KR20230108156A

KR20230108156A - Antibody specifically binding to CD40L and use thereof

Info

Publication number: KR20230108156A
Application number: KR1020220003604A
Authority: KR
Inventors: 김나혜; 최다빈; 임영훈; 이의섭; 지길용
Original assignee: 주식회사 금호에이치티
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2023-07-18
Also published as: WO2023132719A1

Abstract

본 명세서는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 이를 포함하는 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물 및/또는 CD40L 검출용 조성물을 제공하고, The present specification provides an anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof and a pharmaceutical composition for preventing and/or treating T-cell mediated immune diseases comprising the same and/or a composition for detecting CD40L,

Description

CD40L에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도{Antibody specifically binding to CD40L and use thereof}Antibody specifically binding to CD40L and use thereof {Antibody specifically binding to CD40L and use thereof}

CD40L에 특이적으로 결합하는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 용도와 관련된 것으로, 구체적으로, 항 CD40L 항체 ALC/또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항체 ALC/또는 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 및 T-세포 매개성 면역질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.Anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD40L, and related to its use, specifically, anti-CD40L antibody ALC / or antigen-binding fragment thereof, and the antibody ALC / or antigen-binding fragment as an active ingredient It relates to a pharmaceutical composition for preventing and/or treating a T-cell mediated immune disease comprising the present invention.

림프구의 활성화는 적응면역에 있어서 가장 중요한 요소이다. T세포의 경우 두 가지의 세포 내 신호를 바탕으로 활성화되는데 첫 번째는 항원 특이 신호로서 항원제시세포 (antigen presenting cells, APC)의 주조직적합복합체 (major histocompatibility complex, MHC)에서 항원이 T세포에게 적절하게 제시될 때 항원 특이 T세포 표면 수용체 (T-cell surface receptor, TCR)를 통해 전달된다. APC는 항원 제시자일 뿐만 아니라 두 번째 신호를 제공하는데, 두 번째 신호는 생산적인 T세포 활성화에 필요하며 해당 과정을 공동 자극이라고 한다. 공동자극신호 없이 TCR 단독 자극으로는 T세포를 증식시킬 수 없고, 종종 세포자멸사 (apoptosis)를 겪으며, 사이토카인을 생성하지 못하는 등 생산적인 T세포 활성화로 이어지지 않는다. 공동자극은 T세포의 분화 및 증식을 유도하고, 세포사이협력을 가능하게 하는 등의 역할을 수행하기도 하지만, 불필요한 림프구의 활성화를 방지하는 등 면역체계에서의 안전장치 역할도 수행한다. 해당 역할이 제대로 이루어지지 않을 경우 인체의 면역체계가 비정상적인 면역 활성을 유도하게 되어 자가면역질환이 발생할 수 있다. 공동자극신호는 T세포와 APC 사이의 세포표면분자의 여러 수용체와 리간드 (ligand, L)쌍의 상호작용을 통해 전달하며 PD1-PDL1, CD40-CD40L, LFA-1-ICAM-1 등 다양한 수용체-리간드 쌍의 예가 있다. 현재 니볼루맙 (nivolumab), 아테졸리주맙 (atezolizumab)을 비롯한 PD1-PDL1 표적치료제가 가장 많이 승인된 상태이며, LFA-1 표적치료제는 이식, 염증 및 자가면역질환에 있어서 연구 중에 있다. 에팔리주맙 (efalizumab)이 대표적이다.Activation of lymphocytes is the most important factor in adaptive immunity. In the case of T cells, they are activated based on two intracellular signals. The first is an antigen-specific signal, in which antigens are transmitted to T cells in the major histocompatibility complex (MHC) of antigen presenting cells (APC). When presented appropriately, it is delivered via an antigen-specific T-cell surface receptor (TCR). APCs are not only antigen presenters, but also provide a second signal, which is required for productive T-cell activation, a process called co-stimulation. Stimulation of TCR alone without co-stimulatory signals does not lead to productive T-cell activation, such as T cells that cannot proliferate, often undergo apoptosis, and do not produce cytokines. Co-stimulation not only induces differentiation and proliferation of T cells and enables cooperation between cells, but also serves as a safety device in the immune system, such as preventing unnecessary activation of lymphocytes. If this role is not performed properly, the body's immune system induces abnormal immune activity, which can lead to autoimmune diseases. Co-stimulatory signals are transmitted through the interaction of various receptors and ligand (L) pairs of cell surface molecules between T cells and APCs, and various receptors such as PD1-PDL1, CD40-CD40L, and LFA-1-ICAM-1 There are examples of ligand pairs. Currently, PD1-PDL1-targeted therapies, including nivolumab and atezolizumab, are the most approved, and LFA-1-targeted therapies are under study for transplantation, inflammation, and autoimmune diseases. Efalizumab is a typical example.

CD40L에 대한 신호전달체계는 다음과 같다. T세포가 APC를 인지하면 공동자극신호에 관여하는 CD40L 발현을 유도하며, 다양한 사이토카인 신호들을 바탕으로 상향 조절된다. 이렇게 발현된 CD40L은 APC에 존재하는 CD40과 결합하여 APC 활성화를 유도하고, 이로 인하여 APC에서는 다른 공동자극인자인 B7을 발현하거나 IL-12와 같은 사이토카인을 분비하기도 한다. 앞서 일련의 과정들을 통해 T세포는 더욱 증식 및 분화하게 되며, 감염 및 조직손상 부위로의 이동에 관여하는 ICAM-1, VCAM-1, E-셀렉틴, P-셀렉틴 등의 접착분자 발현을 증가시키게 된다. CD40에 의해 생성된 신호는 세포 유형에 따라 다르며, 유사 분열촉진제활성 단백질 인산화효소 (mitogen-activated protein kinase) 경로 및 NF-κB의 활성화를 포함한다. The signaling pathway for CD40L is as follows. When T cells recognize APC, they induce CD40L expression, which is involved in costimulatory signals, and is upregulated based on various cytokine signals. The thus-expressed CD40L binds to CD40 present in APC and induces APC activation, whereby APC expresses another co-stimulatory factor, B7, or secretes cytokines such as IL-12. Through the above series of processes, T cells further proliferate and differentiate, and increase the expression of adhesion molecules such as ICAM-1, VCAM-1, E-selectin, and P-selectin, which are involved in migration to areas of infection and tissue damage. do. Signals generated by CD40 are cell type specific and include activation of the mitogen-activated protein kinase pathway and NF-κB.

CD40-CD40L 신호전달은 내피세포, 상피세포, 섬유모세포 및 신경세포를 포함한 비조혈세포에 대한 세포반응에도 영향을 미치며, 비만세포, 자연살해세포 등의 다양한 세포에서도 발현되기 때문에 그 영향력이 광범위하다고 볼 수 있다. 따라서, 자가면역질환 및 만성염증성질환 등이 발생하지 않도록 적절한 면역반응이 유지되어야하며, 해당 신호전달이 엄격하게 조절되어야 한다. 다양한 자가면역질환에 대한 치료적 접근으로 면역활성에 작용하는 면역세포를 제거하거나 면역 활성에 작용하는 주요 세포사이 또는 단백질사이상호작용을 차단하는 방법 등을 사용할 수 있으며, CD40-CD40L 상호작용을 차단하는 것 역시 비정상면역활성 차단의 주요한 수단이 될 수 있어, 이에 대한 연구가 필요한 실정이다. CD40-CD40L signaling also affects cellular responses to non-hematopoietic cells, including endothelial cells, epithelial cells, fibroblasts and neurons, and is expressed in various cells such as mast cells and natural killer cells, so its influence is broad. can see. Therefore, an appropriate immune response must be maintained so that autoimmune diseases and chronic inflammatory diseases do not occur, and the corresponding signal transduction must be strictly regulated. As a therapeutic approach to various autoimmune diseases, methods such as removing immune cells acting on immune activation or blocking interactions between major cells or proteins acting on immune activation can be used, and blocking the CD40-CD40L interaction It can also be a major means of blocking abnormal immune activity, and research on this is needed.

본 명세서의 일 예는 CD40L을 특이적으로 인식 및/또는 결합하는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.An example of the present specification provides an anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes and/or binds to CD40L.

상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, The anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof,

서열번호 1 (GYTFTRYY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 2 (INPTNGDT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및/또는 서열번호 3 (TRPLGSRDAMDY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위 (Complementarity Determining Regions; CDRs) 및/또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및/또는A polypeptide (CDR-H1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (GYTFTRYY), a polypeptide (CDR-H2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (INPTNGDT), and/or SEQ ID NO: 3 (TRPLGSRDAMDY) heavy chain complementarity determining regions (CDRs) comprising a polypeptide (CDR-H3) comprising an amino acid sequence and/or a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining region; and/or

서열번호 4 (QSVSSSRYSY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1), 서열번호 5 (YAS)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및/또는 서열번호 6 (QHSWELPWTF)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성결정부위 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역A polypeptide (CDR-L1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (QSVSSSRYSY), a polypeptide (CDR-L2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (YAS), and/or SEQ ID NO: 6 (QHSWELPWTF) A light chain complementarity determining region comprising a polypeptide (CDR-L3) comprising an amino acid sequence or a light chain variable region comprising the light chain complementarity determining region

을 포함할 수 있다.can include

일 구체예에서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.In one embodiment, the heavy chain variable region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and the light chain variable region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.

상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 등), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체), 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있고, 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론 항체일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The antibody may be an animal antibody (eg, mouse antibody, etc.), a chimeric antibody (eg, mouse-human chimeric antibody), a humanized antibody, or a human antibody, and the antibody may be a monoclonal or polyclonal antibody, It is not limited thereto.

상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.The antigen-binding fragment may be scFv, (scFv)2, Fab, Fab' or F(ab')2, but is not limited thereto.

다른 예는 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.Another example provides a nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of an anti-CD40L antibody.

다른 예는 항 CD40L 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.Another example provides a nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of an anti-CD40L antibody.

보다 구체적으로, 서열번호 1 내지 6 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 암호화하는, 핵산 분자를 제공한다.More specifically, a nucleic acid molecule encoding at least one amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 6 is provided.

다른 예는Another example is

서열번호 7의 아미노산 서열;the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7;

서열번호 8의 아미노산 서열; 또는the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; or

이들 모두를 암호화하는, 핵산 분자를 제공한다.Nucleic acid molecules that encode all of these are provided.

상기 핵산 분자는The nucleic acid molecule is

서열번호 9의 핵산 서열;the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9;

서열번호 10의 핵산 서열; 또는the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 10; or

이들 모두를 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.It may include all of these, but is not limited thereto.

다른 예는 상기 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.Another example provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule.

일 예에서, 상기 재조합 벡터는 상기 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항 CD40L 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 것일 수 있다.In one example, the recombinant vector includes a nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-CD40L antibody and a nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of the anti-CD40L antibody. The vector of may be included together or included in separate vectors.

상기 재조합 벡터는 상기 핵산 분자를 적절한 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있다.The recombinant vector may be an expression vector for expressing the nucleic acid molecule in an appropriate host cell.

다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.Another example provides a recombinant cell containing the recombinant vector.

다른 예는 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 질병은 T-세포 매개성 면역 질환일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing and/or treating diseases comprising the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient. The disease may be a T-cell mediated immune disease, but is not limited thereto.

다른 예는 상기 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.Another example is a treatment of T-cell mediated immune disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of the CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of T-cell mediated immune disease. Prophylactic and/or therapeutic methods are provided. The treatment method may further include, prior to the administering step, identifying a subject in need of prevention and/or treatment of a T-cell mediated immune disease, but is not limited thereto.

다른 예는 상기 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료, 또는 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.Another example is use of the CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention and/or treatment of T-cell mediated immune diseases, or for the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of T-cell mediated immune diseases. provides

상기 약학 조성물, 방법 및 용도에 있어서, T-세포 매개성 면역 질환은 이식거부, 이식편대숙주질환, 천식, 자가면역질환 등에서 선택된 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.In the pharmaceutical composition, method, and use, the T-cell-mediated immune disease may be one selected from transplant rejection, graft-versus-host disease, asthma, autoimmune disease, and the like, but is not limited thereto.

본 발명자는 CD40L에 결합하여 CD40-CD40L 상호작용을 차단하는 항체를 개발하여, 면역차단효과를 검증하였다.The present inventors developed an antibody that blocks the CD40-CD40L interaction by binding to CD40L, and verified the immunoblocking effect.

이에, 본 명세서에서는 CD40L을 특이적으로 인식하는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이들의 용도가 제공된다.Accordingly, in the present specification, anti-CD40L antibodies or antigen-binding fragments thereof that specifically recognize CD40L and uses thereof are provided.

상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40L에 대하여 억제 활성을 갖는 길항제 (antagonist)일 수 있다. 이는 상기 항체가 CD40L을 발현하는 세포에 특이결합능력, 농도 의존결합능력, 구조결합능력, 및/또는 기능결합능력을 가지고, 상기 항체 처리 시, CD40L과 CD40의 결합이 차단, CD40 및 CD40L 상호작용에 의해 활성화되는 HEK-Blue CD40L 세포의 기능이 차단되고, ICAM-1 발현이 되지 않은 등의 하기 실시예 결과를 통해 확인될 수 있다.The anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof may be an antagonist having inhibitory activity against CD40L. This is because the antibody has specific binding ability, concentration dependent binding ability, structural binding ability, and/or functional binding ability to cells expressing CD40L, and when the antibody is treated, the binding between CD40L and CD40 is blocked, and the interaction between CD40 and CD40L The function of HEK-Blue CD40L cells activated by was blocked, and ICAM-1 expression was not expressed through the following example results.

본 명세서에서 “CD40L (Accession Number: NM_000074, NP_000065 (인간), NM_011616, NP_035746 (마우스))” 은 CD154 또는 CD40 리간드라고도 불리며, 활성화된 T세포에 일차적으로 발현되는 단백질이고, TNF 분자 중 하나이다. 이것은 항원전달세포 (APC)위의 CD40에 결합하여 표적 세포의 종류에 의존하는 많은 효과들을 유도한다.In the present specification, “CD40L (Accession Number: NM_000074, NP_000065 (human), NM_011616, NP_035746 (mouse))”, also called CD154 or CD40 ligand, is a protein primarily expressed in activated T cells and is one of the TNF molecules. It binds to CD40 on antigen presenting cells (APCs) and induces a number of effects that depend on the type of target cell.

본 명세서에서 “CD40 (Cluster of differentiation 40) (Accession Number: NM_001250, NM_001302753, NM_152854, NM_001322421, NM_001322422, NP_001241, NP_001289682, NP_001309350, NP_001309351, NP_690593, NM_001362758, NP_001349687 (인간), NM_011611, NM_170702, NM_170703, NM_170704, NP_035741, NP_733803, NP_733804, NP_733805 (마우스))”은 antigen-presenting cells에서 발견되는 공동 자극 단백질로, antigen-presenting cells 활성화에 필요하다. TH 세포의 CD40L이 CD40에 결합하면 antigen-presenting cells이 활성화되고 다양한 다운스트림 효과가 유도된다.In this specification, “CD40 (Cluster of differentiation 40) (Accession Number: NM_001250, NM_001302753, NM_152854, NM_001322421, NM_001322422, NP_001241, NP_001289682, NP_001309350, NP_001 309351, NP_690593, NM_001362758, NP_001349687 (Human), NM_011611, NM_170702, NM_170703, NM_170704, NP_035741, NP_733803, NP_733804, NP_733805 (mouse)” are co-stimulatory proteins found in antigen-presenting cells and are required for activation of antigen-presenting cells. When CD40L of TH cells binds to CD40, antigen-presenting cells are activated and various downstream effects are induced.

본 명세서에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 CD40L은 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대 인간 CD40L (예컨대, 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E)) 일 수 있다. CD40L serving as an antigen of the antibody provided herein may be of mammalian origin, such as human CD40L (e.g., recombinant human CD40L protein (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E) )) can be

본 명세서에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질 또는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로, 상기 물질 또는 단백질을 기초로 재조합적 또는 합성적으로 생산된 단백질도 포함하는 개념으로 사용된다. 일 예에서, 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체 등), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체), 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론 항체일 수 있다.As used herein, "antibody" refers to a substance produced by stimulation of an antigen in the immune system or a protein that specifically binds to a specific antigen, and is recombinantly or synthetically produced based on the substance or protein. It is also used as a concept that includes proteins that have been modified. In one example, the antibody may be non-naturally occurring, such as recombinantly or synthetically produced. The antibody may be an animal antibody (eg, mouse antibody, etc.), a chimeric antibody (eg, mouse-human chimeric antibody), a humanized antibody, or a human antibody. The antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.

또한 본 명세서에서 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유하는 항체의 모든 단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.Also, in the present specification, an antibody may be understood to include all fragments of an antibody having antigen-binding ability, unless otherwise specified.

본 명세서에서 “상보성 결정부위 (Complementarity-determining regions, CDR)”는 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 항체 단편일 수 있다.In the present specification, “complementarity-determining regions (CDRs)” refers to regions that impart binding specificity to an antigen among the variable regions of an antibody. The antigen-binding fragment of the antibody described above may be an antibody fragment containing at least one complementarity determining region.

본 명세서의 일 예는 CD40L을 특이적으로 인식 또는 CD40L에 특이적으로 결합하는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.One example of the present specification provides an anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes or binds to CD40L specifically.

상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,The anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof,

서열번호 1 (GYTFTRYY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1), 서열번호 2 (INPTNGDT)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2), 및/또는 서열번호 3 (TRPLGSRDAMDY)의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위 (Complementarity DeterminingRegions; CDRs) 및/또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및/또는A polypeptide (CDR-H1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (GYTFTRYY), a polypeptide (CDR-H2) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (INPTNGDT), and/or SEQ ID NO: 3 (TRPLGSRDAMDY) heavy chain complementarity determining regions (CDRs) comprising a polypeptide (CDR-H3) comprising an amino acid sequence and/or a heavy chain variable region comprising the heavy chain complementarity determining region; and/or

을 포함할 수 있다.can include

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체 (chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입 (anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입 (anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체 (humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR (complementarity determining regions) 부위를 인간 항체 골격 (framework)에 이식하여 제작된다.Animal-derived antibodies produced by immunizing an animal to be immunized with a desired antigen may generally cause immune rejection when administered to humans for therapeutic purposes, and chimeric antibodies have been developed to suppress such immune rejection. A chimeric antibody is obtained by substituting the constant region of an animal-derived antibody, which causes an anti-isotype reaction, with the constant region of a human antibody using a genetic engineering method. Compared to animal-derived antibodies, chimeric antibodies have improved significantly in anti-isotype response, but animal-derived amino acids are still present in the variable region, resulting in potential anti-idiotypic side effects. are doing What was developed to improve these side effects is a humanized antibody. It is produced by transplanting complementarity determining regions (CDRs), which play an important role in antigen binding, among the variable regions of a chimeric antibody to a human antibody framework.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식 (grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조 (crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등을 활용할 수 있다.The most important thing in the CDR grafting technology for producing humanized antibodies is to select an optimized human antibody that can best accept the CDR region of an animal-derived antibody. structure analysis, molecular modeling techniques, etc. can be used.

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 동물 항체 (예컨대, 마우스 항체), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체) 또는 인간화 항체일 수 있다.According to one embodiment, the antibody may be an animal antibody (eg, mouse antibody), a chimeric antibody (eg, mouse-human chimeric antibody) or a humanized antibody.

상기 항체 또는 항원 결합 단편에 있어서, 서열번호 1 내지 3의 중쇄 CDR을 제외한 중쇄 프레임워크 및/또는 중쇄 불변영역은 면역글로불린 (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 등), IgM, IgA, IgD, 또는 IgE), 예컨대, 인간 면역글로불린 (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 등), IgM, IgA, IgD, 또는 IgE)으로부터 유래한 중쇄 프레임워크 및/또는 중쇄 불변영역일 수 있고, 서열번호 4 내지 6의 경쇄 CDR을 제외한 경쇄 프레임워크 및/또는 경쇄 불변영역은 카파 (κ) 또는 람다 (λ) 타입의 경쇄 프레임워크 및/또는 경쇄 불변영역일 수 있다.In the antibody or antigen-binding fragment, the heavy chain framework and / or heavy chain constant region, except for the heavy chain CDRs of SEQ ID NOs: 1 to 3, is an immunoglobulin (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.), IgM, IgA, IgD , or IgE), such as human immunoglobulin (IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, etc.), IgM, IgA, IgD, or IgE) heavy chain framework and / or heavy chain constant region, sequence Except for the light chain CDRs of numbers 4 to 6, the light chain framework and/or light chain constant region may be a kappa (κ) or lambda (λ) type light chain framework and/or light chain constant region.

완전한 항체는 2개의 전장 (full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마 (ν), 뮤 (μ), 알파 (α), 델타 (δ) 및 엡실론 (ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1 (ν1), 감마2 (ν2), 감마3 (ν3), 감마4 (ν4), 알파1 (α1) 및 알파2 (α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파 (κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.A complete antibody has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to the heavy chain by a disulfide bond. The antibody constant region is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma (ν), mu (μ), alpha (α), delta (δ), and epsilon (ε) types, subclasses has gamma1 (ν1), gamma2 (ν2), gamma3 (ν3), gamma4 (ν4), alpha1 (α1) and alpha2 (α2). The constant regions of light chains are of the kappa (κ) and lambda (λ) types.

본 명세서에서 용어, "중쇄 (heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지 (hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.As used herein, the term "heavy chain" refers to a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having a variable region sequence sufficient to impart specificity to an antigen and a hinge with three constant region domains CH1, CH2 and CH3. ) It is interpreted as meaning including both full-length heavy chains and fragments thereof.

또한, 본 명세서에서 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.In addition, the term "light chain" as used herein refers to a full-length light chain comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to impart specificity to an antigen, and fragments thereof. interpreted in an all-inclusive sense.

본 명세서에서 용어, "CDR (complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.As used herein, the term "complementarity determining region (CDR)" refers to the amino acid sequence of the hypervariable region of the heavy and light chains of immunoglobulin. Heavy and light chains may each contain three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3). The CDRs may provide key contact residues for antibody binding to an antigen or epitope. On the other hand, in the present specification, the term "specifically binding" or "specifically recognizing" has the same meaning as commonly known to those skilled in the art, and an immunological reaction by specifically interacting with an antigen and an antibody. means that

본 명세서에서 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분, 예컨대, CDR을 포함하는 항체의 일부를 의미한다. 예를 들어, 항체의 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있다.As used herein, the term "antigen-binding fragment" refers to a fragment of the entire structure of an immunoglobulin, and refers to a portion of an antibody that includes an antigen-binding portion, for example, a CDR. For example, an antigen-binding fragment of an antibody can be a scFv, (scFv)2, Fab, Fab' or F(ab')2.

Fab은 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역 (CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역 (hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중가닥 Fv (two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단일가닥 Fv (single-chain Fv; scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.Fab has a structure that has variable regions of light and heavy chains, constant regions of light chains, and the first constant region (CH1) of heavy chains, and has one antigen binding site. Fab' differs from Fab in that it has a hinge region containing one or more cysteine residues at the C-terminus of the heavy chain CH1 domain. An F(ab')2 antibody is produced by forming a disulfide bond between cysteine residues in the hinge region of Fab'. Fv is a minimal antibody fragment having only a heavy chain variable region and a light chain variable region, and a recombination technique for producing an Fv fragment is widely known in the art. In double-stranded Fv (two-chain Fv), the heavy chain variable region and light chain variable region are linked by non-covalent bonds, and in single-chain Fv (scFv), the heavy chain variable region and short chain are generally linked through a peptide linker. Since the variable regions are covalently linked or directly linked at the C-terminus, a dimer-like structure can be achieved, such as a double-chain Fv. The antigen-binding fragment can be obtained using a proteolytic enzyme (for example, Fab can be obtained by restriction digestion of whole antibody with papain, and F(ab')2 fragment can be obtained by digestion with pepsin), It can be produced through genetic recombination technology.

본 명세서에서 용어 "힌지 영역 (hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성 (flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.As used herein, the term "hinge region" refers to a region included in the heavy chain of an antibody, present between the CH1 and CH2 regions, and a region that functions to provide flexibility of the antigen binding site in the antibody. it means.

상기 항 CD40L　항체는 단클론항체일 수 있다. 단클론항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을 이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 CD40L 항체는 이용해서 통상의 방법에 의하여 동물 (예컨대, 마우스) 유래의 단클론항체로 제조될 수 있다.The anti-CD40L antibody may be a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies can be prepared by methods well known in the art. For example, it may be manufactured using a phage display technique. Alternatively, an anti-CD40L antibody can be used and prepared as a monoclonal antibody derived from an animal (eg, mouse) by a conventional method.

한편, 전형적인 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 CD40L과의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA (Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석 또는 세포-기반 분석 (cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 CD40L에 대한 각각의 친화도 (Kd values)를 검정할 수 있다.Meanwhile, individual monoclonal antibodies may be screened based on their binding ability to CD40L using a typical ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) format. Inhibitory activity can be assayed through functional assays such as competitive ELISA or cell-based assays for assaying molecular interactions of the conjugates. Then, each affinity (Kd values) for CD40L can be assayed for the selected monoclonal antibody members based on their strong inhibitory activity.

또한, 유세포 분석을 통해서 상기 항체가 CD40L에 특이적으로 결합하는 특이결합능력을 가지고, 상기 유세포 분석 및 ELISA 분석을 통해 농도 의존적으로 결합하는 농도 의존결합능력을 가지고, 웨스턴블롯 분석을 통해 CD40L 구조와 상관없이 CD40L 특정 부위를 인지하여 14D6가 결합하는 구조결합능력을 가지고, 인간 말초혈액단핵세포 분석을 통해 발현된 CD40L을 14D6이 인지하는 등 기능결합능력을 가지는 것을 확인할 수 있다. 유세포 분석을 통해 상기 항체가 농도 의존적으로 CD40L과 CD40의 결합을 차단하는 농도 의존차단능력을 가지고, HEK-blue CD40L 세포 분석을 통해 농도 의존적으로 기능 차단이 이루어진 것을 확인하였고, 상기 항체가 세포사이부착분자-1 (ICAM-1) 발현을 감소시켜, 기능차단능력이 있는 것을 확인할 수 있다.In addition, the antibody has a specific binding ability to specifically bind to CD40L through flow cytometry, and has a concentration-dependent binding ability to bind in a concentration-dependent manner through the flow cytometry and ELISA analysis, and the CD40L structure and Regardless, it can be confirmed that 14D6 has structural binding ability by recognizing a specific site of CD40L and has functional binding ability, such as recognizing CD40L expressed by 14D6 through analysis of human peripheral blood mononuclear cells. Through flow cytometry, it was confirmed that the antibody has a concentration-dependent blocking ability to block the binding of CD40L and CD40 in a concentration-dependent manner, and that the function was blocked in a concentration-dependent manner through HEK-blue CD40L cell analysis, and the antibody adheres between cells. It can be confirmed that the molecule-1 (ICAM-1) expression is reduced to have a function-blocking ability.

다른 예는 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 질병은 T-세포 매개성 면역 질환일 수 있다. 다른 예는 상기 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예는 상기 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료, 또는 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing and/or treating diseases comprising the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient. The disease may be a T-cell mediated immune disease. Another example is a treatment of T-cell mediated immune disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of the CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of prevention and/or treatment of T-cell mediated immune disease. Prophylactic and/or therapeutic methods are provided. The method, prior to the administering step, may further include identifying a subject in need of prevention and/or treatment of T-cell mediated immune disease. Another example is use of the CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof for the prevention and/or treatment of T-cell mediated immune diseases, or for the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and/or treatment of T-cell mediated immune diseases. provides

상기 약학 조성물, 방법 및 용도에 있어서, T-세포 매개성 면역 질환은 이식거부, 이식편 대 숙주 질환, 천식, 자가면역질환 (예컨대, 뇌척수염 (예컨대, 알러지성 뇌척수염), 류마티스 관절염, 전신홍반성 낭창 (루프스), 아토피 피부염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결정성 다발동맥염, 기쿠치병, 교원병, 하시모코 갑상선염, 건선, 백반증, 갑상선 기능 항진증, 섬유근육통, 원형탈모, 알러지, 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈 등) 등에서 선택된 것일 수 있다.In the pharmaceutical composition, method and use, the T-cell mediated immune disease is transplant rejection, graft versus host disease, asthma, autoimmune disease (eg, encephalomyelitis (eg, allergic encephalomyelitis), rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus ( lupus), atopic dermatitis, multiple sclerosis, type 1 diabetes, Crohn's disease, ulcerative colitis, Behçet's disease, Sjogren's syndrome, myasthenia gravis, scleroderma, polyarteritis crystallosis, Kikuchi disease, collagen disease, Hashimoko's thyroiditis, psoriasis, vitiligo, thyroid hyperfunction, fibromyalgia, alopecia areata, allergy, uveitis, autoimmune hemolytic anemia, etc.).

다른 예는 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 수지상 세포의 분화 및 기능의 조절을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 다른 예는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 수지상 세포의 분화 및/또는 기능의 조절 또는 수지상 세포의 분화 및/또는 기능을 조절하기 위한 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.Another embodiment provides a pharmaceutical composition for regulating the differentiation and/or function of dendritic cells, comprising the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient. Another embodiment provides a method for regulating the differentiation and/or function of dendritic cells comprising administering a pharmaceutically effective amount of an anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof to a subject in need of regulating the differentiation and function of dendritic cells. do. Another embodiment provides the use of an anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof for use in the regulation of dendritic cell differentiation and/or function or in the preparation of a pharmaceutical composition for regulating dendritic cell differentiation and/or function.

상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 트레할로스, 알르기니, 히스티딘, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier. The pharmaceutically acceptable carriers are commonly used in the formulation of drugs, and include lactose, dextrose, sucrose, trehalose, algini, histidine, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, 1 selected from the group consisting of calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc. It may be more than one species, but is not limited thereto. The pharmaceutical composition may further include at least one selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, which are commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.

상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 또는 병변부위 국소 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.An effective amount of the pharmaceutical composition or the antibody or antigen-binding fragment thereof may be administered orally or parenterally. In the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, or local administration to the lesion site may be administered. When administered orally, since the protein or peptide is digested, the oral composition may be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach. In addition, the composition may be administered by any device capable of transporting an active substance to a target cell.

본 명세서의 “약학적 유효량”은 소망하는 약리적 효과를 나타낼 수 있는 유효 성분 (즉, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편)의 함량 또는 투여량을 의미하는 것일 수 있으며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 정해질 수 있다.The term "pharmaceutically effective amount" as used herein may mean the content or dosage of an active ingredient (ie, anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof) capable of exhibiting a desired pharmacological effect, and includes a formulation method, administration method, patient It can be variously determined by factors such as age, weight, sex, medical condition, food, administration time, administration interval, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity.

상기 약학 조성물 내의 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량 또는 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000 mg/kg, 구체적으로 0.01 내지 100 mg/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 mg/kg, 더욱 구체적으로 0.1 내지 20 mg/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.The content of the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof or the dosage of the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof in the pharmaceutical composition depends on the formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, medical condition, food, administration time, administration It can be prescribed in various ways depending on factors such as interval, administration route, excretion rate and response sensitivity. For example, the daily dose of the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof is 0.001 to 1000 mg/kg, specifically 0.01 to 100 mg/kg, more specifically 0.1 to 50 mg/kg, and more specifically 0.1 to 20 mg. /kg may be in the range, but is not limited thereto. The daily dose may be formulated as one formulation in unit dose form, formulated in appropriate portions, or prepared by placing it in a multi-dose container.

상기 약학 조성물은 다른 항암제와 같은 다른 약물과 병용 투여 가능하며, 그 투여량, 투여 방법 및 다른 약물의 종류는 환자의 상태에 따라서 적절하게 처방될 수 있다.The pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs such as other anticancer drugs, and the dosage, administration method, and type of other drugs may be appropriately prescribed according to the patient's condition.

상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition may be formulated in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules. Additional topics may be included.

상기 약학 조성물의 투여 대상은 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류 등을 포함하는 포유류일 수 있다. 상기 대상은 앞서 설명한 T-세포 매개성 면역 질환을 가지는 환자, 또는 T-세포 매개성 면역 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자일 수 있다.The subject of administration of the pharmaceutical composition may be mammals including humans, primates including monkeys, and the like. The subject may be a patient having a T-cell mediated immune disease described above, or a patient in need of prevention and/or treatment of a T-cell mediated immune disease.

한편, 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40L에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 CD40L을 검출 또는 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 예는 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 CD40L의 검출용 조성물을 제공한다. 또 다른 예는 생물 시료에 상기 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는 CD40L의 검출 방법을 제공한다. 상기 검출 방법에서, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 CD40L이 존재하는 것으로 결정 (판단)할 수 있다. 따라서, 상기 검출 방법은, 상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계 이후에, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 CD40L이 존재하는 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.On the other hand, since the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof specifically binds to CD40L, CD40L can be detected or identified using the anti-CD40L antibody. Accordingly, another embodiment of the present invention provides a composition for detecting CD40L comprising the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof. Another example is treating a biological sample with the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof; And it provides a CD40L detection method comprising the step of determining whether the antigen-antibody reaction. In the detection method, when an antigen-antibody reaction is detected, it can be determined (determined) that CD40L is present in the biological sample. Accordingly, the detecting method may further include determining that CD40L is present in the biological sample when an antigen-antibody reaction is detected after the step of determining whether the antigen-antibody reaction exists.

상기 생물 시료는 포유류, 예컨대 인간 (예컨대, 이식 예정 환자 또는 이식 받은 환자, 자가면역질환 환자 등)으로부터 얻은 (분리된) 세포, 조직, 체액 (예, 혈액, 혈장, 혈청 등), 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.The biological sample may be (separated) cells, tissues, body fluids (eg, blood, plasma, serum, etc.) obtained from a mammal, such as a human (eg, a patient scheduled for transplantation or a transplanted patient, an autoimmune disease patient, etc.), and their culture It may be selected from the group consisting of water and the like.

상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피 (Immunochromatography), 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석 (enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석 (enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석 (luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴 블롯 (Western blotting), 마이크로어레이 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The step of determining whether the antigen-antibody reaction may be performed through various methods known in the art. For example, it can be measured through conventional enzymatic reactions, fluorescence, luminescence and / or radiation detection, specifically, immunochromatography, immunohistochemistry, enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescence immunoassay (LIA), Western blotting , It can be measured by a method selected from the group consisting of microarray, etc., but is not limited thereto.

다른 예에서, 앞서 설명한 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 전구체로서 항체 제작에 사용될 수 있을 뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대 펩티바디), 이중 특이 항체, 또는 다중 특이 항체의 구성 성분으로 포함될 수 있다.In another example, the heavy chain complementarity determining region of the anti-CD40L antibody described above, the light chain complementarity determining region, or a combination thereof; Alternatively, a polypeptide molecule comprising a heavy chain variable region, a light chain variable region, or a combination thereof is provided. The polypeptide molecule can be used as a precursor of an antibody to prepare an antibody, and can also be included as a component of a protein scaffold (e.g., peptibody) having a structure similar to that of an antibody, a bispecific antibody, or a multispecific antibody. .

다른 예는 상기 항 CD40L 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항 CD40L 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.Another example is to include a nucleic acid molecule encoding the heavy chain complementarity determining region, heavy chain variable region or heavy chain of the anti-CD40L antibody and a nucleic acid molecule encoding the light chain complementarity determining region, light chain variable region or light chain of the anti-CD40L antibody together in one vector, or Recombinant vectors each contained in a separate vector are provided.

용어 “벡터 (vector)”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pcDNA 시리즈 (예, pcDNA3.4 등), pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pQKX1, pQKX2, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.The term “vector” refers to a means for expressing a gene of interest in a host cell. Examples include viral vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors and bacteriophage vectors, adenoviral vectors, retroviral vectors and adeno-associated viral vectors. Vectors that can be used as the recombinant vector are plasmids often used in the art (eg, pcDNA series (eg, pcDNA3.4, etc.), pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pQKX1, pQKX2, pGEX series, pET series and pUC19, etc.), phage (eg, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 and M13, etc.) or viruses (eg, SV40, etc.) can be manufactured by manipulating.

상기 재조합 벡터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된 (operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결 (operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.In the recombinant vector, the nucleic acid molecule may be operably linked to a promoter. The term “operably linked” refers to a functional linkage between a nucleotide expression control sequence (eg, a promoter sequence) and another nucleotide sequence. Such regulatory sequences may be “operably linked” to regulate the transcription and/or translation of other nucleotide sequences.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.The recombinant vector can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression. As the expression vector, conventional ones used in the art to express foreign proteins in plants, animals, or microorganisms may be used. The recombinant vector may be constructed through various methods known in the art.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.The recombinant vector may be constructed using a prokaryotic or eukaryotic cell as a host. For example, when the vector used is an expression vector and a prokaryotic cell is used as a host, a strong promoter capable of promoting transcription (e.g., pLλ promoter, CMV promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, T7 promoter, etc.), a ribosome binding site for initiation of translation, and a transcription/translation termination sequence. In the case of using a eukaryotic cell as a host, the origin of replication operating in the eukaryotic cell included in the vector includes the f1 origin of replication, the SV40 origin of replication, the pMB1 origin of replication, the adeno origin of replication, the AAV origin of replication and the BBV origin of replication, etc. It is not limited. In addition, promoters derived from the genome of mammalian cells (eg, metallotionine promoter) or promoters derived from mammalian viruses (eg, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, The cytomegalovirus promoter and the tk promoter of HSV) can be used, and usually have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO-S, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK, HEK293 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The recombinant cell may be obtained by introducing the recombinant vector into an appropriate host cell. As the host cell, any host cell known in the art can be used as a cell capable of continuously cloning or expressing the recombinant vector stably, and prokaryotic cells include, for example, E. coli JM109 and E. coli. Bacillus strains such as BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Sera Enterobacteriaceae and strains such as Tia marcessons and various Pseudomonas species, etc., in the case of transformation into eukaryotic cells, as host cells, yeast (Saccharomyce cerevisiae), insect cells, plant cells and animal cells, such as Sp2/0 , CHO (Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO-S, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK, HEK293 cell lines, etc. may be used, but It is not limited.

상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.For the transfer (introduction) of the nucleic acid molecule or a recombinant vector containing the same into a host cell, a transfer method widely known in the art may be used. As the delivery method, for example, when the host cell is a prokaryotic cell, a CaCl2 method or an electroporation method may be used, and when the host cell is a eukaryotic cell, a microinjection method, a calcium phosphate precipitation method, an electroporation method, or a liposome method. -mediated transfection method, gene bombardment, etc. may be used, but is not limited thereto.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.The method for selecting the transformed host cell can be easily performed according to a method widely known in the art using a phenotype expressed by a selection marker. For example, when the selection marker is a specific antibiotic resistance gene, the transformant can be easily selected by culturing the transformant in a medium containing the antibiotic.

다른 예는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항 CD40L 항체의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 임의로 배양 배지로부터 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.Another embodiment provides a method for producing an anti-CD40L antibody comprising expressing the nucleic acid molecule or a recombinant vector containing the same in a host cell. The production method may include culturing the recombinant cells containing the recombinant vector, and optionally may further include isolating and/or purifying the antibody from the culture medium.

본 발명의 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD40L에 결합하는 효과를 갖고, CD40 및 CD40L의 결합을 차단하는 효과를 가지고, 이로 인하여, T 세포-매개 면역질환, 특히 자가면역질환에 대한 예방 및/또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.The anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has the effect of binding to CD40L and blocking the binding of CD40 and CD40L, thereby preventing and preventing T cell-mediated immune diseases, particularly autoimmune diseases. / or can be usefully used for treatment.

도 1a 및 1b는 14D6 단클론항체를 제작하는 과정을 보여준다. 면역원으로 재조합 인간 CD40L 단백질을 사용하여 4회의 면역화를 수행한 것으로, 면역화된 비장세포와 골수종 세포의 융합을 통해 하이브리도마 세포를 얻는다.
도 2는 세포에 14D6 단클론항체 처리 시 결합여부를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. Negative cont.는 14D6 단클론항체 대신 1x PBS를 처리한 음성 대조군이다. 도 2a 및 도 2b는 각각 CHO 세포 및 CD40 표면발현 CHO 세포에서 결합정도를 확인한 것이고, 도 2c는 CD40L 표면발현 CHO 세포에서 결합정도를 확인한 것이다.
도 3은 세포에 14D6 단클론항체 처리 시 농도에 따른 결합정도를 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. Negative cont.는 14D6 단클론항체 대신 1x PBS를 처리한 음성 대조군, Positive cont.는 14D6 단클론항체 대신 5C8을 처리한 양성 대조군을 의미한다.
도 4는 14D6 단클론항체의 농도에 따른 결합 능력을 ELISA 분석으로 확인한 결과이다.
도 5는 14D6 단클론항체의 구조결합 능력을 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과이다. Reducing은 이황화결합이 끊어진 환원조건, Non Reducing은 이황화결합이 유지된 비환원조건을 의미하고, Jurkat와 HeLaS3은 각각 CD40L을 발현한다고 알려진 Jurkat 세포와 HeLaS3 세포를 의미한다.
도 6은 14D6 단클론항체의 기능결합능력을 인간 말초혈액단핵세포 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 14D6 단클론항체의 농도에 따른 CD40L과 CD40 결합 차단 정도를 유세포 분석으로 확인한 결과이다. 해당 도면의 모식도는 Bjab 세포와 CD40L-hFc 단백질을 이용한 14D6 항체의 차단능 검증을 위한 모식도를 의미하고, Negative cont.는 1x PBS를 처리한 음성 대조군, Positive cont.는 항체를 처리하지 않은 양성 대조군을 의미한다.
도 8a는 HEK-blue CD40L 세포가 CD40L과 반응하여 농도 의존생리활성을 나타내는지 확인하기 위한 적정 재조합 인간 CD40L 단백질 농도 조건 확립을 위해, 상기 단백질 농도에 따른 655nm 파장에서의 흡광도를 측정한 결과이다.
도 8b는 14D6 단클론항체의 기능차단능력을 HEK-Blue CD40L 세포를 이용해 확인한 결과이다. 아래쪽 그래프는 14D6에 의한 중화 효과를 백분율로 나타낸 것이다.
도 9는 14D6 단클론항체의 기능차단능력을 ICAM-1 발현 여부를 이용해 확인한 결과이다. 도 9b는 상기 ICAM-1 발현 여부를 히스토그램으로 나타낸 것이다.
도 9a, 9c 및 9d는 상기 ICAM-1 발현 여부를 dot plot으로 나타낸 것이다. 1사분면에 분포가 많으면 ICAM-1 발현이 높은 것으로 CD40-CD40L 상호작용이 많이 일어난 것을 의미하고, 4사분면에 분포가 많을수록 항체에 의해 해당 상호작용이 차단되어 ICAM-1 발현이 감소하였다는 것을 의미한다. 도 9d는 14D6을 처리한 경우 B세포 내 농도 별 발현 정도를 나타낸다.
도 9c의 blocking efficiency graph는 도 9d의 농도에 따른 결합 차단 효율을 그래프로 표현한 것이고, 도 9c의 dot plot에서 사분면으로 나뉘지 않은 두 dot plot의 경우 실험을 진행한 모든 세포에서의 ICAM-1 발현 정도를 나타내고, 사분면으로 나뉘어진 두 dot plot의 경우 B 세포 내 ICAM-1 발현 정도를 나타낸다.
도 10은 14D6의 키메릭항체의 서열을 나타내는 그림이다.
도 11a 14D6의 키메릭항체의 결합능력을 확인하기 위해 세포에 1x PBS (Negative cont.)와 키메릭항체 반응물을 각각 첨가하고, 14D6 키메릭항체가 세포 표면에 발현한 CD40L에 결합하는지를 유세포분석기로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11b는 14D6의 키메릭항체의 결합능력을 확인하기 위해 세포에 14D6 마우스항체와 키메릭항체 반응물을 각각 첨가하고, 14D6 마우스 및 키메릭항체가 세포 표면에 발현한 CD40L에 결합하는지를 유세포분석기로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11c는 14D6의 키메릭항체의 결합능력을 확인하기 위해 세포에 14D6 키메릭항체와 14D6 마우스항체를 함께 처리하여 차단효과를 검증한 결과이다. Chimeric & Mouse 14D6는 마우스 14D6 처리 후 키메릭 14D6를 처리한 것이고, Chimeric 14D6는 키메릭 14D6만을 처리한 것을 의미한다.1a and 1b show a process of preparing a 14D6 monoclonal antibody. Four immunizations were performed using recombinant human CD40L protein as an immunogen, and hybridoma cells were obtained through fusion of immunized splenocytes and myeloma cells.
2 is a graph showing the result of confirming the binding of 14D6 monoclonal antibody to cells by flow cytometry. Negative cont. is a negative control treated with 1x PBS instead of 14D6 monoclonal antibody. Figures 2a and 2b confirm the degree of binding in CHO cells and CD40 surface-expressing CHO cells, respectively, and Fig. 2c confirms the degree of binding in CD40L surface-expressing CHO cells.
3 is a graph showing the result of confirming the degree of binding according to concentration when cells were treated with 14D6 monoclonal antibody by flow cytometry. Negative cont. means a negative control treated with 1x PBS instead of 14D6 monoclonal antibody, and positive cont. means a positive control treated with 5C8 instead of 14D6 monoclonal antibody.
Figure 4 shows the result of confirming the binding ability according to the concentration of 14D6 monoclonal antibody by ELISA analysis.
5 is a result of confirming the structural binding ability of 14D6 monoclonal antibody by Western blot analysis. Reducing means a reducing condition in which disulfide bonds are broken, Non Reducing means a non-reducing condition in which disulfide bonds are maintained, and Jurkat and HeLaS3 refer to Jurkat cells and HeLaS3 cells known to express CD40L, respectively.
Figure 6 is the result of confirming the functional binding ability of the 14D6 monoclonal antibody through human peripheral blood mononuclear cell analysis.
7 is a result of confirming the degree of blocking of CD40L and CD40 binding according to the concentration of 14D6 monoclonal antibody by flow cytometry. The schematic diagram of the corresponding figure means a schematic diagram for verifying the blocking ability of the 14D6 antibody using Bjab cells and CD40L-hFc protein, Negative cont. is a negative control treated with 1x PBS, and Positive cont. is a positive control untreated means
8a is a result of measuring absorbance at a wavelength of 655 nm according to the protein concentration in order to establish an appropriate recombinant human CD40L protein concentration condition to confirm whether HEK-blue CD40L cells react with CD40L and exhibit concentration-dependent physiological activity.
8B is a result of confirming the function blocking ability of 14D6 monoclonal antibody using HEK-Blue CD40L cells. The lower graph shows the neutralizing effect by 14D6 as a percentage.
9 is a result of confirming the function blocking ability of 14D6 monoclonal antibody using ICAM-1 expression. 9b shows the expression of ICAM-1 as a histogram.
9a, 9c and 9d show the expression of ICAM-1 as a dot plot. A high distribution in the 1st quadrant means high ICAM-1 expression, which means that a lot of CD40-CD40L interactions have occurred, and a high distribution in the 4th quadrant means that the interaction is blocked by the antibody and ICAM-1 expression is reduced. do. Figure 9d shows the expression level for each concentration in B cells when treated with 14D6.
The blocking efficiency graph of FIG. 9c is a graph of the binding blocking efficiency according to the concentration of FIG. 9d, and in the case of the two dot plots not divided into quadrants in the dot plot of FIG. 9c, ICAM-1 expression in all cells subjected to the experiment. In the case of two dot plots divided into quadrants, the degree of ICAM-1 expression in B cells is shown.
10 is a diagram showing the sequence of a 14D6 chimeric antibody.
In order to confirm the binding ability of the chimeric antibody of FIG. 11a 14D6, 1x PBS (Negative cont.) and a chimeric antibody reactant were added to the cells, respectively, and whether the 14D6 chimeric antibody binds to CD40L expressed on the cell surface was analyzed by flow cytometry. It is a graph showing the result of checking.
Figure 11b shows a comparison between the 14D6 mouse antibody and the chimeric antibody reactant added to cells to confirm the binding ability of the 14D6 chimeric antibody, respectively, and whether the 14D6 mouse antibody and the chimeric antibody bind to CD40L expressed on the cell surface by flow cytometry. This is a graph showing the result.
11C shows the result of verifying the blocking effect by treating cells with the 14D6 chimeric antibody and the 14D6 mouse antibody together to confirm the binding ability of the 14D6 chimeric antibody. Chimeric & Mouse 14D6 refers to treatment with mouse 14D6 followed by treatment with chimeric 14D6, and Chimeric 14D6 means treatment with only chimeric 14D6.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 제한하지 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention and do not limit the scope of the present invention.

실시예 1. 14D6 단클론항체 제작 및 세포주 준비Example 1. Preparation of 14D6 monoclonal antibody and cell line

실시예 1-1. 14D6 단클론항제 제작Example 1-1. 14D6 monoclonal drug production

CD40L 특이 단클론항체를 개발하기 위하여 6주령의 Balb/c 암컷 마우스와 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E)을 이용하였고, 상기 단백질의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.To develop a CD40L-specific monoclonal antibody, 6-week-old Balb/c female mice and recombinant human CD40L protein (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E) were used, and the protein sequence are shown in Table 1 below.

명명denomination 서열order 서열번호sequence number Human_CD40L_ProteinHuman_CD40L_Protein MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLMIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRA ANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL 1111

최초면역 시 재조합 인간 CD40L 단백질 100μg을 상기 마우스 복강에 주입하였고, 3주 후에 10μg씩 2주 간격으로 2회 주입하였다. 세포융합을 실시하기 3일 전 상기 재조합 인간 CD40L 단백질 100μg을 주입하여 면역반응증가 및 CD40L에 대한 항체가 증폭되도록 유도하였다. 최종면역을 수행한지 3일 후, 면역화된 마우스의 비장을 적출하고 균질화하여 비장세포를 획득하고, RPMI 배지 (Welgene, Gyeongsan-si, Korea)로 2회 세척하였다. 비장세포와 0.4 (v/v)% 트리판블루를 1:1의 부피비로 혼합한 후, 현미경으로 염색되지 않은 세포를 계수하여 생 세포수를 계수하였다. 세포융합은 X63 마우스 골수종 세포주 (ATCC, Virginia, USA)를 사용하였으며, 비장세포와 동일한 방법으로 세포 세척 후 생세포수를 계수하였다. X63 세포와 비장세포는 세포수에 따라 1:5의 비율로 혼합하고 원심분리 후 상층액을 제거하였다.At the time of the first immunization, 100 μg of recombinant human CD40L protein was injected into the peritoneal cavity of the mouse, and after 3 weeks, 10 μg was injected twice at 2-week intervals. 100 μg of the recombinant human CD40L protein was injected 3 days before cell fusion to induce an increase in immune response and amplification of antibodies against CD40L. Three days after the final immunization, the spleen of the immunized mouse was removed and homogenized to obtain splenocytes, and washed twice with RPMI medium (Welgene, Gyeongsan-si, Korea). Splenocytes and 0.4 (v / v)% trypan blue were mixed at a volume ratio of 1: 1, and the number of live cells was counted by counting unstained cells under a microscope. For cell fusion, X63 mouse myeloma cell line (ATCC, Virginia, USA) was used, and viable cells were counted after washing the cells in the same manner as for spleen cells. X63 cells and splenocytes were mixed at a ratio of 1:5 according to the number of cells, and the supernatant was removed after centrifugation.

이 후, 50 (v/v)% 폴리에틸렌글라이콜 (polyethylene glycol)-1500 (Sigma, Saint louis, USA)을 첨가하여 세포융합을 유도하고, 이를 원심분리한 후 HAT 배지 (hypoxanthine aminopterin thymidine medium) (Sigma, Saint louis, USA)가 포함된 20 (v/v)% 열비활성화 소태아혈청 (Fetal bovine serum; FBS)(Gibco, Texas, USA) 함유 RPMI 배지로 부유시켰다. 상기 부유액을 96 웰 플레이트에 150μl/웰로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 군락이 형성되는 웰이 관찰될 때까지 배양하였다. 배양 후 7일 경과 후, HT 배지 (hypoxantin-thymidine culture medium) (Sigma, Saint louis, USA)가 포함된 20 (v/v)% FBS 함유 RPMI 배지를 웰당 150μl 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 48시간 배양하였다. 이 후 이들 배양액과 CD40L-hFc 단백질 혼합액 (CD40L-hFc (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H01H) 2μg/test을 CD40을 발현하는 Bjab 세포 (DSMZ, Brauschweig, Germany) 배양약 100ul/test에 처리하여 차단효과가 있는 클론만 선별하였다. 2회의 제한희석을 거쳐 단일 콜로니로 구성된 14D6-52-5 단일클론항체 (이하, 14D6) 하이브리도마세포를 확보하여 14D6 단클론항체를 제작하였고, 그 과정을 도 1에 나타내었다. 14D6의 차단능은 상기 2회의 제한희석을 통해 얻을 수 있다.After that, 50 (v / v)% polyethylene glycol (polyethylene glycol) -1500 (Sigma, Saint louis, USA) was added to induce cell fusion, and after centrifugation, HAT medium (hypoxanthine aminopterin thymidine medium) (Sigma, Saint Louis, USA) was suspended in RPMI medium containing 20 (v/v)% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Texas, USA). The suspension was dispensed into a 96-well plate at 150 μl/well, and cultured in a 37° C., 5% CO ₂ cell incubator until wells in which colonies were formed were observed. After 7 days of culture, 150 μl of RPMI medium containing 20 (v / v)% FBS containing HT medium (hypoxantin-thymidine culture medium) (Sigma, Saint louis, USA) was added per well, and 37 ° C, 5% CO ₂ It was cultured for 48 hours in a cell incubator. Then, these cultures and CD40L-hFc protein mixture (CD40L-hFc (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H01H) 2μg/test were mixed with CD40-expressing Bjab cells (DSMZ, Brauschweig, Germany) Only clones with blocking effects were selected by treatment with 100ul/test of the culture medium After two limited dilutions, 14D6-52-5 monoclonal antibody (hereinafter referred to as 14D6) hybridoma cells composed of single colonies were obtained and 14D6 A monoclonal antibody was prepared, and the process is shown in Figure 1. The blocking ability of 14D6 can be obtained through the above two limited dilutions.

실시예 1-2. 세포주 준비Example 1-2. cell line preparation

상기 실시예 1-1에서 준비한 단클론항체의 효과를 검증하기 위해 세포주를 준비하였다.A cell line was prepared to verify the effect of the monoclonal antibody prepared in Example 1-1.

구체적으로, 인간 버킷 림프종 B세포인 Bjab (DSMZ, Brauschweig, Germany), Ramos (ATCC; American Type Culture Collection)와 인간 T 림프구세포인 Jurkat (한국세포주은행), 자궁경부암세포인 HeLaS3 (한국세포주은행)를 10 (v/v)% FBS가 첨가된 RPMI 배지에서 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양했다. 중국 햄스터 난소 세포주 계열인 CD40L 표면발현 CHO 세포 (ATCC), CD40 표면발현 CHO 세포 (ATCC), CHO 세포 (ATCC), HEK-Blue CD40L 세포 (InvivoGen)는 10 (v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지 (Welgene)에서 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양했다.Specifically, human Burkitt's lymphoma B cells Bjab (DSMZ, Brauschweig, Germany) and Ramos (ATCC; American Type Culture Collection), human T lymphocyte cells Jurkat (Korea Cell Line Bank), and cervical cancer cell HeLaS3 (Korea Cell Line Bank) was cultured in RPMI medium supplemented with 10 (v/v)% FBS at 37°C and 5% CO ₂ in a cell culture medium. CD40L surface-expressing CHO cells (ATCC), CD40 surface-expressing CHO cells (ATCC), CHO cells (ATCC), and HEK-Blue CD40L cells (InvivoGen), a Chinese hamster ovary cell line, were supplemented with 10 (v/v)% FBS. It was cultured in DMEM medium (Welgene) at 37°C, 5% CO ₂ in a cell incubator.

실시예 2. 세포주에서의 14D6 단클론항체의 결합능력 확인Example 2. Confirmation of binding ability of 14D6 monoclonal antibody in cell lines

실시예 2-1. 유세포 분석Example 2-1. flow cytometry

14D6 단클론항체의 특이결합능력을 검증하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 준비한 CHO 세포, CD40 표면발현 CHO 세포, CD40L 표면발현 CHO 세포에 1x PBS (음성 대조군), 8G1 (양성 대조군) (대한민국 공개공보 제 10-2018-0131989 호, 미국 공개특허 US 2020-0291123 A1의 항체), 상기 실시예 1-1에서 준비한 14D6 단클론항체를 0.05μg/test로 처리하고, 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, 결합된 항체를 확인하기 위해 염소 항-마우스 Ig-FITC 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 넣었다. 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후 상기 PBS 2ml를 이용해 상기와 동일한 방법으로 세척한 다음 유세포 분석기 (Stratedigm, California, USA )로 측정하였고, 그 결과를 도 2a 내지 2c에 나타내었다. 그 결과, 14D6 단클론항체는 CD40L 표면발현 CHO 세포에만 특이적으로 결합 (도 2c)하고, 음성 대조군 (1x PBS)은 모든 종류의 세포에 결합하지 않고, 8G1 항체는 CD40 CHO 세포에 특이적으로 결합하지만 CD40L CHO 세포에는 결합하지 않는 것 (도 2a 및 2b)을 확인하였다.In order to verify the specific binding ability of the 14D6 monoclonal antibody, 1x PBS (negative control), 8G1 (positive control) were added to the CHO cells, CD40 surface-expressing CHO cells, and CD40L surface-expressing CHO cells prepared in Example 1-2 above (Republic of Korea Publication) Antibody of No. 10-2018-0131989, US Patent Application Publication No. US 2020-0291123 A1) and the 14D6 monoclonal antibody prepared in Example 1-1 were treated at 0.05 μg/test and reacted at 4° C. for 30 minutes. 2 ml of PBS was added and centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes to remove unbound antibodies, and a goat anti-mouse Ig-FITC antibody (Jackson, Pennsylvania, USA) was added to confirm the bound antibodies. After reacting at 4° C. for 20 minutes, washing with 2 ml of PBS was performed in the same manner as above, and then measurement was performed using a flow cytometer (Stratedigm, California, USA), and the results are shown in FIGS. 2a to 2c. As a result, the 14D6 monoclonal antibody specifically bound only to CD40L surface-expressing CHO cells (Fig. 2c), the negative control (1x PBS) did not bind to all types of cells, and the 8G1 antibody specifically bound to CD40 CHO cells. However, it was confirmed that it did not bind to CD40L CHO cells (Figs. 2a and 2b).

또한, 농도의존결합을 검증하기 위하여 상기 실시예 1-2에서 준비한 CD40L 표면발현 CHO 세포에 14D6을 0.01, 0.05, 0.1, 또는 0.5μg/test로 처리하고, 4℃에서 30분 동안 반응시키고, 상기 유세포분석과 실질적으로 동일한 방법으로 결합 정도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 음성 대조군으로는 1x PBS, 양성 대조군으로는 5C8 (Genetex, Irvine, USA)를 상기 14D6 대신 0.5μg/test의 양으로 첨가하여 측정하였다. 그 결과, CD40L 표면발현 CHO 세포에 14D6을 농도별로 처리하고 유세포분석기로 측정한 결과 농도에 비례하여 14D6 항체가 CD40L에 결합하는 것을 확인하였고, 0.1μg 이상의 농도에서는 결합이 포화상태인 것을 확인하였다. In addition, in order to verify concentration-dependent binding, CD40L surface-expressing CHO cells prepared in Example 1-2 were treated with 0.01, 0.05, 0.1, or 0.5 μg/test of 14D6, reacted at 4° C. for 30 minutes, and The degree of binding was measured in substantially the same way as flow cytometry, and the results are shown in FIG. 3 . 1x PBS as a negative control and 5C8 (Genetex, Irvine, USA) as a positive control were added in an amount of 0.5 μg/test instead of 14D6, and the measurement was performed. As a result, CD40L surface-expressing CHO cells were treated with 14D6 at each concentration, and as a result of flow cytometry analysis, it was confirmed that the 14D6 antibody binds to CD40L in proportion to the concentration, and at a concentration of 0.1 μg or more, it was confirmed that the binding was saturated.

실시예 2-2. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 분석Example 2-2. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) assay

Maxisorp 96 웰 ELISA 플레이트에 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China)을 웰당 100ng/100μl 넣고, 37℃에서 1시간 반응시켜 항원을 코팅한 다음 비특이결합을 줄이기 위하여 1 (w/v)% BSA (Bovine Serum Albumin) 용액을 웰당 200μl 넣고, 37℃에서 1시간 반응시켰다.100ng/100μl of recombinant human CD40L protein (Sino biological, Beijing, China) was added per well to a Maxisorp 96-well ELISA plate, reacted at 37°C for 1 hour to coat the antigen, and then 1 (w/v)% 200 μl of BSA (Bovine Serum Albumin) solution was added per well, and reacted at 37° C. for 1 hour.

상기 실시예 1-2에서 준비한 14D6을 1000ng/ml에서부터 2배씩 계열희석하여 각각 100μl씩 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤 세척완충액 (0.05% tween-20 in PBS)으로 3회 세척하여 결합되지 않은 1차항체를 제거하였다.14D6 prepared in Example 1-2 was serially diluted 2-fold from 1000ng/ml, 100 μl each was added, reacted at 37°C for 1 hour, and washed three times with a washing buffer (0.05% tween-20 in PBS) to obtain unbound Primary antibody was removed.

그 후, 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 100μl 넣고, 37℃에서 30분 반응시킨 후 세척완충액으로 3회 세척하였다. TMB 용액 (Thermofisher, Waltham, USA) 을 50μl 넣어 10분간 반응시키고, 황산 50μl를 넣어 반응을 중지시킨 다음 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여, 농도에 따른 결합 능력을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. ELISA 분석 결과 역시 유세포분석의 결과와 마찬가지로 농도에 비례하여 14D6 항체가 CD40L에 결합하는 것을 확인하였고, 100ng/ml 이후의 농도에서는 결합이 포화상태인 것을 확인하였다.Thereafter, 100 μl of goat anti-mouse IgG-HRP antibody (Jackson, Pennsylvania, USA) was added, reacted at 37° C. for 30 minutes, and washed three times with a washing buffer. 50 μl of TMB solution (Thermofisher, Waltham, USA) was added and reacted for 10 minutes, 50 μl of sulfuric acid was added to stop the reaction, and then the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm to confirm the binding ability according to the concentration. The results are shown in FIG. was ELISA analysis also confirmed that the 14D6 antibody binds to CD40L in proportion to the concentration, as in the result of flow cytometry, and it was confirmed that the binding was saturated at concentrations greater than 100 ng/ml.

실시예 2-3. 웨스턴 블롯 (Western blotting) 분석Example 2-3. Western blotting analysis

CD40L을 발현한다고 알려진 Jurkat 세포 (한국세포주은행)와 HeLaS3 세포 (한국세포주은행)를 1x10⁸개만큼 배양하여 용해완충액 (1 (v/v)% NP-40) 10ml로 현탁한 후, 4℃에서 30분간 용해시켰다. 상기 용해된 세포현탁액을 3분간 원심 분리하여 세포잔존물을 제거하고, 상층액만 채취하였다. 상기 용해물에 2x SDS-PAGE 시료버퍼를 넣고 5분간 끓인 후, 4%에서 15%로 gel percent 농도가 증가하는 SDS겔 (Biorad, Hercules, USA)에 주입하여 전기영동하였다. 전기영동을 진행한 용해물을 PVDF막에 전기이동하고, 비특이결합을 줄이기 위하여 5 (w/v)% 탈지분유 용액으로 차단한 다음 검출하고자 하는 CD40L 단백질에 특이 결합하는 14D6을 0.5μg/ml로 처리하였다. 세척완충액 (0.05 (v/v)% tween-20 in TBS)으로 3회 세척하여 결합되지 않은 1차항체를 제거하고, 과산화효소결합 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 결합시켰다. 상기 PVDF 막을 세척완충액으로 다시 세척한 후 화학발광증폭검출시스템 (ECL)을 사용하여 표적단백질을 검출하여, 14D6의 구조결합능력을 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.Jurkat cells (Korea Cell Line Bank) and HeLaS3 cells (Korea Cell Line Bank) known to express CD40L were cultured by 1x10 ⁸ cells and suspended in 10 ml of lysis buffer (1 (v/v)% NP-40) at 4°C. Dissolved for 30 minutes. The dissolved cell suspension was centrifuged for 3 minutes to remove cell remnants, and only the supernatant was collected. After adding 2x SDS-PAGE sample buffer to the lysate and boiling for 5 minutes, it was injected into an SDS gel (Biorad, Hercules, USA) in which the gel percent concentration increased from 4% to 15%, and electrophoresis was performed. The lysate subjected to electrophoresis was electrophoresed onto a PVDF membrane, blocked with a 5 (w/v)% skim milk powder solution to reduce nonspecific binding, and then 0.5 μg/ml of 14D6, which specifically binds to the CD40L protein to be detected, was added. was treated with Unbound primary antibody was removed by washing three times with washing buffer (0.05 (v/v)% tween-20 in TBS), and a peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG-HRP antibody (Jackson, Pennsylvania, USA) was added. combined After washing the PVDF membrane again with a washing buffer, the target protein was detected using a chemiluminescence amplification detection system (ECL) to confirm the structural binding ability of 14D6, and the results are shown in FIG. 5 .

그 결과, 14D6 항체는 환원성 또는 비환원성 조건에 관계없이 분자량이 32 ~ 39kDA인 CD40L을 검출하는 것을 확인하여, 이황화결합이 끊어진 환원조건 및 이황화결합이 유지된 비환원조건 모두에서 결합이 이루어졌다는 것을 확인하였고, 이는 14D6이 CD40L의 구조와 상관없이 CD40L의 특정 부위를 인지하여 결합한다는 것을 의미한다.As a result, it was confirmed that the 14D6 antibody detected CD40L with a molecular weight of 32 to 39 kDA regardless of reducing or non-reducing conditions, indicating that the binding was made under both reducing conditions in which disulfide bonds were broken and non-reducing conditions in which disulfide bonds were maintained. This means that 14D6 recognizes and binds to a specific site of CD40L regardless of the structure of CD40L.

실시예 2-4. 인간 말초혈액단핵세포 분석Example 2-4. Human peripheral blood mononuclear cell analysis

림프구와 단핵구로 구성된 PBMC층에 PMA와 이오노마이신을 처리하여 자극할 경우, 신호전달경로를 거쳐 T세포가 활성화되고 이로 인해 CD40L의 발현이 유도된다. 자극된 인간 PBMC에 14D6을 처리하여 발현된 CD40L을 인지하는지 검증하고자 실험을 진행하였다.When the PMA and ionomycin are treated and stimulated in the PBMC layer composed of lymphocytes and monocytes, T cells are activated through a signal transduction pathway, which induces the expression of CD40L. Experiments were conducted to verify whether stimulated human PBMCs were treated with 14D6 and recognized CD40L.

사람 혈액 (Zenbio, North carolina, USA)을 PBS와 1:1의 부피비로 섞어 희석하고 피콜튜브에 넣은 후, 2200rpm에서 20분간 원심분리하여 인간말초혈액단핵세포 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 확보하였다. PBS 30ml을 넣고 2200rpm에서 5분간 원심분리하여 PBMC를 세척한 다음 상층액을 제거하였다. PBMC와 0.4 (v/v)% 트리판블루를 1:1의 부피비로 섞은 후, 현미경으로 염색되지 않은 세포를 계수하여 생세포수를 확인하였다. 다시 원심분리 후, 상층액을 제거한 PBMC를 10 (v/v)% RPMI 배지로 부유시키고, 6 웰 플레이트에 1x10⁷개/5ml/웰씩 분주하였다. 자극그룹에 PMA 20ng/ml, 이오노마이신 (ionomycin) 1μg/ml을 넣고 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 6시간 동안 반응시켰다. 세포를 모두 모은 후, 14D6을 0.1μg씩 처리하고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 결합하지 않은 항체를 제거한 다음 T세포 선별을 위한 CD3-APC (Invitrogen, Waltham, USA)와 14D6 검출을 위한 염소 항-마우스 Ig-FITC 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 처리하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 2ml을 이용해 상기 실시예 2-1과 실질적으로 동일한 방법으로 세척한 다음 유세포분석기로 측정하였고, 이를 통해 인간 혈액 내의 T세포를 활성화시켜 발현이 유도된 CD40L을 14D6이 인지하는지 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 음성 대조군으로 1x PBS를, 양성 대조군으로 5C8 (Genetex, Irvine, USA)을 상기 14D6 대신 0.1μg씩 각각 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과, 무자극 조건하에서는 대조군 및 14D6 그룹에서 검출된 FITC가 매우 낮은 것을 확인하여 CD40L의 발현이 유도되지 않는 것을 확인하였고, 자극 조건 하에서는 양성 대조군 및 14D6 그룹에서 높은 수준의 검출된 FITC를 확인하였다. 이는 14D6 항체가 PMA 및 이오노마이신에 의해 T 세포에서 유도된 CD40L을 검출한다는 것을 의미한다.Human blood (Zenbio, North Carolina, USA) was diluted with PBS in a volume ratio of 1:1, put into a Ficoll tube, and centrifuged at 2200 rpm for 20 minutes to obtain human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). did 30 ml of PBS was added and centrifuged at 2200 rpm for 5 minutes to wash the PBMCs, and then the supernatant was removed. After mixing PBMC and 0.4 (v/v)% trypan blue at a volume ratio of 1:1, the number of viable cells was confirmed by counting unstained cells under a microscope. After centrifugation again, the PBMCs from which the supernatant was removed were suspended in 10 (v/v)% RPMI medium, and dispensed into a 6-well plate at 1×10 ⁷ cells/5ml/well. 20ng/ml of PMA and 1μg/ml of ionomycin were added to the stimulation group and reacted in a 37°C, 5% CO ₂ cell incubator for 6 hours. After collecting all the cells, 14D6 was treated with 0.1 μg each and reacted at 4°C for 30 minutes. Then, 2 ml of PBS was added and centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes to remove unbound antibodies, and then CD3-APC (Invitrogen, Waltham, USA) for T cell selection and goat anti-mouse Ig-FITC antibody (Jackson, USA) for 14D6 detection. Pennsylvania, USA) and reacted at 4° C. for 30 minutes. It was washed with 2 ml of PBS in substantially the same manner as in Example 2-1 and then measured by flow cytometry. Through this, it was confirmed whether 14D6 recognized CD40L whose expression was induced by activating T cells in human blood. is shown in Figure 6. Experiments were conducted by treating 1x PBS as a negative control and 0.1 μg each of 5C8 (Genetex, Irvine, USA) instead of 14D6 as a positive control. As a result, it was confirmed that the FITC detected in the control and 14D6 groups was very low under unstimulated conditions, confirming that the expression of CD40L was not induced, and high levels of FITC detected in the positive control and 14D6 groups under stimulated conditions. . This means that the 14D6 antibody detects CD40L induced in T cells by PMA and ionomycin.

실시예 3. 세포주에서의 14D6 단클론항체의 차단능력 확인Example 3. Confirmation of blocking ability of 14D6 monoclonal antibody in cell lines

실시예 3-1. 유세포 분석Example 3-1. flow cytometry

상기 실시예 1-1에서 준비한 14D6 0.05, 0.1 또는 0.5μg/100μl와 CD40L-hFc 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H01H) 2μg을 섞은 후 상온에서 30분 동안 반응시키고, 반응액을 Bjab 세포 (DSMZ, Brauschweig, Germany)에 처리한 다음 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심분리하여 결합하지 않은 혼합액을 제거하고, 결합여부를 확인하기 위해 염소 항-인간Ig-FITC 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 넣었다. 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후 PBS 2ml을 이용해 상기 실시예 1-1와 실질적으로 동일한 방법으로 세척한 다음 유세포분석기로 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 음성 대조군으로 1x PBS를 14D6 대신 100μl의 양으로 사용하였고, 항체 처리시 항체의 차단효과에 의해 FITC 신호가 감소하게 되는데 항체를 처리하지 않은 그룹을 결합이 최대로 일어난 것으로 정하고 항체 처리에 따라 결합이 감소하는 것을 확인하기 위해, 양성 대조군으로 항체를 처리하지 않은 상기 세포를 준비하여 실험을 진행하였다.After mixing 0.05, 0.1 or 0.5μg/100μl of 14D6 prepared in Example 1-1 and 2μg of CD40L-hFc protein (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H01H), the mixture was incubated at room temperature for 30 minutes. After reacting for 30 minutes, the reaction mixture was treated with Bjab cells (DSMZ, Brauschweig, Germany) and then reacted at 4°C for 30 minutes. Thereafter, 2 ml of PBS was added and centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes to remove unbound mixture, and a goat anti-human Ig-FITC antibody (Jackson, Pennsylvania, USA) was added to confirm binding. After reacting at 4° C. for 20 minutes, washing with 2 ml of PBS in substantially the same manner as in Example 1-1, and then measuring with a flow cytometer, the results are shown in FIG. 7 . As a negative control, 1x PBS was used in an amount of 100 μl instead of 14D6, and the FITC signal was reduced by the blocking effect of the antibody when treated with the antibody. In order to confirm the reduction, the experiment was conducted by preparing the cells not treated with the antibody as a positive control.

그 결과, 14D6의 농도가 증가할수록 차단효과가 증가하고, 14D6의 차단능은 0.1μg 이상의 농도에서 음성대조군과 유사한 것을 확인하였고, 농도 의존적으로 CD40L과 CD40의 결합을 차단하는 것을 확인하였고, 0.1μg/50μl 이상의 농도에서는 결합이 포화상태인 것을 확인하였다 (도 7).As a result, the blocking effect increased as the concentration of 14D6 increased, and it was confirmed that the blocking ability of 14D6 was similar to that of the negative control at a concentration of 0.1 μg or more, and it was confirmed that the binding of CD40L and CD40 was blocked in a concentration-dependent manner. / It was confirmed that the binding was saturated at a concentration of 50 μl or more (FIG. 7).

실시예 3-2. HEK-blue CD40L 세포를 이용한 분석Example 3-2. Analysis using HEK-blue CD40L cells

HEK-Blue CD40L 세포는 인간배아신장유래세포인 HEK293 세포에 인간 CD40 유전자를 형질주입하여 만들어졌으며, NF-κB유도 분비 배아 알칼리 인산분해효소 (secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP) 구조물을 생성하도록 제조되었다. 상기 SEAP은 리포터유전자로서 CD40과 CD40L 반응이 일어나면 NK-κB가 활성화되고, 이로 인해 자극받은 프로모터에 의해 전사가 시작되어 생성된 SEAP구조물이 배양배지로 분비된다. 따라서 해당 세포를 이용하면, CD40 자극에 의해 활성화되는 NF-κB를 바탕으로 CD40L의 생리활성을 감지할 수 있다.HEK-Blue CD40L cells were made by transfecting HEK293 cells, which are human embryonic kidney-derived cells, with the human CD40 gene, and were prepared to generate an NF-κB-induced secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) construct. The SEAP is a reporter gene, and when a reaction between CD40 and CD40L occurs, NK-κB is activated, and transcription is started by the stimulated promoter, and the generated SEAP structure is secreted into the culture medium. Therefore, using the corresponding cells, the physiological activity of CD40L can be detected based on NF-κB activated by CD40 stimulation.

HEK-blue CD40L 세포가 CD40L과 반응하여 농도 의존생리활성을 나타내는지 확인하고, 적정 실험조건을 확립하기 위한 실험을 진행하였다. 구체적으로, HEK-Blue CD40L 세포 (Invivogen, San diego, USA)를 10 (v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용해 필요량만큼 희석하고, 96 웰 플레이트에 8x10⁴cells/180μl/well씩 분주하였다. 이후, 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E)을 0.005, 0.05, 0.5, 5, 50, 또는 500ng/20μl/웰씩 해당 웰에 넣어준 다음 37℃, 5% CO₂ 조건의 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 콴티블루용액 (Quanti-Blue solution) (Invivogen, San diego, USA)을 새로운 96 웰 플레이트에 150μl/웰씩 분주하고, 상기 24시간 배양한 샘플을 상기 웰에 50μl/웰씩 첨가하였다. 그 후, 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 655nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, OD_655nm 값이 1인 25ng/ml 농도를 적정 기준 값으로 설정하였고, 그 결과를 도 8a에 나타내었다.Experiments were conducted to confirm whether HEK-blue CD40L cells react with CD40L to exhibit concentration-dependent physiological activity, and to establish appropriate experimental conditions. Specifically, HEK-Blue CD40L cells (Invivogen, San diego, USA) were diluted to the required amount using DMEM medium supplemented with 10 (v/v)% FBS, and dispensed into a 96-well plate at 8x10 ⁴ cells/180 μl/well. did Then, 0.005, 0.05, 0.5, 5, 50, or 500ng/20μl/well of recombinant human CD40L protein (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E) was added to each well, and then 37 ℃, 5% CO ₂ It was cultured for 24 hours in a cell culture medium. 150 μl/well of Quanti-Blue solution (Invivogen, San Diego, USA) was dispensed into a new 96-well plate, and the 24-hour cultured samples were added to the wells at 50 μl/well. Then, after reacting at 37 ° C. for 30 minutes, absorbance was measured at a wavelength of 655 nm, and a concentration of 25 ng / ml having an OD _{655 nm} value of 1 was set as a titration reference value, and the results are shown in FIG. 8A.

또한, 농도 의존차단능력을 검증하기 위하여 14D6 0.05, 0.5, 5, 50, 500 또는 5000ng/ml와 재조합 인간 CD40L 단백질 (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E) 12.5 또는 25ng/ml을 각각 동일한 용량으로 섞고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. HEK-Blue CD40L 세포를 10 (v/v)% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용해 필요량만큼 희석하고, 96 웰 플레이트에 8x10⁴cells/180μl/웰씩 분주하였다.In addition, to verify the concentration-dependent blocking ability, 14D6 0.05, 0.5, 5, 50, 500 or 5000 ng/ml and recombinant human CD40L protein (Sino biological, Beijing, China, Accession#: NP_000065.1, Cat: 10239-H08E) 12.5 or 25 ng/ml were mixed in the same volume and reacted at room temperature for 30 minutes. HEK-Blue CD40L cells were diluted to the required amount using DMEM medium supplemented with 10 (v/v)% FBS, and dispensed into a 96-well plate at 8x10 ⁴ cells/180 μl/well.

상기 14D6와 재조합 인간 CD40L 단백질을 반응시킨 혼합물을 20μl/웰씩 상기 HEK-Blue CD40L 세포를 분주시킨 웰에 넣어준 다음 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 콴티블루용액을 새로운 96 웰 플레이트에 150μl/웰씩 분주하고, 상기 24시간 배양한 샘플을 해당 웰에 50μl/웰씩 첨가하였다. 37℃ 조건에서 30분 동안 반응시킨 후 655nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 8b에 나타내었다.The mixture obtained by reacting 14D6 with recombinant human CD40L protein was added to the wells in which the HEK-Blue CD40L cells were dispensed at 20 μl/well, and cultured for 24 hours in a 37°C, 5% CO ₂ cell incubator. QuantiBlue solution was dispensed into a new 96-well plate at 150 μl/well, and the 24-hour cultured sample was added to the corresponding well at 50 μl/well. After reacting for 30 minutes at 37° C., absorbance was measured at a wavelength of 655 nm, and the results are shown in FIG. 8B.

그 결과, 14D6 항체의 농도가 증가함에 따라 OD 값이 감소한 것을 확인하여, 14D6 처리 농도에 따라 기능차단이 이루어진 것을 확인하였고, 재조합 인간 CD40L 단백질을 12.5ng/ml의 농도로 사용하였을 경우, 항체농도 50ng/ml 이상에서부터, 재조합 인간 CD40L 단백질을 12.5ng/ml의 농도로 사용하였을 경우, 항체농도 500ng/ml 이상에서부터 완전하게 차단이 이루어진 것을 확인하였다 (도 8b).As a result, it was confirmed that the OD value decreased as the concentration of the 14D6 antibody increased, and it was confirmed that the function was blocked according to the 14D6 treatment concentration, and when the recombinant human CD40L protein was used at a concentration of 12.5 ng/ml, the antibody concentration From 50 ng/ml or more, when the recombinant human CD40L protein was used at a concentration of 12.5 ng/ml, it was confirmed that complete blocking was achieved from an antibody concentration of 500 ng/ml or more (FIG. 8B).

실시예 3-3. 세포사이부착분자-1 (ICAM-1) 발현 여부를 이용한 분석Example 3-3. Analysis using intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression

CD40과 CD40L가 상호작용할 경우 ICAM-1 발현이 증가하는데, 14D6을 처리하는 경우 CD40과 CD40L 상호작용 차단에 의한 ICAM-1 발현 수준 감소 여부를 확인하기 위해, 14D6 항체 처리 시 ICAM-1 발현 정도를 확인하기 위해 실험을 진행하였다.When CD40 and CD40L interact, ICAM-1 expression increases. In the case of treatment with 14D6, to determine whether the ICAM-1 expression level was reduced by blocking the interaction between CD40 and CD40L, the level of ICAM-1 expression was measured when treated with 14D6 antibody. An experiment was conducted to confirm.

구체적으로. 상기 실시예 1-2에서 준비한 CD40L 표면발현 CHO 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 2x10⁴cells/100μl씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 각 웰마다 Ramos 세포 (ATCC, Virginia, USA)를 5x10⁴cells/100μl씩 넣었다. 세포가 혼재된 웰에 14D6을 0.1, 0.2, 0.5, 1, 또는 2μg/50μl씩 넣고, 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 배양한 세포를 모두 모은 후, B세포 (Ramos 세포) 선별을 위한 CD19-PECy7 항체 (BD biosciences, New jersey, USA)와 세포사이부착분자-1 (intercellular adhesion molecule-1; ICAM-1) 검출을 위한 DNP007-FITC 항체 (Dinona, Seongnam-si, Korea) (대한민국 등록공보 제 10-2063341 호, 유럽 공개특허 EP 3909979 A1에서 제조된 항체)를 처리하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, 유세포분석기 (Stratedigm, California, USA)로 측정하였다. 음성대조군으로 상기 Ramos 세포를 단독으로 배양한 것, 양성대조군으로는 상기 CD40L 표면발현 CHO 세포에 Ramos 세포를 넣고 상기 14D6를 첨가하지 않고 배양한 것을 준비하였다. 상기 유세포 분석기로 측정하여, CD40L의 ICAM-1을 발현시키는 기능을 차단하는지 여부를 확인한 결과를 도 9a 내지 9d에 나타내었다. 도 9c의 dot plot은 상기 대조군의 발현 정도, 도 9d의 dot plot은 상기 14D6을 처리한 경우 농도 별 발현 정도를 나타낸다. 상기 도 9c의 blocking efficiency graph는 각 농도에 따른 blocking 비율을 하기 수학식 1에 의해 구하였다.Specifically. The CD40L surface-expressing CHO cells prepared in Example 1-2 were dispensed per well at 2x10 ⁴ cells/100 μl per well in a 96-well plate, and cultured for 24 hours in a 37°C, 5% CO ₂ cell incubator. Thereafter, 5x10 ⁴ cells/100 μl of Ramos cells (ATCC, Virginia, USA) were added to each well. 0.1, 0.2, 0.5, 1, or 2 μg/50 μl of 14D6 was added to the cell-mixed well, and incubated for 24 hours in a 37°C, 5% CO ₂ cell incubator. After collecting all the cultured cells, CD19-PECy7 antibody (BD biosciences, New Jersey, USA) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) detection for selection of B cells (Ramos cells) DNP007-FITC antibody (Dinona, Seongnam-si, Korea) for (Korean Registration No. 10-2063341, antibody prepared in European Patent Publication EP 3909979 A1) was treated and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. 2 ml of PBS was added thereto and centrifugation was performed at 1700 rpm for 3 minutes to remove unbound antibodies, and the results were measured using a flow cytometer (Stratedigm, California, USA). As a negative control, Ramos cells were cultured alone, and as a positive control, Ramos cells were added to the CD40L surface-expressing CHO cells and cultured without the addition of 14D6. 9a to 9d show the results of confirming whether or not the function of CD40L to express ICAM-1 is blocked by measuring with the flow cytometer. The dot plot in FIG. 9c shows the expression level of the control group, and the dot plot in FIG. 9d shows the expression level by concentration when the 14D6 is treated. In the blocking efficiency graph of FIG. 9C, the blocking ratio according to each concentration was obtained by Equation 1 below.

[수학식 1][Equation 1]

Blocking efficiency = 100% - (각 농도별 dot blot에서 1사분면에 위치한 점들의 비율 / 양성대조군의 dot blot에서 1사분면에 위치한 점들의 비율 (83.4%)) x 100%Blocking efficiency = 100% - (Ratio of dots located in the 1st quadrant in the dot blot for each concentration / Ratio of dots located in the 1st quadrant in the positive control dot blot (83.4%)) x 100%

(상기 각 농도별 dot blot에서 1사분면에 위치한 점들의 비율은 각 농도별 dot blot에 분포하고 있는 전체 점 대비 1사분면에 위치한 점들의 비율을 의미한다)(The ratio of dots located in the first quadrant in the dot blot for each concentration above means the ratio of dots located in the first quadrant to all dots distributed on the dot blot for each concentration)

그 결과, 14D6 항체 농도가 증가함에 따라 차단이 일어나, ICAM-1 발현 수준이 감소하였으며, 0.5μg/test 이상의 농도에서는 포화상태의 결합으로 인해 ICAM-1이 거의 발현되지 않은 것을 확인하였다 (도 9a 내지 9d).As a result, as the concentration of the 14D6 antibody increased, blocking occurred, and the expression level of ICAM-1 decreased, and at a concentration of 0.5 μg/test or higher, it was confirmed that ICAM-1 was hardly expressed due to saturating binding (FIG. 9a). to 9d).

실시예 4. 14D6 마우스 항체와 키메릭 항체의 비교Example 4. Comparison of 14D6 mouse antibody and chimeric antibody

실시예 4-1. 14D6 키메릭 항체 제작 및 서열 확인Example 4-1. 14D6 chimeric antibody construction and sequence confirmation

상기 실시에 1-1에서 준비한 14D6을 생산하는 하이브리도마로부터 RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용해 RNA를 추출한 다음, 마우스 Ig-프라이머셋 (Novagen, Wisconsin, USA)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 통해 14D6의 가변부위 DNA를 확보하였고, 상기 중합효소연쇄반응은 PCR kit (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여, 95℃에서 5분동안 진행하고, 95℃ 60초, 60℃ 60초, 72℃ 60초의 3 step을 35 cycle로 진행하고, 72℃에서 5분동안 진행하는 조건으로 수행하였고, 사용된 프라이머 정보를 하기 표 2에 나타내었다.RNA was extracted from the hybridoma producing 14D6 prepared in Example 1-1 using RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), and then polymerized using mouse Ig-primer set (Novagen, Wisconsin, USA) 14D6 variable region DNA was secured through enzyme chain reaction, and the polymerase chain reaction was carried out at 95 ° C for 5 minutes using a PCR kit (Bioneer, Daejeon, Korea), 95 ° C for 60 seconds, 60 ° C 60 seconds, 3 steps of 72 ° C. for 60 seconds were performed in 35 cycles, and carried out under the conditions of 5 minutes at 72 ° C., and the primer information used is shown in Table 2 below.

명명denomination 서열order 프라이머명Primer name 서열번호sequence number Primer_Heavy_ChainPrimer_Heavy_Chain ACTAGTCGACATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTTACTAGTCGACATGAAATGCAGCTGGRTYATSTTCTT MuIgVH5’-DMuIgVH5’-D 1212 Primer_Light_ChainPrimer_Light_Chain ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGTACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT MuIgkVL5’-CMuIgkVL5'-C 1313

(상기 표 2에서 R은 A 또는 G, Y는 C 또는 T, K는 G 또는 T, S는 C 또는 G, M는 A 또는 C, W는 A 또는 T, D는 A 또는 G 또는 T, H는 A 또는 C 또는 T, V는 A, C 또는 G, B는 C, G 또는 T를 의미하고, 관련 내용은 상기 사용된 Ig-프라이머셋에 기재되어 있다)상기 DNA를 T벡터 (Promega, Madison, USA)에 삽입하고 형질전환한 후 코스모진텍 (Cosmogenetech, Seoul, Korea) 사에 의뢰하여, DNA 서열을 확인하였다. 상기 확인된 14D6의 가변부위 DNA를 코스모진텍 (Cosmogenetech, Seoul, Korea) 사에 의뢰하여 사람 항체 불변부위와 함께 합성하였고, 합성된 것을 제한효소 EcoRI, XhoI (Biolabs, Massachusetts, USA) 로 절단하여 원하는 부분의 DNA만 확보하였다. 이후 pcDNA3.4 발현벡터 (Invitrogen, Waltham, USA)에 삽입하고 형질전환한 후, 다시 한 번 14D6 유전자의 중쇄 가변영역 (서열번호 1 및 2) 및 14D6 경쇄 가변영역 (서열번호 3 및 4)의 DNA 서열을 확인하여 제대로 된 키메릭항체가 제작되었는지 확인하였고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 10에 나타내었다.(In Table 2, R is A or G, Y is C or T, K is G or T, S is C or G, M is A or C, W is A or T, D is A or G or T, H Is A or C or T, V is A, C or G, B is C, G or T, and related information is described in the used Ig-primer set) The DNA is converted into a T vector (Promega, Madison , USA), and after transformation, Cosmogenetech (Cosmogenetech, Seoul, Korea) was commissioned to confirm the DNA sequence. The identified 14D6 variable region DNA was requested to Cosmogenetech (Seoul, Korea) and synthesized together with the human antibody constant region, and the synthesized DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and XhoI (Biolabs, Massachusetts, USA). Only the DNA of the desired part was obtained. Then, after insertion into the pcDNA3.4 expression vector (Invitrogen, Waltham, USA) and transformation, the heavy chain variable region (SEQ ID NOs: 1 and 2) and the 14D6 light chain variable region (SEQ ID NOS: 3 and 4) of the 14D6 gene were once again inserted into the expression vector (Invitrogen, Waltham, USA). It was confirmed whether the correct chimeric antibody was produced by confirming the DNA sequence, and the results are shown in Table 3 and FIG. 10 below.

명명denomination 서열order 서열번호sequence number 14D6-V_H-CDR1-Amino_Acid14D6- _VH -CDR1-Amino_Acid GYTFTRYYGYTFTRYY 1One 14D6-V_H-CDR2-Amino_Acid14D6- _VH -CDR2-Amino_Acid INPTNGDTINPTNGDT 22 14D6-V_H-CDR3-Amino_Acid14D6-VH- _CDR3 -Amino_Acid TRPLGSRDAMDYTRPLGSRDAMDY 33 14D6-V_L-CDR1-Amino_Acid14D6- _VL -CDR1-Amino_Acid QSVSSSRYSYQSVSSSRYSY 44 14D6-V_L-CDR2-Amino_Acid14D6- _VL -CDR2-Amino_Acid YASYAS 55 14D6-V_L-CDR3-Amino_Acid 14D6- _VL -CDR3-Amino_Acid QHSWELPWTQHSWELPWT 66 14D6-V_H-Amino_Acid14D6- _VH -Amino_Acid QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKAS GYTFTRYY MFWVKQRPGQGLEWIGE INPTNGDT NFNEEFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC TRPLGSRDAMDY WGPGTSVTVSSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKAS GYTFTRYY MFWVKQRPGQGLEWIGE INPTNGDT NFNEEFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYC TRPLGSRDAMDY WGPGTSVTVSS 77 14D6-V_L-Amino_Acid14D6- _VL -Amino_Acid DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS QSVSSSRYSY MHWYQQKPGQPPKLLIK YAS SLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEGEDTATYYC QHSWELPWT FGGGTKLEIKDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS QSVSSSRYSY MHWYQQKPGQPPKLLIK YAS SLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEGEDTATYYC QHSWELPWT FGGGTKLEIK 88 14D6-V_H-Gene14D6- _VH -Gene caggtgcagcttcaacaaagtggtgccgaattggtgaaacccggggccagcgtgaagttgtcctgcaaagcaagtggttatacttttactcgatattatatgttctgggttaagcaacgtccaggtcaagggctggaatggatcggcgaaattaaccctacaaacggagataccaactttaacgaagagttcaaaagtaaggccactttgacagtcgacaagagtagcagtaccgcatacatgcagttgtctagcctcacaagcgaggattccgctgtgtattattgcacacgccctttgggctcacgcgatgcaatggattactggggtccagggacatctgtcactgtgtcttcacaggtgcagcttcaacaaagtggtgccgaattggtgaaacccggggccagcgtgaagttgtcctgcaaagcaagtggttatacttttactcgatattatatgttctgggttaagcaacgtccaggtcaagggctggaatggatcggcgaaattaaccctacaaacggagataccaactttaacgaagagttcaaaagtaaggccactttgacagtcga caagagtagcagtaccgcatacatgcagttgtctagcctcacaagcgaggattccgctgtgtattattgcacacgccctttgggctcacgcgatgcaatggattactggggtccagggacatctgtcactgtgtcttca 99 14D6-V_L-Gene14D6- _VL -Gene gacatagtactgacacaaagccctgcatcactggcagtctctctcgggcagcgagctactatatcatgccgcgcttcacagagtgtctcaagctccagatatagctatatgcactggtaccaacaaaagcctgggcagccaccaaaattgttgattaaatatgcctcttccctggaaagtggagttcccgcaagatttagcgggagcgggtctgggaccgactttacattgaatatacacccagtcgaaggtgaggacacagccacatattactgccaacattcatgggagttgccctggactttcggaggaggaactaagctcgaaataaaagacatagtactgacacaaagccctgcatcactggcagtctctctcgggcagcgagctactatatcatgccgcgcttcacagagtgtctcaagctccagatatagctatatgcactggtaccaacaaaagcctgggcagccaccaaaattgttgattaaatatgcctcttccctggaaagtggagttcccgcaagatttagcgggagcgggtctgggacc gactttacattgaatatacacccagtcgaaggtgaggacacagccacatattactgccaacattcatgggagttgccctggactttcggaggaggaactaagctcgaaataaaa 1010

(상기 표 3에서 Amino_Acid는 아미노산 서열을 의미하고, Gene은 코딩 핵산 서열을 의미하고, 밑줄 친 굵은 글씨 는 각 서열의 CDR 부위를 의미한다)(In Table 3 above, Amino_Acid means the amino acid sequence, Gene means the coding nucleic acid sequence, and the underlined bold text means the CDR region of each sequence)

실시예 4-2. 14D6 마우스항체와 키메릭항체의 기능 비교Example 4-2. Comparison of functions between 14D6 mouse antibody and chimeric antibody

ExpiCHO-S 세포 (Gibco, Texas, USA)를 6mM 글루타맥스 (Glutamax, Gibco, Texas, USA)가 첨가된 BalanCD 배지 (Irvine scientific, California, USA)를 이용해 배양하고, 250ml 플라스크에 6x10⁸개/100ml가 되도록 준비하여 125rpm, 37℃, 8% CO₂ 세포배양기에서 5분간 안정화시켰다. 상기 실시예 4-1에서 준비한 키메릭항체의 DNA의 경쇄부분 66μg, 중쇄부분 34μg을 OptiPRO 배지 (Gibco, Texas, USA) 2ml에, ExpiFectamine CHO 용액 (Gibco, Texas, USA) 320μl를 OptiPRO 배지 3.7ml에 넣고 혼합하였다. 상기 DNA 혼합물과 ExpiFectamine CHO 용액 혼합물을 섞고, 상온에서 2분 동안 반응시켰다. 이후 해당 반응물을 상기 ExpiCHO-S 세포에 천천히 떨어뜨린 다음 125rpm, 37℃, 8% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. 24시간 후, ExpiCHO 피드 (Gibco, Texas, USA) 24ml와 ExpiCHO 인핸서 (Gibco, Texas, USA) 600μl를 잘 섞은 후, 세포생존율이 70% 이하가 될 때까지 125rpm, 37℃, 8% CO₂ 세포배양기에서 배양하여 키메릭 항체 14D6을 생산하였다. CD40L을 세포표면에 발현하는 CHO 세포주에 음성 대조군으로, 1x PBS 또는 상기 ExpiCHO-S에서 생산한 14D6 키메릭 항체가 포함된 배양액을 각각 100ul씩 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, 결합여부를 확인하기 위해 염소 항-인간Ig-FITC 항체 (Jackson, Pennsylvania, USA)를 넣었다. 4℃에서 20분 동안 반응시킨 후 PBS 2ml을 이용해 상기 실시예 1-1와 실질적으로 동일한 방법으로 세척한 다음 유세포분석기로 측정하여 배양액 내의 14D6 키메릭항체가 CD40L과 결합하는지 확인하였고, 그 결과를 도 11a 및 도 11b에 나타내었다. 키메릭항체는 반응물 대신 1x PBS를 처리한 음성 대조군과 비교하였을 때, CD40L에 더 잘 결합하는 것을 확인하였으며 (도 11a), 14D6 마우스항체 비교하였을 때 유사한 정도로 결합한 것을 확인하였다 (도 11b).ExpiCHO-S cells (Gibco, Texas, USA) were cultured using BalanCD medium (Irvine scientific, California, USA) supplemented with 6mM Glutamax (Glutamax, Gibco, Texas, USA), and 6x10 ⁸ cells/piece were added to a 250ml flask. It was prepared to be 100ml and stabilized for 5 minutes in a 125rpm, 37℃, 8% CO ₂ cell incubator. 66 μg of the light chain part and 34 μg of the heavy chain part of the DNA of the chimeric antibody prepared in Example 4-1 were added to 2 ml of OptiPRO medium (Gibco, Texas, USA), and 320 μl of ExpiFectamine CHO solution (Gibco, Texas, USA) was added to 3.7 ml of OptiPRO medium. was added and mixed. The DNA mixture and the ExpiFectamine CHO solution mixture were mixed and reacted at room temperature for 2 minutes. Thereafter, the corresponding reactants were slowly dropped onto the ExpiCHO-S cells and then cultured in a cell incubator at 125 rpm, 37° C., and 8% CO ₂ . After 24 hours, 24 ml of ExpiCHO feed ₍ Gibco, Texas, USA) and 600 μl of ExpiCHO enhancer (Gibco, Texas, USA) were mixed well, and the cells were incubated at 125 rpm, 37°C, 8% CO until the cell viability was less than 70%. The chimeric antibody 14D6 was produced by culturing in an incubator. As a negative control, 100 ul each of 1x PBS or a culture solution containing the 14D6 chimeric antibody produced by ExpiCHO-S was added to the CHO cell line expressing CD40L on the cell surface, and reacted at 4° C. for 30 minutes. 2 ml of PBS was added and centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes to remove unbound antibodies, and goat anti-human Ig-FITC antibody (Jackson, Pennsylvania, USA) was added to confirm binding. After reacting at 4°C for 20 minutes, it was washed with 2 ml of PBS in substantially the same manner as in Example 1-1, and then measured by flow cytometry to confirm whether the 14D6 chimeric antibody in the culture medium binds to CD40L. 11a and 11b are shown. It was confirmed that the chimeric antibody binds better to CD40L when compared to the negative control treated with 1x PBS instead of the reactant (FIG. 11a), and binds to a similar degree when compared to the 14D6 mouse antibody (FIG. 11b).

추가적으로, 14D6 키메릭항체와 마우스항체가 동일한 결합 부위를 인지하는지 확인하고자 두 가지 항체를 함께 처리하여 차단효과를 검증하였다. 구체적으로, 마우스항체를 먼저 처리하고 키메릭항체를 처리하거나, 키메릭항체를 먼저 처리하고 마우스항체를 처리하는 방식으로 차단효과를 확인하였다. 그 중, 마우스항체를 먼저 처리하고 키메릭항체를 처리하고 PBS 2ml을 넣고 1700rpm에서 3분간 원심 분리하여 세척한 후, 차단효과를 상기 유세포 분석기로 분석하여 확인하였고, 그 결과를 도 11c에 나타내었다. 그 결과, 상기 두 가지 경우에서 모두 결합능력이 저하되는 것을 확인할 수 있었고, 14D6 키메릭항체와 마우스항체가 동일한 결합 부위를 인지한다는 것을 확인하였다.Additionally, in order to confirm whether the 14D6 chimeric antibody and the mouse antibody recognize the same binding site, the two antibodies were treated together to verify the blocking effect. Specifically, the blocking effect was confirmed by treating the mouse antibody first and then the chimeric antibody, or treating the chimeric antibody first and then the mouse antibody. Among them, the mouse antibody was first treated, then the chimeric antibody was treated, 2 ml of PBS was added, centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes, washed, and the blocking effect was analyzed by the flow cytometer, and the results are shown in FIG. 11C . As a result, it was confirmed that the binding ability was reduced in both cases, and it was confirmed that the 14D6 chimeric antibody and the mouse antibody recognized the same binding site.

<110> Kumho HT, Inc. <120> Antibody specifically binding to CD40L and use thereof <130> DPP20214802KR <160> 13 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VH-CDR1-Amino_Acid <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VH-CDR2-Amino_Acid <400> 2 Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VH-CDR3-Amino_Acid <400> 3 Thr Arg Pro Leu Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VL-CDR1-Amino_Acid <400> 4 Gln Ser Val Ser Ser Ser Arg Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VL-CDR2-Amino_Acid <400> 5 Tyr Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VL-CDR3-Amino_Acid <400> 6 Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VH-Amino_Acid <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Met Phe Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Pro Leu Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VL-Amino_Acid <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Arg Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Gly Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VH-Gene <400> 9 caggtgcagc ttcaacaaag tggtgccgaa ttggtgaaac ccggggccag cgtgaagttg 60 tcctgcaaag caagtggtta tacttttact cgatattata tgttctgggt taagcaacgt 120 ccaggtcaag ggctggaatg gatcggcgaa attaacccta caaacggaga taccaacttt 180 aacgaagagt tcaaaagtaa ggccactttg acagtcgaca agagtagcag taccgcatac 240 atgcagttgt ctagcctcac aagcgaggat tccgctgtgt attattgcac acgccctttg 300 ggctcacgcg atgcaatgga ttactggggt ccagggacat ctgtcactgt gtcttca 357 <210> 10 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14D6-VL-Gene <400> 10 gacatagtac tgacacaaag ccctgcatca ctggcagtct ctctcgggca gcgagctact 60 atatcatgcc gcgcttcaca gagtgtctca agctccagat atagctatat gcactggtac 120 caacaaaagc ctgggcagcc accaaaattg ttgattaaat atgcctcttc cctggaaagt 180 ggagttcccg caagatttag cgggagcggg tctgggaccg actttacatt gaatatacac 240 ccagtcgaag gtgaggacac agccacatat tactgccaac attcatggga gttgccctgg 300 actttcggag gaggaactaa gctcgaaata aaa 333 <210> 11 <211> 261 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human_CD40L_Protein <400> 11 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_Heavy_Chain <400> 12 actagtcgac atgaaatgca gctggrtyat sttctt 36 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_Light_Chain <400> 13 actagtcgac atggagwcag acacactsct gytatgggt 39 <110> Kumho HT, Inc. <120> Antibody specifically binding to CD40L and use thereof <130> DPP20214802KR <160> 13 <170> enPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VH-CDR1-Amino_Acid <400> 1 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VH-CDR2-Amino_Acid <400> 2 Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VH-CDR3-Amino_Acid <400> 3 Thr Arg Pro Leu Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VL-CDR1-Amino_Acid <400> 4 Gln Ser Val Ser Ser Ser Arg Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VL-CDR2-Amino_Acid <400> 5 Tyr Ala Ser One <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VL-CDR3-Amino_Acid <400> 6 Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VH-Amino_Acid <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Tyr Met Phe Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Thr Asn Gly Asp Thr Asn Phe Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Pro Leu Gly Ser Arg Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 111 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VL-Amino_Acid <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Arg Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Gly Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp 85 90 95 Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 357 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VH-Gene <400> 9 caggtgcagc ttcaacaaag tggtgccgaa ttggtgaaac ccggggccag cgtgaagttg 60 tcctgcaaag caagtggtta tacttttact cgatattata tgttctgggt taagcaacgt 120 ccaggtcaag ggctggaatg gatcggcgaa attaacccta caaacggaga taccaacttt 180 aacgaagagt tcaaaagtaa ggccactttg acagtcgaca agagtagcag taccgcatac 240 atgcagttgt ctagcctcac aagcgaggat tccgctgtgt attattgcac acgccctttg 300 ggctcacgcg atgcaatgga ttactggggt ccagggacat ctgtcactgt gtcttca 357 <210> 10 <211> 333 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 14D6-VL-Gene <400> 10 gacatagtac tgacacaaag ccctgcatca ctggcagtct ctctcgggca gcgagctact 60 atatcatgcc gcgcttcaca gagtgtctca agctccagat atagctatat gcactggtac 120 caacaaaagc ctgggcagcc accaaaattg ttgattaaat atgcctcttc cctggaaagt 180 ggagttcccg caagatttag cgggagcggg tctgggaccg actttacatt gaatatacac 240 ccagtcgaag gtgaggacac agccacatat tactgccaac attcatggga gttgccctgg 300 actttcggag gaggaactaa gctcgaaata aaa 333 <210> 11 <211> 261 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Human_CD40L_Protein <400> 11 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer_Heavy_Chain <400> 12 actagtcgac atgaaatgca gctggrtyat sttctt 36 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer_Light_Chain <400> 13 actagtcgac atggagwcag acacactsct gytatgggt 39

Claims

다음의 상보성 결정부위 (complementarity determining region; CDRs)를 포함하는, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2,
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및
서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3.An anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following complementarity determining regions (CDRs):
CDR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
CDR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
CDR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
CDR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
CDR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and
CDR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.

제1항에 있어서,
서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편.According to claim 1,
a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7; and
Light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8
Including, anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof.

제1항 또는 제2항에 있어서, 항 CD40L 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체인, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편.The anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, wherein the anti-CD40L antibody is an animal antibody, a chimeric antibody, or a humanized antibody.

제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 CD40L 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편.The anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, wherein the antigen-binding fragment is scFv, (scFv)2, Fab, Fab', or F(ab')2 of the anti-CD40L antibody.

제1항 또는 제2항의 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating T-cell mediated immune diseases comprising the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1 or 2.

제5항에 있어서, 상기 T-세포 매개성 면역 질환은 이식거부, 이식편대 숙주질환, 천식, 또는 자가면역질환인, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.The pharmaceutical composition for preventing or treating T-cell mediated immune disease according to claim 5, wherein the T-cell mediated immune disease is transplant rejection, graft versus host disease, asthma, or an autoimmune disease.

제6항에 있어서, 상기 자가면역질환은 뇌척수염, 류마티스 관절염, 전신홍반성 낭창, 아토피 피부염, 다발성 경화증, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결정성 다발동맥염, 기쿠치병, 교원병, 하시모코 갑상선염, 건선, 백반증, 갑상선 기능 항진증, 섬유근육통, 원형탈모, 알러지, 포도막염 또는 자가면역 용혈성 빈혈인, T-세포 매개성 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.The method of claim 6, wherein the autoimmune disease is encephalomyelitis, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, multiple sclerosis, type 1 diabetes, Crohn's disease, ulcerative colitis, Behçet's disease, Sjogren's syndrome, myasthenia gravis, scleroderma, crystallosis Pharmaceutical composition for prevention or treatment of polyarteritis, Kikuchi disease, collagen disease, Hashimoko's thyroiditis, psoriasis, vitiligo, hyperthyroidism, fibromyalgia, alopecia areata, allergy, uveitis or autoimmune hemolytic anemia, T-cell mediated immune disease .

서열번호 1 내지 6 중에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 암호화하는, 핵산 분자.A nucleic acid molecule encoding one or more amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 6.

서열번호 7의 아미노산 서열;
서열번호 8의 아미노산 서열; 또는
이들 모두를 암호화하는, 핵산 분자.the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7;
the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8; or
A nucleic acid molecule that encodes all of them.

제9항에 있어서,
서열번호 9의 핵산 서열;
서열번호 10의 핵산 서열; 또는
이들 모두를 포함하는, 핵산분자.According to claim 9,
the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 9;
the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 10; or
Nucleic acid molecules, including all of them.

제8항 또는 제10항의 핵산 분자를 포함하는, 재조합 벡터.A recombinant vector comprising the nucleic acid molecule of claim 8 or 10 .

제11항의 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 세포.A recombinant cell comprising the recombinant vector of claim 11 .

제12항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.A method for producing an anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof, comprising culturing the recombinant cell of claim 12.

제1항 또는 제2항의 항 CD40L 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, CD40L 검출용 조성물.A composition for detecting CD40L, comprising the anti-CD40L antibody or antigen-binding fragment thereof of claim 1 or 2.