CN111139220B - 脐带间充质干细胞的三维培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脐带间充质干细胞的三维培养方法。该脐带间充质干细胞的三维培养方法包括以下步骤：将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中，然后在水平转速为20rpm～40rpm条件下旋转培养脐带间充质干细胞，其中，细胞培养器的底部的内表面为弧面，底部的内表面经抗细胞贴附处理。上述脐带间充质干细胞的三维培养方法能够提高脐带间充质干细胞所分泌外泌体的产量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种脐带间充质干细胞的三维培养 方法。
背景技术
外泌体是由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成，并主动 分泌至胞外的大小均一，分子直径为40nm～100nm的亚细胞双层膜囊泡，其内 含有与细胞来源相关的蛋白质、miRNA及mRNA等物质。外泌体既可以通过质 膜受体直接激活受体细胞，也可以转运蛋白质、miRNA及mRNA甚至细胞器进 入受体细胞内，同时也可以携带处于不同病例状态下的细胞所含有的特异性物 质，从而在生理学和病理学上都发挥着重要的作用。
脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)，具 有自我更新和多向分化潜能，在一定条件下能分化成多种成体细胞，可参与受 损组织的再生修复。近年来，随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌的 外泌体已成为研究热点。
传统的脐带间充质干细胞培养采用二维培养方法(平面法)，培养面的面积 限制了干细胞的扩增倍数，产量少，不能满足市场对外泌体的需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种脐带间充质干细胞的三维培养方法，该以三维培 养方法培养的脐带间充质干细胞分泌外泌体的量高。
一种脐带间充质干细胞的三维培养方法，包括以下步骤：
将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中，然后在水平转速为20rpm～40 rpm条件下旋转培养所述脐带间充质干细胞，其中，所述细胞培养器的底部的内 表面为弧面，所述底部的内表面经抗细胞贴附处理。
上述脐带间充质干细胞的三维培养方法通过将脐带间充质干细胞接种搭配 底部经抗细胞贴附处理的细胞培养器中，并在水平转速为20rpm～40rpm条件下 旋转培养，使得脐带间充质干细胞在培养过程中维持细胞团块的三维构象从而 模拟细胞在体内的生长环境，使脐带间充质干细胞之间接触紧密，分子信号交 流更加频繁，促进干细胞各种细胞因子表达水平的提高，提高外泌体表达量， 提高外泌体的产量高。
在其中一个实施例中，所述弧面为圆弧面，所述细胞培养器为U型细胞板。
在其中一个实施例中，所述旋转培养的水平转速为30rpm。
在其中一个实施例中，培养所述脐带间充质干细胞的培养基为以Ultroser G 替代血清的干细胞培养基。
在其中一个实施例中，所述干细胞培养基中Ultroser G的质量百分含量为 1.5％～2.5％。
在其中一个实施例中，所述将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中的步 骤中，接种密度为50个/μL～80个/μL。
在其中一个实施例中，在所述将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中的 步骤之后，还包括将接种在所述细胞培养器中的脐带间充质干细胞在37℃、20 rpm～40rpm条件下水平旋转孵育的步骤。
在其中一个实施例中，在所述孵育的步骤之后，还包括将孵育后的脐带间 充质干细胞在450rmp～550rmp的转速下离心2.5min～3.5min的步骤。
在其中一个实施例中，还包括以脐带为原料制备脐带间充质干细胞的步骤。
在其中一个实施例中，所述以脐带为原料制备脐带间充质干细胞的步骤包 括：
将脐带剪切为2cm～3cm组织块，去除脐动脉和脐静脉，剥离脐带胶质，接 着将剥离脐带胶质的组织块剪碎成1mm3～3mm3的组织块后，加入无血清间充质 干细胞完全培养基培养，得到脐带间充质干细胞。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以 许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实 施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术 领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术 语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的脐带间充质干细胞的三维培养方法，包括步骤S110～步骤 S120。
步骤S110、制备脐带间充质干细胞。
具体地，将脐带剪切为2cm～3cm组织块，去除脐动脉和脐静脉，剥离脐带 胶质，接着将剥离脐带胶质的组织块剪碎成1mm3～3mm3的组织块后，加入无血 清间充质干细胞完全培养基培养，得到脐带间充质干细胞。
进一步地，在无菌条件下，将脐带剪切为2cm～3cm组织块，去除脐动脉和 脐静脉，剥离脐带胶质，然后再将剥离脐带胶质的组织块剪碎成1mm3～3mm3的组织块。然后将1mm3～3mm3的组织块均匀铺在细胞培养皿中，加入无血清间 充质干细胞完全培养基，每隔三天换液，当脐带间充质干细胞融合度达到 80％～85％时，去除培养基，消化后收获细胞，得到原代脐带间充质干细胞。接 着将原代脐带间充质干细胞传代培养两次或三次，得到脐带间充质干细胞。细 胞融合度是指细胞贴壁并且完全舒展以后的总面积与培养表面面积的比例，用 于衡量细胞的密度。
步骤S120、将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中，然后在水平转速为 20rpm～40rpm条件下旋转培养脐带间充质干细胞，其中，细胞培养器的底部的 内表面为弧面，底部的内表面经抗细胞贴附处理。
细胞培养器的底部的弧面设置和水平旋转培养形成细胞在体内的生长模拟 环境，便于脐带间充质干细胞在培养过程中形成细胞团块，利用细胞间的交流， 促进外泌体的表达。进一步地，弧面为圆弧面，细胞培养器为U型细胞板。旋 转培养的水平转速为30rpm。
在其中一个实施例中，培养脐带间充质干细胞的培养基为以Ultroser G替代 血清的干细胞培养基。Ultroser G替代血清使得培养脐带间充质干细胞所分泌的 外泌体安全性更高。进一步地，干细胞培养基中Ultroser G的质量百分含量为 1.5％～2.5％。
在其中一个实施例中，将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中的接种密 度为50个/μL～80个/μL。此接种密度更利于脐带间充质干细胞的在细胞培养器 中生长。
在其中一个实施例中，在将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中的步骤 之后，还包括将接种在细胞培养器中的脐带间充质干细胞在37℃、20rpm～40rpm 条件下水平旋转孵育的步骤。
在其中一个实施例中，在孵育的步骤之后，还包括将孵育后的脐带间充质 干细胞在450rmp～550rmp的转速下离心2.5min～3.5min的步骤。
上述脐带间充质干细胞的三维培养方法通过将脐带间充质干细胞接种搭配 底部经抗细胞贴附处理的细胞培养器中，并在水平转速为20rpm～40rpm条件下 旋转培养，使得脐带间充质干细胞在培养过程中维持细胞团块的三维构象从而 模拟细胞在体内的生长环境，使脐带间充质干细胞之间接触紧密，分子信号交 流更加频繁，促进干细胞各种细胞因子表达水平的提高，提高外泌体表达量， 提高外泌体的产量高。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括 除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均 为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例 如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
实施例1的间充质干细胞均为人源脐带来源间充质干细胞，原代细胞通过 脐带组织华氏胶中采集获得，原代脐带间充质干细胞传代至P2代后(即原代经 两次传代所得的细胞)冻存，细胞含量为每个冻存管200万细胞，容量1mL。 实施例1使用的干细胞培养基为以Ultroser G作为血清替代物的无动物源物质干 细胞培养基(LONZA,12-725F)，其中Ultroser G含量为2％。
实施例1的脐带间充质干细胞的三维培养方法的步骤为：
(1)将冻存于液氮罐中的干细胞冻存管取出，立即放入预热的37℃酒精中 进行快速解冻。
(2)解冻后的干细胞转移到含有干细胞培养基的T175培养瓶中，在恒温 培养箱中37℃，5％CO2培养3天，待融合率达到80％时使用0.25％胰酶进行消 化，依次方法将干细胞传代至P4代。
(3)P4代间充质干细胞接种于96孔板(Thermo ScientificTM NuncTM 96孔 聚苯乙烯圆底微孔板，货号168136)中，最外侧一圈孔内不接种，接种量为200μL 培养基10000个细胞每孔。接种后的96孔板至于37℃恒温培养箱内水平30rmp 旋转孵育1h，使细胞沉降并聚集成球状团块。
(4)将孵育后的96孔板放入离心机中，500rmp离心3min，之后保持96 孔板处于37℃，5％CO2，水平30rmp的条件培养3天。
(5)将培养3天后的96孔板中上清液收集于50mL离心管，2000rmp离心 5min去除细胞碎片等杂质，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液。
使用流式细胞术对上述步骤(5)得到的滤液中的外泌体进行鉴定，检测标 记为CD105，Annexin V双阳性标记区即为外泌体，同时使用质控微球对外泌体 含量进行定量分析。
经检测，按照实施例1的脐带间充质干细胞的三维培养方法培养所获得的 滤液中外泌体的含量2.5mg/mL。
实施例2
实施例2所使用的脐带间充质干细胞、培养基及其他试剂与实施例1的相 同，其不同在于，实施例2使用的96孔板为的平底孔板。具体地，实施例2的 脐带间充质干细胞的三维培养方法的步骤为：
(1)将冻存于液氮罐中的脐带间充质干细胞冻存管取出，立即放入预热的 37℃酒精中进行快速解冻。
(2)解冻后的干细胞转移到含有干细胞培养基的T175培养瓶中，在恒温 培养箱中37℃，5％CO2培养3天，待融合率达到80％时使用0.25％胰酶进行消 化，依次方法将干细胞传代至P4代。
(3)P4代间充质干细胞接种于96孔板(Thermo ScientificTM NuncTM MicroWellTM96孔微孔板货号：167008)中，最外侧一圈孔内不接种，接种量为 200μL培养基10000个细胞每孔。接种后的96孔板至于37℃恒温培养箱内培养 3天。
(4)将培养3天后的96孔板中上清液收集于50mL离心管，2000rmp离心 5min去除细胞碎片等杂质，然后用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，收集滤液。
使用流式细胞术对上述步骤(4)得到的滤液中的外泌体进行鉴定，检测标 记为CD105，Annexin V双阳性标记区即为外泌体，同时使用质控微球对外泌体 含量进行定量分析。
经检测，按照实施例2的脐带间充质干细胞的三维培养方法培养所获得的 滤液中外泌体的含量为1.0mg/mL。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。
Claims (8)
1.一种脐带间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中后，将接种在所述细胞培养器中的脐带间充质干细胞在37℃、20rpm～40rpm条件下水平旋转孵育；及
将孵育后的脐带间充质干细胞在450rmp～550rmp的转速下离心2.5min～3.5min，然后在水平转速为20rpm～40rpm条件下旋转培养所述脐带间充质干细胞，其中，所述细胞培养器为U型细胞板，所述细胞培养器的底部的内表面经抗细胞贴附处理。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，所述旋转培养的水平转速为30rpm。
3.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，培养所述脐带间充质干细胞的培养基为以Ultroser G替代血清的干细胞培养基。
4.根据权利要求3所述的脐带间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，所述干细胞培养基中Ultroser G的质量百分含量为1.5％～2.5％。
5.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，所述将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器中的步骤中，接种密度为50个/μL～80个/μL。
6.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，所述孵育的时间为1h。
7.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，还包括以脐带为原料制备脐带间充质干细胞的步骤。
8.根据权利要求7所述的脐带间充质干细胞的三维培养方法，其特征在于，所述以脐带为原料制备脐带间充质干细胞的步骤包括：
将脐带剪切为2cm～3cm组织块，去除脐动脉和脐静脉，剥离脐带胶质，接着将剥离脐带胶质的组织块剪碎成1mm3～3mm3的组织块后，加入无血清间充质干细胞完全培养基培养，得到脐带间充质干细胞。
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