KR20230108156A - Cd40l에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 명세서는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 이를 포함하는 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물 및/또는 CD40L 검출용 조성물을 제공하고,

Description

CD40L에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도{Antibody specifically binding to CD40L and use thereof}
CD40L에 특이적으로 결합하는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도와 관련된 것으로, 구체적으로, 항 CD40L 항체 ALC/또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 ALC/또는 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 및 T-세포 매개성 면역질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
림프구의 활성화는 적응면역에 있어서 가장 중요한 요소이다. T세포의 경우 두 가지의 세포 내 신호를 바탕으로 활성화되는데 첫 번째는 항원 특이 신호로서 항원제시세포 (antigen presenting cells, APC)의 주조직적합복합체 (major histocompatibility complex, MHC)에서 항원이 T세포에게 적절하게 제시될 때 항원 특이 T세포 표면 수용체 (T-cell surface receptor, TCR)를 통해 전달된다. APC는 항원 제시자일 뿐만 아니라 두 번째 신호를 제공하는데, 두 번째 신호는 생산적인 T세포 활성화에 필요하며 해당 과정을 공동 자극이라고 한다. 공동자극신호 없이 TCR 단독 자극으로는 T세포를 증식시킬 수 없고, 종종 세포자멸사 (apoptosis)를 겪으며, 사이토카인을 생성하지 못하는 등 생산적인 T세포 활성화로 이어지지 않는다. 공동자극은 T세포의 분화 및 증식을 유도하고, 세포사이협력을 가능하게 하는 등의 역할을 수행하기도 하지만, 불필요한 림프구의 활성화를 방지하는 등 면역체계에서의 안전장치 역할도 수행한다. 해당 역할이 제대로 이루어지지 않을 경우 인체의 면역체계가 비정상적인 면역 활성을 유도하게 되어 자가면역질환이 발생할 수 있다. 공동자극신호는 T세포와 APC 사이의 세포표면분자의 여러 수용체와 리간드 (ligand, L)쌍의 상호작용을 통해 전달하며 PD1-PDL1, CD40-CD40L, LFA-1-ICAM-1 등 다양한 수용체-리간드 쌍의 예가 있다. 현재 니볼루맙 (nivolumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab)을 비롯한 PD1-PDL1 표적치료제가 가장 많이 승인된 상태이며, LFA-1 표적치료제는 이식, 염증 및 자가면역질환에 있어서 연구 중에 있다. 에팔리주맙 (efalizumab)이 대표적이다.
CD40L에 대한 신호전달체계는 다음과 같다. T세포가 APC를 인지하면 공동자극신호에 관여하는 CD40L 발현을 유도하며, 다양한 사이토카인 신호들을 바탕으로 상향 조절된다. 이렇게 발현된 CD40L은 APC에 존재하는 CD40과 결합하여 APC 활성화를 유도하고, 이로 인하여 APC에서는 다른 공동자극인자인 B7을 발현하거나 IL-12와 같은 사이토카인을 분비하기도 한다. 앞서 일련의 과정들을 통해 T세포는 더욱 증식 및 분화하게 되며, 감염 및 조직손상 부위로의 이동에 관여하는 ICAM-1, VCAM-1, E-셀렉틴, P-셀렉틴 등의 접착분자 발현을 증가시키게 된다. CD40에 의해 생성된 신호는 세포 유형에 따라 다르며, 유사 분열촉진제활성 단백질 인산화효소 (mitogen-activated protein kinase) 경로 및 NF-κB의 활성화를 포함한다.
CD40-CD40L 신호전달은 내피세포, 상피세포, 섬유모세포 및 신경세포를 포함한 비조혈세포에 대한 세포반응에도 영향을 미치며, 비만세포, 자연살해세포 등의 다양한 세포에서도 발현되기 때문에 그 영향력이 광범위하다고 볼 수 있다. 따라서, 자가면역질환 및 만성염증성질환 등이 발생하지 않도록 적절한 면역반응이 유지되어야하며, 해당 신호전달이 엄격하게 조절되어야 한다. 다양한 자가면역질환에 대한 치료적 접근으로 면역활성에 작용하는 면역세포를 제거하거나 면역 활성에 작용하는 주요 세포사이 또는 단백질사이상호작용을 차단하는 방법 등을 사용할 수 있으며, CD40-CD40L 상호작용을 차단하는 것 역시 비정상면역활성 차단의 주요한 수단이 될 수 있어, 이에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 명세서의 일 예는 CD40L을 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1 (GYTFTRYY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 2 (INPTNGDT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및/또는 서열번호 3 (TRPLGSRDAMDY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위 (Complementarity Determining Regions; CDRs) 및/또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및/또는
서열번호 4 (QSVSSSRYSY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 5 (YAS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및/또는 서열번호 6 (QHSWELPWTF)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성결정부위 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 등), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체), 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있고, 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론 항체일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항 CD40L 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
보다 구체적으로, 서열번호 1 내지 6 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 암호화하는, 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는
서열번호 7의 아미노산 서열;
서열번호 8의 아미노산 서열; 또는
이들 모두를 암호화하는, 핵산 분자를 제공한다.
상기 핵산 분자는
서열번호 9의 핵산 서열;
서열번호 10의 핵산 서열; 또는
이들 모두를 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.
일 예에서, 상기 재조합 벡터는 상기 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항 CD40L 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 것일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 상기 핵산 분자를 적절한 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 질병은 T-세포 매개성 면역 질환일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 상기 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료, 또는 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기 약학 조성물, 방법 및 용도에 있어서, T-세포 매개성 면역 질환은 이식거부, 이식편대숙주질환, 천식, 자가면역질환 등에서 선택된 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자는 CD40L에 결합하여 CD40-CD40L 상호작용을 차단하는 항체를 개발하여, 면역차단효과를 검증하였다.
이에, 본 명세서에서는 CD40L을 특이적으로 인식하는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이들의 용도가 제공된다.
상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40L에 대하여 억제 활성을 갖는 길항제 (antagonist)일 수 있다. 이는 상기 항체가 CD40L을 발현하는 세포에 특이결합능력, 농도 의존결합능력, 구조결합능력, 및/또는 기능결합능력을 가지고, 상기 항체 처리 시, CD40L과 CD40의 결합이 차단, CD40 및 CD40L 상호작용에 의해 활성화되는 HEK-Blue CD40L 세포의 기능이 차단되고, ICAM-1 발현이 되지 않은 등의 하기 실시예 결과를 통해 확인될 수 있다.
본 명세서에서 “CD40L (Accession Number: NM_000074, NP_000065 (인간), NM_011616, NP_035746 (마우스))” 은 CD154 또는 CD40 리간드라고도 불리며, 활성화된 T세포에 일차적으로 발현되는 단백질이고, TNF 분자 중 하나이다. 이것은 항원전달세포 (APC)위의 CD40에 결합하여 표적 세포의 종류에 의존하는 많은 효과들을 유도한다.
본 명세서에서 “CD40 (Cluster of differentiation 40) (Accession Number: NM_001250, NM_001302753, NM_152854, NM_001322421, NM_001322422, NP_001241, NP_001289682, NP_001309350, NP_001309351, NP_690593, NM_001362758, NP_001349687 (인간), NM_011611, NM_170702, NM_170703, NM_170704, NP_035741, NP_733803, NP_733804, NP_733805 (마우스))”은 antigen-presenting cells에서 발견되는 공동 자극 단백질로, antigen-presenting cells 활성화에 필요하다. TH 세포의 CD40L이 CD40에 결합하면 antigen-presenting cells이 활성화되고 다양한 다운스트림 효과가 유도된다.
본 명세서에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 CD40L은 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대 인간 CD40L (예컨대, 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E)) 일 수 있다.
본 명세서에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질 또는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로, 상기 물질 또는 단백질을 기초로 재조합적 또는 합성적으로 생산된 단백질도 포함하는 개념으로 사용된다. 일 예에서, 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 등), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체), 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론 항체일 수 있다.
또한 본 명세서에서 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유하는 항체의 모든 단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서에서 “상보성 결정부위 (Complementarity-determining regions, CDR)”는 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 항체 단편일 수 있다.
본 명세서의 일 예는 CD40L을 특이적으로 인식 또는 CD40L에 특이적으로 결합하는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1 (GYTFTRYY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 2 (INPTNGDT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및/또는 서열번호 3 (TRPLGSRDAMDY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위 (Complementarity DeterminingRegions; CDRs) 및/또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및/또는
서열번호 4 (QSVSSSRYSY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 5 (YAS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및/또는 서열번호 6 (QHSWELPWTF)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성결정부위 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체 (chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입 (anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입 (anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체 (humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR (complementarity determining regions) 부위를 인간 항체 골격 (framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식 (grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조 (crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등을 활용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체) 또는 인간화 항체일 수 있다.
상기 항체 또는 항원 결합 단편에 있어서, 서열번호 1 내지 3의 중쇄 CDR을 제외한 중쇄 프레임워크 및/또는 중쇄 불변영역은 면역글로불린 (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 등), IgM, IgA, IgD, 또는 IgE), 예컨대, 인간 면역글로불린 (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 등), IgM, IgA, IgD, 또는 IgE)으로부터 유래한 중쇄 프레임워크 및/또는 중쇄 불변영역일 수 있고, 서열번호 4 내지 6의 경쇄 CDR을 제외한 경쇄 프레임워크 및/또는 경쇄 불변영역은 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 타입의 경쇄 프레임워크 및/또는 경쇄 불변영역일 수 있다.
완전한 항체는 2개의 전장 (full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마 (ν), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1 (ν1), 감마2 (ν2), 감마3 (ν3), 감마4 (ν4), 알파1 (α1) 및 알파2 (α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파 (κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 명세서에서 용어, "중쇄 (heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지 (hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
또한, 본 명세서에서 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
본 명세서에서 용어, "CDR (complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분, 예컨대, CDR을 포함하는 항체의 일부를 의미한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있다.
Fab은 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중가닥 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단일가닥 Fv (single-chain Fv; scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "힌지 영역 (hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성 (flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
상기 항 CD40L　항체는 단클론항체일 수 있다. 단클론항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 CD40L 항체는 이용해서 통상의 방법에 의하여 동물 (예컨대, 마우스) 유래의 단클론항체로 제조될 수 있다.
한편, 전형적인 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 CD40L과의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA (Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석 또는 세포-기반 분석 (cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 CD40L에 대한 각각의 친화도 (Kd values)를 검정할 수 있다.
또한, 유세포 분석을 통해서 상기 항체가 CD40L에 특이적으로 결합하는 특이결합능력을 가지고, 상기 유세포 분석 및 ELISA 분석을 통해 농도 의존적으로 결합하는 농도 의존결합능력을 가지고, 웨스턴블롯 분석을 통해 CD40L 구조와 상관없이 CD40L 특정 부위를 인지하여 14D6가 결합하는 구조결합능력을 가지고, 인간 말초혈액단핵세포 분석을 통해 발현된 CD40L을 14D6이 인지하는 등 기능결합능력을 가지는 것을 확인할 수 있다. 유세포 분석을 통해 상기 항체가 농도 의존적으로 CD40L과 CD40의 결합을 차단하는 농도 의존차단능력을 가지고, HEK-blue CD40L 세포 분석을 통해 농도 의존적으로 기능 차단이 이루어진 것을 확인하였고, 상기 항체가 세포사이부착분자-1 (ICAM-1) 발현을 감소시켜, 기능차단능력이 있는 것을 확인할 수 있다.
다른 예는 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 질병은 T-세포 매개성 면역 질환일 수 있다. 다른 예는 상기 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예는 상기 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료, 또는 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기 약학 조성물, 방법 및 용도에 있어서, T-세포 매개성 면역 질환은 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 천식, 자가면역질환 (예컨대, 뇌척수염 (예컨대, 알러지성 뇌척수염), 류마티스 관절염, 전신홍반성 낭창 (루프스), 아토피 피부염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결정성 다발동맥염, 기쿠치병, 교원병, 하시모코 갑상선염, 건선, 백반증, 갑상선 기능 항진증, 섬유근육통, 원형탈모, 알러지, 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈 등) 등에서 선택된 것일 수 있다.
다른 예는 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 수지상 세포의 분화 및 기능의 조절을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 다른 예는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 수지상 세포의 분화 및/또는 기능의 조절 또는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하기 위한 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 알르기니, 히스티딘, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 또는 병변부위 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서의 “약학적 유효량”은 소망하는 약리적 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분 (즉, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 함량 또는 투여량을 의미하는 것일 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 정해질 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량 또는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000 mg/kg, 구체적으로 0.01 내지 100 mg/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 mg/kg, 더욱 구체적으로 0.1 내지 20 mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다른 항암제와 같은 다른 약물과 병용 투여 가능하며, 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류 등을 포함하는 포유류일 수 있다. 상기 대상은 앞서 설명한 T-세포 매개성 면역 질환을 가지는 환자, 또는 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자일 수 있다.
한편, 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40L에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 CD40L을 검출 또는 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 예는 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CD40L의 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 생물 시료에 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는 CD40L의 검출 방법을 제공한다. 상기 검출 방법에서, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 CD40L이 존재하는 것으로 결정 (판단)할 수 있다. 따라서, 상기 검출 방법은, 상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계 이후에, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 CD40L이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 생물 시료는 포유류, 예컨대 인간 (예컨대, 이식 예정 환자 또는 이식 받은 환자, 자가면역질환 환자 등)으로부터 얻은 (분리된) 세포, 조직, 체액 (예, 혈액, 혈장, 혈청 등), 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피 (Immunochromatography), 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석 (enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석 (luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴 블롯 (Western blotting), 마이크로어레이 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 앞서 설명한 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 전구체로서 항체 제작에 사용될 수 있을 뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대 펩티바디), 이중 특이 항체, 또는 다중 특이 항체의 구성 성분으로 포함될 수 있다.
다른 예는 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 항 CD40L 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
다른 예는 상기 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항 CD40L 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 “벡터 (vector)”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pcDNA 시리즈 (예, pcDNA3.4 등), pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pQKX1, pQKX2, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결 (operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO-S, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK, HEK293 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
다른 예는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항 CD40L 항체의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 임의로 배양 배지로부터 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40L에 결합하는 효과를 갖고, CD40 및 CD40L의 결합을 차단하는 효과를 가지고, 이로 인하여, T 세포-매개 면역질환, 특히 자가면역질환에 대한 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 및 1b는 14D6 단클론항체를 제작하는 과정을 보여준다. 면역원으로 재조합 인간 CD40L 단백질을 사용하여 4회의 면역화를 수행한 것으로, 면역화된 비장세포와 골수종 세포의 융합을 통해 하이브리도마 세포를 얻는다.
도 2는 세포에 14D6 단클론항체 처리 시 결합여부를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. Negative cont.는 14D6 단클론항체 대신 1x PBS를 처리한 음성 대조군이다. 도 2a 및 도 2b는 각각 CHO 세포 및 CD40 표면발현 CHO 세포에서 결합정도를 확인한 것이고, 도 2c는 CD40L 표면발현 CHO 세포에서 결합정도를 확인한 것이다.
도 3은 세포에 14D6 단클론항체 처리 시 농도에 따른 결합정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. Negative cont.는 14D6 단클론항체 대신 1x PBS를 처리한 음성 대조군, Positive cont.는 14D6 단클론항체 대신 5C8을 처리한 양성 대조군을 의미한다.
도 4는 14D6 단클론항체의 농도에 따른 결합 능력을 ELISA 분석으로 확인한 결과이다.
도 5는 14D6 단클론항체의 구조결합 능력을 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과이다. Reducing은 이황화결합이 끊어진 환원조건, Non Reducing은 이황화결합이 유지된 비환원조건을 의미하고, Jurkat와 HeLaS3은 각각 CD40L을 발현한다고 알려진 Jurkat 세포와 HeLaS3 세포를 의미한다.
도 6은 14D6 단클론항체의 기능결합능력을 인간 말초혈액단핵세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 14D6 단클론항체의 농도에 따른 CD40L과 CD40 결합 차단 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과이다. 해당 도면의 모식도는 Bjab 세포와 CD40L-hFc 단백질을 이용한 14D6 항체의 차단능 검증을 위한 모식도를 의미하고, Negative cont.는 1x PBS를 처리한 음성 대조군, Positive cont.는 항체를 처리하지 않은 양성 대조군을 의미한다.
도 8a는 HEK-blue CD40L 세포가 CD40L과 반응하여 농도 의존생리활성을 나타내는지 확인하기 위한 적정 재조합 인간 CD40L 단백질 농도 조건 확립을 위해, 상기 단백질 농도에 따른 655nm 파장에서의 흡광도를 측정한 결과이다.
도 8b는 14D6 단클론항체의 기능차단능력을 HEK-Blue CD40L 세포를 이용해 확인한 결과이다. 아래쪽 그래프는 14D6에 의한 중화 효과를 백분율로 나타낸 것이다.
도 9는 14D6 단클론항체의 기능차단능력을 ICAM-1 발현 여부를 이용해 확인한 결과이다. 도 9b는 상기 ICAM-1 발현 여부를 히스토그램으로 나타낸 것이다.
도 9a, 9c 및 9d는 상기 ICAM-1 발현 여부를 dot plot으로 나타낸 것이다. 1사분면에 분포가 많으면 ICAM-1 발현이 높은 것으로 CD40-CD40L 상호작용이 많이 일어난 것을 의미하고, 4사분면에 분포가 많을수록 항체에 의해 해당 상호작용이 차단되어 ICAM-1 발현이 감소하였다는 것을 의미한다. 도 9d는 14D6을 처리한 경우 B세포 내 농도 별 발현 정도를 나타낸다.
도 9c의 blocking efficiency graph는 도 9d의 농도에 따른 결합 차단 효율을 그래프로 표현한 것이고, 도 9c의 dot plot에서 사분면으로 나뉘지 않은 두 dot plot의 경우 실험을 진행한 모든 세포에서의 ICAM-1 발현 정도를 나타내고, 사분면으로 나뉘어진 두 dot plot의 경우 B 세포 내 ICAM-1 발현 정도를 나타낸다.
도 10은 14D6의 키메릭항체의 서열을 나타내는 그림이다.
도 11a 14D6의 키메릭항체의 결합능력을 확인하기 위해 세포에 1x PBS (Negative cont.)와 키메릭항체 반응물을 각각 첨가하고, 14D6 키메릭항체가 세포 표면에 발현한 CD40L에 결합하는지를 유세포분석기로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11b는 14D6의 키메릭항체의 결합능력을 확인하기 위해 세포에 14D6 마우스항체와 키메릭항체 반응물을 각각 첨가하고, 14D6 마우스 및 키메릭항체가 세포 표면에 발현한 CD40L에 결합하는지를 유세포분석기로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11c는 14D6의 키메릭항체의 결합능력을 확인하기 위해 세포에 14D6 키메릭항체와 14D6 마우스항체를 함께 처리하여 차단효과를 검증한 결과이다. Chimeric & Mouse 14D6는 마우스 14D6 처리 후 키메릭 14D6를 처리한 것이고, Chimeric 14D6는 키메릭 14D6만을 처리한 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 14D6 단클론항체 제작 및 세포주 준비
실시예 1-1. 14D6 단클론항제 제작
CD40L 특이 단클론항체를 개발하기 위하여 6주령의 Balb/c 암컷 마우스와 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E)을 이용하였고, 상기 단백질의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
명명 서열 서열번호
Human_CD40L_Protein MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL 11
최초면역 시 재조합 인간 CD40L 단백질 100μg을 상기 마우스 복강에 주입하였고, 3주 후에 10μg씩 2주 간격으로 2회 주입하였다. 세포융합을 실시하기 3일 전 상기 재조합 인간 CD40L 단백질 100μg을 주입하여 면역반응증가 및 CD40L에 대한 항체가 증폭되도록 유도하였다. 최종면역을 수행한지 3일 후, 면역화된 마우스의 비장을 적출하고 균질화하여 비장세포를 획득하고, RPMI 배지 (Welgene, Gyeongsan-si, Korea)로 2회 세척하였다. 비장세포와 0.4 (v/v)% 트리판블루를 1:1의 부피비로 혼합한 후, 현미경으로 염색되지 않은 세포를 계수하여 생 세포수를 계수하였다. 세포융합은 X63 마우스 골수종 세포주 (ATCC, Virginia, USA)를 사용하였으며, 비장세포와 동일한 방법으로 세포 세척 후 생세포수를 계수하였다. X63 세포와 비장세포는 세포수에 따라 1:5의 비율로 혼합하고 원심분리 후 상층액을 제거하였다.
이 후, 50 (v/v)% 폴리에틸렌글라이콜 (polyethylene glycol)-1500 (Sigma, Saint louis, USA)을 첨가하여 세포융합을 유도하고, 이를 원심분리한 후 HAT 배지 (hypoxanthine aminopterin thymidine medium) (Sigma, Saint louis, USA)가 포함된 20 (v/v)% 열비활성화 소태아혈청 (Fetal bovine serum; FBS)(Gibco, Texas, USA) 함유 RPMI 배지로 부유시켰다. 상기 부유액을 96 웰 플레이트에 150μl/웰로 분주하고, 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 군락이 형성되는 웰이 관찰될 때까지 배양하였다. 배양 후 7일 경과 후, HT 배지 (hypoxantin-thymidine culture medium) (Sigma, Saint louis, USA)가 포함된 20 (v/v)% FBS 함유 RPMI 배지를 웰당 150μl 첨가하고 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 48시간 배양하였다. 이 후 이들 배양액과 CD40L-hFc 단백질 혼합액 (CD40L-hFc (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H01H) 2μg/test을 CD40을 발현하는 Bjab 세포 (DSMZ, Brauschweig, Germany) 배양약 100ul/test에 처리하여 차단효과가 있는 클론만 선별하였다. 2회의 제한희석을 거쳐 단일 콜로니로 구성된 14D6-52-5 단일클론항체 (이하, 14D6) 하이브리도마세포를 확보하여 14D6 단클론항체를 제작하였고, 그 과정을 도 1에 나타내었다. 14D6의 차단능은 상기 2회의 제한희석을 통해 얻을 수 있다.
실시예 1-2. 세포주 준비
상기 실시예 1-1에서 준비한 단클론항체의 효과를 검증하기 위해 세포주를 준비하였다.
구체적으로, 인간 버킷 림프종 B세포인 Bjab (DSMZ, Brauschweig, Germany), Ramos (ATCC; American Type Culture Collection)와 인간 T 림프구세포인 Jurkat (한국세포주은행), 자궁경부암세포인 HeLaS3 (한국세포주은행)를 10 (v/v)% FBS가 첨가된 RPMI 배지에서 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양했다. 중국 햄스터 난소 세포주 계열인 CD40L 표면발현 CHO 세포 (ATCC), CD40 표면발현 CHO 세포 (ATCC), CHO 세포 (ATCC), HEK-Blue CD40L 세포 (InvivoGen)는 10 (v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지 (Welgene)에서 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양했다.
실시예 2. 세포주에서의 14D6 단클론항체의 결합능력 확인
실시예 2-1. 유세포 분석
14D6 단클론항체의 특이결합능력을 검증하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 준비한 CHO 세포, CD40 표면발현 CHO 세포, CD40L 표면발현 CHO 세포에 1x PBS (음성 대조군), 8G1 (양성 대조군) (대한민국 공개공보 제 10-2018-0131989 호, 미국 공개특허 US 2020-0291123 A1의 항체), 상기 실시예 1-1에서 준비한 14D6 단클론항체를 0.05μg/test로 처리하고, 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, 결합된 항체를 확인하기 위해 염소 항-마우스 Ig-FITC 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 넣었다. 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후 상기 PBS 2ml를 이용해 상기와 동일한 방법으로 세척한 다음 유세포 분석기 (Stratedigm, California, USA )로 측정하였고, 그 결과를 도 2a 내지 2c에 나타내었다. 그 결과, 14D6 단클론항체는 CD40L 표면발현 CHO 세포에만 특이적으로 결합 (도 2c)하고, 음성 대조군 (1x PBS)은 모든 종류의 세포에 결합하지 않고, 8G1 항체는 CD40 CHO 세포에 특이적으로 결합하지만 CD40L CHO 세포에는 결합하지 않는 것 (도 2a 및 2b)을 확인하였다.
또한, 농도의존결합을 검증하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 준비한 CD40L 표면발현 CHO 세포에 14D6을 0.01, 0.05, 0.1, 또는 0.5μg/test로 처리하고, 4℃에서 30분 동안 반응시키고, 상기 유세포분석과 실질적으로 동일한 방법으로 결합 정도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 음성 대조군으로는 1x PBS, 양성 대조군으로는 5C8 (Genetex, Irvine, USA)를 상기 14D6 대신 0.5μg/test의 양으로 첨가하여 측정하였다. 그 결과, CD40L 표면발현 CHO 세포에 14D6을 농도별로 처리하고 유세포분석기로 측정한 결과 농도에 비례하여 14D6 항체가 CD40L에 결합하는 것을 확인하였고, 0.1μg 이상의 농도에서는 결합이 포화상태인 것을 확인하였다.
실시예 2-2. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 분석
Maxisorp 96 웰 ELISA 플레이트에 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China)을 웰당 100ng/100μl 넣고, 37℃에서 1시간 반응시켜 항원을 코팅한 다음 비특이결합을 줄이기 위하여 1 (w/v)% BSA (Bovine Serum Albumin) 용액을 웰당 200μl 넣고, 37℃에서 1시간 반응시켰다.
상기 실시예 1-2에서 준비한 14D6을 1000ng/ml에서부터 2배씩 계열희석하여 각각 100μl씩 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤 세척완충액 (0.05% tween-20 in PBS)으로 3회 세척하여 결합되지 않은 1차항체를 제거하였다.
그 후, 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 100μl 넣고, 37℃에서 30분 반응시킨 후 세척완충액으로 3회 세척하였다. TMB 용액 (Thermofisher, Waltham, USA) 을 50μl 넣어 10분간 반응시키고, 황산 50μl를 넣어 반응을 중지시킨 다음 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여, 농도에 따른 결합 능력을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. ELISA 분석 결과 역시 유세포분석의 결과와 마찬가지로 농도에 비례하여 14D6 항체가 CD40L에 결합하는 것을 확인하였고, 100ng/ml 이후의 농도에서는 결합이 포화상태인 것을 확인하였다.
실시예 2-3. 웨스턴 블롯 (Western blotting) 분석
CD40L을 발현한다고 알려진 Jurkat 세포 (한국세포주은행)와 HeLaS3 세포 (한국세포주은행)를 1x108개만큼 배양하여 용해완충액 (1 (v/v)% NP-40) 10ml로 현탁한 후, 4℃에서 30분간 용해시켰다. 상기 용해된 세포현탁액을 3분간 원심 분리하여 세포잔존물을 제거하고, 상층액만 채취하였다. 상기 용해물에 2x SDS-PAGE 시료버퍼를 넣고 5분간 끓인 후, 4%에서 15%로 gel percent 농도가 증가하는 SDS겔 (Biorad, Hercules, USA)에 주입하여 전기영동하였다. 전기영동을 진행한 용해물을 PVDF막에 전기이동하고, 비특이결합을 줄이기 위하여 5 (w/v)% 탈지분유 용액으로 차단한 다음 검출하고자 하는 CD40L 단백질에 특이 결합하는 14D6을 0.5μg/ml로 처리하였다. 세척완충액 (0.05 (v/v)% tween-20 in TBS)으로 3회 세척하여 결합되지 않은 1차항체를 제거하고, 과산화효소결합 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 결합시켰다. 상기 PVDF 막을 세척완충액으로 다시 세척한 후 화학발광증폭검출시스템 (ECL)을 사용하여 표적단백질을 검출하여, 14D6의 구조결합능력을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과, 14D6 항체는 환원성 또는 비환원성 조건에 관계없이 분자량이 32 ~ 39kDA인 CD40L을 검출하는 것을 확인하여, 이황화결합이 끊어진 환원조건 및 이황화결합이 유지된 비환원조건 모두에서 결합이 이루어졌다는 것을 확인하였고, 이는 14D6이 CD40L의 구조와 상관없이 CD40L의 특정 부위를 인지하여 결합한다는 것을 의미한다.
실시예 2-4. 인간 말초혈액단핵세포 분석
림프구와 단핵구로 구성된 PBMC층에 PMA와 이오노마이신을 처리하여 자극할 경우, 신호전달경로를 거쳐 T세포가 활성화되고 이로 인해 CD40L의 발현이 유도된다. 자극된 인간 PBMC에 14D6을 처리하여 발현된 CD40L을 인지하는지 검증하고자 실험을 진행하였다.
사람 혈액 (Zenbio, North carolina, USA)을 PBS와 1:1의 부피비로 섞어 희석하고 피콜튜브에 넣은 후, 2200rpm에서 20분간 원심분리하여 인간말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 확보하였다. PBS 30ml을 넣고 2200rpm에서 5분간 원심분리하여 PBMC를 세척한 다음 상층액을 제거하였다. PBMC와 0.4 (v/v)% 트리판블루를 1:1의 부피비로 섞은 후, 현미경으로 염색되지 않은 세포를 계수하여 생세포수를 확인하였다. 다시 원심분리 후, 상층액을 제거한 PBMC를 10 (v/v)% RPMI 배지로 부유시키고, 6 웰 플레이트에 1x107개/5ml/웰씩 분주하였다. 자극그룹에 PMA 20ng/ml, 이오노마이신 (ionomycin) 1μg/ml을 넣고 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 6시간 동안 반응시켰다. 세포를 모두 모은 후, 14D6을 0.1μg씩 처리하고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 결합하지 않은 항체를 제거한 다음 T세포 선별을 위한 CD3-APC (Invitrogen, Waltham, USA)와 14D6 검출을 위한 염소 항-마우스 Ig-FITC 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 처리하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 2ml을 이용해 상기 실시예 2-1과 실질적으로 동일한 방법으로 세척한 다음 유세포분석기로 측정하였고, 이를 통해 인간 혈액 내의 T세포를 활성화시켜 발현이 유도된 CD40L을 14D6이 인지하는지 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 음성 대조군으로 1x PBS를, 양성 대조군으로 5C8 (Genetex, Irvine, USA)을 상기 14D6 대신 0.1μg씩 각각 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과, 무자극 조건하에서는 대조군 및 14D6 그룹에서 검출된 FITC가 매우 낮은 것을 확인하여 CD40L의 발현이 유도되지 않는 것을 확인하였고, 자극 조건 하에서는 양성 대조군 및 14D6 그룹에서 높은 수준의 검출된 FITC를 확인하였다. 이는 14D6 항체가 PMA 및 이오노마이신에 의해 T 세포에서 유도된 CD40L을 검출한다는 것을 의미한다.
실시예 3. 세포주에서의 14D6 단클론항체의 차단능력 확인
실시예 3-1. 유세포 분석
상기 실시예 1-1에서 준비한 14D6 0.05, 0.1 또는 0.5μg/100μl와 CD40L-hFc 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H01H) 2μg을 섞은 후 상온에서 30분 동안 반응시키고, 반응액을 Bjab 세포 (DSMZ, Brauschweig, Germany)에 처리한 다음 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심분리하여 결합하지 않은 혼합액을 제거하고, 결합여부를 확인하기 위해 염소 항-인간Ig-FITC 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 넣었다. 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후 PBS 2ml을 이용해 상기 실시예 1-1와 실질적으로 동일한 방법으로 세척한 다음 유세포분석기로 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 음성 대조군으로 1x PBS를 14D6 대신 100μl의 양으로 사용하였고, 항체 처리시 항체의 차단효과에 의해 FITC 신호가 감소하게 되는데 항체를 처리하지 않은 그룹을 결합이 최대로 일어난 것으로 정하고 항체 처리에 따라 결합이 감소하는 것을 확인하기 위해, 양성 대조군으로 항체를 처리하지 않은 상기 세포를 준비하여 실험을 진행하였다.
그 결과, 14D6의 농도가 증가할수록 차단효과가 증가하고, 14D6의 차단능은 0.1μg 이상의 농도에서 음성대조군과 유사한 것을 확인하였고, 농도 의존적으로 CD40L과 CD40의 결합을 차단하는 것을 확인하였고, 0.1μg/50μl 이상의 농도에서는 결합이 포화상태인 것을 확인하였다 (도 7).
실시예 3-2. HEK-blue CD40L 세포를 이용한 분석
HEK-Blue CD40L 세포는 인간배아신장유래세포인 HEK293 세포에 인간 CD40 유전자를 형질주입하여 만들어졌으며, NF-κB유도 분비 배아 알칼리 인산분해효소 (secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP) 구조물을 생성하도록 제조되었다. 상기 SEAP은 리포터유전자로서 CD40과 CD40L 반응이 일어나면 NK-κB가 활성화되고, 이로 인해 자극받은 프로모터에 의해 전사가 시작되어 생성된 SEAP구조물이 배양배지로 분비된다. 따라서 해당 세포를 이용하면, CD40 자극에 의해 활성화되는 NF-κB를 바탕으로 CD40L의 생리활성을 감지할 수 있다.
HEK-blue CD40L 세포가 CD40L과 반응하여 농도 의존생리활성을 나타내는지 확인하고, 적정 실험조건을 확립하기 위한 실험을 진행하였다. 구체적으로, HEK-Blue CD40L 세포 (Invivogen, San diego, USA)를 10 (v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용해 필요량만큼 희석하고, 96 웰 플레이트에 8x104cells/180μl/well씩 분주하였다. 이후, 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E)을 0.005, 0.05, 0.5, 5, 50, 또는 500ng/20μl/웰씩 해당 웰에 넣어준 다음 37℃, 5% CO2 조건의 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 콴티블루용액 (Quanti-Blue solution) (Invivogen, San diego, USA)을 새로운 96 웰 플레이트에 150μl/웰씩 분주하고, 상기 24시간 배양한 샘플을 상기 웰에 50μl/웰씩 첨가하였다. 그 후, 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 655nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, OD655nm 값이 1인 25ng/ml 농도를 적정 기준 값으로 설정하였고, 그 결과를 도 8a에 나타내었다.
또한, 농도 의존차단능력을 검증하기 위하여 14D6 0.05, 0.5, 5, 50, 500 또는 5000ng/ml와 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E) 12.5 또는 25ng/ml을 각각 동일한 용량으로 섞고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. HEK-Blue CD40L 세포를 10 (v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용해 필요량만큼 희석하고, 96 웰 플레이트에 8x104cells/180μl/웰씩 분주하였다.
상기 14D6와 재조합 인간 CD40L 단백질을 반응시킨 혼합물을 20μl/웰씩 상기 HEK-Blue CD40L 세포를 분주시킨 웰에 넣어준 다음 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 콴티블루용액을 새로운 96 웰 플레이트에 150μl/웰씩 분주하고, 상기 24시간 배양한 샘플을 해당 웰에 50μl/웰씩 첨가하였다. 37℃ 조건에서 30분 동안 반응시킨 후 655nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 8b에 나타내었다.
그 결과, 14D6 항체의 농도가 증가함에 따라 OD 값이 감소한 것을 확인하여, 14D6 처리 농도에 따라 기능차단이 이루어진 것을 확인하였고, 재조합 인간 CD40L 단백질을 12.5ng/ml의 농도로 사용하였을 경우, 항체농도 50ng/ml 이상에서부터, 재조합 인간 CD40L 단백질을 12.5ng/ml의 농도로 사용하였을 경우, 항체농도 500ng/ml 이상에서부터 완전하게 차단이 이루어진 것을 확인하였다 (도 8b).
실시예 3-3. 세포사이부착분자-1 (ICAM-1) 발현 여부를 이용한 분석
CD40과 CD40L가 상호작용할 경우 ICAM-1 발현이 증가하는데, 14D6을 처리하는 경우 CD40과 CD40L 상호작용 차단에 의한 ICAM-1 발현 수준 감소 여부를 확인하기 위해, 14D6 항체 처리 시 ICAM-1 발현 정도를 확인하기 위해 실험을 진행하였다.
구체적으로. 상기 실시예 1-2에서 준비한 CD40L 표면발현 CHO 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 2x104cells/100μl씩 분주하고, 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 각 웰마다 Ramos 세포 (ATCC, Virginia, USA)를 5x104cells/100μl씩 넣었다. 세포가 혼재된 웰에 14D6을 0.1, 0.2, 0.5, 1, 또는 2μg/50μl씩 넣고, 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 배양한 세포를 모두 모은 후, B세포 (Ramos 세포) 선별을 위한 CD19-PECy7 항체 (BD biosciences, New jersey, USA)와 세포사이부착분자-1 (intercellular adhesion molecule-1; ICAM-1) 검출을 위한 DNP007-FITC 항체 (Dinona, Seongnam-si, Korea) (대한민국 등록공보 제 10-2063341 호, 유럽 공개특허 EP 3909979 A1에서 제조된 항체)를 처리하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, 유세포분석기 (Stratedigm, California, USA)로 측정하였다. 음성대조군으로 상기 Ramos 세포를 단독으로 배양한 것, 양성대조군으로는 상기 CD40L 표면발현 CHO 세포에 Ramos 세포를 넣고 상기 14D6를 첨가하지 않고 배양한 것을 준비하였다. 상기 유세포 분석기로 측정하여, CD40L의 ICAM-1을 발현시키는 기능을 차단하는지 여부를 확인한 결과를 도 9a 내지 9d에 나타내었다. 도 9c의 dot plot은 상기 대조군의 발현 정도, 도 9d의 dot plot은 상기 14D6을 처리한 경우 농도 별 발현 정도를 나타낸다. 상기 도 9c의 blocking efficiency graph는 각 농도에 따른 blocking 비율을 하기 수학식 1에 의해 구하였다.
[수학식 1]
Blocking efficiency = 100% - (각 농도별 dot blot에서 1사분면에 위치한 점들의 비율 / 양성대조군의 dot blot에서 1사분면에 위치한 점들의 비율 (83.4%)) x 100%
(상기 각 농도별 dot blot에서 1사분면에 위치한 점들의 비율은 각 농도별 dot blot에 분포하고 있는 전체 점 대비 1사분면에 위치한 점들의 비율을 의미한다)
그 결과, 14D6 항체 농도가 증가함에 따라 차단이 일어나, ICAM-1 발현 수준이 감소하였으며, 0.5μg/test 이상의 농도에서는 포화상태의 결합으로 인해 ICAM-1이 거의 발현되지 않은 것을 확인하였다 (도 9a 내지 9d).
실시예 4. 14D6 마우스 항체와 키메릭 항체의 비교
실시예 4-1. 14D6 키메릭 항체 제작 및 서열 확인
상기 실시에 1-1에서 준비한 14D6을 생산하는 하이브리도마로부터 RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용해 RNA를 추출한 다음, 마우스 Ig-프라이머셋 (Novagen, Wisconsin, USA)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 통해 14D6의 가변부위 DNA를 확보하였고, 상기 중합효소연쇄반응은 PCR kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여, 95℃에서 5분동안 진행하고, 95℃ 60초, 60℃ 60초, 72℃ 60초의 3 step을 35 cycle로 진행하고, 72℃에서 5분동안 진행하는 조건으로 수행하였고, 사용된 프라이머 정보를 하기 표 2에 나타내었다.
명명 서열 프라이머명 서열번호
Primer_Heavy_Chain ACTAGTCGACATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT MuIgVH5’-D 12
Primer_Light_Chain ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT MuIgkVL5’-C 13
(상기 표 2에서 R은 A 또는 G, Y는 C 또는 T, K는 G 또는 T, S는 C 또는 G, M는 A 또는 C, W는 A 또는 T, D는 A 또는 G 또는 T, H는 A 또는 C 또는 T, V는 A, C 또는 G, B는 C, G 또는 T를 의미하고, 관련 내용은 상기 사용된 Ig-프라이머셋에 기재되어 있다)상기 DNA를 T벡터 (Promega, Madison, USA)에 삽입하고 형질전환한 후 코스모진텍 (Cosmogenetech, Seoul, Korea) 사에 의뢰하여, DNA 서열을 확인하였다. 상기 확인된 14D6의 가변부위 DNA를 코스모진텍 (Cosmogenetech, Seoul, Korea) 사에 의뢰하여 사람 항체 불변부위와 함께 합성하였고, 합성된 것을 제한효소 EcoRI, XhoI (Biolabs, Massachusetts, USA) 로 절단하여 원하는 부분의 DNA만 확보하였다. 이후 pcDNA3.4 발현벡터 (Invitrogen, Waltham, USA)에 삽입하고 형질전환한 후, 다시 한 번 14D6 유전자의 중쇄 가변영역 (서열번호 1 및 2) 및 14D6 경쇄 가변영역 (서열번호 3 및 4)의 DNA 서열을 확인하여 제대로 된 키메릭항체가 제작되었는지 확인하였고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 10에 나타내었다.
명명 서열 서열번호
14D6-VH-CDR1-Amino_Acid GYTFTRYY 1
14D6-VH-CDR2-Amino_Acid INPTNGDT 2
14D6-VH-CDR3-Amino_Acid TRPLGSRDAMDY 3
14D6-VL-CDR1-Amino_Acid QSVSSSRYSY 4
14D6-VL-CDR2-Amino_Acid YAS 5
14D6-VL-CDR3-Amino_Acid QHSWELPWT 6
14D6-VH-Amino_Acid QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKAS GYTFTRYY MFWVKQRPGQGLEWIGE INPTNGDT NFNEEFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC TRPLGSRDAMDY WGPGTSVTVSS 7
14D6-VL-Amino_Acid DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS QSVSSSRYSY MHWYQQKPGQPPKLLIK YAS SLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEGEDTATYYC QHSWELPWT FGGGTKLEIK 8
14D6-VH-Gene caggtgcagcttcaacaaagtggtgccgaattggtgaaacccggggccagcgtgaagttgtcctgcaaagcaagtggttatacttttactcgatattatatgttctgggttaagcaacgtccaggtcaagggctggaatggatcggcgaaattaaccctacaaacggagataccaactttaacgaagagttcaaaagtaaggccactttgacagtcgacaagagtagcagtaccgcatacatgcagttgtctagcctcacaagcgaggattccgctgtgtattattgcacacgccctttgggctcacgcgatgcaatggattactggggtccagggacatctgtcactgtgtcttca 9
14D6-VL-Gene gacatagtactgacacaaagccctgcatcactggcagtctctctcgggcagcgagctactatatcatgccgcgcttcacagagtgtctcaagctccagatatagctatatgcactggtaccaacaaaagcctgggcagccaccaaaattgttgattaaatatgcctcttccctggaaagtggagttcccgcaagatttagcgggagcgggtctgggaccgactttacattgaatatacacccagtcgaaggtgaggacacagccacatattactgccaacattcatgggagttgccctggactttcggaggaggaactaagctcgaaataaaa 10
(상기 표 3에서 Amino_Acid는 아미노산 서열을 의미하고, Gene은 코딩 핵산 서열을 의미하고, 밑줄 친 굵은 글씨 는 각 서열의 CDR 부위를 의미한다)
실시예 4-2. 14D6 마우스항체와 키메릭항체의 기능 비교
ExpiCHO-S 세포 (Gibco, Texas, USA)를 6mM 글루타맥스 (Glutamax, Gibco, Texas, USA)가 첨가된 BalanCD 배지 (Irvine scientific, California, USA)를 이용해 배양하고, 250ml 플라스크에 6x108개/100ml가 되도록 준비하여 125rpm, 37℃, 8% CO2 세포배양기에서 5분간 안정화시켰다. 상기 실시예 4-1에서 준비한 키메릭항체의 DNA의 경쇄부분 66μg, 중쇄부분 34μg을 OptiPRO 배지 (Gibco, Texas, USA) 2ml에, ExpiFectamine CHO 용액 (Gibco, Texas, USA) 320μl를 OptiPRO 배지 3.7ml에 넣고 혼합하였다. 상기 DNA 혼합물과 ExpiFectamine CHO 용액 혼합물을 섞고, 상온에서 2분 동안 반응시켰다. 이후 해당 반응물을 상기 ExpiCHO-S 세포에 천천히 떨어뜨린 다음 125rpm, 37℃, 8% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 24시간 후, ExpiCHO 피드 (Gibco, Texas, USA) 24ml와 ExpiCHO 인핸서 (Gibco, Texas, USA) 600μl를 잘 섞은 후, 세포생존율이 70% 이하가 될 때까지 125rpm, 37℃, 8% CO2 세포배양기에서 배양하여 키메릭 항체 14D6을 생산하였다. CD40L을 세포표면에 발현하는 CHO 세포주에 음성 대조군으로, 1x PBS 또는 상기 ExpiCHO-S에서 생산한 14D6 키메릭 항체가 포함된 배양액을 각각 100ul씩 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, 결합여부를 확인하기 위해 염소 항-인간Ig-FITC 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 넣었다. 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후 PBS 2ml을 이용해 상기 실시예 1-1와 실질적으로 동일한 방법으로 세척한 다음 유세포분석기로 측정하여 배양액 내의 14D6 키메릭항체가 CD40L과 결합하는지 확인하였고, 그 결과를 도 11a 및 도 11b에 나타내었다. 키메릭항체는 반응물 대신 1x PBS를 처리한 음성 대조군과 비교하였을 때, CD40L에 더 잘 결합하는 것을 확인하였으며 (도 11a), 14D6 마우스항체 비교하였을 때 유사한 정도로 결합한 것을 확인하였다 (도 11b).
추가적으로, 14D6 키메릭항체와 마우스항체가 동일한 결합 부위를 인지하는지 확인하고자 두 가지 항체를 함께 처리하여 차단효과를 검증하였다. 구체적으로, 마우스항체를 먼저 처리하고 키메릭항체를 처리하거나, 키메릭항체를 먼저 처리하고 마우스항체를 처리하는 방식으로 차단효과를 확인하였다. 그 중, 마우스항체를 먼저 처리하고 키메릭항체를 처리하고 PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 세척한 후, 차단효과를 상기 유세포 분석기로 분석하여 확인하였고, 그 결과를 도 11c에 나타내었다. 그 결과, 상기 두 가지 경우에서 모두 결합능력이 저하되는 것을 확인할 수 있었고, 14D6 키메릭항체와 마우스항체가 동일한 결합 부위를 인지한다는 것을 확인하였다.
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Claims (14)

  1. 다음의 상보성 결정부위 (complementarity determining region; CDRs)를 포함하는, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2,
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
    을 포함하는, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항 CD40L 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체인, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 CD40L 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 또는 제2항의 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 T-세포 매개성 면역 질환은 이식거부, 이식편대 숙주질환, 천식, 또는 자가면역질환인, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 자가면역질환은 뇌척수염, 류마티스 관절염, 전신홍반성 낭창, 아토피 피부염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결정성 다발동맥염, 기쿠치병, 교원병, 하시모코 갑상선염, 건선, 백반증, 갑상선 기능 항진증, 섬유근육통, 원형탈모, 알러지, 포도막염 또는 자가면역 용혈성 빈혈인, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 서열번호 1 내지 6 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 암호화하는, 핵산 분자.
  9. 서열번호 7의 아미노산 서열;
    서열번호 8의 아미노산 서열; 또는
    이들 모두를 암호화하는, 핵산 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    서열번호 9의 핵산 서열;
    서열번호 10의 핵산 서열; 또는
    이들 모두를 포함하는, 핵산분자.
  11. 제8항 또는 제10항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터.
  12. 제11항의 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 세포.
  13. 제12항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  14. 제1항 또는 제2항의 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, CD40L 검출용 조성물.
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