KR20230038246A - 칼슘 활성화 클로라이드 채널 펩타이드 활성화제의 치료적 용도 - Google Patents
칼슘 활성화 클로라이드 채널 펩타이드 활성화제의 치료적 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 칼슘 활성화 클로라이드 채널 펩타이드 활성화제 및 이의 치료적 용도에 관한 것이다.
Description
본 개시내용은 칼슘 활성화 클로라이드 채널 펩타이드 활성화제 및 이의 치료적 용도에 관한 것이다.
아녹타민(Anoctamin) 단백질 수퍼패밀리에 속하는 칼슘 활성화 클로라이드 채널(Calcium-activated chloride channel; CaCC)은 신호 전달, 심장 및 신경 흥분성 조절, 상피 분비 및 근육 수축을 포함하여 특히 세포 생리학에서 중요한 역할을 한다(Hartzell et al., 2005; Pedemonte and Galietta, 2014). 이러한 광범위한 기능을 고려할 때 클로라이드 채널 기능장애는 광범위한 질병을 유발한다. 이러한 다양한 병리에는 낭포성 섬유증, 쇼그렌 증후군에서와 같이 그리고 방사선 손상에 의해 유발되는 침샘 기능장애, 안구건조증, 구강건조증, 위장 운동성저하 질환 및 심장 부정맥이 포함된다.
TMEM16A는 확인된 이 슈퍼패밀리의 첫 번째 구성원이었다(Caputo et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Yang et al., 2008). TMEM16A의 구조는 최근에 페레독신과 같은 폴딩을 채택하는 광범위한 세포내 도메인을 가진 서브유닛당 10개의 막관통 도메인으로 구성된 동종이합체로 채널을 규정함으로써 밝혀졌다(Dang et al., 2017). 그럼에도 불구하고 지금까지 이 채널에 대해 β-서브유닛은 확인되지 않았다.
여러 TMEM16A 작용제가 확인되었다. 예를 들어, 저분자 컬렉션의 기능적 세포 기반 스크린은 TMEM16A를 활성화하는 것으로 보고된 저분자를 식별할 수 있게 한다(Namkung, W. et al. FASEB J. 2011, 25, 4048-4062; WO2013/002793). 그러나 이러한 화합물은 세포에서 내인성 TMEM16A를 활성화하지 못할 수 있다(Centeio R. et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 2557).
따라서, 칼슘의 존재와는 독립적으로 Ca2+-활성화 클로라이드 채널을 특이적으로 활성화하고 Cl- 컨덕턴스의 지속적인 활성화를 생성하는 새로운 화합물을 발견할 필요가 있다.
KCNE1은 129개 잔기의 펩타이드로, 하나의 짧은 소수성 세포막 스패닝 도메인과 카르복시- 및 아미노-말단 도메인이 각각 세포내 및 세포외 쪽을 향하고 있다(Takumi, T., et al. 2018, Science, 242, 1042-1045). 제노퍼스(Xenopus) 난모세포에 주입되면 KCNE1은 서서히 활성화되는 K+ 전류를 생성한다(Takumi, T., et al. 2018, Science, 242, 1042-1045). 이러한 이유로 KCNE1은 초기에 K+ 채널을 인코딩할 수 있는 최소 서열로 여겨졌다(Goldstein, S.A., and Miller, C. 1991, Neuron 7, 403-408; Wang, K.W., and Goldstein, S.A. 1995. Neuron 14, 1303-9). 다른 이종 세포 모델에서의 실험은 KCNE1의 단독 발현이 포유동물 세포주에서 전류를 유도할 수 없기 때문에 이러한 발견에 의문을 제기했다(Lesage, F., et al. 1993, Receptors Channels, 1, 143-152). 이 수수께끼는 제노퍼스(Xenopus) 난모세포가 KCNE1에 의해 조절되는 내인성 KCNQ1 채널을 발현한다는 발견으로 해결되었다(Barhanin, J. et al. 1996. Nature 384, 78-80; Sanguinetti, M.C. et al. 1996, Nature 384, 80-83). 이러한 실험은 KCNE1이 α-서브유닛이 아니라 심장 활동 전위(IK)에서 느린 재분극 성분의 기초가 되는 전압 의존성 칼륨 KCNQ1 채널의 보조(β) 서브유닛을 인코딩한다는 것을 보여주었다(Barhanin, J. et al. 1996. Nature 384, 78-80; Sanguinetti, M.C. et al. 1996, Nature 384, 80-83). 상술한 K+ 전류 이외에 제노퍼스(Xenopus) 난모세포에 KCNE1의 cRNA를 주입하였을 때 전압 의존성 Cl- 전류가 관찰되었으며(Attali, B. et al. 1993. Nature 365, 850-852), 현재까지 이 전류의 분자의 특성은 파악하기 어렵다.
본 발명자들은 KCNE1이 기공 형성 TMEM16A 서브유닛의 β-서브유닛 역할을 하여 30년 전에 기술된 KCNE1 유도성 Cl- 전류를 유도하며 더 이상 Ca2+에 의해서가 아니라 전적으로 전압에 의해 제어된다는 가설을 세웠다(Attali, B. et al. 1993. Nature 365, 850-852). 이종 및 천연 시스템에서의 전기생리학 및 단분자 풀다운 분석법을 사용하여, 본 발명자들은 KCNE1이 TMEM16A와 물리적으로 상호작용하여 증가된 세포질 Ca2+의 부재에서 지속적인 전압 의존성 클로라이드 전류를 유도함을 입증한다. 중요한 것은, 본 발명자들이 일반적인 S38G 다형성을 포함하여 KCNE1 조절된 도메인 내의 임상적으로 관련된 유전적 다형성이 TMEM16A의 KCNE1-의존성 조절을 폐지한다는 것을 발견하였으며, 이는 이 전류가 유전된 병리학에 기여할 수 있음을 시사한다.
본 발명은 서열 L-A-R-X1-S-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO: 3)을 포함하거나 이로 구성된 의약으로 사용하기 위한 TMEM16A 펩타이드 활성화제에 관한 것으로, 여기서, 상기 X1은 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이고; X2는 프롤린 또는 글루타민이며; X3은 아르기닌 또는 루신이고; X4는 세린 또는 아르기닌이며 및 X5는 글리신 또는 아스파르트산이다.
특히, 펩타이드는 서열 L-A-R-X1-S-X2-X3-X4-X5-D-X6-K-L(SEQ ID NO: 4)을 포함하거나 이로 구성되되, 상기 X1은 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이고, X2는 프롤린 또는 글루타민이며, X3은 아르기닌 또는 루신이고, X4는 세린 또는 아르기닌이며, X5는 글리신 또는 아스파르트산이고 및 X6은 글리신 또는 세린이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 펩타이드는 아미노산 서열 L-A-R-R-S-P-R-S-S(SEQ ID NO: 1) 또는 이의 기능성 변이체, 보다 바람직하게는 아미노산 서열 L-A-R-R-S-P-R-S-S-D-G-K-L(SEQ ID NO: 2) 또는 이의 기능성 변이체를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 펩타이드는 8 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 20개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 13 내지 20개의 아미노산 잔기이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노 서열을 포함하거나 이로 구성되며, 보다 구체적으로 SEQ ID NO: 1 또는 2와 비교하여 3개 이하의 보존적 치환된 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 펩타이드를 인코딩하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 펩타이드, 핵산 또는 발현 벡터는 클로라이드 채널 기능장애로 인한 질병, 바람직하게는 TMEM16-A 채널 기능장애로 인한 질병, 보다 바람직하게는 하기로 구성된 군에서 선택되는 질병의 치료에 사용하기 위한 것이다: 낭포성 섬유증, 구강건조증, 안구건조증, 심장 부정맥 및 위장 운동성저하 질환, 바람직하게는 안구건조증.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 전술한 펩타이드, 핵산 또는 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 8 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 20개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 13 내지 20개의 아미노산 잔기의 펩타이드에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 또한 전술한 바와 같은 펩타이드, 핵산 또는 발현 벡터의 클로라이드 채널 활성화제로서의 용도에 관한 것이다.
도 1. KCNE1은 CaCC TMEM16A를 전압 의존성 클로라이드 채널로 변환한다.
(A) HEK293T 세포에서 KCNE1 또는 TMEM16A 또는 TMEM16A 및 KCNE1 둘 다의 발현 효과를 나타내는 대표적인 전류 트레이스. 트레이스는 -80 mV의 유지 전위에서 20 mV 간격으로 -100 내지 +100 mV의 펄스를 사용하여 생성되었다. (B) +100 mV에서 얻은 전류 밀도의 요약. (C-D) 니플룸산(niflumic acid)(NFA, 100 μM, C), T16A(inh(A01(10 μM, C), 또는 Ani9(300 nM, D)의 적용 효과를 보여주는 대표적인 트레이스. (E-F) 1 mM BAPTA의 존재 하에서 TMEM16A 단독(E) 또는 KCNE1(F)와의 동시발현의 대표적인 트레이스. 전류는 전압 램프(-100 내지 +100 mV, 1s 지속)에 의해 유도되었으며 삽입 그림은 +100 mV에서 얻은 전류 밀도의 요약을 보여준다. Mann-Whitney 테스트(** p < 0.01, *** p < 0.001). 평균±SEM.
도 2. KCNE1 발현은 세포내 Ca2+의 증가로 이어지지 않는다.
(A) 상이한 Ca2+ 농도에서 SK4 및 빈 벡터 또는 KCNE1로 형질감염된 HEK293T 세포로부터 얻은 대표적인 전류 트레이스. SK4 전류는 KCNE1 동시발현에 의해 활성화되지 않아 세포내 칼슘 증가가 없음을 보여준다. 트레이스는 -80 mV의 유지 전위에서 -100 내지 +100 mV의 펄스를 사용하여 생성되었다. (B) +100 mV에서 얻은 전류 밀도의 요약. Mann-Whitney 테스트(** p < 0.05, *** p < 0.001). 평균±SEM.
도 3. KCNE1 및 TMEM16A는 2α:2β 복합체에서 상호작용한다.
(A) TMEM16A의 단분자 풀다운(SiMPull) 분석의 개략도. TMEM16A-GFP 및 HA-태그된 KCNE1을 동시발현하는 HEK293T 세포의 용해물을 비오틴화 항-HA 항체에 접합된 PEG로 피막처리된 커버슬립 상에 고정시켰다. (B) HA-KCNE1에 의한 TMEM16A-GFP의 풀다운을 나타내는 단분자의 대표적인 TIRF 이미지. (C) TMEM16A-GFP(AU, Arbitrary Units)의 2개의 광퇴색 단계(빨간색 화살표)를 보여주는 대표적인 트레이스. (D) TMEM16A-GFP에 대한 광퇴색 단계 분포의 요약. (E-H), HA-TMEM16A에 의한 KCNE1-GFP의 SiMPull에 대해 (A-D)와 동일. (I-L) 항-HA 항체의 특이성. (I-J) HA-KCNE1의 부재에서 TMEM16A-GFP를 사용한 SiMPull 분석. (KL) HA-TMEM16A의 부재에서 KCNE1-GFP를 사용한 SiMPull 분석.
도 4. KCNE1-TMEM16A 복합체는 근위곡 요세관(PCT) 세포에서 전압 의존성 클로라이드 전류를 생성한다.
(A) 야생형 및 kcne1 -/- PCT 세포에서 얻은 대표적인 트레이스. (B-D) NFA(100 μM, B), A01(10 μM, C), Ani9(5 μM, D)와 배양한 후 야생형 세포의 대표적인 트레이스. (E) TMEM16A에 대한 siRNA로 형질감염 후 얻은 트레이스. (F) KCNE1 cDNA로 형질감염 후 kcne1 -/- PCT 세포에서 얻은 트레이스. 전류는 전압 램프(-100 내지 +100 mV, 1s 지속)에 의해 생성되었다. 삽입 그림은 전류 밀도를 보여준다. Mann-Whitney 테스트(*** p < 0.001). 평균±SEM.
도 5. KCNE1의 예비 막관통 도메인(Nter13)은 KCNE1 유도성 TMEM16A 변환에 충분하다.
(A) TMEM16A 상호작용과 관련된 도메인을 결정하는 데 사용되는 KCNE1의 절단 형태를 묘사한 만화. (B-C) TMEM16A 및 KCNE1ΔCt, KCNE1ΔNt(B), KCNE1ΔNt16 또는 KCNE1ΔNt30(C)을 동시발현하는 HEK293T 세포에서 얻은 대표적인 트레이스. (D) TMEM16A를 단독 발현하는 HEK293T 세포에 대한 Nter13 및 스크램블 펩타이드의 효과를 나타내는 대표적인 트레이스. 전류는 전압 램프(-100 내지 +100 mV, 1s 지속)에 의해 유도되었다. 삽입 그림은 +100 mV에서 상이한 조건에 대해 얻은 전류 밀도의 요약을 보여준다. Mann-Whitney 테스트(*** p < 0.001). 평균±SEM.
도 6. Nter13 펩타이드는 TMEM16A의 기능화 모드를 전환하기에 충분하다.
(A) Nter13 펩타이드(100 μM)를 적용하고 세척한 후 얻은 내인성 TMEM16A를 발현하는 제노퍼스(Xenopus) 난모세포의 대표적인 전류 트레이스. (B) TMEM16A를 단독 발현하는 HEK293T 세포에 대한 Nter13 펩타이드 적용(100 μM) 및 Ani9(5 μM)에 의한 역전의 효과를 나타내는 대표적인 트레이스. (C) 시간 경과에 따른 TMEM16A 전류에 대한 Nter13 펩타이드의 효과 및 HEK293T 세포에서 Ani9의 동시적용을 통한 억제. (D) TMEM16A를 발현하는 HEK293T 세포에서 상이한 펩타이드 농도에 대해 관찰된 전류 밀도를 나타내는 농도-반응 곡선. 평균±SEM.
도 7. KCNE1 S38G 및 R32H는 KCNQ1 조절을 손상시키지 않지만 TMEM16A 조절을 폐지한다.
(A) 야생형 KCNQ1 단독으로 형질감염되고 KCNE1 또는 KCNE1R32H 또는 KCNE1S38G이 동시형질감염된 세포로부터의 전체 세포 패치-클램프 기록의 전류 트레이스. (B) +40 mV에서 상이한 조건에 대해 얻은 전류 밀도의 요약. (C-D) KCNE1 및 TMEM16A를 동시발현하는 세포를 이용하고, A-B와 동일하다. 전류 밀도는 +100 mV에서 계산되었다. Mann-Whitney 테스트(** p < 0.05, *** p < 0.001). 평균±SEM.
도 8: hS38G 펩타이드는 TMEM16A에 영향을 미치지 않는다.
(A) hN13(SEQ ID NO: 2) 및 hS38G 서열(SEQ ID NO: 5)의 비교. (B) TMEM16A를 발현하는 HEK293T 세포에서 hN13(100 μM) 또는 hS38G(100 μM)의 관류. 전류는 전압 램프(-100 mV 내지 +100 mV, 1s 지속) 및 +100 mV에서 취한 전류에 의해 유도되었다. 평균±SEM.
도 9: hN13 펩타이드는 TMEM16A에 대해 rN13보다 더 강력하다.
(A) hN13(SEQ ID NO: 2) 및 rN13 서열(SEQ ID NO: 6)의 비교. (B) TMEM16A를 발현하는 HEK293T 세포에서 hN13(100 μM) 또는 rN13(100 μM)의 관류. (C-D) 제노퍼스(Xenopus) 난모세포에 대한 hN13(100 μM, C) 또는 rN13(100 μM, D) 관류, 이어서 Ani-9(5 μM)의 적용의 효과를 보여주는 대표적인 전류. 전류는 전압 램프(-100 mV 내지 +100 mV, 1s 지속) 및 +100 mv에서 취한 전류에 의해 유도되었다. 평균±SEM.
도 10. 유루율(tearing rate)에 대한 N13ter, 비히클, 아밀로라이드 및 스크램블 펩타이드의 효과 비교.
비교를 위해 데이터는 각 눈의 기초 유루율(100%)로 정규화되었으며 각 그룹의 평균이다. A) N13ter 또는 스크램블 펩타이드(둘 다 10 mM)를 0시간에 국소 도포하고 1, 3, 6, 12 및 24시간에 유루율을 측정하였다. N13ter(n=20안; 10마리 쥐); 스크램블(n=20안; 10마리 쥐). *p<0.05 대 스크램블 그룹; 이원 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트. #p<0.05 대 기초; 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트. B) B(기초 유루율). PBS, 아밀로라이드(1 mM) 또는 N13ter(10 mM)를 0시간에 국소 도포하고 1, 3, 6, 12 및 24시간에 유루율을 측정하였다. 비히클(n=14안, 14마리 쥐), 아밀로라이드(n=14안, 7마리 쥐), N13ter(n=12안, 6마리 쥐). *p<0.05 N13 대 비히클 그룹; 이원 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트. #p<0.05 대 기초; 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트.
도 11: 유루율에 대한 N13ter 대 비히클의 급성 효과 비교.
N13ter 펩타이드(10 mM)를 분석하는 다양한 연구에 대한 모든 데이터는 단일 그룹(n=16마리의 쥐에서 32안)으로 모아졌다. 비히클 그룹(n=14안, 7마리 쥐). 비교를 위해 데이터는 각 눈의 기초 유루율(100%)로 정규화되었으며 각 그룹의 평균이다. *p<0.05; ***p<0.001; N13ter 대 비히클 그룹; 이원 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트. #p<0.05 N13ter 대 기초(B); 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트.
도 12: 안구 건조 모델에서 유루율에 대한 N13ter 펩타이드 또는 비히클의 효과.
B(수술 전 기초 유루율). 1-5주(외눈물샘의 외과적 제거 후 1, 2, 3, 4 및 5주에 측정된 유루율). 5주차 유루율 값은 펩타이드 적용 후 다른 시점과 비교하기 위한 기준으로 사용되었다. N13ter 펩타이드(10 mM) 또는 비히클(Vehicle(PBS))을 0시간에 국소 도포하고 1, 3, 6, 12 및 24시간에 유루율을 측정하였다. N13ter(n=14안; 9마리 쥐); 비히클(n=12안; 8마리 쥐).**p<0.01 대 비히클 그룹; 이원 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트. "p<0.01 대 5주 기초; 일원 ANOVA + Bonferroni 사후 테스트.
(A) HEK293T 세포에서 KCNE1 또는 TMEM16A 또는 TMEM16A 및 KCNE1 둘 다의 발현 효과를 나타내는 대표적인 전류 트레이스. 트레이스는 -80 mV의 유지 전위에서 20 mV 간격으로 -100 내지 +100 mV의 펄스를 사용하여 생성되었다. (B) +100 mV에서 얻은 전류 밀도의 요약. (C-D) 니플룸산(niflumic acid)(NFA, 100 μM, C), T16A(inh(A01(10 μM, C), 또는 Ani9(300 nM, D)의 적용 효과를 보여주는 대표적인 트레이스. (E-F) 1 mM BAPTA의 존재 하에서 TMEM16A 단독(E) 또는 KCNE1(F)와의 동시발현의 대표적인 트레이스. 전류는 전압 램프(-100 내지 +100 mV, 1s 지속)에 의해 유도되었으며 삽입 그림은 +100 mV에서 얻은 전류 밀도의 요약을 보여준다. Mann-Whitney 테스트(** p < 0.01, *** p < 0.001). 평균±SEM.
도 2. KCNE1 발현은 세포내 Ca2+의 증가로 이어지지 않는다.
(A) 상이한 Ca2+ 농도에서 SK4 및 빈 벡터 또는 KCNE1로 형질감염된 HEK293T 세포로부터 얻은 대표적인 전류 트레이스. SK4 전류는 KCNE1 동시발현에 의해 활성화되지 않아 세포내 칼슘 증가가 없음을 보여준다. 트레이스는 -80 mV의 유지 전위에서 -100 내지 +100 mV의 펄스를 사용하여 생성되었다. (B) +100 mV에서 얻은 전류 밀도의 요약. Mann-Whitney 테스트(** p < 0.05, *** p < 0.001). 평균±SEM.
도 3. KCNE1 및 TMEM16A는 2α:2β 복합체에서 상호작용한다.
(A) TMEM16A의 단분자 풀다운(SiMPull) 분석의 개략도. TMEM16A-GFP 및 HA-태그된 KCNE1을 동시발현하는 HEK293T 세포의 용해물을 비오틴화 항-HA 항체에 접합된 PEG로 피막처리된 커버슬립 상에 고정시켰다. (B) HA-KCNE1에 의한 TMEM16A-GFP의 풀다운을 나타내는 단분자의 대표적인 TIRF 이미지. (C) TMEM16A-GFP(AU, Arbitrary Units)의 2개의 광퇴색 단계(빨간색 화살표)를 보여주는 대표적인 트레이스. (D) TMEM16A-GFP에 대한 광퇴색 단계 분포의 요약. (E-H), HA-TMEM16A에 의한 KCNE1-GFP의 SiMPull에 대해 (A-D)와 동일. (I-L) 항-HA 항체의 특이성. (I-J) HA-KCNE1의 부재에서 TMEM16A-GFP를 사용한 SiMPull 분석. (KL) HA-TMEM16A의 부재에서 KCNE1-GFP를 사용한 SiMPull 분석.
도 4. KCNE1-TMEM16A 복합체는 근위곡 요세관(PCT) 세포에서 전압 의존성 클로라이드 전류를 생성한다.
(A) 야생형 및 kcne1 -/- PCT 세포에서 얻은 대표적인 트레이스. (B-D) NFA(100 μM, B), A01(10 μM, C), Ani9(5 μM, D)와 배양한 후 야생형 세포의 대표적인 트레이스. (E) TMEM16A에 대한 siRNA로 형질감염 후 얻은 트레이스. (F) KCNE1 cDNA로 형질감염 후 kcne1 -/- PCT 세포에서 얻은 트레이스. 전류는 전압 램프(-100 내지 +100 mV, 1s 지속)에 의해 생성되었다. 삽입 그림은 전류 밀도를 보여준다. Mann-Whitney 테스트(*** p < 0.001). 평균±SEM.
도 5. KCNE1의 예비 막관통 도메인(Nter13)은 KCNE1 유도성 TMEM16A 변환에 충분하다.
(A) TMEM16A 상호작용과 관련된 도메인을 결정하는 데 사용되는 KCNE1의 절단 형태를 묘사한 만화. (B-C) TMEM16A 및 KCNE1ΔCt, KCNE1ΔNt(B), KCNE1ΔNt16 또는 KCNE1ΔNt30(C)을 동시발현하는 HEK293T 세포에서 얻은 대표적인 트레이스. (D) TMEM16A를 단독 발현하는 HEK293T 세포에 대한 Nter13 및 스크램블 펩타이드의 효과를 나타내는 대표적인 트레이스. 전류는 전압 램프(-100 내지 +100 mV, 1s 지속)에 의해 유도되었다. 삽입 그림은 +100 mV에서 상이한 조건에 대해 얻은 전류 밀도의 요약을 보여준다. Mann-Whitney 테스트(*** p < 0.001). 평균±SEM.
도 6. Nter13 펩타이드는 TMEM16A의 기능화 모드를 전환하기에 충분하다.
(A) Nter13 펩타이드(100 μM)를 적용하고 세척한 후 얻은 내인성 TMEM16A를 발현하는 제노퍼스(Xenopus) 난모세포의 대표적인 전류 트레이스. (B) TMEM16A를 단독 발현하는 HEK293T 세포에 대한 Nter13 펩타이드 적용(100 μM) 및 Ani9(5 μM)에 의한 역전의 효과를 나타내는 대표적인 트레이스. (C) 시간 경과에 따른 TMEM16A 전류에 대한 Nter13 펩타이드의 효과 및 HEK293T 세포에서 Ani9의 동시적용을 통한 억제. (D) TMEM16A를 발현하는 HEK293T 세포에서 상이한 펩타이드 농도에 대해 관찰된 전류 밀도를 나타내는 농도-반응 곡선. 평균±SEM.
도 7. KCNE1 S38G 및 R32H는 KCNQ1 조절을 손상시키지 않지만 TMEM16A 조절을 폐지한다.
(A) 야생형 KCNQ1 단독으로 형질감염되고 KCNE1 또는 KCNE1R32H 또는 KCNE1S38G이 동시형질감염된 세포로부터의 전체 세포 패치-클램프 기록의 전류 트레이스. (B) +40 mV에서 상이한 조건에 대해 얻은 전류 밀도의 요약. (C-D) KCNE1 및 TMEM16A를 동시발현하는 세포를 이용하고, A-B와 동일하다. 전류 밀도는 +100 mV에서 계산되었다. Mann-Whitney 테스트(** p < 0.05, *** p < 0.001). 평균±SEM.
도 8: hS38G 펩타이드는 TMEM16A에 영향을 미치지 않는다.
(A) hN13(SEQ ID NO: 2) 및 hS38G 서열(SEQ ID NO: 5)의 비교. (B) TMEM16A를 발현하는 HEK293T 세포에서 hN13(100 μM) 또는 hS38G(100 μM)의 관류. 전류는 전압 램프(-100 mV 내지 +100 mV, 1s 지속) 및 +100 mV에서 취한 전류에 의해 유도되었다. 평균±SEM.
도 9: hN13 펩타이드는 TMEM16A에 대해 rN13보다 더 강력하다.
(A) hN13(SEQ ID NO: 2) 및 rN13 서열(SEQ ID NO: 6)의 비교. (B) TMEM16A를 발현하는 HEK293T 세포에서 hN13(100 μM) 또는 rN13(100 μM)의 관류. (C-D) 제노퍼스(Xenopus) 난모세포에 대한 hN13(100 μM, C) 또는 rN13(100 μM, D) 관류, 이어서 Ani-9(5 μM)의 적용의 효과를 보여주는 대표적인 전류. 전류는 전압 램프(-100 mV 내지 +100 mV, 1s 지속) 및 +100 mv에서 취한 전류에 의해 유도되었다. 평균±SEM.
도 10. 유루율(tearing rate)에 대한 N13ter, 비히클, 아밀로라이드 및 스크램블 펩타이드의 효과 비교.
비교를 위해 데이터는 각 눈의 기초 유루율(100%)로 정규화되었으며 각 그룹의 평균이다. A) N13ter 또는 스크램블 펩타이드(둘 다 10 mM)를 0시간에 국소 도포하고 1, 3, 6, 12 및 24시간에 유루율을 측정하였다. N13ter(n=20안; 10마리 쥐); 스크램블(n=20안; 10마리 쥐). *p<0.05 대 스크램블 그룹; 이원 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트. #p<0.05 대 기초; 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트. B) B(기초 유루율). PBS, 아밀로라이드(1 mM) 또는 N13ter(10 mM)를 0시간에 국소 도포하고 1, 3, 6, 12 및 24시간에 유루율을 측정하였다. 비히클(n=14안, 14마리 쥐), 아밀로라이드(n=14안, 7마리 쥐), N13ter(n=12안, 6마리 쥐). *p<0.05 N13 대 비히클 그룹; 이원 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트. #p<0.05 대 기초; 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트.
도 11: 유루율에 대한 N13ter 대 비히클의 급성 효과 비교.
N13ter 펩타이드(10 mM)를 분석하는 다양한 연구에 대한 모든 데이터는 단일 그룹(n=16마리의 쥐에서 32안)으로 모아졌다. 비히클 그룹(n=14안, 7마리 쥐). 비교를 위해 데이터는 각 눈의 기초 유루율(100%)로 정규화되었으며 각 그룹의 평균이다. *p<0.05; ***p<0.001; N13ter 대 비히클 그룹; 이원 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트. #p<0.05 N13ter 대 기초(B); 일원 분산 분석과 Bonferroni 사후 테스트.
도 12: 안구 건조 모델에서 유루율에 대한 N13ter 펩타이드 또는 비히클의 효과.
B(수술 전 기초 유루율). 1-5주(외눈물샘의 외과적 제거 후 1, 2, 3, 4 및 5주에 측정된 유루율). 5주차 유루율 값은 펩타이드 적용 후 다른 시점과 비교하기 위한 기준으로 사용되었다. N13ter 펩타이드(10 mM) 또는 비히클(Vehicle(PBS))을 0시간에 국소 도포하고 1, 3, 6, 12 및 24시간에 유루율을 측정하였다. N13ter(n=14안; 9마리 쥐); 비히클(n=12안; 8마리 쥐).**p<0.01 대 비히클 그룹; 이원 ANOVA와 Bonferroni 사후 테스트. "p<0.01 대 5주 기초; 일원 ANOVA + Bonferroni 사후 테스트.
본 발명자들은 KCNE1 서브유닛이 TMEM16-A 칼슘 활성화 클로라이드 채널과 상호작용하여 Cl- 컨덕턴스를 활성화하고, TMEM16-A를 칼슘 의존성 채널에서 전압 의존성 채널로 전환함을 보여주었다. 특히, 본 발명자들은 KCNE1의 막관통 도메인에 더 가까운 KCNE1의 N-말단 단편이 TMEM16-A 채널 Cl- 컨덕턴스에 대한 KCNE1의 작용을 반복한다는 것을 보여주었다.
칼슘 의존성 클로라이드 채널 펩타이드 활성화제
따라서, 본 발명은 TMEM16A에 결합하고 클로라이드 컨덕턴스 활성화를 유도하는 KCNE1 단백질의 기능성 N-말단 단편을 포함하거나 이로 구성된 본 명세서에서 TMEM16A 펩타이드 활성화제라고도 명명된 칼슘 의존성 클로라이드 채널 펩타이드 활성화제에 관한 것이다.
"칼슘 의존성 클로라이드 채널 활성화제"는 칼슘 의존성 클로라이드 채널에 결합하여 Cl- 컨덕턴스를 증가시키는 화합물을 의미한다. 본 개시내용에 따르면, 상기 칼슘 의존성 클로라이드 채널 활성화제는 TMEM16A에 결합하여 Cl- 컨덕턴스를 증가시킨다.
본 명세서에서, 용어 "펩타이드", "올리고펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 상호 교환적으로 사용되며, 상기 사슬을 형성하는 아미노산의 수에 관계없이 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산 사슬을 지칭한다.
ISK, JLNS, LQT5, MinK, JLNS2 또는 LQT2/5 인간 유전자(Gene ID: 3753, 2020년 6월 1일 업데이트됨)로도 알려진 칼륨 전압-게이트 채널 서브패밀리 E 조절성 서브유닛 1(KCNE1)은 129개의 아미노산의 단백질을 인코딩한다(NCBI reference: NP_000210.2).
본 개시내용에 따른 TMEM16-A 활성화제 펩타이드는 인간 KCNE1 단백질 서열(NCBI reference: NP_000210.2)의 위치 30 내지 38(SEQ ID NO: 1), 바람직하게는 위치 30 내지 42(SEQ ID NO: 2)(Nter 13Peptide) 사이의 인접한 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성된다.
KCNE1 N-말단 단편은 잘 보존되어 있기 때문에 다른 동물 종에서 유래한 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 생쥐(mouse) 또는 쥐(rat)의 KCNE1 단백질. 인간 KCNE1 단백질에 상응하는 KCNE1 아미노산의 위치는 서열 정렬에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
예를 들어, 쥐 KCNE1 단백질 서열(NCBI reference sequence: NP_0371105.1)의 위치 31 내지 39, 바람직하게는 31 내지 43 사이의 인접한 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성된 TMEM16-A 활성화제 펩타이드도 사용될 수 있다. 유리하게는, TMEM16A 펩타이드 활성화제는 인간 N-말단 KCNE1 단편을 포함하거나 이로 구성되며 인간 TMEM16A에 결합한다.
특정 구체예에서, 본 개시내용에 따른 펩타이드는 전술한 바와 같은 TMEM16A 펩타이드 활성화제의 기능성 변이체일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "TMEM16A 펩타이드 활성화제 기능성 변이체"는 상기 기재된 바와 같은 TMEM16A 펩타이드 활성화제로부터 유래되고 하나 이상(예를 들어, 여러) 위치에서 변경, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하지만 TMEM16A 채널을 활성화할 수 있는 용량을 유지하는 폴리펩타이드 서열을 지칭한다. 변이체는 당업계에 잘 알려진 다양한 기술에 의해 얻을 수 있다. 천연 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 변경하기 위한 기술의 예는 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발 및 합성 올리고뉴클레오티드 구축을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게는, 본 명세서에 사용된 용어 "변이체" 또는 "기능성 변이체"는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 폴리펩타이드 서열의 정렬로부터의 위치에서 매치(동일한 아미노산 잔기)의 수(%)를 지칭한다. 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성을 최대화하도록 정렬될 때 서열을 비교함으로써 결정된다. 특히, 서열 동일성은 두 서열의 길이에 따라 임의의 다수의 수학적 글로벌 또는 로컬 정렬 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열은 바람직하게는 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 글로벌 정렬 알고리즘(예를 들어, Needleman 및 Wunsch 알고리즘; Needleman and Wunsch, 1970)을 이용하여 정렬되는 반면, 실질적으로 상이한 길이의 서열들은 바람직하게는 로컬 정렬 알고리즘(예를 들어, Smith 및 Waterman 알고리즘(Smith and Waterman, 1981) 또는 Altschul 알고리즘(Altschul et al, 1997; Altschul et al., 2005)을 이용하여 정렬된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적을 위한 정렬은 예를 들어 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/과 같은 인터넷 웹 사이트에서 이용 가능한 공개적으로 이용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에서 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본 명세서의 목적을 위해 % 아미노산 서열 동일성 값은 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 두 서열의 최적 전체 정렬을 생성하는 쌍별 서열 정렬 프로그램 EMBOSS Needle을 사용하여 생성된 값을 지칭하며, 여기서 모든 검색 파라미터는 기초값, 즉 스코어링 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 개방 = 10, 갭 확장 = 0.5, 엔드 갭 페널티 = 거짓, 엔드 갭 개방 = 10 및 엔드 갭 확장 = 0.5로 설정된다.
바람직하게는, 용어 "변이체" 또는 "기능성 변이체"는 SEQ ID NO: 1의 서열과 5, 4, 3 또는 2개 미만의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다.
보다 바람직하게는, 용어 "변이체" 또는 "기능성 변이체"는 SEQ ID NO: 2의 서열과 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다.
특히, 기능성 변이체는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 2와 실질적으로 상동이다. 2개의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기가 생물학적으로 유사한 잔기로 대체되는 경우, 즉 보존적 치환인 경우 "상동", "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사"하다.
바람직한 구체예에서, 기능성 변이체는 하나 이상의 보존적 치환에 의해, 바람직하게는 5, 4, 3 또는 2개 미만의 보존적 치환에 의해 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 상이하다.
보다 바람직한 구체예에서, 기능성 변이체는 하나 이상의 보존적 치환, 바람직하게는 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 보존적 치환에 의해 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 상이하다.
본 발명은 자연적으로 발생하는 아미노산으로부터 "치환" 또는 "변형"되어 변경되거나 변형된 아미노산을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "보존적 치환"은 펩타이드의 전체적인 형태 및 기능을 변경하지 않고 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미하며, 이에 제한되지는 않지만 유사한 특성(예컨대, 예를 들어, 극성, 수소 결합 전위, 산성, 염기성, 형상, 소수성, 방향족 등)을 갖는 것으로 아미노산을 대체하는 것을 포함한다.
보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(메티오닌, 루신, 이소루신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 그룹 내에 있다.
TMEM16A 채널을 활성화하는 변이체의 TMEM16 펩타이드 활성화제 능력은 상기 기술된 바와 같이 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, TMEM16A 활성은 전기생리학적 분석의 예에 설명된 대로 패치 클램프 또는 TEVC(Two-Electrode-Voltage-Clamp) 실험으로 평가할 수 있다. 특히, 전술한 바와 같이 전압 의존성 전류를 유도하는 펩타이드 기능성 변이체의 능력은 TMEM16A 및 상기 펩타이드를 동시발현하는 HEK293T 세포와 같은 세포에서의 패치-클램프 실험에 의해 측정될 수 있거나 또는 내재적으로 TMEM16A를 발현하는 제노퍼스(Xenopus) 난모세포에 대한 TEVC 실험을 수행할 수 있다.
바람직하게는, TMEM16A 활성화에 중요한 아미노산 잔기는 기능성 변이체에서 보존되며, 상기 잔기는 인간 KCNE1 단백질 서열(NCBI reference: NP_000210.2 accessed on July 04, 2020)의 32번 위치의 아르기닌 및/또는 38번 위치의 세린에 해당한다(NCBI reference: 2020년 7월 4일에 접속된 NP_000210.2).
특정 구체예에서, 상기 TMEM16A 펩타이드 활성화제는 서열 L-A-R-X1-S-X2-X3-X4-X5(SEQ ID NO: 3)를 포함하거나 이로 구성되되, 상기
- X1은 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이고,
- X2는 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 프롤린 또는 글루타민이며,
- X3은 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 아르기닌 또는 루신이고,
- X4는 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 세린 또는 아르기닌이며,
- X5는 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 세린 또는 아스파르트산이다.
보다 바람직한 구체예에서, 상기 TMEM16A 펩타이드 활성화제는 서열 L-A-R-X1-S-X2-X3-X4-X5-D-X6-K-L(SEQ ID NO: 4)을 포함하거나 이로 구성되되, 상기
- X1은 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이고,
- X2는 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 프롤린 또는 글루타민이며,
- X3은 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 아르기닌 또는 루신이고,
- X4는 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 세린 또는 아르기닌이며,
- X5는 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 세린 또는 아스파르트산이고,
- X6은 20개의 아미노산 중 임의의 하나, 바람직하게는 글리신 또는 세린이다.
보다 바람직한 구체예에서, 상기 TMEM16A 펩타이드 활성화제는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
바람직하게는, 전술한 바와 같은 TMEM16A 활성화제 펩타이드는 8 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 20개의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 13 내지 20개의 아미노산 잔기이다.
보다 바람직하게는, TMEM16A 활성화제 펩타이드는 8 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 20개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 13 내지 20개의 아미노산 잔기이고, SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열과 하나 이상의 보존적 치환, 바람직하게는 6, 5, 4, 3 또는 2개 미만의 보존적 치환에 의해 상이한 아미노산 서열을 포함한다.
펩타이드 제조
본 명세서에 기재된 펩타이드는 당업자에게 공지된 표준 합성 방법, 예를 들어 화학적 합성 또는 유전자 재조합을 사용하여 합성할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 펩타이드는 적절한 순서로 이미 아미노산 서열을 함유하는 사전 형성된 단편의 축합에 의해, 또는 이전에 제조된 여러 단편의 축합에 의해 아미노산 잔기의 단계적 축합에 의해 얻는 한편 축합 동안 펩타이드 결합에 관여하는 것을 제외한 아미노산 작용기는 보호된다. 특히 Merrifield가 최초로 기술한 방법에 따라 펩타이드를 합성할 수 있다.
화학 합성 기술의 예로는 고체상 합성 및 액체상 합성이 있다. 고체상 합성으로서, 예를 들어, 합성되는 펩타이드의 C-말단에 상응하는 아미노산은 유기 용매에 불용성인 지지체에 결합되고, 반응의 교대 반복에 의해, 여기서 그들의 아민기 및 적당한 보호기로 보호되는 측쇄 작용기를 갖는 아미노산은 C-말단에서 N-말단 순서로 하나씩 축합되며, 수지 또는 펩타이드의 아미노기의 보호기에 결합된 아미노산이 방출되면, 펩타이드 사슬은 따라서 이 방식으로 확장된다. 고체상 합성법은 사용하는 보호기의 종류에 따라 크게 tBoc법과 Fmoc법으로 분류된다. 전형적으로 사용되는 보호기는 아미노기에 대한 tBoc(t-부톡시카르보닐), Cl-Z(2-클로로벤질옥시카르보닐), Br-Z(2-브로모벤질로일카르보닐), Bzl(벤질), Fmoc(9-플루오레닐메톡시카르보닐), Mbh(4,4'-디메톡시디벤즈히드릴), Mtr(4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐), Trt(트리틸), Tos(토실), Z(벤질옥시카르보닐) 및 Clz-Bzl(2,6-디클로로벤질); 구아니디노 기에 대한 N02(니트로) 및 Pmc(2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐); 및 히드록실기에 대한 tBu(t-부틸)을 포함한다. 원하는 펩타이드 합성 후 탈보호 반응을 거쳐 고체 지지체에서 잘라낸다. 이러한 펩타이드 절단 반응은 Boc 방법의 경우 불화수소 또는 트리플루오로메탄 설폰산을 사용하여 수행할 수 있고, Fmoc 방법의 경우 TFA를 사용하여 수행할 수 있다.
대안으로, 펩타이드는 재조합 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 이 경우, 핵산 작제물은 본 개시내용에 따른 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열, 상기 서열 중 하나에 상보적인 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 엄격한 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 명세서에 기재된 펩타이드의 N- 및 C-말단은 임의로 단백질분해에 대해 보호될 수 있다. 예를 들어, N-말단은 아세틸기의 형태일 수 있고 및/또는 C-말단은 아미드기의 형태일 수 있다. 단백질분해에 내성이 있는 펩타이드의 내부 변형이 또한 구상된다. 예를 들어, 여기서 적어도 -CONH- 펩타이드 결합은 (CH2NH) 환원 결합, (NHCO) 레트로-인버소 결합, (CH2-O) 메틸렌-옥시 결합, (CH2-S) 티오메틸렌 결합, (CH2CH2) 카바 결합, (CO-CH2) 세토메틸렌 결합, (CHOH-CH2) 히드록시에틸렌 결합), (N-N) 결합, E-알센 결합 또는 -CH=CH-결합에 의해 변형되고 대체된다.
예를 들어 펩타이드는 아세틸화, 아실화, 아미드화, 가교, 고리화, 이황화 결합 형성, 공유 가교 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 인산화 등에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 D 배열의 아미노산(들)로 구성될 수 있으며, 이는 펩타이드가 단백질분해에 대해 내성이 있게 한다. 이들은 또한 분자내 가교, 예를 들어 적어도 2개의 아미노산 잔기를 올레핀 측쇄, 바람직하게는 C3-C8 알케닐 사슬, 바람직하게는 펜텐-2-일 사슬로 변형시킨 후 Walensky et al, 2004에 기술된 소위 "스테이플" 기술에 따라 사슬의 화학적 가교에 의해 안정화될 수 있다. 예를 들어, 위치 i 및 i+4 내지 i+7의 아미노산은 반응성 올레핀 잔기를 나타내는 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 모든 단백질분해에 대해 내성이 있는 화학적으로 변형된 펩타이드는 본 개시내용에 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 펩타이드는 뇨 청소율 및 사용되는 치료 용량에서의 감소 그리고 혈장에서의 반감기의 증가를 위해 그들의 C-말단 또는 리신 잔기에 의해 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 주로 1500 또는 4000 MW의 PEG에 공유 결합된다. 또 다른 구체예에서, 펩타이드 반감기는 약물 전달 시스템 형성 미소구체를 위한 생분해성 및 생체적합성 중합체 물질에 펩타이드를 포함함으로써 증가된다. 중합체 및 공중합체는 예를 들어 폴리(D,L-락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA)(SoonKap Hahn 등의 2007/0184015에서 예시됨)이다.
핵산 작제물 및 발현 벡터
본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따른 TMEM16A 펩타이드 활성화제를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, TMEM16A 펩타이드를 인코딩하는 상기 핵산은 숙주 세포에서 본 개시내용에 따른 펩타이드의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 가능하게 하는 조절 서열(예를 들어, 적합한 프로모터(들), 인핸서(들), 터미네이터(들) 등을 추가로 포함하는 핵산 작제물에 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산 작제물"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성된 인공 핵산 분자를 지칭한다. 핵산 작제물은 핵산 서열의 세그먼트를 포함하도록 변형된 단일 가닥 또는 이중 가닥의 핵산 분자로, 자연계에 존재하지 않는 방식으로 조합되고 병치된다. 핵산 작제물은 일반적으로 "벡터", 즉 외인성으로 생성된 DNA를 숙주 세포로 전달하는 데 사용되는 핵산 분자이다.
전술한 바와 같은 핵산 작제물은 발현 벡터에 포함될 수 있다. 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체 복제와 독립적으로 복제되는 염색체외 개체, 예를 들어, 플라스미드, 염색체외 요소, 미니 염색체 또는 인공 염색체로 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제를 보장하는 모든 수단을 포함할 수 있다. 대안으로, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때 게놈에 혼입되고 혼입된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다.
적절한 벡터의 예는 재조합 혼입 또는 비-혼입 바이러스 벡터 및 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로부터 유도된 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 벡터는 재조합 혼입 또는 비-혼입 바이러스 벡터이다. 재조합 바이러스 벡터의 예는 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
바람직하지만 비제한적인 양태에서, 본 발명의 유전자 작제물은 i) 적어도 하나의 본 발명의 핵산; ii) 프로모터 및 선택적으로 적합한 터미네이터와 같은 하나 이상의 조절 요소; 및 임의로 또한 iii) 3'- 또는 5'-UTR 서열, 리더 서열, 선별 마커, 발현 마커/리포터 유전자, 및/또는 형질전환 또는 혼입(의 효율)을 촉진하거나 증가시킬 수 있는 요소와 같은 유전자 작제물의 하나 이상의 추가 요소를 포함한다.
제어 서열은 상피 세포에 의해 인식되는 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 숙주 세포에 도입될 때 TMEM16A 펩타이드 활성화제의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 포함한다. 프로모터는 돌연변이, 절단 및 혼성 프로모터를 포함하는 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터, 바람직하게는 구성적 프로모터, 보다 바람직하게는 강력한 구성적 프로모터일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 펩타이드를 발현하고(또는 적합한 환경 하에서 발현할 수 있는); 및/또는 본 발명의 핵산 작제물을 함유하는 숙주 또는 숙주 세포에 관한 것이다. 펩타이드를 생산하는 방법은 임의로 상기 펩타이드를 정제하는 단계, 상기 펩타이드를 화학적으로 변형시키는 단계, 및/또는 상기 펩타이드를 약학적 조성물로 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.
약학적 조성물
추가의 양태에서, 본 개시내용은 또한 TMEM16A 펩타이드 활성화제, 상기 기재된 바와 같은 상기 펩타이드를 인코딩하는 핵산 또는 발현 벡터, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
약학적으로 허용 가능한 부형제는 투여 경로 및 유효성분, 예컨대, 펩타이드, 핵산 또는 벡터 발현의 특성에 따라 선택된다. 본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 동물 및/또는 인간에 사용하기 위해 규제 기관 또는 유럽 약전과 같은 공인된 약전에 의해 승인된 것을 의미한다. 용어 "부형제"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 담체 또는 비히클을 지칭한다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 약리학적 유효 물질의 투여를 용이하게 하는 비교적 불활성인 물질이며 액체 용액 또는 현탁액, 에멀젼 또는 사용 전에 액체에 용해 또는 현탁하기에 적합한 고체 형태로 공급될 수 있다. 예를 들어 부형제는 형태나 일관성을 부여하거나 희석제로 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 다양한 삼투압용 염, 캡슐화제, pH 완충 물질 및 완충제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 부형제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 눈으로의 직접 전달에 적합한 임의의 약학적 제제를 포함한다.
약학적 조성물은 경구, 비경구 및 국소를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 경로에 의한 투여를 위해 제형화된다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 통상적으로 사용되는 것들이다. 약학적 조성물은 예를 들어, 그것이 투여되는 개인에게 이점을 나타내기에 충분한 치료적 유효량의 펩타이드/폴리뉴클레오티드/벡터를 포함한다. 약학적 유효 용량은 사용되는 조성물, 투여 경로, 치료되는 포유동물(인간 또는 동물)의 유형, 고려 중인 특정 포유동물의 물리적 특성, 병용 약물 및 기타 요인에 따라 달라지며, 이는 의학 분야의 숙련자들이 인식할 것이다.
가능한 약학적 조성물은 경구, 직장, 국소, 안내 또는 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다. 이들 제형의 경우, 통상의 부형제가 당업자에게 잘 알려진 기술에 따라 사용될 수 있다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 비경구 또는 안구 투여에 적합하다. 보다 바람직하게는, 약학적 조성물은 국소 안구 점적 및 안내 투여를 포함하는 안구 투여 또는 비강 스프레이를 포함하는 경점막 투여에 적합하다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 직후 또는 투여 후 임의의 예정된 시간 또는 기간에 활성 약물을 실질적으로 방출하도록 제형화될 수 있다.
치료적 용도
본 개시내용은 또한 의약으로 사용하기 위한, 바람직하게는 클로라이드 채널 기능장애로 인한 질병의 치료에 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 TMEM16A 펩타이드 활성화제, 핵산, 발현 벡터에 관한 것이다.
클로라이드 채널 기능장애로 인한 질병에는 비제한적인 예로서 쇼그렌 증후군과 같은 침샘 기능장애 또는 방사선 손상으로 인한 침샘 기능장애; 낭포성 섬유증; 위장 운동성저하 장애; 조기 재분극 증후군과 같은 심장 부정맥; 구강건조증과 안구건조증을 포함한다. 클로라이드 채널 기능장애로 인한 질병은 클로라이드 채널, 특히 TMEM16A 채널 활성화제를 활성화하여 치료할 수 있다.
침샘 기능장애로 인한 구강건조증은 쇼그렌 증후군을 비롯한 여러 질병과 두경부암에 대한 방사선 요법 및 약물 치료에 의해 발생한다. 구강건조증은 종종 연하곤란(dysphagia), 감소된 미각 및 기회 감염과 관련이 있다. TMEM16A 채널은 침샘에서 체액 분비에 필수적인 역할을 한다(Catalan MA, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(7):2263-8).
안구건조증(keratoconjunctivis sicca)은 노인에서 매우 흔한 관련 장애로, 누선 또는 마이봄샘 기능 장애로 인해 발생한다. TMEM16A는 침샘 선포 상피 세포에 의한 침 분비를 조절하는 주요 이온 채널이다(Romanenko et al., 2010. J. Biol. Chem. 285, 12990-13001).
위장 운동성저하 장애는 감소된 수축력 또는 느린 전달과 함께 오는 선천적 또는 후천적 변화를 지칭한다. 위장 운동성저하 장애는 위폐색 또는 장폐색과 같은 중증형, 기능성 소화불량, 위마비, 만성변비, 과민성대장증후군(IBS)과 같은 중증을 포함한다.
낭포성 섬유증은 다양한 조직의 분비 상피에 영향을 미치는 유전 질환이다. 기도, 간, 췌장, 소장, 생식 기관 및 기타 조직의 상피 세포가 클로라이드 이온을 수송하고 나트륨과 물을 동반하는 능력이 낭포성 섬유증 환자에서 심각하게 감소되어 호흡기, 췌장 및 장 질환을 유발한다. 낭포성 섬유증에서 결함이 있는 클로라이드 수송은 일반적으로 낭포성 섬유증 막관통 컨덕턴스 조절자(CFTR; Riordan et al., Science 245:1066-73, 1989 참조)로 알려진 클로라이드 채널의 돌연변이로 인해 발생한다.
심장 부정맥은 심장 박동이 불규칙한 상태의 그룹이다. 본 개시내용에 따르면, 심장 부정맥은 바람직하게는 조기 재분극 증후군이다. 조기 재분극 증후군 환자는 심외막과 심내막 사이에 전류 불균형이 있어 탈분극과 재분극이 분산된다.
본 개시내용은 또한 치료적 유효량의 상기 기재된 바와 같은 TMEM16A 펩타이드 활성화제, 핵산, 발현 벡터 또는 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 본 개시내용에 따른 클로라이드 채널 기능장애로 인한 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
"치료적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 유효량을 지칭한다. 본 개시내용의 제품 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량은 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 개인이 원하는 반응을 이끌어내기 위한 제품 또는 약학적 조성물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 치료적 유효량은 또한 전형적으로 제품 또는 약학적 조성물의 임의의 독성 또는 해로운 효과가 치료적으로 유익한 효과보다 더 중요한 양이다.
본 명세서에 사용된 용어 "환자" 또는 "개체"는 포유동물을 의미한다. 바람직하게는, 본 개시내용에 따른 환자 또는 개체는 인간이다.
본 개시내용과 관련하여, 본 명세서에 사용된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 용어가 적용되는 클로라이드 채널 기능장애 또는 상태로 인한 질병의 진행을 역전, 완화 또는 억제하는 것, 또는 해당 용어가 적용되는 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상의 진행을 역전, 완화 또는 억제하는 것을 의미한다.
본 개시내용의 제품은 일반적으로 환자에게 치료 효과를 유도하기에 효과적인 투여량 및 기간 동안 공지된 절차에 따라 투여된다.
투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 전신 투여는 바람직하게는 비경구 예컨대 피하(SC), 근육내(IM), 정맥내(IV) 또는 동맥내와 같은 혈관내; 복막내(IP); 피내(ID); 간질 또는 기타이다. 투여는 예를 들어 주사 또는 관류에 의한 것일 수 있다. 일부 바람직한 구체예에서, 투여는 비경구, 바람직하게는 정맥내(IV) 또는 동맥내와 같은 혈관내이다. 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당업계의 기술 범위 내에 있는 종래의 기술을 채용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 투여는 비경구 또는 안구 투여이다. 보다 바람직하게는 안구건조증의 치료에는 점안제와 안구내 투여를 포함하는 안구 투여가 사용되고, 낭포성 섬유증의 치료에는 비강 스프레이를 포함하는 경점막 투여가 사용될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 클로라이드 채널, 특히 TMEM16A 채널을 활성화하는 데 사용하기 위해, 예를 들어 TMEM16A 채널을 활성화하기 위한 체외 진단 시약, 약물 스크리닝 시약 또는 연구 도구를 위한 상기 기재된 바와 같은 TMEM16A 펩타이드 활성화제, 핵산, 벡터에 관한 것이다.
다음 실시예는 설명을 위해 제공되며 제한하지 않는다.
[실시예]
1. 실험 모델 및 주제 세부 정보
분자 생물학, 유전자 발현 및 세포 배양
mTMEM16A(Dr Lily Yeh Jan 제공) 및 hKCNE1 cDNA는 pIRES2eGFP, pXOOM, pcDNA3.1, pCDNA3.1-GFP 및 pCMV-HA 벡터에서 서브클로닝되었다. KCNE1의 절단 및 돌연변이는 PCR에 의해 생성되었다. SiMPull 실험을 위한 HA-태그는 서열의 N-말단에 융합되었고, 반면 GFP-태그는 C-말단 부분에 융합되었다. HEK293T 및 PCT 세포를 Lipofectamine 2000 또는 인산칼슘 방법을 사용하여 각각 총량 1 및 3.5 ㎍의 DNA로 일시적으로 동시형질감염시키고 직경 18 mm의 커버슬립에 씨딩하였다. HEK 세포는 12웰 플레이트의 폴리-L-리신이 코팅된 유리 커버슬립에서 5% FBS가 포함된 DMEM에서 유지되었다. 야생형 및 녹아웃 생쥐의 PCT 세포를 이전에 설명한 대로 미세절단하고 콜라겐이 코팅된 유리 커버슬립의 F12(Gibco)에서 유지하였다.
전기생리학
HEK293T 및 PCT 세포 전기생리학은 형질감염 후 24 - 48시간 후에 수행되었다. 전체 세포 패치-클램프 실험을 위해 세포는 150 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2 및 10 HEPES, pH 7.4 및 0.05% BSA (mM)를 함유하는 도금액에서 기록되었다. 유리 피펫(저항 2-5 MΩ)을 5 NaCl, 135 CsCl, 2 MgCl2, 5 EGTA, 10 HEPES, pH 7.3 (mM)으로 채웠다. 세포는 펩타이드와 함께 30분의 인큐베이션 후 또는 펩타이드와 함께 관류 동안 기록되었다. 총 칼슘 농도는 Maxchelator(maxchelator.standford.edu)를 사용하여 온도 20℃에서 계산하였다. HEK293T 및 PCT 세포는 Axopatch 200A(Molecular Devices) 증폭기를 사용하여 전압 클램프 모드에서 실온에서 기록되었다. 신호는 10 kHz에서 필터링되고 20 kHz에서 디지털화되었다. 전체 세포 전류는 전압 램프(-100 내지 +100 mV, 1s) 및 I-V 자극 펄스(-100 내지 +100 mV, 20 mV 증가분, 각 펄스당 1s)에 의해 유도되며, 세포는 -80 mV로 유지한다. 전류 밀도는 +100 mV에서 측정되었다. pClamp 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 세포 기록, 데이터 수집 및 전기생리학 실험 분석을 수행하였다.
난모세포 전류 측정은 3 M KCl로 채워진 2개의 표준 미세전극(1-2.5 MΩ 저항)을 사용하여 이루어졌으며 0.05% BSA가 포함된 표준 ND96 용액(mM: 96 NaCl, 2 KCl, 1.8 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, pH 7.4)에서 Dagan TEV 200 증폭기를 사용하여 전압 클램프 하에서 유지되었다. 위에서 설명한 것과 동일한 전압 램프 프로토콜을 사용하여 전류를 유도하였다.
펩타이드 디자인
펩타이드는 Genscript에 의해 목적 서열에 따라 주문되었다. 양은 ≥80%(≥85%까지 업그레이드)의 순도로 4 내지 20 mg 범위였으며 단 하나의 바이알에 분주되었다. 주문 전에 초순수, DPBS(pH 7.1) 및 DMSO의 추가 용해도 시험을 요청하였다. 마지막으로 펩타이드를 초순수에 희석하였다.
단분자 풀다운 분석
SiMPull 분석을 위해, 본 발명자들은 이전에 Jain et al., 2011. Nature 473, 484-488에 의해 기술된 프로토콜을 따랐다. 간략하게, HA-태그된 미끼 단백질 및 GFP-융합된 먹이 단백질(동종이합체 현상을 크게 감소시키는데 널리 사용되는 eGFP A206K 돌연변이체를 적용)로 동시형질감염된 HEK293T 세포를 다음을 함유하는 완충액에서 용해시켰다: (mM) 150 NaCl, 10 Tris pH 7.5, 1 EDTA, 프로테아제 억제제 칵테일(Thermo Scientific) 및 1.5% IGEPAL(Sigma). 용해물을 수집하고 PEG(99%) 및 비오틴-PEG(1%)로 비활성화된 커버슬립에서 풀다운하고 뉴트라비딘(1.4 mg/mL, Pierce) 및 비오틴화 항-HA 항체(15 nM, abcam, #ab26228)로 처리하였다. 비특이적 단백질 결합을 피하기 위해 T50 완충액(mM: 50 NaCl, 10 Tris, 20 EDTA; 0.1 mg/mL BSA, pH 7.5)로 여러 번 세척하였다. 마지막으로, 단분자 복합체는 100x 대물렌즈(Olympus)가 있는 전체 내부 반사 형광 현미경에서 488nm 아르곤 레이저를 사용하여 이미지화되었다. 250 프레임의 13 x 13 ㎛2 동영상을 10-30 Hz의 프레임 속도로 수집하고 Fiji 소프트웨어(NIH)를 사용하여 분석하였다. 각 조건에 대해 여러 번의 독립적인 실험을 수행하였으며 조명이 끝날 때 완전히 퇴색된 지점만 고려하였다. 다양한 조건을 정량적으로 비교하기 위해 대표 데이터 세트가 제공된다(조건당 최소 15개의 영화, 영화당 최소한 분석된 트레이스).
동물
Sprague-Dawley 쥐(수컷, 약 200 g)를 Charles River에서 구입하여 실험을 진행하기 일주일 전에 적응시켰다. 우리당 2~3마리의 쥐를 12시간 간격의 명암 주기와 음식과 물에 대한 자유로운 접근의 제어된 환경에 수용하였다. 동물 실험은 바르셀로나 대학(CEEA)의 동물 관리 및 사용 위원회와 스페인 카탈로니아의 Generalitat de Catalunya(319/19; 10935)의 Departament de Territori i Sostenibilitat의 승인을 받았고, 국제 통증 연구 협회의 윤리적 지침을 따랐다.
펩타이드
N13ter(Nter 13 펩타이드 또는 N13이라고도 함)(LARRSPRSGDGKL) 및 스크램블(LLAKRGRDSGPSR) 펩타이드는 GenScript Biotech(네덜란드 라이덴)에서 구입했으며 CNRS에서 제공받았다. 두 펩타이드 모두 인산염 완충 식염수(PBS)에 10 mM로 용해되었고 국소 안구 적용(1안 당 5 ㎕)에 사용되었다.
눈물 분비 측정
눈물 분비(유루율)는 국소 마취 없이 아래 눈꺼풀에 부착된 페놀 레드 실(Zone-Quick, Menicon, Nagoya, Japan)을 사용하여 30초 동안 측정하였다(Trost, 2007; Acosta 2013). 유루율은 실의 붉은 부분의 길이를 측정하여 ±0.5 mm의 정확도로 측정하였다.
비히클, 양성 대조군, N13ter 또는 스크램블 펩타이드의 급성 효과
동물을 사육한 후, 펩타이드를 국소 적용하기 전에 양쪽 눈에서 기초 유루율을 측정하였다. 그런 다음 동물을 여러 그룹으로 나누고 비히클(PBS), 아밀로라이드(1 mM), 펩타이드 N13 또는 펩타이드 스크램블을 포함하는 용액을 안구 표면(5 ㎕)에 국소 적용하고 1, 3, 6, 12시 및 24시에서 유루율을 측정하였다. 유루율 측정은 동물이 받은 치료에 대해 블라인드로 수행되었다.
안구건조증 동물 모델
안구건조증 모델을 확립하기 위해 이전에 기술된 것과 유사한 절차가 사용되었다(Callejo 2015, Pain; 156(3):483-495, Kovacs, 2016, Pain.;157(2):399-417). 쥐를 케타민/자일라신(80:10 mg/kg)으로 복강내 마취시켰다. 주누선(외안와)의 외과적 양측 제거는 외안각 후방 측두측 피부 절개를 수행한 후 수행되었다. 외안와선의 섬유낭을 노출시켜 해부하고 누선을 조심스럽게 절제하였다. 수술이 끝나면 수술 부위에 항생제/항염증 용액(3 mg/mL 겐타마이신; 0.5 mg/mL 덱사메타손; Colircusi Gentadexa; NTC Ophthalmics, Spain)을 한 방울 떨어뜨렸다. 피부 절개는 5-0 실크 편조 봉합사를 사용하여 봉합하였다. 동물을 개별적으로 수용하고 결막 및 각막 외관을 정기적으로 검사하였다. 눈물 분비는 수술 전(기초) 및 수술 후 1주, 2주, 3주, 4주에 주 1회 국소 마취 없이 아래 눈꺼풀에 부착된 페놀 레드 실을 사용하여 30초 동안 측정하였다(Trost, 2007; Acosta 2013). 유루율은 실의 붉은 부분의 길이를 측정하여 ±0.5 mm의 정확도로 측정하였다. 4주차에 유루율 측정 후, 동물을 두 그룹으로 나누고 펩타이드 중 하나(N13ter 또는 PBS)를 포함하는 용액을 안구 표면(5 ㎕)에 국소 도포하고 유루율을 1, 3, 6, 12 및 24시간에 측정하였다. 유루율 측정은 받은 치료에 대해 블라인드로 수행되었다. 4주차에 감소된 눈물량(건조함)을 나타내지 않았거나 가능한 안구 질환을 나타내는 일종의 염증 또는 충혈을 나타내지 않은 눈은 연구에서 제외하였다.
데이터 분석
데이터는 평균±평균의 표준 편차(SEM)로 표시된다. 서로 다른 데이터 세트 간의 통계적 차이는 Prism 9(GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 반복 측정된 일원 분산 분석 + Bonferroni 사후 테스트(실험 그룹의 각 데이터 포인트 대 기초값) 또는 반복 측정된 이원 ANOVA + Bonferroni 사후 테스트(N13ter 그룹 대 스크램블 또는 비히클 그룹의 각 데이터 포인트, 또는 N13ter 또는 아밀로라이드 그룹 대 비히클 그룹의 각 데이터 포인트)를 수행하여 평가되었다. 유의 수준은 모든 통계 분석에서 p<0.05로 설정되었다.
2. 결과
KCNE1은 TMEM16A를 칼슘 의존성에서 전압 의존성 Cl - 채널로 이동시킨다.
TMEM16A를 조절하는 KCNE1의 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 TMEM16A도 KCNE1도 내인적으로 발현하지 않는 HEK293T 세포 모델을 사용하였다. TMEM16A 또는 KCNE1 단독으로 HEK293T 세포를 형질감염시키면 유의한 전류가 생성되지 않는 반면, 두 단백질의 동시발현은 +100 mV에서 밀도가 18.1 ± 2.8 pA/pF인 전압 의존성 전류를 유도하였다(도 1A 및 1B). 역전 전위는 -4.8 ± 1.3 mV였으며, 이는 사용된 실험 조건에서 예상되는 역전 Cl- 전위와 유사하다. 이 클로라이드 전류는 NFA, T16Ainh-A01(Davis, A.J. et al. 2013. Br J Pharmacol. 168, 773-784) 및 또한 가장 특이적인 TMEM16A 억제제인 Ani9(Seo, Y. et al. 2016, PLoS One 11, e0155771)에 의해 억제되었다(도 1C-E). 이것은 KCNE1이 TMEM16A를 칼슘 의존성에서 전압 의존성 클로라이드 채널로 전환시킴을 시사한다.
KCNE1이 내인성 칼슘 채널을 활성화할 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 빠른 칼슘 킬레이트제 BAPTA의 존재 하에서 유사한 실험을 수행하였다. 도 1F에 도시된 바와 같이, BAPTA는 두 단백질의 동시발현에 의해 유발된 전압 의존성 전류의 형성을 폐지하지 않았다(3.70 ± 0.41 pA/pF 대 21.98 ± 5.32 pA/pF, BAPTA의 부재 또는 존재, P < 0.001). TMEM16A 활성화로 이어지는 KCNE1에 의한 내인성 칼슘 채널의 잠재적 조절을 완전히 배제하기 위해, 본 발명자들은 TMEM16A와 유사한 칼슘 민감도를 갖는 Ca2+-활성화 SK4 채널과 KCNE1을 동시발현시켰다(Cao, Y.J. 및 Houamed, K.M. 1999. FEBS Lett 446, 137-141). 도 2에서 볼 수 있듯이 KCNE1 과발현은 칼슘이 없는 상태에서 SK4 전류의 증가를 유도하지 않았다. 전체적으로, 이러한 결과는 TMEM16A의 KCNE1 유도성 활성화에서 세포내 Ca2+의 영향을 배제한다.
KCNE1에 의한 TMEM16A 활성화에는 물리적 상호작용이 포함된다.
보조 서브유닛으로 간주되려면 단백질이 α-서브유닛과 직접적이고 안정적으로 상호작용해야 한다. TMEM16A와 KCNE1 간의 물리적 연관성을 테스트하기 위해 본 발명자들은 최근에 개발된 단분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하였다(Jain, A. et al. 2011. Nature. 473, 484-488; Levitz, J. et al. 2016. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4194-4199; Royal, P. et al. 2019. Neuron .101, 232-245.e236). 이 기술은 항체 고정화 단백질 복합체(도 3A 및 3E)의 직접적인 시각화를 가능하게 하여 형광단 퇴색을 계산하여 단일 단백질 복합체 내의 조성 및 화학량론을 결정할 수 있다(Jain, A. et al. 2011. Nature. 473, 484-488; Levitz, J. et al. 2016. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4194-4199; Royal, P. et al. 2019. Neuron .101, 232-245.e236). 2개의 추정 파트너 KCNE1 및 TMEM16A와 동시형질감염 후, 이들 중 하나는 HA 친화성 태그로 융합되고 다른 하나는 GFP 표지로 융합된 후, 풀다운 후, 본 발명자들은 두 조건, TMEM16A-GFP + HA-KCNE1(도 3B) 및 KCNE1-GFP + HA-TMEM16A(도 3F) 모두에 대해 많은 형광 스팟을 관찰하였다. 이것은 KCNE1과 TMEM16A 간의 물리적 상호작용을 보여준다. 중요한 것은 HA-KCNE1 또는 HA-TMEM16A가 동시발현되지 않은 경우 GFP에 융합된 단백질이 분리되지 않았으며(도 3J 및 3L) SiMPull 분석에 사용된 HA 항체의 특이성을 확인하였다. 고정된 HA-KCNE1-TMEM16A-GFP 복합체에 대한 퇴색 단계를 분석함으로써, 본 발명자들은 복합체 내의 TMEM16A-GFP 서브유닛의 수를 결정할 수 있었다. 그들은 대부분의 형광 강도 궤적이 2단계 퇴색(~70%)을 보였고 나머지 스팟은 1단계(~20%) 또는 때때로 3단계(~10%)로 퇴색되었음을 발견하였다(도 3C 및 2D). 이 분포는 ~75%의 추정된 GFP 성숙 가능성을 기반으로 엄격한 이량체에 대해 예측된 이항 분포와 잘 일치한다(Ulbrich, M.H. 및 Isacoff, E.Y. Nat Methods, 4, 319-2 321; Zacharias, D.A. et al. 2002. Science, 296, 913-916). HA-TMEM16A-KCNE1-GFP를 사용한 SiMPull 실험의 분석은 대부분의 복합체가 2단계 퇴색(~65%)을 나타냈고 나머지 일부 스팟은 1단계(~25%) 및 3단계(~10%)에서 퇴색되었음을 보여주었다(도 3G 및 3h). 이 분포는 단백질 복합체 내에 2개의 KCNE1-GFP 서브유닛의 존재에 해당한다. 따라서 2개의 KCNE1 서브유닛은 2α:2β 화학양론에 따라 단일 TMEM16A 채널로 조립된다(Dang, S. et al. 2017. Nature. 552, 426-429; Takumi, T. et al. 1988. Science, 242, 1042-1045).
복합체 KCNE1-TMEM16A는 근위곡 요세관 세포에서 전압 의존성 Cl
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전류를 생성한다.
진정한 보조 서브유닛으로 간주되려면 단백질이 네이티브 환경에서 알파 서브유닛과 상호작용해야 한다. KCNE1이 천연 조직에서 TMEM16A의 보조 서브유닛임을 확인하고 이종 과발현으로 인한 가능한 부작용을 제거하기 위해, 본 발명자들은 야생형 및 kcne1 KO 생쥐로부터 얻은 신장 근위곡 요세관(PCT) 세포를 이용하였다(Barriere, H. et al. 2003. J Membr Biol. 193, 153-170). PCT 세포는 자연적으로 TMEM16A와 KCNE1을 모두 동시발현하고(Faria, D. et al. 2014. Kidney Int. 85, 1369-1381; Vallon, V et al. 2001. J Am Soc Nephrol, 12, 2003-2011) TMEM16A 채널 운반 전류를 기록하기 위한 임의의 유전자 조작을 필요로 하지 않기 때문에 관련 모델로 간주된다. 또한 야생형에 비해 kcne1 KO 생쥐의 PCT 세포에서는 K+ 전류의 변형이 발견되지 않았지만 DIDS(4,4'-Diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid)에 민감한 Cl- 컨덕턴스가 손상되었다(Barri_re al., 2003). 본 발명자들은 kcne1 null PCT 세포에서 예상되는 Cl- 역전 전위와 유사한 전류의 손실을 확인하였다(각각 PCT 야생형 및 KO 생쥐의 경우 18.07 ± 1.21 pA/pF 대 5.37 ± 0.56 pA/pF, P < 0.001)(도 4A). 이 전류는 NFA(4.51 ± 0.28 pA/pF), T16A(inh)-A01(5.52 ± 0.72 pA/pF) 및 Ani9(2.88 ± 0.38 pA/pF)에 의해 억제되었다(도 4B-D). 또한, 야생형 PCT 세포에서 이전에 검증된 siRNA 형질감염(Sala-Rabanal, M. et al. 2017. J Biol Chem, 292, 9164-9174)에 의한 TMEM16A의 녹다운은 Cl- 전류 진폭(4.23 ± 0.48 pA/pF)을 상당히 감소시켰다(도 4E). 이것은 여기에서 연구된 Cl- 전류를 담당하는 채널 복합체에 TMEM16A 서브유닛이 관련되어 있음을 보여준다. kcne1 -/- 세포에서 KCNE1 형질감염에 의한 구조 실험은 전압 의존성 Cl- 전류(21.59 ± 1.38 pA/pF)를 완전히 회복함으로써(도 4F), 이들 세포에서 클로라이드 전류의 부재는 kcne1의 KO 때문일 뿐이며 배양 과정에서 발생할 수 있는 변형 때문이 아님을 보여준다.
KCNE1의 N-말단 예비-막관통 도메인은 TMEM16A 조절의 핵심이다
KCNE1은 세포질 내에 세포외 N-말단 부분 및 C-말단 도메인을 갖는 단일 막관통 단백질이다(Takumi, T. et al. 1988. Science, 242, 1042-1045). TMEM16A와의 상호작용 부위를 결정하기 위해, 본 발명자들은 일련의 절단된 KCNE1 형태(도 5A)를 생성하고 TMEM16A를 조절하는 능력에 대해 이들을 시험하였다. 전체 KCNE1 C-말단 도메인의 절단은 KCNE1 매개된 TMEM16A 조절(25.04 ± 4.9 pA/pF, P > 0.15)을 폐지하지 않았다(도 5B). 대조적으로, 전체 N-말단 도메인의 삭제는 TMEM16A를 조절하는 KCNE1의 능력을 억제하였다(6.56 ± 0.89 pA/pF, P < 0.001)(도 5B). 부분 N-말단 절단 ΔNt16(25.43 ± 4.46 pA/pF) 또는 ΔNt30(25.23 ± 6.62 pA/pF)에 대해서는 효과가 관찰되지 않았다(도 5C), 막관통 도메인 앞의 13개 잔기(L30에서 L42까지)의 서열이 TMEM16A 활성화에 필수적이라는 것을 입증한다. 이 결과는 13개의 아미노산 중 8개(KCNE1Δ11-38)를 포함하는 KCNE1의 부분적 결실이 제노퍼스(Xenopus) 난모세포에서 KCNE1 유도성 클로라이드 전류를 폐지했다는 이전 관찰과 일치한다(Attali, B et al. 1993. Nature, 365, 850-852). 이 작은 도메인이 TMEM16A 전류에서 전체 KCNE1의 특성을 반복하기에 충분한지 확인하기 위해, 본 발명자들은 L30-L42 서열을 포함하는 상응하는 합성 펩타이드(Nter13)를 사용하였다. TMEM16A를 발현하는 HEK293T 세포에서 100 μM Nter13을 적용하면 Ani9 민감 전류(15.48 ± 3.25 pA/pF)가 유도되었다(도 5D; 도 6A 및 6B). 다시, 역전 전위는 KCNE1이 동시발현될 때 관찰된 전류와 유사했지만, 스크램블 펩타이드의 적용에 대해서는 효과가 관찰되지 않았다(도 5D).
TMEM16A 조절 서열 내부의 KCNE1 다형성은 Cl
-
전류를 억제한다.
KCNE1의 13개 잔기의 세포외 도메인 내에서, 이전 연구는 KCNQ1의 KCNE1 매개된 조절에 영향을 미치지 않거나 약하게 영향을 미치는(도 7A 및 7B) (Westenskow et al., 2004; Yao et al., 2018) 일반적인 S38G 및 R32H 다형성이 심장 부정맥과 관련될 수 있음을 보여주었다(Crump, S.M., and Abbott, G.W. 2014. Front Genet 5, 3). 따라서 본 발명자들은 TMEM16A를 조절하기 위한 이들 2개의 KCNE1 변이체의 가능성을 시험하였다. 조절 도메인에 없는 관련된 질병 돌연변이 T7I를 대조군으로 사용하였다. 돌연변이 T7I는 TMEM16A(24.69 ± 1.57 pA/pF, P > 0.4)의 KCNE1 의존성 조절을 변경하지 않은 반면(도 7C 및 7D), 두 돌연변이 R32H 및 S38G는 TMEM16A 전류 특성을 조절하는 KCNE1의 능력을 폐지하였으므로(R32H 및 S38G에 대해 각각 5.69 ± 1.18 pA/pF 및 6.96 ± 0.78 pA/pF)(도 7C 및 7D), 이는 인간 질병에서 KCNE1-KCNQ1의 잠재적 영향을 시사한다.
TMEM16A를 발현하는 HEK293T 세포에서, 100 μM 인간 Nter13 펩타이드의 적용이 TMEM16A 전류 특성을 유도하지만, S38G 다형성을 나타내는 펩타이드 N13은 TMEM16A 전류 특성에 영향을 미치지 않는다(도 8). 인간 Nter13 펩타이드는 TMEM16A에서 쥐 N13 펩타이드보다 더 강력하다(도 9). 사실, 100 μM에서 쥐 N13 펩타이드는 TMEM16에 작은 영향만 나타낸다(도 9).
토론
대부분의 이온 채널은 보조(β) 서브유닛과 결합된 기공 형성 α-서브유닛의 복합체로서 조립된다. 이 연구에서, 본 발명자들은 고전적으로 전압-의존성 Kv 채널 수퍼패밀리에 속하는 심장 KCNQ1 기공 형성 서브유닛의 β-서브유닛으로 간주되는 KCNE1이 또한 아녹타민 수퍼패밀리 채널 TMEM16A, 즉 Ca2+-활성화 Cl- 채널(CaCC)의 보조 서브유닛으로서 제공함을 입증한다. 2α:2β 화학량론에 따라 TMEM16A와 안정적으로 상호작용함으로써 KCNE1은 세포내 칼슘 상승이 없는 상태에서 전압 의존성 전류를 유도한다. TMEM16A 상호작용 도메인 내의 KCNE1 다형성은 TMEM16A를 조절하는 능력을 폐지하여 인간 질병에서 이 전압 의존성 클로라이드 전류의 가능한 영향을 시사한다. 이온 채널의 β-서브유닛은 세포에서 전기 신호 분자 플레이어의 다양성에 대한 중요한 소스를 제공한다. 그 자체로는 고유 전류를 유도할 수 없지만 이온 채널의 기공 형성 서브유닛과 결합하고 약리학적 및 생물물리학적 특성을 조절한다. 그들의 생리학적 중요성은 근육 병리, 간질 및 심장 부정맥과 같은 돌연변이와 관련된 많은 질병에 의해 반영된다(Adelman, 1995, Curr Opin Neurobiol. 5, 286-295; Cannon, 2007, Neurotherapeutics. 4, 174-183; Crump and Abbott, 2014, Front Genet. 5, 3; Vergult et al., 2015, Eur J Hum Genet. 23, 628-632). KCNE1은 Kv β-서브유닛의 유명한 예로, KCNQ1 및 hERG와 연관되어 심장 활동 전위의 IKs 및 IKr 구성 요소를 모두 제어하고 60개 이상의 유전자 변이가 인간 질병, 특히 심장 부정맥과 관련이 있는 것으로 보고되었다(Barhanin et al., 1996, Nature. 384, 78-80; Crump and Abbott, 2014, Front Genet. 5, 3; Sanguinetti et al., 1996, Nature. 384, 80-83; Sanguinetti et al., 1995 , Cell.81, 299-307). Nav 및 Kv 채널에 대해 이온 채널의 동일한 수퍼패밀리로부터 기공 형성 α-서브유닛의 β-서브유닛에 의한 혼변조(cross modulation)가 나타났다(Marionneau et al., 2012. J Neurosci. 32, 5716-5727; Nguyen et al. , 2012. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18577-18582). Navβ1은 동일한 조상(Moran et al., 2015, J Exp Biol. 218, 515-525)에서 파생되고 전압 게이트 이온 채널의 수퍼패밀리에 속하는 Kv 및 Nav 채널의 제어를 조정하는 것으로 밝혀졌다. 결과는 계통발생학적으로 관련되지 않은 두 개의 서로 다른 슈퍼패밀리인 전압 개폐 채널과 아녹타민의 혼변조를 보여준다. 본 발명자들은 TMEM16A와 상호작용함으로써 KCNE1이 아녹타민 슈퍼패밀리의 이 구성원의 게이팅을 수정하여 이를 칼슘 의존성 채널에서 전압 의존성 채널로 전환한다는 것을 발견하였다. 매우 민감한 리포터로서 다양한 Ca2+ 킬레이트제와 Ca2+-활성화 SK 채널을 사용한 실험은 이 CaCC의 활성화가 KCNE1이 없을 때 채널의 천연 활성인자인 세포질 Ca2+의 상승과는 무관하다는 것을 입증하였다(Caputo et al. , 2008. Science 322, 590-594; Schroeder et al., 2008. Cell 134, 1019-1029; Yang et al., 2008. Nature 455, 1210-1215). 분명히, 전압 의존성 클로라이드 채널 수퍼패밀리는 ClC 패밀리에 국한되지 않고 KCNE1과 결합될 때 아녹타민 패밀리로 확장된다. 이것은 또한 Ca2+와 전압 의존성 채널 사이의 차이가 그렇게 엄격하지 않으며 오히려 생물물리학적 특성의 연속체를 고려해야 함을 보여준다.
KCNQ1-KCNE1 화학양론은 논쟁의 여지가 있는 반면(Morin and Kobertz, 2008. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1478-1482; Murray et al., 2016. Elife. 5; Nakajo et al., 2010. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18862-18867; Plant et al., 2014. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1438-1446), 본 발명자들은 SiMPull 분석(Jain et al., 2011. Nature. 473, 484-488; Levitz et al., 2016. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4194-4199; Royal et al., 2019. Neuron. 101, 232-245.e236)을 사용하여 TMEM16A-KCNE1 복합체가 2α:2β 서브유닛으로 구성되어 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 이 복합체가 이종 발현시 HEK 세포에서 발생함을 보여주었지만, 또한 이것이 TMEM16A 억제제에 민감한 Cl- 컨덕턴스를 매개하는 천연 신장 세포에 존재함을 보여주었다. 이 Cl- 컨덕턴스는 KCNE1 녹아웃 세포 또는 KCNE1이 녹다운된 세포에서 기록될 수 없으며, 형질감염시 KCNE1 재발현에 의해 이들 세포에서 구조된다. 따라서 TMEM16A-KCNE1 결합은 재조합 과발현 시에만 발견되는 것이 아니라 휴지 막 전위의 유지에 참여하는 천연 세포에서도 관찰될 수 있다.
절단 형태의 KCNE1과 β-서브유닛에 기초한 합성 펩타이드를 사용하는 전기생리학적 분석은 TMEM16A 조절에서 KCNE1의 N-말단의 중요한 역할을 결정할 수 있게 하였다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 KCNE1의 막관통 도메인에 더 가까운 세그먼트가 필요하고 TMEM16A 전류에 대한 전체 KCNE1의 작용을 요약하는데 충분하다는 것을 관찰하였다. 이 세그먼트의 서열에 기초하여 생성된 합성 펩타이드는 최초로 설계된 TMEM16A 작용제이며 임상 적용에 유용할 수 있다. 특히, TMEM16A와 같은 근단의 클로라이드 채널의 활성화는 수분 분비를 유발하여 TMEM16A 표적 활성화제가 낭포성 섬유증 또는 안구건조증 치료를 위한 잠재적인 약물 후보가 되도록 한다. 이 13개 아미노산 세그먼트는 심장 부정맥과 관련된 다형성(R32H 및 S38G)에 영향을 받는 적어도 2개의 잔기를 보유한다(Crump and Abbott, 2014. Front Genet 5, 3).
여러 임상적으로 관련된 KCNE1 변이체가 KCNQ1을 조절하는 능력을 변형하는 것으로 밝혀져 이러한 돌연변이와 심장 부정맥이 있는 다형성 사이의 연결을 제공하는 반면, KCNE1 S38G는 KCNE1에 의한 KCNQ1 조절을 제대로 손상시키지 않는다(Yao et al., 2018. Exp Cell Res 18 363, 315-320). 본 발명자들은 KCNE1 S38G 및 R32H 돌연변이가 TMEM16A를 조절하는 능력을 상실했음을 발견하였으며, 이는 심장 부정맥에서 이 클로라이드 전류의 잠재적인 역할을 시사한다.
이와 관련하여 개의 심장에서 수행된 최근 연구는 심장 재분극 및 탈분극 초기의 공간적 및 시간적 이질성을 줄임으로써 부정맥 위험에 대한 TMEM16A의 보호 역할을 제안한다(Hegyi et al., 2017. Ca. J Mol Cell Cardiol 109, 27-37).
요약하면, 본 발명자들은 잘 알려진 전압 의존성 K+ 채널의 보조 서브유닛인 KCNE1이 아녹타민 음이온 채널 수퍼패밀리의 보조 서브유닛으로 간주되기 위해 필요한 4가지 조건을 충족한다는 것을 발견하였다(Adelman, 1995. Curr Opin Neurobiol. 5, 286-295; Arikkath and Campbell, 2003. Curr Opin Neurobiol. 13, 298-307. J Biol Chem. 271, 27975-27978; Cannon, 2007. Neurotherapeutics. 4, 174-183; Gurnett and Campbell, 1996. Neuron. 7, 403-408; Trimmer, 1998. Curr Opin Neurobiol. 8, 370-374): 첫째, KCNE1은 자체적으로 임의의 이온 채널 활동을 나타내지 않으며, 둘째, KCNE1과 TMEM16A는 고정된 화학양론(2α:2β)과 직접적이고 안정적으로 상호작용하며, 셋째, KCNE1은 TMEM16A 기능을 대폭 변형하여 세포질 칼슘이 증가하지 않은 상태에서도 채널이 작동하도록 하고, 넷째, KCNE1은 천연 조직에서 TMEM16A를 조절한다. 따라서 KCNE1은 계통발생학적으로 관련되지 않은 이온 채널 수퍼패밀리의 두 종류의 선의의 보조 서브유닛의 모든 기준을 충족한다: 전압 개폐 양이온 채널 및 아녹타민 수퍼패밀리. 마지막으로, 임상적으로 관련된 KCNE1 돌연변이의 결과를 분석할 때 TMEM16A-KCNE1 연관성을 고려해야 하며, 이는 S38G를 포함하여 두 개의 알려진 심장 부정맥 관련 KCNE1 변이체가 TMEM16A를 조절하는 능력을 상실했다는 발견에 의해 강조되었다.
안구의 눈물흘림증에 대한 N13 펩타이드 연구.
a) 눈물 분비에 대한 N13ter의 급성 효과
각 실험 그룹(N13ter 및 스크램블)별로 10마리 쥐의 20안에서 펩타이드의 효과를 평가하였다. 어떤 쥐도 외부 안구 구조의 임의의 변화 또는 자극, 감염 또는 염증의 임의의 징후를 나타내지 않았기 때문에 모든 눈이 연구에 포함되었다. 기초 유루율은 N13ter의 경우 7.65±0.49 mm, 스크램블 그룹의 경우 8.10±0.54 mm였다(각각 n=20안, 동물 10마리). N13ter 적용은 스크램블 적용에 비해 유루율이 작지만 유의하게 증가하였다(이원 ANOVA: p=0.0027). Post-hoc Bonferroni의 사후 테스트는 스크램블 그룹과 비교하여 6h(9.65±0.57 mm; *p<0.05) 및 12h(8.85±0.73 mm; *p<0.05) 시점에서 유의한 차이를 보였다. 서로 다른 시점을 기초값과 비교했을 때 6시간에 유의한 차이가 나타났다(#p<0.05; 일원 ANOVA + Bonferroni 사후 테스트).
스크램블 그룹은 기초값 및 N13ter 그룹에 비해 지속적으로 약간 감소하였다. 기초값과 비교할 때 12시간(6.45±0.34 mm; #p<0.05; 일원 ANOVA + Bonferroni 사후 테스트)에서 유의한 차이를 얻었다. 데이터는 N13ter 적용이 스크램블 펩타이드와 비교할 때 유루율에 대한 증강 효과를 가지며 이 효과는 펩타이드 적용 6-12시간 후에 중요해짐을 시사한다. 중요하지는 않지만 적용 후 24시간에 얻은 값은 완전히 기초값을 회복하지 않았으며 이는 치료의 다소 오래 지속되는 효과를 시사한다.
비히클 및 아밀로라이드(양성 대조군)의 효과는 각 실험 그룹(비히클 및 아밀로라이드)에 대해 7마리 쥐의 14안에서 평가하였다. N13ter 펩타이드를 테스트하는 그룹은 이전 연구에서 수행된 것과 동일한 조건에서 6마리 쥐의 12안에서 병행하여 수행되었다. 어떤 쥐도 외부 안구 구조의 임의의 변화 또는 자극, 감염 또는 염증의 임의의 징후를 나타내지 않았기 때문에 모든 눈이 연구에 포함되었다. 기초 유루율은 비히클 그룹에서 5.06±0.38 mm, 아밀로라이드 그룹에서 4.78±0.56 mm, N13ter 그룹에서 4.53±0.43 mm이었다(각각 n=14, 각각 14안 및 12안).
N13ter 적용은 비히클 적용과 비교하여 유루율이 크게 증가하였다(이원 ANOVA: p=0.029). Post-hoc Bonferroni의 사후 테스트는 비히클 그룹과 비교하여 12h(6.66±0.64 mm; *p<0.05) 시점에서 유의한 차이를 보였다. 서로 다른 시점을 기초값과 비교했을 때 12시간에서 유의한 차이를 얻었다(#p<0.05; 일원 분산 분석 + Bonferroni 사후 테스트). 상이한 시점의 비히클 값을 기초값과 비교할 때 유의미한 효과가 발견되지 않아 비히클 적용 효과가 부족함을 나타낸다.
아밀로라이드 적용은 3시간(5.89±0.0.23 mm; n=14)에서 정점에 도달한 유루율 증가의 일시적인 효과를 생성하였다. 테스트한 눈의 14안 중 7안에서 아밀로라이드는 1시간 내지 3시간 사이에 유루율을 증가시켰지만 다른 2안에서는 효과를 유발하지 않았거나 유루율을 약간 감소시켰다. 비히클 그룹과의 비교는 통계적으로 유의한 효과를 나타내지 않았는데, 아마도 데이터의 약간의 분산과 수행된 다중 비교로 인해 검정력이 감소했기 때문일 것이다.
다른 변수(동물 배치, 연구 시기 등)로 인한 차이를 비교하고 최소화하기 위해, 데이터는 각 눈의 기초값으로 정규화되었으며(기초 유루율은 100%로 간주되고 그에 따라 다른 값이 계산됨) 도 10 A 및 B의 각 실험 그룹에 대해 평균화되었다. 증강 효과는 국소 도포 후 2-6시간 사이에 나타난다. 유루율은 기초 수준으로 돌아가기 전에 몇 시간 동안 높은 상태를 유지한다. 대조적으로 비히클 적용(Vehicle Application, PBS)은 어떤 방향에서도 유의한 효과를 나타내지 않았다.
수행된 N13ter 펩타이드의 효과를 테스트하기 위한 실험이 동일한 프로토콜에 따라 수행되었기 때문에 모든 데이터는 도 11과 같이 단일 그룹으로 통합되었다. 비히클 그룹과의 비교는 1, 3, 6, 12 및 24h에서 통계적으로 유의한 효과를 나타내며 6 및 12h에서 최대 증가를 얻었다(도 11).
결론적으로 N13 펩타이드는 쥐의 안구 표면에 국소적으로 적용하였을 때 유루율에 대한 증강 효과를 나타내는 것으로 보인다. 이 증강 효과는 몇 시간 동안 지속되며 일부 효과는 24시간 후에도 여전히 존재한다.
안구건조증 모델에서 눈물 분비에 대한 N13ter 및 비히클의 효과
펩타이드의 효과는 N13ter의 경우 14안(쥐 9마리), 비히클 그룹의 경우 12안(쥐 8마리)에서 평가하였다. 유루율은 N13ter(10mM) 또는 비히클(PBS)의 국소 적용 전 5주에 측정되었다. 수술 5주 후 유루율 값(5주 기준)은 이전 주(N13ter 4.04±0.49 mm, 비히클 그룹 4.75±0.58 mm)와 비슷한 수준을 유지하여 안구 건조도가 비슷한 수준을 유지했음을 나타낸다. 도 12에 도시된 바와 같이, N13ter 적용은 비히클 그룹과 비교하여 통계적으로 유의한 이전 실험에서와 유사한 효과를 생성하였다(이원 ANOVA: p=0.0044). N13ter 적용 후, 유루율의 점진적인 증가가 관찰되었으며 3시간(6.54±0.78 mm; "p<0.01 vs. 비히클; 이원 ANOVA 및 Bonferroni 사후 테스트)에서 정점에 이르렀고 24시간 이내에 기초값으로 돌아가기 전 몇 시간 동안 기초 수준 이상으로 유지되었다. Bonferroni의 사후 테스트가 각 시점에서 유의한 차이를 나타내지 않았지만 아마도 필요한 검정력 및 데이터의 일부 분산으로 인해 반복 측정 일원 분산 분석 테스트와 5주 기초값으로 데이터를 분석한 결과 상당한 차이가 나타났다(p=0.0277). 반대로, 비히클 적용은 기초값(5주 데이터 포인트)을 약간 회복하는 유루율의 초기 감소를 생성하고 나머지 실험 동안 안정적으로 유지되었다. 비록 그 값이 실제로 가까웠고(p=0.0517) Bonferroni의 사후 테스트는 3시간에서 상당한 차이를 나타냈지만(3.21±0.47 mm; np<0.01), 반복 측정 일원 분산 분석 테스트와 5주 기초값은 유의한 차이를 나타내지 않았다. 데이터에 따르면 N13ter를 적용한 후 유루율이 증강되는 반면 비히클 적용은 유루율에 반대 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
결론적으로, N13ter 펩타이드는 나이브 동물과 안구건조증이 발생한 동물 모두에서 쥐의 안구 표면에 국소 적용했을 때 유루율에 대한 증강 효과를 발휘하는 것으로 보인다.
SEQUENCE LISTING
<110> Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
Universit?C?e d'Azur (UCA)
Institut National de la Sant?et de la Recherche M?icale
(INSERM)
<120> THERAPEUTIC USE OF CALCIUM-ACTIVATED CHLORIDE CHANNEL PEPTIDE
ACTIVATOR
<130> BEP200646
<150> EP20305795.5
<151> 2020-07-10
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
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<220>
<223> amino acid residues between positions 30 to 42 of the human KCNE1
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<223> TMEM16-A activator peptide "1
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<223> TMEM16A peptide activator #2
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> X is serine or arginine
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> X is serine or aspartic acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> X is glycine or serine
<400> 4
Leu Ala Arg Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Lys Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> hN13 S38G
<400> 5
Leu Ala Arg Arg Ser Pro Arg Gly Gly Asp Gly Lys Leu
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> amino acid residues between positions 30 to 42 of the rat KCNE1
protein sequence
<400> 6
Leu Ala Arg Arg Ser Gln Leu Arg Asp Asp Ser Lys Leu
1 5 10
Claims (14)
- 서열 L-A-R-X1-S-X2-X3-X4-X5 (SEQ ID NO: 3)을 포함하거나 이로 구성되되, 상기
- X1은 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이고,
- X2는 프롤린 또는 글루타민이며,
- X3은 아르기닌 또는 루신이고,
- X4는 세린 또는 아르기닌이며, 및
- X5는 글리신 또는 아스파르트산인 의약으로 사용하기 위한 TMEM16A 펩타이드 활성화제. - 제1항에 있어서,
서열 L-A-R-X1-S-X2-X3-X4-X5-D-X6-K-L (SEQ ID NO: 4)를 포함하거나 이로 구성되되, 상기
- X1은 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이고,
- X2는 프롤린 또는 글루타민이며,
- X3은 아르기닌 또는 루신이고,
- X4는 세린 또는 아르기닌이며,
- X5는 글리신 또는 아스파르트산이고, 및
- X6은 글리신 또는 세린인 펩타이드. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
아미노산 서열 L-A-R-R-S-P-R-S (SEQ ID NO: 1) 또는 이의 기능성 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 서열 L-A-R-R-S-P-R-S-S-D-G-K-L (SEQ ID NO: 2) 또는 이의 기능성 변이체를 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 펩타이드는 8 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 20개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 13 내지 20개의 아미노산 잔기인 펩타이드. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO: 1 또는 2와 비교하여 3개 이하의 보존적 치환된 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 펩타이드. - 의약으로 사용하기 위한 제1항 내지 제7항에 정의된 펩타이드를 인코딩하는 핵산.
- 의약으로 사용하기 위한 제8항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
- 클로라이드 채널 기능장애로 인한 질병, 특히 TMEM16A 채널 기능장애로 인한 질병의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드, 제8항의 핵산 또는 제9항의 발현 벡터.
- 제10항에 있어서,
상기 클로라이드 채널 기능장애로 인한 질병은 낭포성 섬유증, 구강건조증, 안구건조증, 심장 부정맥 및 위장 운동성저하 질환으로 구성된 군, 바람직하게는 안구건조증에서 선택되는 펩타이드, 핵산 또는 벡터. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드, 제8항의 핵산 또는 제9항의 발현 벡터 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 1 또는 2의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 8 내지 100개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 8 내지 20개의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 13 내지 20개의 아미노산 잔기의 펩타이드.
- 제1항 내지 제7항에 정의된 펩타이드, 제8항에 정의된 핵산 또는 제9항에 정의된 발현 벡터의 클로라이드 채널 활성화제로서의 용도.
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