pMA5-Pylb-PGI, SCK8-ST3/pMA5-Pylb-TPE, SCK8-ST3/pMA5-Pylb-TPP 및 SCK8-ST3/pMA5-Pylb-aGP-PGM-PGI-TPE-TPP를 선별하고 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 밤새 진탕하면서 배양하였다. 배양물을 1%의 접종량으로 스펙티노마이신을 포함하는 신선한 LB 배지에 옮겨 37℃에서 밤새 진탕하면서 배양하고, 5500rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하여 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제를 발현하는 전세포, 내열성 포스포글루코뮤타제를 발현하는 전세포, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소를 발현하는 전세포, 내열성 타가토스 -6-포스페이트 에피머라아제를 발현하는 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 전세포, 및 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제, 내열성 포스포글루코뮤타제, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 공동 발현하는 전세포를 얻었다.
실시예 8: 공동 발현하는 전세포의 촉매 작용에 의한 전분으로부터 타가토스로의 제조
50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)을 사용하여 실시예 7에서 제조된 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제, 내열성 포스포글루코뮤타제, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 공동 발현하는 전세포를 1회 세척하고 5500rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 침전물에 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액을 첨가하여 균체를 약 OD600=300으로 재현탁하였다. 재현탁된 균체를 75℃에서 90분 동안 열처리하였다.
1L의 반응 시스템에서, 최종 농도 100 g/L의 전분, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 및 열처리된 전세포를 각각 첨가하여 약 OD600=20이 되도록 하였다. 70℃의 워터 배스 진탕기에서 46시간 동안 반응시키고 샘플을 취하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석하였다. HPLC 검출 조건은 크로마토그래피 컬럼이 Bio-Rad HPX-87H이고; 유속이 0.6mL/min이며; 컬럼 온도가 60℃이고; 검출기가 시차굴절검출기이며; 주입량이 20μL인 것이다.
총 3회의 병렬 반복 시험을 진행하였고, 도 8은 반응 시간에 따른 타가토스 생산량의 변화 과정 그래프를 나타내며, 70℃의 워터 배스 진탕기에서 46시간 동안 반응시킨 후, HPLC 테스트 결과는 타가토스의 생산량이 50 g/L에 도달하여 수율이 50%에 도달할 수 있음을 보여준다.
실시예 9: 전세포 혼합물의 촉매 작용에 의한 전분으로부터 타가토스로의 제조
50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)을 사용하여 실시예 7에서 제조된 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제를 발현하는 전세포, 내열성 포스포글루코뮤타제를 발현하는 전세포, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소를 발현하는 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 발현하는 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 전세포를 각각 1회 세척하고 5500rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 침전물에 50mM인산나트륨 완충액(pH 7.5)을 각각 첨가하여 균체를 약 OD600=300으로 재현탁하였다. 재현탁된 균체를 75℃에서 90분 동안 열처리하였다.
1L의 반응 시스템에서, 최종 농도 100 g/L의 전분, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 및 상기 네 가지 열처리된 전세포를 첨가하여 약 OD600=20이 되도록 하고, 1:1:1:1:1의 비율로 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제를 발현하는 전세포, 내열성 포스포글루코뮤타제를 발현하는 전세포, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소를 발현하는 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 발현하는 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 전세포를 첨가하였다. 70℃의 워터 배스 진탕기에서 46시간 동안 반응시키고 샘플을 취하여 HPLC 분석하였다. 동일 조건에서 총 3회의 반복 시험을 진행하였고, HPLC 검출 조건은 실시예 8과 동일하다. 70℃의 워터 배스 진탕기에서 46시간 동안 반응시킨 후, HPLC 테스트 결과는 타가토스의 생산량이 73 g/L에 도달하여 수율이 73%에 도달할 수 있음을 보여준다.
실시예 10: 고정화 전세포의 촉매 작용에 의한 전분으로부터 타가토스로의 제조
1L의 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제, 내열성 포스포글루코뮤타제, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 공동 발현하는 투과성 전세포를 재현탁하여 약 OD600=400되도록 하고, 1g의 몬모릴로나이트를 첨가하여 균일하게 교반하였다. 40ml의 5%(w/v) 폴리에틸렌이민 수용액을 첨가하여 실온 조건에서 응집시키고, 20ml의 50% 글루타르알데히드 수용액을 첨가하여 실온에서 3시간 동안 가교시켰다. 그 후, 흡인 여과하여 필터 케이크층을 얻고, 탈이온수로 필터 케이크를 세척한 후 압축하여 과립을 제조하고 건조시켜 고정화 전세포를 얻었다.
1L의 반응 시스템에서, 최종 농도 100 g/L의 전분, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 및 고정화 전세포를 각각 첨가하여 약 OD600=20이 되도록 하고, 70℃의 워터 배스 진탕기에서 반응시켰다. 반응 종료 후 반응액을 4℃에서 원심분리시켜 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 타가토스 함량을 분석하였고; 고정화 과립을 수집하고 완충액으로 세척하여 다음 배치(batch)의 반응을 진행하였다. 실험 결과는 도 9에 도시된 바와 같이, 결과는 고정화 전세포의 연속적인 촉매 작용에 의해 전분으로부터 타가토스를 생산하는 과정에서, 초기 생성물의 수율이 최대 50%에 도달할 수 있고, 연속적인 촉매화 반응 배치의 증가에 따라 생성물의 수율이 점차 감소되며 50배치의 연속 촉매화 후 생성물의 수율이 약 36%를 유지할 수 있음을 보여준다.
실시예 11: 고정화 전세포 혼합물의 촉매 작용에 의한 전분으로부터 타가토스로의 제조
1L의 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 1:1:1:1:1의 비율에 따라 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 포스포글루코뮤타제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 발현하는 투과성 전세포, 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 투과성 전세포를 재현탁하여 약 OD600=300이 되도록 하고, 0.8g의 몬모릴로나이트를 첨가하여 균일하게 교반하였다. 35ml의 5%(w/v) 폴리에틸렌이민 수용액을 첨가하여 실온 조건에서 응집시키고, 18ml의 50% 글루타르알데히드 수용액을 첨가하여 실온에서 3시간 동안 가교시켰다. 그 후, 흡인 여과하여 필터 케이크층을 얻고, 탈이온수로 필테 케이크를 세척한 후 압축하여 과립으로 제조하고 건조시켜 고정화 전세포 혼합물을 얻었다.
1L의 반응 시스템에서, 최종 농도 100 g/L의 전분, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.5) 및 고정화 전세포를 각각 첨가하여 약 OD600=20이 되도록 하고, 70℃의 워터 배스 진탕기에서 반응시켰다. 반응 종료 후 반응액을 4℃에서 원심분리시켜 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 타가토스 함량을 분석하였고; 고정화 과립을 수집하고 완충액으로 세척하여 다음 배치의 반응을 진행하였다. 실험 결과는 도 10에 도시된 바와 같이, 결과는 60배치의 연속 촉매화 후 생성물의 수율이 모두 50%를 초과하고 최대 73% 이상 도달할 수 있음을 보여준다. 실험 결과는 도 10에 도시된 바와 같이, 결과는 고정화 전세포 혼합물이 반응을 연속적으로 촉매화할 시 초기 생성물의 수율이 최대 73% 이상 도달할 수 있고, 연속적인 촉매화 반응이 진행됨에 따라 생성물의 수율이 점차 감소하며 60배치의 연속 촉매화 후 생성물의 수율이 여전히 52%를 유지할 수 있음을 보여준다.
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<223> Primer sequence
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gactcgtaaa cgcctggctg gttgaaaagg aggaattcaa aatgaacacc gaacatccgc 60
tgaaaa 66
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<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer sequence
<400> 28
accgcgatcg ctttcggctt gaacattttg aattcctcct ttttaaatca gtttgaattc 60
accgctg 67
<210> 29
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tcgcggt 67
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caacggcatt ggaaacgttc accatacaaa tctccccctt tgttgtttct 50
Claims (21)
- 타가토스를 생산하기 위한 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아로서,
상기 유전자 조작된 박테리아는 알파-글루칸 포스포릴라제(α-Glucan phosphorylase) 유전자, 포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase) 유전자, 포스포글루코스 이성질화효소(phosphoglucose isomerase) 유전자, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제(tagatose-6-phosphate epimerase) 유전자 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제(tagatose-6-phosphate phosphatase) 유전자를 공동 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아이거나, 또는 알파-글루칸 포스포릴라제 유전자, 포스포글루코뮤타제 유전자, 포스포글루코스 이성질화효소 유전자, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자를 각각 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아의 혼합물인 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 박테리아. - 제1항에 있어서,
상기 바실러스 서브틸리스의 출발 균주는 프로테아제(protease)가 녹아웃(Knockout)된 바실러스 서브틸리스 균주인 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 박테리아. - 제1항에 있어서,
상기 유전자 조작된 박테리아는 알파-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코스 이성질화효소, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 공동 발현하는 발현 벡터를 포함하거나, 또는 알파-글루칸 포스포릴라제의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아, 포스포글루코뮤타제의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아, 포스포글루코스 이성질화효소의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제의 발현 벡터를 포함하는 유전자 조작된 박테리아의 혼합물인 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 박테리아. - 제1항에 있어서,
상기 알파-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포글루코스 이성질화효소, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제는 각각 내열성 알파-글루칸 포스포릴라제, 내열성 포스포글루코뮤타제, 내열성 포스포글루코스 이성질화효소, 내열성 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 및 내열성 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제인 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 박테리아. - 제4항에 있어서,
상기 내열성은 40℃ 이상에서 효소의 활성을 갖는 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 박테리아. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유전자 조작된 박테리아에서의 내인성 우라실 포스포리보실트랜스퍼라아제(uracil phosphoribosyltransferase) 유전자, α-아밀라아제(α-Amylase) 유전자, 포자 형성 RNA 중합효소 σF인자 유전자 및 서팩틴(surfactin) 합성효소 서브유닛 3 유전자는 모두 비활성화 또는 녹아웃되는 것을 특징으로 하는 유전자 조작된 박테리아. - 발현 벡터로서,
알파-글루칸 포스포릴라제 유전자, 포스포글루코뮤타제 유전자, 포스포글루코스 이성질화효소 유전자, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제 유전자 및 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제 유전자를 포함하고, 이러한 유전자들을 공동 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 발현 벡터. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 유전자 조작된 박테리아의 전세포(whole-cell)의 촉매 작용에 의한 전분으로부터 타가토스로의 제조 및 생산 방법으로서,
상기 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아를 발효시켜 전세포를 얻는 단계 (1);
단계 (1)에서 얻은 바실러스 서브틸리스의 전세포를 세포막 투과성 처리하여 투과성 전세포를 얻는 단계 (2); 및
단계 (2)에서 얻은 투과성 전세포의 촉매 작용에 의해 전분으로부터 타가토스를 제조하되, 공동 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아의 전세포는 직접 촉매 작용에 사용되고, 각 효소를 각각 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아의 전세포는 혼합하여 촉매 작용에 사용되는 단계 (3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
단계 (2)에서 얻은 바실러스 서브틸리스 투과성 전세포를 고정화 처리하여 고정화 전세포 또는 고정화 전세포 혼합물을 얻은 후 촉매 작용에 사용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 단계 (1)의 전세포 제조는 외인성 단백질의 발현에 적합한 발효 방법을 통해 얻은 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 단계 (2)의 세포막 투과성 처리는 열처리, 유기 용매 첨가 및/또는 계면활성제 첨가 처리를 통해 얻은 것을 특징으로 하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 유기 용매는 아세톤(acetone), 아세토니트릴(acetonitrile)로부터 선택되고; 상기 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(cetyl trimethyl ammonium bromide), Tween-80으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 열처리의 온도는 45-100℃이고, 열처리 시간은 10-100분이며; 처리시 세포 농도는 OD600=10-300인 것을 특징으로 하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 열처리의 온도는 70-80℃이고, 열처리 시간은 50-70분이며; 처리시 세포 농도는 OD600=30-150인 것을 특징으로 하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 열처리는 HEPES 완충액, 인산염 완충액, Tris 완충액, 아세테이트 완충액으로부터 선택된 완충액에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 단계 (3)에서, 촉매화된 반응 시스템에서 기질 전분의 농도는 50-300 g/L이고; 반응 조건은 pH 5.0-8.0, 40-80℃에서 0.5-96시간 동안 반응하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 단계 (3)에서, 촉매화된 반응 시스템에서 기질 전분의 농도는 100-200 g/L이고; 반응 조건은 pH 6.5-7.5, 45-75℃에서 12-60시간 동안 반응하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 단계 (3)에서, 촉매화의 반응은 HEPES 완충액, 인산염 완충액, Tris 완충액, 아세테이트 완충액으로부터 선택된 완충액에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
각 효소를 각각 발현하는 바실러스 서브틸리스 유전자 조작된 박테리아의 투과성 전세포의 혼합물은 (0.1-10):(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10):(0.1-10)의 비율로 알파-글루칸 포스포릴라제를 발현하는 투과성 전세포, 포스포글루코뮤타제를 발현하는 투과성 전세포, 포스포글루코스 이성질화효소를 발현하는 투과성 전세포, 타가토스-6-포스페이트 에피머라아제를 발현하는 투과성 전세포, 타가토스-6-포스페이트 포스파타아제를 발현하는 투과성 전세포를 혼합한 것을 특징으로 하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 투과성 전세포 고정화 처리 방법에서,
인산나트륨(sodium phosphate) 또는 인산칼륨(potassium phosphate) 완충액으로 상기 투과성 전세포를 재현탁하고 무기질토를 첨가하여 균일하게 교반한 후, 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 수용액을 첨가하여 응집시킨 다음 가교제를 첨가하여 가교시킨 후, 흡인 여과하여 필터 케이크층을 얻고, 탈이온수로 필터 케이크를 세척한 후 압축하여 과립으로 제조하고 건조시켜 고정화 전세포를 얻는 것을 특징으로 하는 방법. - 제20항에 있어서,
상기 무기질토는 몬모릴로나이트(montmorillonite), 규조토, 고령토 및 벤토나이트(bentonite)로부터 선택되고; 상기 가교제는 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 트리하이드록시메틸포스핀(trihydroxymethylphosphine), N,N-메틸렌비스아크릴아미드(N,N-methylenebisacrylamide), 에피클로로히드린(epichlorohydrin) 및 제니핀(genipin)으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
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