KR20220167383A

KR20220167383A - 엑소좀 회수 방법

Info

Publication number: KR20220167383A
Application number: KR1020227039477A
Authority: KR
Inventors: 슌메이 치바; 메이 치바
Original assignee: 풀스템 코., 엘티디.
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2022-12-20
Also published as: US11613734B2; WO2022259525A1; US20220396771A1; CN115707336A; KR20220167354A; EP4123018A4; EP4123018A1; CN117778304A

Abstract

간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀을 효율적으로 대량 회수하는 방법을 제공한다. 당을 함유하는 배지에서 3차원 구조의 부직포를 스캐폴드로 하여 간엽계 줄기세포를 3차원 배양하는, 3차원 배양 공정과, 간엽계 줄기세포의 당소비량이 정체되고 나서 추가로 일정 시간 배양하는, 플래토 상태 후 배양 공정과, 간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀을 회수하는, 엑소좀 회수 공정을 갖는 것을 특징으로 한다. 간엽계 줄기세포는 예를 들어 지방 유래 간엽계 줄기세포다.

Description

엑소좀 회수 방법{METHOD OF COLLECTING FOR EXOSOME}

본 발명은, 간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀 회수 방법에 관한 것이다.

간엽계 줄기세포(mesenchymal stem cell : MSC)는, 간엽 조직 즉 중배엽 유래의 결합 조직에 존재하는, 다분화능을 가진 줄기세포다. 간엽계 줄기세포는 미분화 상태로 염증 억제 효과, 세포 증식 촉진 효과, 혈관신생 촉진 효과 등을 가진 사이토카인·증식 인자를 분비하고, 파라크린을 개재하여 조직 재생을 지지하는 것도 밝혀져 있다(비특허문헌 1). 미분화 간엽계 줄기세포가 분비하는 분자군은 한정된 특정 질환에 한정되지 않고, 다양한 질환에 대하여 치료 효과를 갖는다. 간엽계 줄기세포를 재생하고 싶은 조직 세포로 분화 유도하지 않고, 게다가 세포에 대하여 유전자 변형 등의 인위적인 조작을 전혀 가하지 않으며, 나이브한 간엽계 줄기세포를 이용함으로써 조직 재생이 가능해진다.

엑소좀은, 단백질, 지질 및 RNA를 세포 간에서 이동시킴으로써 세포 간의 정보 전달을 매개할 수 있다(비특허문헌 2, 3). 엑소좀에 포함되는 단백질, microRNA, mRNA 등의 분자는, 유래하는 세포와 유사한 기능이 구비되어 있음이 판명되어 있다. 따라서, 폭넓은 질환에 대한 세포 치료의 원료로서 주목받고 있는 간엽계 줄기세포가 분비하는 엑소좀에는, MSC와 마찬가지의 치료 효과가 구비되어 있는 것으로 기대된다(비특허문헌 4).

특허문헌 1에는, 배양된 신경 줄기세포주(NSCL)로부터 단리된 엑소좀이 기재되어 있다. 이 엑소좀은, 섬유아세포의 이동, 인간제대정맥 내피세포의 분기, 및, 신경돌기의 신장을 촉진할 수 있다.

엑소좀은 줄기세포에 비하여 동물 혈청을 상대적으로 적게 함유하여, 동물 혈청 감염에 의한 증상의 위험성도 배제할 수 있다. 따라서 엑소좀을 이용한 세포 치료법은 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있다.

엑소좀의 회수법으로는 초원심법이나 침전법 등의 방법이 있으나, 이들 방법으로는 치료에 필요한 엑소좀 양을 대량 회수하기 어렵다. 그래서 특허문헌 2에는, 스핑고이드 염기를 사용하는 엑소좀 회수 방법이 개시되어 있다. 그러나 특허문헌 2에 기재된 엑소좀 회수 방법은, 알츠하이머병을 치유하기 위하여 신경 세포의 엑소좀 회수에 한정되어 있다.

비특허문헌 5에는, 항CD63 항체를 고정화한 디바이스를 제작하고, 수백㎕의 혈청 샘플로부터 소포(vesicle)의 단리 및 회수를 실시하는 마이크로유체 시스템을 사용하는 수법이 개시되어 있다. 그러나 비특허문헌 5에 기재된 엑소좀 회수 방법은, 항체에 의한 포착이므로 여전히 회수량이 충분하지 않고, 대량으로 회수하는 기술의 구축이 필요하다.

특허문헌 1 : 국제공개 제2013/150303호 특허문헌 2 : 일본 특허공개 2019-156786호 공보

비특허문헌 1 : Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J, Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (2007) 2739-2749 비특허문헌 2 : Simons and Raposo, Curropin Cell Biology 2009;21:575-581 비특허문헌 3 : Skog et al.,Nat Cell Biology 2008;10:1470~1476; Valadi et al. ,Nat Cell Biology 2007;9:654~659 비특허문헌 4 : Katsuda T, Kosaka N, Takeshita F, Ochiya T. The therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Proteomics. 13 (2013) 1637-1653. 비특허문헌 5 : Chen, C., Skog, J., Hsu, C., Lessard, R. T., Balaj, L., Wurdinger, T., Carter, B. S., Breakefield, X. O., Toner, M., Irimia, D. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab Chip. 10, 505-511(2010)

본 발명은 이러한 문제점을 감안하여 이루어진 것이며, 간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀을 대량으로 회수하는 엑소좀 회수 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 엑소좀 회수 방법은, 간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀 회수 방법으로서, 상기 간엽계 줄기세포에 대사되는 배지 중의 물질량을 계측하면서, 부직포를 스캐폴드로 하여 상기 배지 중에서 간엽계 줄기세포를 3차원 배양하는, 3차원 배양 공정과, 상기 배지 중의 상기 물질량이 정체된 후에 추가로 일정 시간 배양하는, 플래토(plateau) 상태 후 배양 공정과, 상기 일정 시간 배양 후에, 상기 간엽계 줄기세포로부터 엑소좀을 회수하는, 엑소좀 회수 공정을 갖는 것을 특징으로 한다. 여기서 엑소좀이란, 세포로부터 세포 외로 방출된 막소포다. 엑소좀에는, 지질 이중막의 주머니 내에 엑소좀을 방출한 세포 유래의 miRNA, mRNA, lncRNA, 단백질, 대사 소분자 화합물 등이 포함된다.

본 발명에 의하면, 간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀을 효율적으로 대량 회수할 수 있게 된다.

도 1은 골수 유래 간엽계 줄기세포에서, 부직포를 스캐폴드로 하는 배양의 당소비량과 배양 시간의 관계를 나타내는 도면이다.
도 2는 지방 유래 간엽계 줄기세포에서, 부직포를 스캐폴드로 하는 배양의 당소비량과 배양 시간의 관계를 나타내는 도면이다.
도 3은 골수 유래 간엽계 줄기세포 및 지방 유래 간엽계 줄기세포에서, 최종 세포수에 의해 보정한 엑소좀 수를, 부직포 배양(3D)과 배양접시 배양(2D)으로 비교하는 도면이다.
도 4는 골수 유래 간엽계 줄기세포에서, NTA 측정에 의한 엑소좀 수를 부직포 배양(3D)과 배양접시 배양(2D)으로 비교하는 도면이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시형태에 대하여 구체적으로 설명하는데, 본 실시형태는 본 발명의 원리 이해를 용이하게 하기 위한 것이며, 본 발명의 범위는 하기 실시형태에 한정되는 것이 아니고, 당업자가 이하의 실시형태의 구성을 적절히 치환시킨 다른 실시형태도, 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 따른 엑소좀 회수 방법은, (1) 간엽계 줄기세포에 대사되는 배지 중의 물질량을 계측하면서, 부직포를 스캐폴드로 하여 상기 배지 중에서 간엽계 줄기세포를 3차원 배양하는, 3차원 배양 공정과, (2) 배지 중의 물질량이 정체된 후에 추가로 일정 시간 배양하는, 플래토 상태 후 배양 공정과, (3) 일정 시간 배양 후에, 간엽계 줄기세포로부터 엑소좀을 회수하는, 엑소좀 회수 공정을 갖는다. 즉 부직포를 스캐폴드로 하여 간엽계 줄기세포를 배양하는 것뿐만 아니라, 세포가 대사함으로써 그 세포가 배지 중의 물질을 소비하는 양 또는 세포로부터 배지 중으로 산생되는 양이 정체된 후에 일정 시간 배양함으로써, 간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀 회수량을 현저히 증대시키는 것을 본 발명자는 새로운 지견으로서 알아내고, 이러한 사실에 기초하여 본 발명을 완성시켰다.

(1) 3차원 배양 공정

3차원 배양 공정에서는, 간엽계 줄기세포에 대사되는 배지 중의 물질량을 계측하면서, 부직포를 스캐폴드로 하여, 배지 중에서 간엽계 줄기세포를 3차원 배양한다(그리고 본 명세서에서는 3차원을 3D로 기재하는 경우가 있다).

엑소좀이 산생되는 간엽계 줄기세포는, 간엽계에 속하는 세포이고, 1종 이상의 세포(골 세포, 심근 세포, 연골 세포, 건세포, 지방 세포 등), 바람직하게는 2 이상의 세포, 보다 바람직하게는 3 이상의 세포로의 분화능을 가지며, 당해 능력을 유지한 채 증식할 수 있는 세포를 의미한다. 간엽계 줄기세포를 포함하는 조직으로는, 예를 들어, 지방 조직, 제대, 골수, 제대혈, 자궁내막, 태반, 양막, 융모막, 탈락막, 진피, 골격근, 골막, 치소낭, 치근막, 치수, 치배 등을 들 수 있다. 구체적으로 간엽계 줄기세포는, 지방 유래 간엽계 줄기세포(ADSC로 기재하는 경우가 있음), 골수 유래 간엽계 줄기세포(BMSC로 기재하는 경우가 있음), 제대 유래 간엽계 줄기세포, 태반 유래 간엽계 줄기세포, 치수 유래 간엽계 줄기세포 등을 들 수 있고, 지방 유래 간엽계 줄기세포, 또는 골수 유래 간엽계 줄기세포가 바람직하고, 특히 지방 유래 간엽계 줄기세포가 바람직하다.

지방 유래 간엽계 줄기세포는, 골수 유래 간엽계 줄기세포와 비교하여, 세포 증식이 빠르고, 재생 촉진 인자를 많이 분비하며, 면역억제능이 높다는 유리한 특징을 갖는다. 또한, 지방 유래 간엽계 줄기세포는, 복부 또는 둔부의 지방 조직으로부터 얻어지므로, 골수를 채취할 필요가 있는 골수 유래 간엽계 줄기세포와 비교하여, 안전하게 충분한 양을 확보하기 쉽다는 유리한 특징도 갖는다. 또한, 환자의 자가지방조직 유래의 간엽계 줄기세포를 환자 치료에 이용하는 것은, 윤리적 문제가 없고, 면역거부 반응이 없으며, 감염증 등의 문제가 적고, 정맥 투여로 치료 효과가 있는 등의 점에서 우수하다.

배지는 간엽계 줄기세포용 배지이고, 예를 들어, DMEM, MEMα, DMEM/F12, MEM 등을 들 수 있다. 간엽계 줄기세포가 대사함으로써 소비되는 배지 중의 물질은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 당이고, 당 중에서는 글루코스가 바람직하다. 간엽계 줄기세포가 대사함으로써 배지 중으로 산생되는 물질은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 LDH, 락트산 등을 들 수 있다.

사용되는 스캐폴드는 부직포이다. 부직포의 중량은, 1~500g/㎡이면 되고, 예를 들어, 50~200g/㎡인 것이 바람직하다. 부직포는, 친수화 처리된 부직포여도 된다. 부직포의 친수화는, 플루오르 가스 처리, 상압 플라즈마 처리, 진공 플라즈마 처리, 코로나 처리, 친수성 단량체의 그래프트중합 처리, 설폰화 처리, 또는 계면활성제 부여 처리에 의하여 실시할 수 있고, 플루오르 가스 처리, 상압 플라즈마 처리가 바람직하다.

부직포를 구성하는 섬유는 폴리올레핀계 중합체인 것이 바람직하고, 폴리올레핀계 중합체로는 예를 들어, 에틸렌, 프로필렌, 1-부텐, 1-펜텐, 3-메틸-1-부텐, 1-헥센, 1-옥텐, 1-도데센, 1-옥타데센 등을 들 수 있다.

부직포를 구성하는 섬유는, 섬유 직경이 작은 섬유인 것이 바람직하고, 평균 섬유 직경은 바람직하게는 200㎛ 이하, 보다 바람직하게는 10~100㎛, 특히 바람직하게는 15~50㎛다. 섬유에는, 상대적으로 섬유 직경이 큰 섬유와 상대적으로 섬유 직경이 작은 섬유가 혼재하여도 된다.

부직포는 다공질성을 갖는 것이 바람직하다. 다공질성은 조직을 재생시키는 데 필요한 세포로의 충분한 산소 및 영양을 보급하고, 이산화탄소나 노폐물을 신속하게 배출하는 의미에서 중요하다. 또한 다공질성을 가짐으로써 비표면적이 커지고 세포접착성이 높아진다. 이러한 경우의 평균 구멍 직경은, 예를 들어, 5㎛~200㎛, 20㎛~100㎛, 25㎛~100㎛, 30㎛~100㎛, 35㎛~100㎛, 40㎛~100㎛, 50㎛~100㎛ 또는 60㎛~100㎛이며, 바람직하게는, 50㎛~300㎛다.

부직포의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 부직포 시트다. 부직포 시트는, 두께 방향으로 관통한 복수의 관통공을 구비하는 것이 바람직하다. 부직포 시트의 총 막 두께는, 예를 들어, 5㎛ 이상, 10㎛ 이상, 20㎛ 이상 또는 25㎛ 이상이어도 되고, 500㎛ 이하, 300㎛ 이하, 100㎛ 이하, 75㎛ 이하 또는 50㎛ 이하여도 된다. 바람직하게는 30~2000㎛이고, 보다 바람직하게는 500~1000㎛이다.

이 3차원 배양 공정에서는, 간엽계 줄기세포에 대사되는 배지 중의 물질량을 계측하면서 간엽계 줄기세포를 3차원 배양하고, 배지 중의 이 물질량이 정체될 때까지 배양을 계속한다. 배양접시를 스캐폴드로 하는 세포 배양에서는 2차원적으로 세포가 증식되어 가므로, 배양접시의 표면에 세포가 전부 덮은 상태는 파악하기 쉽다. 그러나 부직포를 스캐폴드로 하는 세포 배양에서는 3차원적으로 세포가 증식되어 가므로, 부직포를 세포가 전부 덮은 상태는 파악하기 어렵다. 그래서, 세포가 소비 또는 생산하는 배지 중의 물질량이 정체될 때까지 배양을 계속한다.

세포가 소비 또는 산생하는 배지 중의 물질량의 측정은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 세포가 소비하는 배지 중의 물질량의 측정인 경우는, 배양 시간마다 간엽계 줄기세포의 당소비량을 측정한다. 바람직하게는 전술한 바와 같이 배지 중의 글루코스 양을 측정한다. 간엽계 줄기세포의 글루코스 소비량을 측정하는 경우는, 세포 배양 상청 중의 글루코스 양을 측정하는 시판의 글루코스 검사 키트를 사용할 수 있고, 세포 내에 포함된 2-데옥시글루코스에 산소를 반응시켜 측정할 수 있다.

세포가 소비 또는 산생하는 배지 중의 물질량이 정체됨의 판정은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 배지 중의 물질량과 배양 날짜의 그래프를 작성하고, 거기에서 근사선으로서의 일차함수(y=ax+b)를 도출하고, 그 일차함수의 기울기(a)가 변동이 없어지는 경우를 물질량이 정체된다고 판정한다. 근사선으로서의 일차함수의 기울기(a)가 변동이 없어지는 경우란 예를 들어 -0.1≤a≤0.1이고, 바람직하게는 -0.01≤a≤0.01이며, 보다 바람직하게는 a=0이다. 배지 중의 물질량이 정체됨의 판정에는, 배지 중의 물질량과 배양 날짜의 관계식의 근사선인 일차함수(y=ax+b)의 기울기(a)가 변동이 없어지는 경우뿐만 아니라 배지 중의 소비량 또는 산생량이 마이너스가 되는 경우를 포함시켜도 된다. 근사선으로서의 일차함수의 기울기(a)가 마이너스가 되는 경우란 예를 들어 -0.5≤a≤-0.01이고, 바람직하게는 -0.1≤a≤-0.05이다.

(2) 플래토 상태 후 배양 공정

플래토 상태 후 배양 공정에서는, 간엽계 줄기세포의 배지 중의 물질량이 정체되고 나서 추가로 일정 시간 배양한다.

배지 중의 물질량이 정체되고 나서의 배양 시간은, 특별히 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 12시간~72시간, 바람직하게는 18시간~66시간, 더 바람직하게는 24시간~60시간, 특히 바람직하게는 36시간~54시간, 가장 바람직하게는 48시간이다.

(3) 엑소좀 회수 공정

마지막으로 간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀을 회수한다. 전술한 플래토 상태 후 배양 공정 완료 후에는 대량의 엑소좀이 산생되고, 산생된 대량의 엑소좀의 회수는 통상적으로 이용되는 수법을 이용할 수 있다. 엑소좀의 회수법으로는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 초원심법을 들 수 있다. 초원심법으로는 예를 들어 펠릿다운법, 수크로스쿠션법, 밀도구배원심법 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 엑소좀 회수 방법을 사용함으로써 취득되는 엑소좀은, 엑소좀 함유 제제로서 이용할 수 있다. 엑소좀 함유 제제의 형태는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 주사제, 현탁제, 용액제, 스프레이제와 같은 액제여도 되고, 시트형 제제나 겔형 제제여도 된다.

엑소좀 함유 제제는, 그 이용 방법은 한정되지 않고, 예를 들어, 피험체로 직접 투여하기 위하여 이용하거나, 또는 생체 외에서 이루어지는 조직이나 기관 재구축을 위한 공급원으로서 이용할 수 있다.

엑소좀 함유 제제는 질환 또는 장애 치료에 이용할 수 있다. 대상으로 할 수 있는 질환 또는 장애는, 면역성 질환, 허혈성 질환(하지허혈, 허혈성 심장질환(심근경색 등), 관동맥성 심장질환, 뇌혈관허혈, 신장허혈, 폐허혈 등), 신경성 질환, 크론병, 이식편대숙주병(GVHD), 궤양성 대장염을 포함하는 염증성 장질환, 전신홍반루푸스를 포함하는 교원병, 간경변, 뇌경색, 뇌내혈종, 뇌혈관 경련, 방사선 장염, 아토피성 피부염, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선, 홍반성낭창, 당뇨병, 균상식육종(Alibert-Bazin 증후군), 강피증, 연골 등의 결합조직의 변성 및/또는 염증에서 일어나는 질환, 안질환, 혈관신생 관련질환, 울혈성 심부전, 심근증, 창상, 상피손상, 섬유증, 폐질환, 암 등의 질환이나 장애를 들 수 있다.

또한, 엑소좀 함유 제제는, 미용 목적 치료, 처치 또는 개선에도 이용할 수 있다. 미용 목적이란, 순수하게 건강 상태를 위한 미용을 목적으로 하는 것뿐만 아니라, 수술 후 또는 외상 후의 변형 및 선천성 변형에 대한 미용 치료도 포함된다. 예를 들어, 유방의 조직증대술(가슴확대수술, 유방재건), 볼 또는 상하안검의 함몰에 대한 조직증대술, 그리고 페리-롬버그 증후군, 안면 또는 누두흉에 대한 조직 증대술에 이용할 수 있다.

엑소좀 함유 제제는, 엑소좀 이외에 약학적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함유시켜도 된다. 이와 같은 담체나 첨가물로는, 예를 들어, 등장화제, 증점제, 당류, 당알코올류, 방부제(보존제), 살균제 또는 항균제, pH조절제, 안정화제, 킬레이트제, 유성기제, 겔기제, 계면활성제, 현탁화제, 결합제, 부형제, 활택제, 붕괴제, 발포제, 유동화제, 분산제, 유화제, 완충제, 용해보조제, 항산화제, 감미제, 산미제, 착색제, 정미제, 향료 또는 청량화제 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

실시예

1. 부직포(3D)를 스캐폴드로 하는 엑소좀의 대량 회수(실시예)

이하에, 부직포(3D)를 스캐폴드로 하여 배양하고 그 후 당소비량이 정체된 상태에서의 배양 후의 엑소좀 대량 회수에 따른 실시예를 기재한다.

1-1. 3차원 배양 공정

3차원 배양 공정에서는, 세포의 당소비량(본 실시예에서는 배지 중의 글루코스 소비량)이 정체될 때까지 부직포를 스캐폴드로 하여 세포를 3차원 배양하였다.

골수 유래 간엽계 줄기세포(BMSC) 및 지방 유래 간엽계 줄기세포(ADSC)를 스캐폴드에 파종하였다. 스캐폴드는, 3차원 구조체인 부직포(3D, BioNOCII, CESCO사, 비접착성 24well plate(PrimeSurface(등록 상표) 스미토모 베이클라이트) 사용)를 사용하였다.

BMSC는 각 well에 6×10³개 파종하고, ADSC는 각 well에 4×10⁴개 파종하였다. 기초 배지는, 10% FBS/DMEM F12(시그마) 1.5㎖였다. 그리고 DMEM/F12는, DMEM(DMEM는 글루코스를 포함함)과 Ham's F-12를 1:1로 혼합한 배지이며, FBS를 배지에 대하여 10% 첨가하여 사용하였다.

Day2부터 1.5㎖씩 매일 배지를 교환하고, 사용이 완료된 배양액의 당소비량을 측정하였다. 세포의 당소비량이 정체될 때까지 배양하였다. 당소비량이 정체될 때까지의 배양 시간은 BMSC에서는 10일간이었다. 당소비량이 정체될 때까지의 배양 시간은 ADSC에서는 8일간이었다.

1-2. 플래토 상태 후 배양 공정

플래토 상태 후 배양 공정에서는, 세포의 당소비량이 정체되고 나서 일정 시간 세포를 3차원 배양하였다.

즉, BMSC 및 ADSC의 당소비량이 정체되기 시작하고 나서 바로 배지를 바꾸었다. 배지는 DMEM F12에 10% ExoFBS(후나코시)를 첨가한 것을 사용하였다. 배지를 변경하고 나서 BMSC 및 ADSC에서 48시간 배양하였다. 즉, BMSC에서는 10일간 배양 후, 당소비량이 정체되었으므로, 배지를 DMEM F12+10% ExoFBS로 변경하여 추가로 48시간 배양하였다. ADSC에서는 8일간 배양 후, 당소비량이 정체되었으므로, 배지를 DMEM F12+10% ExoFBS로 변경하여 추가로 48시간 배양하였다.

1.3. 엑소좀 회수 공정

BMSC 및 ADSC에서 48시간 후의 배양 상청 1.5㎖ 전량을 회수하였다. 회수한 배양 상청으로부터 초원심법으로 엑소좀을 회수하였다. 또한 스캐폴드로부터 세포를 박리하여 최종 세포수를 계측하였다.

2. 배양접시(2D)를 스캐폴드로 하는 엑소좀의 회수(비교예)

이하에, 배양접시(2D)를 스캐폴드로 하여 배양하고 그 후 당소비량이 정체된 상태에서의 배양 후의 엑소좀 회수에 따른 비교예를 기재한다.

BMSC 및 ADSC를 스캐폴드에 파종하였다. 스캐폴드는 6㎝ 배양접시(2D, 접착성 세포 배양 접시, 스미토모 베이클라이트)를 사용하였다. BMSC는 각 well에 6×10³개 파종하고, ADSC는 각 well에 4×10⁴개 파종하였다. 기초 배지는, 10% FBS/DMEM F12(시그마) 1.5㎖였다.

다음으로, BMSC 및 ADSC의 당소비량이 정체되기 시작하고 나서 바로 배지를 바꾸었다. 배지는 DMEM F12에 10% ExoFBS(후나코시)를 첨가한 것을 사용하였다. 배지를 변경하고 나서 BMSC 및 ADSC에서 48시간 배양하였다.

BMSC 및 ADSC에서 48시간 후의 배양 상청 1.5㎖ 전량을 회수하였다. 회수한 배양 상청으로부터 엑소좀을 회수하였다.

3. 당소비량이 정체되기 전에 배양한 후의 엑소좀의 회수(비교예)

이하에, 당소비량이 정체되기 전에 배양한 후의 엑소좀의 회수에 따른 비교예를 기재한다.

BMSC 및 ADSC를 스캐폴드에 파종하였다. 스캐폴드는, 3차원 구조체인 부직포(3D, BioNOCII, CESCO사, 비접착성 24well plate(PrimeSurface(등록 상표) 스미토모 베이클라이트) 사용)와, 6㎝ 배양접시(2D, 접착성 세포 배양접시, 스미토모 베이클라이트)를 사용하였다. BMSC는 부직포 스캐폴드와 배양접시 스캐폴드의 각 well에 6×10³개 파종하고, ADSC는 부직포 스캐폴드와 배양접시 스캐폴드의 각 well에 4×10⁴개 파종하였다. 기초 배지는, 10% FBS/DMEM F12(시그마) 1.5㎖였다.

Day2부터 1.5㎖씩 매일 배지를 교환하고, 사용이 완료된 배양액의 당소비량을 측정하였다. BMSC 및 ADSC 둘 다, 부직포 스캐폴드 및 배양접시 스캐폴드에서, 세포의 당소비량이 정체되기 전 단계인 Day7까지 배양하였다.

다음으로, Day7 후에 즉시 배지를 바꾸었다. 배지는 DMEM F12에 10% ExoFBS(후나코시)를 첨가한 것을 사용하였다. 배지를 변경하고 나서 BMSC 및 ADSC 둘 다, 부직포 스캐폴드 및 배양접시 스캐폴드에서, 48시간 배양하였다. 48시간 후의 배양 상청 1.5㎖ 전량을 회수하였다. 회수한 배양 상청으로부터 엑소좀을 회수하였다.

4. 엑소좀 평가

4-1. 3차원 구조체인 부직포를 사용한 효과

전량 회수한 배양 상청 1.5㎖ 내, 평가 항목당 50㎕씩을 ExoCounter(JVCKENWOOD)로 측정(CD63 및 CD81을 엑소좀마커로서 정량)하였다.

도 1은 BMSC에서, 부직포를 스캐폴드로 하는 배양의 당소비량과 배양 시간의 관계다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 플롯값으로부터, 근사선 y=5.4833x+4.287이며, Day10에서의 당소비량은 정체 상태인 것이 확인되었다.

도 2는 ADSC에서, 부직포를 스캐폴드로 하는 배양의 당소비량과 배양 시간의 관계다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 플롯값으로부터, 근사선 y=7.0952x-3.8571이며, Day8에서의 당소비량은 정체 상태인 것이 확인되었다.

각각의 세포 스캐폴드의 최종 세포수로 각각 보정한 엑소좀 산생량의 비교 검토를 시도하였다.

먼저 하기 표 1은 BMSC 및 ADSC의 세포수를 나타낸다.

[표 1]

ExoCounter로 계측된 엑소좀의 수치에서, 각각의 검체의 최종 세포수에 의한 보정값으로, 도면을 작성하였다(도 3). 세포수당 엑소좀 수는, BMSC에 있어서는, CD63에서는 3D 부직포 배양이 2D 배양접시 배양보다 x1.23이고, CD81에서는 3D 부직포 배양이 2D 배양접시 배양보다 x1.39였다. 또한, 세포수당 엑소좀 수는, ADSC에 있어서는, CD63에서는 3D 부직포 배양이 2D 배양접시 배양보다 x2.08이고, CD81에서는 3D 부직포 배양이 2D 배양접시 배양보다 x1.74였다.이와 같이 BMSC 및 ADSC 둘 다, 부직포(3D) 배양으로부터의 엑소좀 회수법에 있어서, 엑소좀 산생량이 증가했음이 실증되었다.

BMSC에 관해서는, NTA측정(입자 분포, 세포수비 보정값(3D/2D ratio))을 실시하고, 비교 검토하였다. NTA측정값(3D: 10.1x10⁹개, 2D: 7.1x10⁹개)으로부터, 3D/2D ratio는, x1.46이고, 상기 표 1의 세포수비(x1.18)를 이용하여 보정한 엑소좀 양 증가는, x1.24였다(도 4). 즉 NTA 측정으로도 엑소좀 산생량이 증가했음이 실증되었다.

4-2. 당소비량이 정체될 때까지 배양한 효과

BMSC 및 ADSC 둘 다, 부직포 스캐폴드(3D) 및 배양접시 스캐폴드(2D)에서, 세포의 당소비량이 정체되기 전 단계인 Day7까지 배양한 경우, 부직포 스캐폴드에서는 세포수는 1.11±0.04x10⁵개이고, 배양접시 스캐폴드에서는 1.43±0.12x10⁵개였다. 세포수의 비율은 부직포 스캐폴드(3D)/배양접시 스캐폴드(2D) ratio=x0.776이었다.

다음으로 CD63 엑소좀 산생량은, 부직포 스캐폴드(3D)에서는 145,863이고, 배양접시 스캐폴드(2D)에서는 189,653이었다. CD63 엑소좀 산생량의 비율은 3D/2D ratio=x0.769였다. 세포수비로 엑소좀 산생량의 비율을 보정하면 0.99가 되어 부직포 스캐폴드(3D)를 사용하여도 엑소좀 산생량이 증대하는 것이 아님이 판명되었다.

다음으로 CD81 엑소좀 산생량은, 부직포 스캐폴드(3D)에서는 139,287이고, 배양접시 스캐폴드(2D)에서는 186,584였다. CD81 엑소좀 산생량의 비율은 3D/2D ratio=x0.747이었다. 세포수비로 엑소좀 산생량의 비율을 보정하면 0.96이 되어 부직포 스캐폴드(3D)를 사용하여도 엑소좀 산생량이 증대하는 것은 아니었다.

이와 같이 BMSC 및 ADSC 둘 다, 단지 부직포(3D) 배양만으로는 엑소좀 산생량을 증대시킬 수는 없고, (a) 부직포(3D)를 스캐폴드로 하여 배양하고 (b) 그 후 당소비량이 정체된 상태에서 배양함으로써, 엑소좀 대량 회수가 가능한 것이 실증되었다.

엑소좀의 대량 산생에 이용할 수 있다.

Claims

간엽계 줄기세포로부터의 엑소좀 회수 방법으로서,
상기 간엽계 줄기세포에 대사되는 배지 중의 물질량을 계측하면서, 부직포를 스캐폴드로 하여 상기 배지 중에서 간엽계 줄기세포를 3차원 배양하는, 3차원 배양 공정과,
상기 배지 중의 상기 물질량이 정체된 후에 추가로 일정 시간 배양하는, 플래토 상태 후 배양 공정과,
상기 일정 시간 배양 후에, 상기 간엽계 줄기세포로부터 CD63 및 CD81을 가지는 엑소좀을 회수하는, 엑소좀 회수 공정
을 갖는 것을 특징으로 하는 엑소좀 회수 방법.
제1항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포에 대사되는 상기 배지 중의 물질은 당이고,
상기 간엽계 줄기세포의 배양 시간에 대한 당소비량을 계측하고,
상기 플래토 상태 후 배양 공정은, 상기 당소비량이 정체되고 나서 추가로 일정 시간 배양하는 것을 특징으로 하는 엑소좀 회수 방법.
제2항에 있어서,
상기 플래토 상태 후 배양 공정에서, 상기 간엽계 줄기세포의 배양 시간에 대한 당소비량 계측으로는 글루코스의 소비량을 계측하는 것을 특징으로 하는 엑소좀 회수 방법.
제3항에 있어서,
상기 플래토 상태 후 배양 공정에서, 상기 물질량이 정체되고 나서의 배양 시간은, 24시간 이상 72시간 이하인 것을 특징으로 하는 엑소좀 회수 방법.
제4항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포는, 지방 유래 간엽계 줄기세포인 것을 특징으로 하는 엑소좀 회수 방법.
제5항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포가 지방 유래 간엽계 줄기세포인 경우, 상기 3차원 배양 공정의 지방 유래 간엽계 줄기세포의 배양 시간은 7일 이상 9일 이하인 것을 특징으로 하는 엑소좀 회수 방법.
제4항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포는, 골수 유래 간엽계 줄기세포인 것을 특징으로 하는 엑소좀 회수 방법.
제7항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포가 골수 유래 간엽계 줄기세포인 경우, 상기 3차원 배양 공정의 골수 유래 간엽계 줄기세포의 배양 시간은 9일 이상 11일 이하인 것을 특징으로 하는 엑소좀 회수 방법.