JP6976322B2 - 新規抗ｃｔｌａ４抗体 - Google Patents

Description

本開示内容は、概して、新規抗ＣＴＬＡ４抗体に関する。

配列表の参照
本出願は、以下の表に示す配列を含有する。参照により本明細書に組み込まれる、配列表のコンピュータによって読み取り可能なコピーが、本出願とともに提出される。

Ｔ細胞の活性化には、２つの別個のシグナルが必要である。第１のものは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面のＭＨＣに関連して提示される名目上の抗原との間の抗原特異的相互作用である。第２のシグナルは、いくつかの可能性ある同時刺激分子を介して提供される。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞応答を広げるまたは下方制御する細胞表面タンパク質を含む複数の機序によって厳しく調節されている（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， （１９７０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ６９： １０４２； Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （２００２） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ７３： Ｓ３１−Ｓ３５）。ＣＤ２８、構成的に発現されるＩｇ−ファミリータンパク質は、Ｔ細胞応答の最良に特性決定された同時刺激シグナルの１つである。ＡＰＣ上のリガンドＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）とのＣＤ２８結合は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および抗アポトーシス因子の産生を誘導することによってＴ細胞増殖につながる。ＣＴＬＡ４は、共阻害分子として同定された最初の分子であり、体液性および細胞性免疫応答の両方の調節において重要な役割を果たす（Ｂｒｕｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：２６７−２７０）。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８スーパーファミリーに属し、ＣＤ２８に対して３１％の全体的なアミノ酸同一性を有する。ＣＴＡＬ４は、細胞外ＩｇＶドメインのジスルフィド結合ホモ二量体から構成される（Ｓｔａｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｎａｔｕｒｅ ４１０： ６０８−６１１）。他の阻害性受容体とは異なり、ＣＴＬＡ４は、古典的な免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を欠く。これにもかかわらず、２種のホスファターゼ、ＳＨＰ−２およびセリン−トレオニンホスファターゼタンパク質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、ＣＴＬＡ４のＹＶＫＭモチーフと会合すると報告されている（Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２２９： １２−２６）。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４は、その天然リガンドとしてＣＤ８０およびＣＤ８６を共有する。しかし、ＣＴＬＡ４：Ｂ７相互作用の親和性は、ＣＤ２８：Ｂ７相互作用の親和性よりも１０倍高い（Ｐｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９４）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８０：２０４９−２０５８）。これによって、ＣＴＬＡ４が、ＣＤ２８からＢ７リガンドを捕捉し、ＣＤ２８依存性同時刺激をアンタゴナイズすることが可能となり、これは、Ｔ細胞活性化に対するＣＴＬＡ４の阻害効果の一部を説明する。ＣＴＬＡ４はまた、Ｔ細胞応答を減弱するＴＣＲシグナルとは独立した別個の遠位シグナルを送達することが提案されている（Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．， （１９９７）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８６：１６４５−１６５３）。ＡＰＣ上のＢ７分子と相互作用することによって、ＣＴＬＡ４は、トリプトファンのキヌレニンへの変換を触媒するＩＤＯの発現を誘導し、局所トリプトファン枯渇とその後のＴ細胞増殖および活性化の阻害をもたらす（Ｍｅｌｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６： １３９１−１４０１）。脂質ラフトが会合しているＣＴＬＡ４は、ＴＣＲ複合体と親密に相互作用し、脂質ラフト完全性およびＴＣＲ媒介性シグナルを変更した（Ｃｈｉｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．， （２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９７：１２９−１３５）。さらに、ＣＴＬＡ４は、活性化されたＴ細胞上のシナプスへのリクルートの結果としてＢ７ライゲーションとは独立に機能し得る（Ｃｈｉｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５： １７７−１８１）。

負のレギュレーターとしてのＣＴＬＡ４の重要性は、ＣＴＬＡ４ノックアウトマウスの表現型によって著しく示される（Ｔｉｖｏｌ ｅｔ ａｌ．， （１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：５４１−５４７）。ＣＴＬＡ４欠損マウスは、抗原の認識およびＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＤ２８間の対立しないまたは競合しない同時刺激相互作用の後の、Ｔ細胞の過剰な増殖に起因する、脾腫、リンパ節腫大および多臓器Ｔリンパ性浸潤を伴う広範囲の急速致死性Ｔリンパ増殖性疾患を発症する。さらに、ＣＴＬＡ４遺伝子の多型は、１型糖尿病、甲状腺炎、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチを含むいくつかの自己免疫疾患と関連している（Ｇｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， （２００５） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２０４：１０２−１５）。

ＣＤ２８は、ほとんどの休止Ｔ細胞および活性化されたＴ細胞で発現されるが、ＣＴＬＡ４は、構成的に発現される制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の場合を除いて、活性化されたＴ細胞に制限される。ＣＴＬＡ４は、ＴｒｅｇおよびＣＤ８エフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の両方で機能する。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ８^＋エフェクター機能の調節において転写因子Ｅｏｍｅｓを標的とし、ＩＦＮγおよびグランザイムＢ発現および潜在的な細胞溶解性Ｔ細胞機能の低減をもたらす。Ｔｒｅｇ細胞でのＣＴＬＡ４発現の喪失は、その抑制機能を損ない、病的自己免疫を誘発する。ＣＴＬＡ４のＴｅｆｆに対する阻害効果およびＴｒｅｇに対する刺激効果は、免疫応答の減弱につながり、したがって、耐性および／またはアネルギーを媒介する（Ｃａｒｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５： １３５２−１３５６； Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５： ３０３７−３０４２）。

ＣＴＬＡ４は、その免疫応答における負の役割のために、癌の成長および発生との相関を有するとわかった。ＣＴＬＡ４は、腫瘍において、腫瘍内Ｔｅｆｆ細胞と比較して高レベルでＴｒｅｇ細胞で発現され、抗ＣＴＬＡ４は、完全な腫瘍保護を誘導するために、Ｔｒｅｇ細胞と、およびＴｅｆｆ細胞と結合することが必要であることがわかっている（Ｐｅｇｇｓ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０６： １７１７）。さらに、抗ＣＴＬＡ４媒介性腫瘍破壊は、腫瘍内ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ細胞比の増大および腫瘍内ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ細胞比の増大と規則的に関連していた（Ｑｕｅｚａｄａ ｅｔ ａｌ．， （２００６） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１６： １９３５； Ｃｕｒｒａｎ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７： ４２７５）。

動物モデルを用いた初期の研究において、ＣＴＬＡ４の抗体遮断は、自己免疫を増悪させるとわかった（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７： １３３３−６； Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ７３： ５７−６２）。したがって、ＣＴＬＡ４阻害性シグナルの遮断は、腫瘍免疫への拡張によって、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫性を増強し、定着腫瘍の退縮を引き起こすことがわかった。高悪性度結腸癌のマウスモデルでは、例えば、Ｌｅａｃｈらは、ＣＴＬＡ４遮断の治療効力を実証した。ＣＴＬＡ４に向けられた抗体の投与は、ＣＤ８０陽性およびＣＤ８０陰性結腸癌腫両方の腫瘍成長を有意に拒絶した。さらに、この拒絶は、腫瘍細胞に対する続発的曝露に対して免疫性をもたらした。加えて、本発明者らは、抗ＣＴＬＡ４を用いる処置が、マウス線維肉腫Ｓａ１Ｎの成長を低減することを示した（Ｌｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１： １７３４−１７３６）。最近の研究によって、両細胞種でのＣＴＬＡ４の遮断による、Ｔｅｆｆ細胞機能の直接増強およびＴｒｅｇ細胞活性の同時阻害が、癌免疫療法の際に抗ＣＴＬＡ４抗体の完全治療効果を媒介するために必須であることが示唆された（Ｐｅｇｇｓ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０６：１７１７−２５）。

複数の治療的介入と組み合わせたＣＴＬＡ４遮断の多用途性は、４Ｔ１（乳癌）、ＥＬ４（リンパ腫）、ＣＴ２６（結腸癌）などの種々のマウス腫瘍モデルにおいて報告されている（Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６ Ｓｕｐｐｌ １５： ３０４８）。ワクチン（Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７１： ７０−８２）、化学療法（Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８： ５３０１−５３０４）、放射線（Ｄｅｗａｎ ｅｔ ａｌ．， （２００９） Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １５： ５３７９−５３８８）、シトシン−ホスフェートグアニンオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）アジュバント（Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３： ３２８１−３２８８）、抗体（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８４： ５４９３−５５０１； Ｒｅｄｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， （２０１３） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２： １４２−５３）および凍結融解壊死処置（Ｗａｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， （２０１２） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７２： ４３０−４３９．）と組み合わせた、抗腫瘍活性に対する相乗効果が実証されている。一例では、Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌらは、３種の異なる腫瘍株：ＳＡ１Ｎ線維肉腫、Ｍ１０９肺癌腫およびＥＭＴ−６***癌腫を使用して、抗ＣＴＬＡ４抗体およびイクサベピロンの組合せが、これらの腫瘍モデルにおいて、動物の７０〜１００％において長く持続する完全な応答を達成し、各処置単独と比較してかなり優れた有効性をもたらす相乗的抗腫瘍効果を示すことを実証した。完全に腫瘍退縮した動物が、致死用量の腫瘍細胞を用いて再負荷された場合には、イクサベピロンおよびＣＴＬＡ４抗体を用いて処置された動物は、その後の腫瘍を拒絶し、防御的記憶免疫応答の発生を示した（Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．， （２００８） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６ Ｓｕｐｐｌ １５： ３０４８）。

イピリムマブ、ＣＴＬＡ４／Ｂ７相互作用を遮断可能であるヒト抗ＣＴＬＡ４抗体（Ｋｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１： ６２５１−９）は、複数の悪性腫瘍についての種々の臨床治験において試験されている（Ｈｏｏｓ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３７： ５３３−４６； Ａｓｃｉｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．， （２０１１） Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９： １９６）。腫瘍退縮および疾患安定化が頻繁に観察され、種々の臓器系に影響を及ぼすことが可能な炎症性浸潤物を伴う有害事象を伴った。２０１１年には、イピリムマブは、すでに処置されていた進行黒色腫を有する患者の第ＩＩＩ相治験における全生存の改善に基づいて、米国および欧州連合において切除不能なまたは転移性の黒色腫の処置のために承認された（Ｈｏｄｉ ｅｔ ａｌ．， （２０１０） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３： ７１１−２３）。

しかし、イピリムマブ処置は、処置されている人のうち１０〜２０％におけるＴ細胞活性化および増殖のために、重症の、命にかかわる可能性のある免疫学的有害作用と関連していた。イピリムマブ処置の費用は、驚くほど高い。したがって、ＣＴＬＡ４に対する新規抗体を開発することが継続的に必要である。

一態様では、本開示は、ＣＴＬＡ４と結合する新規抗体またはその抗原結合断片、それをコードするポリヌクレオチドおよびそれを使用する方法を提供する。

一実施形態では、抗体またはその断片は、ヒトＣＴＬＡ４と結合する。別の実施形態では、抗体またはその断片は、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ４と結合する。別の実施形態では、抗体またはその断片は、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４の、そのリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用を遮断する。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３、５、７、１９、２１、および２３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列を含む。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１１、１３、１５、２７、２９および３１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列を含む。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号３、配列番号５および／または配列番号７を含む重鎖可変領域、ならびに
ｂ）配列番号１９、配列番号２１および／または配列番号２３を含む重鎖可変領域
からなる群から選択される重鎖可変領域を含む。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号１１、配列番号１３および／または配列番号１５を含む軽鎖可変領域、ならびに
ｂ）配列番号２７、配列番号２９および／または配列番号３１を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号３、配列番号５および／または配列番号７を含む重鎖可変領域、ならびに
配列番号１１、配列番号１３および／または配列番号１５を含む軽鎖可変領域、または
ｂ）配列番号１９、配列番号２１および／または配列番号２３を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２７、配列番号２９および／または配列番号３１を含む軽鎖可変領域
を含む。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１、配列番号１７、配列番号３３、配列番号３７および少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のあるそれらの相同配列からなる群から選択される重鎖可変領域を含む。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９、配列番号２５、配列番号３５、配列番号３９および少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性のあるそれらの相同配列からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号９を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域および配列番号２５を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号３３を含む重鎖可変領域および配列番号３５を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号３７を含む重鎖可変領域および配列番号３９を含む軽鎖可変領域、
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）に対して少なくとも８０％の配列同一性のある重鎖可変領域および軽鎖可変領域
を含む。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴結合アッセイによって測定されるものとして、１０^−９Ｍ以下（例えば、≦９×１０^−１０Ｍ、≦８×１０^−１０Ｍ、≦７×１０^−１０Ｍ、≦６×１０^−１０Ｍ、≦５×１０^−１０Ｍ、≦４×１０^−１０Ｍ、≦３×１０^−１０Ｍ、≦２×１０^−１０Ｍまたは≦１０^−１０Ｍ）のＫＤ値で、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）タンパク質と特異的に結合可能である。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１０^−８Ｍ以下（例えば、≦９×１０^−９Ｍ、≦８×１０^−９Ｍ、≦７×１０^−９Ｍ、≦６×１０^−９Ｍ、≦５×１０^−９Ｍ、≦４×１０^−９Ｍ、≦３×１０^−９Ｍ、≦２×１０^−９Ｍまたは≦１０^−９Ｍ）または１０^−９Ｍ以下（例えば、≦９×１０^−１０Ｍ、≦８×１０^−１０Ｍ、≦７×１０^−１０Ｍ、≦６×１０^−１０Ｍ、≦５×１０^−１０Ｍ、≦４×１０^−１０Ｍ、≦３×１０^−１０Ｍ、≦２×１０^−１０Ｍまたは≦１０^−１０Ｍ）のＫＤ値でサルＣＴＬＡ４と結合する。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるものとして、６００ｎｇ／ｍｌ以下（例えば、≦５００ｎｇ／ｍｌ、≦４００ｎｇ／ｍｌ、≦３００ｎｇ／ｍｌ、≦２００ｎｇ／ｍｌ、≦１００ｎｇ／ｍｌ）のＩＣ５０で、ヒトＣＴＬＡ４のそのリガンドとの結合を阻害可能である。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるものとして、３０ｎｇ／ｍｌ以下（例えば、≦２５ｎｇ／ｍｌ、≦２０ｎｇ／ｍｌ、≦１５ｎｇ／ｍｌ、≦１０ｎｇ／ｍｌ、≦９ｎｇ／ｍｌ、≦８ｎｇ／ｍｌ、≦７ｎｇ／ｍｌ、≦６ｎｇ／ｍｌ、≦５ｎｇ／ｍｌ、≦４ｎｇ／ｍｌ、≦３ｎｇ／ｍｌ、≦２ｎｇ／ｍｌ、≦１ｎｇ／ｍｌ）のＥＣ５０で、ヒトＣＴＬＡ４と結合可能である。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＦＡＣＳアッセイによって測定されるものとして、６００ｎｇ／ｍｌ以下（例えば、≦５００ｎｇ／ｍｌ、≦４００ｎｇ／ｍｌ、≦３００ｎｇ／ｍｌ、≦２００ｎｇ／ｍｌ、≦１００ｎｇ／ｍｌ）または３０ｎｇ／ｍｌ以下（例えば、≦２５ｎｇ／ｍｌ、≦２０ｎｇ／ｍｌ、≦１５ｎｇ／ｍｌ、≦１０ｎｇ／ｍｌ、≦９ｎｇ／ｍｌ、≦８ｎｇ／ｍｌ、≦７ｎｇ／ｍｌ、≦６ｎｇ／ｍｌ、≦５ｎｇ／ｍｌ、≦４ｎｇ／ｍｌ、≦３ｎｇ／ｍｌ、≦２ｎｇ／ｍｌ、≦１ｎｇ／ｍｌ）のＩＣ５０で、ヒトＣＴＬＡ４のそのリガンドとの結合を阻害可能である。

先行する請求項のいずれかの抗体またはその抗原結合断片は、ＦＡＣＳアッセイによって測定されるものとして、６０００ｎｇ／ｍｌ以下、２４００ｎｇ／ｍｌ以下、１２００ｎｇ／ｍｌまたは４００ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＣＴＬＡ４と結合可能である。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化モノクローナル抗体である。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、宿主細胞によって生成される。

別の態様では、本開示は、同一エピトープについて、本明細書において開示される抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ラクダ化された単一ドメイン抗体、ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ジスルフィド安定化ダイアボディー（ｄｓダイアボディー）、ナノボディー、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である。

特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、コンジュゲートをさらに含む。

本開示は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。本開示は、前記の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。本開示は、前記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。特定の実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ベクター中でＳＶ４０プロモーターなどのプロモーターと作動可能に結合される。特定の実施形態では、本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞または２９３Ｆ細胞である。

別の態様では、本開示は、本明細書において開示される抗体またはその抗原結合断片を発現する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、宿主細胞を、抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドが発現される条件下で培養することを含む。

別の態様では、本開示は、本明細書において開示されるような抗体またはその抗原結合断片を含むキットを提供する。

別の態様では、本開示は、個体においてＣＴＬＡ４によって媒介される疾患を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、方法は、個体に本明細書において開示される抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態では、個体は、ＣＴＬＡ４阻害剤に対して応答する可能性が高い障害または状態を有すると同定されている。特定の実施形態では、疾患は癌である。

別の態様では、本開示は、本明細書において開示されるような抗体またはその抗原結合断片および１種以上の医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。これらの実施形態のうち特定のものでは、医薬担体は、例えば、希釈剤、抗酸化剤、アジュバント、賦形剤または非毒性補助物質であり得る。

図１は、ＥＬＩＳＡによって測定されたものとしての、マウス抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０の結合ＥＣ５０を示す図である。図の上のパネルは、マウス抗体の濃度の一定範囲にわたる吸光度を示し、図の下のパネルは、各試験抗体の算出されたＥＣ５０を示す。 図２は、ＦＡＣＳによって測定されたものとしての、マウス抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０の結合ＥＣ５０を示す図である。図の上のパネルは、マウス抗体の濃度の一定範囲にわたる平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図の下のパネルは、各試験抗体の算出されたＥＣ５０を示す。 図３は、ＥＬＩＳＡによって測定されたものとしての、マウス抗ＣＴＬＡ４抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０による、ＣＴＬＡ４リガンドＣＤ８０のＣＴＬＡ４との結合の遮断を示す。図の上のパネルは、抗体の濃度の一定範囲にわたる吸光度を示す。抗ＣＴＬＡ４抗体の遮断ＩＣ５０が、図３の下のパネルに示されている。 図４は、ＦＡＣＳによって測定されたものとしての、マウス抗ＣＴＬＡ４抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０による、ＣＴＬＡ４リガンドＣＤ８０のＣＴＬＡ４との結合の遮断を示す。図の上のパネルは、抗体濃度の一定範囲にわたるＭＦＩを示す。抗ＣＴＬＡ４抗体の遮断ＩＣ５０が、図４の下のパネルに示されている。 図５は、ＥＬＩＳＡによって測定されたものとしての、ヒト化抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０の結合ＥＣ５０を示す図である。図の上のパネルは、ヒト化抗体の濃度の一定範囲にわたる吸光度を示し、図の下のパネルは、各試験抗体の算出されたＥＣ５０を示す。 図６は、ＦＡＣＳによって測定されたものとしての、ヒト化抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０の結合ＥＣ５０を示す図である。図の上のパネルは、ヒト化抗体の濃度の一定範囲にわたる平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図の下のパネルは、各試験抗体の算出されたＥＣ５０を示す。 図７は、ＥＬＩＳＡによって測定されたものとしての、ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０による、ＣＴＬＡ４リガンドＣＤ８０のＣＴＬＡ４との結合の遮断を示す。図の上のパネルは、抗体濃度の一定範囲にわたる吸光度を示す。抗ＣＴＬＡ４抗体の遮断ＩＣ５０が、図７の下のパネルに示されている。 図８は、ＦＡＣＳによって測定されたものとしてのヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０による、ＣＴＬＡ４リガンドＣＤ８０のＣＴＬＡ４との結合の遮断を示す。図の上のパネルは、抗体濃度の一定範囲にわたるＭＦＩを示す。抗ＣＴＬＡ４抗体の遮断ＩＣ５０が、図８の下のパネルに示されている。 図９は、種々の濃度のマウス抗ＣＴＬＡ４抗体に応じた、ＰＢＭＣによるＩＬ−２（ｐｇ／ｍＬ）産生を示す図である。試験されたマウス抗ＣＴＬＡ４抗体は、左から右に、１０Ｂ１０、６Ｆ３、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照であった。ｘ軸上に示されるように、各抗体は、３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬで試験した。 図１０は、種々の濃度のマウス抗ＣＴＬＡ４抗体に応じた、ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）産生を示す図である。試験されたマウス抗ＣＴＬＡ４抗体は、左から右に、１０Ｂ１０、６Ｆ３、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照であった。ｘ軸上に示されるように、各抗体は、３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬで試験した。 図１１は、種々の濃度のヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体に応じた、ＰＢＭＣによるＩＬ−２（ｐｇ／ｍＬ）産生を示す図である。試験されたヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体は、左から右に、１０Ｂ１０、６Ｆ３、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照であった。ｘ軸上に示されるように、各抗体は、３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬで試験した。 図１２は、種々の濃度のヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体に応じた、ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）産生を示す図である。試験されたヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体は、左から右に、１０Ｂ１０、６Ｆ３、ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照であった。ｘ軸上に示されるように、各抗体は、３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬで試験した。 図１３は、ＨｕＧＥＭＭモデルにおける腫瘍成長に対するヒト化ＣＴＬＡ４抗体の阻害効果を示す図である。

本開示の以下の説明は、単に、本開示の種々の実施形態を例示するよう意図される。そのようなものとして、論じられる特定の改変は、本開示の範囲に対する制限と解釈されてはならない。本開示の範囲から逸脱することなく、種々の等価物、変法および改変が行われ得ることは当業者には明らかであろう、また、このような同等な実施形態は、本明細書に含まれるべきであるということは理解される。刊行物、特許および特許出願を含む本明細書において引用されたすべての参考文献は、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる。

―定義―
用語「抗体」は、本明細書において、特異的抗原と結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体または二重特異性（二価）抗体を含む。天然の無傷の抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域ならびに第１、第２および第３の定常領域からなり、各軽鎖は、可変領域および定常領域からなる。哺乳動物重鎖は、α、δ、ε、γおよびμとして分類され、哺乳動物軽鎖は、λまたはκとして分類される。抗体は、「Ｙ」型を有し、Ｙのステムは、ジスルフィド結合を介して一緒に結合している２つの重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙの各アームは、単一軽鎖の可変および定常領域と結合している単一重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両鎖中の可変領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽（Ｌ）鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重（Ｈ）鎖ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度可変ループを含有する。本明細書において開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉの慣習（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ 第２７３巻（４号）：９２７頁（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ 第１８６巻（３号）：６５１〜６３頁（１９８５年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ 第１９６巻：９０１頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ 第３４２巻（６２５２号）：８７７〜８３頁（１９８９年）；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））によって定義または同定され得る。３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりもより高度に保存され、超可変ループを支持するスキャフォールドを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）として知られる、両端に位置するストレッチの間に挿入されている。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５種の主要なクラスまたはアイソタイプとして、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらは、α、δ、ε、γおよびμ重鎖それぞれの存在を特徴とする。主要な抗体クラスのうちいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）またはＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分割される。

用語「抗原結合断片」とは、本明細書において、１つまたは複数のＣＤＲを含む、抗体の一部から形成される抗体断片、または抗原と結合するが無傷の天然抗体構造を含まない任意のその他の抗体断片を指す。抗原結合断片の例として、制限するものではないが、ダイアボディー、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディー（ｄｓダイアボディー）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディー）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディー、ドメイン抗体および二価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合断片は、親抗体が結合する同一抗原と結合可能である。特定の実施形態では、抗原結合断片は、１種または複数の異なるヒト抗体に由来するフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。

抗体に関して「Ｆａｂ」とは、ジスルフィド結合によって単一重鎖の可変領域および第１の定常領域と結合している単一軽鎖（可変および定常領域の両方）からなる抗体の部分を指す。

「Ｆａｂ’」とは、ヒンジ領域の部分を含むＦａｂ断片を指す。

「Ｆ（ａｂ’）_２」とは、Ｆａｂ’の二量体を指す。

抗体に関して「Ｆｃ」とは、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２および第３の定常領域と結合している、第１の重鎖の第２および第３の定常領域からなる抗体の部分を指す。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどの種々のエフェクター機能に関与するが、抗原結合における機能に関与しない。

抗体に関して「Ｆｖ」とは、完全抗原結合部位を有するための抗体の最小断片を指す。Ｆｖ断片は、単一重鎖の可変領域と結合している単一軽鎖の可変領域からなる。

「一本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、互いに直接またはペプチドリンカー配列を介して接続している軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる遺伝子操作された抗体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、第８５巻：５８７９頁（１９８８年））。「一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域と接続しているｓｃＦｖからなる遺伝子操作された抗体を指す。

「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」とは、２つのＶ_Ｈドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ 第２３１巻（１−２号）：２５〜３８頁（１９９９年）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ 第７４巻（４号）：２７７〜３０２頁（２００１年）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は、元々、ラクダ科〔Camelidae〕（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ）に由来していた。ラクダ化抗体は、軽鎖を欠くが、信頼のおける抗原結合レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ 第３６３巻（６４２８号）：４４６〜８頁（１９９３年）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ 第５４巻（１号）：３９〜４７頁（２００２年）；Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．らＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第１０９巻（１号）：９３〜１０１頁（２００３年））。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫応答によって生じた最小の既知抗原結合単位に相当する（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ 第２１巻（１３号）：３４９０〜８頁．（２００７年））。

「ナノボディー」とは、重鎖抗体に由来するＶＨＨドメインおよび２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体断片を指す。

「ダイアボディー」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を含み、この断片は、同一ポリペプチド鎖中でＶ_Ｌドメインと接続しているＶ_Ｈドメイン（Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ）を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． 第９０巻（１４号）：６４４４〜８頁（１９９３年）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照のこと）。同一鎖上の２つのドメイン間で対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインが、別の鎖の相補的ドメインと対を形成するようにされ、それによって、２つの抗原結合部位を作製する。抗原結合部位は、異なる抗原（またはエピトープ）の同一のものを標的とし得る。

「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する抗体断片を指す。特定の例では、２つまたはそれ以上のＶ_Ｈドメインは、ペプチドリンカーと共有結合によって結合されて、二価または多価ドメイン抗体を作製する。二価ドメイン抗体の２つのＶ_Ｈドメインは、同一または異なる抗原を標的とし得る。

特定の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）_２」は、３つのペプチド鎖：ペプチドリンカーによって連結され、２つのＶ_Ｌ部分とジスルフィド橋によって結合されている２つのＶ_Ｈ部分を含む。

特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓダイアボディー」は、Ｖ_Ｈ１およびＶ_Ｌ１の間のジスルフィド橋を介してＶ_Ｌ１−Ｖ_Ｈ２（同様にペプチドリンカーによって連結された）と結合しているＶ_Ｈ１−Ｖ_Ｌ２（ペプチドリンカーによって連結された）を含む。

特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓＦｖ」または「ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’」は、３つのペプチド鎖：重鎖がペプチドリンカー（例えば、長い可動性リンカー）によって連結され、ジスルフィド橋を介してそれぞれ、Ｖ_Ｌ１およびＶ_Ｌ２部分と結合しており、各ジスルフィド対形成された重鎖および軽鎖が異なる抗原特異性を有する、Ｖ_Ｈ１−Ｖ_Ｈ２部分を含む。

特定の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、別のＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ部分と二量体化されたＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌ（ペプチドリンカーによって連結された）を含み、その結果、一方の部分のＶ_Ｈのものが、もう一方の部分のＶ_Ｌと協調し、同一抗原（またはエピトープ）または異なる抗原（またはエピトープ）を標的化し得る２つの結合部位を形成する、二価ダイアボディーまたは二価ＳｃＦｖ（ＢｓＦｖ）である。その他の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、Ｖ_Ｌ１−Ｖ_Ｈ２（同様にペプチドリンカーによって連結された）と会合しているＶ_Ｈ１−Ｖ_Ｌ２（ペプチドリンカーによって連結された）を含み、その結果、Ｖ_Ｈ１およびＶ_Ｌ１が協調し、Ｖ_Ｈ２およびＶ_Ｌ２が協調し、各協調対が異なる抗原特異性を有する二重特異性ダイアボディーである。

抗体または抗原結合断片に関して用語「ヒト化」とは、本明細書において、抗体または抗原結合断片が、非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来するＦＲ領域、適用可能な場合には、ヒトに由来する定常領域を含むことを意味する。ヒト化抗体または抗原結合断片は、特定の実施形態では、ヒトにおいて低減された免疫原性を有するので、ヒト治療薬として有用である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモットまたはハムスターである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗原結合断片は、非ヒトであるＣＤＲ配列を除く実質的にすべてのヒト配列から構成される。いくつかの実施形態では、ヒトに由来するＦＲ領域は、それが由来するヒト抗体と同一のアミノ酸配列を含み得る、またはいくつかのアミノ酸変更、例えば、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のアミノ酸の変更を含み得る。いくつかの実施形態では、このようなアミノ酸の変更は、重鎖ＦＲ領域中にのみ、軽鎖ＦＲ領域中にのみまたは両方の鎖中に存在し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトＦＲ１−３およびヒトＪＨおよびＪκを含む。

用語「キメラ」とは、本明細書において、ある種に由来する重鎖および／または軽鎖の一部ならびに別の種に由来する重鎖および／または軽鎖の残りを有する抗体または抗原結合断片を意味する。例示的例では、キメラ抗体は、ヒトに由来する定常領域およびマウスなどに由来する非ヒト種に由来する可変領域を含み得る。

「ＣＴＬＡ４」は、本明細書において、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４、膜貫通タンパク質を指し、活性化されたＴｒｅｇ細胞の表面で主に発現される。ＣＴＬＡ４は、ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）（両方とも抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される）とより高い親和性で結合するＣＤ２８の相同体である。細胞性免疫の同時刺激経路、すなわち、ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面のＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）と結合し、Ｔ細胞活性化、分化、組織遊走および末梢性トレランス誘導において役割を果たすが（Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９：２２５を参照のこと）、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０／８６との競合的結合は、ＣＤ８０／８６−ＣＤ２８相互作用の遮断およびＴ細胞活性化の終結をもたらす。ヒトＣＴＬＡ４の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＡＬ０７４７３．１の下で公開されており、ヒトＣＴＬＡ４をコードする代表的なｍＲＮＡ核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ４１４１２０．１の下で示されている。

用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、本明細書において、例えば、抗体および抗原の間などの２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片は、ヒトおよび／またはＣＴＬＡ４と、≦１０^−６Ｍ（例えば、≦５×１０^−７Ｍ、≦２×１０^−７Ｍ、≦１０^−７Ｍ、≦５×１０^−８Ｍ、≦２×１０^−８Ｍ、≦１０^−８Ｍ、≦５×１０^−９Ｍ、≦２×１０^−９Ｍ、≦１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ）の結合親和性（Ｋ_Ｄ）で特異的に結合する。Ｋ_Ｄとは、本明細書において、結合速度に対する解離速度の割合（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）を指し、表面プラズモン共鳴法を使用して、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器を使用して決定され得る。

「結合を遮断する」または「同一エピトープについて競合する」能力とは、本明細書において、抗体または抗原結合断片の、２つの分子（例えば、ヒトＣＴＬＡ４および抗ＣＴＬＡ４抗体）の間の結合相互作用を、任意の検出可能な程度に阻害する能力を指す。特定の実施形態では、２つの分子間の結合を遮断する抗体または抗原結合断片は、２つの分子間の結合相互作用を少なくとも５０％阻害する。特定の実施形態では、この阻害は、６０％超、７０％超、８０％超または９０％超であり得る。

用語「エピトープ」は、本明細書において、抗体が結合する、抗原上の原子またはアミノ酸の特定の群を指す。２種の抗体は、抗原について競合結合を示す場合には、抗原内の同一エピトープと結合し得る。例えば、本明細書において開示されるような抗体または抗原結合断片が、６Ｆ３および１０Ｂ１０などの例示的抗体のヒトＣＴＬＡ４との結合を遮断する場合には、抗体または抗原結合断片は、それらの例示的抗体と同一のエピトープと結合すると考えられ得る。

「６Ｆ３」または「６Ｆ３マウス」とは、本明細書において、配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号７のＣＤＲ３ならびに配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のＣＤＲ２および配列番号１５のＣＤＲ３を有するマウスモノクローナル抗体を指す。

「６Ｆ３ヒト化」とは、本明細書において、６Ｆ３のヒト化モノクローナル抗体を指し、配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域を有する。

「１０Ｂ１０」または「１０Ｂ１０マウス」とは、本明細書において、配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１のＣＤＲ２および配列番号２３のＣＤＲ３ならびに配列番号２７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２および配列番号３１のＣＤＲ３を有するマウスモノクローナル抗体を指す。

「１０Ｂ１０ヒト化」とは、本明細書において、１０Ｂ１０のヒト化モノクローナルを指し、配列番号３７の重鎖可変領域および配列番号３９の軽鎖可変領域を有する。

「保存的置換」とは、アミノ酸配列に関して、アミノ酸残基を、同様の生理化学的特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基と置換することを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）の間で、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）の間で、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の間で、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）の間で行われ得る。当技術分野で公知であるように、保存的置換は、通常、タンパク質のコンホメーション構造において重大な変化を引き起こさず、従って、タンパク質の生物活性を保持し得る。

アミノ酸配列（または核酸配列）に関して「配列同一性パーセント（％）」は、最大数の同一アミノ酸（または核酸）を達成するように、配列をアラインし、必要に応じて、ギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基と同一である、候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基と考えられる場合も考えられない場合もある。アミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）；Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）も参照のこと）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで入手可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６６巻：３８３〜４０２頁（１９９６年）；Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、第２３巻（２１号）：２９４７〜８頁（２００７年）も参照のこと）およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なツールを使用して達成され得る。当業者は、ツールによって提供されるデフォルトパラメータを使用してもよく、またはアラインメントにとって必要に応じて、例えば、適したアルゴリズムを選択することなどによって、パラメータをカスタマイズしてもよい。

「エフェクター機能」とは、本明細書において、抗体のＦｃ領域の、Ｃ１複合体およびＦｃ受容体などのそのエフェクターとの結合に起因する生物学的活性を指す。例示的エフェクター機能は、抗体およびＣ１複合体上のＣ１ｑの相互作用によって誘導される補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体のＦｃ領域の、エフェクター細胞上のＦｃ受容体との結合によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、および食作用を含む。

状態を「処置すること」または「処置」とは、本明細書において、状態を予防することまたは軽減すること、状態の発症または発生の速度を減速すること、状態の発生のリスクを低減すること、状態と関連する症状の発生を予防することまたは遅延すること、状態と関連する症状を低減することまたは終了させること、状態の完全なまたは部分的な退縮をもたらすこと、状態を治癒させることまたはそれらのいくつかの組合せを含む。

「単離された」物質は、天然状態から人の手によって変更されている。「単離された」組成物または物質が天然に生じる場合には、元の環境から変化されている、または取り出されている、または両方である。例えば、生存する動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、実質的に純粋な状態で存在するようにその天然状態の共存する材料から十分に分離されている場合には「単離されている」。特定の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動など）またはクロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣなど）によって決定されるような、少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度を有する。

用語「ベクター」とは、本明細書において、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現を引き起こすように作動可能に挿入され得る媒体を指す。ベクターは、宿主細胞内に運ぶ遺伝要素の発現を引き起こすように、宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用され得る。ベクターの例として、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージおよび動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーとして、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能要素およびリポーター遺伝子を含む、発現を制御するための種々の要素を含有し得る。さらに、ベクターは、複製起点を含有し得る。ベクターはまた、限定されるものではないが、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質コーティングを含む、細胞へのその侵入を補助するための材料を含み得る。

語句「宿主細胞」とは、本明細書において、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入されている細胞を指す。

用語「治療上有効な量」または「有効投与量」とは、本明細書において、ＣＴＬＡ４抗体に関与している疾患または状態を処置するのに有用な薬物の投与量または濃度を指す。

用語「医薬上許容される」は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（単数または複数）および／または塩が、一般に、製剤を含むその他の成分と化学的におよび／または物理的に適合しており、そのレシピエントと生理学的に適合していることを示す。

−抗ＣＴＬＡ４抗体−
抗ＣＴＬＡ４抗体６Ｆ３、１０Ｂ１０、６Ｆ３ヒト化および１０Ｂ１０ヒト化のＣＤＲ配列および重鎖または軽鎖可変領域が、以下の表１〜４に示されている。

特定の実施形態では、本明細書において提供される１つまたは複数のＣＤＲ配列は、得られる抗体が１つまたは複数の特性において親抗体を上回って改善されるように（例えば、抗原結合の改善、グリコシル化パターンの改善、ＣＤＲ残基でのグリコシル化のリスクの低減、ＣＤＲ残基での脱アミノ化の低減、薬物動態半減期の増大、ｐＨ感受性およびコンジュゲーションに対する適合性）、そうでなければ、親抗体と比較可能である（すなわち、上記の修飾または変更を除いて、ＣＤＲ配列の同一のセットを有する抗体）、または親抗体の抗原結合特性を少なくとも実質的に保持するように、修飾または変更され得る。

当業者ならば、本明細書において提供されるＣＤＲ配列は、ヒトＣＴＬＡ４との結合親和性の改善などの生物活性の改善を提供するように、アミノ酸の１つまたは複数の置換を含有するように修飾され得るということを理解するであろう。例えば、抗体変異体（ＦａｂまたはｓｃＦｖ変異体など）のライブラリーが作製され、ファージディスプレイ技術を用いて発現され、次いで、ヒトＣＴＬＡ４との結合親和性についてスクリーニングされ得る。別の例については、抗体の、ヒトＣＴＬＡ４との結合をコンピュータ上でシミュレートし、結合面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定するためにコンピュータソフトウェアが使用され得る。このような残基は、結合親和性の低下を防ぐために置換において避けられるか、またはより強力な結合を提供するために置換のために標的とされるかのいずれかであり得る。特定の実施形態では、ＣＤＲ配列中の置換（単数または複数）のうち少なくとも１つ（またはすべて）は、保存的置換である。

特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表１および２に列挙されるもの（単数または複数）に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する、１つまたは複数のＣＤＲ配列を含み、その一方で、対応するＣＤＲ配列が、表１および２に列挙されるもの（単数または複数）に対して１００％の配列同一性にある場合を除いて、ヒトＣＴＬＡ４に対して、実質的に同一の配列を有するその親抗体と同様またはさらにより高いレベルの結合親和性を保持する。

特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片は、ヒト化されている。ヒト化抗体は、ヒト化抗体を用いる場合にしばしば観察されるような、ヒトにおける免疫原性および／または結合親和性の低減の問題を有さない。これらのヒト化抗体は、ヒトＣＴＬＡ４に対する結合親和性を、好ましくは、例示的抗体：６Ｆ３および１０Ｂ１０のものと同様のレベルで保持する。

また、同一エピトープについて、本明細書において提供される抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片と競合する、抗体および抗原結合断片も本明細書において考慮される。特定の実施形態では、抗体は、６Ｆ３、１０Ｂ１０、６Ｆ３ヒト化または１０Ｂ１０ヒト化のヒトまたはサルＣＴＬＡ４との結合を、例えば、１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、１０^−７．５Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、１０^−８．５Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満または１０^−１０Ｍ未満のＩＣ_５０値（すなわち、５０％阻害濃度）で遮断する。ＩＣ_５０値は、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射性リガンド競合結合アッセイおよびＦＡＣＳ解析などの競合アッセイに基づいて決定される。

いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片は、プラズモン共鳴結合アッセイまたはＥＬＩＳＡによって測定されるものとして、^−６Ｍ（例えば、≦５×１０^−７Ｍ、≦２×１０^−７Ｍ、≦１０^−７Ｍ、≦５×１０^−８Ｍ、≦２×１０^−８Ｍ、≦１０^−８Ｍ、≦５^−９Ｍ、≦２×１０^−９Ｍ、≦１０^−９Ｍ、^−１０Ｍ）の結合親和性（Ｋｄ）でヒトＣＴＬＡ４と特異的に結合可能である。結合親和性は、抗原および抗原結合分子間の結合が平衡に達する場合に、結合速度に対する解離速度の割合（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）として算出されるＫ_Ｄ値によって表され得る。抗原結合親和性（例えば、Ｋ_Ｄ）は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器を使用するプラズモン共鳴結合アッセイを含む当技術分野で公知の適した方法を使用して適宜決定され得る（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９章、１９．１４単元、２００６年を参照のこと）。

特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその断片は、ヒトＣＴＬＡ４と、０．０５ｎＭ〜１ｎＭ（例えば、０．１ｎＭ〜０．９ｎＭ、０．１ｎＭ〜０．８ｎＭ、０．１ｎＭ〜０．７ｎＭ、０．１ｎＭ〜０．６ｎＭ、０．１ｎＭ〜０．５ｎＭ、０．１ｎＭ〜０．４ｎＭ、０．１ｎＭ〜０．３ｎＭまたは０．１ｎＭ〜０．２ｎＭ）のＥＣ_５０（すなわち、５０％結合濃度）で結合する。抗体のヒトＣＴＬＡ４との結合は、当技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチアッセイ、ウエスタンブロット、その他の結合アッセイによって測定され得る。例示的例では、試験抗体（すなわち、第１の抗体）は、固定化されたヒトＣＴＬＡ４と結合することが可能にされ、結合していない抗体を洗浄除去した後に、結合している第１の抗体と結合でき、その検出を可能にする標識された二次抗体が導入される。検出は、固定化されたＣＴＬＡ４が使用される場合にはマイクロプレートリーダーを用いて実施され得る。

特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその断片は、ヒトＣＴＬＡ４のヒトＢ７．１またはＢ７．２との結合を、競合アッセイにおいて測定されるような、３ｎＭ〜１０ｎＭ（例えば、３．５ｎＭ〜９．５ｎＭ、３．５ｎＭ〜８．５ｎＭまたは５ｎＭ〜８．５ｎＭ）のＩＣ_５０で阻害する。

いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ１−ＣＨ２またはＣＨ１−ＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態では、定常領域は、所望の特性を付与するように１つまたは複数の修飾をさらに含み得る。例えば、定常領域は、１種もしくは複数のエフェクター機能を低減もしくは枯渇させるように、ＦｃＲｎ受容体結合を改善するように、または１つまたは複数のシステイン残基を導入するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片は、エフェクター機能が低減している、または枯渇しているＩｇＧ４アイソタイプの定常領域を有する。種々のアッセイ、例えば、Ｆｃ受容体結合アッセイ、Ｃ１ｑ結合アッセイおよび細胞溶解アッセイが、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を評価すると知られており、当業者によって容易に選択され得る。

特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、抗体−薬物コンジュゲート、二重特異性または多価抗体の基礎として使用され得る。

本明細書において提供される抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、標識された抗体、二価抗体または抗イディオタイプ抗体であり得る。組換え抗体は、動物においてではなく組換え法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで調製される抗体である。二重特異性または二価抗体は、２種の異なるモノクローナル抗体の断片を有し、２種の異なる抗原を結合し得る人工抗体である。「二価」である抗体またはその抗原結合断片は、２つの抗原結合部位を含む。２つの抗原結合部位は、同一抗原と結合する場合も、またはそれらは、異なる抗原と各々結合する場合もあり、その場合には、抗体または抗原結合断片は、「二重特異性」と特性決定される。

いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片は、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディー、ナノボディー、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である。

いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片は、コンジュゲートをさらに含む。種々のコンジュゲートは、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片と連結され得るということは考慮される（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ． Ｍ． ＣｒｕｓｅおよびＲ． Ｅ． Ｌｅｗｉｓ、Ｊｒ．（編）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９年）を参照のこと）。これらのコンジュゲートは、その他の方法の中でも、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、会合、ブレンドまたは付加によって抗体または抗原結合断片と連結され得る。特定の実施形態では、本明細書において開示される抗体および抗原結合断片は、エピトープ結合部分の外側に、１つまたは複数のコンジュゲートとの結合に利用され得る特異的部位を含有するように遺伝子操作され得る。例えば、このような部位は、コンジュゲートとの共有結合を促進するために、例えば、システインまたはヒスチジン残基などの１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を含み得る。特定の実施形態では、抗体は、コンジュゲートと間接的に、または別のコンジュゲートを介して連結され得る。例えば、抗体または抗原結合断片は、ビオチンとコンジュゲートされ、次いで、アビジンとコンジュゲートされている第２のコンジュゲートと間接的にコンジュゲートされ得る。コンジュゲートは、検出可能な標識、薬物動態修飾部分、精製部分または細胞傷害性部分であり得る。検出可能な標識の例として、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼまたはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^１１１Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１４Ｃ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^８６Ｙ、^８８Ｙ、^９０Ｙ、^１７７Ｌｕ、^２１１Ａｔ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１２Ｂｉおよび^３２Ｐ、その他のランタニド、発光標識）、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または検出用金を挙げることができる。特定の実施形態では、コンジュゲートは、抗体の半減期を増大するのに役立つＰＥＧなどの薬物動態修飾部分であり得る。その他の適したポリマーとして、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなど、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。特定の実施形態では、コンジュゲートは、磁性ビーズなどの精製部分であり得る。「細胞傷害性部分」は、細胞にとって有害である、または細胞に損傷を与え得る、または死滅させ得る任意の薬剤であり得る。細胞傷害性部分の例として、制限するものではないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および抗有糸***剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。

―ポリヌクレオチドおよび組換え法―
本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、表１に提供されるＣＤＲ配列をコードする、表１および２に示されるような１種または複数のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードし、配列番号２、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３８および少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するそれらの相同配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードし、配列番号１０、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４０および少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するそれらの相同配列からなる群から選択される配列を含む。特定の実施形態では、同一性パーセンテージは、遺伝暗号縮重に起因し、コードされるタンパク質配列は、変更されないままである。

抗ＣＴＬＡ４抗体およびその抗原結合断片（例えば、表１中の配列を含む）をコードする単離されたポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の組換え技術を使用してさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のためにベクター中に挿入され得る。別の実施形態では、抗体は、当技術分野で公知の相同組換えによって生成され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。多数のベクターが入手可能である。ベクター成分は、一般に、限定されるものではないが、以下のうち１種または複数を含む：シグナル配列、複製起点、１種または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）および転写終結配列。

いくつかの実施形態では、ベクター系として、哺乳動物、細菌、酵母系などが挙げられ、限定されるものではないが、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ，ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２など、ならびにその他の実験室および市販のベクターなどのプラスミドを含む。適したベクターとして、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を挙げることができる。

抗体または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターは、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞に導入され得る。クローニングに適した、本明細書におけるベクター中でＤＮＡを発現する宿主細胞は、上記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物として、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリキア属〔Escherichia〕、例えば、大腸菌〔E.coli〕、エンテロバクター属〔Enterobacter〕、エルウィニア属〔Erwinia〕、クレブシエラ属〔Klebsiella〕、プロテウス属〔Proteus〕、サルモネラ属〔Salmonella〕、例えば、サルモネラ・チフィリウム〔Salmonella typhimurium〕、セラチア属〔Serratia〕、例えば、セラチア・マルセッセンス〔Serratia marcescans〕および赤痢菌属〔Shigella〕ならびにＢ．スブチリス〔subtilis〕およびＢ．リケニフォルミス〔licheniformis〕などのバチルス属〔Bacilli〕、Ｐ．エルジノーサ〔aeruginosa〕などのシュードモナス属〔Pseudomonas〕およびストレプトマイセス属〔Streptomyces〕などの腸内細菌科〔Enterobacteriaceae〕が挙げられる。

原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核細胞微生物は、抗ＣＴＬＡ４抗体をコードするベクターの適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ〔Saccharomyces cerevisiae〕または一般的なパン酵母は、下等真核細胞宿主微生物の中で最もよく使用されている。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ〔Schizosaccharomyces pombe〕；例えば、Ｋ．ラクチス〔lactis〕、Ｋ．フラギリス〔fragilis〕（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス〔bulgaricus〕（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッカーアミー〔wickeramii〕（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチー〔waltii〕（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム〔drosophilarum〕（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス〔thermotolerans〕およびＫ．マーキシアヌス〔marxianus〕などのクリベロミセス属〔Kluyveromyces〕宿主；ヤロウイア属〔yarrowia〕（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス〔Pichia pastoris〕（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属〔Candida〕；トリコデルマ・リーゼイ〔Trichoderma reesia〕（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ〔Neurospora crassa〕；シュワニオミセス・オクシデンタリス〔Schwanniomyces occidentalis〕などのシュワニオミセス属〔Schwanniomyces〕；および例えば、アカパンカビ属〔Neurospora〕、アオカビ属〔Penicillium〕、トリポクラジウム属〔Tolypocladium〕ならびにＡ．ニデュランス〔A.nidulans〕およびクロコウジカビ〔A.niger〕などのアスペルギルス属〔Aspergillus〕宿主などの糸状菌などの、いくつかのその他の属、種および株が一般に入手可能であり、本明細書において有用である。

本明細書において提供されるグリコシル化抗体または抗原断片の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞における例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにヨトウガ〔Spodoptera frugiperda〕（イモムシ）、ネッタイシマカ〔Aedes aegypti〕（蚊）、ヒトスジシマカ〔Aedes albopictus〕（蚊）、キイロショウジョウバエ〔Drosophila melanogaster〕（ショウジョウバエ〔fruiffly〕）およびカイコ〔Bombyx mori〕などの宿主に由来する対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ〔Autographa californica〕ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコ〔Bombyx mori〕ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、本明細書において、本発明に従って、特に、ヨトウガ〔Spodoptera frugiperda〕細胞のトランスフェクションのためにウイルスとして使用され得る。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主として使用され得る。

しかし、関心は、脊椎動物細胞において最大であり、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．第３６巻：５９頁（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．第２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス***腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．第３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）がある。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、２９３Ｆ細胞である。

宿主細胞は、抗ＣＴＬＡ４抗体生成のために上記の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地で培養される。

本明細書において提供される抗体または抗原結合断片を生成するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）および「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．第５８巻：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または再発行米国特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（マイクロモーラー範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を用いて補給され得る。任意のその他の必要な栄養補助剤もまた、当業者に公知であろう適当な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどといった培養状態は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかとなろう。

組換え技術を使用する場合には、抗体は、細胞膜周辺腔において細胞内で生成され得る、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生成される場合には、第１のステップとして、微粒子状細片、宿主細胞または溶解した断片のいずれかが例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年）には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。手短には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍される。細胞細片は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合には、このような発現系から得られた上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用してまず濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が前記のステップのいずれにも含まれ得、外来性の混入物質の成長を防ぐために、抗生物質が含まれ得る。

細胞から調製される抗体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに応じて変わる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖をベースとする抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．第６２巻：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプに対して、およびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．第５巻：１５６７ １５７５（１９８６年））。親和性リガンドが付着されるマトリックスは、最も多くはアガロースであるが、その他のマトリックスが利用可能である。コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて達成され得るものよりも迅速な流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ．ＴＭ．樹脂（Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー 陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のためのその他の技術も、回収されるべき抗体に応じて利用可能である。

任意の予備的精製ステップ（単数または複数）後に、対象の抗体および混入物質を含む混合物は、約２．５〜４．５の間のｐＨの溶出バッファーを使用する、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付され得る。

―キット―
本開示は、生体サンプルにおいてＣＴＬＡ４と結合するために使用される抗ＣＴＬＡ４抗体を含むキットを提供する。生体サンプルは、血漿を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、検出可能な標識とコンジュゲートしている抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む。特定のその他の実施形態では、キットは、未標識抗ＣＴＬＡ４抗体または抗原結合断片を含み、未標識抗ＣＴＬＡ４抗体と結合可能である二次標識抗体をさらに含む。キットは、使用の説明、およびキット中の成分の各々を分離するパッケージをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、キットは、ＣＴＬＡ４によって媒介される疾患または状態を処置、予防または遅延するのに有用である。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチアッセイにおいて、またはイムノグラフィー〔immunographic〕アッセイにおいて有用な基質またはデバイスと関連している。有用な基質またはデバイスは例えば、マイクロタイタープレートおよび試験ストリップであり得る。

―医薬組成物および治療方法―
本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片および１種または複数の医薬上許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。

本明細書において開示される医薬組成物において使用するための医薬上許容される担体として、例えば、医薬上許容される液体、ゲルまたは固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、バッファー、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分配剤〔dispending agents〕、封鎖剤またはキレート化剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または非毒性補助物質、当技術分野で公知のその他の成分またはそれらの種々の組合せを挙げることができる。

適した成分として、例えば、抗酸化剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、バッファー、保存料、滑沢剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤または糖およびシクロデキストリンなどの安定化剤を挙げることができる。適した抗酸化剤として、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール〔butylated hydroxanisol〕、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルを挙げることができる。本明細書において開示されるように、本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片およびコンジュゲートを含む組成物中に、メチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤を含めることによって、抗体または抗原結合断片の酸化が減少される。酸化の低減は、結合親和性の喪失を防ぐまたは低減し、それによって、抗体安定性を改善し、有効期間を最大化する。したがって、特定の実施形態では、本明細書において開示されるような１種または複数の抗体または抗原結合断片およびメチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤を含む組成物が提供される。抗体または抗原結合断片を、メチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤と混合することによって、酸化を防ぐための、有効期間を延長するための、および／または本明細書において提供されるような抗体もしくは抗原結合断片の有効性を改善するための方法がさらに提供される。

さらに例示するために、医薬上許容される担体として、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張性デキストロース注射、滅菌水注射またはデキストロースおよび乳酸リンゲル注射などの水性ビヒクル、植物起源の硬化油、綿実油、トウモロコシオイル、ゴマ油またはピーナッツオイルなどの非水性ビヒクル、静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性剤、リン酸またはクエン酸バッファーなどのバッファー、重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、塩酸プロカインなどの局所麻酔、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの懸濁剤および分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ−８０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）などの封鎖剤またはキレート化剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を挙げることができる。担体として利用される抗菌剤は、複数回用量容器中の医薬組成物に添加され得、これとして、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンズアルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。適した賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールを挙げることができる。適した非毒性補助物質として、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解促進剤、または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンもしくはシクロデキストリンなどの薬剤を挙げることができる。

医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、丸剤、カプセル剤、錠剤、持続放出製剤または散剤であり得る。経口製剤はとして、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどといった標準担体を挙げることができる。

実施形態では、医薬組成物は、注射用組成物に製剤化される。注射用医薬組成物は、例えば、液体溶液、懸濁液、エマルジョンまたは液体溶液、懸濁液またはエマルジョンを作製するのに適した固体形態などの任意の従来の形態で調製され得る。注射のための調製物として、注射用に準備された滅菌および／または非発熱性溶液、皮下錠剤を含む、使用直前に溶媒と組み合わされるべく準備された凍結乾燥散剤などの滅菌乾燥可溶性製剤、注射用に準備された滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルと組み合わされるべく準備された滅菌乾燥不溶性製剤、ならびに滅菌および／または非発熱性エマルジョンを挙げることができる。

特定の実施形態では、単位用量非経口調製物は、アンプル、バイアルまたはニードルを備えたシリンジ中にパッケージングされる。非経口投与用のすべての調製物は、当技術分野で公知であり、実施されるように滅菌および非発熱性でなくてはならない。

特定の実施形態では、滅菌、凍結乾燥散剤は、適した溶媒中に本明細書において開示されるような抗体または抗原結合断片を溶解することによって調製される。溶媒は、散剤または散剤から調製された再構成された溶液の安定性またはその他の薬理学的成分を改善する賦形剤を含有し得る。使用され得る賦形剤として、それだけには限らないが、水、デキストロース、ソルビトール〔sorbital〕、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたはその他の適した薬剤が挙げられる。溶媒は、クエン酸、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムなどのバッファーまたは、一実施形態ではおよそ中性のｐＨの、当業者に公知のその他のこのようなバッファーを含有し得る。当業者に公知の溶液のその後の滅菌濾過と、それに続く標準状態下での凍結乾燥によって、望ましい製剤が提供される。一実施形態では、得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアル中に配分される。各バイアルは、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片またはその組成物の単一投与量または複数回投与量を含有し得る。バイアルに用量または用量のセットに必要なものを上回る少量（例えば、約１０％）を過剰充填することは、正確なサンプル引き出しおよび正確な投薬を促進するために許容される。凍結乾燥散剤は、約４℃〜室温などの適当な状態下で保存され得る。

注射水を用いる凍結乾燥散剤の再構成は、非経口投与において使用するための製剤を提供する。一実施形態では、再構成のために滅菌および／または非発熱性水またはその他の液体の適した担体が、凍結乾燥散剤に付加される。正確な量は、与えられている選択された療法に応じて変わり、経験的に決定され得る。

本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片の治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与し、それによって、ＣＴＬＡ４と関係する関連する状態または障害を処置または予防することを含む治療方法もまた提供される。別の態様では、本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片の治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫応答の上方制御から恩恵を受ける対象における状態を処置するための方法が提供される。

本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片の治療上有効な量は、例えば、体重、年齢および過去の病歴、現在の薬物適用、対象の健康の状態および交差反応の可能性、アレルギー、感受性および有害な副作用、ならびに投与経路および腫瘍発達の程度などの当技術分野で公知の種々の因子に応じて変わる。投与量は、これらおよびその他の状況または必要条件によって示されるように、当業者（例えば、医師または獣医師）によって比例的に低減または増大され得る。

特定の実施形態では、本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療上有効な投与量で投与され得る。これらの実施形態のうち特定のものでは、抗体または抗原結合断片は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で投与され、これらの実施形態のうち特定のものでは、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、３ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の実施形態では、投薬量は、治療過程にわたって変化し得る。例えば、特定の実施形態では、初期投薬量は、その後の投薬量よりも高い場合がある。特定の実施形態では、投薬量は、対象の反応に応じて治療過程にわたって変わり得る。

投与計画は、最適な望ましい応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回用量が投与され得、または数回の分割用量が経時的に投与され得る。

本明細書において開示される抗体および抗原結合断片は、例えば、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内注入を含む静脈内、筋肉内または皮内注射）または非経口ではない（例えば、経口、鼻腔内、眼球内、舌下、直腸内または局所）経路などの当技術分野で公知の任意の経路によって投与され得る。

ＣＴＬＡ４と関連する状態および障害は、免疫関係疾患または障害であり得る。特定の実施形態では、ＣＴＬＡ４関連状態および障害として、腫瘍および癌、例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌腫、膀胱癌、食道癌、中皮腫、黒色腫、頭頸部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、胸腺癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉腫〔mycoses fungoids〕、メルケル細胞癌、および古典的なホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型Ｂ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭癌腫およびＨＨＶ８関連原発性滲出リンパ腫、ホジキンリンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫などの中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫が挙げられる。特定の実施形態では、腫瘍および癌は、転移性、特に、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性腫瘍である。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１関連状態および障害として、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、全身性強皮症、自己免疫糖尿病などといった自己免疫疾患が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１関連状態および障害として、慢性ウイルス感染、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、カポジウエスト〔Kaposi West〕肉腫関連ヘルペスウイルス伝染病、シンリングウイルス〔thin ring virus〕（トルクテノウイルス）、ＪＣウイルスまたはＢＫウイルスのウイルス感染などの感染性疾患が挙げられる。

―使用方法―
本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を使用する方法をさらに提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を投与することを含む、個体においてＣＴＬＡ４によって媒介される状態を処置する方法を提供する。特定の実施形態では、個体はＣＴＬＡ４アンタゴニストに対して応答する可能性が高い障害または状態を有すると同定されている。特定の実施形態では、障害または状態は、腫瘍または癌を含む。

特定のこれらの実施形態では、１種または複数の上記のさらなる治療薬と組み合わせて投与される本明細書において開示される抗体または抗原結合断片は、１種または複数のさらなる治療薬と同時に投与されてもよく、特定のこれらの実施形態では、抗体または抗原結合断片およびさらなる治療薬（複数可）は、同一医薬組成物の一部として投与されてもよい。しかし、別の治療薬と「組み合わせて」投与される抗体または抗原結合断片は、薬剤と同時に、または薬剤と同一組成物中で投与されなくてもよい。別の薬剤に先立って、またはその後に投与される抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片および第２の薬剤が、異なる経路によって投与される場合でさえ、その語句が本明細書において使用される場合、その薬剤と「組み合わせて」投与されると考えられる。可能であれば、本明細書において開示される抗体または抗原結合断片と組み合わせて投与されるさらなる治療薬は、さらなる治療薬の英文添付文書に列挙されるスケジュールに従って、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３年（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７版； Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ； ＩＳＢＮ： １５６３６３４４５７； 第５７版（２００２年１１月））もしくは当技術分野で周知のプロトコールに従って投与される。

以下の実施例は、特許請求された本発明をより良好に例示するために提供され、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。以下に記載されるすべての特定の組成物、材料および方法は、全体で、または一部で本発明の範囲内に入る。これらの特定の組成物、材料および方法は、本発明を制限するものではなく、単に、本発明の範囲内に入る特定の実施形態を例示するものである。当業者は、発明の能力を行使することなく、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料および方法を開発し得る。本発明の範囲内にとどまりながら本明細書に記載される手順において多数の変法を行うことができるということは理解されよう。このような変法が本発明の範囲内に含まれることは本発明者らの意図である。

［実施例１］
マウス免疫処置およびヒトＣＴＬＡ４に対するマウス抗体の生成
ヒトＣＴＬＡ４に対する抗体を作製するために、ヒスチジンタグが融合されたＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡ（ｈＣＴＬＡ４−Ｈｉｓ、配列番号４９）、マウスＦｃ（ｈＣＴＬＡ４−ｍＦｃ、配列番号５１）およびヒトＦｃタグ（ｈＣＴＬＡ４−ｈＦｃ、配列番号５３）をＰＣＲによって得、それぞれ、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号：Ｖ−７９０）中にサブクローニングした。ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３細胞における一時的な発現後、ｈＣＴＬＡ４−ＨｉｓＴａｇをＮＴＡカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製し、ｈＣＴＬＡ４−ｍＦｃおよびｈＣＴＬＡ４−ｈＦｃをプロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。

ハイブリドーマ細胞株を作製するために必要なマウスを免疫処置するために、１００μｇのヒトＣＴＬＡ４−ｍＦｃ融合タンパク質および１００μｌの完全フロイントアジュバントを混合し、混合物を皮下注射によって５匹の６〜７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス各々に投与した。２週間後、抗原（これまでに注射した量の半量）を、上記と同一の方法を使用して不完全フロイントアジュバントと混合し、混合物を皮下注射によって各マウスに投与した。１週間後、最終追加免疫を実施した。３日後、各マウスの尾から血液を採取して血清を得た。次いで、血清をＰＢＳを用いて１／１０００で希釈し、ＥＬＩＳＡを実施して、ヒトＣＴＬＡ４−ｍＦｃを認識する抗体の力価が増大したか否かを解析した。その後、十分な量の抗体が得られたマウスを選択し、選択したマウスで細胞融合プロセスを実施した。

細胞融合実験の３日前に、５０μｇのヒトＣＴＬＡ４−ｍＦｃ融合タンパク質を、腹膜内注射によって各マウスに投与した。各免疫処置マウスに麻酔を施し、次いで、身体の左側に位置するその脾臓を抽出し、メッシュを用いてすりつぶして細胞を単離し、これを培養培地（ＲＰＭＩ１６４０）と混合して、脾臓細胞懸濁液を調製した。懸濁液を遠心分離して、細胞層を集めた。得られた１×１０^８個の脾臓細胞を１．５×１０^７個の骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）と混合し、混合物を遠心分離して細胞を沈殿させた。沈殿物をゆっくりと分散させ、ＰＥＧ Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．、カタログ番号７１８１）を用いて処置した。混合した細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり０．１ｍｌで分配し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。１日目に、各ウェルへ、血清ならびにＨＡＴおよび２×メトトレキサートを含有する追加の０．１ｍｌの培地を添加することによって、細胞に供給した。３日目および７日目に、各ウェルから得た０．１ｍｌの培地を、０．１ｍｌの新鮮なＨＴ培地と交換した。スクリーニングは、通常９〜１４日目の間に行った。

［実施例２］
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ解析に基づく、ヒトＣＴＬＡ４に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択
ヒトＣＴＬＡ４−ｈＦｃを使用してＥＬＩＳＡ結合解析を実施した。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号９０１８）を、１００μｌのコーティングバッファー（ＰＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＨ３０２５６．０１Ｂ）中の２μｇ／ｍｌ ＣＴＬＡ４−ｈＦｃ（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を用いて、４℃で一晩コーティングした。ウェルを吸引し、２００μｌの、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：７３８３２８）を有するブロッキングバッファーを添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって、非特異的結合部位をブロッキングした。洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ−２０（商標）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ１３７９）を有するＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファー中のハイブリドーマ上清の適した希釈物を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌ／ウェルの、ブロッキングバッファー中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：３１４３２）とともに６０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、１００μｌ／ウェルの基質溶液ＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：００−４２０１−５６）を添加し、プレートを室温で２分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を添加して、反応を停止した。比色シグナルを発現させ、Ａｕｔｏ Ｐｌａｔｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（供給業者：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、モデル：ＭＮＲ０６４３、ソフトウェア：ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４）を使用して４５０ｎｍで読み取った。この方法によって、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質と高度に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を反復的に選択した。

ビオチン化ヒトＣＤ８０−ｍＦｃを、ヒトＣＴＬＡ４−ｍＦｃとの結合から遮断することによって、ＥＬＩＳＡベースのリガンド遮断解析を実施した。ＣＴＬＡ４−ｍＦｃ抗原（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号：ＳＨ３０２５６．０１Ｂ）バッファーに懸濁し（２μｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号：９０１８）を４℃で一晩コーティングした。プレートを、洗浄バッファーＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｐ１３７９）を使用して３回洗浄した。各ウェルに２００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号：７３８３２８））を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、３回洗浄した。ウェルに、種々の濃度（ＰＢＳ中のハイブリドーマ上清の適した希釈）の抗ＣＴＬＡ４抗体を添加し（１００μｌ／ウェル）、３７℃で１時間インキュベートした。リガンドを添加し（０．１μｇ／ｍｌ ＣＤ８０−ｍＦｃ−ビオチン、１００μｌ／ウェル）、３７℃で２時間インキュベートし、３回洗浄した。二次抗体（Ａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号：Ｅ０７４１８−１６３２、１：５００、１００μｌ／ウェル）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートし、３回洗浄した。ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｔ０４４０、１００μｌ／ウェル）を添加し、室温で３分間インキュベートした。反応を停止するために、２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４（１００μｌ／ウェル）を添加した。比色シグナルを発現させ、Ａｕｔｏ Ｐｌａｔｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（供給業者：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、モデル：ＭＮＲ０６４３、ソフトウェア：ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４）を使用して４５０ｎｍで読み取った。

ｈＣＴＬＡ４−２９３Ｔ細胞株を使用して抗体の細胞結合解析を実施した。９６ウェル培養プレートの各ウェルに２×１０^５個の２９３Ｔ−ＣＴＬＡ４細胞を入れることによって、各反応にそれらを使用した。細胞を、示された抗体（１／５の希釈を用いて２０μｇ／ｍｌ）とともに４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーを用いて３回洗浄した。１００μｌ／ウェルの細胞に、二次抗体（ＰＥヤギ抗マウス：１：２００、ＰＥマウス抗ヒト：１：１０）を添加し、４℃で４０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳバッファーを用いて３回洗浄し、ＦＡＣＳアレイによって解析した。

ＦＡＣＳベースのリガンド遮断解析を実施して、ｈＣＴＬＡ４−２９３Ｔ細胞とのビオチン化ヒトＣＤ８０結合の遮断における抗ＣＴＬＡ４ハイブリドーマ抗体を調べた。ＣＴＬＡ４発現性２９３Ｔ細胞をＦＡＣＳバッファー（３％ウシ胎児血清を有するＰＢＳ）に懸濁した。細胞懸濁液に種々の濃度の試験ハイブリドーマ抗体を添加し、９６ウェルプレート中で４℃で６０分間インキュベートした。ウェルにビオチン標識ＣＤ８０タンパク質を添加し、４℃で６０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、マウス抗ビオチンＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ、カタログ番号４０９００４）を添加した。ＦＡＣＳアレイを使用してフローサイトメトリー解析を実施した。

研究の結果が図１〜４に示されている。抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体は、固相（図１）および細胞表面（図２）上でＣＴＬＡ４を結合できる。抗体はまた、９６ウェルプレート（図３）またはヒトＣＴＬＡ４を用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（図４）上でＣＤ８０のＣＴＬＡ４との結合を遮断できる。これらのデータは、抗ＣＴＬＡ４抗体が、ＣＴＬＡ４を結合し、リガンドＣＤ８０とのその結合を遮断できることを実証した。

［実施例３］
抗ｈＣＴＬＡ４抗体の、モノクローナル抗体クローンを得るためのサブクローニングおよび精製
サブクローニングは、制限希釈の手順に基づいており、モノクローナル抗体を産生する個々のハイブリドーマクローンを得るように設計されている。各ハイブリドーマを複数ラウンド（４ラウンド）の制限希釈に付した。サブクローニングの各ラウンドについて、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳベースの遮断解析によってクローンを試験した。

合計２０種の抗ｈＣＴＬＡ４ハイブリドーマ抗体について抗体精製を実施した。ハイブリドーマ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２％Ｌ−グルタミンおよび１％の調整したＮａＨＣＯ_３溶液を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）中で培養した。次いで、選択されたハイブリドーマ細胞を血清不含培養培地に適応させ、プロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して上清から抗体を精製した。ＰＢＳを用いて洗浄した後、結合された抗体を、０．１ＭグリシンｐＨ３．０を使用して溶出し、続いて、２．０Ｍ Ｔｒｉｓを使用してｐＨ中和した。バッファー交換および抗体濃縮のためにＵｌｔｒａ−１５遠心濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ）を使用した。

［実施例４］
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ解析に基づく、結合およびリガンド遮断活性における、精製されたマウス抗ｈＣＴＬＡ４抗体の特性決定
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ解析に基づいて、精製されたハイブリドーマ抗体をさらに特性決定した。適用された方法は、これらの場合には、ＥＣ５０およびＩＣ５０を測定するために精製された抗体を使用した点を除いて、実施例２において上記のものと同様であった。表５〜８は、抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０の結果を示す。

［実施例５］
マウス抗ＣＴＬＡ４抗体のＢｉａｃｏｒｅ解析
抗体の結合特徴をさらに特性決定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００、ＧＥ）を使用してハイブリドーマ抗体をプロファイリングして、結合動態学を解明し、平衡結合定数を算出した。このアッセイは、マウス抗体捕獲キット（ＢＲ−１００８−３８、ＧＥ）を使用して捕獲法によって実施した。抗マウスＦｃ ｍａｂを、ｐＨ５．０固定化バッファーで２５μｇ／ｍｌに希釈した後、５μｌ／分の流速で表９に示されるパラメータを用いて固定化を実施した。１）１０μｌ／分の流速で通常０．５〜１分間リガンドを注入すること、２）通常３分間、選択した解析物を注入することと、それに続いて、３０μｌ／分の流速で通常５〜１０分間、ランニングバッファー（１×ＰＢＳ−Ｐ２０）中で解離させること、ならびに３）１０μｌ／分の流速で通常１〜２分間、再生溶液１０ｍＭグリシンｐＨ１．７を注入することによって、動態的実行を行った。

研究の結果が表１０に示されている。６Ｆ３および１０Ｂ１０の両方とも、ＣＴＬＡ４との高い結合親和性を有する。

［実施例６］
種間および同様の分子間の交差反応性
抗体の種交差反応性を評価するために、マウスおよびカニクニザル〔cynomoulgus macaque〕ＣＴＬＡ４をＲＴ−ＰＣＲによってクローニングし、ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３細胞において発現させ、精製した。タンパク質ベースのＥＬＩＳＡを使用してカニクイザルＣＴＬＡ４との結合について抗体を試験した。研究の結果は、抗体は、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ４と同等の親和性で結合し、ＣＤ８０のカニクイザルＣＴＬＡ４との結合を、ヒトＣＴＬＡ４と比較して同様の有効性で遮断することを示した。選択された抗体のうち、使用したアッセイのいずれにおいても、マウスＣＴＬＡ４と検出可能な親和性で結合したものはなかった。ヒトＩＣＯＳおよびＣＤ２８と交差反応したものはなかった。

［実施例７］
ＰＢＭＣによるサイトカイン産生に対する抗ＣＴＬＡ４ハイブリドーマ抗体の効果
ＣＴＬＡ４ハイブリドーマ抗体の活性を、リンパ球エフェクター細胞におけるＣＴＬＡ４シグナル伝達経路の遮断に対するその効果によって評価した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：１０７７−１）を使用することによって新たに単離されたヒトＰＢＭＣを調製し、２×１０^６個細胞／ｍｌの濃度の１０％ ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ １６４０中、５ｎｇ／ｍｌブドウ球菌〔staphylcoccus〕エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて刺激した。次いで、ＣＴＬＡ４抗体の存在下または不在下で、９６ウェルプレートで各ウェルに１００μｌのＰＢＭＣを添加した（ウェルあたり２×１０^５個細胞）。抗体の一連の濃縮物（３０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍｌ）を試験した。３７℃で７２または９６時間インキュベートした後、９６ウェルプレートを遠心分離し、上清を集め、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号：ＤＹ２８５）を使用してＩＬ−２およびＩＦＮ−γ生成を測定した。陰性対照としてアイソタイプ対照抗体を使用した。研究の結果が、図９（ＩＬ−２分泌）および図１０（ＩＦＮ−γ分泌）に提供され、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０が、ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌を促進できることを実証する。対照的に、アイソタイプ対照抗体を含有する培養物は、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌の増大を全く示さなかった。

［実施例８］
抗ＣＴＬＡ４抗体ｃＤＮＡ配列クローニングおよびヒト化
免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号：７４１０４）によって、ｈＣＴＬＡ４抗体を産生するハイブリドーマ細胞株から単離された全ＲＮＡを鋳型として使用し、スーパースクリプト（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号：１８０６４−１４）を製造業者の使用説明書に従って用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、縮重マウスＩｇＧプライマーを使用して、５０μｌ容量反応混合物中でｃＤＮＡ産物をＰＣＲに付した（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ， （１９９３） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３： ２０６−２１１； Ｓｔｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ， （２０１０） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：３−１４）。変性のための９４℃、１．５分、アニーリングのための５０℃、１分および合成のための７２℃、１分の３０サイクルを用い、Ｓ１０００（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号：１８４−２０００）において反応を実施した。３０回目のサイクルの最後に、反応混合物を伸長のためにさらに７２℃で７分間インキュベートした。

ＰＣＲ混合物を、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１％アガロース／Ｔｒｉｓ−ホウ酸ゲルでの電気泳動に付した。予測される大きさ（重鎖および軽鎖についておよそ４００ｂｐ）を有するＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、精製した。３μｌの精製されたＰＣＲ産物を、ｐＭＤ−１８Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：Ｄ１０１Ａ）中にクローニングし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ大腸菌〔E.coli〕（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｃ４０４０−０３）中に形質転換した。ユニバーサルＭ１３フォワードおよびリバースプライマーを使用するコロニーＰＣＲによってクローンをスクリーニングし、Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用する両方向でのＤＮＡシーケンシングのために各反応物から１０個の陽性クローンを選択した。

抗体６Ｆ３（配列番号１および９）、１０Ｂ１０（配列番号１７および２５）の可変領域配列を、対応するハイブリドーマクローンから増幅した。これらの抗体は、ＣＤ８０とのＣＴＬＡ４結合の遮断ならびにＴ細胞活性化およびサイトカイン放出の増強などの所望の機能を示した。

抗体ヒト化設計
ＣＤＲグラフティングアプローチ（その全文が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２２５，５３９号）を使用して、６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体をヒト化した。マウス抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０の軽鎖および重鎖可変鎖配列を、ＮＣＢＩデータベースを検索することによって構造バイオインフォマティクス研究共同体〔Research Collaboratory for Structural Bioinformatics〕（ＲＣＳＢ）タンパク質データバンクにおいて入手可能なものに対して比較した。６Ｆ３および１０Ｂ１０のモデルを、最高配列相同性を有するＶＨおよびＶＬ構造に基づいてそれぞれ作製した。

マウス６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体のＶＨおよびＶＬ中の相補性決定領域（ＣＤＲ）とグラフトされることとなる鋳型ヒト抗体を、ＩＭＧＴ／Ｄｏｍａｉｎ Ｇａｐ Ａｌｉｇｎ ３Ｄ構造データベース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉを検索することによって、マウス６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体と高い相同性を有するアミノ酸配列を有するヒト抗体生殖系列から選択した。６Ｆ３については、選択された鋳型ヒトＶＨは、ＩＧＨＶ１−４６^＊０１およびＩＧＨＪ４^＊０１の組合せであり、選択された鋳型ヒトＶＬは、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０１の組合せであった。１０Ｂ１０については、選択された鋳型ヒトＶＨは、ＩＧＨＶ４−３０−４^＊０７およびＩＧＨＪ１^＊０１の組合せであり、選択された鋳型ヒトＶＬは、ＩＧＫＶ１−３３^＊０１およびＩＧＫＪ４^＊０１の組合せであった。

上記の鋳型ヒト抗体のＣＤＲアミノ酸配列を、それぞれ、マウス６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体のＣＤＲのものによって置換した。さらに、上記の鋳型ヒト抗体ＶＨおよびＶＬのフレームワークが、マウス６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体のＶＨおよびＶＬに由来する必要なアミノ酸配列とグラフトされて、機能的ヒト化抗体が得られた。６Ｆ３および１０Ｂ１０のＶＨおよびＶＬについては、上記の鋳型ヒト抗体のフレームワークアミノ酸のいくつかの部位を、マウス６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体中の対応するアミノ酸配列に復帰変異させた。６Ｆ３抗体軽鎖可変領域のヒト化のために、位置４８のアミノ酸をＬｅｕ（Ｌ）からＶａｌ（Ｖ）に変異させ、６Ｆ３抗体重鎖可変領域ヒト化のために、位置４８のアミノ酸をＭｅｔ（Ｍ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異させ、位置６７のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＡｌａ（Ａ）に変異させ、位置６９のアミノ酸をＭｅｔ（Ｍ）からＬｅｕ（Ｌ）に変異させ、位置７１のアミノ酸をＡｒｇ（Ｒ）からＡｌａ（Ａ）に変異させ、位置７３のアミノ酸をＴｈｒ（Ｔ）からＬｙｓ（Ｋ）に変異させ、位置７８のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＡｌａ（Ａ）に変異させ、位置９３のアミノ酸をＡｌａ（Ａ）からＴｈｒ（Ｔ）に変異させた。ヒト化１０Ｂ１０抗体の軽鎖可変領域については、位置４のアミノ酸をＭｅｔ（Ｍ）からＬｅｕ（Ｌ）に変異させ、位置７１のアミノ酸をＰｈｅ（Ｆ）からＴｙｒ（Ｙ）に変異させ、ヒト化１０Ｂ１０抗体の重鎖可変領域については、位置２７のアミノ酸をＧｌｙ（Ｇ）からＴｙｒ（Ｙ）に変異させ、位置３０のアミノ酸を、Ｓｅｒ（Ｓ）からＴｈｒ（Ｔ）に変異させ、位置４８のアミノ酸をＩｌｅ（Ｉ）からＭｅｔ（Ｍ）に変異させ、位置６７のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異させ、位置７１のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＡｒｇ（Ｒ）に変異させた。

ヒト化６Ｆ３抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３３および３５と名付けた。重鎖および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号３４および３６と名付けた。ヒト化１０Ｂ１０抗体の軽鎖可変および重鎖可変のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３７および３９と名付けた。アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列は、それぞれ配列番号３８および４０と名付けた。

ヒト化６Ｆ３または１０Ｂ１０抗体のＩｇＧ１アイソタイプを生成した（ｈ６Ｆ３−ＩｇＧ１およびｈ１０Ｂ１０−ＩｇＧ１）。ｈ６Ｆ３−ＩｇＧ１の全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列（配列番号４１および４３）、ｈ１０Ｂ１０−ＩｇＧ１の全長重鎖および軽鎖アミノ酸配列（配列番号４５および４７）が上記の表４中に提供されている。

ヒト化６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体の構築および発現
ヒト化６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを合成し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ｖ−７９０）中にクローニングした。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３細胞（１０^６個／ｍＬで２００ｍＬ）を１００μｇの各ヒト化重鎖および軽鎖発現プラスミドを用いてトランスフェクトし、６日間培養した。次いで、上清中のヒト化抗体を、プロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。

［実施例９］
結合の活性および特異性ならびにリガンド遮断活性におけるヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体の特性決定
ヒト化６Ｆ３−ｈＩｇＧ１および１０Ｂ１０−ｈＩｇＧ１抗体の作製および精製後に、ＥＬＩＳＡベースの結合およびＣＴＬＡ４／ＣＤ８０遮断解析ならびにＦＡＣＳベースの結合およびＣＴＬＡ４／ＣＤ８０遮断解析を使用して、抗体の結合および特異性を調べた。使用した方法は、上記の実施例４において記載したものと同様であった。

図５（上のパネル）は、それぞれヒト化６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体のＣＴＬＡ４結合曲線を示した。図５の下のパネルは、ＥＬＩＳＡ結合データから算出された、試験した各抗体のＥＣ５０を示し、ヒト化６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体が、ＣＴＬＡ４と結合できることを実証する。対照的に、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体は、ＣＴＬＡ４結合を全く示さなかった。

同様に、ＦＡＣＳベースの結合アッセイでは、ヒト化６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体の両方とも（図６、上のパネル）、ＣＴＬＡ４との強力な結合を実証した。ヒト化６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体のＦＡＣＳ結合データから算出されたＥＣ５０は、それぞれ図６の下のパネルに示されている。

図７（上のパネル）は、それぞれヒト化６Ｆ３およびヒト化１０Ｂ１０抗体のＥＬＩＳＡベースのリガンド遮断アッセイの結果を示す。各ヒト化抗体のＩＣ５０の定量化が、図７の下のパネルに示されている。

図８は、ＦＡＣＳベースのリガンド遮断アッセイによって測定されるようにヒト化６Ｆ３およびヒト化１０Ｂ１０抗体の両方が、ＣＤ８０とのＣＴＬＡ４結合を遮断したことを示す。図８の下のパネルは、各ヒト化抗体のＩＣ５０を提供する。

［実施例１０］
ヒト化６Ｆ３および１０Ｂ１０抗体のＢｉａｃｏｒｅ動態解析
ＣＴＬＡ４およびヒト化ＣＴＬＡ４抗体間の結合動態学を、実施例５において記載されたとおりにＢｉａｃｏｒｅ３０００によって測定した。関係式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによって決定された速度定数から解離定数、ＫＤを算出した。表１５に示されるように、ヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０は、そのマウス対応物に対して同様の親和性でヒトＣＴＬＡ４と結合した。

［実施例１１］
ＰＢＭＣによるサイトカイン産生に対するヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体の効果
ヒト化ＣＴＬＡ４抗体の活性を、実施例６に記載されるように、リンパ球エフェクター細胞におけるＣＴＬＡ４シグナル伝達経路の遮断に対するその効果によって評価した。研究の結果は、図１１（ＩＬ−２分泌）および図１２（ＩＦＮ−γ分泌）に提供されており、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体６Ｆ３および１０Ｂ１０が、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌を促進できることを実証する。対照的に、アイソタイプ対照抗体を含有する培養物は、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌の増大を示さなかった。

［実施例１２］
腫瘍成長阻害に対するヒト化ＣＴＬＡ４抗体の効果
ヒト化１０Ｂ１０抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を、ＣＴＬＡ４ ＨｕＧＥＭＭ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてヒト化エキソン２およびエキソン３を含有するキメラヒト／マウスＣＴＬＡ４遺伝子を有する遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）の一種を使用して評価した。各マウスに、腫瘍発生のためにＭＣ３８マウス結腸腺癌細胞（１×１０^６個）を用いて右の後側腹部に皮下播種した。平均腫瘍サイズが約７５ｍｍ^３に達した時点で、マウスをその腫瘍サイズに基づいて無作為にグループ化し、同日に抗体処置を開始した。アイソタイプ対照および試験抗体を、ＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍＬに新たに製剤化し、マウスに１０ｍｇ／ｋｇで腹膜内注射（ｉ．ｐ．）によって週に２回（ＢＩＷ）３週間投薬した。腫瘍サイズおよび体重をＢＩＷで測定し、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を（１−（処置グループにおけるＴＶ２１日目−ＴＶ０日目／対照グループにおけるＴＶ２１日目−ＴＶ０日目）×１００％）として算出した。

図１３に示されるように、グループ２中のヒト化抗ＣＴＬＡ４抗体１０Ｂ１０は、有意な抗腫瘍活性をもたらし（ｐ＜０．００１）、２１日目にそのＴＧＩは８４．８５％であった。

本開示は、特定の実施形態（その一部は好ましい実施形態である）に関して特に示され、記載されているが、本明細書において開示されるような本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の種々の変法が行われ得るということは当業者によって理解されなくてはならない。

Claims (22)

1. ａ）配列番号３、配列番号５および配列番号７のアミノ酸配列をそれぞれＨＣＤＲ（重鎖ＣＤＲ）１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、ならびに配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５のアミノ酸配列をそれぞれＬＣＤＲ（軽鎖ＣＤＲ）１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、または
   ｂ）配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３のアミノ酸配列をそれぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３として含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２７、配列番号２９および配列番号３１のアミノ酸配列をそれぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３として含む軽鎖可変領域、
   を含む、単離された抗ＣＴＬＡ４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）抗体またはその抗原結合断片。
2. 配列番号１、配列番号１７、配列番号３３および配列番号３７からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
3. 配列番号９、配列番号２５、配列番号３５および配列番号３９からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
4. ａ）配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号９を含む軽鎖可変領域、
   ｂ）配列番号１７を含む重鎖可変領域および配列番号２５を含む軽鎖可変領域、
   ｃ）配列番号３３を含む重鎖可変領域および配列番号３５を含む軽鎖可変領域、
   ｄ）配列番号３７を含む重鎖可変領域および配列番号３９を含む軽鎖可変領域、または
   ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）に対して少なくとも９０％の配列同一性のある重鎖可変領域および軽鎖可変領域
   を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
5. 表面プラズモン共鳴結合アッセイによって測定されるものとして、１０^−９Ｍ以下のＫＤ値でヒトＣＴＬＡ４タンパク質と特異的に結合可能である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
6. １０^−８Ｍ以下または１０^−９Ｍ以下のＫＤ値でサルＣＴＬＡ４と結合する、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
7. ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるものとして、６００ｎｇ／ｍｌ以下または３００ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でヒトＣＴＬＡ４のそのリガンドとの結合を阻害可能である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
8. ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるものとして、３０ｎｇ／ｍｌ以下または３ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＣＴＬＡ４と結合可能である、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
9. ＦＡＣＳアッセイによって測定されるものとして、６００ｎｇ／ｍｌ以下または３０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でヒトＣＴＬＡ４のそのリガンドとの結合を阻害可能である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
10. ＦＡＣＳアッセイによって測定されるものとして、６０００ｎｇ／ｍｌ以下、２４００ｎｇ／ｍｌ以下、１２００ｎｇ／ｍｌまたは４００ｎｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＣＴＬＡ４と結合可能である、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
11. ヒト化モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
12. ヒト化モノクローナル抗体が、宿主細胞によって生成される、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
13. ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはｄｓダイアボディーである、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
14. コンジュゲートをさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
15. 請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
16. 請求項１５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
17. 請求項１６に記載のベクターを含む宿主細胞。
18. 請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法であって、請求項１７に記載の宿主細胞を、請求項１５に記載のポリヌクレオチドが発現される条件下で培養することを含む、方法。
19. 請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含むキット。
20. 治療上有効な量の請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片および１種または複数の医薬上許容される担体を含む、個体においてＣＴＬＡ４によって媒介される疾患または免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであろう状態を処置するための、医薬組成物。
21. ＣＴＬＡ４阻害剤に対して応答する可能性が高い障害または状態を有すると同定されている個体に投与される、請求項２０に記載の医薬組成物。
22. 疾患または状態が癌である、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。

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