CN105899660A

CN105899660A - 通过酶的ph-稳定化来提高产率

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Publication number: CN105899660A
Application number: CN201580004217.2A
Authority: CN
Inventors: 松井知子
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2014-01-13
Filing date: 2015-01-08
Publication date: 2016-08-24
Also published as: WO2015104321A1; US20160319264A1; EP3094724A1

Abstract

本发明涉及提高来源于亲本酶的变体酶的产率或生产力的方法，所述方法包括选择产生变体酶的宿主细胞的步骤，该变体酶至少具有该亲本酶的酶比活性以及在5‑9的pH范围内的提高的pH‑稳定性。

Description

通过酶的PH-稳定化来提高产率

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。

发明领域

本发明涉及提高来源于亲本酶的酶变体的产率或生产力的方法，所述方法包括选择产生酶变体的宿主细胞的步骤，该酶变体至少具有亲本酶的酶比活性以及在5-9的pH范围内的提高的pH-稳定性。

发明背景

长期以来，酶被蛋白质工程化以便产生人工变体，以提供或调节某些感兴趣的特性，例如，pH依赖性活性、热稳定性、底物裂解模式、裂解比活性、底物特异性和/或底物结合(WO 0151620 A2)。

鉴定适合作为蛋白质工程化的靶标以提高感兴趣的酶的产率或生产力的筛选特性对于酶的工业化制造而言将是非常令人感兴趣的。

发明内容

在于此提供的实例中，出人意料地显示出酶的pH稳定性的增加(即，酶在一定pH水平下经过一些时间之后保留其活性的能力的增加)与产率和/或生产力的显著提高相关。

因此，在本发明的第一方面提供了提高酶的产率和/或生产力的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码感兴趣的亲本酶的一种或多种变体的突变多核苷酸的表达基因文库，其中与亲本酶相比，该一种或多种变体包括至少一个氨基酸改变；

b)在有益于产生该一种或多种变体酶的条件下培养宿主细胞；

c)选择产生变体酶的宿主细胞，该变体酶至少具有亲本酶的酶比活性以及在5-9的pH范围内的提高的pH-稳定性，其中与亲本的产率和/或生产力相比，该变体酶的产率和/或生产力得到提高；并且任选地

d)回收该变体酶。

附图简要说明

图1示出了实例1的枯草芽孢杆菌MDT99(包括染色体整合亲本普鲁兰酶编码基因的极低蛋白酶(δ-11)菌株)的普鲁兰酶表达水平，其与枯草芽孢杆菌HyGe380(具有染色体整合变体8编码基因的相同背景宿主菌株)的普鲁兰酶表达水平进行比较。结果显示变体8具有提高的表达。

发明详述

本发明的第一方面提供了提高酶的产率和/或生产力的方法，所述方法包括以下步骤：

d)回收该变体酶。

编码序列：术语“编码序列”或“编码……的多核苷酸”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。

突变的多核苷酸：编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:15的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预期用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白质表达与纯化(Protein Expression andPurification)2:95-107。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如，德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。

具有酶活性的多肽的来源

本发明的具有酶活性的多肽可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合给定的来源使用的术语“从…中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经***来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，从给定来源中获得的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是***多肽，如具有[酶]活性的芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一方面，该多肽是嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、脱支芽孢杆菌(Bacillusderamificans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一方面，该多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、***链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一方面，该多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

该多肽可以是真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，如假丝酵母属(Candida)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)多肽；或丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)多肽。

在另一方面，该多肽是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酶母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

在一个优选实施例中，该亲本酶是一种选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；优选地，该亲本酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、普鲁兰酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶；更优选地，该亲本酶是普鲁兰酶GH13_14；并且最优选地，该亲本酶是来自芽孢杆菌属的普鲁兰酶。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

优选地，该亲本酶是由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的普鲁兰酶和/或该亲本酶是与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:16的多肽序列具有至少60％序列一致性的普鲁兰酶。优选地，该亲本酶是由以下多核苷酸编码的普鲁兰酶，该多核苷酸与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:15的多核苷酸序列具有至少65％序列一致性；或更优选地至少70％序列一致性，75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列一致性。优选地，该亲本酶是与SEQID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:16的多肽序列具有至少60％序列一致性；或更优选地至少70％序列一致性，75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列一致性的普鲁兰酶。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

在一个优选实施例中，该宿主细胞是原核宿主细胞，优选***；更优选地是选自下组的属的***，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属；并且最优选地，该宿主细胞属于选自下组的物种，该组由以下各项组成：嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、脱支芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金杆菌。

表达载体

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体、构建体或基因文库。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处***或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。

该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(origin of replication)”或“质粒复制子(plasmid replicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝***到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞，以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

该多核苷酸可以按多种方式操纵，以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸***载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，它增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。

控制序列也可以是编码与多肽的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-端可以包含对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核***中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子***。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。

可以按迭代方式使用本发明的方法，其中在一个循环中步骤(d)的变体酶被用作后续循环中的起点或亲本酶。优选地，步骤(a)至(d)被重复至少一次，其中每个循环或重复的步骤(d)中的变体酶充当后续循环中的亲本酶。

提高的产率

在本发明的上下文中，术语“提高的产率”或“提高的生产力”意指生产的产物最终量/添加的底物量被提高或者通过较短培养期获得相同的产物量。

优选地，该变体酶的产率和/或生产力被提高至少10％；优选地至少20％；更优选地至少30％；仍更优选地至少40％并且最优选地至少50％，以上优选地在每个循环中。

还优选的是该变体酶在5-9的pH范围内的pH-稳定性被提高至少10％；优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％；并且最优选地至少120％，以上优选地在每个循环中。

另外，优选的是该变体酶的pH-稳定性如在此的实例3中进行确定并且被提高至少10％；优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％；并且最优选地至少120％，以上优选地在每个循环中。

此外，优选的是该变体酶在pH 7和/或8下具有比亲本酶提高的pH稳定性，如在此的实例4中所确定的；优选地提高至少10％；优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％；并且最优选地至少120％。

优选地，该变体酶在6-8的pH范围内；更优选地在6-7的pH范围内或在6.5-7.5的pH范围内具有提高的pH-稳定性。

在一个优选实施例中，如在此的实例3或4中所确定的，与其亲本酶相比，该变体酶在pH 5下、在pH 6下、在pH 7下、在pH 8下或在pH 9下具有提高的pH稳定性；最优选地，该变体酶在pH 7下具有提高的pH稳定性。

最后，优选的是该变体酶在5-9的pH范围内；优选地在6-9的pH范围内；更优选地6.5-9的pH范围；更优选地7-9的pH范围；并且最优选地7-8的pH范围内具有提高的pH-稳定性。

实例

实例1：普鲁兰酶测定

红色普鲁兰测定(麦格酶公司(Megazyme))

底物溶液

0.1g红色普鲁兰(麦格酶公司)

15ml 50mM乙酸钠，pH 5

通过将10μl的酶样品与80μl的底物溶液混合在一起来制备反应混合物并且在55℃下孵育20min。将50μl的乙醇添加至该反应混合物中并且在3500rpm下离心10min。小心地取出上清液并且读取在A510处的吸光度。

在麦格酶(Megazyme)普鲁兰酶测定中，根据制造商的说明书将商业普鲁兰酶D2(诺维信公司)用作标准，以确定普鲁兰酶活性单位。

实例2：嵌合体普鲁兰酶变体的构建

将来自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌NCIB11777(编码SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:1)和脱支芽孢杆菌(编码SEQ ID NO:4的SEQ ID NO:3)的在三联启动子***(如在WO 99/43835中所述)的控制下编码普鲁兰酶的基因组DNA使用组织试剂盒(Tissue kit)[马歇雷-纳高公司(MACHEREY-NAGEL)]根据制造商的说明书进行分离，所述三联启动子***由来自地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)的启动子和苏云金杆菌cryIIIA启动子(包括稳定序列)组成。将编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因与普鲁兰酶基因盒(描述于例如戴德瑞奇森(Diderichsen)，B.；波尔森(Poulsen)，G.B.；约根森(Joergensen)，S.T.；“枯草芽孢杆菌的一种有用的克隆载体”(Auseful cloning vector for Bacillus subtilis)质粒(Plasmid)30:312(1993))相关联，并且用作选择标记(戴德瑞奇森等人，1983，质粒30:312-315)。

这些基因组包含如分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3中的普鲁兰酶基因。将这些基因组DNA用作PCR扩增的模板，使用下面的正向引物和反向引物(变体1R-8R)在以下条件下进行所述PCR扩增。

PCR1条件

1.0μl模板

4.8μl H₂O

4μl Phusion HF缓冲液

1.6μl dNTP(2.5mM)

0.2μl正向引物和反向引物(20μM)

高保真DNA聚合酶(赛默科技公司(ThermoScientific))

98℃/30sec

30x(98℃/10sec，60℃/20sec，72℃/3min)

72℃/5min

正向引物cggaacgcctggctgacaacacg(SEQ ID NO:5)

变体1R atccaaatacgcattcgaaacagcagccgatgcgatcgatgaac(SEQ ID NO:6)

变体2R ctgtaataataacgaggcaaattaagcacattacgagatatcac(SEQ ID NO:7)

变体3R catccaggaggattcgtatcttccaggtccacaatcatgcctctc(SEQ ID NO:8)

变体4R gttaccatcgagtccgttccgaatattgtcattaaacaccgctac(SEQ ID NO:9)

变体5R tctaaataagcgttgcttacagcctttggagtcgctgcagcctg(SEQ ID NO:10)

变体6R ctgtgatgaatcaagcacattacgtggtatgagattgactgcttc(SEQ ID NO:11)

变体7R caggtccacaatcatgcctctcgttgcattgactgaaatagcacg(SEQ ID NO:12)

变体8R gtttcgtaaattgtcattaaacacgccaattcccaagcccttttg(SEQ ID NO:13)

反向引物caatccaagagaaccctgatacggatg(SEQ ID NO:14)

将PCR片段在0.7％琼脂糖凝胶中分离并且通过凯杰凝胶提取试剂盒(Qiagen Gelextraction kit)回收，并且然后使用第一PCR片段作为正向引物和反向引物，使用芽孢杆菌属NCIB11777的基因组(针对变体1-4)和脱支芽孢杆菌NN18718的基因组(针对变体5-8)作为模板进行第二轮PCR扩增。

PCR2条件

0.6μl模板

0.3μl反向引物(20μM)

3μl Phusion HF缓冲液

1.56μl dNTP(2.5mM)

0.36μl高保真DNA聚合酶(赛默科技公司)

5.18μl H2O

4.0μl大引物(来自PCR1的150ng片段)

98℃/5min

10x(98℃/30sec，68℃/15sec，72℃/6min)

25x(98℃/30sec，60℃/5sec，72℃/6min)

72℃/10min

将生成的具有普鲁兰酶基因与芽孢杆菌属基因组侧翼区的PCR片段和CAT基因整合到枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组中。

实例3：通过MTP培养筛选提高的pH稳定性

将芽孢杆菌属文库或变体培养于包含两种培养基的MTP中，所述培养基为培养基1和培养基2，在2或3天培养之后其最终pH分别是8和6-7左右。

培养基1；pH约8

培养基2；pH约6-7

Bacto^TM胰蛋白胨 13.3g/L

Bacto^TM酵母提取物 26.6g/L

甘油 4.4g/L

通过实例1中所描述的红色普鲁兰测定测量普鲁兰酶活性并且确定培养基1与培养基2之间的生产力比率；这些比率不受比活性变化的影响。选择比亲本普鲁兰酶具有更高培养基1/培养基2比率的变体作为pH稳定性提高的候选物。关于结果参见表1。选择变体8用于进一步研究，编码DNA序列提供于SEQ ID NO:15中并且编码的氨基酸序列提供于SEQ IDNO:16中。

表1.提高的pH稳定性，表示为培养基1与培养基2中的变体的普鲁兰酶生产力比率。

实例4：筛选pH稳定性

将在测定缓冲液(50mM琥珀酸、50mM HEPES、50mM CHES、50mM CABS、1mM CaCl2、75mM KCl、0.01％Triton X-100、全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏应用科学公司(RocheApplied Science))，用HCl或NaOH调节至pH值6.0、7.0和8.0)中在55℃下孵育30分钟之后的残余活性使用实例1中所描述的红色普鲁兰测定来测量。确认这些变体在pH 7和/或8下具有比亲本提高的pH稳定性，如在表2中所示。

表2.在55℃下，在pH 6、7和8下30分钟之后的pH稳定性。

	pH 6	pH 7	pH 8
				亲本	100％	16％	10％
变体6	42％	42％	10％
				变体8	93％	93％	45％

实例5：枯草芽孢杆菌表达宿主的构建

枯草芽孢杆菌MDT191是极低蛋白酶宿主菌株。其通过在以下基因中引入缺失而来源于枯草芽孢杆菌A164(ATCC 6051A)：sigF(spoIIAC)、nprE、aprE、amyE、srfAC、wprA、bpr、vpr、mpr、epr、以及ispA。

根据阿纳格诺斯托普洛斯(Anagnostopoulos)和斯皮宰曾(Spizizen)的程序(细菌学杂志(J.Bacteriol.)1961.81:741-746)，用约1μg变体8基因组DNA转化MDT191。

如下检查氯霉素抗性转化体的普鲁兰酶活性。将转化体铺板于Difco胰蛋白胨血琼脂基质(BD诊断公司(BD Diagnostics)，富兰克林湖，新泽西州，美国)+5μg/ml氯霉素上，并且将JPUL-008和MDT191铺板于LB板上。将这些板在37℃下孵育过夜。然后用1％琼脂+0.5％雷马素(Remazol)艳蓝染色的普鲁兰和100mM乙酸钠覆盖这些板。将这些板在50℃下孵育几小时。变体8阳性对照和转化体两者均在雷马素艳蓝染色的普鲁兰中产生指示普鲁兰酶活性的透明区，然而宿主MDT191阴性对照没有。选择一个转化体，命名为枯草芽孢杆菌HyGe380。

实例6：罐发酵中的表达评估

将表达亲本普鲁兰酶以及变体8(HyGe380)的枯草芽孢杆菌菌株在1L罐中进行发酵。将每种芽孢杆菌属菌株在包含葡萄糖、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二钠、硫酸镁和金属的培养基中在37℃、pH 6.5下于1L实验室发酵罐中伴随着充分的搅拌和通气培养3天。

在发酵期间周期性地取培养物等分试样。将这些样品离心，并且上清液被用来通过实例1中所描述的红色普鲁兰测定测量普鲁兰酶生产力。

其生产力列于下表中。还将上清液在SDS-PAGE(ATTO e-PAGEL12.5％)中跑胶，并且证实它们具有对应于所测量的活性单位的条带信号强度。

表3.亲本和嵌合变体8普鲁兰酶的普鲁兰酶生产力。

	30h	50h
			亲本	18U/ml	50U/ml
变体8	45U/ml	100U/ml

实例7：普鲁兰酶文库的构建

使用以下所示的与载体侧翼和N-末端普鲁兰酶序列具有至少15mer同源的正向引物，以及在一个或两个位点具有饱和诱变的回复突变引物，用变体8的基因组DNA作为模板进行PCR。使用与配对的回复突变引物的区域具有至少15mer同源的正向引物以及以下所示的与载体侧翼具有至少15mer同源的反向引物进行另一轮PCR。引物的设计遵循In-Fusion克隆程序(CLONETECH公司)。

正向引物ttgcttttagttcatcgatagcatcagcagattctacctcgacagaag(SEQ ID NO:17)

反向引物ttattgattaacgcgtttactttttaccgtggtctg(SEQ ID NO:18)

PCR条件

1.0μl模板

4.8μl H₂O

4μl Phusion HF缓冲液

1.6μl dNTP(2.5mM)

0.2μl正向引物和反向引物(20μM)

高保真DNA聚合酶(赛默科技公司)

98℃/30sec

30x(98℃/10sec，60℃/20sec，72℃/3min)

72℃/5min

将两个PCR片段进行凝胶纯化并且在包括如描述于WO 99/43835中的遗传元件的表达载体中通过In-Fusion克隆(CLONTECH公司)，遵循其用户手册进行克隆。通过这样做，将来自克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶(aprH)的信号肽如描述于WO 99/43835中与文库基因在框内与编码普鲁兰酶的DNA融合。

将生成的In-Fusion连接溶液转化进大肠杆菌DH5α中并且从大肠杆菌文库转化体中回收文库质粒。然后通过同源重组将质粒文库整合进枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组中。在三联启动子***的控制下表达该基因(如描述于WO 99/43835中)。将编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记物，如描述于狄代丽柯森(Diderichsen)等人，1993，质粒(Plasmid)30:312-315中。

将文库克隆在包含补充有6mg/L氯霉素的培养基2的96孔MTP中在30℃-37℃下培养1-3天。离心该板并且将培养物上清液用于普鲁兰酶测定。

实例8：筛选提高的pH稳定性

如实例4中所描述，测量培养物上清液的稳定性，并且选择在pH7下比亲本普鲁兰酶具有更高残余活性的克隆。

表4.亲本和合成变体75普鲁兰酶的普鲁兰酶生产力。

使用组织试剂盒[马歇雷-纳高公司]，根据其程序分离所选择变体的基因组DNA，并且将普鲁兰酶编码序列使用实例7中所描述的正向引物和反相引物进行PCR扩增并且然后进行测序以确定其序列。

实例9：MTP中的表达评估

将所筛选的枯草芽孢杆菌克隆，即实例8中所描述的变体75，在至少4个包含具有6mg/L氯霉素的培养基1或培养基2的孔中在220rpm、37℃下发酵3天。离心培养物，并且将上清液小心地取出用于普鲁兰酶测定，并且将平均表达水平与亲本普鲁兰酶进行比较，以确认在pH 7下具有较高稳定性的变体在使用的任一培养基中显示出较高表达水平。

表5.变体75与其亲本在不同培养基中的表达水平。

		培养基1	培养基2
				亲本	100％	100％
变体75	E699R	315％	365％

Claims

1.一种提高酶的产率和/或生产力的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码感兴趣的亲本酶的一种或多种变体的突变多核苷酸的表达基因文库，其中与该亲本酶相比，该一种或多种变体包括至少一个氨基酸改变；

b)在有益于产生该一种或多种变体酶的条件下培养该宿主细胞；

c)选择产生变体酶的宿主细胞，该变体酶至少具有该亲本酶的酶比活性以及在5-9的pH范围内的提高的pH-稳定性，其中与该亲本的产率和/或生产力相比，该变体酶的产率和/或生产力得到提高；并且任选地

d)回收该变体酶。

2.如权利要求1所述的方法，其中该亲本酶是一种选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶；优选地，该亲本酶是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、普鲁兰酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶；更优选地，该亲本酶是普鲁兰酶GH13_14；并且最优选地，该亲本酶是来自芽孢杆菌属的普鲁兰酶。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中该亲本酶是由与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQID NO:15的多核苷酸序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸编码的普鲁兰酶。

4.如任何以上权利要求所述的方法，其中该亲本酶是与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:16的多肽序列具有至少60％序列一致性的普鲁兰酶。

5.如任何以上权利要求所述的方法，其中该宿主细胞是原核宿主细胞，优选***；更优选地是选自下组的属的***，该组由以下各项组成：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属；并且最优选地，该宿主细胞属于选自下组的物种，该组由以下各项组成：嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、脱支芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金杆菌。

6.如任何以上权利要求所述的方法，其中步骤(a)至(d)被重复至少一次，并且其中每个循环的步骤(d)中的变体酶充当后续循环中的亲本酶。

7.如任何以上权利要求所述的方法，其中该变体酶的产率或生产力被提高至少10％；优选地至少20％；更优选地至少30％；仍更优选地至少40％并且最优选地至少50％。

8.如任何以上权利要求所述的方法，其中该变体酶在5-9的pH范围内的pH-稳定性被提高至少10％；优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％；并且最优选地至少120％。

9.如任何以上权利要求所述的方法，其中如在此的实例3中所确定的，该变体酶的pH-稳定性被提高至少10％；优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％；并且最优选地至少120％。

10.如任何以上权利要求所述的方法，其中该变体酶在pH 7和/或8下具有比该亲本酶提高的pH稳定性，如在此的实例4中所确定的；优选地提高至少10％；优选地至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％；并且最优选地至少120％。

11.如任何以上权利要求所述的方法，其中该变体酶在5-9的pH范围内；优选地在6-9的pH范围内；更优选地6.5-9的pH范围；更优选地7-9的pH范围；并且最优选地7-8的pH范围内具有提高的pH-稳定性。