TWI682998B

TWI682998B - 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法

Info

Publication number: TWI682998B
Application number: TW107111508A
Authority: TW
Inventors: 梁成才; 趙顯國; 李英美; 金成俌
Original assignee: 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-31
Publication date: 2020-01-21
Also published as: CN111094563A; TW201839140A; CL2019002793A1; CL2019002792A1; CN111601888B; WO2018182344A1; KR20180111667A; EP3604515A1; EP3604515A4; TWI695888B; BR112019020229A2; BR112019020230A2; CA3058589A1; CN111094563B; WO2018182345A1; KR20180111666A; KR102074957B1; EP3604513A4; EP3604513A1; KR20210019482A

Abstract

本申請案是有關於一種包括果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法。

Description

用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法

塔格糖是少量存在於牛奶、乳酪、可可等食品、以及如蘋果與柑橘般具有甜味的天然水果的天然甜味料，塔格糖的物理性質亦與砂糖相似。塔格糖的卡路里為1.5kcal/g(即砂糖的卡路里的1/3)，血糖指數(Glycemic index，GI)為3(即砂糖的血糖指數的5%)，然而，其具有與砂糖相似的甜味，並且具有各種健康功能性，故而可用作可同時滿足健康與口感的替代甜味料而應用至多種製品。

先前公知的塔格糖的製備方法有以半乳糖為主原料的化學(觸媒反應)方法與生物學(異構酶反應)方法(參照PCT WO 2006/058092、韓國註冊專利第10-0964091號及韓國註冊專利第10-1368731號)。然而，於上述先前的製備方法中，作為半乳糖的基礎原料的乳糖因國際市場中的生乳(raw milk)及乳糖的生產量、供需量等而價格存在不穩定性，導致塔格糖生產原料的穩定供需存在極限。因此，需要一種能夠以普遍的糖(砂糖、葡萄糖、果糖等)為原料來製備塔格糖的新的方法而對此進行了研究，上述文獻中揭示有分別自葡萄糖、半乳糖及果糖生產半乳糖、阿洛酮糖及塔格糖的方法(韓國註冊專利第10-744479號、韓國註冊專利第10-1057873號及韓國註冊專利第10-1550796號)。

另一方面，已知塔格糖-6-磷酸激酶(Tagatose-6-phosphate kinase，酶學委員會(Enzyme Commission，EC)2.7.1.144)如下述[反應式1]般以三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)與D-塔格糖6-磷酸(D-tagatose 6-phosphate)為基質而生產二磷酸腺苷(Adenosine Diphosphate，ADP)與D-塔格糖1,6-二磷酸(D-tagatose 1,6-biphosphate)，但並無針對上述塔格糖-6-磷酸激酶是否具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的活性的研究。

[反應式1]ATP+D-塔格糖6-磷酸<=>ADP+D-塔格糖1,6-二磷酸

於此種背景下，本發明者等人為了開發一種利用經濟性原料且可提高向塔格糖的轉化率的方法而進行銳意研究，結果確認到塔格糖-6-磷酸激酶(Tagatose-6-phosphate kinase，EC 2.7.1.144)具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的功能，藉此完成本申請案。

因此，可於以葡萄糖或澱粉為原料而依次製備葡萄糖-1-磷酸及葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)後，利用本申請案的塔格糖-6-磷酸激酶將葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)轉化成塔格糖-6-磷酸(tagatose-6-phosphate)，利用執行不可逆反應路徑的塔格糖-6-磷酸磷酸酶(tagatose-6-phosphate phosphatase)生產塔格糖，並且可明顯提高自葡萄糖或澱粉向塔格糖的轉化率。

本申請案的一目的在於提供一種有效製備塔格糖-6-磷酸的組成物，上述組成物包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物。

本申請案的另一目的在於提供一種有效製備塔格糖的組成物，上述組成物包括：塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物；及塔格糖-6-磷酸磷酸酶(tagatose-6-phosphate phosphatase)、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物。

本申請案的另一目的在於提供一種塔格糖-6-磷酸的製備方法，其包括使塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物與果糖-6-磷酸接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟。上述方法可更包括使上述塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而轉化成塔格糖的步驟。

本申請案的其他目的及優點藉由隨附的發明申請專利範圍、圖式及下述詳細說明而變得更加明確。本說明書中未記載的內容可由在本申請案的技術領域或相似領域內具有常識者充分地認知、推導，因此省略其說明。

以下，具體地對本申請案的內容進行說明。另一方面，本申請案中揭示的一實施方式的說明及實施形態中的共通事項亦可應用於其他實施方式的說明及實施形態。另外，本申請案中所揭示的各種要素的所有組合均屬於本申請案的範疇。而且，本申請案的範疇並不限制於以下具體的記述。

為了達成本申請案的一目的，本申請案的一實施方式提供一種包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物。

已知上述塔格糖-6-磷酸激酶(Tagatose-6-phosphate kinase，EC 2.7.1.144)是以ATP與D-塔格糖6-磷酸(D-tagatose 6-phosphate)為基質而生產ADP與D-塔格糖1,6-二磷酸(D-tagatose 1,6-biphosphate)者，例如可無限制地包括其他能夠以果糖-6-磷酸為基質而生產塔格糖的物質。

上述塔格糖-6-磷酸激酶可包括由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的多肽、或與序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列具有至少80%、90%、95%、97%或99%的同源性的多肽。另外，只要為具有上述同源性且具有表現出與由上述序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的蛋白質相應的功效(即，將果糖-6-磷酸的果糖的第4碳位置差向異構化而轉化成塔格糖-6-磷酸的果糖-6-磷酸C4-差向異構化活性)的胺基酸序列的多肽，則即便具有一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加的胺基酸序列，亦當然包括於本申請案的範圍內。而且，作為由可根據公知的基因序列製備的探針、例如於嚴格的條件下與編碼上述多肽的鹼基序列的全部或一部分的互補序列雜交(hybridization)的聚核苷酸編碼的多肽，亦可無限制地包括具有果糖-6-磷酸C4-差向異構化活性的多肽。

於本申請案中，揭示了“塔格糖-6-磷酸激酶”表現出將果糖-6-磷酸的第4碳位置差向異構化而將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的果糖-6-磷酸4-差向異構化活性，因此於本申請案中，“塔格糖-6-磷酸激酶”可與“果糖-6-磷酸-4-差向異構酶(Fructose-6-phosphate C4-epimerase)”互換使用。

於本申請案中，用語“嚴格的條件”是指可實現聚核苷酸間的特異性雜交的條件。此種條件依存於聚核苷酸的長度及互補性程度，這些參數為本技術領域所熟知，諸如具體記載在文獻(例如，J.Sambrook等人，同源)中。例如，可列舉如下條件：同源性較高的基因彼此雜交、具有80%以上、90%以上、95%以上、97%以上或99%以上的同源性的基因彼此雜交、同源性低於上述的基因彼此不雜交化的條件；或於通常的南方雜交的清洗條件，即於60℃、1×鹽水檸檬酸鈉(Saline Sodium Citrate，SSC)、0.1%十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)、具體而言60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、更具體而言68℃、0.1×SSC、0.1% SDS對應的鹽濃度及溫度下清洗1次、具體而言2次至3次的條件。上述雜交中所使用的探針可為鹼基序列的互補序列的一部分。此種探針能夠以根據公知序列製成的寡核苷酸為引子而藉由以包括此種鹼基序列的基因片段為模板的聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)製作。另外，業者可視需要而根據如探針長度的要素調節溫度及清洗溶液的鹽濃度。

於本申請案中，用語“同源性”是指兩個多肽部分(moiety)間的一致性的百分比。自一個部分至另一部分為止的序列間的一致性可藉由公知的相應技術而確定。例如，可藉由如下方式確定同源性：對序列資訊進行整列，利用可容易地獲得的電腦程式直接對兩個多肽分子間的序列資訊(例如分值(score)、一致性(identity)及相似度(similarity)等參數(parameter))進行整列(例如基礎局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)2.0)。另外，聚核苷酸間同源性可藉由如下方式確定：於在構成同源區域間的穩定雙鏈的條件下將聚核苷酸雜交後，分解成單鏈特異性核酸酶而確定所分解的片段的尺寸。

作為一實施例，本申請案的塔格糖-6-磷酸激酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自厭氧繩菌屬的酶或其變異體、來自網團菌屬(The genus of Dictyoglomus)的酶或其變異體，具體而言，可為來自嗜熱厭氧繩菌(Anaerolinea thermophila)、厭氧繩菌細菌(Anaerolineae bacterium)或嗜熱網團菌(Dictyoglomus thermophilum)的酶或其變異體，但並不限制於此。

本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶或其變異體具有將D-果糖(fructose)-6-磷酸的第4碳位置差向異構化而轉化成D-塔格糖-6-磷酸的特徵。作為本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶，可使用已知具有塔格糖-6-磷酸激酶(tagatose-6-phosphate kinase)活性的酶，已知塔格糖-6-磷酸激酶是以D-塔格糖6-磷酸(D-tagatose 6-phosphate)為基質而生產D-塔格糖1,6-二磷酸(D-tagatose 1,6-biphosphate)者。於本申請案中，首次揭示上述塔格糖-6-磷酸激酶具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性。因此，本申請案的一實施例是有關於一種包括於自果糖-6-磷酸製備塔格糖-6-磷酸時將塔格糖-6-磷酸激酶用作果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的塔格糖-6-磷酸激酶的新的用途。另外，本申請案的一實施例是有關於一種將塔格糖-6-磷酸激酶用作果糖-6-磷酸-4-差向異構酶而自果糖-6-磷酸製備塔格糖-6-磷酸的方法。

作為一實施例，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可為耐熱性較高的酶。具體而言，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可於50℃至70℃下表現出最大活性的50%至100%、60%至100%、70%至100%或75%至100%的活性。更具體而言，本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可於55℃至65℃、60℃至70℃、55℃、60℃或70℃下表現出最大活性的80%至100%或85%至100%的活性。

進而，由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可分別依次由序列號2、序列號4或序列號6的核苷酸序列編碼，但並不限制於此。

本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶或其變異體可為藉由如下方式獲得者：於以表現本申請案的上述酶或其變異體的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid，DNA)(例如序列號2、序列號4或序列號6的核苷酸)轉形至大腸桿菌(E.coli)等菌株後，對其進行培養而獲得培養物，對上述培養物進行粉碎而藉由管柱等進行精製。除大腸桿菌(Escherichia coli)以外，上述轉形用菌株還可為麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、米麴菌(Aspergillus oryzae)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。於具體例中，作為此種轉形的菌株，微生物可為大腸桿菌BL21(DE3) /pBT7-C-His-an1、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E或大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E，上述大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1於2017年3月20日以寄存編號KCCM11996P寄存至韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)，上述大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E於2017年9月13日以寄存編號KCCM12110P寄存，上述大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E於2017年8月11日以寄存編號KCCM12093P寄存。

本申請案中使用的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶可利用編碼上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸提供。

於本申請案中，用語“核酸”具有總括DNA分子或核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)分子的含義，作為核酸的基本構成單元的核苷酸不僅可包括天然核苷酸，而且亦包括糖或鹼基位點經修飾的類似物(參照文獻：Scheit，核苷酸類似物(Nucleotide Analogs)，John Wiley，New York(1980)；Uhlman及Peyman，化學綜述(Chemical Reviews)，90：543-584(1990))。

本申請案的核酸可為編碼本申請案的由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的多肽的核酸、或編碼與本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶具有至少80%、90%、95%、97%或99%的遺傳同源性且具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的多肽的核酸。例如，編碼由序列號1的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸可為與序列號2的鹼基序列具有至少 80%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性的核酸。另外，編碼由序列號3或序列號5的胺基酸序列構成的上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的各核酸可為與對應於其的序列號4或序列號6的鹼基序列具有至少80%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性的核酸。而且，本申請案的核酸可包括可藉由密碼簡並性(codon degeneracy)而轉譯成本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的核酸，當然亦可包括如下核酸：於嚴格的條件下與由相對於序列號2、序列號4或序列號6的鹼基序列為互補性的鹼基序列構成的核酸雜交，且編碼具有本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的多肽。

可使用於本申請案的表現果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物可為包括包含上述核酸的重組載體的微生物。上述載體可為以可使本申請案的核酸發揮作用的方式連接的形態。於本申請案中，用語“以可發揮作用的方式連接”通常是為了執行功能而鹼基表現調節序列與編碼靶蛋白的鹼基序列以可發揮作用的方式連接，從而可對編碼的鹼基序列的表現產生影響。可利用業界公知的基因重組技術以可發揮作用的方式與載體連接，可使用業界的剪切及連接酶等實現位點特異性DNA剪切及連接。

於本申請案中，用語“載體”是指用以將鹼基選殖及/或轉移至有機體、例如宿主細胞的任意的介質。載體可為不同的DNA片段結合而可導入所結合的片段的複製的複製單元(replicon)。此處，“複製單元”是指於生物體內作為DNA自複製單元發揮功能、即可藉由自調節而實現複製的任意的遺傳單元(例如，質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒)。本申請案的用語“載體”可包括用以於試管內、生物體外或生物體內將鹼基導入至有機體(例如宿主細胞)的病毒介質及非病毒介質，可包括微環DNA、如睡美人(Sleeping Beauty)的轉位子(Izsvak等人，分子生物學雜誌(J.MoI.Biol.)302：93-102(2000))或人工染色體。作為通常使用的載體的示例，可列舉天然狀態或重組狀態的質體、黏質體、病毒及細菌噬菌體。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及Charon21A等作為噬菌體載體或黏質體載體，可使用pBR類、pUC類、pBluescriptII類、pGEM類、pTZ類、pCL類及pET類等作為質體載體。可使用於本申請案的載體並無特別限制，可使用公知的表現載體。另外，上述載體可為以更包括各種抗生素抗性基因為特徵的重組載體。於本申請案中，用語“抗生素抗性基因”是對抗生素具有抗性的基因，具有該基因的細胞可存活於以相應的抗生素進行處理過的環境中，因此於在大腸桿菌中獲得大量質體的過程中有效地用作篩選標誌。於本申請案中，抗生素抗性基因並非為對本申請案的核心技術(即由載體的最佳組合實現的表現效率)產生較大影響的要素，因此可無限制地使用通常使用的抗生素抗性基因作為篩選標誌。作為具體的示例，可使用針對胺苄青黴素(ampicilin)、四環素(tetracyclin)、康黴素(kanamycin)、氯黴素(chloroamphenicol)、鏈黴素(streptomycin)或新黴素(neomycin)的抗性基因等。

可利用於本申請案的表現果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物可利用將包括編碼上述酶的核酸的載體導入至宿主細胞內的方法，使上述載體轉形的方法可包括將核酸導入至細胞內的任一方法可選擇如於本技術領域內公知的適當的標準技術而執行。可包括電致孔(electroporation)、磷酸鈣共沉澱(calcium phosphate co-precipitation)、反轉錄病毒感染(retroviral infection)、顯微注射法(microinjection)、二乙胺乙基(Dicthylaminoethyl，DEAE)-葡聚糖(DEAE-dextran)、陽離子脂質體(cationic liposome)法及熱衝擊法等，但並不限制於此。

轉形的基因只要可於宿主細胞內表現，則可包括所有***於宿主細胞的染色體內的形態及位於染色體外的形態。並且，上述基因只要為包括DNA及RNA作為可編碼多肽的聚核苷酸且可導入至宿主細胞內而表現者即可，因此可無限制地使用具有上述特徵者。例如，上述基因能夠以作為包括自表現所需的所有要素的聚核苷酸結構體的表現盒(expression cassette)形態導入至宿主細胞。上述表現盒通常可包括以可發揮作用的方式連接於上述基因的啟動子(promoter)、轉錄終止訊號、核糖體結合位點及轉譯終止訊號。上述表現盒可呈可實現自複製的表現載體形態。另外，上述基因亦可為如下者：以其本身的形態或聚核苷酸結構體的形態導入至宿主細胞而於宿主細胞內以可發揮作用的方式與表現所需的序列連接。

本申請案的微生物只要為包括本申請案的核酸或本申請案的重組載體而可生產本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物即可，因此可包括原核微生物及真核微生物中的任一種。例如，可包括屬於埃希氏菌(Escherichia)屬、歐文氏桿菌(Erwinia)屬、沙雷氏菌(Serratia)屬、普羅威登菌(Providencia)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬及短桿菌(Brevibacterium)屬的微生物菌株，具體而言，可為大腸桿菌(E.coli)或麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)，但並不限制於此。作為此種微生物的具體例，可為大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1、大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E或大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E等。

本申請案的微生物可包括除上述核酸導入或載體導入以外可藉由各種公知方法表現本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶或相關酶的所有微生物。

本申請案的微生物的培養物可為於培養基中培養表現本申請案的塔格糖-6-磷酸激酶或相關酶的微生物而製備者。

於本申請案中，用語“培養”是指使上述微生物於適當地調節的環境條件下生長。本申請案的培養過程可利用業界熟知的適當的培養基與培養條件實現。此種培養過程可根據選擇的菌株而由業者容易地調整來使用。培養微生物的上述步驟並無特別限制，可藉由公知的批式培養方法、連續式培養方法、流加式培養方法等執行。此時，培養條件並無特別限制，可使用鹼性化合物(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)調節最適pH值(例如，pH5至pH9，具體而言為pH7至pH9)。另外，可於培養中使用如脂肪酸聚二醇酯的消泡劑來抑制氣泡的產生，另外，為了保持培養物的好氧狀態而可向培養物中注入氧氣或含氧氣體、或為了保持厭氧狀態及微好氧狀態而可不注入氣體或注入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體。培養溫度可保持為25℃至40℃、具體而言為30℃至37℃，但並不限制於此。培養時間可持續至獲得所期望的有用物質的生產量為止，具體而言，可培養約0.5小時至60小時，但並不限制於此。而且，使用的培養用培養基作為碳供給源可單獨或混合糖及碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素)、油脂及脂肪(例如，大豆油、葵花籽油、花生油及椰子油)、脂肪酸(例如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸)、醇(例如，甘油及乙醇)與有機酸(例如，乙酸)等而使用，但並不限制於此。作為氮供給源，可單獨或混合含氮的有機化合物(例如，蛋白腖、酵母萃取液、肉汁、麥芽萃取液、玉米漿、大豆粕粉及尿素)或無機化合物(例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨)等而使用，但並不限制於此。作為磷供給源，可單獨或混合磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、與其對應的含鈉的鹽等而使用，但並不限制於此。另外，於培養基中可包括如金屬鹽(例如，硫酸鎂或硫酸鐵)、胺基酸及維生素的其他必需生長促進物質。

本申請案的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物可更包括果糖-6-磷酸，上述果糖-6-磷酸可藉由本申請案的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶而轉化成塔格糖-6-磷酸。

本申請案的另一實施方式是有關於一種用於生產塔格糖的組成物，其包括：塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物；及塔格糖-6-磷酸磷酸酶(tagatose-6-phosphate phosphatase)、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物。於本實施方式中，對塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物的說明與上述實施方式相同。

本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶只要為具有去除塔格糖 -6-磷酸的磷酸基而轉化成塔格糖的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的酶或其變異體。

根據本申請案的一實施例，本申請案的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可為如下蛋白質：由序列號7的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號7的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號7的胺基酸序列構成的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可藉序列號8的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖-6-磷酸異構酶(glucose-6-phosphate isomerase)、表現上述葡萄糖-6-磷酸異構酶的微生物或上述微生物的培養物，可於存在上述酶的條件下將葡萄糖-6-磷酸異構化而生成果糖-6-磷酸。本申請案的葡萄糖-6-磷酸-異構酶只要為具有將葡萄糖-6-磷酸異構化成果糖-6-磷酸的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可為如下蛋白質：由序列號9的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號9的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號9的胺基酸序列構成的葡萄糖-6-磷酸-異構酶可由序列號10的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖磷酸變位酶(phosphoglucomutase)、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或上述微生物的培養物，上述酶促進將葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸、或將葡萄糖-6-磷酸轉化成葡萄糖-1-磷酸的可逆反應。本申請案的葡萄糖磷酸變位酶(phosphoglucomutase)只要為具有可將葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸或相反地轉化的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖磷酸變位酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自新阿波羅棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖磷酸變位酶可為如下蛋白質：由序列號11的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號11的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號11的胺基酸序列構成的葡萄糖磷酸變位酶可由序列號12的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括葡萄糖激酶(glucokinase)、表現上述葡萄糖激酶的微生物或上述微生物的培養物。本申請案的葡萄糖激酶只要為具有將葡萄糖磷酸化的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的葡萄糖激酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自異常球菌屬或厭氧繩菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自異常球菌屬中度嗜熱菌(Deinococcus geothermalis)、嗜熱厭氧繩菌(Anaerolinea thermophila)的酶或其變異體。本申請案的葡萄糖激酶只要為具有可將葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。具體而言，本申請案的葡萄糖激酶可為磷酸依存型葡萄糖激酶。根據本申請案的一實施例，本申請案的葡萄糖激酶可為如下蛋白質：由序列號13或序列號15的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號13或序列號15的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號13的胺基酸序列構成的葡萄糖激酶可由序列號14的核苷酸序列編碼，本申請案的由序列號15的胺基酸序列構成的葡萄糖激酶可由序列號16的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase)、澱粉磷酸化酶(starch phosphorylase)、麥芽糊精磷酸化酶(maltodextrin phosphorylase)或蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase)、表現上述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或上述微生物的培養物。上述磷酸化酶只要為具有可將澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。磷酸化酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自新阿波羅棲熱袍菌的酶或其變異體。本申請案的磷酸化酶可為如下蛋白質：由序列號17的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號17的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號17的胺基酸序列構成的磷酸化酶可由序列號18的核苷酸序列編碼。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括：α-澱粉酶(α-amylase)、支鏈澱粉酶(pullulanase)、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)、蔗糖酶(sucrase)或異澱粉酶(isoamylase)；表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物；或表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可單獨包括可用於生產本申請案中所記載的塔格糖的兩種以上的酶或其轉形體、或包括藉由編碼兩種以上的酶的核苷酸而轉形的轉形體。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括4-α-葡聚糖轉移酶(4-α-glucanotransferase)、表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物或表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物的培養物。本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶只要為具有將葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糊精或蔗糖的活性的蛋白質即可，因此可無限制地包括上述蛋白質。本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如可為來自棲熱袍菌屬的酶或其變異體，具體而言，可為來自海棲熱袍菌的酶或其變異體。根據本申請案的一實施例，本申請案的4-α-葡聚糖轉移酶可為如下蛋白質：由序列號19的胺基酸序列構成的蛋白質；或由與上述序列號19的胺基酸序列具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%的遺傳同源性或由上述任意兩個數值定義的範圍內的遺傳同源性的序列構成的蛋白質。根據本申請案的一實施例，本申請案的由序列號19的胺基酸序列構成的4-α-葡聚糖轉移酶可由序列號20的核苷酸序列編碼。

作為可使用於上述實施例的微生物的示例，可列舉大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2及大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4等。上述重組微生物分別於2017年3月20日以寄存編號KCCM11990P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1)、KCCM11991P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2)、KCCM11992P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1)、KCCM11993P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2)、KCCM11994P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4)寄存至韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括與上述酶的各基質對應的物質、成分或組成物。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括通常使用於上述用於生產塔格糖的組成物的任意適當的賦形劑。作為此種賦形劑，例如可為保存劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等張劑等，但並不限定於此。

本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括金屬。於一實施例中，本申請案的金屬可為包括2價陽離子的金屬。具體而言，本申請案的金屬可為選自由鎳、鈷、鋁、鎂(Mg)及錳(Mn)所組成的族群中的一種以上。更具體而言，本申請案的金屬可為金屬離子或金屬鹽，更進一步具體而言，上述金屬鹽可為選自由NiSO₄、MgSO₄、MgCl₂、NiCl₂、CoCl₂、CoSO₄、MnCl₂及MnSO₄所組成的族群中的一種以上。

本申請案的另一實施方式是有關於一種塔格糖-6-磷酸的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-二磷酸醛縮酶、表現上述塔格糖-二磷酸醛縮酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟。

與上述用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物相關的事項可相同地適用於用於生產塔格糖的組成物。

本申請案的另一實施方式是有關於一種塔格糖-6-磷酸的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟。上述方法可更包括使上述塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而轉化成塔格糖的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物的培養物與葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate)接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6- 磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的葡萄糖磷酸變位酶、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物的培養物與葡萄糖-1-磷酸(Glucose-1-phosphate)接觸而將上述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的葡萄糖磷酸化酶、表現上述葡萄糖磷酸化酶的微生物或表現上述葡萄糖磷酸化酶的微生物的培養物與葡萄糖接觸而將上述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。

本申請案的方法可更包括使α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶、表現上述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物或表現上述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。

本申請案的方法可更包括使如本申請案所述的4-α-葡聚糖轉移酶、表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物或表現上述4-α-葡聚糖轉移酶的微生物的培養物與葡萄糖接觸而將上述葡萄糖轉化成澱粉、麥芽糊精或蔗糖的步驟。

於本申請案的方法中，能夠以pH5.0至pH9.0的條件、30℃至80℃的溫度條件及/或0.5小時至48小時的條件執行各接觸。具體而言，本申請案的接觸可於pH6.0至pH9.0的條件或pH7.0至pH9.0的條件下執行。另外，本申請案的接觸可於35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃的溫度條件下執行。而且，本申請案的接觸可執行0.5小時至36小時、0.5小時至24小時、0.5小時至12小時、0.5小時至6小時、1小時至36小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至6小時、3小時至36小時、3小時至24小時、3小時至12小時、3小時至6小時、12小時至36小時或18小時至30小時。

於一實施例中，本申請案的接觸可於存在金屬、金屬離子或金屬鹽的條件下執行。

本申請案的又一實施方式是有關於一種塔格糖的製備方法，其包括使本申請案所述的用於生產塔格糖的組成物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合及聚磷酸鹽(polyphosphate)接觸的步驟。

於本申請案的一具體例中，提供一種塔格糖的製備方法，其包括：使如本申請案所述的葡萄糖磷酸化酶、表現上述葡萄糖磷酸化酶的微生物或上述微生物的培養物與葡萄糖接觸而將上述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟；使如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或上述微生物的培養物與上述葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate)接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟；使本申請案中所記載的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶、表現上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物或上述微生物的培養物與上述果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate)接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟；使如本申請案所述的塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物與上述塔格糖-6-磷酸(tagatose-6-phosphate)接觸而將上述塔格糖-6-磷酸轉化成塔格糖的步驟。

上述各轉化反應可依序實施或以同一反應系統的原位(in situ)反應實施。於上述方法中，藉由上述磷酸磷酸酶自塔格糖-6-磷酸游離的磷酸被用作葡萄糖激酶的基質而用於生成葡萄糖-6-磷酸，因此磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率。

於上述方法的一例中，葡萄糖可藉由如下方式製備：使如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖。因此，上述具體例的方法可更包括將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。

於本申請案的另一具體例中，提供一種塔格糖的製備方法，其包括如下：使如本申請案所述的葡萄糖磷酸變位酶、表現上述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或上述微生物的培養物與葡萄糖-1-磷酸(Glucose-1-phosphate)接觸而將上述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟；使如本申請案所述的葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現上述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或上述微生物的培養物與上述葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate)接觸而將上述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟；使本申請案中所記載的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶、表現上述果糖-6-磷酸-4-差向異構酶的微生物或上述微生物的培養物與上述果糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate)接觸而將上述果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的步驟；使如本申請案所述的塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物與上述塔格糖-6-磷酸(tagatose-6-phosphate)接觸而將上述塔格糖-6-磷酸轉化成塔格糖的步驟。

上述各轉化反應可依序實施或以同一反應系統的原位反應實施。

於上述方法的一例中，葡萄糖-1-磷酸可藉由如下方式製備：使如本申請案所述的α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現上述磷酸化酶的微生物或表現上述磷酸化酶的微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸。因此，上述具體例的方法可更包括將上述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。此時，藉由磷酸磷酸酶自塔格糖-6-磷酸游離的磷酸被用作磷酸化酶的基質而用於生成葡萄糖-1-磷酸，因此磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率。

上述方法可更包括對所製備的塔格糖進行精製的步驟。上述精製並無特別限制，可使用於本申請案的技術領域內通常使用的方法。作為非限制性的示例，可列舉層析法、分步結晶及離子精製等。上述精製方法可僅實施一種方法，亦可一併實施兩種以上的方法。例如，可藉由層析法對塔格糖生成反應物進行精製，可利用欲分離的糖與附著於離子樹脂的金屬離子之間的弱結合力的差異執行藉由上述層析法進行的糖的分離。

另外，本申請案可更包括於本申請案的精製步驟前或精製步驟後實施脫色、脫鹽、或既實施脫色又實施脫鹽的步驟。藉由實施上述脫色及/或脫鹽，可無雜質地獲得更純淨的塔格糖反應物。

本申請案的塔格糖製備方法因將葡萄糖或澱粉用作原料而較為經濟，因磷酸不會堆積而可獲得較高的轉化率，且因包括不可逆反應路徑的塔格糖-6-磷酸磷酸酶(tagatose-6-phosphate phosphatase)反應而可明顯地提高向塔格糖的轉化率。

另外，能夠以葡萄糖或澱粉為原料而藉由複合酶反應生產塔格糖，從而具有製備方法簡單、經濟且改善產率的優點。

圖1是表示藉由蛋白質電泳(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE))對使用於自澱粉、蔗糖或葡萄糖製備塔格糖的反應路徑的酶的分子量進行分析的結果。M為蛋白質大小測定標記(size marker，Bio-RAD，USA)。

圖2是表示作為本申請案的一實施例的酶的CJ_AN1_F6P4E具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的高效液相層析法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)的層析結果。

圖3是表示作為本申請案的一實施例的酶的CJ_DT_F6P4E具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的HPLC層析結果。

圖4是表示作為本申請案的一實施例的酶的CJ_AB_F6P4E具有果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的HPLC層析結果。

圖5是表示於本申請案的一實施例中利用塔格糖-6-磷酸激酶(CJ_DT_F6P4E)及CJ_T4_T6PP對果糖-6-磷酸進行處理時轉化成塔格糖的HPLC層析結果。

圖6是表示於同時添加本申請案的參與自麥芽糊精製備塔格糖的路徑的所有酶的情形時藉由複合酶反應生成塔格糖的HPLC層析結果，其中將CJ_AN1_F6P4E用作塔格糖-6-磷酸激酶。

圖7是表示作為本申請案的酶的T4具有塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性的HPLC層析結果。

以下，列舉實施例而詳細地對本申請案進行說明，但上述實施例僅為有助於理解本申請案者，本申請案並不限定於此。

實施例1：各酶的重組表現載體及轉形體的製備

為了提供本申請案的作為塔格糖製備路徑中所需的耐熱性酶的α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase)、葡萄糖磷酸變位酶(phosphoglucomutase)、葡萄糖-6-磷酸-異構酶(glucose-6-phosphate-isomerase)、4-α-葡聚糖轉移酶(4-α-glucanotransferase)，以作為嗜熱微生物的新阿波羅棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)或海棲熱袍菌的註冊於基因庫(Genbank)的基因序列為對象而選擇推測為上述酶的基因序列[按照上述酶的記載順序分別為序列號18(CT1)、序列號12(CT2)、序列號10(TN1)、序列號20(TN2)]。

基於所選擇的上述基因序列製作正向引子(forward primer，序列號21：CT1-Fp、序列號23：CT2-Fp、序列號25：TN1-Fp、序列號27：TN2-Fp)及反向引子(reverse primer，序列號22：CT1-Rp、序列號24：CT2-Rp、序列號26：TN1-Rp、序列號28：TN2-Rp)而進行合成，利用其而以新阿波羅棲熱袍菌的染色體DNA(基因組(genomic)DNA)為模板來藉由聚合酶鏈反應(PCR)擴增各酶的基因。使用限制酶NdeI及XhoI或SalI將擴增的各酶的基因***至大腸桿菌表現用質體載體pET21a(Novagen公司)而製備分別命名為pET21a-CJ_ct1、pET21a-CJ_ct2、pET21a-CJ_tn1及pET21a-CJ_tn2的重組表現載體。

利用通常的轉形方法[參照Sambrook等人，1989]將上述表現載體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)菌株而製備分別命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1及大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2的轉形體(轉形微生物)，並於2017年3月20日按照布達佩斯條約將上述轉形體分別以寄存編號KCCM11990P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1)、KCCM11991P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2)、KCCM11992P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1)及KCCM11993P(大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2)寄存至韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。

實施例2：重組酶的製備

將於實施例1中製備的表現各酶的大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2、大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1及大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2接種至裝有5ml的溶菌酶肉湯(Lysozyme Broth，LB)液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0。

將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600nm的吸光度成為2.0時，添加1mM的異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)而誘導重組酶表現。上述培養過程中的攪拌速度為180rpm，且培養溫度保持為37℃。於在4 ℃下以8,000×g對培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，並利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液，使用多聚組胺酸標籤(His-tag)親和層析法精製各酶。於利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液對精製的重組酶液進行透析後用於反應。

藉由SDS-PAGE分析確認精製的各酶的分子量，根據結果，確認到CT1(α-葡聚糖磷酸化酶)為約96kDa、CT2(葡萄糖磷酸變位酶)為約53kDa、TN1(葡萄糖-6-磷酸-異構酶)為約51kDa(參照圖1)。

實施例3：塔格糖-6-磷酸激酶的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性的確認

3-1.包括塔格糖-6-磷酸激酶基因的重組表現載體及重組微生物的製備1

為了發掘新的耐熱性果糖-6-磷酸-4-差向異構酶(Fructose-6-phosphate-4-epimerase)，以作為嗜熱微生物的嗜熱厭氧繩菌(Anaerolinea thermophila)的註冊於基因庫的基因序列為對象而選擇推測為上述酶的基因序列，基於上述微生物的胺基酸序列(序列號1)與鹼基序列(序列號2)資訊而***至包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His(Bioneer公司)來製作命名為pBT7-C-His-an1的重組表現載體。藉由通常的轉形方法[參照Sambrook等人，1989]將上述表現載體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)菌株而製備命名為大腸桿菌BL21 (DE3)/pBT7-C-His-an1的轉形體(轉形微生物)，並於2017年3月20日按照布達佩斯條約將上述轉形體以寄存編號KCCM11996P(大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-an1)寄存至韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。

3-2.包括塔格糖-6-磷酸激酶基因的重組表現載體及重組微生物的製備2

為了提供果糖-6-磷酸-4-差向異構酶(Fructose-6-phosphate-4-epimerase)，分別獲得來自作為嗜熱微生物的厭氧繩菌細菌(Anaerolineae bacterium)SG8_19或嗜熱圓錐網團菌(Dictyoglomus turgidum)的塔格糖-6-磷酸激酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的重組載體及轉形微生物。

具體而言，以註冊於基因庫及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的厭氧繩菌細菌SG8_19或嗜熱圓錐網團菌基因序列為對象而選擇塔格糖-6-磷酸激酶基因序列，基於上述兩種微生物的胺基酸序列(序列號3及序列號5)與鹼基序列(序列號4及序列號6)資訊而製備包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組載體pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E及pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E(Bioneer(股份有限公司)，韓國)。

所製備的上述表現載體藉由通常的轉形方法[參照Sambrook等人，1989]轉形至大腸桿菌BL21(DE3)菌株而製備分別命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_AB_F6P4E及大腸桿菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_DT_F6P4E的轉形體(重組微生物)，並於布達佩斯條約下將上述轉形體依次寄存至寄存機關(韓國微生物保存中心：Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)而被賦予寄存編號KCCM12093P(寄存日期2017年8月11日)及KCCM12110P(寄存日期2017年9月13日)。

3-3.重組塔格糖-6-磷酸激酶的製備

為了自所製備的上述重組微生物製備重組酶CJ_DT_F6P4E、CJ_AB_F6P4E及CJ_AN1_F6P4E，將各重組微生物接種至裝有包括有胺苄青黴素(ampicillin)抗生素的5ml的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0。將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600nm的吸光度成為2.0時，添加1mM的IPTG(異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)而誘導重組酶表現。於180rpm及37℃的條件下執行上述種菌培養及正式培養。於在4℃下以8,000×g對正式培養的培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用25mM的Tris-HCl(pH值為7.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，並利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液。於使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製後，以填充劑的10倍的液量流加含有20mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH₂PO₄(pH值為8.0)緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。其次，更流加含有250mM的咪唑及300mM的NaCl的50mM的NaH₂PO₄(pH值為8.0)緩衝溶液進行溶出精製後，使用25mM的Tris-HCl(pH值為7.0)緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_DT_F6P4E、CJ_AB_F6P4E及CJ_AN1_F6P4E。

3-4.重組塔格糖-6-磷酸激酶的果糖-6-磷酸-4-差向異構酶活性分析

對在上述實施例3-3中獲得的重組塔格糖-6-磷酸激酶的果糖-6-磷酸-4-差向異構化活性進行分析。具體而言，將1重量%的作為基質的果糖-6-磷酸懸浮至25mM的Tris-HCl(pH值為7.0)緩衝溶液，添加精製的1unit/ml的CJ_DT_F6P4E、CJ_AB_F6P4E及CJ_AN1_F6P4E而於60℃下反應1小時，之後為了去除磷酸，添加1unit/ml的磷酸酶(NEB公司，鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、小牛場(Calf Intestinal))而於37℃下處理1小時。利用HPLC對反應產物進行分析，以使用SP0810(Shodex公司)管柱於80℃下以1ml/min的流速流加流動相(水)的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器(Refractive Index Detector)對產物進行分析。

根據結果，可確認到CJ_DT_F6P4E、CJ_AB_F6P4E及CJ_AN1_F6P4E均具有將果糖-6-磷酸轉化成塔格糖-6-磷酸的活性(圖2至圖4)。

實施例4：塔格糖-6-磷酸磷酸酶(D-tagatose-6-phosphate phosphatase)的發掘

為了於本申請案的塔格糖製備路徑中藉由同步聚合酶反應自果糖-6-磷酸生產塔格糖而發掘可與塔格糖-6-磷酸激酶同時進行酶反應的塔格糖-6-磷酸磷酸酶。

4-1.包括塔格糖-6-磷酸磷酸酶基因的重組表現載體及重 組微生物的製備

以註冊於基因庫的海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)基因序列為對象而選擇推測為塔格糖-6-磷酸磷酸酶的基因(序列號8，以下記載為t4)及胺基酸序列(序列號7)，基於所選擇的上述基因序列製作正向引子(forward primer，序列號29)及反向引子(reverse primer，序列號30)而進行合成。利用上述引子以海棲熱袍菌的染色體DNA(基因組DNA)為模板而藉由聚合酶鏈反應(PCR)擴增t4基因。使用限制酶NdeI及XhoI將擴增的各酶基因***至大腸桿菌表現用質體載體pET21a(Novagen公司)而製備重組表現載體，並命名為pET21a-CJ_t4。藉由熱衝擊(heat shock transformation，Sambrook與Russell：分子選殖(Molecular cloning)，2001)將所製備的上述表現載體轉形至大腸桿菌BL21(DE3)菌株而製備重組微生物後，冷凍保管於50%甘油中待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4，於2017年3月20日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心(Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM)而被賦予寄存編號KCCM11994P。

4-2.重組塔格糖-6-磷酸磷酸酶的製備

將大腸桿菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4接種至裝有5ml的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600nm的吸光度成為2.0。將種菌培養的該培養液接種至裝有LB液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於600nm的吸光度成為2.0時，添加1mM的IPTG而誘導重組酶表現。於180rpm的攪拌速度及37℃下執行上述種菌培養及正式培養。於在4℃下以8,000×g對正式培養的培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，利用相同的緩衝溶液進行懸浮，之後利用超音波細胞粉碎機對細胞進行粉碎。於在4℃下以13,000×g對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液，利用多聚組胺酸標籤親和層析法精製酶，之後於利用50mM的Tris-HCl(pH值為8.0)緩衝溶液進行透析而使用，將精製的上述重組酶命名為CJ_T4。

4-3.CJ_T4的塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性的分析

為了分析CJ_T4的活性，於將塔格糖-6-磷酸懸浮至50mM的Tris-HCl(pH值為7.5)緩衝溶液後，添加精製的0.1unit/ml的CJ_T4與10mM的MgCl₂而於70℃下反應10分鐘，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用HPX-87H(Bio-Rad公司)管柱於60℃下以0.6ml/min的流速流加流動相(水)的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器對塔格糖與塔格糖-6-磷酸進行分析。

結果顯示，於反應產物中生成塔格糖，於在磷酸及塔格糖反應物中添加上述CJ_T4後進行相同的反應，結果未形成塔格糖。因此，可確認到CJ_T4具有不可逆的塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性(圖7)。

實施例5：藉由同步聚合酶反應進行的塔格糖生產

為了對藉由複合酶自果糖-6-磷酸生產塔格糖的活性進行分析，於包括1unit/ml的CJ_t4(寄存編號：KCCM11994P)、1unit/ml的CJ_DT_F6P4E及25mM的Tris-HCl(pH值為7.0)緩衝溶液的反應液中添加0.1%(w/v)果糖-6-磷酸而於60℃的溫度下反應1 小時，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用SP0810(Shodex公司)管柱於80℃下以1ml/min的流速流加流動相的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器檢測塔格糖。

根據結果，確認到生成塔格糖，且可確認到藉由塔格糖-6-磷酸激酶與塔格糖-6-磷酸磷酸酶的同步聚合酶反應而可自果糖-6-磷酸生產塔格糖(圖5)。

實施例6：藉由同步聚合酶反應而自麥芽糊精生產塔格糖

為了對藉由複合酶而自麥芽糊精生產塔格糖的活性進行分析，於包括1unit/ml的CT1、1unit/ml的CT2、1unit/ml的TN1、1unit/ml的T4、1unit/ml的CJ_AN1_F6P4E及20mM至50mM的磷酸鈉(sodium phosphate，pH值為7.0)的反應液中添加5%(w/v)麥芽糊精而於60℃的溫度下反應1小時，之後利用HPLC對反應產物進行分析。以使用SP0810(Shodex公司)管柱於80℃下以0.6ml/min的流速流加流動相的條件執行HPLC分析，利用示差折射率檢測器檢測塔格糖。

根據結果，可確認到藉由所添加的CT1、CT2、TN1、T4及AN1的複合酶反應而自麥芽糊精生成塔格糖(圖6)。

【生物材料寄存】

[國外寄存資訊/國內寄存資訊]

寄存編號：KCCM11990P/BCRC940665

寄存日期：2017年3月20日/2018年6月29日

寄存機關名：韓國微生物保存中心/財團法人食品工業發展研究所

寄存編號：KCCM11991P/BCRC940666

寄存日期：2017年3月20日/2018年6月29日

寄存編號：KCCM11992P/BCRC940667

寄存日期：2017年3月20日/2018年6月29日

寄存編號：KCCM11993P/BCRC940668

寄存日期：2017年3月20日/2018年6月29日

寄存編號：KCCM11994P/BCRC940669

寄存日期：2017年3月20日/2018年6月29日

寄存機關名稱：韓國微生物保存中心/財團法人食品工業發展研究所

寄存編號：KCCM11996P/BCRC940670

寄存日期：2017年3月20日/2018年6月29日

寄存編號：KCCM12093P/BCRC940671

寄存日期：2017年8月11日/2018年6月29日

寄存編號：KCCM12110P/BCRC940672

寄存日期：2017年9月13日/2018年6月29日

<110> CJ第一製糖

<120> 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法

<130> P18-6045

<150> KR 17/0042165

<151> 2017-03-31

<160> 30

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 429

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 果糖-6-磷酸C4-差向異構酶(AN1)，來自Anaerolinea thermophila

<400> 1

<210> 2

<211> 1278

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 果糖-6-磷酸-C4-差向異構酶(AN1)的DNA序列，來自Anaerolinea thermophila

<400> 2

<210> 3

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ_AB_F6P4E的胺基酸序列，來自Anaerolineae bacterium

<400> 3

<210> 4

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ_AB_F6P4E的核苷酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 408

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ_DT_F6P4E的胺基酸序列，來自Dictyoglomus thermophilum

<400> 5

<210> 6

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CJ_DT_F6P4E的核苷酸序列，來自Dictyoglomus thermophilum

<400> 6

<210> 7

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T4)，來自Thermotoga maritima

<400> 7

<210> 8

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 塔格糖-6-磷酸磷酸酶(T4)的DNA序列，來自Thermotoga maritima

<400> 8

<210> 9

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 葡萄糖-6-磷酸異構酶(TN1)，來自Thermotoga maritima

<400> 9

<210> 10

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 葡萄糖-6-磷酸異構酶(TN1)的DNA序列，來自Thermotoga maritima

<400> 10

<210> 11

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 磷酸變位酶(CT2)，來自Thermotoga neapolitana

<400> 11

<210> 12

<211> 1416

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 磷酸變位酶(CT2)的DNA序列，來自Thermotoga neapolitana

<400> 12

<210> 13

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ dg ppgk

<400> 13

<210> 14

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ dg ppgk的DNA序列

<400> 14

<210> 15

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ at ppgk

<400> 15

<210> 16

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多磷酸依賴型葡萄糖激酶CJ at ppgk的DNA序列

<400> 16

<210> 17

<211> 823

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α-葡聚糖磷酸化酶(CT1)，來自Thermotoga neapolitana

<400> 17

<210> 18

<211> 2472

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α-葡聚糖磷酸化酶(CT1)的DNA序列，來自Thermotoga neapolitana

<400> 18

<210> 19

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-α-葡聚糖轉移酶(TN2)，來自Thermotoga maritima

<400> 19

<210> 20

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-α-葡聚糖轉移酶(TN2)的DNA序列，來自Thermotoga maritima

<400> 20

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT1的正向引子DNA序列

<400> 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT1的反向引子DNA序列

<400> 22

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT2的正向引子DNA序列

<400> 23

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT2的反向引子DNA序列

<400> 24

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TN1的正向引子DNA序列

<400> 25

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TN1的反向引子DNA序列

<400> 26

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TN2的正向引子DNA序列

<400> 27

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TN2的反向引子DNA序列

<400> 28

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T4的正向引子DNA序列

<400> 29

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T4的反向引子DNA序列

<400> 30

Claims

一種用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現所述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其更包括果糖-6-磷酸。
如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖-6-磷酸的組成物，其中所述塔格糖-6-磷酸激酶由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成。
一種用於生產塔格糖的組成物，其包括：塔格糖-6-磷酸激酶、表現所述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或所述微生物的培養物；及塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第4項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括果糖-6-磷酸。
如申請專利範圍第4項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖-6-磷酸異構酶、表現所述葡萄糖-6-磷酸異構酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第6項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖磷酸變位酶、表現所述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第7項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表現所述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第6項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括葡萄糖磷酸化酶、表現所述葡萄糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物。
如申請專利範圍第9項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶、表現所述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶的微生物或所述微生物的培養物。
一種塔格糖的製備方法，其包括使果糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸激酶、表現所述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而製備塔格糖-6-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第11項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使所製備的所述塔格糖-6-磷酸與塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而製備塔格糖的步驟。
如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖-6-磷酸-異構酶、表現所述葡萄糖-6-磷酸-異構酶的微生物或所述微生物的培養物與葡萄糖-6-磷酸接觸而將所述葡萄糖-6-磷酸轉化成果糖-6-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第13項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖磷酸變位酶、表現所述葡萄糖磷酸變位酶的微生物或所述微生物的培養物與葡萄糖-1-磷酸接觸而將所述葡萄糖-1-磷酸轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第14項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表現所述α-葡聚糖磷酸化酶、澱粉磷酸化酶、麥芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將所述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖-1-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第13項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使葡萄糖磷酸化酶、表現所述葡萄糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培養物與葡萄糖接觸而將所述葡萄糖轉化成葡萄糖-6-磷酸的步驟。
如申請專利範圍第16項所述的塔格糖的製備方法，其更包括使α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶、異澱粉酶、表現所述α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶、異澱粉酶的微生物或所述微生物的培養物與澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合接觸而將所述澱粉、麥芽糊精或蔗糖轉化成葡萄糖的步驟。
如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其中以pH5.0至pH9.0的條件、40℃至80℃的溫度條件及/或0.5小時至24小時的條件執行所述接觸。
如申請專利範圍第11項或第12項所述的塔格糖的製備方法，其中所述塔格糖-6-磷酸激酶由序列號1、序列號3或序列號5的胺基酸序列構成，所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶由序列號7的胺基酸序列構成。
一種塔格糖的製備方法，其包括：使以下進行接觸的步驟：（a）澱粉、麥芽糊精、蔗糖或其組合；（b）（i）塔格糖-6-磷酸磷酸酶、（ii）塔格糖-6-磷酸激酶、（iii）葡萄糖-6-磷酸-異構酶、（iv）葡萄糖磷酸變位酶或葡萄糖磷酸化酶、（v）磷酸化酶及（vi）α-澱粉酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、葡萄糖澱粉酶或蔗糖酶中的一種以上；及（c）磷酸。