CN108251468A - 生物法生产d-阿洛酮糖的工艺 - Google Patents

生物法生产d-阿洛酮糖的工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN108251468A
CN108251468A CN201810120400.4A CN201810120400A CN108251468A CN 108251468 A CN108251468 A CN 108251468A CN 201810120400 A CN201810120400 A CN 201810120400A CN 108251468 A CN108251468 A CN 108251468A
Authority
CN
China
Prior art keywords
psicose
epimerases
protein
polypeptide
technique
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810120400.4A
Other languages
English (en)
Inventor
魏淼
章志林
陈圣
严明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Langnai Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Tianjin Langnai Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Langnai Biotechnology Co Ltd filed Critical Tianjin Langnai Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201810120400.4A priority Critical patent/CN108251468A/zh
Publication of CN108251468A publication Critical patent/CN108251468A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2431—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01026—Beta-fructofuranosidase (3.2.1.26), i.e. invertase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03001—Ribulose-phosphate 3-epimerase (5.1.3.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种生物法生产D‑阿洛酮糖的工艺，包括由D‑果糖制备生产D‑阿洛酮糖的方法、由D‑葡萄糖生产D‑阿洛酮糖的工艺和由蔗糖生产D‑阿洛酮糖的工艺。该生物法生产D‑阿洛酮糖的工艺在重组细胞中表达3‑差向异构酶；通过使用所表达的3‑差向异构酶由D‑果糖制备D‑阿洛酮糖。本发明的生物法生产D‑阿洛酮糖的工艺选用的3‑差向异构酶具有活性高、耐高温、稳定性好的优点，根据本发明的生产D‑阿洛酮糖的工艺可由D‑果糖或廉价的原料如蔗糖或D‑葡萄糖大规模且连续地制备D‑阿洛酮糖，整个过程绿色无污染低能耗。

Description

生物法生产D-阿洛酮糖的工艺
技术领域
本发明属于糖生产技术领域，具体是一种生物法生产D-阿洛酮糖的工艺。
背景技术
随着人们对健康饮食的日益重视，研发健康安全的低热量功能性甜味剂成为食品行业研究的重点。D-阿洛酮糖作为自然界中天然存在但含量极少的天然低热量功能性甜味剂，已经成为人们研究的热点。
D-阿洛酮糖(D-allulose)又名D-核糖-2-己酮糖，是D-果糖的C-3位的差向异构体。D-阿洛酮糖是一种天然存在但有含量极少的低热量功能性甜味剂，其甜度为蔗糖的70％，但能量仅为蔗糖的0.3％，可以用作低卡路里减肥食品的甜味剂。同时，D-阿洛酮糖还具有抑制肝中脂质合成有关酶活性的功能，有助于减少腹部脂肪堆积，并能一定程度上控制体重，可以用于健康食品等各种各样的功能性食品。此外，D-阿洛酮糖还能够改善食品风味、外观等，延长食品的保存期限。因此，D-阿洛酮糖这种健康安全的低热量功能性甜味剂已获得越来越多的关注，成为最具市场竞争力的新型甜味剂之一。
由于D-阿洛酮糖是一种较为稀有的天然单糖，从自然界中分离提取产量低，成本高，难以满足人们作为低热量健康甜味剂的需要，也不适宜工业化大生产的要求，因此为了应用于食品工业，需要有高效的D-阿洛酮糖生产方法。传统的D-阿洛酮糖生产方法主要为化学法，生产过程需要消耗大量费用、产生许多副产物和污染物。而生物法制备D-阿洛酮糖具有反应专一性强，产物组分简单易纯化且属于天然产品等特点，已经成为研究的热点。
生物法制备D-阿洛酮糖最为有效的方法是寻找能使果糖转变为D-阿洛酮糖的酶。然而，目前的阿洛酮糖-3-差向异构酶存在高温下稳定性降低或者活性低反应速度慢等问题，不利于工业化生产D-阿洛酮糖的成本控制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种生物法生产D-阿洛酮糖的工艺，该工艺采用一种稳定性极高的固定化阿洛酮糖-3-差向异构酶，基于这种固定化酶，建立了阿洛酮糖连续生产工艺，可以有效地解决现有工艺中酶不稳定的难题，为大规模、低成本生产阿洛酮糖奠定基础。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，通过3-差向异构酶生产D-阿洛酮糖，包括以下步骤：
在重组细胞中表达3-差向异构酶；通过使用所表达的3-差向异构酶由D-果糖制备D-阿洛酮糖；
具有所述3-差向异构酶活性的分离的蛋白质或多肽，其选自下组：
(a)蛋白质或多肽，其与SEQ ID No：2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性；
(b)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID No：1的多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID No：1的多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的蛋白质或多肽编码序列具有至少70％序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体；和
(e)任何(a)、(b)或(c)的蛋白质或多肽，其包含SEQ ID No：2或由SEQ ID No：2组成，和
(f)(a)，(b)，(c)，(d)，或(e)的蛋白质或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性。
用于制备制备D-阿洛酮糖的所述3-差向异构酶包含于所述重组细胞的培养物中或是从所述培养物分离。
所述由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺还包括将所述3-差向异构酶固定于载体上。
适于本发明的生物法生产D-阿洛酮糖的工艺的载体可包括大孔树脂、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸盐、双醛淀粉等，优选为大孔树脂，但不限于此。
所述由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺还包括用固定有3-差向异构酶的载体填充管柱，并向填充载体的管柱供应D-果糖溶液。
一种由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，包括以下步骤：将3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上；
具有所述3-差向异构酶活性的分离的蛋白质或多肽，其选自下组：
(a)蛋白质或多肽，其与SEQ ID No：2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性；
(b)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID No：1的多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID No：1的多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的蛋白质或多肽编码序列具有至少70％序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体；和
(e)任何(a)、(b)或(c)的蛋白质或多肽，其包含SEQ ID No：2或由SEQ ID No：2组成，和
(f)(a)，(b)，(c)，(d)，或(e)的蛋白质或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性。
所述D-葡萄糖溶液是精制过的葡萄糖溶液，或者是由淀粉酶解制得的未精制的D-葡萄糖母液。
所述3-差向异构酶是包含于所述重组细胞的培养物中或是从所述培养物分离。
所述重组细胞包含来源于编码3-差向异构酶的基因。
所述载体包括大孔树脂、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸钠、双醛淀粉。
上述由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，还包括以下步骤：用其上固定有3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶的所述载体填充管柱；并且向填充载体的管柱供应D-葡萄糖溶液。
上述由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，还包括以下步骤：将其上固定有所述3-差向异构酶以及所述D-葡萄糖异构酶的所述载体分别填充于两根管柱中，并且使所述两根管柱彼此连通连接。
一种由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，包括以下步骤：将3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上；
具有所述3-差向异构酶活性的分离的蛋白质或多肽，其选自下组：
(a)蛋白质或多肽，其与SEQ ID No：2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性；
(b)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID No：1的多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID No：1的多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的蛋白质或多肽编码序列具有至少70％序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体；和
(e)任何(a)、(b)或(c)的蛋白质或多肽，其包含SEQ ID No：2或由SEQ ID No：2组成，和
(f)(a)，(b)，(c)，(d)，或(e)的蛋白质或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性。
所述3-差向异构酶包含于所述重组细胞的培养物中或是从所述培养物分离。
所述重组细胞包含来源于编码3-差向异构酶的基因。
所述载体包括大孔树脂、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸钠、双醛淀粉。
上述由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，还包括以下步骤：用其上固定有所述3-差向异构酶、所述蔗糖水解酶以及所述D-葡萄糖异构酶的所述载体来填充管柱，并且向所填充的管柱供应蔗糖溶液。
上述由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，还包括以下步骤：将其上固定有所述3-差向异构酶、所述蔗糖水解酶以及所述D-葡萄糖异构酶的所述载体各自分别填充于各自管柱中，并且使所述三根管柱彼此连通连接。
本发明的一种生物法生产D-阿洛酮糖的工艺，包括由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺、由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺和由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺。本发明的生物法生产D-阿洛酮糖的工艺选用的3-差向异构酶具有活性高、耐高温、稳定性好的优点，根据本发明的生产D-阿洛酮糖的工艺可由D-果糖或廉价的原料如蔗糖或D-葡萄糖大规模且连续地制备D-阿洛酮糖，整个过程绿色无污染低能耗。
附图说明
图1是本发明3-差向异构酶的表达中D-果糖进行异构反应的HPLC分析结果示意图；
图2是温度对D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率的影响示意图；
图3是在60℃的反应温度下固定3-差向异构酶的相对活性与时间关系图；
图4是温度对D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化率的影响示意图；
图5是使用固定3-差向异构酶、蔗糖水解酶及D-葡萄糖异构酶由蔗糖制备D-阿洛酮糖时，温度对蔗糖转化为D-阿洛酮糖的转化率的影响示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明提出的一种生物法生产D-阿洛酮糖的工艺进行详细说明。
本发明提供一种通过使用3-差向异构酶来生产D-阿洛酮糖的工艺，包括由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺、由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺和由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺。申请人曾经提交一项申请号为201610047300.4的专利申请，在该申请中详细描述了一种3-差向异构酶，本发明生产D-阿洛酮糖的方法采用的3-差向异构酶均是该专利申请描述的3-差向异构酶，并且该3-差向异构酶在重组细胞中表达。
在申请号为201610047300.4的专利申请中，3-差向异构酶被描述为：
具有所述3-差向异构酶活性的分离的蛋白质或多肽，其选自下组：
(a)蛋白质或多肽，其与SEQ ID No：2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性；
(b)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID No：1的多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID No：1的多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的蛋白质或多肽编码序列具有至少70％序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或***的变体；和
(e)任何(a)、(b)或(c)的蛋白质或多肽，其包含SEQ ID No：2或由SEQ ID No：2组成，和
(f)(a)，(b)，(c)，(d)，或(e)的蛋白质或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性。
本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺包括以下步骤：在重组细胞中表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶；以及通过使用所表达的3-差向异构酶由D-果糖制备D-阿洛酮糖。
本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺还可以包含以下步骤：从能够表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶的重组细胞的培养物中分离3-差向异构酶；以及通过使用所分离的3-差向异构酶由D-果糖制备D-阿洛酮糖。
本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺还可以包括将3-差向异构酶固定于载体上的步骤。适合于本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺的载体可包含大孔树脂、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸盐、双醛淀粉等，优选为大孔树脂，但不限于此。
根据本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺可以还包括用固定有3-差向异构酶的载体填充管柱，并向填充载体的管柱供应D-果糖溶液的步骤。
本发明还提供一种由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其包括将3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上的步骤。适合于本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺的载体可包含大孔树脂，优选为大孔树脂，但不限于此。其中D-葡萄糖异构酶可以是购买的商业化D-葡萄糖异构酶(如购自诺维信公司)，也可以是自主构建生产的来源于嗜热栖热菌的D-葡萄糖异构酶。
在由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺中，3-差向异构酶可以是包含于能够表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶的重组细胞的培养物中，也可以是从所述培养物中分离获得。
本发明提供的一种由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其包含以下步骤：将3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上；用其上固定有3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶的所述载体填充管柱；以及向填充载体的管柱供应D-葡萄糖溶液。其上固定有3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶的载体可填充于同一管柱中，或分别填充于两根管柱中，优选将载体分别填充于两根管柱中且两根管柱互相连接。
本发明还提供一种由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其包括将3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上的步骤。适合于本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺的载体可包含大孔树脂，优选为大孔树脂，但不限于此。其中蔗糖水解酶是购买的商业化蔗糖水解酶(如购自诺维信公司)，D-葡萄糖异构酶可以是购买的商业化D-葡萄糖异构酶(如购自诺维信公司)，也可以是自主构建生产的来源于嗜热栖热菌的D-葡萄糖异构酶。
在如上文所述的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺中，3-差向异构酶可以是包含于能够表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶的重组细胞的培养物中，也可以是从所述培养物中分离获得。
本发明提供的一种由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其包含以下步骤：将3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上；用其上固定有3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶的所述载体填充管柱；以及向填充载体的管柱供应蔗糖溶液。其上固定有3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶的载体可填充于同一管柱中，或分别填充于各自的管柱中，优选将载体分别填充于三根管柱中且两根管柱分别于填充固定3-差向异构酶的管柱互相连接。
本申请中由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺所使用的3-差向异构酶来源为申请号201610047300.4的专利申请中的3-差向异构酶。
如本申请中由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺所使用，术语：“3-差向异构酶”的意思是具有使D-果糖C-3位异构转化为D-阿洛酮糖的转化活性的差向异构酶。
表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的3-差向异构酶的重组细胞的培养物可通过在培养基中且在培养条件下培养经过转化的细菌来获得，所述培养条件容易由本发明所属领域的技术人员根据菌株性质加以选择。培养方法可包含所属领域的技术人员已知的任何培养方法，如分批培养、连续培养以及分批补料培养，但不限于此。
本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺的一个实施例中可以包括从表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶的重组细胞的培养物中分离3-差向异构酶的步骤。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，通过离心、过滤等从表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶的重组细胞的培养物分离得到的细胞；或通过使分离的细胞破碎并离心所获得的上清液；或通过加热、分级分离、层析等方法从上述上清液分离并纯化的3-差向异构酶可用于使D-果糖转化为D-阿洛酮糖的酶。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，3-差向异构酶可以在培养物中的细胞的形式或从所述细胞分离的3-差向异构酶的形式。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，制备D-阿洛酮糖的步骤还可以包括将3-差向异构酶或表达3-差向异构酶的细胞固定于载体上的步骤。
因为在酶或细胞被固定于载体上的情况下，可长时间维持活性，有利于提高工业生产的效率，降低生产成本，所以所述固定化已用于使用酶或微生物的工业生产方法中。可用于固定化的载体可包含大孔树脂、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸盐、双醛淀粉等，但不限于此。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，固定化可通过使用大孔树脂作为载体来进行。大孔树脂多孔，表面积大，有利于固定更多的酶或细胞，同时大孔树脂的强度高，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，有利于D-阿洛酮糖的连续生产。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，大孔树脂可通过戊二醛来修饰，以便酶或细胞能稳固地固定在载体上。将大孔树脂用水溶胀，然后加入戊二醛至终浓度1％对其进行修饰，作为酶或细胞的固定化载体。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，可将制得的含有来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶的上清液在70℃中加热30min，以获得纯化的3-差向异构酶。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，通过使用修饰过的大孔树脂作为用于固定化的载体，所述固定化可将固定化载体加入含有3-差向异构酶的上清液中至终浓度为0.2％，以在大孔树脂表面或内部形成酶-大孔树脂复合物来进行。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，将3-差向异构酶固定于载体上的步骤可还包括用固定有酶的载体填充管柱，并向所述填充管柱供应D-果糖溶液的步骤。
用其上固定有酶或细胞的载体填充的管柱、以及用所述载体填充管柱的方法可较容易地由本发明所属领域的技术人员根据所用的酶或细胞或用于固定化的载体进行选择。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，有可能通过用固定有酶的载体填充管柱来制备填充床管柱。转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的反应可通过向填充床管柱供应D-果糖溶液来进行。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，当向填充固定有包含3-差向异构酶的细胞的填充床管柱供应恒定浓度的D-果糖溶液时，差向异构化反应通过固定的细胞进行，从而将D-果糖转化生成D-阿洛酮糖。通过使用模拟移动床进行分离纯化，然后可以制得高纯度的D-阿洛酮糖。
在本申请中术语“固定化”的意思是将具有生物活性的物质，在这种情况下是将3-差向异构酶或蔗糖水解酶或D-葡萄糖异构酶或包含其的细胞固定于载体上。
在本申请中，术语“操作稳定性”的意思是可操作用于连续制备目标产物(在本申请中指D-阿洛酮糖)的生物反应器，不同时期与其初始活性相比维持合适生产力的水平。
在本发明的由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，在60℃条件下下向填充有固定有包含3-差向异构酶的细胞的载体上的管柱以0.15ml/min的流速供应浓度为700g/L的D-果糖溶液，其能确保30天或30天以上的操作稳定性。
本发明还提供一种由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其包括将3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上的步骤。
如上文所述，因为用作制备D-阿洛酮糖的底物D-果糖较贵，使用廉价底物如D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖更有利于降低生产成本促进D-阿洛酮糖的大规模工业生产。D-葡萄糖异构酶能够将D-葡萄糖转化为D-果糖，因此可通过使用这两种酶由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，3-差向异构酶可为表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶的重组细胞的培养物，或从所述培养物中分离的细胞或3-差向异构酶。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，D-葡萄糖异构酶可为表达来源于嗜热栖热菌的D-葡萄糖异构酶的重组细胞的培养物，或从所述培养物中分离的细胞或D-葡萄糖异构酶。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，D-葡萄糖异构酶可购得。如可使用购买自诺维信公司的商业化D-葡萄糖异构酶或固定D-葡萄糖异构酶。
D-葡萄糖异构酶是一种使D-葡萄糖转化为D-果糖的代表性酶，并且当前用于制备果葡糖浆。在当前用于工业生产的酶中，D-葡萄糖异构酶是活性以及机制已得到清楚解析的酶之一。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，重组细胞可为经过包含编码3-差向异构酶的基因以及D-葡萄糖异构酶的基因的重组载体转化的菌株，或经过包含上述基因的2个重组载体共转化的菌株。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，大孔树脂可通过戊二醛来修饰，以便酶或细胞能稳固地固定在载体上。将大孔树脂用水溶胀，然后加入戊二醛至终浓度1％对其进行修饰，作为酶或细胞的固定化载体。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，通过使用修饰过的大孔树脂作为用于固定化的载体，所述固定化可将固定化载体加入含有酶或细胞的上清液中至终浓度为0.2％，以在大孔树脂表面或内部形成酶/细胞-大孔树脂复合物来进行。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，编码3-差向异构酶的基因以及编码D-葡萄糖异构酶的基因可在相同的重组细胞中表达或分别在不同的两种重组细胞中表达，且固定化步骤可通过将所培养的重组细胞或从所述细胞中分离的两种酶的混合物固定于载体上来进行。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，可分别将表达3-差向异构酶的重组细胞培养物或从培养物分离的细胞或3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，本发明的方法可还包括用固定有重组细胞或酶的载体填充管柱的步骤。
根据本发明由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺可还包括用固定的3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶填充管柱，并向所述填充的管柱供应D-葡萄糖溶液的步骤。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，填充床管柱可通过用固定酶填充管柱来制备。转化D-葡萄糖生成D-阿洛酮糖的反应可通过向填充床管柱供应D-葡萄糖溶液来进行。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，固定的3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶可分别填充于两根管柱中。
用其上固定有酶或细胞的载体填充的管柱、以及用所述载体填充管柱的方法可较容易地由本发明所属领域的技术人员根据所用的酶或细胞或用于固定化的载体进行选择。
在本发明的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，有可能分别用固定有3-差向异构酶的载体以及固定有D-葡萄糖异构酶的载体填充两根管柱，彼此连通这两根管柱，以将从D-葡萄糖异构生成的D-果糖从填充有D-葡萄糖异构酶的管柱转移到填充有3-差向异构酶的管柱，以进行将D-果糖异构为D-阿洛酮糖的反应，最终完成由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的过程。当向两根连通的管柱组成的固定化反应器供应作为底物的D-葡萄糖溶液时，D-葡萄糖在填充有D-葡萄糖异构酶的管柱中转化为D-果糖，并且转移至填充有3-差向异构酶的管柱的D-果糖转化为D-阿洛酮糖。因此，可实现由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖的过程。
本发明还提供一种由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其包括将3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上的步骤。
如上文所述，因为用作制备D-阿洛酮糖的底物D-果糖较贵，使用廉价底物如蔗糖制备D-阿洛酮糖更有利于降低生产成本促进D-阿洛酮糖的大规模工业生产。蔗糖水解酶能够将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，D-葡萄糖异构酶能够将D-葡萄糖转化为D-果糖，因此可通过使用这三种酶由蔗糖制备D-阿洛酮糖。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，3-差向异构酶可为表达来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的新型3-差向异构酶的重组细胞的培养物，或从所述培养物中分离的细胞或3-差向异构酶。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，D-葡萄糖异构酶可为表达来源于嗜热栖热菌的D-葡萄糖异构酶的重组细胞的培养物，或从所述培养物中分离的细胞或D-葡萄糖异构酶。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，D-葡萄糖异构酶可购得。如可使用购买自诺维信公司的商业化D-葡萄糖异构酶或固定D-葡萄糖异构酶。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，蔗糖水解酶可购得。如可使用购买自诺维信公司的商业化蔗糖水解酶或固定蔗糖水解酶。
蔗糖水解酶是一种使蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖的代表性酶。在当前已用于工业生产的酶中，蔗糖水解酶是活性以及机制已得到清楚解析的酶之一。
D-葡萄糖异构酶是一种使D-葡萄糖转化为D-果糖的代表性酶，并且当前用于制备果葡糖浆。在当前用于工业生产的酶中，D-葡萄糖异构酶是活性以及机制已得到清楚解析的酶之一。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，重组细胞可为经过包含编码3-差向异构酶的基因、编码蔗糖水解酶的基因以及编码D-葡萄糖异构酶的基因的重组载体转化的菌株，或经过包含上述基因的3个重组载体共转化的菌株。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，大孔树脂可通过戊二醛来修饰，以便酶或细胞能稳固地固定在载体上。将大孔树脂用水溶胀，然后加入戊二醛至终浓度1％对其进行修饰，作为酶或细胞的固定化载体。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，通过使用修饰过的大孔树脂作为用于固定化的载体，所述固定化可将固定化载体加入含有酶或细胞的上清液中至终浓度为0.2％，以在大孔树脂表面或内部形成酶/细胞-大孔树脂复合物来进行。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，编码3-差向异构酶的基因、编码蔗糖水解酶的基因以及编码D-葡萄糖异构酶的基因可在相同的重组细胞中表达或分别在不同的两种或三种重组细胞中表达，且固定化步骤可通过将所培养的重组细胞或从所述细胞中分离的三种酶的混合物固定于载体上来进行。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，可分别将表达3-差向异构酶的重组细胞培养物或从培养物分离的细胞或3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶和蔗糖水解酶固定于载体上。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，本发明的方法可还包括用固定有重组细胞或酶的载体填充管柱的步骤。
根据本发明由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺可还包括用固定的3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶填充管柱，并向所述填充的管柱供应蔗糖溶液的步骤。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，填充床管柱可通过用固定酶填充管柱来制备。转化蔗糖生成D-阿洛酮糖的反应可通过向填充床管柱供应蔗糖溶液来进行。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，固定的3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶可分别填充于三根管柱中。
用其上固定有酶或细胞的载体填充的管柱、以及用所述载体填充管柱的方法可较容易地由本发明所属领域的技术人员根据所用的酶或细胞或用于固定化的载体进行选择。
在本发明的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺一个实施例中，有可能分别用固定有蔗糖水解酶的载体、固定有3-差向异构酶的载体以及固定有D-葡萄糖异构酶的载体填充三根管柱，且两根管柱分别于填充固定3-差向异构酶的管柱互相连接，以将由蔗糖水解生成的D-葡萄糖和D-果糖混合溶液从填充有蔗糖水解酶的管柱转移到填充有3-差向异构酶的管柱，以进行将D-果糖异构为D-阿洛酮糖的反应，然后将经模拟移动床分离过后的D-葡萄糖含量较高的溶液转移至填充有D-葡萄糖异构酶的管柱，然后将反应过后D-果糖含量提高的溶液再转移至填充有3-差向异构酶的管柱，再次进行将D-果糖异构为D-阿洛酮糖的反应，最终完成由蔗糖生产D-阿洛酮糖的最优过程。
下文通过特定实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶活性的测量
3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶的活性是通过分别使用D-果糖、蔗糖以及D-葡萄糖作为底物进行测量。将酶或含有所述酶的样品添加到含有100g/L底物的浓度为50mM的磷酸钠缓冲溶液(pH8.0)中，随后在60℃下反应1小时，然后在100℃条件下加热30分钟来终止反应。通过配备有示差折光检测器的高效液相色谱测量D-果糖、D-葡萄糖以及D-阿洛酮糖的浓度。其中色谱柱为BENSON BP-800Ca，柱温85℃，流动相为超纯水，流速0.6mL/min。基于HPLC测得的D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖以及D-阿洛酮糖的量来计算酶活性。对于酶活性的分析，将3-差向异构酶的一个单位定义为在pH8.0以及60℃条件下每分钟产生1umol D-阿洛酮糖所用酶的量，将蔗糖水解酶的一个单位定义为在pH8.0以及60℃条件下每分钟水解1umol蔗糖所用酶的量，将D-葡萄糖异构酶的一个单位定义为在pH8.0以及60℃条件下每分钟产生1umol D-果糖所用酶的量。
实施例1：3-差向异构酶的表达
将包含来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的编码3-差向异构酶的基因的重组细胞接种在装有50mL液体LB培养基(NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉g/L)的250mL三角烧瓶中，并在37℃的摇床中培养活化，直到培养液在波长600nm处的吸光度达到2.0。将该培养液加入到装有5L发酵培养基(15g/L蛋白胨，25g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，2g/L葡萄糖，3g/L乳糖)的7L的发酵罐中，进行发酵培养以大规模生产3-差向异构酶。在发酵过程中，维持搅拌速率为500rpm，通风率为1.0vvm，培养温度为37℃，培养时间为15小时。为了测量所表达的3-差向异构酶的活性，在6000rpm条件下对培养物离心10min以收集细胞，将收集到的细胞重悬于50mM的磷酸钠缓冲溶液(pH8.0)中，然后用高压均质机对所得到的悬浮液进行高压处理，使细胞破裂。将上述细胞裂解液进行离心以获得含有3-差向异构酶的上清液，并使用此上清液进行D-果糖的异构化反应，通过测定反应液中D-阿洛酮糖的含量计算3-差向异构酶的活性。图1为D-果糖进行异构反应的HPLC分析结果。
实施例2：3-差向异构酶的固定化以及D-阿洛酮糖的制备
(1)3-差向异构酶的固定化
为了进行D-阿洛酮糖的大规模生产，可以将来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的3-差向异构酶固定于载体上。将包含来源于申请号为201610047300.4的专利申请中的编码3-差向异构酶的基因的重组细胞接种在装有50mL液体LB培养基(NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉g/L)的250mL三角烧瓶中，并在37℃的摇床中培养活化，直到培养液在波长600nm处的吸光度达到2.0。将该培养液加入到装有5L发酵培养基(15g/L蛋白胨，25g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，2g/L葡萄糖，3g/L乳糖)的7L的发酵罐中，进行发酵培养15小时。培养结束后，将所得培养物离心以收集细胞，然后用50mM pH为8.0的磷酸钠缓冲溶液将细胞清洗一遍，再用上述缓冲溶液将收集的细胞重悬，然后用高压均质机对所得到的悬浮液进行高压处理，使细胞破裂。将上述细胞裂解液进行离心以获得含有3-差向异构酶的上清液，将获得的上清液添加至用戊二醛修饰过的大孔树脂溶液中，然后用搅拌器将含有3-差向异构酶的上清液与修饰过的大孔树脂混合均匀，以形成3-差向异构酶-大孔树脂复合物，其中3-差向异构酶被固定在大孔树脂的表面及内部。
(2)使用固定的3-差向异构酶制备D-阿洛酮糖
用上述(1)中的固定有3-差向异构酶的大孔树脂来填充管柱(16mm*200mm)，然后向填充好的管柱中供应浓度为700g/L的D-果糖溶液，随后测量D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化率。
(2-1)反应温度对转化率的影响
为了确定固定化反应器的最佳反应温度，在40℃、50℃、60℃的反应温度条件下进行D-果糖转化为D-阿洛酮糖的转化反应。根据图2所示结果，发现在60℃反应条件下转化率最高。
(2-2)D-果糖溶液的供应速度对生产效率及转化率的影响
基于(2-1)的结果，将D-果糖溶液的浓度设定为700g/L，将反应温度设定为60℃。通过调整D-果糖溶液的流速来测量固定化反应器的生产效率及转化率。结果如下表1所示。
表1
(2-3)固定化反应器的操纵稳定性
通过在60℃反应温度下使用填充有固定3-差向异构酶的管柱进行D-果糖转化D-阿洛酮糖的反应观测其相对活性的下降，以测量管柱中填充的固定3-差向异构酶的操作稳定性。此时，底物D-果糖溶液的浓度为700g/L，流速为0.15mL/min，发现在上述反应条件下固定3-差向异构酶可维持30天或长于30天的操作稳定性。图3显示在60℃的反应温度下固定3-差向异构酶的操作稳定性。
实施例3：通过使用固定3-差向异构酶及D-葡萄糖异构酶由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖
分别用实施例2中的固定于大孔树脂上的3-差向异构酶以及固定的D-葡萄糖异构酶(如购自诺维信公司)来填充两根管柱，并使其互相连通，随后测量D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化率。
(1)温度对由D-葡萄糖制备D-阿洛酮糖转化率的影响
为了确定固定化反应器的最佳反应温度，在40℃、50℃、60℃的反应温度条件下进行D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的转化反应。根据图4所示结果，发现在60℃反应条件下转化率最高。
(2)D-葡萄糖溶液的供应速度对生产效率及转化率的影响
基于实施例2的结果，将D-葡萄糖溶液的浓度设定为700g/L，将反应温度设定为60℃。通过调整D-葡萄糖溶液的流速来测量固定化反应器的生产效率及转化率。结果如下表2所示。
表2
实施例4：通过使用固定3-差向异构酶、蔗糖水解酶及D-葡萄糖异构酶由蔗糖制备D-阿洛酮糖
分别用固定的蔗糖水解酶(例如购自诺维信公司)、固定的D-葡萄糖异构酶(例如购自诺维信公司)以及实施例2中的固定于大孔树脂上的3-差向异构酶来填充三根管柱，并使两根管柱分别于填充固定3-差向异构酶的管柱互相连接，随后测量蔗糖转化为D-阿洛酮糖的转化率。
为了确定固定化反应器的最佳反应温度，在40℃、50℃、60℃的反应温度条件下进行蔗糖转化为D-阿洛酮糖的转化反应。根据图5所示结果，发现在60℃反应条件下转化率最高。
序列表
<110> 南京朗奈生物技术有限公司
<120> 生物法生产D-阿洛酮糖的工艺
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagcaga aaatcggtat tcacgcgttc gtgtgggttg gtggctggag cgaggaagag 60
tgccgtcaag cgctggagag cagccgtgcg agcggttacg acctgatcga gattccgctg 120
ctggaaccgg cggcgatcga tgtggcgctg acccgtagcc tgctggagaa gaccggtctg 180
gaagcgacct gcaccctggc gctgaccccg gaaaccgaca tcagcagcac cgatgaggcg 240
attgttgcgc gtggtgaacg tctgctgcac gacgcgctgg cggtggcgcg tgatctgggt 300
gcgagctacc tgggtggcgt tattttcggc gcgctgaccc gttatcgtga gccgctggcg 360
ccggcgggtc gtctgaacag catgcgtgtg ctggcgcgtc tggcggaaca ggcggcggtt 420
aacggtatgc aactgggcct ggaagtggtt aaccgttacg aaagcaactt tctgaacacc 480
gcggagcagg cgctgaacct gatcgaagag attggcgcgc cgaacctggt ggttcacctg 540
gacacctatc acatgaacat cgaagaggaa aacttcgtga agccggtggt tgcgtgcggt 600
aaacgtctgg gctacgtgca cgttggtgaa agccaccgtg gctatctggg taccggcacc 660
gtggattttc cgggtttctt tcgtgcgctg cgtcaggcgg gttatcaagg cccggttacc 720
ttcgagagct ttagccgtgc gcaagaaatc gcgaacctga gcggtagcct ggcgatttgg 780
cgtcacacct ggaccgaccg tttcgatctg gcgcgtcagg cgcgtgcgtt tattgcggcg 840
ggtctggagg cgaccgacac ccaagaagat taa 873
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Gln Lys Ile Gly Ile His Ala Phe Val Trp Val Gly Gly Trp
1 5 10 15
Ser Glu Glu Glu Cys Arg Gln Ala Leu Glu Ser Ser Arg Ala Ser Gly
20 25 30
Tyr Asp Leu Ile Glu Ile Pro Leu Leu Glu Pro Ala Ala Ile Asp Val
35 40 45
Ala Leu Thr Arg Ser Leu Leu Glu Lys Thr Gly Leu Glu Ala Thr Cys
50 55 60
Thr Leu Ala Leu Thr Pro Glu Thr Asp Ile Ser Ser Thr Asp Glu Ala
65 70 75 80
Ile Val Ala Arg Gly Glu Arg Leu Leu His Asp Ala Leu Ala Val Ala
85 90 95
Arg Asp Leu Gly Ala Ser Tyr Leu Gly Gly Val Ile Phe Gly Ala Leu
100 105 110
Thr Arg Tyr Arg Glu Pro Leu Ala Pro Ala Gly Arg Leu Asn Ser Met
115 120 125
Arg Val Leu Ala Arg Leu Ala Glu Gln Ala Ala Val Asn Gly Met Gln
130 135 140
Leu Gly Leu Glu Val Val Asn Arg Tyr Glu Ser Asn Phe Leu Asn Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gln Ala Leu Asn Leu Ile Glu Glu Ile Gly Ala Pro Asn Leu
165 170 175
Val Val His Leu Asp Thr Tyr His Met Asn Ile Glu Glu Glu Asn Phe
180 185 190
Val Lys Pro Val Val Ala Cys Gly Lys Arg Leu Gly Tyr Val His Val
195 200 205
Gly Glu Ser His Arg Gly Tyr Leu Gly Thr Gly Thr Val Asp Phe Pro
210 215 220
Gly Phe Phe Arg Ala Leu Arg Gln Ala Gly Tyr Gln Gly Pro Val Thr
225 230 235 240
Phe Glu Ser Phe Ser Arg Ala Gln Glu Ile Ala Asn Leu Ser Gly Ser
245 250 255
Leu Ala Ile Trp Arg His Thr Trp Thr Asp Arg Phe Asp Leu Ala Arg
260 265 270
Gln Ala Arg Ala Phe Ile Ala Ala Gly Leu Glu Ala Thr Asp Thr Gln
275 280 285
Glu Asp
290

Claims (18)

1.一种由D-果糖制备生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，通过3-差向异构酶生产D-阿洛酮糖，包括以下步骤：
在重组细胞中表达3-差向异构酶；通过使用所表达的3-差向异构酶由D-果糖制备D-阿洛酮糖；
具有所述3-差向异构酶活性的分离的蛋白质或多肽，其选自下组：
(a)蛋白质或多肽，其与SEQ ID No：2的氨基酸序列具有至少70%序列同一性；
(b)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID No：1的多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID No：1的多肽编码序列的基因组 DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；
(c) 蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的蛋白质或多肽编码序列具有至少70%序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽包含一个或多个（几个）氨基酸的取代、缺失和/或***的变体；和
(e) 任何(a)、(b)或(c)的蛋白质或多肽，其包含SEQ ID No：2或由SEQ ID No：2组成，和
(f) (a)，(b)，(c)，(d)，或(e)的蛋白质或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性。
2.根据权利要求1所述的由D-果糖制备生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述3-差向异构酶包含于所述重组细胞的培养物中或是从所述培养物分离。
3.根据权利要求1或2所述的由D-果糖制备生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺的步骤还包括将所述3-差向异构酶固定于载体上。
4.根据权利要求3所述的由D-果糖制备生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述载体包括大孔树脂、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸盐、双醛淀粉。
5.根据权利要求3所述的由D-果糖制备生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述由D-果糖生产D-阿洛酮糖的工艺的步骤还包括用固定有3-差向异构酶的载体填充管柱，并向填充载体的管柱供应D-果糖溶液。
6.一种由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，包括以下步骤：将3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上；
具有所述3-差向异构酶活性的分离的蛋白质或多肽，其选自下组：
(a)蛋白质或多肽，其与SEQ ID No：2的氨基酸序列具有至少70%序列同一性；
(b)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID No：1的多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID No：1的多肽编码序列的基因组 DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；
(c) 蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的蛋白质或多肽编码序列具有至少70%序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽包含一个或多个（几个）氨基酸的取代、缺失和/或***的变体；和
(e) 任何(a)、(b)或(c)的蛋白质或多肽，其包含SEQ ID No：2或由SEQ ID No：2组成，和
(f) (a)，(b)，(c)，(d)，或(e)的蛋白质或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性。
7.根据权利要求6所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，所述D-葡萄糖溶液是精制过的葡萄糖溶液，或者是由淀粉酶解制得的未精制的D-葡萄糖母液。
8.根据权利要求6所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，所述3-差向异构酶是包含于所述重组细胞的培养物中或是从所述培养物分离。
9.根据权利要求8所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，所述重组细胞包含来源于编码3-差向异构酶的基因。
10.根据权利要求6所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，所述载体包括大孔树脂、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸钠、双醛淀粉。
11.根据权利要求6所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，还包括以下步骤：用其上固定有3-差向异构酶以及D-葡萄糖异构酶的所述载体填充管柱；并且向填充载体的管柱供应D-葡萄糖溶液。
12.根据权利要求11所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，还包括以下步骤：将其上固定有所述3-差向异构酶以及所述D-葡萄糖异构酶的所述载体分别填充于两根管柱中，并且使所述两根管柱彼此连通连接。
13.一种由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺， 其特征在于，包括以下步骤：将3-差向异构酶、蔗糖水解酶以及D-葡萄糖异构酶固定于载体上；
具有所述3-差向异构酶活性的分离的蛋白质或多肽，其选自下组：
(a)蛋白质或多肽，其与SEQ ID No：2的氨基酸序列具有至少70%序列同一性；
(b)蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID No：1的多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID No：1的多肽编码序列的基因组 DNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；
(c) 蛋白质或多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO：1的蛋白质或多肽编码序列具有至少70%序列同一性；
(d)SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽包含一个或多个（几个）氨基酸的取代、缺失和/或***的变体；和
(e) 任何(a)、(b)或(c)的蛋白质或多肽，其包含SEQ ID No：2或由SEQ ID No：2组成，和
(f) (a)，(b)，(c)，(d)，或(e)的蛋白质或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向异构酶及塔格糖-3-差向异构酶活性。
14.根据权利要求13所述的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺， 其特征在于，所述3-差向异构酶包含于所述重组细胞的培养物中或是从所述培养物分离。
15.根据权利要求14所述的由蔗糖生产D-阿洛酮糖的工艺， 其特征在于，所述重组细胞包含来源于编码3-差向异构酶的基因。
16.根据权利要求13所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，所述载体包括大孔树脂、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸钠、双醛淀粉。
17.根据权利要求13至16任一项所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，还包括以下步骤：用其上固定有所述3-差向异构酶、所述蔗糖水解酶以及所述D-葡萄糖异构酶的所述载体来填充管柱，并且向所填充的管柱供应蔗糖溶液。
18.根据权利要求17所述的由D-葡萄糖生产D-阿洛酮糖的工艺，其特征在于，还包括以下步骤：将其上固定有所述3-差向异构酶、所述蔗糖水解酶以及所述D-葡萄糖异构酶的所述载体各自分别填充于各自管柱中，并且使所述三根管柱彼此连通连接。
CN201810120400.4A 2018-02-06 2018-02-06 生物法生产d-阿洛酮糖的工艺 Pending CN108251468A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810120400.4A CN108251468A (zh) 2018-02-06 2018-02-06 生物法生产d-阿洛酮糖的工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810120400.4A CN108251468A (zh) 2018-02-06 2018-02-06 生物法生产d-阿洛酮糖的工艺

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108251468A true CN108251468A (zh) 2018-07-06

Family

ID=62744551

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810120400.4A Pending CN108251468A (zh) 2018-02-06 2018-02-06 生物法生产d-阿洛酮糖的工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108251468A (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022520A (zh) * 2018-09-18 2018-12-18 上海立足生物科技有限公司 一种阿洛酮糖的生产工艺
CN109287904A (zh) * 2018-09-07 2019-02-01 陕西省生物农业研究所 一种含有d-阿洛酮糖的发酵果蔬汁的制备方法
CN110438113A (zh) * 2019-07-23 2019-11-12 吉林中粮生化有限公司 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法
CN112342179A (zh) * 2021-01-05 2021-02-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法
CN113677803A (zh) * 2018-12-21 2021-11-19 绿光生物科技股份有限公司 阿洛酮糖的无细胞生产
CN113667707A (zh) * 2021-10-21 2021-11-19 中粮营养健康研究院有限公司 由葡萄糖生产d-阿洛酮糖的方法
CN114736942A (zh) * 2022-03-25 2022-07-12 上海龙殷生物科技有限公司 一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法
CN117229334A (zh) * 2023-11-13 2023-12-15 保龄宝生物股份有限公司 一种d-阿洛酮糖液体的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533711A (zh) * 2012-02-22 2012-07-04 江南大学 一种d-塔格糖3-差向异构酶固定化方法
CN105821027A (zh) * 2016-04-01 2016-08-03 南京朗奈生物技术有限公司 一种新型3-差向异构酶以及对其进行编码的多核苷酸
WO2018004308A2 (ko) * 2016-06-30 2018-01-04 씨제이제일제당 (주) 신규 내열성 과당-6-인산-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533711A (zh) * 2012-02-22 2012-07-04 江南大学 一种d-塔格糖3-差向异构酶固定化方法
CN105821027A (zh) * 2016-04-01 2016-08-03 南京朗奈生物技术有限公司 一种新型3-差向异构酶以及对其进行编码的多核苷酸
WO2018004308A2 (ko) * 2016-06-30 2018-01-04 씨제이제일제당 (주) 신규 내열성 과당-6-인산-3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109287904A (zh) * 2018-09-07 2019-02-01 陕西省生物农业研究所 一种含有d-阿洛酮糖的发酵果蔬汁的制备方法
CN109022520A (zh) * 2018-09-18 2018-12-18 上海立足生物科技有限公司 一种阿洛酮糖的生产工艺
CN113677803A (zh) * 2018-12-21 2021-11-19 绿光生物科技股份有限公司 阿洛酮糖的无细胞生产
CN110438113A (zh) * 2019-07-23 2019-11-12 吉林中粮生化有限公司 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法
CN112342179A (zh) * 2021-01-05 2021-02-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法
CN112342179B (zh) * 2021-01-05 2021-04-06 中国科学院天津工业生物技术研究所 产塔格糖的枯草芽孢杆菌基因工程菌及制备塔格糖的方法
CN113667707A (zh) * 2021-10-21 2021-11-19 中粮营养健康研究院有限公司 由葡萄糖生产d-阿洛酮糖的方法
CN113667707B (zh) * 2021-10-21 2022-04-15 中粮营养健康研究院有限公司 由葡萄糖生产d-阿洛酮糖的方法
CN114736942A (zh) * 2022-03-25 2022-07-12 上海龙殷生物科技有限公司 一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法
CN114736942B (zh) * 2022-03-25 2024-04-02 上海龙殷生物科技有限公司 一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法
CN117229334A (zh) * 2023-11-13 2023-12-15 保龄宝生物股份有限公司 一种d-阿洛酮糖液体的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108251468A (zh) 生物法生产d-阿洛酮糖的工艺
CN102869783B (zh) 阿洛酮糖-差向异构酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向异构酶制备d-阿洛酮糖的方法
CN107699557A (zh) 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法
CN106520746A (zh) 一种高纯度d‑阿洛酮糖的制备方法
CN109957536B (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用
CN103501636A (zh) 从植物汁制备异麦芽酮糖的方法
CN101631856A (zh) 由棒状杆菌属表达的***糖异构酶和使用其制造塔格糖的方法
CN110452845B (zh) 一种产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌
CN112831489B (zh) 一种阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶、其固定化方法与应用
CN105821027A (zh) 一种新型3-差向异构酶以及对其进行编码的多核苷酸
CN111394292A (zh) 一种多途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及其应用
KR102044957B1 (ko) 사이코스의 제조방법
CN109576239B (zh) 耐热磷酸化酶及其应用
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
CN108048440A (zh) 一种耐高温葡萄糖异构酶突变体及其应用
CN107937454B (zh) 一种固定化酶催化剂生物合成d-塔格糖的方法
CN112760316B (zh) 人工油体固定化多酶生产塔格糖的方法
CN111411066B (zh) 一种双途径复合产神经氨酸枯草芽孢杆菌及构建方法
CN111394410B (zh) 一种高催化活性神经氨酸合酶及应用
CN110396507A (zh) 源自Cnuibacter physcomitrellae的L-泛解酸内酯脱氢酶
CN113481189A (zh) 一种蔗糖异构酶突变体及其应用
CN111455003A (zh) 一种微藻制备d-阿洛酮糖的方法
JP3650632B2 (ja) マルトースをトレハロースに変換する組換え型酵素
CN106244566B (zh) 一种软骨素合酶突变体及其应用
CN102250988A (zh) 一种生物酶法生产塔格糖的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination