KR20220054368A - Dna 손상 반응의 컨쥬게이션된 억제제 - Google Patents

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숀 디. 폰테인
브라이언 알. 헤른
다니엘 브이. 산티
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프로린크스 엘엘시
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Abstract

본 명세서에는 질병의 치료의 치료제로서 사용하기에 적합한 DNA 손상 반응의 억제제의 방출가능한 컨쥬게이트가 제공된다.

Description

DNA 손상 반응의 컨쥬게이션된 억제제
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 8월 28일자, 미국 가출원번호 제62/893,075호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
DNA는 예를 들어 활성 산소 종, 자외선 및 이온화 방사선의 작용을 통해 각 세포 주기 동안 여러 번 손상된다. DNA 손상 반응 (DDR)은 손상의 특성에 따라 다양한 형태를 취한다. 단일 가닥 파손 (nick)은 불일치 복구 (MMR), 뉴클레오타이드 절단 복구 (NER) 또는 염기 절단 복구 (BER)에 의해 복구될 수 있다. 단일 가닥 DNA 파손이 (세포 분열 전에 선행되어야 하는) DNA 복제 이전에 복구되지 않으면, 복제 공정 동안 독성이 강한 이중 가닥 DNA 파손이 형성될 수 있다. 세포는 매일 약 50개의 이중 가닥 파손이 축적되고, 대부분 활성 산소 종에 의해 유도되는 것으로 추정된다. 이중 가닥 파손 복구에는 두 가지 주요 경로가 있다. 자매 염색분체(sister chromatid)가 사용 가능한 경우, 후기 S 기 및 G2 기 동안, 상동 재조합 복구 (HRR)는 오류가 없는 복구를 제공한다. 자매 염색분체를 사용할 수 없는 경우, 비상동 말단 결합 (non-homologous end joining, NHEJ)은 유전 정보의 오류 및 손실을 초래하는 주형 없이 파손 말단을 직접적으로 결찰한다.
BRCA1, BRCA2, 및 PALB2와 같은 효소는 오류가 없는 상동 재조합 복구 (HRR) 과정을 통한 이러한 이중 가닥 DNA 파손의 복구에 있어서 중요하다. 이러한 단백질의 돌연변이는 암에 대한 감수성을 크게 증가시키며, 유방암, 난소암, 및 전립선암에서 가장 흔하다.
많은 암이 하나 이상의 개별 복구 경로에서 결함이 있고, 따라서 나머지 기능적 경로에 더 많이 의존한다는 점을 감안할 때, DNA 손상 반응 (DDR)을 억제하는 것은 암 치료에 있어서 잠재적으로 가치있는 치료법이다. 유전독성 요법에 대한 내성은 또한 DDR 신호전달의 증가와 관련될 수 있으며, 이러한 신호전달을 억제하면 방사선 및 유전독성 요법을 강화할 수 있다.
PARP 억제제는 DNA 복구, 게놈 안정성, 및 프로그래밍된 세포 사멸에 관여하는 단백질 패밀리인, 효소 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)의 작용을 차단한다. PARP는 단일 가닥 DNA 파손, 예를 들어, 화학적 제제 또는 방사선에 의해 유발된 파손을 감지하고, DNA 가닥-파손 복구에 관여하는 효소에 대한 신호로 작용하는 폴리(ADP-리보스)의 합성에 의해 복구 반응을 개시한다. 따라서 PARP 억제제는 이중 가닥 DNA 파손의 축적을 유발하고, 궁극적으로 돌연변이된 BRCA1, BRCA2, 또는 PALB2가 있는 세포와 같이 HRR에 결함이 있는 세포의 사멸을 유발한다. 이와 유사하게, 종양 억제인자 PTEN이 결여된 세포는 HRR 구성요소 Rad51의 하향조절로 인해 PARP 억제에 민감할 수 있다.
여러 PARP 억제제가 암 치료용으로 승인되어 있으며, 올라파립 (생식선 BRCA 돌연변이 진행성 난소암 환자), 루카파립 (BRCA-돌연변이 난소암), 니라파립 (상피암, 나팔관암, 및 원발성 복막암), 및 탈라조파립 (생식선 BRCA-돌연변이 유방암)을 포함한다. 벨리파립 (진행성 난소암, 삼중 음성 유방암, 및 비소세포폐암), 파미파립, CEP-9722 (비소세포폐암), 및 E7016 (흑색종)을 포함하는 다른 PARP 억제제는 임상 시험중이다.
DDR 경로의 다른 주요 표적은 ATM 및 ATR 키나제이며, 이는 세포 주기 정지를 유도하고 CHK1 및 CHK2와 같은 다운스트림 표적을 통해 DNA 손상 복구를 촉진한다. 이들은 사이클린-의존성 키나제 (CDK) 활성을 감소시키는 역할을 하여, G1-S, intra-S, 및 G2-M 세포 주기 체크포인트에 세포 주기 진행의 속도를 늦추고 정지시켜, 복제 또는 유사분열 이전에 DNA 손상을 복구하는데 사용할 수 있는 시간을 늘린다. ATM 및 ATR는 또한 DNA 복구 단백질의 전사를 유도하고 번역 후 변형을 통해 활성화를 향상시킨다.
DNA 복구에 대한 영향으로 인해, DNA 손상 반응의 억제제는 또한 DNA 복제 및 전사 동안 발생하는 토포아이소머라제-1/DNA 절단 복합체; 플래티늄 복합체와 같은 DNA 가닥 가교제 예컨대 (옥살리플라틴, 시스플라틴, 카보플라틴); 및 방사선, 블레오마이신, 및 엔다이인(enediyne)과 같은 단일 가닥 파손 유도제의 포획을 통한 DNA 가닥 파손을 야기하는 DNA 손상 화학요법제, 특히 토포아이소머라제 억제제 (캄토테신, 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸, SN-38, 에토포사이드, 및 유사 화합물)의 효과를 상승시킬 수 있다.
단일 가닥 DNA 손상은 또한 화학요법제를 사용한 치료에 의해 개시될 수 있으며, 따라서 암 치료에서 PARP 억제제와 상승적으로 작용할 수 있다. 불행하게도, 이러한 제제의 바람직하지 않은 독성은 또한 일반적으로 상승적이며, 이러한 조합으로 치료하는 능력을 크게 제한한다. 바람직하지 않은 독성은 정상적인 (즉, 비종양) 조직에서 높은 수준으로 두 가지 제제가 조합되어 존재하기 때문에 발생하므로, 화학요법제 및 PARP 억제제의 동시 전신 노출을 방지하면서 동시 종양 노출을 제공하는 방법이 필요하다. 이를 달성하기 위한 하나의 방법이 2019년 1월 11일에 출원된 PCT 특허 출원 PCT/US19/13314, “Synergistic Cancer Treatment”에 개시되어 있다. 상기 개시내용은 향상된 투과성 및 체류 (EPR) 효과로 인해 종양 조직에 축적되는 토포아이소머라제 억제제의 방출가능한 PEG-컨쥬게이트를 사용하며, 이는 2019년 1월 11일에 출원된 PCT 출원 PCT/US19/13306, “Protocol for for Minimizing Toxicity of Combination Dosages and Imaging Agent for Verification”에 개시되어 있다. 상기 방법에서, 화학요법제는 대략 10 nm 유체역학적 반경을 가지는 큰 폴리에틸렌 글리콜 담체에 방출 가능하게 컨쥬게이션된다. 정상 조직에 비해 종양 조직의 손상된 림프 배수로 인해, 이러한 나노미립자 컨쥬게이트가 포획되고 종양 조직에 축척되는 동안 전신 순환 및 정상 조직으로부터 제거된다. 종양에 포획되는 동안, 컨쥬게이트는 화학요법제를 방출하여 종양 세포로 흡수되고 DNA 손상을 개시하는 역할을 한다. 컨쥬게이트가 전신 순환으로부터 제거되면, 컨쥬게이션된 화학요법제가 종양에 존재하지만 정상 조직에는 존재하지 않는 기간 동안 DNA 손상 복구의 억제제가 제공된다.
택일적인 방법으로서, DNA 복구의 억제제가 또한 종양-축적 컨쥬게이트로서 제공되어, 종양 조직 내 추적을 증폭시키고 DNA 손상 복구 제제에 대한 정상 조직의 노출을 최소화할 수 있다. 본 발명은 이러한 DNA 손상 복구의 컨쥬게이트를 제공한다.
본 발명은 질병의 치료의 치료제로서 사용하기에 적합한 DNA 손상 반응의 억제제의 방출가능한 컨쥬게이트를 제공한다. 가용성 컨쥬게이트가 종양 조직에 축적되는 경향, 뿐만 아니라 종양 내 주사를 통해 종양 조직에 불용성 컨쥬게이트를 직접 투여할 가능성을 고려할때, 이러한 컨쥬게이트는 DNA 손상 반응 억제제의 높은 국소 농도를 제공하면서도 전신 노출을 최소화하고, 따라서 전신 독성을 개선할 것으로 예상된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 다음의 화학식(I)을 가지는 DNA 손상 반응의 컨쥬게이션된 억제제를 제공하며
M-(Z*-L-D)y (I)
여기서 M은 거대분자 담체이고; y는 M에 부착된 링커-약물 L-D의 수를 기술하는 숫자이고; Z*는 연결 작용기이고; L은 방출 가능한 링커이고; D는 DNA 손상 반응의 억제제이다. 일부 구현예에서, M은 가용성 거대분자 담체이고 y = 1-8이다. 일부 구현예에서, M은 분자량이 1,000-100,000 달톤 사이인 가용성 거대분자 담체이고, y = 1-8이다. 다른 구체예에서, M은 불용성 거대분자 담체이고, y는 M 상의 D의 농도를 기술하는 다중도이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 D가 방출 가능한 카바메이트 기를 통해 링커 L에 연결된 1차 또는 2차 아민을 포함하는 화학식(I)의 컨쥬게이트를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 D가 카바모일-메틸렌 기를 통해 링커 L에 연결된 아실-하이드라존을 포함하는 화학식(I)의 컨쥬게이트를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물의 제조 방법 및 질병의 치료에서 이의 용도를 제공한다.
도 1은 다양한 DNA 손상 반응의 억제제의 구조를 도시한다.
도 2는 Z*가 트라이아졸인 PARP 억제제 탈라조파립 (TLZ)의 방출 가능한 PEG 컨쥬게이트, 및 이의 제조 방법의 제1 구현예를 도시한다.
도 3은 Z*가 카복사마이드인 PARP 억제제 탈라조파립 (TLZ)의 방출 가능한 PEG 컨쥬게이트, 및 이의 제조 방법의 제2 구현예를 도시한다.
도 4는 PARP 억제제 루카파립의 방출 가능한 PEG 컨쥬게이트, 및 이의 제조 방법의 일 구현예를 도시한다.
도 5는 MX-1 마우스 이종이식편에 대한 방출 가능한 PEG-탈라조파립 (PEG-TLZ)의 효능을 도시한다. 패널 A는 단일 IP 용량의 방출 가능한 PEG-TLZ (5, 10, 20, 또는 30 μmol TLZ/kg) 대 유리 TLZ의 일일 경구 용량 (0.25 또는 0.4 μmol/kg TLZ)로 치료한 후의 종량 부피를 도시한다. 또한 방출 불가능한 PEG화된 TLZ을 도시되어 있으며, 이것은 비효과적이다.
도 6은 도 5에 요약된 실헙에 대한 개별 종양 부피를 도시한다.
도 7은 도 5에 요약된 실헙에 대한 무사건 생존 데이터를 도시한다.
도 8은 pH 9.4 (●), 8.4 (■), 7.4(▲), 5.0(▼) 및 pH 1.1 (◆)에서 방출 가능한 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 안정성을 도시한다.
도 9A는 방출 불가능한 아실화된 탈라조파립 컨쥬게이트 (Mod = H)의 안정성을 도시한다. 도 9B는 방출 가능한 아실화된 탈라조파립 컨쥬게이트 (R1 = SO2Me)의 방출 동역학 및 안정성을 도시한다.
도 10은 탈라조파립 (BMN-673)의 방출 가능한 컨쥬게이트 (R7 = 치환된 아릴)가 상이한 완충액: 패널 A, pH 9.0; 패널 B: pH 7.4에 배치될 때 만니히 염기 R7-CH2-TLZ (R7 = 치환된 아릴)의 축적을 나타낸다.
도 11은 마우스에서 방출 불가능한 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트 (점선, 빈 원형) 및 실시예 11의 방출 가능한 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트 (채워진 원형), 및 방출 가능한 컨쥬게이트으로부터 방출된 유리 탈라조파립 (삼각형)의 약동학 연구의 결과를 도시한다.
도 12는 KT-10 (패널 A,B), MX-1 (패널 C,D), TC-71 (패널 E,F), DLD-1 BRCA2-/- (패널 G,H), 및 DLD-1 BRCA2wt/wt (패널 I,J) 마우스 이종이식편에 대해 제0일에 단일 용량으로 제공된, 방출 가능한 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 효능을 유리 탈라조파립의 28일의 일일 경구 투여량과 비교하여 도시한다.
본 발명은 다음의 화학식(I)을 가지는 DNA 손상 반응의 컨쥬게이션된 억제제를 제공하며
M-(Z*-L-D)y (I)
여기서 M은 거대분자 담체이고; y는 M에 부착된 링커-약물 L-D의 수를 기술하는 숫자 (예를 들어, 1의 다중도) 이고; Z*는 연결 작용기이고; L은 방출 가능한 링커이고; D는 DNA 손상 반응의 억제제이다. 일부 구현예에서, y는 1의 다중도이다. 일부 구현예에서, M은 가용성 거대분자 담체이고 y = 1-8이다. 일부 구현예에서, M은 분자량이 1,000-100,000 달톤 사이인 가용성 거대분자 담체이고, y = 1-8이다. 일부 구체예에서, M은 불용성 거대분자 담체이고, y는 M 상의 D의 농도를 기술하는 다중도이다.
본 발명의 링커는 억제제를 담체에 방출 가능하게 연결한다. 적절한 조건 하에서, 링커는 절단되어 유리 억제제를 방출한다. 본 발명의 구현예에서, 링커-약물은 화학식(II)를 가지고, 예를 들어 미국 특허 8,680,315 및 8,754,190 (상기 특허 둘 모두 본 명세서에 참조 문헌으로 포함)에 개시된 바와 같이 비가수분해성 베타-제거 메커니즘을 통해 약물을 방출하며
Figure pct00001
(II)
여기서 Z는 거대분자 담체에 링커-약물을 컨쥬게이션하는 연결기이고; n = 0-6이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되 여기서 각 R6은 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; Y는 부재하거나 또는 화학식 N(R7)CH2을 가지되, 여기서 R7은 임의 치환된 C1-C4 알킬 또는 임의 치환된 아릴이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다. 일부 구현예에서, Z는 거대분자 담체에 링커-약물을 컨쥬게이션하는 연결기이고; n = 1-4이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되 여기서 각 R6은 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; Y는 부재하거나 또는 화학식 N(R7)CH2을 가지되, 여기서 R7은 임의 치환된 C1-C4 알킬이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
용어 “알킬”은 1-20, 1-12, 1-8, 1-6, 또는 1-4개 탄소 원자의 선형, 분지형, 또는 사이클릭 포화 탄화수소 기를 포함하는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 알킬은 선형 또는 분지형이다. 선형 또는 분지형 알킬 기의 예로는, 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 알킬은 사이클릭이다. 사이클릭 알킬 기의 예로는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜타다이에닐, 사이클로헥실, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 “알콕시”는 산소에 결합된 알킬 기를 포함하며, 메톡시, 에톡시, 아이소프로폭시, 사이클로프로폭시, 사이클로뷰톡시, 등을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 “알케닐”은 2-20, 2-12, 2-8, 2-6, 또는　2-4개 탄소 원자의, 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 비-방향족 불포화 탄화수소를 포함하는 것으로 이해된다.
용어 “알키닐”은 2-20, 2-12, 2-8, 2-6, 또는　2-4개 탄소 원자의, 탄소-탄소 삼중 결합을 가지는 비-방향족 불포화 탄화수소를 포함하는 것으로 이해된다.
용어 “아릴”은 6-18개 탄소, 바람직하게 6-10개 탄소의 방향족 탄화수소 기를 포함하며, 페닐, 나프틸, 및 안트라세닐과 같은 기를 포함하는 것으로 이해된다. 용어 “헤테로아릴”은 N, O 또는 S 원자 중 적어도 하나를 함유하는 3-15개 탄소, 바람직하게 N, O 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는　3-7개 탄소를 포함하는 방향족 고리를 포함하며, 피롤릴, 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 퀴놀릴, 인돌릴, 인데닐, 등과 같은 기를 포함한다.
일부 경우에, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 알킬 연결부를 통해 분자의 나머지 부분에 커플링될 수 있다. 이러한 경우, 치환체는 알케닐알킬, 알키닐알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬로서 지칭될 것이며, 이는 알킬렌 모이어티가 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티와, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴이 커플링되는 분자 사이에 있음을 나타낸다.
용어 “할로겐” 또는 “할로”는 브로모, 플루오로, 클로로 및 아이오도를 포함하는 것으로 이해된다.
용어 “헤테로사이클릭 고리” 또는 “헤테로사이클릴”은 N, O, 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는 3-15 원 방향족 또는 비방향족 고리를 지칭하는 것으로 이해된다. 예시로는 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라하이드로피라닐, 피롤리딘, 및 테트라하이드로퓨라닐, 뿐만 아니라 상기 용어 “헤테로아릴”에 대해 제공된 예시적인 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로사이클릴은 비방향족이다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로사이클릴은 방향족이다.
“임의 치환된”은, 달리 명시되지 않는 한, 기(group)가 동일하거나 또는 상이한 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의) 치환기로 치환되거나 또는 비치환될 수 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 치환기의 예로는, 비제한적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, -CN, -ORaa, -SRaa, -NRaaRbb, -NO2, -C=NH(ORaa), -C(O)Raa, -OC(O)Raa, -C(O)ORaa, -C(O)NRaaRbb, -OC(O)NRaaRbb, -NRaaC(O)Rbb, -NRaaC(O)ORbb, -S(O)Raa, -S(O)2Raa, -NRaaS(O)Rbb, -C(O)NRaaS(O)Rbb, -NRaaS(O)Rbb, -C(O)NRaaS(O)2Rbb, -S(O)NRaaRbb, -S(O)2NRaaRbb, -P(O)(ORaa) (ORbb), 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴을 포함하되, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 및 아릴은 각각 독립적으로 Rcc으로 임의 치환되고, 여기서
Raa 및 Rbb는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴이거나, 또는
Raa 및 Rbb는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릴을 형성하는데, 이는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알콕시, 또는 -CN으로 임의 치환되고, 여기서:
각각의 Rcc는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 아릴, -CN, 또는 -NO2이다.
본 명세서에서 사용 시, 달리 명확하게 지시되지 않는 한 단수형 용어 (“a”“an”등)의 사용은 하나 이상을 지칭한다.
제거 속도는 주로 R1 및 R2 기에 의해 제거되며, 이 중 적어도 하나는 전자-끄는 기 예컨대 CN 또는 C1-C6 알킬설폰, 아릴설폰, 또는 헤테로아릴-설폰, 또는 설폰아마이드이며, 각각 임의 치환된다. 적절한 전자-끄는 기는 미국 특허 8,680,315 및 8,754,190에서 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN, -SO2N(CH3)2, -SO2CH3, -SO2Ph, -SO2PhCl, -SO2N(CH2CH2)2O, -SO2CH(CH3)2, -SO2N(CH3)(CH2CH3), 또는 -SO2N(CH2CH2OCH3)2이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 하나는 SO2R5이고 다른 하나는 H이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 하나는 -SO2CH3이고 다른 하나는 H이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2는 pH 7.4, 37 ℃에서 100-1000 시간 사이의 D 방출에 대한 반감기를 제공하도록 선택된다. R4 기는 H 또는 임의 치환된 C1-C3 알킬일 수 있거나, 또는 R4 둘 모두는 함께 3-6 원 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, 각 R4는 독립적으로 H 또는 메틸이다. 일부 구현예에서, R4는 H이다. Z는 동족 작용기 Z'와의 반응을 통해 거대분자 담체 M에 링커를 연결하도록 하는 작용기이다. Z의 일반적인 예로는 할로겐, 아자이드, 알켄, 알킨, 싸이올, 말레이미드, 카보닐, 카복실 산, 아민, 및 아미노옥시 기 포함하며, M-Z*-L 연결을 형성하고 여기서 X는 에터, 싸이오에터, 1,2,3-트라이아졸, 옥심, 또는 카복실 아마이드 (카복사마이드) Z'가 하기 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, Y는 부재하거나 또는 N(R7)CH2이다. 일부 구현예에서, Y는 부재한다. 일부 구현예에서, Y는 N(R7)CH2이다. 일부 구현예에서, R7은 임의 치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R7은 C1-C6 알콕시 또는 -OH로 임의 치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 구현예에서, R7은 -CH2CH2OCH3 또는 -CH3이다. 일부 구현예에서, R7은 임의 치환된 아릴이다. 일부 구현예에서, R7은 임의 치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R7은 -C(O)NRaaRbb에 의해 임의 치환된 페닐이다.
DNA 손상 반응 억제제는 DNA 가닥 파손이 복구되는 하나 이상의 과정을 방해하는 화합물을 의미한다. 일반적인 DNA 손상 반응 억제제는 PARP, ATR, 또는 ATM와 같은 DNA 복구 효소의 활성을 억제한다.
본 발명에 유용한 DNA 손상 반응 억제제는 일반적으로 두 가지 구조적인 클래스로 분류된다. 일 구현예에서, 억제제는 염기성 아민 기를 포함하며, 이를 통해 약물이 카바메이트 기를 통한 링커 L의 부착에 의해 컨쥬게이션된다. 이러한 억제제로는 예를 들면 벨리파립(veliparib), 니라파립(niraparib), 루카파립(rucaparib), 및 베르조세르팁 (berzosertib, (VX-970, VE-822))을 포함한다. 이러한 억제제는 Y는 부재하고 D는 염기성 질소를 통해 부착된 화학식의 링커-약물을 생성한다.
또 다른 구체예에서, DNA 손상 반응 억제제는 염기성 아민 기를 포함하지 않지만, 오히려 프탈라존 (또는 프탈라진-1(2H)-온) 또는 관련된 폴리사이클릭 2,7,8,9-테트라하이드로-3H-피리도[4,3,2-데]프탈라진-3-온 형태로 아실하이드라존을 포함한다. 이러한 억제제 아실하이드라존의 NH를 미국 특허 8,754,190에 개시된 것과 유사한 N-(클로로메틸)카바메이트를 사용한 알킬화에 의해 컨쥬게이션되어 연결기 Y = N(R8)CH2를 제공할 수 있다. 이러한 억제제로는 예를 들어 탈라조파립 (TLZ, BMN673), 올라파립, 파미파립, CEP-9722, 및 E7016을 포함한다. 이러한 억제제는 Y가 화학식 N(R7)CH2를 가지는 화학식(II)의 링커-약물을 생성한다. 일부 구현예에서, Y는 화학식 N(R7)CH2를 가지고 D는 D의 비염기성 질소 원자에 대한 알킬 결합부를 통해 링커 L에 연결된다. 미국 특허 8,754,190의 싸이올 및 페놀 컨쥬게이트와는 대조적으로, 일반적인 프탈라존의 pKa는 12이며, 베타-제거로 인한 중간체 만니히 염기 Y-D의 적절한 분해 속도를 달성하기 위해 R8 = H 또는 임의 치환된 C1-C4 알킬이 필요하다. 이러한 링커-약물은 하기 실시예에 기재된 바와 같이 강염기, 예를 들어 리튬 다이아이소프로필아마이드 (LDA), 또는 금속 헥사메틸다이실아자이드 예컨대 소듐, 리튬, 또는 포타슘 HMDS의 반응에 이해 형성된 약물의 음이온 형태와 (N-클로로메틸)-카바메이트의 반응에 의해 제조될 수 있다. 비알킬화 구아니딘 염기, 예를 들어 7-메틸-1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]덱-5-엔 (MTBD)이 또한 사용될 수 있다. N-(클로로메틸)카바메이트는 미국 특허 8,754,190에 기재된 바와 유사하게, 링커 클로로포메이트와 임의 치환된 아민 R7-NH2의 반응에 의해 형성된 링커-카바메이트를 사용하여 제조될 수 있다.
특정 구체예에서, DNA 손상 반응 억제제는 염기성 및 비염기성 질소 기를 포함하며, 이러한 경우 수득되는 궁극적인 링커-약물은 생성물로부터 사용되는 반응 조건에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 탈라조파립은 염기성 및 비염기성 질소 모두를 포함한다. 탈라조파립을 링커-클로로포메이트으로 아실화하여 Y가 부재하는 화학식(II)의 링커-약물을 제공하는 것이 가능하지만, 아실화된 탈라조파립의 이러한 컨쥬게이트는 가수분해 분해에 민감한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 아실하이드라존을 포함하는 DDR에 대한 억제제의 경우, Y = N(R7)CH2인 화학식(II)의 화합물이 바람직하다.
일 구현예에서, 화학식(II)의 링커-약물은 가용성 거대분자 담체 M에 연결되어 컨쥬게이트를 제공한다. M의 적합한 예로는 합성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 및 천연 중합체, 예를 들어 덱스트란, 히알루론산, 및 무작위-서열 단백질 및 항체와 같은 단백질이 있다. M의 기능 중 하나는 향상된 투과성 및 체류 (EPR) 효과에 따라 종양 조직에서 컨쥬게이션된 약물의 축적을 유도하는 것인며, 이는 빠르게 성장하는 종양 조직에 나노 미립자를 포획하기 위해 잘 발달되지 않은 림프 배수에 의존한다. 이러한 기전에 따르면, 종양 조직에 대한 항종양 약물의 전달을 강조하고 비종양 조직의 약물 노출을 최소화하여, 바람직하지 않은 독성을 완화시킬 수 있다. PCT 출원 PCT/US2019/13306 및 PCT 공보 WO2019/140271에 입증된 바와 같이, 유체역학적 반경이 5 내지 50 nm인 컨쥬게이트는 특히 효과적인 것으로 예상되며, 평균 분자량이 대략 40,000 달톤인 다중-아암 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 제조된 컨쥬게이트는 종양 조직에서 높은 축적 및 수명을 나타낸다. 특정 구체예에서, M은 평균 분자량이 20,000 내지 60,000 달톤이며, 유체역학적 반경이 5 내지 50 nm인 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, y = 1-4이다. 가장 바람직하게, M은 4-8 개의 아암을 가지며 (y = 4-8), 평균 분자량이 대략 40,000 달톤인 다중-아암의 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, M은 평균 분자량이 1,000 내지 100,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, M은 유체역학적 반경이 5 내지 50 nm이다. 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 히알루론산, 등과 같은 큰 중합체는 일반적으로 다분산성이며; 존재하는 단량체 단위 수 범위로 인해 평균 분자량에 대한 분자량의 범위를 가지는 종의 혼합물을 포함하는 것으로 이해된다. 단량체 함량 (및 이에 따른 분자량)의 이러한 다분산도는 일반적으로 대략 ± 15%, 10%, 또는 5%이고, 본 발명에 사용하기 위한 중합체의 유영성에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 평균 분자량 40,000이 폴리에틸렌 글리콜이 특정되는 경우, 이것은 900 ± 100 에틸렌 옥사이드 단위를 가지는 개별 중합체를 포함하는 대략 40,000 ± 5,000 달톤의 다분산성 중합체를 설명한다. 도 2 및 3에서, 예시적인 구조는 4-아암 중합체를 나타내며 여기서 각 아암은 에틸렌 옥사이드 단량체 단위 z를 포함하고; 중합체의 평균 분자량이 대략 40,000 달톤인 경우, z는 227 ± 25이다.
또 다른 구체예에서, 화학식(II)의 링커-약물은 불용성 담체 M에 연결되어 비순환성 컨쥬게이트를 제공한다. 불용성 M의 적합한 예로는 벌크 물질로서 또는 미소구체와 같은 미세미립자 현탁액로서의 하이드로겔 데포를 포함한다. 이러한 구현예에서, M이 초고분자량의 가교 중합체임에 따라, y는 불용성 M 매트릭스에 부착된 링커-약물의 농도를 기술하는 다중도이다. 예를 들어, M이 4-아암 중합체를 가교시켜 형성되는 경우, 1, 2, 3, 또는 4개의 링커-약물이 중합체-중합체 단위에 부착될 수 있다. 이에 따라, 바람직한 다중도는 링커-약물을 M과 적합한 비율로 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 이와 같이, M에서의 적합한 약물 농도가 달성될 수 있다. 또한, M의 중합체-중합체 단위의 밀도는 중합체 분자량의 선택에 의해 달라질 수 있다; 예를 들어, 평균 분자량이 20 kDa인 가교된 4-아암 PEG로 구성된 하이드로겔은 하이드로겔 밀리리터당 최대 5 마이크로몰의 부착된 약물을 허용할 수 있는 반면에, 10 kDa PEG로 구성된 하이드로겔은 부착된 약물 하이드로겔 밀리리터당 최대 10 마이크로몰을 허용할 수 있다. 하이드로겔 M 밀리리터당 0.1 내지 50 마이크로몰, 바람직하게는 밀리리터당 0.1 내지 10 마이크로몰의 부착된 링커-약물이 일반적인 값이다. 이러한 구현예에서, M은 바람직하게 D가 방출된 후 불용성 담체의 제거를 허용하는 분해가능한 가교결합을 포함한다. 이러한 하이드로겔 물질 및 이에 대한 링커-약물의 부착 방법은 예를 들어 미국 특허 9,649,385에서 확인할 수 있다.
M은 작용기 Z*를 통해 링커-약물에 연결되며, 이것은 링커 약물 상의 Z 기와 M 상의 동족 Z' 기의 반응에 의해 형성된다. Z/Z'의 예로 하나가 아자이드이고 다른 하나는 알킨 또는 사이클로옥틴인 경우 Z* = 1,2,3-트라이아졸; 하나가 아민이고 다른 하나는 카복실 산 또는 활성 에스터인 경우 Z* = 카복사마이드를 제공하고; 하나가 클로로포메이트 또는 활성 카보네이트이고 다른 하나는 아민인 경우 Z* = 카바메이트를 제공하고; 하나가 알코올이고 다른 하나는 아이소시아네이트인 경우 Z* = 카바메이트를 제공하고; 하나가 아이소시아네이트이고 다른 하나는 아민인 경우 Z* = 우레아를 제공하고; 하나가 케톤 또는 알데하이드이고 다른 하나는 아미노옥시인 경우 Z* = 옥심를 제공하고; 하나가 싸이올이고 다른 하나는 말레이미드 또는 할로카보닐인 경우 Z* = 싸이오에터를 제공한다. 특정 구체예에서, Z*는 아자이드와 사이클로옥틴 예컨대 아자다이벤조사이클로옥틴 (DBCO), 바이사이클로[6.1.0]논-4-아인 (BCN), 또는 5-하이드록시사이클로옥틴 (5HCO)의 고리화 첨가로부터 생성된 트라이아졸이다. 일부 구현예에서, DNA 손상 반응의 컨쥬게이션된 억제제 (예를 들어, 화학식(III)의 컨쥬게이트)의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 화학식(II)의 링커-약물을 연결기 Z*가 형성되는 조건하에서 작용기 Z와 반응할 수 있는 동족 작용기 Z'를 포함하는 활성화된 거대분자 담체와 접촉시키는 단계, 및 선택적으로 컨쥬게이트를 단리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 화학식(I)의 컨쥬게이트는 화학식(III)의 컨쥬게이트이고,
Figure pct00002
(III)
여기서 M, Z*, D, n, R1, R2, R4, Y, 및 y는 본 명세서에서 화학식(I) 또는 (II)에 대해 개시된 바와 같다. 일부 구현예에서, Z*는 연결기이고; n = 0-6이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되 여기서 각 R6은 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; Y는 부재하거나 또는 화학식 N(R7)CH2을 가지되, 여기서 R7은 임의 치환된 C1-C4 알킬 또는 임의 치환된 아릴이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다. 일부 구현예에서, n은 1-4이고 R7은 임의 치환된 C1-C4 알킬이다.
일부 구현예에서, 화학식(I)의 컨쥬게이트는 화학식(IV)의 컨쥬게이트이고,
Figure pct00003
(IV),
여기서 M, Z*, n, R1, R2, R4, R7, 및 y는 본 명세서에서 화학식(I) 또는 (II)에 대해 개시된 바와 같다. 일부 구현예에서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이다. 일부 구현예에서, y는 4이다. 일부 구현예에서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고; n은 4이고; Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이고; y는 4이다. 일부 구현예에서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고; n은 1이고; 각 R4는 알킬이고; R7은 임의 치환된 알킬이고; Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이고; y는 4이다.
일부 구현예에서, 화학식(I)의 컨쥬게이트는 화학식(IV)의 컨쥬게이트이고,
Figure pct00004
(V),
여기서 M, Z*, n, R1, R2, R4, 및 y는 본 명세서에서 화학식(I) 또는 (II)에 대해 개시된 바와 같다. 일부 구현예에서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터 또는 트라이아졸이다. 일부 구현예에서, y는 4이다. 일부 구현예에서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고; n은 4이고; Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이고; y는 4이다. 일부 구현예에서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고; n은 1이고; 각 R4는 알킬이고; R7은 임의 치환된 알킬이고; Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이고; y는 4이다.
본 명세서의 설명에서, 하나의 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는 다른 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태와 조합될 수 있으며, 각각의 모든 설명 조합이 구체적으로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하게 이해해야 한다. 예를 들어, 화학식(I)의 M에 대해 본 명세서에 제공된 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는 Z*, L, D, 및 y의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태와 조합될 수 있으며, 각각의 모든 조합이 구체적으로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하다. 또한, 화학식(I), (II), (III), 또는 (IV)와 같은 임의의 화학식의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는, 적용 가능한 경우, 본 명세서에 설명된 다른 화학식에 동일하게 적용되고, 동일하게 기재되며, 각각의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태가 모든 화학식에 대해 별도로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하게 이해된다. 예를 들어, 화학식(II)의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는, 적용 가능한 경우, 본 명세서에 설명된 임의의 화학식, 예컨대 화학식(I), (III), 및 (IV)에 동일하게 적용되고, 동일하게 기재되며, 각각의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태가 모든 화학식에 대해 별도로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하다.
본 발명의 컨쥬게이트는 기술 분야 내 공지된 표준 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 최적의 안정성은 일반적으로 pH 3 내지 6, 바람직하게 4 내지 5의 제형에서 관찰된다. 제형 완충제는 삼투압 농도, 이온 강도, 무균성 및 안정성을 조절하기 위해 당업계에 공지된 부형제를 임의로 포함할 수 있다. 제형은 주사용 수용액 또는 재구성용 동결건조제로 제공될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는 다양한 질병 또는 병태를 치료하기 위해 이러한 치료를 필요로 하는 인간 또는 동물 대상체에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 질병은 암이다. 일부 구현예에서, 질병은 유방암, 난소암, 또는 췌장암이다.
“합성 치사(synthetic lethality)”로서 지칭되는 개념인, 유전적 돌연변이가 DNA 손상 반응의 결핍을 초래하는 암 치료에서 PARP 억제의 유용성은 잘 확립되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Nijman, FEBS Letts 2011 Jan 3; 585(1): 1-6] 및 이의 참조문헌 참고). 유전적 돌연변이의 두드러진 예로는 BRCA1, BRCA2, 및 PTEN 유전자의 돌연변이이며, 이는 DNA 손상 복구를 위해 PARP에 대한 이러한 돌연변이 세포의 의존성 증가로 인해 PARP 억제제를 사용한 치료에 대한 민감성을 초래하는 것으로 밝혀졌다. PARP 억제제는 이러한 돌연변이 유전적 배경의 맥락에서 유방암, 난소암 및 췌장암의 치료에서 특히 성공적인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Zhu et al., Mol Cancer 19, 49 (2020)]. https://doi.org/10.1186/s12943-020-01167-9). 본 발명의 컨쥬게이트가 장기간 방출 및 PARP 억제제에 대한 노출을 제공하기 때문에, DNA 손상 반응에서 이러한 유전적 결함을 가지는 암의 치료에서도 또한 유용할 것으로 예상된다.
PARP 억제제는 또한 다른 제제와 병용으로 사용되는 경우 효과적인 것으로 밝혀져 있다. 병용 제제의 비제한적인 예는 다음과 같다: 캄토테신을 비롯한 DNA 손상제 예컨대 이리노테칸, 엑사테칸(exatecan), SN-38, 및 예를 들어, 미국 특허 7,462,627; 7,744,861; 8,906,353; 9,855,261; 10,653,689; 10,016,411; 및 10,729,782 및 PCT 공보 WO2015/155976에 기재된 이러한 제제의 컨쥬게이트; 테모졸로이미드(temozolomide) 및 기타 알킬화제; 더말루밥(durvalumab), 펨브롤리주밥(pembrolizumab), 및 이볼루맙(ivolumab)을 비롯한 면역요법제; ATM, ATR, 및 AKT 억제제를 비롯한 키나제 억제제 예컨대 이파타세르팁(ipatasertib), 베르조세르팁, 닥톨리십(dactolisib), AZD6738, VE-821, 및 VE-822; 항혈관신생제 예컨대 세리다립(cediranib); 안드로겐 수용체 리간드 예컨대 엔잘루타미드(enzalutamide) 및 아비라테론(abiraterone); 및 방사선 요법. 예를 들어 문헌 [C. Pezaro, Ther Adv Med Oncol. 2020; 12: 1758835919897537]를 참조한다. 유전적 돌연변이가 부재하는 경우, PARP 억제제는 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제와 같은 후성 유전학적 변형제 예컨대 다이뉴클레오사이드 항대사물질 구아데시타빈(guadecitabine)과 조합하여 효과적인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Pulliam et al., Clin Cancer Res. 2018; 24(13): 3163-75]). 본 발명의 컨쥬게이트는 이러한 제제와 병용하여 암 치료에서 유용성을 발견할 것으로 유사하게 예상된다.
PARP 억제제는 다양한 신경퇴행성 질병에 대해 활성을 나타냈으며, 이 경우 PARP의 과도한 활성화가 PARthanatos라는 프로그래밍된 세포 사멸의 특정 형태를 초래한다 (문헌 [Wang et al., Sci Signal. 2011 Apr 5; 4(167):ra20]). 신경퇴행성 질병에서의 PARP 억제제의 활성, 예컨대 망막색소변성증 (문헌 [Sahaboglu et al., Sci. Rep. 2016; 6:39537]), 녹내장성 망막병증 및 시신경망막병증 (미국 특허 No. 6,444,676), 및 알츠하이머병 (문헌 [Gao et al., J. Enzyme Inhibition 및 Med Chem 2019, 34:1, 150-162]).
컨쥬게이트의 투여는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 두개내 및 유리체내를 비롯한 임의의 경로에 의해 이루어질 수 있다.
다음의 특정 예시적인 구현예가 하기에 제공된다:
구현예 1. 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서
M-(Z*-L-D)y
여기서 M은 가용성 거대분자 담체이고;
y = 1 내지 8이고;
Z*는 연결기이고;
L은 방출 가능한 링커이고;
D는 DNA 손상 반응의 억제제인 컨쥬게이트.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, D는 PARP 억제제, ATM 억제제, 또는 ATR 억제제인 것인 컨쥬게이트.
구현예 3. 구현예 1에 있어서, 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서,
Figure pct00005
여기서 Z*는 연결기이고; n = 1-4이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되 여기서 각 R6은 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; Y는 부재하거나 또는 화학식 N(R7)CH2을 가지되, 여기서 R7은 임의 치환된 C1-C4 알킬이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아닌 것인 컨쥬게이트.
구현예 4. 구현예 3에 있어서, Y는 부재하고 D는 D의 1차 또는 2차 아민 질소 원자에 카바메이트 결합부를 통해 링커 L에 연결되는 것인 컨쥬게이트.
구현예 5. 구현예 4에 있어서, D는 루카파립, 벨리파립, 니라파립, 또는 베르조세르팁인 것인 컨쥬게이트.
구현예 6. 구현예 3에 있어서, Y는 화학식 N(R7)CH2를 가지고 D는 D의 비염기성 질소 원자에 대한 알킬 결합부를 통해 링커 L에 연결되는 것인 컨쥬게이트.
구현예 7. 구현예 6에 있어서, D는 탈라조파립, 올라파립, 타미파립, E7016, 또는 CEP-9722인 것인 컨쥬게이트.
구현예 8. 구현예 1에 있어서, M은 분자량이 1000 내지 100,000인 PEG이고, y는 = 1-8인 것인 컨쥬게이트.
구현예 9. 구현예 1에 있어서, M은 유체역학적 반경ㅇ 5 내지 50 nm인 것인 컨쥬게이트.
구현예 10. 구현예 1에 있어서, Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 우레아, 옥심, 싸이오에터, 또는 1,2,3-트라이아졸인 것인 컨쥬게이트.
구현예 11. 구현예 1에 있어서, R1 및 R2는 pH 7.4, 37 ℃에서 100-1000 시간 사이의 D 방출에 대한 반감기를 제공하도록 선택되는 것인 컨쥬게이트.
구현예 12. 구현예 1에 있어서, 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서,
Figure pct00006
.
여기서 M은 거대분자 담체이고; n = 1-4이고; Z*는 연결기이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되, 여기서 각 R6는 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; R7는 임의 치환된 C1-C3 알킬이고; y = 1의 다중도이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아닌 것인 컨쥬게이트.
구현예 13. 구현예 12에 있어서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고 y = 4인 것인 컨쥬게이트.
구현예 14. 구현예 12에 있어서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고; n = 4이고; Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이고; y = 4인 것인 컨쥬게이트.
구현예 15. 구현예 1에 있어서, 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서,
Figure pct00007
여기서 M은 거대분자 담체이고; n = 1-4이고; Z*는 연결기이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되, 여기서 각 R6는 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; y = 1의 다중도이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아닌 것인 컨쥬게이트.
구현예 16. 구현예 14에 있어서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고; n = 4이고; Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸이고; y = 4인 것인 컨쥬게이트.
구현예 17. 다음의 화학식의 링커-약물로서,
Figure pct00008
여기서 Z는 연결기이고; n = 1-4이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되 여기서 각 R6은 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; Y는 부재하거나 또는 화학식 N(R7)CH2을 가지되, 여기서 R7은 임의 치환된 C1-C4 알킬이고; D는 DNA 손상 반응의 억제제이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아닌 링커-약물.
다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아니다.
제조 A
링커 알코올, 클로로포메이트, 및 석신이미딜 카보네이트의 합성
특정 링커 알코올, 클로로포메이트, 및 석신이미딜 카보네이트의 합성은 이전에, 예를 들어 미국 특허 8,680,315 및 8,754,190, 및 문헌 [Santi et al. (2012) Proc Natl Acad Sci USA 109: 6211-6]에 기재되어 있다. 추가적인 링커는 다음의 방법에 따라 제조하였다.
Figure pct00009
Figure pct00010
(1) 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (n = 1, R 1 = CN, R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3 ).
-30 ℃에서 THF 중의 1 M 포타슘 tert-뷰톡사이드 용액 (3.5 mL, 3.5 mmol)을 7 mL의 THF 중의 메틸 3-아지도-2,2-다이메틸프로피오네이트 (문헌 [Kim, Synthetic Communications]에 따라 제조; 300 mg, 1.9 mmol) 및 아세토나이트릴 (0.365 mL, 7.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 -30 ℃에서 30 분간 교반한 다음 1 시간에 걸쳐 주위 온도로 가온하고 추가적인 30 분 동안 교반하였다. 혼합물을 얼음 위에서 냉각시키고 6 N HCl (0.62 mL, 3.7 mmol)을 첨가하여 켄칭한 다음, EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 케톤을 제공하였다.
소듐 보로하이드라이드 (33 mg, 0.88 mmol)를 7 mL의 메탄올 중의 미정제 케톤 (300 mg, ca. 1.75 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 15 분간 교반한 다음 켄칭 6 N HCl (0.7 mL)을 첨가하여 켄칭하고, EtOAc와 물 사이에 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 및 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 알코올을 제공하였다. SiO2 (20-40% EtOAc/헥산)에서 정제하여, 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (142 mg, 0.85 mmol)을 제공하였다. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 3.83-3.92 (m,1H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), 및 0.96 (s,3H).
(2) 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 클로로포메이트 (n = 1, R 1 = CN, R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3 ).
피리딘 (136 uL, 1.7 mmol)을 얼음 위에서 냉각된 8 mL의 THF 중의 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (142 mg, 0.85 mmol) 및 트라이포스진 (425 mg, 1.44 mmol)의 용액에 적가하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도로 가온하고 15 분간 교반한 다음, 여과하고 농축하여 클로로포메이트를 제공하였다.
(3) 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (n = 1, R 1 = CN, R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3 ).
상기로부터의 클로로포메이트를 8 mL의 THF에 용해시키고, 얼음 위에서 냉각시키고, N-하이드록시석신이미드 (291 mg, 2.5 mmol) 및 피리딘 (204 uL, 2.53 mmol)으로 처리하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도로 가온하고 15 분간 교반한 다음, EtOAc와 5% KHSO4 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 및 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 석신이미딜 카보네이트를 제공하였다. SiO2 (20-40% EtOAc/헥산)에서 정제하여, 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (174 mg, 0.56 mmol)를 제공하였다. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 5.03 (dd,J=7.0,5.1,1H), 3.27-3.41 (m,6H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), 및 0.96 (s,3H).
n = 2-6인 링커는 표시된 바와 같이 상응하는 동족화된 할로-에스터로 시작하여 제조한다.
5-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-펜틸 석신이미딜 카보네이트 (n = 2, R 1 = CN, R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N3 ).
(a) 에틸 4-클로로-2,2-다이메틸뷰타노에이트.
500-mL 둥근바닥 플라스크에 교반 막대, 고무 격막, 질소 주입구, 및 열전대 프로브를 장착하고, 히트 건으로 건조하고, iPr2NH (5.30 mL, 37.4 mmol, 1.1 당량, 0.27 M 최종 농도) 및 THF (100 mL)를 채웠다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 냉각시키면서, nBuLi (헥산 중의 1.28 M, 27.8 mL, 35.7 mmol, 1.05 당량, 0.26 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 +10 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~10 분) 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 15 분간 0 ℃에서 교반하고, -78 ℃로 냉각하고, THF (5 mL) 중의 에틸 아이소뷰티레이트 (4.6 mL, 4.0 g, 34 mmol, 1.0 당량, 0.24 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 -65 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~5 분간) 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 45 분간 -78 ℃에서 교반한 다음, THF (5 mL) 중의 1-브로모-2-클로로 에탄 (2.8 mL, 34 mmol, 1.0 당량, 0.24 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 -68 ℃를 초과하지 않는 속도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 15 분간 -78 ℃에서 교반하고, 0 ℃로 가온하고, 15 분간 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL) 및 5% KHSO4 (100 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 톨루엔 (10 mL x 2)으로부터 농축하여 밝은 노란색 오일로서 4.85 g (27 mmol, 79%)의 원하는 클로라이드를 수득하였다:
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ4.14 (q, J=7.2 Hz, 2 H), 3.43 - 3.57 (m, 2 H), 1.94 - 2.19 (m, 2 H), 1.27 (t, J=7.1 Hz, 3 H), 1.22 (s, 6 H)
(b) 에틸 4-아지도-2,2-다이메틸뷰타노에이트 .
Figure pct00011
100-mL의 둥근바닥 플라스크에 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착하고, 에틸 4-클로로-2,2-다이메틸뷰타노에이트 (2-1) (4.85 g, 27 mmol, 1.0 당량, 0.54 M 최종 농도), DMSO (50 mL), 및 소듐 아자이드 (2.28 g, 35 mmol, 1.3 당량, 0.70 M)를 채웠다. 반응 혼합물을 블라스트 쉴드 뒤에서 70 ℃에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 EtOAc (200 mL) 및 H2O (100 mL)으로 희석하였다. 유기 상을 분리하고, H2O (3 x 100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 0%, 5%, 10%, 20% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 4.33 g (23.3 mmol, 87%)의 원하는 아자이드를 밝은 노란색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ4.15 (q, J=7.1 Hz, 2 H), 3.22 - 3.35 (m, 2 H), 1.81 - 1.96 (m, 2 H), 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3 H), 1.15 - 1.24 (m, 6 H)
(c) 5-아지도-1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-펜타논 .
Figure pct00012
500-mL, 3-넥 둥근 바닥 플라스크에 교반 막대, 3개의 고무 격막, 열전대 프로브 및 질소 주입구 바늘를 장착하고, 다이메틸설폰 (5.59 g, 59.4 mmol, 2.2 당량, 0.42 M 최종 농도) 및 THF (100 mL)를 채웠다. 혼합물을 주위 온도에서 15 분간 교반한 다음, 0 ℃로 냉각하면서 n-BuLi 용액 (42 mL, 54 mmol, 2.0 당량, 0.39 M 최종 농도)을 내부 온도가 +5 ℃를 초과하지 않는 속도 (추가 ~10 분 필요)로 적가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 15 분간 교반한 다음, -78 ℃로 냉각하면서, THF (10 mL) 중의 에스터 용액 (5.0 g, 27.0 mmol, 1.0 당량, 0.19 M 최종 농도)을 캐눌라를 통해 내부 온도가 - 70 ℃를 초과하지 않는 속도 (추가 ~ 5 분 필요)로 적가하였다. 반응 혼합물을 - 78 ℃에서 10 분간 교반하고, 0 ℃로 가온하고 (배스 제거), 0 ℃에서 30 분간 교반하였다. 반응 진행을 TLC로 분석하였고, 출발 물질이 더욱 극성인 생성물로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 0 ℃로 냉각시면서, 1 M HCl를 첨가하고 반응 혼합물을 H2O (100 mL) 및 EtOAc (200 mL)으로 추가적으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 100 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 황색 오일을 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피 (120 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리 30%, 40%, 50% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 3.49 g (15.0 mmol, 55 % 수율)의 원하는 생성물을 백색 고체로서 수득하였다.
(d) 5-아지도-1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-펜탄올.
Figure pct00013
200-mL, 회수 플라스크에 고무 격막, 교반 막대, 및 질소 주입구를 장착하고, 5-아지도-1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-펜타논 (3.44 g, 14.8 mmol, 1.0 당량, 0.25 M 최종 농도) 및 메탄올 (60 mL)을 채웠다. 용액을 0 ℃로 냉각하면서, NaBH4 (279 mg, 7.37 mmol, 0.5 당량, 0.12 M 최종 농도)를 고체로서 소량 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분간 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (EtOAc) (100 mL), 5% KHSO4 (100 mL), 및 물 (100 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 100 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 백색 반고체를 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피 (120 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 40%, 50% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여,3.4 g (13.7 mmol, 93% 수율)의 원하는 알코올을 백색 고체로서 수득하였다.
(e) 5-아지도-1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-펜틸 석신이미딜 카보네이트.
Figure pct00014
100-mL, 둥근바닥 플라스크에 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착하고, 5-아지도-1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-펜탄올 (2.00 g, 8.50 mmol, 1.0 당량, 0.25 M 최종 농도), DCM (35 mL), 및 트라이포스진 (0.93 g, 3.1 mmol, 0.37 당량)을 채우고 0 ℃로 냉각하였다. 피리딘 (0.72 mL, 8.9 mmol)을 실린지를 통해 적가하고 반응 혼합물을 0 ℃에서 5 분간 교반하고, 10 분에 걸쳐 주위 온도로 가온하고, 주위 온도에서 45 분간 교반하였다. 반응 진행을 TLC로 모니터링하였고, 클로로포메이트로 완전히 전환되었음을 나타냈다. N-하이드록시석신이미드 (1.17 g, 10.2 mmol, 1.2 당량)을 고체로서 소량 첨가한 다음, 피리딘 (0.82 mL, 10.20 mmol, 1.2 당량)을 적가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 30 분간 교반하였다. 반응 진행을 TLC로 모니터링하였고, 클로로포메이트가 원하는 석신이미딜 카보네이트로 완전히 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 다이클로로메테인 (DCM) (30 mL) 및 5% KHSO4 (30 mL)으로 희석하였다. 수상을 DCM (2 x 30 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 포화 NaHCO3 (30 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (80 g, 실리카 겔 카트리지, 단계적 구배 40, 50, 60% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 2.36 g (6.27 mmol, 74% 수율)의 원하는 석신이미딜 카보네이트를 무색 오일로서 수득하였다.
이러한 과정에 따라 제조된 추가적인 알코올 및 클로로포메이트 및 석신이미딜 카보네이트 화합물은, n = 1-3, R2 = H, 각 R4 = Me, 및 R1 = MeSO2, PhSO2, (4-클로로페닐)SO2, (4-메틸페닐)SO2, 아이소프로필-SO2, N,N-다이메틸아미노-SO2, (4-메틸피페리디닐)SO2, 모폴리노-SO2, 싸이오모폴리노-SO2, N-에틸-N-메틸아미노-SO2, 및 N,N-비스(2-메톡시에틸)아미노-SO2인 것을 포함한다.
실시예 1
R7 = 치환된 알킬을 가지는 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 합성
Figure pct00015
R1 = MeSO2, R2 및 각 R4는 H, n = 4, R7는 2-메톡시에틸, 및 Z*는 트라이아졸인 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 합성이 컨쥬게이트의 제조에 의해 예시된다. 상이한 R1 또는 다른 기를 가지는 유사한 컨쥬게이트를 적절한 클로로포메이트 또는 석신이미딜 카보네이트로 시작하여 동일한 방법에 따라 제조할 수 있다 (제조 A).
N-(클로로메틸)카바메이트의 합성. 20-mL 신틸레이션 바이알에 교반 막대 및 스크류 캡을 장착하고, 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 석신이미딜 카보네이트 (560 mg, 1.49 mmol, 1.0 당량, 0.23 M 최종 농도) (문헌 [Santi et al., 2012 Proc Natl Acad Sci US109: 6211-6]), MeCN (6 mL), 메톡시 에틸amine (143 μL, 1.64 mmol, 1.1 당량, 0.25 M 최종 농도), 및 iPr2NEt (0.39 mL, 2.29 mmol, 1.5 당량, 0.35 M 최종 농도)를 채웠따. 반응 혼합물을 주위 온도에서 30 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL) 및 5% KHSO4 수용액 (30 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 30 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수 (30 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (80 SiO2; 단계적 구배 용리: 50%, 60%, 70%, 100% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 318 mg (0.948 mmol, 63%)의 카바메이트를 무색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ5.14 - 5.23 (m, 1 H), 5.04 - 5.13 (m, 1 H), 3.43 - 3.50 (m, 2 H), 3.32 - 3.41 (m, 6 H), 3.28 (t, J=6.8 Hz, 2 H), 3.15 (m, J=4.9 Hz, 1 H), 3.00 (s, 3 H), 1.78 (br. s., 2 H), 1.51 - 1.69 (m, 2 H), 1.42 (d, J=4.3 Hz, 4 H). C12H24N4O5S에 대해 계산된 LCMS (ESI) m/z [M+Na]+: 337.2; 관측치: 337.1.
20 mL 신틸레이션 바이알에 교반 막대 및 스크류 캡을 장착하고, 카바메이트 (150 mg, 0.445 mmol, 1.0 당량, 0.1 M 최종 농도), 1,2-다이클로로에탄 (4.5 mL), 파라폼알데하이드 (27 mg, 0.892 mmol, 2 당량, 0.2 M), 및 TMSCl (0.23 mL, 1.8 mmol, 4 당량, 0.40 M)을 채웠다. 반응 혼합물을 50 ℃에서 24 시간 동안 가열하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (ELSD, 0-100%B)으로 모니터링하였고, 출발 물질 (RT = 8.92 분)이 덜 극성인 생성물 (RT = 10.89 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 여과하고, 농축하고, 50% EtOAc/헥산 (10 mL)에 용해시켰다. 생성된 탁한 용액을 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과하고 생성된 여액을 농축하여 175 mg (약 0.45 mmol, 정량 수율)을 수득하였다. 생성물 N-(클로로메틸)카바메이트를 THF (1.8 mL)에 바로 용해시키고 추가의 정제 없이 사용하였다.
Z = 아자이드, n = 2, R1 = MeSO2, R2 = H, 각 R4 = Me, 및 y는 = N(R7)CH2 (여기서 R7 = 2-메톡시에틸)인 N-(클로로메틸)카바메이트를 제조 A의 상응하는 링커 석신이미딜 카보네이트로부터 출발하여 유사하게 제조하였다. 25-mL 둥근바닥 플라스크에 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착하고, 석신이미딜 카보네이트 (1.0 g, 2.7 mmol, 1.0 당량, 0.23 M 최종 농도), 아세토나이트릴 (10.8 mL), 및 메톡시에틸 아민 (0.28 mL, 3.2 mmol, 1.2 당량)을 채웠다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반하면서, iPr2NEt (0.71 mL, 4.1 mmol, 1.5 당량)을 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 30 분간 교반하였다. TLC 분석은 카보네이트가 새로운 생성물로 완전히 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL) 및 5% KHSO4 (20 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 20 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔; 40, 50, 80% EtOAc/헥산의 단계적 구배 용리)를 통해 정제하여, 828 mg (2.71 mmol, 91% 수율)의 원하는 생성물을 무색 오일로서 수득하였다. 20-mL 신틸레이션 바이알에 교반 막대 및 스크류 캡을 장착하고, 카바메이트 (153 mg, 0.45 mmol, 1.0 당량, 0.10 M 최종 농도), DCE (4.5 mL), 파라폼알데하이드 (55 mg, 1.82 mmol, 4.0 당량), 및 TMSCl (230 μL, 1.82 mmol, 4 당량)을 채웠다. 바이알을 플라스틱 스크류 캡으로 밀봉하고 반응 혼합물을 50 ℃에서 24 시간 동안 가열하였다. 반응 과정은 뷰탄올 (200 μL) 중 5 mM iPr2NEt로 희석된 분취량의 반응 혼합물 (2 μL)을 C18 HPLC/ELSD (0-100%B)으로 모니터링하였고, 카바메이트 (RT = 8.56 분)가 덜 극성인 생성물 (RT = 10.64 분)으로 완전히 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 코튼 플러그를 통해 여과하고, 농축하고, 50% EtOAc/헥산 (5 mL)에 재용해시키고, 여과하고, 밝은 황색 오일로 농축하였다. 이러한 미정제 생성물을 THF에 용해시키고 추가의 정제 없이 바로 사용하였다.
Figure pct00016
방출 가능한 링커-탈라조파립 (D = 탈라조파립인 화학식(II))의 합성. 히트-건 건조된 10-mL 둥근바닥 플라스크에 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구 바늘를 장착하고, 탈라조파립 (100 mg, 0.263 mmol, 1.0 당량, 65 mM 최종 농도) 및 THF (2.5 mL)을 채웠다. 용액을 -78 ℃로 냉각하면서, NaHMDS 용액 (THF 중의 1 M, 0.26 mL, 0.263 mmol, 1.0 당량, 65 mM 최종 농도)을 실린지를 통해 천천히 적가하였다. 반응 혼합물을 -78 ℃에서 5 분간 교반한 다음, N-(클로로메틸)카바메이트 용액 (THF 중의 0.26 M, 1.3 mL, 0.342 mmol, 1.3 당량, 84 mM 최종 농도)을 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 -78 ℃에서 15 분간 교반하고, 15 분에 걸쳐 0 ℃로 가온하고, 0 ℃에서 30 분간 교반하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (0-100% B, 310 nm)으로 모니터링하였고, 탈라조파립 (RT = 8.55 분)이 덜 극성인 생성물 (RT = 10.67 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 EtOAc (10 mL) 및 10% 시트르산 (10 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 10 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수 (10 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 황색 잔여물을 수득하였다. C18 분취용 HPLC (35-70%B TFA 없음)을 통해 정제하여, 95 mg (0.130 mmol, 50%)의 원하는 생성물 (Z = 아자이드, n = 4, R1 = MeSO2, R2 및 각 R4 = H, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, 및 D = 탈라조파립인 화학식(II)의 링커-약물)을 백색 고체로서 수득하였다. C32H38F2N10O6S에 대해 계산된 LCMS (ESI) m/z [M+H]+: 729.3; 관측치: 729.2. C18 HPLC는 310 nm에서 모니터링하였다: 91% (0-100%B, RT = 9.95 분). 알킬화의 위치화학은 2D-NMR 상관관계에 의해 결정하였다.
방출 가능한 링커-탈라조파립 (D = 탈라조파립인 화학식(II))을 또한 하기 제공되는 절차에 따라 제조하였다. 히트-건 건조된 10-mL 둥근바닥 플라스크에 교반 막대, 고무 격막, 질소 주입구 바늘, 및 열전대 프로브를 장착하고, TLZ (100 mg, 0.263 mmol, 1.0 당량, 0.1 M 최종 농도) 및 THF (2.6 mL)를 채웠다. 혼합물을 -78 ℃로 냉각하면서, NaHMDS의 용액을 (THF 중의 1 M, 0.26 mL. 0.26 mmol, 1.0 당량, 0.1 M 최종 농도) 내부 온도가 -72 ℃를 초과하지 않는 속도 (대략 2 분 이상) 적가하였다. 반응 혼합물을 -78 ℃에서 5 분간 혼합한 다음 링커 클로로메틸 카바메이트의 용액 (THF 중의 0.5 M, 0.68 mL, 0.34 mmol, 1.3 당량, 0.1 M 최종 농도)을 내부 온도가 -72 ℃를 초과하지 않는 속도로 적가하였다. 반응 혼합물을 -78 ℃에서 5 분간 교반하고, 15 분에 걸쳐 0 ℃로 가온하고, 0 ℃에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (10 분에 걸쳐 0-100%, 310 nm)으로 모니터링하였고, TLZ (RT = 8.43 분)가 덜 극성인 생성물 (RT = 7.64 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 -78 ℃로 냉각하고, 0.1 M Tris (pH 7.5, 3 mL)를 내부 온도가 -50 ℃를 초과하지 않는 속도 천천히 첨가하였다. 가능한 격렬하게 교반하면서 생성된 혼합물을 주위 온도로 가온하였다 (차가운 배스 제거) (수성층은 해동되어야 함). 혼합물을 EtOAc (30 mL)와 0.1 M Tris (pH 7.5, 30 mL) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고 EtOAc (3 x 30 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 황색 오일을 수득하였다. 분취용 C18 HPLC (15 분에 걸쳐 35-70%B, 310 nm)를 통해 정제하여, 90 mg (0.141 mmol, 54% 수율)의 원하는 컨쥬게이트를 황색 유리질 오일로서 수득하였다.
유사한 방법을 사용하여, Z = 아자이드, n = 2, R1 = MeSO2, R2 =H, 각 R4 = Me, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, 및 D = 탈라조파립인 화학식(II)의 링커-약물을 제조하였다. 4-mL 바이알에 교반 막대, 격막 스크류 캡, 및 질소 주입구를 장착하고, TLZ (22 mg, 0.06 mmol, 1 당량, 50 mM 최종 농도) 및 THF (0.6 mL)를 채웠다. 구아니딘 염기 7-메틸-1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]덱-5-엔 (MTBD) (11 μL, 0.080 mmol, 1.3 당량)을 첨가하고 반응 혼합물을 1-2 분간 교반한 후 클로로메틸 카바메이트 용액 (THF 중의 100 mM (0.78 mL, 0.080 mmol, 1.3 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반하였다. 뷰탄올 (200 μL) 중 5 mM iPr2NEt에 희석하여 반응 분취량 (2 μL) ??칭에 대해 반응 진행을 C18 HPLC로 모니터링하였다. HPLC 분석은 TLZ (RT = 8.53 분)가 덜 극성인 생성물 (10.07 분)로 전환되었음을 나타냈고, 약 53%의 전체 전환율 (15 분 내지 1 시간 전환 사이에 5% 변화)이었다. 반응 혼합물을 -78 ℃로 냉각하고, 2 mL의 0.1 N Tris (pH 7.5)를 적가하였다. 가능한 격렬하게 교반하면서 생성된 혼합물을 주위 온도로 가온하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (10 mL) 및 0.1 N Tris (pH 7.5) (10 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 5 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 분취용 HPLC (35-70%B TFA 없음)을 통해 정제하여,14 mg (0.02 mmol, 32% 수율)의 원하는 링커-TLZ를 수득하였다. 순도는 310 nm에서 C18 HPLC를 모니터링하여 결정하였다: 98% (0-100%B, RT = 10.00 분).
동일한 방법을 사용하여, 다음의 추가적인 화학식(II)의 링커 약물을 제조하였다:
Z = 아자이드, n = 4, R1 = MeSO2, R2 =H, 각 R4 = H, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, 및 D = 올라파립인 것인 링커 약물;
Z = 아자이드, n = 4, R1 = MeSO2, R2 =H, 각 R4 = H, Y = N(R7)CH2, R7 = 4-(N,N-다이에틸카복사마이도)페닐, 및 D =탈라조파립인 것인 링커 약물;
Z = 아자이드, n = 2, R1 = 싸이오모폴린-SO2, R2 =H, 각 R4 = Me, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, 및 D = 탈라조파립인 것인 링커 약물.
방출 가능한 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 합성. 20 mL 신틸레이션 바이알에 PEG40kDa-[5HCO]4 (MeCN 중의 24.5 mM, 4.1 mL, 0.1 mmol, 1.0 당량, 25 mM 최종 농도)의 용액 및 화학식(II)의 아지도-링커-탈라조파립 (여기서 Z = 아자이드, n = 4, R1 = MeSO2, R2 및 각 R4 = H, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, 및 D = 탈라조파립 (95 mg, 0.130 mmol, 1.3 당량, 32 mM 최종 농도))을 채웠다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 24 시간 동안 가열하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (0-100%B, 310 nm)으로 모니터링하였고, 링커-탈라조파립 (RT = 9.95 분)이 더욱 극성인 생성물 (+RT = 9.17 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 400 mL MeOH에 대해 18 시간 동안 투석하였다 (12,000-14,000 MWCO). 잔류물을 농축하고, THF (10 mL)에 재용해시키고, 격렬하게 교반하는 MTBE (100 mL)에 천천히 첨가하여 침전시켰다. 생성된 고체를 소결 유리 깔때기에서 진공 여과에 의해 수집하고, MTBE (3x100 mL)으로 세척하고, 고진공 하에서 건조시켜, 700 mg (0.064 mmol TLZ, 64% 수율)의 PEG 컨쥬게이트를 무색 잔류물로서 수득하였다. C18 HPLC는 310 nm에서 모니터링하였다: 90% (0-100%B, RT = 9.17 분).
상기 제공된 절차에 따라 제조된 방출 가능한 PEG-TLZ 컨쥬게이트의 샘플을 pH 9.0 또는 9.4의 완충액에 용해시키고 37 ℃에서 유지하였다. HPLC 분석은 유리 탈라조파립이 3.40 및 1.69 시간의 반감기로 방출되었음을 나타냈으며, 각각, pH 7.4에서 168-135 시간의 반감기를 추정하였다. 대조적으로, 유사한 안정한 컨쥬게이트 (R1은 H)는 18 시간에 걸쳐 pH 5.0, 7.4, 또는 9.4에서 유리 탈라조파립의 방출을 나타내지 않았다.
상기 제공된 절차에 따라 제조된 방출 가능한 PEG-TLZ 컨쥬게이트의 용액 (Z* = 트라이아졸, n = 4, R1 = MeSO2, R2 및 각 R4 = H, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, y = 4, 및 D = 탈라조파립인 화학식(III))을 pH 9.4, 8.4, 7.4, 5.0, 및 pH 1.1의 완충액에서 37 ℃로 가열하였다. 각 용액에서 방출된 TLZ 분획의 양을 측정하였으며 결과가 도 8에 도시되어 있다. 하이드록사이드 촉매화된 방출이 pH 7.4에서 9.4에 걸쳐 관찰되었다. 삽입된 그림은 m = 1.00, R2 = 0.9980인 TLZ 방출에 대한 pH-logobsd 플롯을 도시한다.
유사한 화학식(III)의 컨쥬게이트 (여기서 Z* = 트라이아졸, n = 2, R1 = MeSO2, R2 =H, 각 R4 = Me, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, y = 1, 및 D = 탈라조파립)를 20-kDa PEG-DBCO를 사용하여 유사하게 제조하였고, pH 7.4에서 300 시간에 해당하는 반감기로 탈라조파립을 방출하였다.
실시예 2
아실화된 탈라조파립 컨쥬게이트의 제조 및 안정성 연구
Figure pct00017
아실화에 의한 “방출 불가능한” PEG-탈라조파립. 히트-건 건조된 10-mL 둥근바닥 플라스크에 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착하고, 탈라조파립 (15 mg, 39 μmol, 1.0 당량) 및 THF (1 mL)를 채운 다음 -78 ℃로 냉각하였다. NaHMDS 용액 (THF 중의 1.0 M, 39 μL, 39 μmol, 1.0 당량)을 실린지를 통해 적가하고 반응 혼합물을 -78 ℃에서 5 분간 교반하였다. 링커 클로로포메이트 1-1 용액 (THF 중의 0.5 M, 94 μL, 47 μmol, 1.2 당량)을 실린지를 통해 적가하고 반응 혼합물을 - 78 ℃에서 5 분간 교반하고, 20 분에 걸쳐 0 ℃로 가온하고, 0 ℃에서 45 분간 교반하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (0-100%B, 310 nm)으로 모니터링하였고, 탈라조파립 (RT = 8.36 분)이 덜 극성인 생성물 (RT = 10.78 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 EtOAc (10 mL)와 10% 시트르산 (10 mL) 사이에 분배하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 10 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 이러한 미정제 생성물을 MeCN (2 mL)에 용해시키고 추가의 정제 없이 사용하였다. C26H25F2N9O3에 대해 계산된 LCMS (ESI) m/z [M+H]+ : 550.2; 관측치: 550.1. C18 HPLC는 310 nm에서 모니터링하였다: 90% (10% TLZ; 0-100%B, RT = 10.78 분)
1.5-mL 원심분리 튜브에 PEG20kDa-DBCO의 용액 (4.4 mM, 1.0 mL, 4.4 μmol, 1.0 당량) 및 상기 안정한 링커-탈라조파립의 용액 (MeCN 중의 23 mM, 240 μL, 5.5 μmol, 1.3 당량)을 채웠다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (0-100%B, 310 nm)으로 모니터링하였고, N3-L(St)-탈라조파립 (RT = 10.78 분) 및 PEG-DBCO (RT = 9.20 분)이 중간 극성의 생성물 (RT = 9.36 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각하고 24 시간 동안 400 mL MeOH에 대해 투석하였다 (12,000-14,000 MWCO). 잔류물을 황색 잔류물로 농축하고 MeCN (2 mL)에 용해시켰다. C18 HPLC는 310 nm에서 모니터링하였다: 83% (0-100%B, RT = 9.36 분).
Figure pct00018
아실화에 의한 “방출 가능한” PEG-탈라조파립. 히트-건 건조된 10-mL 둥근바닥 플라스크에 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착하고, 탈라조파립 (8 mg, 20 μmol, 1.0 당량) 및 THF (1 mL)를 채운 다음 -78 ℃로 냉각하였다. NaHMDS 용액 (THF 중의 1.0 M, 21 μL, 21 μmol, 1.0 당량)을 실린지를 통해 첨가하고 반응 혼합물을 -78 ℃에서 10 분간 교반하였다. 링커 클로로포메이트 1-4 용액 (THF 중의 400 mM, 63 μL, 25 μmol, 1.2 당량)를 실린지를 통해 적가하고, 반응 혼합물을 - 78 ℃에서 5 분간 교반하고, 20 분에 걸쳐 0 ℃로 가온하고, 0 ℃에서 45 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (10 mL)와 H2O (10 mL) 사이에 분배하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 10 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 이러한 미정제 생성물을 추가의 정제 없이 사용하였다. C28H29F2N9O5S에 대해 계산된 LCMS (ESI) m/z: 642.2; 관측치: 642.1 C18 HPLC는 310 nm에서 모니터링하였다: 50% (50:50 생성물: TLZ; 0-100%B, RT = 10.21 분).
유리 4 mL 바이알에서, 미정제 링커-TLZ의 용액 (MeOH 중의 12 mM, 417 μL, 5.0 μmol, 1.0 당량)을 PEG20kDa-DBCO 용액 (MeCN 중의 4.3 mM, 1.8 mL, 7.7 μmol, 1.5 당량)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 16 시간 동안 400mL의 MeOH에 대한 투석을 통해 (12,000-14,000MW CO) 정제하여 잔류물의 농도는 원하는 화합물을 제공하였다. C18 HPLC는 310 nm에서 모니터링하였다: 93% (0-100% B, RT = 9.28 분).
컨쥬게이트 1-3 (Mod = H)의 안정성을 37 ℃에서 pH 9.4, 7.4, 및 5.0에서 평가하였으며 결과는 도 9A에 도시되어 있다. 컨쥬게이트는 pH 5.0에서 상당히 안정적이었고, 11시간에 걸쳐 2% 손실이 있었다. 그러나, pH 의존적 불안정성이 발견되었으며, 각각 pH 9.4 및 7.4에서, 95% 및 75%의 컨쥬게이트의 상당한 손실이 있었다. 컨쥬게이트 1-6의 안정성을 또한 37 ℃에서 pH 9.0 및 5.0에서 평가하였으며 결과가 도 9B에 도시되어 있다. 방출 가능한 컨쥬게이트 (R1= SO2Me)는 pH 9.4에서 컨쥬게이트의 급속한 손실, 뿐만 아니라 pH 5에서 상당한 제거를 나타냈다.
실시예 3
R7 = 치환된 아릴을 가지는 탈라조파립의 방출 가능한 컨쥬게이트
탈라조파립 컨쥬게이트는 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 미국 특허 8,754,190의 링커, 즉, R7 = 아릴인 링커를 사용하여 제조하였다. 링커-클로로메틸 카바메이트로 처리하기 전에 NaHMDS를 사용한 탈라조파립의 탈양성자화는 50-80% 전환율로 진행되었다. 안정한 알킬화된-탈라조파립 컨쥬게이트은 우수한 안정성을 나타내었고, 37 ℃, pH 9.4, 7.4, 및 5.0에서 대략 15 시간에 걸쳐 손실이 관찰되지 않았다. 도 10에 도시된 바와 같이, 방출 가능한 컨쥬게이트가 완충제에 배치될 때 pH 9.0 및 7.4 모두에서 중간체의 축적이 관찰되었다. 중간체는 LCMS에 의해 만니히 염기 R7-CH2-TLZ로서 식별되었다. pH 7.4에서 PEG-컨쥬게이트는 약 88시간의 반감기를 가지며, 만니히 염기는 11.73시간의 TLZ 방출에 대한 추정된 t1/2를 가진다.
Figure pct00019
실시예 4
링커-올라파립의 제조 및 안정성 연구
Figure pct00020
단계 1. 6-아지도헥실 N-(2-메톡시에틸)-N-클로로메틸 카바메이트. 파라폼알데하이드 (37 mg, 1.2 mmol) 및 클로로트라이메틸실란 (311 μL, 2.46 mmol)을 6 mL의 1,2-다이클로로에탄 중의 6-아지도헥실 N-(2-메톡시에틸) 카바메이트 (150 mg, 0.615 mmol, 0.1 M 최종 농도) 용액에 연속적으로 첨가하였다. 교반된 반응물을 50 oC 오일 배스에 넣고, C18 HPLC로 모니터링하였다. 24 시간 이후, 반응이 완료된 것으로 판단되었다. 반응 혼합물을 건조 농축하고, 생성된 잔류물을 10 mL의 1:1 EtOAc:헥산으로 처리하였다. 현탁액을 0.2 μm 실린지 필터를 통해 여과시키고, 여액을 건조 농축시켜 미정제 표제 화합물 (187 mg)을 무색 액체로서 제공하고 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 2. 6-아지도헥실 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립) 카바메이트. N2 하에서 히트 건/진공 건조된 둥근 바닥 플라스크에서, 올라파립 (10.8 mg, 24.9 μmol, 0.02 M 최종 농도)을 1.0 mL THF에 현탁시켰다. 현탁액을 -78 ℃ 아세톤/드라이 아이스 배스에서 냉각시키고, THF 중의 1.0 M NaHMDS 용액 (30 μL, 30 μmol)을 첨가하였다. -78 oC에서 5 분간 교반한 이후, 반응을 5 분간 공기-가온하였으며, 이 시간 동안 반응은 주황색으로 변했다. -78 ℃로 재냉각한 후, THF 중의 6-아지도헥실 N-(2-메톡시에틸)-N-클로메틸 카바메이트 0.3 M 용액 (108 μL, 32.4 μmol)을 첨가하였다. 차가운 배스를 제거하고, 주황색 반응물을 공기-가온하였다. 20 분 이내에, 주황색으로부터 밝은 황색으로 색상이 변했다. 2 시간 후, 반응 혼합물을 20 mL의 1:1 EtOAc:H2O에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 유기 상을 H2O 및 염수 (각각 10 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, MgSO4으로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발로 농축시켰다. 미정제 농축물을 SiliaSep 4 g 컬럼에 로딩하고, 헥산 중의 아세톤의 단계적 구배 (0%, 20%, 40%; 각 30 mL 이후 60%, 80%; 각 40 mL)으로 생성물을 용리하였다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 건조 농축하여, 무색 필름으로서표제 화합물 (6 mg, 9 μmol, 37% 수율)을 수득하였다. C18 HPLC, 280 nm에서 순도를 결정하였다: 92.1% (RV = 10.56 mL). LC-MS (m/z): 계산치, 691.3; 관측치, 691.4 [M+H]+.
단계 3. 6-아지도헥실 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립) 카바메이트 (방출 불가능한 PEG-올라파립)의 MeO-PEG 20kDa -DBCO 트라이아졸. 1.5 mL 에펜도르프 튜브에서, m-PEG20kDa-DBCO (400 μL, 2.0 μmol)의 5 mM 용액을 MeCN 중의 6-아지도헥실 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립) 카바메이트 (0.42 mL, 2.1 μmol, 2.5 mM 최종 농도)의 5 mM 용액과 함께 혼합하였다. 반응 튜브를 37 ℃ 물 배스에 1 시간 동안 두고, 이후 Speed Vac를 사용하여 0.1 mL로 농축하였다. 잔류물을 H2O로 1.0 mL으로 희석하고 PD MidiTrap 컬럼에서 정제하였다. 물로 용리하여 1.2 mL의 표제 화합물을 수용액으로서 제공하였다. C18 HPLC, 280 nm에서 순도를 결정하였다: 93.6% (RV = 9.36 mL).
Figure pct00021
단계 1. 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(2-메톡시에틸)-N-클로로메틸 카바메이트. 파라폼알데하이드 (24 mg, 0.80 mmol) 및 클로로트라이메틸실란 (101 μL, 0.80 mmol)을 연속적으로 1 mL의 1,2-다이클로로에탄 중의 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(2-메톡시에틸)-N-클로로메틸 카바메이트 (67 mg, 0.20 mmol, 0.2 M 최종 농도)의 용액에 첨가하였다. 교반된 반응물을 50 ℃ 오일 배스에 넣고, HPLC로 모니터링하였다. 20 시간 이후, 반응이 완료된 것으로 판단되었다. 반응 혼합물을 건조 농축하고, 생성된 잔류물을 1.5 mL의 1:1 EtOAc:헥산으로 처리하였다. 현탁액을 0.2 μm 실린지 필터를 통해 여과시키고, 여액을 건조 농축시켜 미정제 표제 화합물 (80 mg)을 무색 액체로서 제공하고 이를 추가의 정제 없이 사용하였다.
단계 2. 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립) 카바메이트. N2 하에서 히트 건/진공 건조된 둥근 바닥 플라스크에서, 올라파립 (44 mg, 0.10 mmol, 0.05 M 최종 농도)을 1.5 mL THF에 현탁시켰다. 현탁액을 -78 ℃ 아세톤/드라이 아이스 배스에서 냉각시키고, THF 중의 1.0 M NaHMDS 용액 (100 μL, 100 μmol)을 첨가하였다. 현탁액이 보라색으로 변했다. -78 oC에서 5 분간 교반한 이후, 반응을 5 분간 공기-가온하였다. -78 ℃로 재냉각한 후, THF 중의 0.3 M의 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(2-메톡시에틸)-N-클로메틸 카바메이트 용액 (0.43 mL, 0.13 mmol)을 첨가하였다. 보라색이 즉시 사라졌으며, 생성된 주황색 반응물을 공기-가온하였다. 20 분 이내에, 주황색으로부터 밝은 황색으로 색상이 변했다. 2 시간 후, 반응 혼합물을 40 mL의 1:1 EtOAc:H2O에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 유기 상을 H2O 및 염수 (각각 20 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, MgSO4으로 건조시키고, 여과하고, 회전 증발로 농축시켰다. 미정제 농축액을 분취용 HPLC으로 정제하였다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 ~50%으로 농축하여 MeCN를 제거하였다. 생성된 수성 농출물을 40 mL EtOAc으로 추출하고, 유기 상을 H2O, NaHCO3 (포화 수용액), 및 염수 (각 40 mL)으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 회전 증발에 의해 건조 농축하여 표제 화합물 (20 mg, 26 μmol, 26% 수율)을 무색 오일로서 제공하였다.
C18 HPLC, 280 nm에서 순도를 결정하였다: 88.0% (RV = 9.87 mL).
LC-MS (m/z): 계산치, 783.3; 관측치, 783.4 [M+H]+.
단계 3. 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립) 카바메이트 (방출 가능한 PEG-올라파립 (여기서 R 1 = MeSO 2) )의 MeO-PEG 20kDa -DBCO 트라이아졸. 1.5 mL 에펜도르프 튜브에서, m-PEG20kDa-DBCO (0.40 mL, 2.0 μmol)의 5 mM 용액을 MeCN 중의 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립) 카바메이트 (0.21 mL, 2.1 μmol, 3 mM 최종 농도)의 10 mM 용액과 함께 혼합하였다. 반응 튜브를 37 ℃ 물 배스에 1 시간 동안 두고, 이후 Speed Vac를 사용하여 0.1 mL로 농축하였다. 잔류물을 H2O로 1.0 mL으로 희석하고 PD MidiTrap 컬럼에서 정제하였다. 물로 용리하여 수용액으로서 1.2 mL의 표제 화합물 ((Z* = 트라이아졸, n = 4, R1 = MeSO2, R2 및 각 R4 = H, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, y = 1, 및 D = 올라파립인 화학식(III))을 제공하였다. C18 HPLC, 280 nm에서 순도를 결정하였다: 97.2% (RV = 9.29 mL).
올라파립 안정하게-연결된 PEG 컨쥬게이트의 시험관 내 안정성. 1.5 mL 유리 HPLC 바이알에서, 6-아지도헥실 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립) 카바메이트의 MeO-PEG20kDa-DBCO 트라이아졸의 수용액 (0.1 mL)을 완충액 (0.85 mL) 및 H-Lys(DNP)-OH을 함유하는 DMSO (45 μL) (DMSO 중의 10 mM, 5 μL; 내부 표준)의 예비가열된 용액에 첨가하였다. 바이알을 가열된 (37 ℃) HPLC 오토샘플러에 두고, 안정성 분석을 C18 HPLC로 주기적으로 모니터링하였다. 일주일 이후, 유리 올라파립은 관찰되지 않았다.
R 1 = MeSO 2 를 가지는 가용성 PEG 컨쥬게이트로부터 올라파립 절단의 시험관 내 동역학 두 개의 1.5 mL 유리 HPLC 바이알 각각에서, PEG화된 링커-올라파립 (0.1 mL)의 수용액을 완충액 (0.85 mL) 및 H-Lys(DNP)-OH를 함유하는 DMSO (45 μL) (DMSO 중의 10 mM, 5 μL, 내부 표준)의 예비가열된 혼합물에 첨가하였다. 바이알을 가열된 (37 ℃) HPLC 오토샘플러에 두고, β제거 반응을 C18 HPLC으로 주기적으로 모니터링하였다. 37 ℃, pH 9.58 보레이트에서 관찰된 올라파립 방출의 반감기는 1.56 시간이었다. 상기 데이터로부터, pH 7.4에서 계산된 반감기는 236 시간이다.
실시예 5
4-아암 PEG-올라파립 컨쥬게이트의 제조
Figure pct00022
PEG 40kDa -{7-[(카바모일옥시)-4,5,6,7,8,9-헥사하이드로-1H-사이클로옥타[d][1,2,3]트라이아졸-1-yl]-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립} 4 ,.MeCN 중의 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 N-(2-메톡시에틸)-N-(메틸렌-올라파립) 카바메이트 (실시예 4, 2.3 mL, 23 μmol, 7 mM 최종 농도)의 10 mM 용액을 MeCN 중의 PEG40kDa-[5HCO]4 용액 (21.2 mM 사이클로옥틴, 0.94 mL, 20 μmol 사이클로옥틴; 5 μmol PEG; 문헌 [Henise et al., Engineering Reports 7 Apr 2020; e12213]에 따라 제조)와 혼합하였다. 반응 바이알을 파라필름으로 밀봉하고, 37 ℃ 물 배스에 넣고, 주기적으로 C18 HPLC로 모니터링하였다. 52 시간 후, 반응 혼합물을 20 시간 동안 MeOH에 대해 투석하였다 (12-14k MWCO). 잔류물을 제거하고 ~0.2 mL으로 농축하였다. 농축물을 1 mL THF로 희석한 다음 칭량한 15 mL 팔콘 튜브에 중의 얼음 냉각한 MTBE 10 mL에 첨가하였다. 혼합물을 0 oC에서 20 분간 유지한 다음 원심분리하고 (2000x g, 1 분) 따라내었다. 고체를 MTBE (2x 10 mL)으로 세척하고 상기와 같이 단리하였다. 습윤 고체를 고진공 하에서 건조하여 표제 화합물 (191 mg, 4.31 μmol PEG, 86% 수율)을 백색 고체로서 제공하였다. C18 HPLC, 280 nm에서 순도를 결정하였다: 97.5% (RV = 9.32 mL).
실시예 6
방출 가능한 PEG-루카파립 (R1 = MeSO2)의 제조.
Figure pct00023
아지도-링커-루카파립의 합성. 1.5-mL 유리 바이알에 캡 및 교반 막대를 장착하고, 순차적으로 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 석신이미딜 카보네이트 (18 mg, 47 μmol, 1.0 당량, 47 mM 최종 농도), MeCN (1 mL), 루카파립 포스페이트 (20 mg, 47 μmol, 1.0 당량, 47 mM 최종 농도), iPr2NEt (16 μL, 94 μmol, 2.0 당량, 94 mM 최종 농도), 및 DMSO (0.5 mL)를 채웠다. 반응을 주위 온도에서 30 분간 교반하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (0-100%B, 355 nm)으로 모니터링하였고, 루카파립 (RT = 7.25 분)이 덜 극성인 생성물 (RT = 10.79 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 EtOAc (5 mL)와 10% 시트르산 (5 mL) 사이에 분배하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 5 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (4 g 실리카 겔 카트리지: 50%, 75%, 100 % EtOAc/헥산, 10% 아세톤/EtOAc)를 통해 정제하여, 17 mg (29 μmol, 62%)의 원하는 생성물을 수득하였다. C28H33FN6O5S에 대해 계산된 LCMS (ESI) m/z [M+H]+: 585.2; 관측치: 585.2 C18 HPLC는 355 nm에서 모니터링하였다: 98% (0-100%B, RT = 9.93 분)
Figure pct00024
방출 가능한 PEG-루카파립 컨쥬게이트의 합성. 1.5-mL 원심분리 튜브에 PEG20kDa-DBCO의 용액 (4.9 mM, 1.0 mL, 4.9 μmol, 1.0 당량, 4.9 mM 최종 농도) 및 아지도-링커-루카파립의 용액 (31 mM 링커-루카파립, 174 μL, 5.4 μmol, 1.1 당량, 5.5 mM 최종 농도)을 채웠다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 16 시간 동안 가열하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (0-100% B, 355 nm)으로 모니터링하였고, 링커-루카파립 (RT = 9.94 분)이 더욱 극성인 생성물 (RT = 9.23 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 400 mL에 대해 18 시간 동안 투석하였다 (12,000-14,000 MWCO). 잔류물을 농축하여 97 mg의 PEG 컨쥬게이트를 무색 잔류물로서 수득하였다. C18 HPLC는 355 nm에서 모니터링하였다: 96% (0-100%B, RT = 9.23 분).
실시예 7
방출 가능한 PEG-VX970 (R1 = MeSO2)의 제조.
Figure pct00025
아지도-링커-VX970 (R 1 = MeSO 2 ). 1.5-mL 유리 바이알에 캡 및 교반 막대를 장착하고, 순차적으로 7-아지도-1-(메틸설포닐)-2-헵틸 석신이미딜 카보네이트 (15 mg, 39 μmol, 0.9 당량), MeCN (0.5 mL), VX970 (20 mg, 43 μmol, 1.0 당량), iPr2NEt (10 μL, 60 μmol, 1.5 당량), 및 DMSO (0.5 mL)를 채웠다. 반응을 주위 온도에서 30 분간 교반하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (0-100%B, 310 nm)으로 모니터링하였고, VX970 (RT = 8.56 분)이 덜 극성인 생성물 (RT = 10.85 분)로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 후처리 또는 추가 정제 없이 사용하였다. C33H40N8O7S2에 대해 계산된 LCMS (ESI) m/z [M+H]+: 725.3; 관측치 725.3. C18 HPLC는 310 nm에서 모니터링하였다: 90% (0-100%B, RT = 10.85)
Figure pct00026
방출 가능한 PEG-VX-970 (R 1 = MeSO 2 ). 1.5 mL 원심분리 튜브에 PEG20kDa-DBCO의 용액 (MeCN 중의 4.4 mM, 1.0 mL, 4.4 μmol, 1.0 당량) 및 아지도-링커-VX970의 용액 (171 μL, 4.8 μmol, 1.1 당량)을 채웠다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 30 분간 가열한 다음, 추가의 PEG-DBCO (100 μL, 0.4 μmol, 0.1 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 반응 진행을 C18 HPLC (0-100%B, 310 nm)으로 모니터링하였고, 링커-VX970 (RT = 10.85 분)이 더욱 극성인 생성물 (RT = 9.42 분 )로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각하고, 500 mL MeOH에 대해 18 시간 동안 투석하였다 (12,000-14,000 MWCO). 잔류물을 농축하고 생성된 백색 잔류물을 10 mM NaOAc (pH 5)에 용해시켜 무색 용액 (대략 4 mM)을 제공하였다. C18 HPLC는 310 nm에서 모니터링하였다: >98% (0-100%B, RT = 9.42 분)
실시예 8
PEG-탈라조파립의 약동학 연구
Z* = 트라이아졸, n = 4, R1 = MeSO2, R2 및 각 R4 = H, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, y = 4, 및 D = 탈라조파립인 화학식(III)의 컨쥬게이트
수컷 CD-1 마우스 (N=20, 평균 중량 30 g)에 등장성 아세테이트 (pH 5) 중의 실시예 1에 따라 제조된 방출 가능한 PEG-탈라조파립 (R1 = SO2Me) 또는 방출 불가능한 PEG-탈라조파립(30 μmol/kg, 2.03 mM, 14.8 mL/kg) 용액을 IP 투여하였다. 다양한 시점에 혈액 샘플 (N=4 마우스, 200 μL)을 수집하여 1M 시트레이트/0.1% 플루로닉 F68 (pH 4.5) 용액 (수득한 샘플 부피의 10%)으로 즉시 처리하고 원심분리하여 혈장 샘플 (100 μL)을 제공하고, 이를 처리하는 동안 얼음에 보관하고 분석할 때까지 -80 ℃에서 동결하였다. 채혈 일정은 다음과 같다: 마우스 1-4는 1 시간 및 24 시간에 샘플링하고; 마우스 5-8는 2 시간 및 48 시간에 샘플링하고; 마우스 9-12는 4 시간 및 72 시간에 샘플링하고; 마우스 13-16는 8 시간 및 96 시간에 샘플링하고; 마우스 17-20는 12 시간 및 120 시간에 샘플링하였다.
각 PK 샘플 또는 표준 (10 μL)의 분취량을 내부 표준으로서 15 μM DNP-Lys를 함유하는 MeOH/0.5%AcOH (50 μL)으로 처리하였다. 샘플을 격렬하게 볼텍싱하고, 원심분리하고 (21,000xg, 4 ℃, 10 분), H2O/0.5%AcOH (200 μL)를 함유하는 HPLC 바이알로 옮겼다. 샘플 (220 μL)을 C18 HPLC 컬럼에 주입하고 H2O/MeCN/0.1% TFA (15 분에 걸친 0-100%B)으로 용리하였다. 얼음 위의 마우스 혈청에서 PEG-탈라조파립 용액 (PEG 상의 1 mM 탈라조파립; 0.25 mM 컨쥬게이트)을 연속적으로 희석하여 표준 곡선을 생성하였다. 분취량을 상기와 같이 처리하고 분석하였다. 피크 면적은 농도에 대해 플롯팅하고 선형 방정식에 맞추었다. PEG-탈라조파립에 대한 LLOQ는 16 pmol (10 μL 혈청 중의 2 μM)인 것으로 결정하였다. PK 샘플 농도는 표준 곡선에 대한 보간 피크 면적을 기반으로 계산하고 시간에 대해 플롯했으며 결과는 도 11에 도시되어 있다. 흡수 및 제거 반감기는 1/Y2의 가중치를 갖는 결과 데이터에 이지수 방정식을 피팅하여 계산하였다.
PK 파라미터가 하기 표 1에 제공된다.
표 1. 방출 가능한 PEG-탈라조파립 (Mod = SO2Me)a의 PK 파라미터
용량 30 μmol/kg
C0 b 544 μM
Cmax c 331 μM
Tmax 9 시간
t1/2,α 3 시간
t1/2,β 19 시간
aPK 파라미터는 이중지수 (y=C0*((exp(-k1*t)-exp(-k2*t))에 대한 약동학 데이터의 적합성으로부터 파생됨.
b C0는 t1/2,β를 외삽하여 수득하여 위의 방정식으로부터 계산한 t=0에서의 이론적 농도.
c Cmax 및 Tmax는 최대 농도 및 최대 농도의 시간.
실시예 9
쥐과 MX-1 이종이식편에서 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 효능
MX-1 인간 삼중 음성 유방암 암종 세포주를 Charles River Labs (Frederick, Maryland)으로부터 입수하였다. 세포를 RPMI-1640, 10% FBS및 1% 2 mM L-글루타민, 37 ℃, 95% 공기/5% CO2 분위기에서 배양하였다.
암컷 NCr 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 MX-1 종양 세포 (Matrigel과 1:1로 혼합된 100 μl 무혈청 배지 2x106 세포)를 피하 주사하여 종양 이종이식편을 확립하였다. 종양 이종이식편이 공여 마우스에서 1000-1500 mm3에 도달했을 때, 이를 절제하고, 균일한 크기의 단편으로 나누고 (대략 2.5 x 2.5 mm), Matrigel에 포매하고 수여 마우스에서 피하 투관침 이식을 통해 재이식하였다.
DMSO 중의 탈라조파립 용액 (55 mM, 454 μL)을 10% 다이메틸아세트아마이드, 6% 솔루톨, 및 84% PBS로 구성된 경구 투여 완충액에 첨가하여 탈라조파립 용액 (50 μM)을 제조하였다. 탈라조파립 함량은 10% 다이메틸아세트아마이드, 6% 솔루톨, 및 84% PBS 용액에서 ε310nm = 9872 M-1cm-1에 의해 결정하였고, 0.4 내지 0.9 μmol/kg 탈라조파립을 전달하기 위해 8.5-19 mL/kg으로 p.o. 전달하였다. 최대 8 mM 탈라조파립 (2 mM PEG~[탈라조파립]4)을 함유하는 PEG-탈라조파립의 용액 (실시예 1, R1 = MeSO2, R7 = MeO(CH2)2)을 등장성 아세테이트 (pH 5)에서 제조하고, 0.2 μM 실린지 필터를 통해 멸균 여과하였으며, TLZ 함량은 10% 다이메틸아세트아마이드, 6% 솔루톨, 및 84% PBS에서 ε310nm = 9872 M-1cm-1에 의해 결정하였다. 용량은 15-120 μmol 약물/kg을 전달하기 위해 ~15 mL/kg mL/kg으로 IP 전달하였다.
MX-1 종양을 보유하는 마우스는 종양이 ~100-300 mm3 크기에 도달할 때 투여하였다. 투여 용액을 상기 지시된 바와 같이 투여하였다. 종양 부피 (캘리퍼스 측정: 0.5x(길이x 너비2)) 및 체중을 매주 2회 측정하였다. 데이터는 시간에 대한 상대적 종양 부피로 표시되며 평균 +/- 저SEM으로 표시된다. 큰 종양을 보유하는 마우스는 종양이 1000-3000 mm3에 도달했을 때 투여하였다. 결과가 도 5-7 및 하기 표 3에 나타난다.
개별 마우스의 질병을 설명하는데 사용된 명명법은 문헌 [Houghton et al. (Pediatric Blood & Cancer, 2007 49:928-40)]에 제안된 바와 같으며, 표 2에 요약되어 있다. 진행성 질병 (PD)은 사건까지의 일수로 계산된 종양 성장 지연 (TGD) 값에 기초하여 PD1 또는 PD2로 분류하였다. 각 마우스에 대해 TGD는 사건 발생 시간을 대조군의 사건 발생 시간 중앙값으로 나누어 계산하였다. PD가 있고 치료군에서 사건가 있었던 각각의 개별 마우스에 대해, TGD 값은 해당 마우스에 대한 사건까지의 시간을 대조군에서 사건까지의 시간 중앙값으로 나눔으로써 계산하였다. 사건까지의 중앙값은 Kaplan-Meier 무사건 생존 분포를 기반으로 추정되었다.
표 2. 개별 마우스의 질병을 설명하는 명명법
명칭 약자 설명
진행성 질병 1 PD1 연구 기간 동안 초기 부피로부터 < 50% 회귀 및 종료 시 > 25% 증가; 마우스의 TGD 값 ≤ 1.5
진행성 질병 2 PD2 PD1, 마우스의 TGD 값 > 1.5
안정한 질병 SD 연구 기간 동안 초기 부피로부터 < 50% 회귀 및 종료 시 ≤ 25% 증가
부분 관해 PR 적어도 하나의 시점 동안 종양 부피 회귀 ≥50%이지만 측정가능한 종양 (>0.05 cm3)
완전 관해 CR 적어도 하나의 시점 동안 측정 가능한 종양 덩어리 (< 0.05 cm3) 소실
완전 관해 유지 MCR CR, 및 종양 부피는 연구 종료 시 <0.05 cm3
사건 초기 종양 부피 또는 사망에서 종양 부피의 4배
무사건 생존 EFS 부피가 4배 증가하지 않은 종양에 대한 첫 번째 사건 또는 연구 종료까지의 시간
종양 성장 지연 TGD 이벤트 발생 시간을 대조군의 사건 발생 시간 중앙값으로 나눈 값
표 3 MX-1 종양에 대한 PEG~TLZ Houghton 분석
단일 용량 μmol/kg 용량
μmol/kg 		PD1 PD2 SD PR CR MCR
TLZ 0.4 4 1
TLZ 0.7 2 2 1
PEG~TLZ 120 3* 1* 1
PEG~TLZ 40 2*
PEG~TLZ 13 1 1 1 2
*=D14에 죽은 채로 발견
실시예 10
쥐과 이종이식편에서 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 효능
실시예 1에 따라 제조된 방출 가능한 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 효능을 실시예 9와 유사하게 쥐과 MX-1, KT-10, TC-71, DLD-1 BRCA2-/-, 및 DLD-1 BRCA2wt/wt에서 또한 연구하였다. 결과가 도 12에 도시되어 있다.
피하 KT-10 종양을 보유하는 마우스 (n=5) 코호트에 5- 내지 40-μmol/kg으로 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트를 단일 IP 주사하여 처리하였다. 종양 부피를 매주 측정하고 각 그룹에 대해 무사건 생존(EFS)을 계산했으며, 여기서 사건은 치료 첫날 초기 종양 부피의 4배로 정의하였다. 40 μmol/kg의 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트를 투여하면 제7일에 평균 ~17% 체중 감소가 발생하였지만, 모든 동물은 제14일에 회복하였다. PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 용량 의존적 종양 성장 반응 및 Kaplan-Meier 무사건 생존이 도 12A 및 12B에 도시되어 있으며; 대조군 종양의 EFS 중앙값은 11일이었다. 5 μmol/kg TLZ의 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트로, 3개의 종양은 약간의 퇴행을 나타냈고 EFS 중앙값은 25일이었으며 모든 종양은 사건에 도달하였다. 10 μmol/kg에서, 모든 종양은 >50% 퇴행하였고 48일의 EFS 중앙값을 나타내었으며 4/5 개의 종양이 사건에 도달하였다. 20- 및 40 μmol/kg의 더 높은 용량의 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트에서, 모든 종양은 EFS >8 주를 나타냈고; 20 μmol/kg으로 처리된 그룹에서 5 개 종양 중 4개 및 40 μmol/kg으로 처리된 마우스에서 5 개 종양 중 2 개의 재성장으로 완전히 퇴행하였다. 10 μmol/kg에서 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 용량에 대한 EFS T/C는 4.3이었으며, 이는 종양에 대한 고활성 약제로 적합하다.
TLZ-감응성 BRCA1-결핍 MX-1 종양을 보유하는 마우스는 매일 경구 TLZ 및 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 단일 IP 주사로 처리하였다. PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 용량 의존적 종양 성장 반응 및 Kaplan-Meier 무사건 생존이 도 12C 및 12D에 도시되어 있다. 0.4 μmol/kg (0.15 mg/kg) TLZ 용량의 일일 투여량으로는, 모든 종양에서 초기 크기의 4 배에 도달하지 않았으므로, 사건은 초기 종양 부피의 2배로 정의하였다 (도 12D); 대조군 종양은 중앙값 2x-EFS은 7 일이었고, 0.4 μmol/kg TLZ의 경우 ~3 주 동안 성장 억제가 존재하였으며, 이후 종양이 성장하여 EFS 중앙값이 35 일에 도달하였다. 명백하게, MX-1 종양은 오직 0.1 mg/kg TLZ 일일 투여량으로 12 주 동안 유지된 CR을 나타내는 KT-10만큼 TLZ에 대해 민감하지 않다 (26). 40 μmol/kg TLZ의 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트를 사용하여, 동물은 제8일까지 ~9% 체중 감소가 있었고 5마리 중 2마리가 사망하였다. 나머지 3마리의 마우스는 초기 체중을 되찾았고 50일 동안 종양 성장을 나타내지 않았고; 검열된 사망한 마우스는 신뢰할 수 있는 EFS 분석을 허용하지 않았다. 마우스는 체중 감소 없이 5~30μmol/kg의 PEG-탈라조파립 접합체 단일 용량을 견딜 수 있었다. 13 μmol/kg의 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트 용량은 0.4μmol(0.15mg)/kg/day의 유리 TLZ에 대한 35일 EFS와 유사한 31일의 EFS 중앙값을 생성하였다. 13 μmol/kg에서 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트에 대한 4.4의 EFS T/C는 약물이 이러한 낮은 용량에서 매우 활성임을 나타낸다.
TC-71 종양을 보유하는 마우스는 매일 경구 TLZ 및 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 단일 IP 주사로 처리하였다. 종양 성장은 40 μmol/kg만큼 높은 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트 농도에 의해 억제되지 않았으며, EFS 곡선은 미미한 활성을 나타낸다 (도 12E 및 12F).
BRCA2-/- 및 DLD-1 BRCA2wt/wt 종양을 보유하는 마우스는 매일 경구 TLZ 및 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 단일 IP 주사로 처리하였다. BRCA2-/-의 경우, 20 μmol/kg의 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 1회 주사는 0.87 μmol(0.33mg)/kg/일의 21회 일일 투여량과 동등하게 종양 성장 억제에 효과적이었다 (도 12G). 무사건 생존 중앙값은 10 μmol/kg의 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트로 처리한 동물의 경우 ~5 배 및 일일 TLZ x 21 일 또는 20 μmol/kg PEG-탈라조파립 컨쥬게이트의 단일 용량으로 처리된 동물의 경우 각각 11 또는 13 배 증가하였다 (도 12H). 대조적으로, BRCA2 충만 DLD-1 종양은 QD 경구 TLZ 또는 IP PEG~TLZ에 내성이 있었다 (도 12I 및 12J); 여기에서 대조군에 비해 처리된 동물의 EFS 중앙값은 증가하지 않았다.
실시예 11
4-아암 방출 가능한 컨쥬게이트의 제조
Figure pct00027
20-mL 신틸레이션 바이알에 링커-탈라조파립 (실시예 1) (여기서 Z = 아자이드, n = 5, R1 = MeSO2, R2 및 각 R4 = H, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, 및 D = 탈라조파립 (392 mg, 0.538 mmol, 1.3 당량, 34 mM 최종 농도)) 및 PEG40kDa-[5HCO]4 (15.6 mL, 0.414 mmol, 1 당량, 27 mM 최종 농도)의 용액을 채웠다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 48 시간 동안 가열하였다. C18 HPLC (0-100%B, 310 nm)를 통한 분석은 링커-TLZ가 더욱 극성인 생성물로 전환되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 50%MeOH/H2O (1 L)에 대해 18 시간, 100% MeOH에 대해 4 시간, 및 100% MeOH에 대해 4 시간 동안 투석하였다. 투석 잔류물을 농축하고, THF (30mL)에 용해시키고, 교반 중인 MTBE (250mL)에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도에서 15분 동안 교반하고, 고체를 소결 유리 깔때기를 통한 진공 여과를 통해 수집하였다. 수집된 고체를 MTBE (3 x 100 mL)로 세척하고 진공 하에서 건조하여 2.93 g (0.264 mmol TLZ, 64% 수율)의 원하는 생성물 (Z*는 트라이아졸, n = 5, R1은 MeSO2, R2는 H, 각 R4는 H, Y는 N(R7)CH2, R7은 2-메톡시에틸인 화학식(III)), 및 D는 탈라조파립)을 백색 고체로서 수득하였다. 310 nm에서 C18 HPLC 순도를 결정하였다: 92% (0-100%B, RT = 10.39).
100 mg/mL의 컨쥬게이트를 함유하는 용액을 PEG 및 TLZ 함량에 대해 분석하였다. 변형된 BaCl2/I2 분석을 사용하여 PEG 함량을 측정하였고 (4, 5), PEG~TLZ 함량은 등장성 아세테이트 9872 M-1cm-1을 사용하여 등장성 아세테이트에서 A310에 의해 측정하여 3.6의 비율 (PEG REG를 기준으로 이론치의 95%)을 제공하였다.
컨쥬게이트 (~100 μM)를 함유하는 용액을 H-Lys(DNP)-OH를 함유하는 (10 mM DMSO, 10 μL, 100 μM 최종 농도) 동역학 완충액 (100 mM 보레이트, pH 9.4 또는 9.0, 37 ℃; 100 mM 바이신, pH 8.4, 37 ℃; 100 mM HEPES, pH 7.4, 37 ℃; 100 mM NaOAc, pH 5.0, 37 ℃)에서 37 ℃로 가열하였다. 반응 분취량 (10 μL)을 직접 주입하고 H2O/MeCN/0.1% TFA으로 용출하여 주기적으로 반응 진행을 C18 HPLC (310 nm)으로 모니터링하였다. 피크 영역은 시간에 따라 플롯팅된다. pH 7.4에서 160 시간에 해당하는 탈라조파립 방출의 반감기를 결정하였다.
실시예 12
Z* = 카복사마이드인 컨쥬게이트의 제조
Z* = 카복사마이드인 컨쥬게이트의 제조는 PEG-탈라조파립 컨쥬게이트 (여기서 R1 = MeSO2)의 제조에 의해 예시되며, 및 관련 컨쥬게이트는 상기 실시예로부터 화학식(II)의 적절한 링커-약물을 치환함으로써 제조될 수 있다.
Figure pct00028
Figure pct00029
화학식(II)의 아지도-링커-탈라조파립 (여기서 Z = 아자이드, n = 2, R1 = MeSO2, R2 =H, 각 R4 = Me, Y = N(R7)CH2, R7 = 2-메톡시에틸, 및 D = 탈라조파립 (실시예 1))을 THF에 용해시키고, 얼음에서 냉각하고, 아세트산 (2.5 당량)으로 처리한 후 THF 중의 1.0 M 트라이메틸포스핀 (5.0 당량)으로 처리하였다. HPLC 분석 (~2시간)에 의해 아자이드가 사라질 때까지 반응을 진행한 다음, 물 (10 당량)을 첨가하여 중간체 포스핀이민을 분해한다. 혼합물을 주위 온도로 가온하고, 20 부피의 메틸 t-뷰틸에터 (MTBE)를 첨가하고, 상을 분리하였다. 수성상을 수집하고, MTBE로 세척한 다음, 진공 하에서 건조하여 암모늄 염을 제공하고, 이는 물 및 0.1% 트라이플루오로아세트산을 함유하는 아세토나이트릴을 사용하여 분취용 역상 HPLC에 의해 정제될 수 있으며, 진공 하에서 건조하였다. 건조된 암모늄 염을 THF에 용해시키고, N2-분위기 하에서 THF 중의 4-아암 40-kDa PEG-(석신이미딜 에스터)4 (암모늄 염에 대한 0.9 당량의 석신이미딜 에스터)의 용액에 첨가한 후, N,N-다이아이소프로필-에틸아민 (2 당량)을 첨가하였다. 반응이 종료되면 (~ 1 시간), 반응 혼합물을 교반되는 얼음 냉각의 MTBE 5 부피에 천천히 첨가하여 생성물을 침전시키고, 여과에 의해 수집하고, 진공하에서 건조하여 화학식(III)의 컨쥬게이트 (여기서 M은 40-kDa, 4-아암 PEG, Z*는 카복사마이드, n = 2, R1 = MeSO2, R2 = H, 각 R4 = Me, Y = N(CH2CH2OMe)CH2, D = 탈라조파립, 및 y는 = 4)를 제공하였다.
평균 분자량이 10-40 kDa인 다양한 PEG-석신이미딜 에스터가 상업적으로 입수 가능한 상기 방법에 사용하기 적합하다. 이러한 에스터는 일반 화학식 W-{[CH2CH2O]q(CH2)rCOOSu}y를 가지며 여기서 W는 코어 기이거나 또는 말단 캡핑 기, q = 상기 논의된 바와 같은 PEG 사슬당 에틸렌 옥사이드 단량체의 수, r = 1-6, 및 y는 = 1-8이다. 대표적인 W 코어 기로는 펜타에리트리톨 (y=4), 헥사글리세롤 (y=8), 트라이펜타에리스리톨 (y=8), 다이펜타에리스리톨 (y=6), 소르비톨 (y=6), 글리세롤 (y=3), 및 중심점에 대해 여러 PEG 사슬을 부착하는 역할을 하는 기타 폴리올을 포함한다. 구체적인 구현예에서, W는 펜타에리트리톨이고 y = 4이다. 대표적인 말단 캡핑 W 기는 (C1-C6) 알콕시 및 탄수화물 기를 포함한다. y = 2인 경우, PEG는 화학식 (SuOOC)(CH2)rO[CH2CH2O]q(CH2)rCOOSu를 가진다.
Z* = 카바메이트인 컨쥬게이트는 PEG-(석신이미딜 에스터)를 활성화된 PEG-카보네이트, 예를 들어 PEG-(나이트로페닐 카보네이트)으로 치환하여 제조할 수 있다. Z* = 우레아인 컨쥬게이트는 PEG-(석신이미딜 에스터)를 PEG-아이소시아네이트로 치환하여 제조할 수 있다.
실시예 13
M이 불용성 거대분자 담체인 컨쥬게이트의 제조
베타-제거에 의해 분해되는 가교를 포함하는 하이드로겔 담체의 제조 및 주사 가능한 미소구체로서 이의 제조는, 예를 들어 미국 특허 9,649,385, PCT 공보 WO2019/152672, 및 문헌 [Henise et al., Engineering Reports, 7 April 2020, e12213]에 기재되어 있다. 이러한 불용성 거대분자 담체는 다음과 같은 공지된 방법에 따라 DNA 손상 반응의 억제제의 컨쥬게이트의 제조에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 아세토나이트릴과 같은 미반응성 유기 용매에 현탁된 유리 아미노 기를 포함하는 하이드로겔 미소구체의 멸균 현탁액을 활성 Z' 기를 아미노 기에 부착하는 작용제로 처리한다. 활성화된 담체 M-Z'를 용매로 세척하여 임의의 과량의 시약 및 부산물을 제거한 후, 화학식(II)의 링커-약물을 링커 약물 상의 작용기 Z와 활성화된 담체 상의 Z'의 반응을 수행하는데 요구되는 임의의 추가적인 시약과 함게 첨가하여 화학식(I)의 컨쥬게이트 M-(Z*-L-D)y를 형성하고, 여기서 M은 불용성 거대분자 담체이고 y는 M 상의 L-D 농도를 기술하는 숫자이다.
문헌 [Henise et al. (2020)]의 절차에 따라, 아세토나이트릴 중의 하이드로겔 미소구체의 멸균 현탁액은 과량의 (하이드로겔 아민에 대해 1.5 몰당량)의 사이클로옥틴 시약 5-하이드록시사이클로옥틴 석신이미딜 카보네이트 및 트라이에틸아민 (4 몰당량)과 함께 반응시킨다. 주위 온도에서 14 시간 동안 교반한 이후, 현탁액을 배수하고, 활성화된 미소구체 M-(Z')y (여기서 Z' = 사이클로옥틴)을 세척하여 과량의 시약 및 부산물을 제거한다. 임의의 반응하지 않은 아미노 기는 아세트산 무수물으로 처리하여 캡핑하였다. 그런 다음, 실시예 1의 아지도-링커-약물의 (사이클로옥틴 기에 대한) 1.2 당량을 반응기에 첨가한 후 반응기를 90 시간 동안 37 ℃에서 가열하여 컨쥬게이션 반응을 완료하였다. 생성된 컨쥬게이트 M-(Z*-L-D)y를 세척하여 반응하지 않은 시약 및 부산물을 제거한 다음, 선택적으로 투여에 적합한 제형 완충제로 교환한다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.

Claims (20)

  1. 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서
    M-(Z*-L-D)y
    여기서 M은 거대분자 담체이고;
    y는 M에 부착된 링커-약물 L-D의 수를 기술하는 숫자이고;
    Z*는 연결기이고;
    L은 방출 가능한 링커이고;
    D는 DNA 손상 반응의 억제제인 것인 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, D는 PARP 억제제, ATM 억제제, 또는 ATR 억제제인 것인 컨쥬게이트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서
    Figure pct00030

    여기서 Z*는 연결기이고; n = 0-6이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되 여기서 각 R6은 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; Y는 부재하거나 또는 화학식 N(R7)CH2을 가지되, 여기서 R7은 임의 치환된 C1-C4 알킬 또는 임의 치환된 아릴이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아닌 것인 컨쥬게이트.
  4. 제3항에 있어서, Y는 부재하고 D는 D의 1차 또는 2차 아민 질소 원자에 카바메이트 결합부를 통해 링커 L에 연결되는 것인 컨쥬게이트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, D는 루카파립, 벨리파립, 니라파립, 또는 베르조세르팁인 것인 컨쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Y는 화학식 N(R7)CH2를 가지고 D는 D의 비염기성 질소 원자에 대한 알킬 결합부를 통해 링커 L에 연결되는 것인 컨쥬게이트.
  7. 제6항에 있어서, D는 탈라조파립, 올라파립, 타미파립, E7016, 또는 CEP-9722인 것인 컨쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, M은 분자량이 1,000 내지 100,000 달톤인 PEG이고, y는 = 1-8인 것인 컨쥬게이트.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, M은 유체역학적 반경이 5 내지 50 nm인 것인 컨쥬게이트.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, M은 불용성 거대분자 담체인 것인 컨쥬게이트.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 우레아, 옥심, 싸이오에터, 또는 1,2,3-트라이아졸인 것인 컨쥬게이트.
  12. 제3항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2는 pH 7.4, 37 ℃의 온도에서 100-1000 시간 사이의 D 방출에 대한 반감기를 제공하도록 선택되는 것인 컨쥬게이트.
  13. 제1항에 있어서, 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서
    Figure pct00031
    .
    여기서 M은 거대분자 담체이고; n = 0-6이고; Z*는 연결기이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되, 여기서 각 R6는 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; R7는 임의 치환된 C1-C3 알킬 또는 임의 치환된 아릴이고; y = 1내지 8이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아닌 것인 컨쥬게이트.
  14. 제13항에 있어서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고 y = 4인 것인 컨쥬게이트.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, Z*는 카복사마이드, 카바메이트, 옥심, 싸이오에터, 또는 트라이아졸인 것인 컨쥬게이트.
  16. 제1항에 있어서, 다음의 화학식을 가지는 컨쥬게이트로서
    Figure pct00032

    여기서 M은 거대분자 담체이고; n = 0-6이고; Z*는 연결기이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되, 여기서 각 R6는 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; y = 1 내지 8이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아닌 것인 컨쥬게이트.
  17. 제16항에 있어서, M은 40-kDa 4-아암 PEG이고 y = 4인 것인 컨쥬게이트.
  18. 다음의 화학식의 링커-약물로서,
    Figure pct00033

    여기서 Z는 연결기이고; n = 0-6이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, CN, 또는 SO2R5이되, 여기서 R5는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 N(R6)2이되 여기서 각 R6은 독립적으로 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 헤테로아릴이거나, 또는 N(R6)2는 4-8개 원자의 고리를 형성하고; 각 R4는 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성하고; Y는 부재하거나 또는 화학식 N(R7)CH2을 가지되, 여기서 R7은 임의 치환된 C1-C4 알킬 또는 임의 치환된 아릴이고; D는 DNA 손상 반응의 억제제이고; R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아닌 것인 링커-약물.
  19. 암 치료에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트의 용도.
  20. DNA 손상 반응의 컨쥬게이션된 억제제의 제조 방법으로서, 상기 방법은 제18항의 링커-약물을 연결기 Z*가 형성되는 조건하에서 작용기 Z와 반응할 수 있는 동족 작용기 Z'를 포함하는 활성화된 거대분자 담체와 접촉시키는 단계, 및 선택적으로 컨쥬게이트를 단리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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