CN109666620B - 一种生产塔格糖的工程菌株，其构建方法及应用 - Google Patents
一种生产塔格糖的工程菌株，其构建方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生产塔格糖工程菌株的构建方法及应用。所述构建方法通过调控葡萄糖胞内代谢，降低细胞中果糖6‑磷酸激酶的酶活性，增强葡萄糖激酶和葡萄糖6‑磷酸异构酶酶活性从而提高胞内果糖6‑磷酸的含量，构建由6‑磷酸塔格糖3‑差向异构酶和6‑磷酸塔格糖磷酸化酶组成的塔格糖合成途径，由果糖透过酶和果糖激酶组成的果糖代谢途径；获得了一株谷氨酸棒杆菌重组菌株，该菌株可以代谢葡萄糖、果糖或者蔗糖合成塔格糖，与目前报道的生物转化果糖合成塔格糖方法相比，具有操作简便、便于分离等优点，适合规模化生产塔格糖。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产塔格糖工程菌，该工程菌的制备方法以及将其用于发酵生产塔格糖中的应用。
背景技术
塔格糖(D-Tag)是天然存在的一种稀有单糖，是半乳糖的酮糖形式，果糖的差向异构体。甜味特性与蔗糖相似，而产生的热量只为蔗糖的三分之一，所以被称之为低热量甜味剂。塔格糖具有低热量值、零血糖生成指数、血糖钝化作用、无龋齿性、益生元作用和抗氧化活性等优良营养特性，塔格糖具有四大功能:低能量，降血糖，改善肠道菌群和抗龋齿。美国食品与药品管理局(FDA)2003年就将D-塔格糖列为安全食品(GRAS)添加剂。塔格糖的安全性及其在食品中的应用已被日本厚生省批准，
目前生产塔格糖主要通过化学合成和生物转化两种方法，化学合成需要多步保护和脱保护步骤，造成能耗高、收率低，生产成本高。生物转化法以半乳糖为原料，经L-***糖异构酶催化合成D-塔格糖，该方法催化合成效率较高，然而半乳糖价格昂贵，同时该反应转化率仅有50％，造成产物分离成本上升、塔格糖生产成本高，导致该生物转化法无法广泛应用。相关专利提出建立体外催化体系转化果糖合成塔格糖，经过磷酸化和脱磷酸化步骤提高转化率，但是需要昂贵的ATP作为辅酶，会造成塔格糖生产成本的上升，不适合大规模生产，所以亟待开发一种低成本，低污染，高产率的塔格糖合成新方法。本发明提出采用基因工程技术和微生物学方法构建微生物重组菌株，再以廉价的葡萄糖、果糖为底物发酵生产塔格糖的新思路，与以上方法相比，该方法具有环境友好、底物来源丰富且廉价、转化率高、不依赖辅酶ATP等优点，适合规模化生产塔格糖。
发明内容
本发明的目的一是提供一种生产塔格糖工程菌株的构建方法。所述构建方法包括以下步骤：
(1)增强葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性，其特征为通过引入强启动子或者采用质粒表达形式提高葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因的表达强度，或者采用染色体整合方式整合其他物种来源的酶活性更高的葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶基因。
(2)降低果糖6-磷酸激酶的酶活性，其特征为采用基因敲除或者引入弱启动子方式，降低细胞果糖6-磷酸激酶基因的表达水平。
(3)增强6-磷酸塔格糖3-差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸化酶的酶活性，其特征为采用染色体整合或者质粒表达形式，向胞内引入6-磷酸塔格糖3-差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸化酶基因。
(4)增强果糖透过酶和果糖激酶的酶活性，其特征为采用强启动子、染色体整合或者质粒表达形式，增强果糖透过酶和果糖激酶基因的表达水平。
所述增强葡萄糖激酶和葡萄糖6-磷酸异构酶的酶活性和降低果糖6-磷酸激酶的酶活性的目的在于，提高胞内果糖6-磷酸的含量；所述增强6-磷酸塔格糖异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸化酶的酶活性的目的在于将胞内果糖6-磷酸转化为塔格糖6-磷酸；所述增强果糖透过酶和果糖激酶的目的在于提高工程菌株利用果糖转化为果糖6-磷酸的能力。
所述塔格糖工程菌株的构建方法适用于以谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酿酒酵母等菌株为宿主菌进行遗传改造，所获得工程菌株用于发酵法合成塔格糖。
本发明的目的二是提供重组菌株Tag的构建方法，包括以下步骤：
(1)扩增来源于根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens的6-磷酸塔格糖4-差向异构酶基因(SEQ ID NO:1)和来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶基因(SEQ ID NO:2)，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1；扩增来源于嗜热网球菌Dictyoglomus thermophilum的6-磷酸塔格糖4-差向异构酶基因(SEQ ID NO:3)和来源于古生球菌属Archaeoglobus fulgidus的6-磷酸塔格糖磷酸化酶基因(SEQ ID NO:4)，并将其构建至表达载体pEC-XK99E中，得到重组表达载体pEC-T6PE-T6PP2，将重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1和pEC-T6PE-T6PP2分别构建至野生型谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株Tag1和Tag2。
(2)在谷氨酸棒杆菌13032中，通过分子遗传操作降低谷氨酸棒杆菌中的果糖6-磷酸激酶(SEQ ID NO:5)表达水平，得到重组菌株Tag3。
(3)将携带6-磷酸塔格糖4-差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸化酶基因的重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1构建至重组菌株Tag3中，获得重组菌株Tag4。
(4)扩增来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶基因(SEQ ID NO:6)和葡萄糖6-磷酸异构酶基因(SEQ ID NO:7)，将其构建在表达载体pXMJ19中，得到重组质粒pXMJ19-GlK-PGI，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI和pEC-T6PE-T6PP1转化至重组菌株Tag3中，得到重组菌株Tag5。
(5)扩增来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶基因(SEQ ID NO:8)和粪肠球菌Enterococcus faecalis的果糖激酶基因(SEQ ID NO:9)，并将其构建至表达载体pEC-T6PE-P6PP中得到重组载体pEC-T6PE-P6PP-Frk-GlF，将重组质粒pXMJ19-GlK-PGI和pEC-T6PE-P6PP-Frk-GlF构建至重组菌株Tag3中，获得重组菌株Tag6。
本发明的目的三是提供所述谷氨酸棒杆菌工程菌株Tag1、Tag2、Tag4、Tag5和Tag6在塔格糖生产中的应用。其特征为，采用重组菌株Tag1、Tag2、Tag4和Tag5发酵葡萄糖合成塔格糖；重组菌株Tag6可以发酵葡萄糖、果糖、蔗糖或者以上三者的混合液如糖蜜生产塔格糖。
用该方法制备塔格糖，具有原料成本低、产率高等优点，适合规模化生产塔格糖。
附图说明
图1发酵法制备塔格糖的技术路线。
图2重组菌株Tag5发酵葡萄糖合成塔格糖的高效液相色谱图分析结果。
图3重组菌株Tag6发酵果糖合成塔格糖的高效液相色谱图分析结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步详述本发明。
本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag1和Tag2的构建
1.构建重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1
根据KEGG数据库中来源于根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens的6-磷酸塔格糖4-差向异构酶T6PE基因(SEQ ID NO:1)和来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶T6PP基因(SEQ ID NO:2)，设计引物1，引物2，引物3和引物4，并通过PCR扩增获得相应序列，用限制性内切酶SacI和SmaI同时对基因T6PE1和表达载体pEC-XK99E(Kirchner O and Tauch A.2003,Tools for genetic engineering in the amino acid-producing bacterium Corynebacterium glutamicum.J.Biotechnol.104:287–299)进行酶切，连接得到重组质粒pEC-T6PE1；进一步采用限制性内切酶SmaI和XbaI同时对基因T6PP1和表达载体pEC-T6PE1进行酶切、连接得到重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1。引物序列如下：
引物1：CAGTCGAGCTCATGACCGCCATTTTGGAAAATC
引物2：GATCCCCCGGGTCAGTGGCGGCCTTCGCCCGT
引物3：GATCCCCCGGGAAAGGAGGACAACCAtgtcaaccccgcgtcagattcttgctgca
引物4：CTAGCTCTAGATTAACCGAGAAGGTCTTTTGCGGT
2.构建重组表达载体pEC-T6PE-T6PP2
根据NCBI数据库中来源于Dictyoglomus thermophilum的嗜热网球菌6-磷酸塔格糖4-差向异构酶T6PE基因(SEQ ID NO:3)和来源于古生球菌属Archaeoglobus fulgidus的6-磷酸塔格糖磷酸化酶T6PP基因(SEQ ID NO:4)，设计引物5，引物6，引物7和引物8，并通过PCR扩增获得相应序列，用限制性内切酶SacI和SmaI同时对基因T6PE2和表达载体pEC-XK99E进行酶切，连接得到重组质粒pEC-T6PE2；进一步采用限制性内切酶SmaI和XbaI同时对基因T6PP2和表达载体pEC-T6PE2进行酶切、连接得到重组表达载体pEC-T6PE-T6PP2。引物序列如下：
引物5：CAGTCGAGCTCatgtggcttagtaaagattatttg
引物6：GATCCCCCGGGTTATAAGTTTACAGCATAGTGATAG
引物7：GATCCCCCGGGAAAGGAGGACAACCATGTTCAAACCAAAGGCCATCG
引物8：CTAGCTCTAGATCACCGCAACAATCCCAGAAACT
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag1
将重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1电转化至野生型谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株Tag1,将重组表达载体pEC-T6PE-T6PP2电转化至野生型谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株Tag2。
实施例2谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag4的构建
1.构建整合载体pK18mobsacB-pfk'
根据KEGG数据库中来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的果糖6-磷酸激酶基因的上游序列(SEQ ID NO:10)和下游序列(SEQ ID NO:11)，设计引物9，引物10，引物11和引物12，引物9和引物10经PCR扩增获得相应pfk'基因上游序列，引物9和引物10经PCR扩增获得相应pfk”基因下游序列；采用融合PCR方法得到由上游和下游序列组成的融合PCR片段pfk'-pfk”，进一步采用限制性内切酶EcoRI和HindIII融合片段pfk'-pfk”和载体pK18mobsacB(
A,Tauch A,Jager W,Kal inowski J,Thierbach G,PuhlerA.1994.SmTag mobil izable multi-purpose cloning vectors derived from theEscherichia coli plasmids pK18 and pK19:selection of defined deletions in thechromosome of Corynebacterium glutamicum.Gene 145:69-73)进行酶切，连接得到获得重组质粒pK18mobsacB-pfk，具体引物序列如下所示：
引物9:ACCGGAATTCATGATTTTGGTTTCCTTCTGCGA
引物10:TTCGAATGGAACTTCCTTCAAGCTGGCTGTGCGGACGATTCCT
引物11:AGGAATCGTCCGCACAGCCAGCTTGAAGGAAGTTCCATTCGAACG
引物12:ACTCAAGCTTGTTAAGACGCAGCTGACCAGTG
2.获得果糖6-磷酸激酶基因敲除的重组菌株Tag3
2.1制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞，将基因敲除载体pK18mobsacB-pfk电转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞中。
2.2挑取在卡那抗性平板上生长的阳性菌落，划线于含有10％蔗糖的LB平板上，放置30℃培养箱中培养24h，此步骤的目的是在于通过蔗糖致死性，筛选卡那缺失克隆。
2.3从LB蔗糖平板上挑取若干菌落，用引物5和引物8再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得1822DNA片段的为阳性克隆。
2.4保存经PCR验证正确的菌株，即无果糖6-磷酸激酶基因活性的重组谷氨酸棒杆菌，命名为Tag3。
3.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag4
将携带6-磷酸塔格糖3-差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸化酶基因的重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1电转化至重组菌株Tag3中，获得重组菌株Tag4。
实施例3谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag5的构建
1.构建重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI
根据KEGG数据库中来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶GlK基因(SEQ ID NO:4)和葡萄糖6-磷酸异构酶PGI基因(SEQ ID NO:5)，设计引物13,引物14，引物15和引物16，并以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增葡萄糖激酶基因glk和葡萄糖6-磷酸异构酶的基因pgi，用限制性内切酶HindIII和PstI同时对基因pgi和表达载体pXMJ19进行酶切，并用T4连接酶进行连接，获得表达载体pXMJ19-PGI；进一步采用限制性内切酶PstI和XbaI同时对基因glk和表达载体pXMJ19-PGI进行酶切，获得重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI。具体引物序列如下所示：
引物13：CACTCAAGCTTATGGGATCCATGGCGGACATTTCGACCAC
引物14：GACAACTGCAGCTACCTATTTGCGCGGTACCACT
引物15：GACAACTGCAGAAAGGAGGACAACCatgccacaaaaaccggccagtt
引物16：GATGGTCTAGATTAGTTGGCTTCCACTACAGAGC
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag5
将重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI和pEC-T6PE-T6PP1电转化至重组菌株Tag3中，获得重组菌株Tag5。
实施例4谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag6的构建
1.构建重组表达载体pEC-T6PE-T6PP-Frk-GlF
根据NCBI数据库中来源于谷氨酸棒杆菌的tuf启动子核苷酸序列，来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶Glf基因序列(SEQ ID NO:6)，来源于大肠杆菌Enterococcus faecalis的果糖激酶Frk基因(SEQ ID NO:7)序列，设计引物17，引物18，引物19，引物20，引物21和引物22，并采用PCR扩增获得tuf启动子，果糖透过酶基因glf和果糖激酶基因frk片段，采用融合PCR策略，以上述三个片段为模板，获得tuf-glf-frk融合片段，并通过酶切连接方式构建至重组表达质粒pEC-T6PE-T6PP1中，得到重组表达质粒pEC-T6PE-T6PP1-FK-GlF。
引物17：GATGGTCTAGATGGCCGTTACCCTGCGAATGT
引物18：agtacccagatttttccattcaTTGTATGTCCTCCTGGACTTCGTG
引物19：CACGAAGTCCAGGAGGACATACAAtgaatggaaaaatctgggtact
引物20：ACCCTGACTACTTTCAGAACTCATtcacagcgagcgctgaagatcgt
引物21：
acgatcttcagcgctcgctgtgaAAAGGAGGACAACCATGAGTTCTGAAAGTAGTCAGGGT
引物22：CTACTTCTGGGAGCGCCACATCTCCT
2.获得谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag6
将重组表达载体pXMJ19-GlK-PGI和pEC-T6PE-T6PP-Frk-GlF电转化至果糖6-磷酸激酶基因敲除的重组菌株Tag3中，获得重组菌株Tag6。
实施例5谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag1、Tag2、Tag4和Tag5在塔格糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag1发酵葡萄糖合成塔格糖
选用100mL BHI培养基(脑心浸粉37g/L,卡那霉素25ng/mL)，加入终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag1进行培养24-48h，发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器,上样量为10μl。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag2发酵葡萄糖合成塔格糖
重组菌株Tag2的培养方法同1相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag4发酵葡萄糖合成塔格糖重组菌株Tag4的培养方法同1相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag5发酵葡萄糖合成塔格糖
重组菌株Tag5的培养方法同1相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
发酵结果显示，经过48小时，重组菌株Tag1可以发酵葡萄糖合成1.2g/L塔格糖，重组菌株Tag2可以发酵葡萄糖合成0.8g/L塔格糖，重组菌株Tag4可以发酵葡萄糖合成4.6g/L塔格糖，与重组菌株Tag1相比，塔格糖产量提高近3.8倍；重组菌株Tag5可以发酵葡萄糖合成6.4g/L塔格糖，与重组菌株Tag1相比，塔格糖产量提高5.3倍。结果如图2((a)表示发酵液0h；(b)表示发酵液48h；(c)表示塔格糖纯品)。
实施例6谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag6在塔格糖生产中的应用
1、谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag6发酵葡萄糖合成塔格糖
重组菌株Tag6的培养方法同实施例5中重组菌株Tag1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的葡萄糖，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
2、谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag6发酵果糖合成塔格糖
重组菌株Tag6的培养方法同实施例5中重组菌株Tag1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的果糖，培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
3、谷氨酸棒杆菌重组菌株Tag6发酵蔗糖合成塔格糖
重组菌株Tag6的培养方法同实施例5中重组菌株Tag1的培养方法相同，培养基中添加终浓度为2％(质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度)的蔗糖，培养培养24-48h，发酵最终样品进行液相色谱检测。
发酵结果显示，经过48小时，重组菌株Tag6可以发酵葡萄糖合成6.8g/L塔格糖，发酵果糖生成8.6g/L塔格糖，发酵蔗糖生成7.9g/L塔格糖。结果如图3((a)表示发酵液0h；(b)表示发酵液48h；(c)表示塔格糖纯品)。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种生产塔格糖的工程菌株、其构建方法及应用
<130> 2018.12.10
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 1
atgaccgcca ttttggaaaa tctcgccgcc gcgcgccgcg ccggcaaacc tgcgggcatc 60
acttcggtct gctcggccca ccccgttgtc ctgcgcgccg caatccgccg cgccgccgcc 120
agtcaaacgg ccgtactgat cgaggccacc tgcaatcagg tcaatcatct cggtggttat 180
accggcatga caccgcgtga cttcgttgcc ttcgtcaaca gcatcgccgc ggaagaagga 240
ctgcccgccg aactgctgat ctttggcggc gatcatctcg gccccaatcc ctggcgcagg 300
gagaaggccg aggacgcgct gacaaaagcc gccgccatgg tcgacgccta tgtcacagct 360
ggttttcgca agatccacct tgatgcatcg atgggctgcg ccggtgagcc ggcagccctg 420
gatgacgtca ccatcgccca ccgcgccgcg aaactcacag ccgttgccga aaaggcagcc 480
actgaggctg gcctgccaaa accgctttat attctgggca ccgaagtgcc ggtgcccggc 540
ggtgccgacc atgtgcttga gaccgtcgca ccgaccgaac cgcaggcggc gcgcaacacc 600
atcgatcttc atcgcgaaat ctttgcgcag cacggtcttt ccgatgcgtt cgaacgggtc 660
atcgcctttg tcgtgcagcc gggtgtggaa ttcggcagcg acaatgtcgt cgcttatgat 720
ccgcaggcag cgcagagcct gagcgccgtg ctggatggcg aaccgcgact ggtcttcgaa 780
gcccattcga ccgattacca gaccgagcct gcccttgcgg cactggtacg cgacggatat 840
ccgatcctca aagttggacc gggcctcacc ttcgcttacc gggaagcgct ttatgcactc 900
gacatgatcg cctccgaaat ggtcggcacc tatggcgacc gaccgctggc gcggactatg 960
gaaaaattga tgttaagcgc gccgggcgac tggcagggcc attaccatgg cgacgacatc 1020
acgctccgat tgcaacgcca ttacagctac agcgaccgca tccgttacta ctggacgcga 1080
ccggaagcgc tcgcggccgt ttccaccttg cataaggcac tggatgggaa gacaattccc 1140
gaaaccctgc tgcgccaata tctcggcgaa ttgccgctcg cggcggttgc gggaaaggaa 1200
ccggaggagg ttctggtcgc ggcggtggat caggtgctgg cgacctatca cgcggcgacg 1260
ggcgaaggcc gccactga 1278
<210> 2
<211> 669
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgtcaaccc cgcgtcagat tcttgctgca atttttgata tggatggatt acttatcgac 60
tcagaacctt tatgggatcg agccgaactg gatgtgatgg caagcctggg ggtggatatc 120
tcccgtcgta acgagctgcc ggacacctta ggtttacgca tcgatatggt ggtcgatctt 180
tggtacgccc ggcaaccgtg gaatgggcca agccgtcagg aagtagtaga acgggttatt 240
gcccgtgcca tttcactggt tgaagagaca cgtccattat taccaggcgt gcgcgaagcc 300
gttgcgttat gcaaagaaca aggtttattg gtgggactgg cctccgcgtc accactacat 360
atgctggaaa aagtgttgac catgtttgac ttacgcgaca gtttcgatgc cctcgcctcg 420
gccgaaaaac tgccttacag caagccgcat ccgcaagtat atctcgactg cgcagcaaaa 480
ctgggcgttg accctctgac ctgcgtagcg ctggaagatt cggtaaatgg catgatcgcc 540
tctaaagcag cccgcatgcg ttccatcgtc gttcctgcgc cagaagcgca aaatgatcca 600
cgttttgtat tagcagacgt caaactttca tcgctgacag aactcaccgc aaaagacctt 660
ctcggttaa 669
<210> 3
<211> 1227
<212> DNA
<213> Dictyoglomus thermophilum
<400> 3
atgtggctta gtaaagatta tttgagaaaa aagggagttt attctatatg tagctctaat 60
ccatatgtga ttgaggcaag tgttgaattt gctaaggaga agaatgatta tattttaatt 120
gaggcgacac ctcatcagat aaaccagttt ggtggatatt caggtatgac tcccgaagat 180
tttaaaaact ttgtaatggg aataataaaa gaaaagggaa tagaagagga tagggtgatt 240
cttggagggg accatttagg ccctctccct tggcaagatg aaccttcttc ttctgcaatg 300
aaaaaggcaa aagaccttat aagggccttt gtggagagtg gttataagaa gatacacctt 360
gattgtagta tgtctctttc tgatgatcct gtagtgctct ctcccgagaa gatagcagaa 420
agggagaggg aacttcttga ggttgcagaa gagactgcta gaaagtacaa ttttcagcct 480
gtgtatgtgg tgggaactga tgtaccggta gctggaggag gcgaagagga aggtattacc 540
tcagtggagg attttagagt agcaatctcc tctttaaaaa aatattttga ggatgttcca 600
aggatatggg ataggataat tggttttgta ataatgcttg gtataggttt taattatgaa 660
aaagtgtttg agtatgacag gattaaggtg agaaaaattt tagaggaggt aaagaaagag 720
aatctttttg ttgaaggtca ctctactgac tatcagacaa aacgtgcatt gagagatatg 780
gtagaggatg gagtaagaat tcttaaggtt ggtcctgctt taacagcaag ttttagaagg 840
ggagtatttt tattaagtag cattgaggat gagcttatat cggaagataa aaggtctaat 900
attaagaaag ttgtgcttga gactatgtta aaagatgata aatattggag aaagtattat 960
aaggattcag aaagattaga attagatatt tggtacaact tacttgatag gattagatat 1020
tattgggaat ataaagagat aaaaatagct ttaaataggc tttttgaaaa tttttcggaa 1080
ggggttgata ttagatacat ctatcaatat ttttatgatt cgtattttaa agtaagagaa 1140
ggaaaaataa gaaatgatcc aagggagcta ataaagaatg aaataaagaa ggtcttggag 1200
gactatcact atgctgtaaa cttataa 1227
<210> 4
<211> 672
<212> DNA
<213> Archaeoglobus fulgidus
<400> 4
atgttcaaac caaaggccat cgcagttgac atagatggca ccctcaccga cagaaagagg 60
gctctgaact gcagggctgt tgaagctctc cgcaaggtaa aaattcccgt gattttggcc 120
actggtaaca tatcttgttt tgcgagggct gcagcaaagc tgattggagt ctcagacgtg 180
gtaatctgcg agaatggggg cgtggtgagg ttcgagtacg atggggagga tattgtttta 240
ggagataaag agaaatgcgt tgaggctgtg agggtgcttg agaaacacta tgaggttgag 300
ctgctggact tcgaatacag gaagtcggaa gtgtgcatga ggaggagctt tgacatcaac 360
gaggcgagaa agctcattga ggggatgggg gttaagcttg tggattcagg ctttgcctac 420
cacattatgg atgctgatgt tagcaaggga aaagctttga agttcgttgc cgagaggctt 480
ggtatcagtt cagcggagtt tgcagttatc ggcgactcag agaacgacat agacatgttc 540
agagttgctg gattcggaat tgctgttgcc aatgccgatg agaggctgaa ggagtatgct 600
gatttagtta cgccatcacc agacggcgag ggggttgttg aggctttgca gtttctggga 660
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<211> 1041
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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caagacggtt gggaaggact gttaggcgat cgtcgcgtac agctgtatga cgatgaagat 180
attgaccgaa tcctccttcg aggcggcacc attttgggca ctggtcgcct ccatccggac 240
aagtttaagg ccggaattga tcagattaag gccaacttag aagacgccgg catcgatgcc 300
cttatcccaa tcggtggcga aggaaccctg aagggtgcca agtggctgtc tgataacggt 360
atccctgttg tcggtgtccc aaagaccatt gacaatgacg tgaatggcac tgacttcacc 420
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gctgaatctc acaaccgtgt gatgatcgtg gaggtcatgg gccgccacgt gggttggatt 540
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gatattgcag agatctgcaa ggcgatggaa cgtcgcttcc agatgggcga gaagtacggc 660
attatcgtcg ttgcggaagg tgcgttgcca cgcgaaggca ccatggagct tcgtgaaggc 720
cacattgacc agttcggtca caagaccttc acgggaattg gacagcagat cgctgatgag 780
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
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<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 7
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tag 1623
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<212> DNA
<213> Zymomonas mobilis
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<213> Enterococcus faecalis
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aagctgtgga cttactcctg gcagctgacg tgcaattggg ctaccttgcc ggcccgcagg 840
atacttccac tggtcagctg cgtcttaac 869
Claims (4)
1.一种生产塔格糖工程菌株的构建方法，其特征在于，出发菌株为谷氨酸棒杆菌，敲除果糖6-磷酸激酶基因，将来源于根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens的6-磷酸塔格糖4-差向异构酶T6PE基因SEQ ID NO:1和来源于大肠杆菌Escherichia coli的6-磷酸阿洛酮糖磷酸化酶T6PP基因SEQ ID NO:2，构建得到重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1；或将来源于Dictyoglomus thermophilum的嗜热网球菌6-磷酸塔格糖4-差向异构酶T6PE基因SEQ IDNO:3和来源于古生球菌属Archaeoglobus fulgidus 的6-磷酸塔格糖磷酸化酶T6PP基因SEQ ID NO:4，构建得到重组表达载体pEC-T6PE-T6PP2，将重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1和pEC-T6PE-T6PP2分别构建至谷氨酸棒杆菌中。
2.一种谷氨酸棒杆菌工程菌株Tag的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将权利要求1中得到的重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1电转化至野生型谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株Tag1, 将重组表达载体pEC-T6PE-T6PP2电转化至野生型谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株Tag2；
（2）制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞，将基因敲除载体pK18mobsacB-pfk电转化进入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032电转感受态细胞中，通过分子遗传操作降低谷氨酸棒杆菌中的果糖6-磷酸激酶基因表达水平，得到重组菌株Tag3；
（3）将携带6-磷酸塔格糖3-差向异构酶和6-磷酸塔格糖磷酸化酶基因的重组表达载体pEC-T6PE-T6PP1构建至重组菌株Tag3中，获得重组菌株Tag4；
（4）来源于谷氨酸棒杆菌的葡萄糖激酶glk基因SEQ ID NO:4和葡萄糖6-磷酸异构酶基因pgi SEQ ID NO:5，以谷氨酸棒杆菌基因组为模板PCR扩增葡萄糖激酶基因glk和葡萄糖6-磷酸异构酶的基因pgi，用限制性内切酶HindIII和PstI同时对基因pgi和表达载体pXMJ19进行酶切，并用T4连接酶进行连接，获得表达载体pXMJ19-pgi；进一步采用限制性内切酶PstI和XbaI同时对基因glk和表达载体pXMJ19-pgi进行酶切，获得重组表达载体pXMJ19-glk-pgi；将重组表达载体pXMJ19-glk-pgi和pEC-T6PE-T6PP1电转化至重组菌株Tag3中，获得重组菌株Tag5；
（5）将来源于谷氨酸棒杆菌的tuf启动子核苷酸序列，来源于运动假单胞菌Zymomonas mobilis果糖透过酶基因glf序列SEQ ID NO:6，来源于大肠杆菌Enterococcus faecalis的果糖激酶基因frk SEQ ID NO:7序列，采用PCR扩增获得tuf启动子，果糖透过酶基因glf和果糖激酶基因frk片段，采用融合PCR策略，以上述三个片段为模板，获得tuf-glf-frk融合片段，并通过酶切连接方式构建至重组表达质粒pEC-T6PE-T6PP1中，得到重组表达质粒pEC-T6PE-T6PP1-frk-glf；将重组表达载体pXMJ19-glk-pgi和pEC-T6PE-T6PP1-frk-glf电转化至果糖6-磷酸激酶基因敲除的重组菌株Tag3中，获得重组菌株Tag6。
3.权利要求2中所述重组菌株Tag1，Tag2，Tag4和Tag5在发酵葡萄糖合成塔格糖中的应用。
4.权利要求2中所述重组菌株Tag6在塔格糖合成中的应用，其特征在于，重组菌株Tag6的发酵底物为葡萄糖、果糖、蔗糖中的一种或者多种。
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