KR20150041619A - 변형된 피브로넥틴 단편 또는 이의 변이체 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 피브로넥틴 단편 또는 이의 변이체 및 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 세포 생물학, 및 특히 세포외 매트릭스 단백질의 기능 및 세포외 매트릭스 단백질과 인테그린의 상호작용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인테그린, 특히, 인테그린 α5β1 및 인테그린 ανβ3에 대한 특이적 길항제로서 사람 피브로넥틴 단편 및/또는 이의 변이체에 관한 것이다. 이와 함께 제출된 서열 텍스트 파일은 이의 전문이 참조로서 인용된다.
인테그린은 세포-매트릭스 및 세포-세포 상호작용을 매개하는 당단백질 막 수용체 패밀리이다. 인테그린은 α 및 β 서브유니트로 이루어진 이종이량체이다. 지금까지, 18개 α 및 8개 β 서브유니트를 포함하는 적어도 24개의 별개의 인테그린 이종이량체가 보고되었다. 인테그린은 상이한 세포외 매트릭스(ECM) 단백질과의 특이적 상호작용을 통해 세포의 고착 및 이동을 매개한다. 추가로, 세포 생존, 분열 및 분화는 또한 효과적인 세포-ECM 연합에 의존한다(문헌참조: Morgan et al. 2009, IUBMB Life, 61:731-38).
인테그린 α5β1 및 ανβ3은 배양된 세포의 접착 접촉면에 위치하고 있다. 상기 인테그린-ECM 복합체는 고착 및 이동을 위해 요구되는 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 지속시킬 뿐만 아니라 세포-ECM 복합체의 형성은 또한 효소 및 어댑터를 세포 내부 역학적 복합체로 구성시킴에 의해 인테그린-매개된 세포내 시그날 전달을 유발한다. 인테그린의 상기 세포내 시그날 다운스트림은 유전자 발현, 세포 생존, 분화 및 증식에 영향을 미칠 수 있다. 인테그린은 혈관형성 및 종양 진행과 같은 많은 병리학적 병태에 관련되어 있다.
여러 인테그린은 피브로넥틴에 존재하는 Arg-Gly-Asp (RGD) 모티프를 통해 피브로넥틴과 상호작용하는 것으로 공지되어 있다. 이들 인테그린은 5αv 인테그린(ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6, 및 ανβ8) 및 2개의 β1 인테그린(α5β1 및 α8β1)을 포함한다(문헌참조: Smith, W., 2008, J. Allergy Clin. Immunol. 121 :S375-S379). 피브로넥틴은 다른 세포외 매트릭스 단백질 뿐만 아니라 인테그린에 결합하는 세포외 매트릭스의 고분자량(약 440kDa)의 당단백질이다. 피브로넥틴은 C-말단에서 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 단량체의 이량체로서 존재한다. 각각의 피브로넥틴 단량체는 3개 유형의 도메인, I형, II형 및 III형을 함유하는 230 내지 250 kDa의 분자량을 갖는다. I형 및 II형 도메인은 쇄내 디설파이드 결합에 의해 안정화되지만 III형 도메인은 임의의 디설파이드 결합을 함유하지 않는다. 디설파이드 결합의 부재는 FN III형 도메인의 구조에서 유연성을 유도할 수 있다.
각각의 도메인은 피브로넥틴 단량체의 길이를 따라 기능성 및 단백질-결합 영역을 형성하도록 구성된 다수의 모듈을 함유한다. 예를 들어, I형 도메인에서 모듈은 피브로넥틴 매트릭스 어셈블리의 개시를 위해 요구되고 I형 및 III형 둘다의 도메인에서 모듈은 다른 피브로넥틴 분자와의 연합을 위해 중요하다. 상기 RGD 모티프는 III형 도메인 (FNIII 10)의 모듈 10에 위치하고 인테그린 α5β1 및 ανβ3으로의 피브로넥틴의 결합 부위를 구성한다. III형 도메인 모듈 9(FNIII 9), 특히 PHSRN 공동상승작용(synergy) 루프에서의 서열은 피브로넥틴의 인테그린 α5β1로의 결합을 촉진시킨다. 피브로넥틴의 인테그린 ανβ3 결합은 모듈 9의 공동상승작용 효과를 요구하지 않는다.
다양한 세포 기능을 조절하는데 있어서의 인테그린 역할 때문에, 질환들의 치료제로서 인테그린 길항제를 사용하는 가능성에 대해 연구되었다. 예를 들어, 혈소판 응집을 활성화시키는 인테그린인 인테그린 αΠbβ3에 대한 길항제는 혈전-관련 허혈성 혈관 질환을 치료하기 위한 항-응고제로서 실험되었다(문헌참조: Coller et al., 2008, Blood, 112:3011-25). 로도스토민과 같은 디스인테그린은 인테그린-매개된 혈소판 응집 및 세포 접착을 억제하는 뱀독에서 천연적으로 발견되는 소형 단백질 인테그린 길항제의 패밀리이다. 그러나, 디스인테그린은 비특이적이고 고도로 면역원성이다. 이것은 상기 세포 표면상의 βi- 및 β3- 함유 인테그린에 결합하는 것에 대해 피브로넥틴과 경쟁하고 비특이적으로 인테그린 α5β1, ανβ3 및 인테그린 αIIbβ3의 활성을 억제한다. 따라서, 인테그린 α5β1 및 ανβ3에 대한 길항제로서 디스인테그린의 용도는 혈소판 응집 및 혈액 응고를 차단하는 이의 αIIbβ3 길항제 활성으로 인해 고위험의 출혈을 부과한다.
유사하게, 예르시니아 슈도튜버큘로시스 단백질 인베이신(invasin)은 인테그린-결합 단백질이다. 상기 세균 인베이신 단백질은 인테그린에 결합함에 의해 세균의 세포로의 진입을 촉진시킨다. 인테그린 길항제로서 인베이신의 사용은 상기 세균성 단백질이 또한 고도로 면역원성이고 상기 인베이신 단백질의 특이성은 한정되어 있지 않기 때문에 문제가 있다.
고농도에서, FNIII 9-10은 어느 정도 전장 피브로넥틴 분자의 생물학적 활성을 모방한다(문헌참조: van der Walle et al., 2002, Protein Engineering 15: 1021-24). FNIII9-10은 인테그린에 결합하는 것에 대해 다른 ECM 단백질과 경쟁한다. 인테그린에 대한 결합 도메인을 포함하는 상기 절단된 피브로넥틴 분자 또는 단편, 예를 들어, FNIII 10 또는 FNIII 9-10은 사람에서 덜 면역원성이고 디스인테그린과 비교하여 보다 높은 특이성을 갖고. 따라서 출혈을 유발하지 않는다. 그러나, 인테그린 길항제로서 절단된 피브로넥틴을 사용하는 경우 어려움이 존재한다. 상기 어려움 중 하나는 안정성 및 용해도이다. 사람 FNIII 9 또는 FNIII 9-10은 단독으로는 구조적으로 불안정하다(문헌참조: van der Walle, supra). 추가로, 고농도에서 FNIII 9-10은 불용성이고 이는 이의 대규모 제조 및 생산에 대한 큰 과제를 부여한다. 따라서, 낮은 면역원성, 높은 특이성 및 증진된 안전성 및 용해도를 갖는 보다 우수한 디자인된 인테그린 길항제가 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 특히, 당업계에서 발견되는 한계에 의해 방해받지 않는 인테그린 길항제 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명자는 예상치 않게도 본원에 기재된 돌연변이체 또는 변형된 사람 피브로넥틴 (FN) 단편들이 인테그린 길항제 활성을 나타냄을 밝혔다. 추가로, 본원에 기재된 FNIII 10 또는 FNIII 9-10 돌연변이체 또는 변이체는 야생형 서열을 갖는 FN 단편과 비교하여 증가된 용해도 및 안전성을 나타냈다.
사람 FN에서, 상기 RGD 모티프는 주로 무질서하게 이동성인 III형 도메인 10의 루프에 위치하고, 추정컨대 유연성은 이의 기능을 위해 중요하다. 본 발명자는 예상치 않게도 FNIII 10 내 가공된 디설파이드 결합을 도입함에 의한 증가된 도메인내 강직성이 개선된 용해도 및 안정성을 부여하고/하거나 인테그린 α5β1 및/또는 인테그린 ανβ3에 대한 길항제 활성을 유지하거나 개선시킴을 밝혔다. 특정 양태에서, 본 발명의 FNIII 단편은 용해도가 pH 7.0의 용액에서 적어도 약 20 내지 약 24mg/ml인 것으로 입증되었다. 특정 다른 양태에서, 본 발명의 FNIII 단편은 용해도가 적어도 약 7 내지 약 27 mg/ml인 것으로 입증되었다. 특정 양태에서, 상기 용해도는 유리된 아미노산 Arg 및 Glu의 부재하에 성취된다. 특정 다른 양태에서, 본 발명의 FNIII 단편은 야생형 사람 서열을 갖는 FNIII 단편과 비교하여, 약 10%에서 약 300%까지, 특히, 약 20%에서 약 280%까지, 25%에서 약 250%까지, 30%에서 약 200%까지, 20%에서 약 150%까지 용해도가 증가되는 것으로 입증되었다.
인테그린 ανβ3에 결합할 필요는 없지만, 모듈 9는 인테그린 α5β1에 결합하는 공동상승작용 증진을 제공하는 것으로 사료된다. 본 발명자는 놀랍게도, FNIII 9의 존재하에, 예를 들어, 화학식 Cys-X8-Cys을 포함하고, 추가로, 예를 들어, 화학식 Cys1490X2RGDX3Cys1499를 포함하는, RGD 모티프를 플랭킹하는 2개의 Cys 치환을 통해 모듈 10에 도입된 디설파이드 결합이 FNIII 9-10 변이체의 용해도 및 안정성을 개선시키고 이들의 인테그린 α5β1 길항제 활성을 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 추가로, 본 발명자는 예상치 않게, 예를 들어, 화학식 Cys-X7-Cys을 포함하고, 추가로, 예를 들어, 화학식 Cys1491XRGDX3Cys1499를 포함하는 RGD 모티프를 플랭킹하는, FNIII 모듈 10에서 조작된 디설파이드 결합이 FNIII 10 변이체의 용해도 및 안정성을 개선시키고 인테그린ανβ3에 대한 이들의 길항 활성을 개선시킬 수 있음을 발견하였다. 추가로, 본 발명자는 놀랍게도, FNIII 9-10과 관련하여, 화학식, 예를 들어, Cys-X7-Cys, 및 추가로, 예를 들어, Cys1491XRGDX3Cys1499를 포함하는 Cys 치환을 갖는 변이체가 인테그린 α5β1 대신 인테그린 ανβ3에 결합 특이성을 나타냄을 발견하였다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10(FNIII 10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, 상기 FNIII 10은 디설파이드 결합을 형성하기 위해 Arg-Gly-Asp (RGD) 모티프 및 2개의 Cys 치환을 포함하고, 여기서, 1개의 Cys 치환체는 RGD 모티프의 N-말단에 있고 다른 Cys 치환체는 RGD 모티프의 C-말단에 있으며, 여기서, FNIII 10은 서열번호 2와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드 억제제는 인테그린 α5β1 또는 인테그린 ανβ3 활성을 억제할 수 있고 인테그린 αIIbβ3 활성을 억제하지 않는다. 본원 전반에 걸쳐, 상기 변형된 사람 피브로넥틴 단편은 임의로 사람 피브로넥틴의 다른 모듈 및/또는 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 변형된 사람 피브로넥틴은 III형 도메인 모듈 9를 추가로 포함하고, 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9 및 10 (FNIII 9-10)은 서열번호 4와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 특정 다른 양태에서, 상기 FNIII 9-10은 모듈 9의 아미노산 1408번 위치에서 Leu의 Pro로의 치환을 추가로 포함한다.
특정 양태에서, 상기 2개의 Cys 치환체는 RGD 모티프를 플랭킹하는 약 6개 내지 약 9개의 아미노산 잔기에 의해 분리되어 있다. 특정 다른 양태에서, 상기 2개의 Cys 치환체는 7 또는 8개의 아미노산 잔기에 의해 분리되어 있다. 특정 양태에서, 상기 2개의 Cys 치환체는 아미노산 1487 내지 1501번에 위치한다. 특정 다른 양태에서, 상기 FNIII 10은 아미노산 1491, 1492, 1496, 1497 또는 1498번에 하나 이상의 아미노산 치환체를 추가로 포함하고, 여기서, 1491번에서 아미노산 치환체는 Arg 또는 Ile이고, 1492번에서 아미노산 치환체는 Ala 또는 Pro이고, 1496번에서 아미노산 치환체는 Met, Asn 또는 Trp이고, 1497번에서 아미노산 치환체는 Asn이고, 1498번에서 아미노산 치환체는 Asp 또는 Glu이다. 본원 전반에 걸쳐 사용되는 아미노산 넘버링은 전장 사람 피브로넥틴 단백질(서열번호 74)의 아미노산 넘버링을 기초로 한다. 예를 들어, 서열번호 74의 서열을 기초로 아미노산 위치 1491번에서의 Thr 잔기는 서열번호 2에 보여지는 바와 같이 FNIII 10의 아미노산 위치 76번에서 Thr 잔기를 언급한다.
특정 양태에서, Cys 치환체는 아미노산 위치 1491번에서 Thr의 Cys로의 치환(T1491C) 및 아미노산 위치 1499번에서 Ser의 Cys로의 치환(S1499C)이다. 특정 양태에서, 상기 FNIII 10은 화학식 C1491Xi(n)RGDX2(n)C1499를 포함하고, 여기서, 상기 n 은 1, 2 또는 3이고, Xi 및 X2는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기를 나타낼 수 있다. 특정 양태에서, 상기 FNIII 10은 화학식 C1491Xi(i)RGDX2(3)C1499를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 인테그린 ανβ3 활성을 억제한다.
또 다른 양태에서, FNIII 10은 화학식 Cys1491-Xi-Arg-Gly-Asp-X2-X3-X4-Cys1499를 포함하고, 여기서, Xi는 Gly, Ala 또는 Pro이고; X2는 Ser, Met, Asn 또는 Trp이고; X3은 Pro 또는 Asn이고; X4는 Ala, Asp 또는 Glu이다. 특정 양태에서, Xi는 Pro이고, X2는 Met이고, X3은 Pro이고, X4는 Asp이다. 특정 다른 양태에서, Xi는 Pro이고, X2는 Trp이고, X3은 Asn이고, X4는 Glu이다. 특정 다른 양태에서, Xi는 Ala이고, X2는 Asn이고, X3은 Pro이고, X4는 Asp이다. 특정 양태에서, Xi는 Gly이고, X2는 Ser이고, X3은 Pro이고, X4는 Ala이다. 특정 다른 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 다른 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 인테그린 ανβ3 활성을 선택적으로 억제하거나 선택적으로 억제할 수 있다.
특정 다른 양태에서, 변형된 사람 피브로넥틴 단편은 추가로 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 임의로 포함하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9(FIII 9)를 포함하고, FNIII 9 및 FNIII 10 (FNIII 9-10)은 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는다.
특정 다른 양태에서, Cys 치환은 아미노산 위치 1490번에서 Val의 Cys로의 치환(V1490C) 및 아미노산 위치 1499번에서 Ser의 Cys로의 치환(S1499C)이고, 여기서, 상기 변형된 사람 피브로넥틴은 단편은 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 임의로 추가로 포함하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9를 임의로 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 FNIII 10은 화학식 Cys1490-X1-X2-Arg-Gly-Asp-X3-Pro-X4-Cys1499를 포함하고, 여기서, Xi는 Thr, Arg 또는 Ile이고; X2는 Gly, Ala 또는 Pro이고; X3은 Phe, Arg, Asp, Ser, Met 또는 Asn이고; X4는 Ala 또는 Asp이다. 특정 양태에서, Xi는 Arg이고, X2는 Ala이고, X3은 Asn이고, X4는 Asp이다. 특정 다른 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 108, 서열번호 109 또는 서열번호 110의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 32, 서열번호 108, 서열번호 109 또는 서열번호 110의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 인테그린 α5β1 활성을 선택적으로 억제하거나 선택적으로 억제할 수 있다. 특정 양태에서, Cys 치환은 아미노산 위치 1490번에서 Val의 Cys로의 치환(V1490C) 및 아미노산 위치 1499번에서 Ser의 Cys로의 치환(S1499C)이고, 여기서, 상기 변형된 사람 피브로넥틴 단편은 임의로 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환 및 임의로 아미노산 위치 1341번에서 Asn의 Ala로의 치환, 아미노산 위치 1377번에서 His의 Pro로의 치환, 아미노산 1376번에서 Pro의 Lys로의 치환 또는 아미노산 위치 1376번에서 Pro의 Asp로의 치환을 임의로 추가로 포함하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9를 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113 또는 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 인테그린 α5β1 활성을 선택적으로 억제하거나 선택적으로 억제할 수 있다.
FNIII 9-10 상호도메인 연결체의 유연성은 사람 FN 단백질에서 대규모 형태적 변화를 허용하는 것으로 사료된다. FNIII 9-10 계면에서 링커의 확장에 의한 FNIII 9 및 FNIII 10의 부분적 구조의 비커플링은 모듈 9의 공동상승작용 결합을 상실시킨다(문헌참조: Altroff et al., 2004, J. Biological Chemistry, 279:55995-56003). 이전의 결과는 모듈 9 및 10의 접합부를 가로지르는 디설파이드 결합에 의해 도입된 도메인간 경직성이 인테그린 α5β1로의 결합을 통한 FNIII 9-10의 공동상승작용 세포 접착 활성을 폐지시키고, FNIII9-독립적 인테그린 ανβ3 결합에 대한 친화성을 감소시킴을 보여주었다(문헌참조: Altroff et al., supra).
그러나, 본 발명자는 놀랍게도, 비-공유 결합에 의해 생성된 모듈 9와 10 간의 상호도메인 연결체가 인테그린 α5β1에 대한 이의 결합 친화성을 유지시킴을 발견하였다. 상기 비-공유 결합은 FNIII 9 및 FNIII 10에 대한 적당한 배향을 제공할 수 있고 인테그린 α5β1로의 결합을 촉진시킨다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9 및 사람 피브로넥틴 III형 모듈 10(FNIII 9-10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, FNIII 9는 임의로 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 포함하고, 여기서, FNIII 9 및/또는 FNIII 10은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, FNIII 9 및 FNIII 10에서 상기 아미노산 잔기는 비-공유 결합을 형성하고, 여기서, FNIII 9 및 FNIII 10은 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 64는 아니다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 인테그린 α5β1 활성을 선택적으로 억제하거나 선택적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 측면에 따라, 특정 양태에서, FNIII 9 및 FNIII 10에서 아미노산 치환은 상호도메인간 디설파이드 결합을 형성한다. 특정 다른 양태에서, FNIII 9 및 FNIII 10에서 아미노산 치환들은 상호도메인 수소 결합을 형성한다. 특정 양태에서, FNIII 9에서 아미노산 치환은 아미노산 위치 1340번에서 Ala의 Asp로의 치환(A1340D)이고 FNIII 10에서 아미노산 치환은 아미노산 위치 1442번에서 Val의 Lys로의 치환 (V1442K)이다(도 4). 특정 추가의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 다른 양태에서, FNIII 10에서 아미노산 치환은 아미노산 위치 1491번에서 Thr의 Arg로의 치환(T1491R)이다. 특정 양태에서, 상기 비-공유 상호도메인 연결체는 아미노산 위치 1341번에서의 Asn과 위치 1491번에서의 아미노산 사이에 형성된다. 특정 추가의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는다.
추가의 측면에서, 본 발명은 화학식 Val1490-X1-X2-Arg-Gly-Asp-X3-X4-X5-X6-Ser1500을 포함하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10(FNIII 10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서. Xi는 Thr 또는 Arg이고; X2는 Ala 또는 Pro이고; X3은 Met, Trp 또는 Asn이고; X4는 Pro 또는 Asn이고; X5는 Asp 또는 Glu이고; X6은 Ser 또는 Gly이고, 여기서, 상기 변형된 피브로넥틴 단편은 서열번호 2와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 50은 아니다. 특정 양태에서, Xi는 Thr이고; X2는 Pro이고; X3은 Met이고; X4는 Pro이고; X5는 Asp이고; X6은 Ser이다. 특정 다른 양태에서, Xi는 Thr이고; X2는 Ala이고; X3은 Asn이고; X4는 Pro이고; X5는 Asp이고; X6은 Ser이다. 추가의 양태에서, Xi는 Arg이고; X2는 Ala이고; X3은 Asn이고; X4는 Pro이고; X5는 Asp이고; X6은 Ser이다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 인테그린 α5β 1 활성 및/또는 인테그린 ανβ3 활성을 억제하거나 억제할 수 있다. 특정 다른 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 48, 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 상기 측면에 따라, 특정 양태에서, 상기 변형된 피브로넥틴 단편은 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 임의로 포함하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9(FNIII 9)를 추가로 포함하고, 여기서, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10 (FNIII 9-10)은 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60 또는 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 60 또는 62의 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 기재된 모든 양태는 이들이 조합될 수 없다고 문단에 명시되는 않는 경우 다른 양태에와 조합될 수 있다. 예를 들어, 상호도메인간 디설파이드 결합을 포함하는 FNIII 9-10을 포함하는 변형된 피브로넥틴 단편은 FNIII 9와 FNIII 10 사이에 조작된 상호도메인 연결체를 추가로 포함할 수 있다. 다른 조합은 또한 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 이해된다.
추가의 측면에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 상기된 다양한 측면에 기재된 치료학적 유효량의 폴리펩타이드를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 세포를 본 발명의 유효량의 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인테그린-매개된 세포 접착, 성장, 이동 또는 분화를 억제하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 인테그린은 ανβ3 및/또는 α5β1 인테그린을 포함한다. 본 발명의 상기 측면에 따라, 특정 양태에서, 상기 인테그린은 인테그린 ανβ3이다. 특정 추가의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 44 또는 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 다른 추가의 양태에서, 상기 인테그린은 인테그린 α5β1이고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56 또는 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 인테그린-매개된 세포 접착, 성장, 이동 또는 분화를 억제하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 인테그린은 ανβ3 또는 α5β1이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 종양 성장, 종양 진행 또는 종양 전이를 억제하거나 치료하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 종양은 ανβ3 또는 α5β1을 발현한다. 특정 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 본원에 기재된 본 발명의 치료학적 유효량의 폴리펩타이드를 포함한다. 이들 측면에 따라, 특정 양태에서, 상기 인테그린은 인테그린ανβ3이고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 48 또는 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 다른 양태에서, 상기 인테그린은 인테그린 α5β1이고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 상기 포유동물은 사람이다.
또 다른 추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는 포유동물에서 혈관형성-관련 질환을 억제하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 혈관형성-관련 질환은 암, 황반 퇴화, 부종 또는 관절염이다. 상기 측면에 따라, 특정 양태에서, 상기 혈관형성-관련 질환은 인테그린 ανβ3 및/또는 α5β1에 의해 매개된 질환을 포함하고; 특정 다른 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 48, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 또는 서열번호 61의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 19, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 47, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59 또는 서열번호 61의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 제공된 숙주 세포를 상기 발현 벡터로부터 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 유효 조건하에서 배양하는 단계 및 (b) 상기 배양물로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 분리된 폴리펩타이드는 유리된 Arg 및/또는 Glu 없이 완충액중에서 회수한다.
본 발명의 특정 양태는 하기의 바람직한 양태 및 특허청구범위의 보다 상세한 기재로부터 자명할 것이다.
본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 표현적으로 참조로서 본원에 인용된다.
상기 출원 내에서, 달리 언급되지 않는 경우, 사용된 기술은 여러 널리 공지된 참조문헌 중 어느 하나에서 찾을 수 있다: 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA). 특정 정의가 제공되지 않은 경우, 본원에 기재된 분자 생물학, 유전자 조작, 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약적 및 약제학적 화학의 실험 과정 및 기술과 연계하여 사용되는 명명은 당업계에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되고 있는 것들이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형 및 전달 및 환자의 치료를 위한 표준 기술이 사용될 수 있다.
문단에서 달리 요구되지 않는 경우, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 예를 들어, "폴리펩타이드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리펩타이드를 의미한다.
하기된 바와 같이, 본 발명은 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10(FNIII 10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, 상기 FNIII 10은 Arg-Gly-Asp (RGD) 모티프를 포함하고, 상기 변형된 사람 피브로넥틴 단편은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 변형된 사람 피브로넥틴 단편은 서열번호 2와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 변형된 사람 피브로넥틴 단편은 임의로 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 추가로 포함하는 FNIII 9를 추가로 포함하고, 상기 변형된 사람 피브로넥틴 단편은 서열번호 4와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본원 전반에 걸쳐 사용되는 아미노산 넘버링은 전장의 성숙한 사람 피브로넥틴(서열번호 74)의 아미노산 넘버링에 따른다. 전장 사람 피브로넥틴 cDNA 및 단백질 서열은 각각 GenBank 승인 번호 NM_212476 (서열번호 73) 및 NP_997641 (서열번호 74)를 기초로 한다.
또한, 본 발명의 변형된 FNIII 10 또는 변형된 FNIII 9-10 뿐만 아니라, 제한없이 피브로넥틴 III형 도메인의 모듈 6, 모듈 7 및/또는 모듈 8을 포함하는, 피브로넥틴의 추가의 모듈 및 도메인을 포함하는 변형된 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드가 또한 본원 발명에 포함된다. 본원에 기재된 하나 이상의 본 발명의 돌연변이를 갖는 전장 FN 폴리펩타이드가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
사람 피브로넥틴은 FNIII 10에 있는 RGD 모티프를 통해 인테그린 α5β1 및 인테그린 ανβ3 에 결합한다. 도 1을 참조한다. 그러나 단독의 FNIII 10은 인테그린 ανβ3에 대해 단지 낮은 친화성을 보여준다. 본 발명자는 예상치않게 RGD 루프로 FVIII 10 내에 2개의 Cys 치환 사이에 형성된 쇄내 디설파이드 결합의 도입이 FNIII 10의 인테그린 결합 및/또는 길항제 활성을 개선시킴을 밝혔다. 추가로, 예상치 않게, 화학식 Cys1491-X1-RGD-X2-X3-X4-Cys1499을 포함하는 Cys 치환이 FNIII 10 또는 FNIII 9-10과 관련하여 인테그린 ανβ3 길항제 활성을 개선시킴을 밝혔다. 한편, 화학식 Cys1490-Xi-X2-Arg-Gly-Asp-X3-Pro-X4-Cys1499을 포함하는 변형된 FNIII 9-10은 야생형 서열을 갖는 FNIII 9-10과 비교하여 동등하거나 보다 우수한 인테그린 α5β1 길항제 활성을 나타냈다. 특정 다른 양태에서, 보존성 아미노산 치환을 포함하는 추가의 돌연변이는 변형된 피브로넥틴 단편의 목적하는 활성에 영향을 미치는 것 없이 본원에 기재된 변형된 본 발명의 피브로넥틴 단편에 도입될 수 있다.
고농도에서 FNIII 9-10은 전장 FN 생물학적 활성과 어느정도 유사한 것으로 사료되었다. FNIII 9-10 또는 FNIII 10는 용액중에서 구조적으로 불안정한 것으로 공지되어 있다. 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환(L1408P)이 FNIII 9의 안정성을 개선시킨다는 것이 이전에 보고되었다. 문헌[van der Walle et al., supra]을 참조한다. 또한, FNIII 10 내에 아미노산 위치 1422번에서 Asp의 Asn으로의 치환이 FNIII 10의 안정성을 개선시킨다는 것이 이전에 보고되었다(문헌참조: Koide A., et al. Biochemistry 2001, 40: 10326-10333). 그러나, 본 발명자들은 예상치 않게 예를 들어, 화학식 Cys1491XRGDX3Cys1499을 포함하는, RGD 루프내 형성된 조작된 디설파이드 결합이 L1408P 및/또는 D1422N 치환의 존재와는 상관없이 FN 단편 FNIII 9-10 및 FNIII 10의 안정성 및 용해도를 증가시킴을 밝혔다. 또한, 화학식 Cys1490X2RGDX3Cys1499 을 포함하는 RGD 루프내 형성된 조작된 디설파이드 결합이 FN 단편 FNIII 9-10의 안정성 및 용해도를 증가시킴을 밝혔다.
예르시니아 슈도튜버쿨로시(Yersinia pseudotuberculosi)의 인베이신과 같은 다른 천연의 인테그린 βi 결합 단백질 같지 않게, FNIII 9-10의 α5β1 인테그린 상호작용 표면은 2개의 모듈간의 최소 상호작용으로 때문에 덜 유연하다. 문헌[ Hamburger et al., Science, 1999, 286:291]을 참조한다. FN 모듈 9와 모듈 10 사이의 구조적 유연성은 FN 생물학적 기능을 유지시키는데 중요한 것으로 시사되었다. 문헌[Altroff et al., supra; Van Nhieu et al. 1996, J. Biol. Chem. 271:7665-72: and Biochemistry 37: 10945 (1998)]을 참조한다. 그러나 놀랍게도 FNIII 9와 FNIII 10 사이의 제한된 도메인간 이동이 FNIII 9-10의 인테그린 α5β1 길항 활성에 영향을 미치지 않는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 상기 측면에 따라, 특정 양태에서, 본 발명은 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9 및 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편(FNIII 9-10)을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 제공하고, 여기서, 상기 FNIII 9는 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 임의로 포함하고, 여기서, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10은 각각 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, FNIII 9 및 FNIII 10에서 아미노산 치환은 비-공유 결합을 형성하고, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10은 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 64는 아니다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 인테그린 α5β1 활성을 억제한다.
컴퓨터 보조 3차원 도킹 모델을 사용하여 본 발명자는 인테그린 cc5 서브유닛과의 상호작용에 관여하는 FNIII 9의 아미노산 잔기를 동정했다(도 5A, 오른쪽 패널). 상기 도킹 모델은 또한 FNIII 9가 allb 또는 αV 서브유닛과 상호작용하지 않음을 보여준다. FNIII 9-10 L1408P CRARGDNPDC (서열번호 32)의 컴퓨터 생성된 도킹 모델은 상기 FNIII 변이체가 호전적인 도킹 에너지에 의해 입증된 바와 같이 인테그린 α5β1 결합에 대한 선택성을 보여줌을 입증한다(도 5B, 하부 패널).
본원에 기재된 다양한 양태 뿐만 아니라, 목적하는 길항제 활성에 영향을 주지 않는 추가의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 FN 단편을 포함하는 폴리펩타이드로서 상기 변형된 FN 단편이 상응하는 야생형 FN 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일한 폴리펩타이드가 또한 본 발명에 포함된다. FN의 아미노산 서열은 상이한 포유동물 종간에 고도로 보존되어 있다. 하나의 예로서, 도 2는 다른 지적된 포유동물 종 기원의 FNIII 9-10과 사람 기원의 FNIII 9-10의 아미노산 서열 정렬을 보여주고 있고, 상기 서열들은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 데이타베이스로부터 가용하다. 전장 FN의 서열은 또한 대중에게 가용하다. 따라서, 제한없이, 상이한 포유동물 종 중에 서열의 보존성을 토대로 서열번호 2(또는 서열번호 4)와 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 동일하고 FN 단편의 목적하는 활성을 유지하는 삽입(들), 결실(들) 및 치환(들)을 포함하는, 추가의 돌연변이를 본 발명의 FN 변이체가 갖는지의 여부를 결정하는 것은 당업자의 능력 범위내에 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"는 특히, 게놈 DNA, cDNA, 재조합 DNA, 재조합 RNA, 또는 합성 기원의 핵산 및 이의 조합을 포함하는 핵산에 의해 암호화된 단백질을 언급하고, 이는 (1) 이것이 통상적으로 발견되는 적어도 일부 단백질이 부재이거나, (2) 동일한 공급원. 예를 들어, 동일한 세포 또는 종 기원의 다른 단백질이 필수적으로 없거나, (3) 상이한 종 기원의 세포에 의해 발현되거나, (4) 이것이 공급원 세포로부터 분리되는 경우 천연적으로 발견되는 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질의 약 50% 이상과 분리되어 있거나, (5) 천연적으로 "분리된 단백질"이 결합된 모든 폴리펩타이드 또는 일부에 결합(공유 또는 비공유 상호작용)되어 있지 않거나, (6) 천연적으로 결합되어 있지 않거나 (7) 천연적으로 존재하지 않는 폴리펩타이드와 작동적으로 결합(공유 또는 비공유 상호작용에 의해)되어 있다. 바람직하게, 상기 분리된 단백질은 이의 치료학적, 진단학적, 예방학적 또는 연구 사용을 방해하는 이의 천연 환경에서 발견되는 다른 오염 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다른 오염물이 실질적으로 없다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드," "뉴클레오타이드," "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 DNA, RNA, 이의 유도체 또는 조합체를 포함하는 핵산을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 천연 및 비재조합 세포, 유전학적으로 조작되거나 재조합 세포 또는 화학적 합성에 의해 생성된 단백질을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있고, 천연 단백질의 아미노산 서열, 또는 천연 서열의 하나 이상의 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 서열을 갖는 분자를 포함한다. 본 발명에 따라, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 구체적으로, 변형된 사람 피브로넥틴 또는 이의 단편 또는 이의 변이체를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 인테그린 활성을 억제하는 이의 사람 피브로넥틴 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정 양태에서, 상기 인테그린은 인테그린 α5β1 또는 ανβ3이다. 다른 특정 양태에서, 상기 인테그린은 αIIbβ3이 아니다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "인테그린 길항제" 또는 "인테그린에 대한 길항제"는 인테그린 활성을 억제하거나, 차단하거나, 중화시키거나, 감소시키거나, 폐지시키거나, 방해할 수 있는 분자를 언급한다. 특정 양태에서, 상기 길항제는 인테그린에 결합하고 인테그린이 다른 분자, 예를 들어, 다른 ECM 단백질에 결합하지 못하도록 차단시킴에 의해 인테그린 활성을 억제한다. 특정 다른 양태에서, 상기 길항제는 인테그린에 결합하고 인테그린이 세포내 다운스트림 시그날 전달 반응을 유도하지 못하도록 함에 의해 인테그린 활성을 억제한다.
본원에 사용된 바와 같은 인테그린 활성과 관련된 용어 "억제" 또는 "억제하다"는 제한없이 결합 분석, 이동 분석, 아폽토시스 분석 및 세포 접착 분석을 포함하는 다양한 기능적 분석에 의해 분석된 바와 같이 인테그린의 활성을 감소시키는 인테그린 길항제의 성질을 언급한다. 본 발명의 특정 양태에서, 변형된 피브로넥틴 단편을 포함하는 폴리펩타이드는 인테그린 활성을 억제하고, 특정 양태에서, 상기 인테그린은 인테그린 α5β1이다. 특정 다른 양태에서, 상기 인테그린은 인테그린 ανβ3이다. 특정 추가의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 길항제의 부재하에 대조군과 비교하여 약 0% 내지 약 100%까지 인테그린 활성을 억제한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택적으로 억제하다", "선택적 억제", "차등학적으로 억제하다" 또는 "차등적 억제"는 특정 표적 분자에 대해 차등적 선택성을 보여주는 길항제의 성질을 언급한다. 예를 들어, 인테그린 ανβ3 활성을 억제하지만 인테그린 α5β1 활성을 억제하지 않는 변형된 FN 단편을 포함하는 폴리펩타이드는 인테그린 ανβ3을 선택적으로 억제한다. 특정 양태에서, FNIII 10을 포함하고 임의로 FNIII 9를 추가로 포함하는 변형된 피브로넥틴 단편을 포함하는 폴리펩타이드는 인테그린 ανβ3 활성을 선택적으로 억제하고; 특정 다른 양태에서, FNIII 9-10을 포함하는 변형된 피브로넥틴 단편을 포함하는 폴리펩타이드는 인테그린 α5β1 활성을 선택적으로 억제한다. 특정의 또 다른 양태에서, FNIII 9-10을 포함하는 변형된 피브로넥틴 단편을 포함하는 폴리펩타이드는 인테그린 ανβ3 및 인테그린 α5β1 활성 둘다를 특이적으로 억제한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "천연적으로-존재하는"은 천연에서 발견될 수 있는 대상물, 예를 들어, 천연의 공급원으로부터 분리될 수 있고 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않는 유기체(바이러스를 포함하는) 중에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 상기 용어 "천연적으로 존재하는" 또는 "천연"이 핵산 분자, 폴리펩타이드, 숙주 세포 등과 같은 생물학적 물질과 연계하여 사용되는 경우 천연에 존재하고 사람에 의해 조작되지 않은 물질을 언급한다. 유사하게, 본원에 사용된 바와 같은 "재조합", "비-천연적으로 존재하는" 또는 "비천연"은 천연에서 발견되지 않거나 사람에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 물질을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 핵산 서열 또는 폴리펩타이드 서열과 관련된 용어 "야생형"은 사람에 의해 의도적으로 변형시키지 않은 천연 또는 천연적으로 존재하는 서열을 언급한다. 야생형 사람 피브로넥틴 아미노산 서열은 서열번호 74에 제시된다. 야생형 서열로부터 변이된 아미노산 서열을 갖는 천연적으로 존재하는 대립형질 변이체가 존재할 수 있는 것으로 이해된다. 상기 야생형 사람 FN 아미노산 서열은 본원 전반에 걸쳐 사용되는 아미노산 잔기의 넘버링을 참조로 서열번호 74에 제시되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질 단편" 또는 "폴리펩타이드 단편"은 상응하는 야생형 단백질의 전장 아미노산 서열 보다 적은 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질을 언급한다. 단백질의 단편은 N 말단 및/또는 C 말단으로부터 전장 단백질의 절단부(들) 또는 전장 단백질의 내부 기원의 절단부(들)를 함유할 수 있다. 특정 양태에서, 폴리펩타이드의 단편은 전장 폴리펩타이드의 목적하는 활성을 보유한다. 특정 다른 양태에서, 폴리펩타이드의 단편은 전장 단백질과 비교하여 목적하는 추가의 또는 변화된 활성을 획득한다. 특정 양태에서, 상기 단백질 단편은 본원에 기재된 본 발명의 변형을 하나 이상 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 도메인 III 모듈(FNIII 10) 또는 모듈 9 및 10(FNIII 9-10)을 포함하는 사람 피브로넥틴 단편이다. 특정 다른 양태에서, 추가의 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)을 추가로 포함하고 목적하는 활성을 보유하는 변형된 사람 피브로넥틴을 포함하는 폴리펩타이드는 또한 본 발명에 의해 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변이체", "돌연변이체" 또는 "변형된"은 야생형 서열과 상이한 하나 이상의 치환 또는 변화를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 언급한다. 특정 양태에서, 상기 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10(FNIII 10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함한다. 해독후 변형을 추가로 포함하는 변형된 FN 변이체가 또한 고려되고 본 발명의 범위에 포함된다. 본원에 기재된 상응하는 본 발명의 아미노산 치환(들)을 포함하는 전장의 사람 FN이 또한 본 발명에 의해 고려되고 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동성" 또는 "동일한"은 상응하는 피브로넥틴 단편간에 전체 서열 유사성 및/또는 동일성 수준을 언급한다. 높은 서열 상동성은 단백질 활성의 보존을 시사한다. 다수의 공개적으로 가용한 알고리듬 또는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 서열 상동성을 결정할 수 있다. 추가의 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환 및 서열 상동성 수준을 결정하는 것은 당업자의 능력 범위내에 있다.
용어 "의 N-말단" 또는 "의 C-말단"은 단백질 또는 이의 단편에서 2개 이상의 아미노산 잔기의 상대적 위치를 언급하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 참조 아미노산 잔기의 N-말단의 펩타이드 서열내 아미노산 잔기는 참조 아미노산 잔기가 N-말단에 있는 것 보다 펩타이드 서열의 N-말단에 더 인접하게 있는 펩타이드 서열의 위치에 있는 것으로 이해된다. 유사하게, 참조 아미노산 잔기의 C-말단의 아미노산 잔기는 참조 아미노산 서열 잔기가 C-말단에 있는 것 보다 펩타이드 서열의 C 말단에 더 인접한 펩타이드 서열의 위치에 있는 것으로 이해된다.
사람 FNIII 10 및 FNIII 9-10 변이체는 하기 표 1에 요약되어 있다:
본원에 사용된 바와 같이, 20개의 통상적인 아미노산 및 이들의 약어는 통상적인 용법에 따른다. 임의의 목적을 위해 본원에 참조로서 인용되는 문헌[IMMUNOLOGY -A SYNTHESIS, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Gren, Eds.), 1991, Sinauer Associates, Sunderland, Mass.]을 참조한다. 특정 양태에 따라, 단일 또는 다중 아미노산 치환(특정 양태에서, 보존성 아미노산 치환)은 천연적으로 존재하는 서열(특정 양태에서, 분자간 접촉부를 형성하거나 기능성 도메인을 포함하는 도메인(들) 외부의 폴리펩타이드 부분에서)에서 만들어질 수 있다. 특정 양태에서, 보존성 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않는다(예를 들어, 대체 아미노산은 이중나선과 같은 모 단백질 또는 본래의 단백질의 특성인 2차 구조를 붕괴시키지 말아야 한다). 당업계에 인지된 폴리펩타이드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[참조: PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; and Thornton et at., 1991, Nature 354: 105]에 기재되어 있고 이들은 각각 본원에 참조로서 인용된다.
천연적으로 존재하는 잔기들은 공통된 측쇄 성질을 기준으로 다음 부류로 분류될 수 있다: 1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; 3) 산성: Asp, Glu; 4) 염기성: His, Lys, Arg; 5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기들: Gly, Pro; 및 6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
보존성 아미노산 치환은 생물학적 시스템에서 합성에 의한 것이 아닌 화학적 펩타이드 합성에 의해 통상적으로 혼입되는 비-천연적으로 존재하는 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 이들은 펩타이도모사체 및 다른 역전되거나 역위된 형태의 아미노산 잔기들을 포함한다.
대조적으로, 비-보존성 치환은 이들 부류의 하나의 구성원이 또 다른 부류 기원의 구성원으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 상기 치환된 잔기들은 분자의 상동성 또는 비-상동성 또는 비-보존성 영역으로 도입될 수 있다.
특정 양태에 따라 상기와 같이 변화시키는데 있어서, 아미노산의 하이드로패틱(hydropathic) 지수가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산에는 이의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 하이드로패틱 지수가 할당된다. 이들은 다음과 같다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5) (문헌참조: Kyte et al, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131).
단백질에 대한 상호활성 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 상기 하이드로패틱 아미노산 지수의 중요성은 당업계에서 이해되고 있다(문헌참조: 예를 들어, Kyte et al, 1982, ibid.). 특정 아미노산은 유사한 하이드로패틱 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유하는 것으로 공지되어 있다. 하이드로패틱 지수를 기준으로 변화시키는데 있어서, 특정 양태에서, 이의 하이드로패틱 지수가 ±2 범위내에 있는 아미노산의 치환이 포함된다. 특정 양태에서, ±1내에 있는 것들이 포함되고 특정 양태에서 ±0.5내에 있는 것들이 포함된다.
유사 아미노산들은 특히, 이에 의해 생성된 생물학적 기능성 단백질 또는 펩타이드가 본원에와 같이 면역학적 양태에 사용하기 위해 의도되는 경우 소수성을 기초로 효과적으로 치환될 수 있는 것으로 이해된다. 특정 양태에서, 이의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같은 단백질의 최고 국소 평균 친수성은 이의 면역원성 및 항원-결합 또는 면역원성과 상호관련되고, 즉 단백질의 생물학적 성질과 상호관련된다.
미국 특허 제4,554,101호에 기재된바와 같이, 하기의 친수성 값은 이들 아미노산 잔기에 할당된다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트 (+3.0 ± 1); 글루타메이트 (+3.0 ± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발란 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5) 및 트립토판 (-3.4). 유사한 친수성 값을 기초로 변화시키는데 있어서, 특정 양태에서, 친수성 값이 ±2내에 있는 아미노산들의 치환이 포함되고, 특정 양태에서, ±1내에 있는 것들이 포함되고, 특정 양태에서, ±0.5내에 있는 것들이 포함된다. 예시적인 아미노산 치환들은 표 2에 제시된다.
당업자는 널리 공지된 기술을 사용하여 본원에서 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 적합한 변이체를 결정할 수 있다. 특정 양태에서, 당업자는 활성을 위해 중요한 것으로 사료되지 않는 영역들을 표적화함에 의해 활성을 파괴시키지 않고 변화될 수 있는 적합한 영역의 분자들을 동정할 수 있다. 특정 양태에서, 당업자는 유사한 폴리펩타이드 중에 보존된 분자의 잔기들 및 부분들을 동정할 수 있다(예를 들어, 서열 정렬의 분석에 의해). 특정 양태에서, 생물학적 활성 또는 구조를 위해 중요한 영역이 생물학적 활성을 파괴시키는 것 없이 또는 폴리펩타이드 구조에 역효과를 미치지는 것 없이 보존성 아미노산 치환될 수 있다.
추가로, 당업자는 활성 또는 구조를 유지시키기에 중요한 유사하거나 관련된 폴리펩타이드에서 아미노산 잔기들 동정할 수 있다. 상기 비교 관점에서, 당업자는 유사 단백질내 활성 또는 구조를 위해 중요한 아미노산 잔기들에 상응하는 단백질에서 아미노산 잔기들의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 상기 예측된 중요한 아미노산 잔기들에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환들을 선택할 수 있다. 상이한 포유동물 종 기원의 FNIII 9-10의 아미노산 서열 정렬은 도 2에 나타낸다.
당업자는 또한 유사한 폴리펩타이드에서 상기 구조와 관련하여 3차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 상기 정보의 관점에서, 당업자는 이의 3차원 구조와 관련하여 폴리펩타이드의 아미노산 잔기들의 정렬을 예측할 수 있다. 특정 양태에서, 당업자는 단백질 표면상에 있는 것으로 예측된 아미노산 잔기들에 라디칼 변화가 일어나지 않도록 선택할 수 있는데 그 이유는 상기 잔기들이 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여할 수 있기 때문이다. 더욱이, 당업자는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성시킬 수 있다. 이어서 상기 변이체는 당업자에게 공지된 활성 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 상기 변이체는 적합한 변이체에 대한 정보를 수집하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 대한 변화가 파괴되거나, 목적하지 않게 감소되거나 적합하지 않은 활성을 유도하는 것으로 밝혀진 경우, 상기 변화를 갖는 변이체는 회피될 수 있다. 다른 말로, 상기 통상적인 실험으로부터 수집된 정보를 기초로 하여, 당업자는 추가의 치환이 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합하여 회피되어야만 경우 아미노산들을 용이하게 결정할 수 있다.
20개의 통상적인 아미노산의 입체이성체(예를 들어, D-아미노산), 비-천연적으로 존재하는 아미노산, 예를 들어 α-,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산들이 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 위해 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-Ν,Ν,Ν-트리메틸라이신, ε-Ν-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록실라이신, σ-Ν-메틸아르기닌 및 기타 유사한 아미노산들 및 이미노산들(예를 들어, 4-하이드록시프롤린). 본원에 사용된 폴리펩타이드 명명에서, 표준 용법 및 통상법에 따라 왼손 방향은 아미노 말단 방향이고 오른손 방향은 카복시 말단 방향이다.
특정 다른 양태에서, 사람 피브로넥틴을 포함하는 폴리펩타이드는 융합 단백질을 형성하기 위한 이종성 실체를 추가로 포함한다. 상기 이종성 실체는 재조합적으로 합성된 사람 피브로넥틴 단편의 검출 및/또는 정제를 촉진시킬 수 있다. 적합한 이종성 실체는 제한 없이, 다중-히스티딘 태그, GFP (녹색 형광 단백질) 태그, GST (글루타티온 S-트랜스퍼라제) 태그 및 말토스 결합 단백질 태그, FLAG 태그 또는 HA 태그를 포함한다. 적합한 태그의 선별, 및 이종성 태그(또는 에피토프 태그)와 함께 목적하는 단백질을 발현하는 발현 벡터의 작제는 당업자의 능력 범위내에 있다. 목적하는 에피토프 태그에 연결된 표적 단백질은 PCR에 의해 생성될 수 있고, 여기서, 에피토프 태그를 암호화하는 서열은 프라이머 서열에 혼입된다. 이종성 태그에 접합된 목적하는 단백질의 재조합 발현을 위해 디자인된 발현 벡터는 상업적으로 시판되고 있고, 예를 들어, pGEX-2KS (제조원: GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) 및 pET21a (제조원: Novagen)가 있다. 특정 양태에서, 상기 이종성 실체 또는 에피토프 태그는 예를 들어, 재조합적으로 합성된 폴리펩타이드의 정제 후 빌트-인 프로테아제 절단 부위의 프로테아제 절단에 의해 제거된다.
상기 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포 또는 표적 세포의 형질전환을 위해 적합하고 삽입된 이종성 핵산 서열의 발현을 지시하고/하거나 통제하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 언급한다. 발현은 전사, 해독 및 RNA 스플라이싱(인트론이 존재하는 경우)과 같은 프로세싱들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 발현 벡터는 사람 피브로넥틴 단편 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 발현 벡터는 6개-히스티딘-접합된 사람 피브로넥틴 단편 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
전형적으로, 숙주 세포 또는 표적 세포 중 임의의 하나에 사용되는 발현 벡터는 벡터 유지를 위한 서열 및 외인성 뉴클레오타이드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유한다. 상기 서열은 특정 양태에서 "플랭킹 서열"로서 총체적으로 언급되고 전형적으로 다음의 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 포함한다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 오리진, 전사 종결 서열, 공여자 및 수용자 스플라이스 부위를 함유하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩타이드 분비를 위해 리더 서열을 암호화하는 서열, 리포좀 결합 부위, 폴리아데닐화 시그날 서열, 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 삽입하기 위한 1개 또는 다수의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 폴리링커 영역 및 적합한 마커 요소.
상기 용어 "형질도입"은 통상적으로 파아지에 의해 하나의 세균으로부터 다른 세균으로의 유전자 전달을 언급하기 위해 사용된다. "형질도입"은 또한 레트로바이러스와 같은 바이러스에 의해 진핵 세포 서열의 획득 및 전달을 언급한다.
상기 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 취득을 언급하기 위해 사용되고 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입되는 경우 "형질감염"되었다라고 언급된다. 다수의 형질감염 기술이 당업계에 널리 공지되어 있고 본원에 기재되어 있다. 문헌[예를 들어, Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Elsevier); and Chu et al., 1981, Gene 13: 197]을 참조한다. 상기 기술을 사용하여 하나 이상의 외인성 DNA 잔기들을 적합한 숙주 세포로 도입할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환"은 세포의 유전학적 특성에서의 변화를 언급하고 세포는 이것이 새로운 DNA를 함유하도록 변형된 경우 형질전환되었다라고 언급된다. 예를 들어, 세포는 이것이 이의 본래 상태로부터 유전학적으로 변형된 경우 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후, 상기 형질전환 DNA는 물리적으로 세포의 염색체로 통합함에 의해 세포의 DNA와 재조합될 수 있고 복제되는 것 없이 에피좀 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나 플라스미드로서 독립적으로 복제할 수 있다. 세포는 DNA가 세포의 분열과 함께 복제되는 경우 안정하게 형질전환된다.
상기 용어 "숙주 세포"는 핵산 서열이 도입되거나 도입될 수 있어 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 세포를 언급하기 위해 사용된다. 상기 용어는 유전자가 존재하는 한 자손이 형태학적으로 또는 유전학적 구성에 본래의 모 세포와 동일하든지에 상관없이 모 세포의 자손을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 및 가장 바람직하게는 설치류 또는 사람 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 세포와 본 발명의 치료학적 유효량의 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 인테그린-매개된 세포 접착, 성장, 이동 또는 분화를 억제하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 인테그린은 ανβ3 및/또는 α5β1 인테그린이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양 성장, 종양 진행 또는 종양 전이를 억제하거나 치료하는 방법을 제공하고, 상기 종양은 ανβ3 및/또는 α5β1을 발현한다. 적합한 종양의 비-배타적 예는 폐 암종, 유방 종양, 결장 종양, 골육종, 췌장 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 교모세포종, 전립선 종양, 간 종양 및 흑색종을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 종양은 인테그린 α5β1을 발현하고, 적합한 종양의 비-배타적인 예는 폐 종양, 유방 종양, 결장 종양, 흑색종, 골육종 및 전립선 종양을 포함한다. 특정 다른 양태에서, 상기 종양은 인테그린 ανβ3을 발현하고, 적합한 종양의 비-배타적인 예는 유방 종양, 흑색종, 췌장 종양, 난소 종양, 자궁 교모세포종 및 전립선 종양을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는 포유동물에서 혈관형성 관련된 질환을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 혈관형성 관련된 질환은 암, 황반 퇴화, 부종, 관절염, 다발성 경화증, 혈관 기형, 비만, 건선, 무사마귀, 알레르기성 피부염, AIDS에서 카포시 육종, 당뇨 망막증, 1차 폐 고혈압, 천식, 낭성 섬유증, 염증성 장 질환, 치주 질환, 간경변, 자궁내막증, 난소낭포, 자궁 출혈, 골수염 또는 당뇨성 신경병증이다. 상기 측면에 따라, 특정 양태에서, 상기 혈관형성 관련된 질환은 인테그린 ανβ3 및/또는 α5β1에 의해 매개된 질환을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 분리된 폴리펩타이드의 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 기재된 목적하는 결과를 성취하기에 충분한, 예를 들어, 인테그린 매개된 세포 접착, 성장, 이동 또는 분화를 억제하거나 종양 성장, 종양 진행 또는 종양 전이를 억제하기에 충분한 양을 언급한다. "유효량" 또는 "치료학적 유효량"을 구성하는 폴리펩타이드 또는 화합물의 양은 폴리펩타이드 또는 화합물, 장애 및 이의 중증도 및 치료될 피검체의 연령에 따라 다양하지만 통상적으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 피검체는 포유동물이다. 특정 양태에서, 상기 포유동물은 사람이다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료하는" 또는 "치료"는 포유동물에서, 예를 들어, 사람에서 질환 또는 장애를 치료를 포함하고 (i) 질환 또는 장애를 억제하는, 즉 이의 발병을 억제하고/하거나; (ii) 질환 또는 장애를 경감시키는, 즉 장애의 퇴행을 유발하고/하거나; (iii) 장애의 진행을 서행시키고/시키거나; (iv) 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 진행을 억제하거나, 경감시키거나 서행시키는 것을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 대한 투여 경로는 경구; 정맥내, 복강내, 뇌내(조직질실내), 뇌실내, 피하, 근육내, 안내, 동맥내, 문정맥내 또는 병변내 경로; 지연된 방출 시스템 또는 이식 장치에 의한 경로를 포함한다. 상기 약제학적 조성물은 볼러스 주사 또는 연속적 주입 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 또한 목적하는 분자가 흡수되거나 캅셀화되어 있는 막, 스폰지 또는 또 다른 적당한 물질의 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 상기 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관으로 이식될 수 있고 목적하는 분자의 전달은 확산, 시간 설정 방출 볼러스 또는 연속 투여일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 약제학적 조성물에 대한 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있고, 여기서, 상기 전달될 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 배합된다. 적합한 담체, 희석제 및 부형제 및 이의 제제는 예를 들어, 문헌[참조: Genaro, A. O. "Remington: The Science and Practice of Pharmacy." Lippincott Williams & Wilkins (2005)]에 기재되어 있다.
생체내 사용되는 수성 약제학적 조성물을 위해, 멸균성의 발열원 제거된 물이 바람직하다. 상기 제형은 포유동물, 특히 사람에게 투여하기에 적합한 약제학적으로 허용되는 조성물을 제조하기 위해 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 유효량의 폴리펩타이드를 함유한다. 당업자 또는 담당의의 지식 범위내 및 본원에 교시된 바와 같이 유효량의 조성물이 목적하는 치료학적 효과를 성취하기 위해 포유동물, 바람직하게는 사람에게 투여될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 변형된 FN 단편을 포함하는 상기 조성물은 치료학적 효과를 제공하기 위해 다른 항암제, 항-혈관형성 약물 및 화학치료요법 약물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 변형된 FN 단편은 단백질용해성 분해를 방지하거나 감소시키기 위해 화학적으로 변형시킬 수 있다. 단백질 또는 이의 단편의 화학적 변형 또는 최적화를 위한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고, 이는 제한없이 천연 아미노산 잔기의 비천연 아미노산 잔기로의 치환, 아미노산 결합 대체, N-아실화, N-피로글루탐이트, 및/또는 C-아미드화, 및 N-말단 에스테르화 또는 페길화 변형에 의해 N 또는 C-말단을 차단시킴을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Vlieghe et al., 2010, Drug Discovery Today, 15:40-56]을 참조한다.
추가의 측면에서, 본원에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 에멀젼, 겔, 용액, 현탁액 등의 형태로 있을 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수송 및 저장을 용이하게 하기 위해 건조된 형태로 조성물을 제조하기 위해 동결건조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 밀봉된 바이엘, 컨테이너, 앰푸울 등에 저장될 수 있다. 상기 조성물이 건조된 형태로 있는 경우, 상기 조성물은 투여 전에 용해되거나 재현탁된다(예를 들어, 멸균된 증류수 또는 완충액 중에서). 조성물이 적합한 용해도를 갖는, 식염수 또는 인산 완충 식염수 또는 임의의 상기 담체와 같은 불활성 담체가 사용될 수 있다.
이하의 실시예는 본 발명의 특정 양태 및 이의 다양한 용도를 설명한다. 이들은 설명할 목적으로만 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로서 받아들이지 말아야 한다.
실시예
실시예 1 FIII 단편의 야생형 및 이의 변이체를 발현하는 발현 벡터의 작제
야생형 사람 FN III 9-10은 벡터 pET21a (Novagen)에 클로닝하고 발현하였다. 상기 FNIII 변이체를 암호화하는 DNA는 이. 콜리(E. coli)에서 선호되어 사용되는 코돈으로 구성되었다. 야생형 FNIII 9-10 암호화 서열은 Nde I 인지 부위 및 친화성 정제를 위해 6개의 히스티딘 잔기를 갖는 정배향 프라이머 5'- CATATGCATATGCACCACCACCACCACCACGGTCTTGATTCCCCAACT-3' (서열번호 75)와 함께 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시켰다. 역배향 프라이머는 5'- AAGCTTAAGCTTTCATGTTCGGTAATTAATGGAAATTGG-3' (서열번호 76)이고 Hind III 인지 부위 및 TCA (또는 TTA) 정지 코돈을 갖는다. 상기 PCR 생성물은 정제하고 이어서 이. 콜리 재조합 벡터, pET21a (Novagen)의 Nde I 및 Hind III 부위로 연결하였다. 상기 재조합 플라스미드를 사용하여 이. 콜리 DH5a 균주를 형질전환시키고 LB (pH 7.4에서 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1.0% NaCl, 1.0% 한천) 및 100 μg/ml 항생제 앰피실린을 갖는 한천 플레이트 상에서 콜로니를 선별하였다.
FNIII 9-10 변이체를 합성하고 Nde I 및 Hind III 제한 부위를 함유하는 프라이머와 중첩 올리고뉴클레오타이드 전략을 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다. 변이체를 합성하거나 확인하기 위해 사용되는 다양한 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 표 3에 열거한다.
상기 폴리머라제 연쇄 반응은 이의 전문이 본원에 참조로서 인용되는 문헌[US2008/0188413]에 기재된 과정에 따라 수행하였다. 간략하게, 상기 반응은 1분동안 95℃에서, 1분동안 55℃에서 및 1분동안 72℃에서 25 사이클로 수행하였다. 프라이머의 혼합물은 또한 다중 돌연변이 부위를 생성시키기 위해 사용하였다. 상기 PCR 생성물은 2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 분리하고 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화하였다. 상기 목적하는 PCR 생성물을 정제하고 이어서 효모 전달 벡터 pPICZ 알파 A의 Eco RI 및 Sac II 부위로 연결하였다. 상기 재조합 플라스미드를 사용하여 에스케리치아 콜리 XL1-블루 균주를 형질전환시키고 콜로니는 항생제 제오신을 함유하는 한천 플레이트상에서 선별하였다. 제오신-양성 콜로니로부터 기원하는 플라스미드 DNA를 증폭시키고 분리하고 상기 플라스미드에 함유된 상기 FNIII 서열은 DNA 서열 분석으로 확인하였다.
실시예 2 FNIII 9-10 및 FNIII 10 변이체의 발현 및 정제
야생형 FNIII 9-10, FNIII 10 또는 이의 변이체의 단백질 발현은 최소의 변형과 함께 제조업자의 추천에 따라 피키아(Pichia) EASYCOMP™ 형질전환 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, FNIII 9-10, FNIII 10 또는 이의 변이체를 암호화하는 DNA를 함유하는 총 10μg의 플라스미드는 Sac I로 분해하여 플라스미드를 선형화한다. 피키아 균주(Pichia strain) X33은 피키아 EASYCOMP™ 키트를 사용하는 열 쇼크 방법에 의해 선형화된 작제물로 형질전환시켰다. 상기 선형화된 작제물은 단일 교차에 의해 5' AOX1 유전자좌에서 통합시켰다. 피키아 세포는 리티카제(Sigma)로 용해시키고 PCR로 분석하여 피키아 게놈으로의 FNIII 서열의 통합을 입증하였다. 콜로니는 YPD (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스 및 2% 한천) 및 100 μg/ml의 제오신을 함유하는 한천 플레이트상에서 선별하였다. 다중 카피의 FNIII 삽입물을 갖는 다수의 콜로니는 최고의 FNIII 9-10 또는 FNIII 10 단백질 발현을 위해 선별하였다.
재조합 FNIII 9-10, FNIII 10 및 변이체는 다음과 같이 제조하였다: 선택된 콜로니는 30℃에서 100 μg/ml의 제오신을 함유하는 YPD 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 및 2% 덱스트로스)에서 성장시켰다. 48시간 후, 세포는 원심분리에 의해 수거하고 1리터의 최소 메탄올 배지 (아미노산 없이 황산암모늄 및 4 x 10-5 % 비오틴과 함께 1.34% 효모 질소 염기를 함유하는)에서 성장시켰다. 총 1%의 메탄올은 24시간 마다 1회 첨가하여 2일 동안 FNIII 또는 이의 변이체의 발현을 유도하였다. 상기 상등액은 원심분리에 의해 수거하고 5 리터 완충액 A (5 mM EDTA, 8M 우레아 및 10 mM Na-포스페이트 완충액, pH 7.7)에 대해 2회 투석하였다. 상기 최종 용액을 니켈-킬레이팅 칼럼으로 로딩하고 200 mM의 이미다졸 농도 구배로 용출시켰다. 상기 재조합 FNIII 9-10, FNIII 10 및 이의 변이체는 HPLC(역상 C18 HPLC)로 추가로 정제하였다. 상기 정제된 재조합 FNIII은 트리신-SDS-PAGE에 의해 판단되는 바와 같이 95% 초과의 순도를 가졌다. 여러 FNIII 변이체의 발현 및 순도는 도 6에 나타낸다. CPRGDMPDC (서열번호 20, L1408P (CARGDNPDC) 단백질 (서열번호 22) 및 L1408P, V1442K 치환 (서열번호 28)의 서열을 갖는 FNIII 9-10 변이체의 대표적인 HPLC 프로필 및 순도는 각각 도 6A-C에 나타낸다.
실시예 3 FNIII 10 도메인내 디설파이드 결합은 FNIII 9-10 및 FNIII 10의 안정성 및 용해도를 개선시켰다
이전에 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환이 FNIII 9-10의 안정성을 개선시킴을 보여주었다(문헌참조: van der Walle et al, 2002, Protein Engineering 15: 1021-24). 모듈 10에서 도메인내 디설파이드 결합 돌연변이의 안정성은 상이한 pH 값에서 완충액 중에서 1차원 NMR 스펙트럼 분석에 의해 시험하였다. L1408P 돌연변이의 존재는 50 mM 유리된 아르기닌 및 글루타민을 함유하는 용액 중에서 야생형 FNIII 9-10과 비교하여 pH 5.0에서 FNIII 9-10의 안정성을 개선시켰다. 유리된 아르기닌 및 글루타민은 최대 성취가능한 단백질 농도를 증가시키고 침전 및 분해에 대한 장기 안정성을 개선시킬 목적으로 부가하였다(문헌참조: Golovanov A.P., et al. J. Am. Chem. Soc. 126 (2004) 8933-8939). 그러나, L1408P 돌연변이체의 안정성은 유리된 아르기닌 및 글루타민의 부재하에서 고 pH, 예를 들어, pH 6.0(도 3A, 하부 우측 패널) 또는 낮은 pH, 예를 들어, pH 3.5에서 감소되었다. 한편, 도메인내 디설파이드 결합은 L1408P 돌연변이에 대한 필요 없이 및 유리된 아르기닌 및 글루타민에 대한 필요 없이 pH 7.5에서도 포스페이트 완충액 중에서 FNIII 9-10을 안정화시켰다. 도 3A, 상부 우측 패널에 나타낸 바와 같이, 도메인내 디설파이드 결합을 갖고 L1408 돌연변이가 없는 FNIII 9-10 (CPRGDMPDC, 서열번호 20)은 아르기닌 및 글루타민 없이 용액 중에서 pH 7.5에서 안정하게 유지되었다. 상기 도메인내 디설파이드 결합은 또한 FNIII 9-10 변이체의 안정성 및 용해도를 증가시켰다(도 3B).
또한 위치 1422번(서열번호 65)에서 모듈 10에서 Asp에서 Asn으로의 치환이 pH 5에서 50mM 유리된 아르기닌 및 글루타민의 존재하에 FNIII 10의 안정성을 개선시켰다. 그러나, D1422N 돌연변이체의 안정성은 pH가 5.4 및 6으로 증가되는 경우 감소하였다. 도 3A의 하부 좌측 패널을 참조한다. 도 3C에 나타낸 바와 같이, FNIII 10 (CPRGDMPDC) 단백질 (서열번호 6)에 존재하는 상기 도메인내 디설파이드 결합은 D1422N 돌연변이 필요 없이 FNIII 10의 안정성 및 용해도를 개선시켰다 (도 3C).
실시예 4 FNIII 9-10 또는 FNIII 10 변이체는 인테그린 α5β1- 또는 ocvP3-매개된 세포 접착을 억제하였다
FNIII 변이체의 인테그린 길항제 활성은 이전에 기재된 바와 같이 세포 접착 억제 분석에 의해 평가하였다(문헌참조: Zhang, et al., 1998 J Biol Chem 273:7345-7350). 간략하게, 96-웰 임물론-2 미세역가 플레이트(Costar, Corning, NY)는 50 내지 500nM의 농도로 기질을 함유하는 100 ㎕의 포스페이트 완충 식염수(PBS: 10 mM 포스페이트 완충액, 0.15M NaCl, pH 7.4)로 피복하였고, 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 피복을 위한 기질은 다음을 포함했다: α5β1에 대해 피브리노겐 (FG) 50 μg/ml, ανβ3에 대해 비트로넥틴 (VN) 10 μg/ml, 및 αIIbβ3에 대해 피브로넥틴 (FN) 25 μg/ml. 비특이적 단백질 결합 부위는 실온(25℃)에서 1.5시간동안 200㎕의 열-변성된 1% 소 혈청 알부민(BSA, Calbiochem)으로 각각의 웰을 항온처리함에 의해 차단시켰다. 이후, 상기 차단 열-변성된 BSA는 버리고 각각의 웰을 200㎕의 PBS로 2회 세척하였다.
ανβ3 (CHO-ανβ3) 및 α5β1 (CΗΟ-α5β1) 인테그린을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포는 100㎕의 듈베코 변형된 이글스 배지(DMEM)에 유지시켰다. CHO-co^3 및 CHO-α5β1 둘다는 네오마이신 내성 유전자로 안정한 형질감염에 의해 확립된, 와이. 다카다 박사(Scripps Research Institute)의 일종의 기프트이다. 로그 단계로 성장하는 CHO 세포는 트립신 처리하여 탈착시키고 3 x 105 세포/ml로 상기 분석에 사용하였다. FNIII 9-10, FNIII 10 및 이의 변이체는 0.001-500 μΜ의 농도로 배양된 세포에 첨가하였고 15분동안 5% CO2에서 37℃에서 항온처리하였다. 상기 처리된 세포를 이어서 피복된 플레이트에 첨가하고 1시간동안 5% CO2에서 37℃에서 항온처리하였다. 이어서 상기 항온처리 용액을 버리고 비-부착된 세포는 200 ㎕의 PBS로 2회 세척함에 의해 제거하였다.
결합 세포는 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 정량하였다. 간략하게, 상기 웰은 10분동안 100㎕의 10% 포르말린으로 고정화시키고 건조시켰다. 이어서 50㎕의 0.05% 크리스탈 바이올렛은 실온에서 20분동안 웰에 첨가하였다. 각각의 웰은 200㎕의 증류수로 4회 세척하였고 건조시켰다. 착색은 150㎕의 착색 용액 (50% 알콜 및 0.1% 아세트산)을 첨가함에 의해 수행하였다. 상기 수득한 흡광도는 600nm에서 판독하고 상기 판독은 부착 세포 수와 서로 관련된다. 억제는 % 억제= 100-[OD600 (FNIII 야생형 또는 변이체 -처리된 샘플)/OD600 (비처리된 샘플)] x 100으로서 정의되었다. IC50은 세포 접착의 50% 억제를 위해 요구되는 농도(nM)로서 정의되었다. 따라서, 보다 낮은 IC50은 각각의 인테그린의 세포 접착 활성을 억제하는데 있어서 변이체의 보다 큰 특이성 또는 효능을 지적한다. 상기 결과는 하기 표 4 및 5에 요약한다.
야생형 FNIII 10은 인테그린 ανβ3에 결합하는 것에 대해 FN과 효과적으로 경쟁하지 않았고 따라서 세포 접착 분석에서 인테그린 ανβ3 길항제 활성을 보여주지 않았다. 아미노산 위치 1492번 내지 1451번(서열번호 50)에서 서열 PRGDWNEGSK을 갖는 FNIII 10은 인테그린 ανβ3 결합 활성을 나타냈고, 인테그린 ανβ3에 결합하는 것에 대해 전장 FN과 경쟁하였다. 표 4 및 문헌[Richards et al., J Mol Biol. 2003, 326(5): 1475-88]을 참조한다.
예상치 않게, 예를 들어, T1491C와 S1499C 치환 사이에 화학식 Cys-X7-Cys를 포함하는 서열에서 RGD 모티프를 플랭킹하는 2개의 Cys 치환 사이에 RGD 루프로 디설파이드 결합의 도입은 인테그린 ανβ3 길항제 활성을 크게 증진시키는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 서열번호 2와 비교하여 표 4, 서열번호 6, 8 및 10을 참조한다). 추가로, 상기 조작된 디설파이드 결합은 이미 인테그린 ανβ3 길항제 활성을 나타내는 FNIII 10 변이체의 인테그린 ανβ3 길항제 활성을 추가로 증진시켰다. 예를 들어, FNIII 10 PRGDMPD (즉, CPRGDMPDC를 갖는 서열번호 6)의 배경에서 RGD 모티프를 플랭킹하는 2개의 시스테인 치환은 Cys 치환이 없는 변이체(서열번호 48)와 비교하여 인테그린 ανβ3 결합 친화성을 7배까지 증가시켰고, 따라서 세포 접착의 50%를 억제하는데 요구되는 농도를 감소시켰다(서열번호 6과 서열번호 48의 결과를 비교하여).
요약하여, 느슨하게 구조화된 RGD 루프내 디설파이드의 도입은 실질적으로 인테그린 ανβ3에 대한 FNIII 변이체의 결합 친화성을 증가시켰고, 따라서, 세포 접착 분석에 의한 측정시 인테그린 ανβ3 길항제 활성을 증가시켰다.
* 괄호 안의 %는 FN 단편의 부재하에 대조군과 비교하여 억제 %를 나타낸다.
야생형 FNIII 9-10은 인테그린 α5β1과 결합하지만 인테그린 ανβ3에 결합하지 않는다. 표 5에서 야생형 FNIII 9-10 (서열번호 4)의 결과를 참조한다. 흥미롭게도, 화학식 C-X7-C에서 RGD 모티프를 플랭킹하는 조작된 디설파이드 결합을 갖는 FNIII 9-10 변이체는 변화된 결합 특이성을 나타내었다. 예를 들어, 아미노산 위치 1490번 내지 1501번에서 아미노산 서열 VCPRGDMPDCSK를 갖는 FNIII 9-10(서열번호 20)은 인테그린 α5β1 대신, 인테그린 ανβ3 길항제 활성을 보여주었지만 FNIII 9-10은 인테그린 α5β1 결합제로서 고려되었다. 서열번호 4의 결과인 표 5의 결과와 함께 서열번호 6 및 20의 결과를 비교한다.
한편, 화학식 C-X8-C를 포함하는 서열에서 Cys 치환에 의해 형성된 도메인내 디설파이드 결합은 FNIII 9-10의 결합 특이성을 변화시키지 않았고, 몇몇 경우에 인테그린 α5β1에 대한 결합 친화성을 개선시켰다(예를 들어, 서열번호 4 또는 서열번호 63의 결과와 비교하여 서열번호 32의 결과인 표 5를 참조한다).
모듈 9 및 10(L1408P 치환의 배경에서) 사이의 도메인간 디설파이드 결합은 FNIII 9-10 단편을 안정화시켰지만, 인테그린 α5β1에 결합하는 모듈 9의 공동상승작용 효과를 감소시키는 것으로 이전에 보고되었다(문헌참조: Altroff et al., supra). 그러나, 본 발명자는 예상치않게 위치 1340번 및 1442번 (A1340D 및 V1442K 치환)에서 조작된 Asp와 Lys 사이에 형성된 도메인간 연결을 갖는 FNIII 9-10(L1408P 치환의 배경에서)은 인테그린 α5β1과 비교하여 결합 친화성을 유지시킴을 밝혔다(서열번호 4 또는 서열번호 63의 결과와 비교하여 서열번호 40의 결과인 표 5를 참조한다).
추가로, FNIII 9-10 변이체의 일부는 또한 인테그린 ανβ3에 대한 결합 친화성을 획득하였다(서열번호 4 또는 서열번호 63의 결과와 비교하여 서열번호 60의 결과인 표 4를 참조한다).
요약하면, 화학식 C-X8-C를 포함하는 서열에서 FNIII 9-10의 RGD 루프에 도입된 디설파이드 결합은 인테그린 α5β1 길항제 활성을 개선시킬 수 있다(서열번호 4, 서열번호 63 및 서열번호 62과 서열번호 32의 결과를 비교하는 표 5).
실시예 5 FNIII 10 및 FNIII 9-10 변이체는 인테그린 αIIοβ3에 결합하지 않았고 혈소판 응집을 유도하지 않았다
적어도 2주동안 임의의 약물치료를 받지 않았던 건강한 공여자 기원의 정맥내 혈액(9개 부분) 샘플을 3.8% 나트륨 시트레이트(1개 부분)에 수거하였다. 혈액 샘플을 10분동안 150 x g에서 원심분리하여 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 수득하고 5분동안 방치하였고 PRP를 수거하였다. 상기 혈소판 결핍 혈장(PPP)은 25분동안 2000 x g에서 원심분리하여 잔류 혈액으로부터 제조하였다. 상기 PPP 혈소판 계수는 혈액 분석기상에서 측정하였고 250,000 혈소판/㎕로 희석하였다. 상이한 농도에서 190㎕의 PRP 및 10㎕의 FNIII 10 또는 FNIII 9-10 변이체의 용액 또는 PBS 용액을 37℃에서 Hema Tracer 601 응집기에서 5분동안 항온처리하였다. 10 마이크로리터의 200 μΜ 아데노신 디포스페이트 (ADP)를 추가로 첨가하여 광 방출에 의한 혈소판 응집 반응을 모니터링하였다. 표 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 시험된 야생형 또는 변이체 중 어떠한 것도 인테그린 αIIbβ3에 결합하지 않거나 혈소판 응집을 촉진시키지 않았다.
실시예 6 인테그린-매개된 세포 이동, 세포 생존 및 세포 성장에 대한 FNIII 10 또는 FNIII 9-10 변이체의 효과
인테그린-매개된 생물학적 과정에 대한 FNIII 10 또는 FNIII 9-10 변이체의 효과를 분석하였다. 유동 세포측정기에 의해 확인된 바와 같이 ανβ3 또는 5β1을 안정하게 발현하는 사람 흑색종 세포 A375 또는 A549는 FNIII 10 CPRGDMPDC (CPRGDMPDC을 갖는 서열번호 6) 또는 FNIII 9-10 L1408P CRARGDNPDCSK (서열번호 32)으로 항온처리하고 세포 이동에 대한 효과는 트랜스웰 분석에 의해 조사하였다. 세포 이동(Haptotaxis) 분석은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌참조: Bisanz et al., 2005, Model. Mol. Ther. 12:4 634-643). 8㎛ 공극 폴리카보네이트를 갖는 삽입체(Falcon)는 실온에서 2시간동안 공극 막의 내면상에 200㎕의 피브로넥틴(50μg/ml)으로 피복하고 이어서 실온에서 2시간동안 1%(w/v) 열 변성된 BSA로 세척하고 차단함에 이어서 PBS로 2회 세척하였다. 챔버는 무혈청 DMEM으로 구성하고 이어서 1 x 105 세포를 상부 챔버상에 위치시켰다. 각각의 실험은 이면에 PBS/1% (w/v) BSA로 피복된 폴리카보네이트 필터로 이루어진 대조군을 수반하였고, 이것은 일관되게 어떠한 이동을 입증하지 않았다. 6시간 항온처리후, 세포는 3.7% 포름알데하이드로 고정화시키고 크리스탈 바이올렛으로 염색시켰다. 상부 챔버에 잔류하는 세포는 면봉으로 제거하고 이동하는 세포를 사진촬영하고 정량하였다. FN-III 변이체에 의한 이동의 억제는 분주시에 상이한 용량의 FN-III 변이체를 상부 챔버에 첨가하는 것을 제외하고는 상기와 같이 수행하였다. 이들 결과는 FN-III 변이체가 세포 이동을 억제하였음을 보여주는 도 7A에 요약한다.
추가로, 세포 사이클 정지에 대한 FNIII 10 또는 FNIII 9-10 변이체의 효과를 조사하였다. 세포 사이클 분석은 약간의 변형과 함께 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Brooks et al., 1994, Cell 79: 1157-1164). 간략하게, FN-III 변이체는 세포가 고루 분포된 경우 씨딩 24시간 후 첨가하였다. 처리한지 48시간 후, 유동 및 접착된 세포는 세척하고 PBS에 수거하였다. 세포는 10분동안 1,000rpm에서 원심분리하고 -80℃에서 저장하기 전에 냉 70% PBS 3ml 중에 재현탁시켰다. 45분동안 4℃에서 항온처리한 후, 세포를 수거하고 4℃에서 10분동안 1,300 rpm에서 원심분리하였다. 후속적으로, 세포는 15분동안 37℃에서 1 ml의 PI 염색 용액(9.4ml의 PBS 중 200㎕의 1 mg/ml 프로피디움 요오드, 200㎕의 RNase A 및 200㎕의 5% Triton X-100)중에 재현시켰다. 세포 형광은 상기된 바와 같이 FACScan 유동 세포측정기 (Becton-Dickinson)를 사용하여 측정하였다. 상기 결과는 도 7B에 요약한다. 요약하면, FNIII 야생형 단편의 처리는 대조군(PBS)과 비교하여 증가된 %의 G1 세포를 유발하였고, FNIII 변이체의 처리는 추가로 세포 사이클 정지를 유도하였다.
추가로, 아폽토시스를 유도하는 FNIII 또는 FNIII 9-10 변이체의 능력을 분석하였다. 세포 아폽토시스 실험은 약간의 변형과 함께 이전에 기재한 바와 같이 수행하였다(문헌참조: Maubant et al., 2006, Blood 108: 3035-3044). 간략하게, FN-III 변이체는 세포가 고루 분산된 경우 씨딩 24시간 후 첨가하였다. 처리한지 48시간 후, 유동 및 접착된 세포를 수거하고 15분동안 37℃에서 어넥신 V-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) 및 PI(Sigma)를 사용하는 100㎕의 V/프로피듐 요오드 (PI)로 염색하였다. 상기 수득한 형광은 유동 세포 측정기로 측정하였다. 어넥신 V 및 PI의 조합을 사용한 세포의 염색은 비-아폽토시스성 세포 (어넥신 V-/PT), 조기 아폽토시스성 세포 (어넥신 V+/PI+), 후기 아폽토시스성 세포(어넥신 V+/PI+), 및 괴사성 세포 (어넥신 V-/PI_)임을 밝혔다. 상기 결과는 도 7C-7D에 요약한다. 요약하면, FNIII 및 이의 변이체는 인테그린-발현 세포에서 아폽토시스를 유도하였다.
본 발명을 상세히 기재하고 이의 특정 양태를 참조하면서, 변형 및 변화는 첨부된 특허청구범위에 정의된 발명의 범위를 벗어나는 것 없이 가능하다는 것은 자명하다. 보다 구체적으로, 본 발명의 일부 측면이 특히 이로운 것으로서 동정되었지만, 본 발명은 필수적으로 본 발명의 이들 특정 측면으로 제한되지 않는다.
실시예 6 본 발명의 변이체의 열안정성 및 용해도
차등 스캐닝 열량측정기(DSC)에 의해 측정된 열안정성
생물치료제를 제조, 저장 및 환자로의 전달에 걸쳐 안정하게 유지시키는 것이 중요하다. 차등 스캐닝 열량측정기(DSC)는 용액 중 생물치료제의 상대적 안정성의 양호한 지시제인 것으로 나타난, 단백질의 열 전이 중간점인 Tm의 정확하고, 신속하고 용이한 측정을 가능하게 한다(문헌참조: Demarest et al., 2004; Sanchez-Ruiz et al., 1988; Vermeer and Norde, 2000). 결과적으로, DSC는 하기에 적용하였다: (1) 제형화를 위한 완충제 및 부형제 스크리닝; (2) 활성 뿐만 아니라 합당한 안정성을 갖는 치료학적 후보물 스크리닝; 및 (3) 단백질 응집 경향 예측. 상기 이유 때문에, 본 발명자는 DSC에 의해 디자인된 단백질의 안정성 특징, 9.10Fn3 변이체 및 10Fn3 변이체의 Tm을 분석하였다.
DSC 분석은 VP-DSC 마이크로열량측정기 (MicroCal)를 사용하여 수행하였다. 샘플은 3-kDa 분자량 컷오프 막을 사용하여 제조된 완충액으로 투석시키고, 샘플의 최종 농도는 약 ~0.7mg/ml로 조정하였다. 모든 실험은 60℃/hr의 스캔 비율로 20에서 110℃로 가열하였다. 완충액-완충액 기준선은 동일한 실험적 조건하에 수득하였고 샘플 미량으로부터 공제하였다. 데이타 분석은 DSC 분석 부가물이 장착된 Origin 7.0 (OriginLab Corp, Northampton, MA)에서 수행하였다. 각각의 단백질 과열 용량 곡선은 일치하는 완충액 스캔의 표준 공제에 이어서 상기 데이타의 농도 표준화에 의해 보정하였다. 전이 중간점 또는 용융 온도(겉보기 Tm)는 표준화된 데이타로부터 열 변성 곡선의 정점을 계산함에 의해 결정하였다.
차등 분산 열량측정 (DSC) 실험을 사용하여 온도의 함수로서 목적하는 분자의 용액(Cp)의 과열 용량을 모니터링함에 의해 생물학적 거대분자의 열 유도된 전이를 연구하였다(문헌참조: Bruylants et al., 2005; Spink, 2008). 본 발명자는 PBS 완충액에서 열 안정성 비교를 위해 일련의 본 발명의 조작된 단백질의 DSC 실험을 수행하였다. 본 발명의 단백질에 대한 열 변성 과정은 비가역적이기 때문에, 전이 엔탈피(AH°m) 대신 용융 온도(Tm)는 본 발명의 단백질에 대한 안정성을 반영하기 위해 사용하였다. 이들 단백질의 열-유도된 폴딩 풀림은 하나의 흡열성 반응 전이로 이루어진 DSC 프로필을 생성시켰다. 논-투-상태(non-two-state) 전이 모델을 사용한 DSC 추적물의 탈엄킴은 Tm과 함께 하나의 흡열반응을 생성시켰다. 상기 모델의 피트니스는 실험적이고 계산된 추적물의 비교에 의해 확인하였다. 단지 하나의 피크를 갖는 변성 곡선은 일반적으로 단백질 분자에서 하나 이상의 도메인을 지적하는 것으로 취해지고 다양한 도메인이 서로 비독립적으로 변성을 진행한다. 3개의 대표적인 단백질에 대한 DSC 실험은 각각 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32), FNIII 9-10, L1408P (서열번호 63) 및 FNIII 9-10 L1408P (RARGDNPD) 변이체 (서열번호 62)에서 62.4℃, 60.8℃ 및 58.7℃의 Tm 값을 나타냈다(표 6 및 도 8A를 참조한다). FNIII 10 야생형 (서열번호 2), FNIII 10, FNIII 10 PRGDMPD 변이체(서열번호 48) 및 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6) 변이체의 안정성은 각각 80.7℃, 74.3℃ 및 85.0℃이다(표 7 및 도 9A를 참조한다). 단지 하나의 주요 흡열 반응의 존재는 디설파이드 결합의 존재 또는 부재하의 생성물로 인한 이종성의 부재를 확인시켜주었다. 상기 연구에서, DSC 전이의 7m 값은 재현가능하고 따라서 WT 및 이의 돌연변이의 상대적 열 안정성을 반영하는 것으로 추정할 수 있다.
황산암모늄 침전에 의해 측정된 용해도
용해도는 약제학적 사전제형화 동안에 연구된 주요 물리화학적 성질이다. 액체 투여 형태 개발을 위해, 정확한 용해도 데이타는 가공된 생성물의 강성을 확신하는데 필수적이다. 고체 투여 형태를 위해, 용해도 데이타는 적당한 양의 약물이 생체내 흡수를 위해 가용한지의 여부를 결정하는데 중요하다. 화합물이 낮은 수용해도를 갖는 경우, 위장관(GI) 체류 시간내에 용해율 제한되거나 용해도 제한된 흡수를 받을 수 있다. 단백질 용해도를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 방법은 고해상도 구조적 연구 및 약제학적 적용에 유용하다. 여러 연구는 표면 잔기의 돌연변이 유발을 사용하여 단백질 용해도를 증진시키는데 성공하였다. 여기서, 본 발명자는 폴딩된 단백질의 RGD 루프에 대한 돌연변이가 이들의 용해도에 어떻게 영향을 미치는지를 연구함에 의해 단백질 용해도의 고유 결정인자를 조사하였다.
황산암모늄을 사용한 단백질 침전은 단백질 용해도를 측정하는데 성공적이었다(문헌참조: Trevino, S.R., Scholtz, J.M., and Pace, C.N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of pharmaceutical sciences 97, 4155-4166). 황산암모늄 침전은 동일한 단백질의 변이체의 상대적 용해도 값에 대해 신속하고 정확한 정보를 제공할 수 있다. 상기 방법은 실험적으로 신임할 수 있는데, 그 이유는 실험 과정동안에 도입될 수 있는 동결건조된 단백질 또는 부수적 이온의 물/완충액 내용물과 같이 통제하기가 어려운 인자들이 고농도의 염에 의해 차폐되기 때문이다. 또한, 상기 방법은 잘-한정된 수성 및 고형상을 갖는 침전된 용액을 생성시키고 이것은 높은 가용성 단백질을 연구하는 경우에도 비교적 소량의 단백질(10mg 이하)을 필요로 한다.
모든 측정은 이전에 기재된 바와 같이 실온(25℃)에서 수행하였다(문헌참조: Trevino, S.R., Scholtz, J.M., and Pace, C.N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of pharmaceutical sciences 97, 4155-4166). 간략하게, 3개의 용액(50 mM 완충액, 50mM 완충액 중에 3.0 M 황산암모늄, 및 50mM 완충액 중에 단백질 스톡 용액)을 목적하는 황산암모늄 및 단백질 농도와 함께 15㎕의 최종 샘플 용량을 위해 0.2ml의 PCR 튜브에 함께 혼합하였다. 상기 샘플은 무정형 염석 공정을 위해 >1분 동안 평형화되도록 방치하였다. 이어서, 상기 샘플을 1.5 ml의 에펜도르프 튜브에 전달하고 응집물의 제거를 위해 16,000g에서 1분동안 원심분리하였다. 상기 분광측정기는 495 ㎕의 1.1 M 황산암모늄 용액으로 블랭크하였다. 원심분리 후, 5㎕의 샘플을 495㎕의 블랭크 용액에 첨가하고 혼합하여 흡광도 측정을 위해 100배 희석물을 생성시켰다.
단백질 용해도 측정 bt 황산암모늄 방법은 무정형 침전을 유도하기 위해 사용하였다(문헌참조: Trevino, S.R., Scholtz, J.M., and Pace, C.N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of pharmaceutical sciences 97, 4155-4166). 단백질에 대한 황산암모늄 농도의 함수로서 용해도 곡선을 사용하여 목적하는 단백질의 용해도를 지적한다. FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32), 야생형 단백질 및 FNIII 9-10 L1408P (RARGDNPD) 변이체의 용해도는 24.4, 19.9 및 4.0 mg/ml였다(표 6 및 도 8B를 참조한다). FNIII 10, FNIII 10 야생형(서열번호 2), FNIII 10 (TPRGDMPD) 변이체 (서열번호 48) 및 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)의 용해도는 7.3, 5.3 및 27.8 mg/ml (표 7 및 도 9B를 참조한다). 각각의 용해도 값은 3회 반복하였고 따라서 WT 및 이의 돌연변이의 상대적 용해도를 반영하기 위해 추정될 수 있다. 함께 종합해 보면, 디설파이드 결합의 인테그린 α5β1-특이적 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32) 및 인테그린 ocvp3-특이적 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)로의 혼입이 이들의 안정성 및 용해도를 증가시켰다(도 8B 및 9B를 참조한다).
실시예 7 시험관내 성장 인자-유도된 혈관 튜브 형성에 대한 효과
혈관형성의 재구성 단계를 모델화하기 위해 통상적으로 사용되는 시험관내 분석 중 하나는 튜브 형성 분석이다(문헌참조: Arnaoutova, I., and Kleinman, H.K. (2010). In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols 5, 628-635). 상기 분석은 적당한 세포외 매트릭스 지지체와 함께 서브컨플루언트 밀도로 분주되는 내피 세포가 모세관형 구조를 형성하는 능력을 측정한다. 전형적으로, 상기 능력은 배양 접시의 현미경 이미지에서 이들 모세관형 구조의 수, 길이 또는 영역을 측정함에 의해 정량할 수 있다. 화합물이 튜브 형성을 억제할 수 있는 경우, 이들은 암과 같은 다양한 질환에 유용해야만하고, 여기서 종양은 비교적 작은 크기를 초과하는 성장을 위해 산소 및 영양물을 수용하기 위해 새로운 혈관 형성을 자극한다. 여기서, 본 발명자는 본 발명의 돌연변이체가 튜브 형성을 촉진시키거나 억제하는 능력을 조사하였다.
시험관내 bFGF 또는 VEGF-매개된 내피 튜브 형성에 대한 Fn3 돌연변이체의 효과를 평가하기 위해, 15-웰 μ-슬라이드(ibidi GmbH)를 10μΕ의 매트리겔(BD Biosciences)로 피복시켰다. 15분동안 Fn3 돌연변이체로 예비항온처리된 HUVEC를 2% FBS 및 내피 세포 성장 보충물을 함유하고 최종적으로 50 ng/ml bFGF 또는 20 ng/ml VEGF를 갖는 M199 중의 웰에 첨가하였다. 총 튜브 길이는 ImajeJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였고 지정된 시간에 대조군과 비교하였다. 튜브 형성의 마이크로그래프를 작성하고 N PLAN lOx/0.25 대물 렌즈 및 CCD 카메라를 장착한 역위 현미경(Leica DM IRE2)(CoolSNAP fx; Photometries)으로 프로세싱하였다.
FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) 변이체(서열번호 32)에 의한 VEGF-유도된 튜브 형성에 대한 억제
인테그린 α5β1은 VEGF-유도된 혈관형성에 관여하는 것으로 공지되어 있었다. 인테그린 α5β1의 차단은 시험관내 및 생체내 VEGF 유도된 혈관형성을 억제할 수 있다. 본 발명의 인테그린 cc5pi-특이적 길항제가 모세관 튜브 형성 및 매트리겔 플러그 분석을 억제할 수 있는지를 평가하였다. 유동 세포측정 분석은 인테그린 α5β1이 HUVEC상에 과발현됨을 보여주었다. 본 발명자는 본 연구를 위해 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)를 선택하였고 그 이유는 이것이 가장 강한 결합 및 강성의 생물리학적 성질을 가졌기 때문이다. FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)는 세포외 기저 막 매트릭스인 매트리겔상에서 성장된 HUVEC에 의해 VEGF-유도된 모세관 튜브 형성을 억제하였고(문헌참조: Kleinman et al., 1986), IC50 값은 대락적으로 1.6 μΜ이다(도 10A). 그러나, FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)는 매트리겔상에서 성장된 HUVEC에 의해 bFGF-유도된 모세관 튜브 형성을 억제하지 못했다(도 10B). 상기 결과는 본 발명의 인테그린 α5β1-특이적 길항제가 HUVEC 세포에 대한 인테그린 α5β1 을 특이적으로 표적화할 수 있고 VEGF-유도 튜브 형성에서 이의 관여를 차단함을 시사한다.
FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)에 의한 bFGF-유도된 튜브 형성에 대한 비억제
10Fn3(CPRGDMPDC) 변이체(서열번호 6)는 각각 매트리겔상에서 성장된 HUVEC에 의한 VEGF-유도된 및 bFGF-유도된 모세관 튜브 형성을 억제하지 못했다. 그러나, FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)는 생체내에서 bFGF-유도된 혈관형성을 억제하였다. 튜브 형성 뿐만 아니라, HUVEC 이동은 또한 혈관형성 과정에 관여한다. 따라서, 본 발명자는 본 발명의 인테그린 ccvP3-특이적 길항제가 bFGF-유도 조건하에 튜브 형성이 아닌 이동을 방해할 수 있는 것으로 고려하였다. 이것은 bFGF-유도된 트랜스웰 이동 분석에서 추가로 확인된다.
실시예 8 생체내 매트리겔 플러그 혈관형성 분석
상기 매트리겔 플러그 혈관형성 분석은 누드 마우스에서 이식된 겔 플러그에서 새롭게 형성된 혈관을 검출하기 위해 단순한 생체내 기술이다. 상기 매트리겔 매트릭스 조성물은 기저막 단백질에 상응한다. 이것은 내피 세포와 같은 다양한 세포 유형의 분화를 유도할 수 있다. 혈관형성 또는 항혈관형성 화합물의 활성 수준은 대조군과 비교하여 플러그내 색상 차이에 의해 가시적으로 평가할 수 있다. 추가의 정량은 헤모글로빈 검출과 같은 다양한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 경우에, 단백질의 존재 또는 부재하에 성장 인자(VEGF 또는 bFGF)는 매트리겔과 혼합하고 이어서 마우스에 주사하여 단백질의 항혈관형성 활성을 결정한다.
생체내 혈관형성 효과를 평가하기 위해, 125 ng의 bFGF/VEGF 및 Fn3 돌연변이체와 조합된, 헤파린(500 U/mL)을 함유하는 성장 인자-감소된 액체 매트리겔(0.25ml)을 복부 중간 라인 근처에서 C57BL/6 마우스로 피하내 주사하였다. 이식한지 4일 후, 마우스를 안락사시키고 매트리겔 플러그는 수술적으로 제거하고 CMOS 카메라(600D, Canon)로 사진촬영하였고, 각각의 매트리겔 플러그의 헤모글로빈 함량은 헤모글로빈 비색측정 분석 키트(Cayman)를 사용하여 측정하였다.
FNIII 9-10 변이체 (CRARGDNPDC) (서열번호 32)에 의한 VEGF-유도된 혈관형성에 대한 억제
이어서, 본 발명자는 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)가 매트리겔 플러그 분석을 사용한 생체내 혈관형성을 차단시키는 능력을 측정하였다(문헌참조: Passaniti, R.M. Taylor, R. Pili, Y. Guo, P.V. Long, J.A. Haney, R.R. Pauly, D.S. Grant, G.R. Martin., A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor., Lab. Invest., 67 (1992), pp. 519-528)). 두드러지게, FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)는 네가티브 대조군의 수준에 이르는 수준까지 혈관형성을 억제하였다 (도 11을 참조한다). 이것은 인테그린 α5β1이 VEGF-유도된 혈관형성에 역할을 수행하고 상기 생리학적 과정이 본 발명의 디자인된 cc5pi-특이적 길항제에 의해 차단될 수 있음을 지적한다.
FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)에 의한 bFGF-유도된 혈관형성에 대한 억제
본 발명자는 또한 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)이 매트리겔 플러그 분석을 사용한 생체내 혈관형성을 차단시키는 능력을 측정하였다. 두드러지게, FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체(서열번호 6)는 네가티브 대조군의 수준에 이르는 수준까지 혈관형성을 억제하였다(도 12). 이것은 인테그린 ανβ3이 bFGF-유도된 혈관형성에 역할을 수행하고 상기 생리학적 과정이 본 발명의 디자인된 ανβ3 -특이적 길항제에 의해 차단될 수 있음을 지적한다.
실시예 9 SCID 마우스에서 사람 종양 이종이식체의 성장에 대한 효과
신규 암 치료제의 개발을 위한 주요 임상전 스크리닝은 사람 암 세포의 면역결핍 설치류로의 이종 이식에 의해 성취되어야만 한다(문헌참조: xenograft modelsX Christopher L Morton & Peter J Houghton, NATURE PROTOCOLS. 2007 247-250). 이들 모델은 임상적으로 효과적인 제제를 동정하였고 여전히 약제 산업의 원동력이다. 치료학적 방법의 제안된 기작을 밝히기 위해, 종양의 분자 특성을 종양 생검의 면역조직화학 염색으로 동정할 수 있다. 상기 연구에서, 본 발명자는 각각 2개의 인테그린 길항제의 항-종양 활성을 시험하기 위해 2개의 이종이식 모델을 확립하였다.
종양 혈관형성에 대한 FNIII 돌연변이체의 효과를 평가하기 위해, NOD-SCID 마우스에 1 x 106 사람 흑색종/폐 암종 세포를 등 피하에 주사하였다. 하루 1회 상기 마우스에 다양한 양의 이. 콜리-발현된 돌연변이체(5 또는 10mg/kg 체중)를 피하 주사하였다. 종양을 수거하고 카메라(T30, Sony)로 사진촬영하고, 절개하였다. 종양내 미세혈관 및 세포는 각각 CD31 (BD Biosciences) 및 Ki-67 (Leica)에 대한 Ab를 사용한 IHC 염색을 사용하여 검출하였다. 상기 이미지는 BX51 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 포착하였다. 종양내 미세혈관 밀도 및 세포를 정량하였다. 간략하게, 미세혈관 및 세포의 통합된 광학 밀도(IOD)는 이미지-프로 플러스 소프트웨어를 사용함에 의해 10x 배율로 종양의 각각의 절개부에서 계산하였다.
면역조직화학
모든 조직 절개부를 탈파라핀화하고, 탈수시키고 10 mM Tris-EDTA 완충액(pH 9.0)중에서 6분동안 오토클레이빙하여 열-유도된 항원 복구에 적용하였다. TBS 중에서 2회 세척 후 5분동안 메탄올 중에서 3% H2O2와 항온처리하고 상기 조직 절개부는 5분동안 단백질 블록 (NovoLink™)과 항온처리하였다. 이어서, 상기 샘플은 항체 희석물 중에서 1차 항체와 혼합하였고 30분동안 실온에서 항온처리하였다. TBS 중에서 3회 세척 후, 상기 절개부를 실온에서 10분동안 2차 항체로 항온처리하였다. TBS 중에서 3회 세척한 후, 상기 샘플은 3분동안 DAB 후처리 용액(NovoLink™)을 사용하여 전개시키고 5분동안 0.02% 헤마톡실린으로 대비 염색시키고, 크실렌과 함께 탑재시켰다. 최종적으로, 상기 절개부는 역위된 현미경 (1X71; Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 가시화하였다.
통계학적 분석. 데이타는 평균 ± SD로 표현한다. P < .05의 값은 통계학적으로 유의적인 것으로 고려된다.
FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)에 의한 A375 종양 성장에 대한 억제
FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)의 항혈관형성 활성은 본 발명자에게 이것이 병리학적 혈관형성을 억제할 수 있는지의 여부를 결정하도록 고무시켰다. 종양 성장은 혈관형성 의존성이고 혈관형성의 억제는 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)의 가능한 항종양 활성을 연구하기 위해, 본 발명자는 사람 A375 흑색종 이종이식체를 사용하였다. 유동 세포측정 분석은 인테그린 α5β1이 A375 종양 세포상에서 과발현됨을 보여주었다. FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)의 생체내 피하 투여는 종양 성장의 용량 의존성 억제를 유도하였다. 3주 처리 후, 종양 용적 및 중량의 감소가 관찰되었다(도 13을 참조한다). 종양 하중에서 관찰된 결함에 대한 세포성 기반을 설명하기 위해, 본 발명자는 적당한 마커와 함께 파라핀-매립된 종양 절개부에 대한 면역조직화학을 수행함에 의해 A375-유도된 종양의 증식 및 혈관형성에 대한 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)의 효과를 평가하였다. 종양은 세포성 Ki67 발현 수준의 정량에 의해 반영된 바와 같이, 증식성 상태에서 매우 약간의 결함을 나타냈다. 이것은 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)가 종양 세포 증식에 대해 약간의 억제를 나타낸다는 본 발명의 시험관내 결과와 일치한다. 관찰된 성장 결함에 대한 또 다른 가능한 설명은 βi-인테그린이 종양 혈관형성을 촉진시키는데 관여한다는 것이 이전에 밝혀졌기 때문에 종양 혈관형성을 효율적으로 채택하지 못하는 무능력을 수 있다. 상기 가능성을 시험하기 위해, 본 발명자는 항-CD31 항체를 사용함에 의해 종양에 대한 면역조직화학 분석을 수행하였다. 흥미롭게도, 단백질 처리된 종양은 이들의 능숙한 대응물과 비교하여 상이한 패턴의 CD31 염색을 나타냈다. 단백질 처리된 종양내 총 혈관으로부터 관찰된 CD31-양성 픽셀의 수는 거의 평균적으로 1배 감소하였다. FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)-처리된 종양의 혈관신생은 대조군 종양과 비교하여 상당히 감소하였다(도 13을 참조한다). 이들 결과는 A375-유도된 종양에서 관찰되는 종양-침투된 혈관의 평균 직경에서의 감소를 반영하였고 전체적으로 이들 종양으로의 손상된 혈액 공급을 시사하였다. 이것은 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) 변이체 (서열번호 32)가 튜브 형성 및 매트리겔 플러그 분석시 상당한 억제를 나타낸다는 본 발명의 시험관내 결과에 따른 것이다. 총체적으로, 이들 관찰은 인테그린 α5β1-길항제 치료에 의한 A375-유도된 종양 성장 및 진행에서의 결함이 종양 세포 생존이 아닌 감소된 혈관형성과 상호관련되어 있음을 지적한다.
FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)에 의한 A549 종양 성장에 대한 억제
FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)의 항혈관형성 활성은 본 발명자가 이것이 병리학적 혈관형성을 억제할 수 있는지의 여부를 결정하도록 고무시켰다. 10Fn3(CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)의 가능한 항종양 활성을 연구하기 위해, 본 발명자는 사람 A549 흑색종 이종이식체를 사용하였다. 유동 세포측정 분석은 인테그린 ανβ3이 A549 종양 세포 상에서 과발현되지 않음을 보여주었다. 놀랍게도, FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)의 생체내 피하 투여는 종양 성장의 용량 의존성 억제를 유도하였다. 3주 처리 후, 종양 용적 및 중량의 감소가 관찰되었다(도 14를 참조한다). 종양 하중에서 관찰된 결함에 대한 세포성 기반을 설명하기 위해, 본 발명자는 적당한 마커와 함께 파라핀-매립된 종양 절개부에 대한 면역조직화학을 수행함에 의해 A375-유도된 종양의 증식 및 혈관형성에 대한 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)의 효과를 평가하였다. 종양은 세포성 Ki67 발현 수준의 정량에 의해 반영된 바와 같이 증식성 상태에서 급격한 결함을 나타냈다 (도 14를 참조한다).
도 1은 T1491C와 S1499C 치환 사이의 RGD 루프 영역에 형성된 조작된 상호도메인 디설파이드 결합을 갖는 예시적인 변형된 사람 FNIII 10을 도시한 것이다.
도 2는 상이한 포유동물 종: 침팬지(GenBank 승인번호: XP_003309506) (서열번호 66); 소 (DAA32456)(서열번호 67); 야생돼지 (XP_003133691)(서열번호 68); 마우스(BAE28040) (서열번호 69); 및 래트 (EDL75262) (서열번호 70) 기원의 오톨로그와 야생형 사람 FNIII 9-10 (서열번호 4)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. 표기: "*" 동일한; ":" 보존성 치환; "." 반-보존성 치환.
도 3A-C는 NMR (도 3A), 차등 스캐닝 열량측정 및 황산암모늄 침전 (도 3B, 3C)에 의해 보여지는 바와 같은 야생형 및 돌연변이 FN 단편의 열안정성 및 용해도를 보여준다. 도 3B에서: FNIII 9-10 L1408P- 중간 피크, 정사각형; FNIII 9-10 L1408P (RARGDNPD)- 왼쪽 피크, 삼각형; 및 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDQ- 오른쪽 피크, 원형. 도 3C에서: FNIII 10-중간 피크, 원형; FNIII 10 (PRGDMPD) 단백질(서열번호 48)- 왼쪽 피크, 정사각형; 및 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 단백질 (서열번호 6)- 오른쪽 피크, 삼각형.
도 4는 모듈 9의 A1340D 치환과 모듈 10의 V1422K 치환 사이에 형성된 조작된 상호도메인 수소 결합을 갖는 예시적인 변형된 FNIII 9-10을 도시한 것이다.
도 5A는 인테그린 cc5 서브유닛과 FNIII 9의 상호작용 표면을 보여주는 컴퓨터 기반 모델을 제공한다(오른쪽 패널). 가능한 상호작용 지점이 지적된다. 도 5B는 FNIII 9-10 L1408P-CRA (서열번호 32)-인테그린 결합 복합체의 컴퓨터 도킹 모델, 및 계산된 도킹 에너지를 토대로하는 인테그린 결합 선택성을 보여준다.
도 6A-C는 Ni2 +- 킬레이팅 크로마토그래피에 의한 상이한 FNIII 9-10 변이체의 정제 결과를 보여준다. 상기 용출 프로필은 환원제 2-머캅토에탄올의 존재 또는 부재하에 분자간 S-S 결합에 의해 형성된 단량체 또는 이량체 형태의 FNIII 9-10 변이체의 SDS 겔 전기영동(오른쪽)의 코마시 블루 염색의 A280 (흡광도) (왼쪽) 및 이미지를 측정함에 의해 분석된다.
도 7A-D는 세포 이동, 세포 생존 및 세포 성장에 대한 다양한 FNIII 단편의 효과의 결과를 보여준다. 도 7A- 왼쪽 패널은 A549 세포 이동에 대한 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) (서열번호 32)의 억제 효과를 요약하는 막대 그래프를 제공하고 오른쪽 패널은 A375 세포에 대한 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 단백질(서열번호 6)의 억제 효과를 요약하는 막대 그래프를 제공한다. 도 7B는 다양한 FNIII 변이체가 A375 흑색종 세포에서 G1 정지를 유도함을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 7C 및 7D는 다양한 FNIII 단편들이 각각 A375 세포 및 A549 세포에서 아폽토시스를 유도함을 보여주는 막대 그래프를 제공한다.
도 8A-B는 9FNIII 9-10 변이체의 열안정성 (A) 및 용해도 (B)를 제공한다.
도 9A-B는 FNIII 10 변이체의 열안정성(A) 및 용해도 (B)를 제공한다.
도 10A-B는 FNIII 9-10 변이체인 인테그린 a5pi-특이적 길항제에 의한 VEGF-유도된 튜브 형성의 억제(A)를 제공하고 9,10Fn3 변이체에 의한 bFGF-유도된 튜브 형성의 억제(B)가 없음을 제공한다.
도 11은 FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) 변이체(서열번호 32)인 인테그린 a5p1-특이적 길항제에 의한 VEGF-유도된 혈관형성의 억제를 제공한다.
도 12는 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체(서열번호 6)인 인테그린 ccvP3-특이적 길항제에 의한 bFGF-유도된 혈관형성의 억제를 제공한다.
도 13은 용량 의존적 방식으로 FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) 변이체(서열번호 32)에 의한 A375 함유 NOD-SCID 마우스에서 종양 성장의 억제를 제공한다.
도 14A-C는 용량 의존적 방식으로 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)에 의한 A549 함유 NOD-SCID 마우스에서 종양 성장의 억제를 제공한다.
도 2는 상이한 포유동물 종: 침팬지(GenBank 승인번호: XP_003309506) (서열번호 66); 소 (DAA32456)(서열번호 67); 야생돼지 (XP_003133691)(서열번호 68); 마우스(BAE28040) (서열번호 69); 및 래트 (EDL75262) (서열번호 70) 기원의 오톨로그와 야생형 사람 FNIII 9-10 (서열번호 4)의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. 표기: "*" 동일한; ":" 보존성 치환; "." 반-보존성 치환.
도 3A-C는 NMR (도 3A), 차등 스캐닝 열량측정 및 황산암모늄 침전 (도 3B, 3C)에 의해 보여지는 바와 같은 야생형 및 돌연변이 FN 단편의 열안정성 및 용해도를 보여준다. 도 3B에서: FNIII 9-10 L1408P- 중간 피크, 정사각형; FNIII 9-10 L1408P (RARGDNPD)- 왼쪽 피크, 삼각형; 및 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDQ- 오른쪽 피크, 원형. 도 3C에서: FNIII 10-중간 피크, 원형; FNIII 10 (PRGDMPD) 단백질(서열번호 48)- 왼쪽 피크, 정사각형; 및 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 단백질 (서열번호 6)- 오른쪽 피크, 삼각형.
도 4는 모듈 9의 A1340D 치환과 모듈 10의 V1422K 치환 사이에 형성된 조작된 상호도메인 수소 결합을 갖는 예시적인 변형된 FNIII 9-10을 도시한 것이다.
도 5A는 인테그린 cc5 서브유닛과 FNIII 9의 상호작용 표면을 보여주는 컴퓨터 기반 모델을 제공한다(오른쪽 패널). 가능한 상호작용 지점이 지적된다. 도 5B는 FNIII 9-10 L1408P-CRA (서열번호 32)-인테그린 결합 복합체의 컴퓨터 도킹 모델, 및 계산된 도킹 에너지를 토대로하는 인테그린 결합 선택성을 보여준다.
도 6A-C는 Ni2 +- 킬레이팅 크로마토그래피에 의한 상이한 FNIII 9-10 변이체의 정제 결과를 보여준다. 상기 용출 프로필은 환원제 2-머캅토에탄올의 존재 또는 부재하에 분자간 S-S 결합에 의해 형성된 단량체 또는 이량체 형태의 FNIII 9-10 변이체의 SDS 겔 전기영동(오른쪽)의 코마시 블루 염색의 A280 (흡광도) (왼쪽) 및 이미지를 측정함에 의해 분석된다.
도 7A-D는 세포 이동, 세포 생존 및 세포 성장에 대한 다양한 FNIII 단편의 효과의 결과를 보여준다. 도 7A- 왼쪽 패널은 A549 세포 이동에 대한 FNIII 9-10 L1408P (CRARGDNPDC) (서열번호 32)의 억제 효과를 요약하는 막대 그래프를 제공하고 오른쪽 패널은 A375 세포에 대한 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 단백질(서열번호 6)의 억제 효과를 요약하는 막대 그래프를 제공한다. 도 7B는 다양한 FNIII 변이체가 A375 흑색종 세포에서 G1 정지를 유도함을 보여주는 막대 그래프를 제공한다. 도 7C 및 7D는 다양한 FNIII 단편들이 각각 A375 세포 및 A549 세포에서 아폽토시스를 유도함을 보여주는 막대 그래프를 제공한다.
도 8A-B는 9FNIII 9-10 변이체의 열안정성 (A) 및 용해도 (B)를 제공한다.
도 9A-B는 FNIII 10 변이체의 열안정성(A) 및 용해도 (B)를 제공한다.
도 10A-B는 FNIII 9-10 변이체인 인테그린 a5pi-특이적 길항제에 의한 VEGF-유도된 튜브 형성의 억제(A)를 제공하고 9,10Fn3 변이체에 의한 bFGF-유도된 튜브 형성의 억제(B)가 없음을 제공한다.
도 11은 FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) 변이체(서열번호 32)인 인테그린 a5p1-특이적 길항제에 의한 VEGF-유도된 혈관형성의 억제를 제공한다.
도 12는 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체(서열번호 6)인 인테그린 ccvP3-특이적 길항제에 의한 bFGF-유도된 혈관형성의 억제를 제공한다.
도 13은 용량 의존적 방식으로 FNIII 9-10 (CRARGDNPDC) 변이체(서열번호 32)에 의한 A375 함유 NOD-SCID 마우스에서 종양 성장의 억제를 제공한다.
도 14A-C는 용량 의존적 방식으로 FNIII 10 (CPRGDMPDC) 변이체 (서열번호 6)에 의한 A549 함유 NOD-SCID 마우스에서 종양 성장의 억제를 제공한다.
Claims (73)
- 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10(FNIII 10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드로서, 여기서, 상기 FNIII 10은 Arg-Gly-Asp (RGD) 모티프, 및 디설파이드 결합을 형성하기 위한 2개의 Cys 치환체를 포함하고, 여기서, 1개의 Cys 치환체는 RGD 모티프의 N-말단에 있고 다른 Cys 치환체는 RGD 모티프의 C-말단에 있으며, 상기 FNIII 10은 서열번호 2와 85% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 인테그린 α5β1 또는 인테그린 ανβ3 활성을 억제하고 인테그린 αIIbβ3 활성을 억제하지 않는, 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 2개의 Cys 치환체가 약 6개 내지 약 9개 아미노산 잔기에 의해 분리되어 있는, 폴리펩타이드.
- 제3항에 있어서, 상기 2개의 치환체가 7개 또는 8개 아미노산 잔기에 의해 분리되어 있는, 폴리펩타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 FNIII 10이 아미노산 위치 1491번, 1492번, 1496번, 1497번 또는 1498번에서 하나 이상의 아미노산 치환체를 추가로 포함하고, 위치 1491번에서의 상기 아미노산 치환체가 Arg 또는 Ile이고, 위치 1492번에서의 상기 아미노산 치환체가 Ala 또는 Pro이고, 위치 1496번에서의 상기 아미노산 치환체가 Met, Asn 또는 Trp이고, 위치 1497번에서의 상기 아미노산 치환체가 Asn이고, 위치 1498번에서의 상기 아미노산 치환체가 Asp 또는 Glu인, 폴리펩타이드.
- 제5항에 있어서, 상기 2개의 Cys 치환체가 아미노산 위치 1491번에서 Thr의 Cys로의 치환 및 아미노산 위치 1499번에서 Ser의 Cys로의 치환이고, 상기 FNIII 10이 화학식 Cys1491-X1-Arg-Gly-Asp-X2-X3-X4-Cys1499(여기서,
X1은 Gly, Ala 또는 Pro이고;
X2는 Ser, Met, Asn 또는 Trp이고;
X3는 Pro 또는 Asn이고;
X4는 Ala, Asp 또는 Glu이다)
를 포함하는, 폴리펩타이드. - 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제6항에 있어서, X1이 Pro이고, X2가 Met이고, X3이 Pro이고, X4가 Asp인, 폴리펩타이드.
- 제8항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 변형된 사람 피브로넥틴 단편이 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 임의로 포함하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9(FNIII 9)를 추가로 포함하고, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10 (FNIII 9-10)이 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제10항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제11항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 인테그린 ανβ3 활성을 억제하는, 폴리펩타이드.
- 제5항에 있어서, 상기 변형된 사람 피브로넥틴 단편이 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 임의로 포함하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9(FNIII 9)를 추가로 포함하고, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10 (FNIII 9-10)이 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제14항에 있어서, 상기 2개의 Cys 치환체가 아미노산 위치 1490번에서 Val의 Cys로의 치환 및 아미노산 위치 1499번에서 Ser의 Cys로의 치환이고, 상기 FNIII 10이 화학식 Cys1490-X1-X2-Arg-Gly-Asp-X3-Pro-X4-Cys1499(여기서,
X1은 Thr, Arg 또는 Ile이고;
X2는 Gly, Ala 또는 Pro이고;
X3은 Phe, Arg, Asp, Ser, Met 또는 Asn이고;
X4는 Ala 또는 Asp이다)
를 포함하는, 폴리펩타이드. - 제15항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 108, 서열번호 109 또는 서열번호 110의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제15항에 있어서, X1이 Arg이고, X2가 Ala이고, X3이 Asn이고, X4가 Asp인, 폴리펩타이드.
- 제17항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제15항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 인테그린 α5β1 활성을 억제하는, 폴리펩타이드.
- 제15항에 있어서, 상기 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9(FNIII 9)가 아미노산 위치 1341번에서 Asn의 Ala로의 치환, 아미노산 위치 1377번에서 His의 Pro로의 치환, 아미노산 1376번에서 Pro의 Lys로의 치환 또는 아미노산 위치 1376번에서 Pro의 Asp로의 치환을 임의로 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113 또는 서열번호 114의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 인테그린 α5β1 활성을 억제하는, 폴리펩타이드.
- 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9 및 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10 (FNIII 9-10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드로서, 상기 FNIII 9가 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 임의로 포함하고, 상기 FNIII 9 및 상기 FNIII 10이 각각 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10에서의 상기 아미노산 치환이 비공유 결합을 형성하고, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10이 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상 상동성이고 서열번호 60이 아닌 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제23항에 있어서, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10에서의 상기 아미노산 치환이 도메인간 디설파이드 결합을 형성하는, 폴리펩타이드.
- 제23항에 있어서, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10에서의 상기 아미노산 치환이 도메인간 수소 결합을 형성하는, 폴리펩타이드.
- 제24항에 있어서, 상기 FIII 9에서의 상기 아미노산 치환이 아미노산 위치 1340번에서 Ala의 Asp로의 치환이고, 상기 FNIII 10에서의 상기 아미노산 치환이 아미노산 위치 1442번에서 Val의 Lys로의 치환인, 폴리펩타이드.
- 제26항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제24항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 인테그린 α5β1 활성을 억제하는, 폴리펩타이드.
- 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9 (FNIII 9) 및 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10(FNIII 10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드로서, 여기서, 상기 FNIII 9가 아미노산 위치 1373번 또는 1379번에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10 (FNIII 9-10)이 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제29항에 있어서, 상기 FNIII 9가 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제30항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 아미노산 위치 1373번에서 Asp의 Arg로의 치환 또는 아미노산 위치 1379번에서 Arg의 Asp로의 치환인, 폴리펩타이드.
- 제31항에 있어서, 상기 FNIII 9가 아미노산 위치 1373번에서 Asp의 Arg로의 치환 및 아미노산 위치 1379번에서 Arg의 Asp로의 치환 둘다를 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제30항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 42, 서열번호 44 또는 서열번호 46의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제33항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 42의 아미노산서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제29항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 인테그린 ανβ3 활성을 억제하는, 폴리펩타이드.
- 아미노산 서열 Val1490-X1-X2-Arg-Gly-Asp-X3-X4-X5-X6-Ser1500 (여기서, X1은 Thr 또는 Arg이고; X2는 Ala 또는 Pro이고; X3은 Met, Trp 또는 Asn이고; X4는 Pro 또는 Asn이고; X5는 Asp 또는 Glu이고; X6은 Ser 또는 Gly이다)를 갖는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 10 (FNIII 10)을 포함하는 변형된 사람 피브로넥틴 단편을 포함하는 분리된 폴리펩타이드로서, 여기서, 상기 FNIII 10이 서열번호 2와 85% 이상 상동성이고 서열번호 50이 아닌 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제36항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 48, 서열번호 52 또는 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제37항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제36항에 있어서, 상기 변형된 피브로넥틴 단편이 아미노산 위치 1408번에서 Leu의 Pro로의 치환을 임의로 포함하는 사람 피브로넥틴 III형 도메인 모듈 9(FNIII 9)를 추가로 포함하고, 상기 FNIII 9 및 FNIII 10이 서열번호 4의 아미노산 서열과 85% 이상 상동성인 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제39항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60 또는 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제40항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩타이드.
- 제36항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 인테그린 α5β1 활성 및/또는 인테그린 ανβ3 활성을 억제하는, 폴리펩타이드.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 치료학적 유효량의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 치료학적 유효량의 폴리펩타이드를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 인테그린-매개된 세포 접착, 성장, 이동 또는 분화를 억제하는 방법으로서, 상기 인테그린이 ανβ3 또는 α5β1인, 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 인테그린이 인테그린 ανβ3인, 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 48 또는 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 인테그린이 인테그린 α5β1인, 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
- 제43항의 약제학적 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 인테그린 매개된 세포 접착, 성장, 이동 또는 분화를 억제하는 방법으로서, 상기 인테그린이 ανβ3 또는 α5β1인, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 인테그린이 인테그린 ανβ3인, 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 48 또는 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
- 제49항에 있어서, 상기 인테그린이 인테그린α5β1인, 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60 또는 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 치료학적 유효량의 폴리펩타이드를 종양 세포와 접촉시킴을 포함하는 종양 세포 성장 또는 종양 전이를 억제하는 방법으로서, 상기 종양 세포가 α5β1 또는 ανβ3을 발현하는, 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 48, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 또는 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 종양이 폐 암종, 유방 종양, 결장 종양, 골육종, 췌장 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 교모세포종, 전립선 종양, 간 종양 또는 흑색종인, 방법.
- 제43항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는 포유동물에서 종양 성장 또는 종양 전이를 억제하는 방법으로서, 상기 종양이 α5β1 또는 ανβ3을 발현하는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 48, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60 또는 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 종양이 폐 암종, 유방 종양, 결장 종양, 골육종, 췌장 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 교모세포종, 전립선 종양, 간 종양 또는 흑색종인, 방법.
- 제44항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 종양 진행을 억제하는 방법으로서, 상기 종양 세포가 ανβ3 또는 α5β1을 발현하는, 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 인테그린이 ανβ3이고, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 48 또는 서열번호 60의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 인테그린이 α5β1이고, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 또는 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는, 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 종양이 폐 암종, 유방 종양, 결장 종양, 골육종, 췌장 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 교모세포종, 전립선 종양, 간 종양 또는 흑색종인, 방법.
- 제43항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 종양 전이를 억제하는 방법으로서, 상기 종양 세포가 ανβ3 또는 α5β1을 발현하는, 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 48, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60 또는 서열번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 종양이 폐 암종, 유방 종양, 결장 종양, 골육종, 췌장 종양, 난소 종양, 자궁 종양, 교모세포종, 전립선 종양, 간 종양 또는 흑색종인, 방법.
- 제43항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함을 포함하는, 포유동물에서 혈관형성 관련된 질환을 억제하는 방법으로서, 상기 혈관형성-관련된 질환이 암, 황반 퇴화, 부종 또는 관절염인, 방법.
- 제67항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 20, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 48, 서열번호 56, 서열번호 58, 서열번호 60, 서열번호 62 또는 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 폴리페타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
- 제69항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 21, 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 51, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 57, 서열번호 59, 서열번호 61 또는 서열번호 71의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
- 제69항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
- 제71항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- (a) 발현 벡터로부터 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 허용하기에 효과적인 조건하에서 제72항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양물로부터 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
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