KR20210143723A - 내장 통증의 예방 및/또는 치료를 위한 락토콕커스 락티스 균주 - Google Patents

내장 통증의 예방 및/또는 치료를 위한 락토콕커스 락티스 균주 Download PDF

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KR20210143723A
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뮈리엘 코카인-부스케
헬레네 유타메네
보닌 뮈리엘 메르시에
바실리아 데오도로우
발레리 라루트
마리-라인 다버란-밍곳
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엥스티튀 나쇼날 드 르쉐르슈 푸흐 라그리컬튀흐, 랄리망따씨옹 에 랑비허른망
엥스티튀 나쇼날 데 샹스 아플리케 드 툴루즈
쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄
에꼴 딘지니어스 드 푸르판
에꼴 나쇼날레 베떼리네르 드 툴루즈
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Abstract

본 발명은 내장 통증(visceral pain)의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 락토콕커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주 또는 세포 분획에 관한 것이다.

Description

내장 통증의 예방 및/또는 치료를 위한 락토콕커스 락티스 균주
본 발명은 통증, 특히 내장 통증(visceral pain)을 감소시키는 능력을 갖는 락토콕커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주(strain)에 관한 것이며; 이들 균주는 개체에서 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 유용하다. 본 발명은 또한, 이들 락토콕커스 락티스 균주 중에서도 새로운 균주 및 이들을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
내장 통증은 신체의 내부 기관을 포괄하는 내장(viscera)과 관련된 통증이다. 본원에서 내장이라는 용어는 구강으로부터 항문까지 모든 위장관을 포함한다. 이들 기관은 또한, 예를 들어, 심장, 폐, 생식 기관, 방광, 수뇨관, 소화관의 기관, 바람직하게는 혀, 복부 소화관(abdominal gut), 간, 췌장, 비장 및 신장을 포함한다. 내장 통증은 모호하며, 확산적이며, 둔탁하고 쑤시는 통증을 특징으로 하며, 이는 국소화되지만 복부 및/또는 등으로 퍼지는(radiate) 경향을 가질 수 있다. 내장 통증은 불쾌감의 느낌을 동반할 수 있고, 중증인 경우, 강한 자율적인(autonomic) 현상, 예컨대 발한, 혈관 운동(vasomotor) 반응, 서맥(bradycardia), 메스꺼움 및 구토를 유도한다. 내장 통증은 통상 신체에서 중앙선 및 심부에서 느껴진다.
복부 또는 내장 통증이 존재할 수 있는 여러 가지 병태가 존재한다. 예를 들어, 췌장염 통증, 분만 통증, 장폐색(ileus)과 관련된 복부 수술로부터의 통증, 과민성 장 증후군(irritable bowel syndrome)에서의 통증, 비-궤양성 소화불량증(non-ulcer dyspepsia) 또는 월경 불순(dysmenorrhea)에서의 통증이 존재할 수 있다. 마찬가지로, 간 통증, 신장 통증, 심와부 통증(epigastric pain), 늑막 통증(pleural pain), 및 통증성 담도성(painful biliary colic), 충수염 통증(appendicitis pain) 모두 내장 통증으로 간주될 수 있다. 초기 심근 경색(early myocardial infarction)으로부터의 흉골하(substernal) 통증 또는 압력 또한 내장성(visceral)이다. 나아가, 구강 작열감 증후군(BMS: burning mouth syndrome)은, 위장 기원이 의심되더라도 뚜렷한 병인 없이 혀 및 다른 구강 부위에서의 작열감 또는 촉각 장애를 특징으로 하는 만성 특발성 장애이다. 이러한 BMS는 구강 건조, 얼얼함 또는 불쾌 미각(dysgeusia)을 동반한다. BMS 환자에서 식별된 말초 신경 변경을 고려하면, 일부 임상 시험은 BMS 증상(de Castro et al., 2014)에 미치는 국소 GABA-A 결합 수용체 리간드의 효능을 실증하였다. 위, 십이지장 또는 결장의 질환이 내장 통증을 야기할 수 있다. 내장 통증을 야기하는 보편적으로 마주하게 되는 위장(GI) 장애는 기능성 장 장애(FBD: functional bowel) 및 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease)을 포함한다. 이들 GI 장애는 FBD와 관련하여 위-식도 역류(gastro-esophageal reflux), 소화 불량, 과민성 장 증후군(IBS) 및 기능성 복통 증후군(FAPS: functional abdominal pain syndrome) 및 IBD와 관련하여 클론 질환, 회장염(ileitis) 및 궤양성 대장염을 포함하여 현재 단지 중등도로(moderately) 제어되는 광범위한 질환 상태를 포함하고, 이들은 모두 내장 통증을 규칙적으로 초래한다.
Rome IV 기준에 따르면, 과민성 장 증후군(IBS)은 원인 불명의 기능성 위장 장애이며, 대부분의 나라에서 10-20%의 성인에게 영향을 미친다. IBS는 환자의 삶의 질에 크게 영향을 미치는 다양한 증상을 초래한다(Dean et al., 2005). 스트레스가 IBS의 발병, 유지 및 악화에 중요한 인자인 것으로 제시되었으며(Chang et al., 2011), 이는 유의한 이환율(morbidity) 및 건강 관리 비용을 초래한다. IBS는 뇌-소화관 축의 장애이고, 임상 증상은 구조적 이상(abnormality) 없이(Camilleri et al., 2012) 복통 및 장 습성(즉, 변비, 설사)의 변화를 포함한다. 30% 내지 40%로 다양한 IBS 환자의 하위세트는 결장 확대(colonic distension)에 대한 증강된 민감성을 나타내는 것으로 보고되었으며, 이는 통증에 대한 이들 환자의 감소된 역치, 결장 확대에 반응하여 감각(sensation)의 증가된 강도 및/또는 과장된 내장체부 연관통 구역(viscerosomatic referral)을 통해 알아차려질 수 있다(Mayer et al., 1994, Mayer et al., 2008, Bouin et al., 2001, Zhou et al., 2010). 그러므로, 내장 과민성(visceral hypersensitivity)은 IBS 환자가 경험하는 장 운동의 중증도, 팽만감(bloating) 및 복통 증상을 고려하는 주된 임상 마커로서 제안되었다(Kuiken et al., 2005, Posserud et al., 2007, Camilleri et al., 2008). IBS 병리생리학의 더 양호한 이해를 위해, IBS 특질, 예컨대 장 민감성 및 소화관 전달 시간(gut transit time)의 변화를 모방하는 급성 및 만성 스트레스 동물 모델이 개발되었다(Gue et al., 1997). 래트에서, 직장 팽창(rectal distension)으로의 내장 과민성과 관련된 급성 구속 스트레스(restraint stress)는 부신피질자극호르몬 방출 인자(CRF: corticotrophin releasing factor)의 중심 방출(central release)과 연관 있다(Gue et al., 1997). 이들 장애(IBS 및 BMS)에 대한 현재의 약물학적 치료는 현재까지 주로 증상-유래(symptom-driven)이고 이의 효능은 일반적으로 낮다(Craig et al., 2018).
전술한 내용으로부터 내장 통증의 예방 및/또는 치료를 위한 약물학적 제제에 대한 대안의 필요성이 존재하는 것으로 보인다.
일부 실험적 증거는, 프로바이오틱스가 특히 IBS 환자에서 복통을 조절하기 위한 효과적인 치료 옵션일 것임을 시사하지만(Moayyedi et al., 2010, Hungin et al., 2013, Ford et al., 2014, Didari et al. 2015); 임상 결과는 사용되는 프로바이오틱스의 균주, 이들 균주의 혼합물 및 투약량, 뿐만 아니라 치료 기간 및 IBS 환자의 하위유형으로 인해 연구들 사이에서 상당히 달라진다(Mazurak et al., 2015).
최근, γ-아미노부티르산(GABA)을 생성하는 인간 소화관 공생(commensal) 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium)은 내장 과민성의 래트 배설물 체류(fecal retention) 모델에서 감각 뉴런 활성을 조절하는 것으로 나타났다(Pokusaeva et al., 2017). 더욱이, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 Nissle 1917은 마우스에서 장 민감성을 저해할 수 있는 C12AsnGABAOH 지질펩타이드를 생성하는 것으로 실증되었다(Perez-Berezo et al., 2017). 그러나, 프로바이오틱 자체의 효능에 대한 어떠한 증거도 주어지지 않았으며, C12AsnGABAOH 지질펩타이드의 진통제(analgesic) 특성만 제시되었다.
그러므로, 이는 내장 통증을 감소시키고 낮은 생산 비용으로 생성하기에 용이한 새로운 치료적 접근법을 식별하는 데 유용하다.
이러한 맥락에서, 본 발명자들은 락트산 박테리아인 락토콕커스 락티스의 연구에 초점을 맞추었다. 락토콕커스 락티스 아종 락티스 균주는 시험관내에서 GABA를 생성하는 것으로 알려져 있고(Nomura et al., 1999) 이론적으로는, GABA에서 글루타메이트를 전환시키는 효소인 피리도칼-5'-포스페이트(PLP)-의존적 효소 글루타메이트 데카르복실라제(GAD)를 유전적으로 발현시킬 수 있는 한편, GAD를 발현하고 GABA를 생성하는 이의 유효 역량(effective capacity)은 미지의 이유에서 매우 우연적(aleatory)이다. 사실상, 본 발명자들은, 엘. 락티스(L. lactis) NCDO2727 균주와 NCDO2118 균주 사이에서 GABA 생합성에 관여하는 gad 오페론의 강한 유사성에도 불구하고, 유사한 배양 조건 하에서의 GABA 생성은 NCDO2727 균주에 의해 생성되는 매우 소량의 GABA(GABA 농도는 도 2a에서 항상 0.2 mM 미만임)와 매우 상이하였음을 보여주었다. 동일한 방식으로, 높은 GAD 활성은 NCDO2118 균주에서 수득된 한편, NCDO2727 균주에서 그 양은 매우 낮았다(표 3).
유제품에서 빈번하게 마주치는 엘. 락티스는 가장 많이 섭취되는 박테리아 중 하나이다(Mills et al., 2010, Laroute et al., 2017). 이 박테리아는 발효유를 포함하여 치즈 또는 발효 유제품과 같은 유제품에서 흔히 발견된다.
공생 박테리아로서 간주되지 않긴 하지만, 엘. 락티스는 연구 하의 균주에 따라 소화관에서 일시적으로 지속되는 것으로 밝혀졌다(Wang et al., 2011, Radziwill-Bienkowska et al., 2016, Zhang et al., 2016).
본 발명자들은, 24시간 이하의 배양 시간에서 다량의 GABA, 즉, 적어도 10 mM의 γ-아미노부티르산(GABA)을 생성할 수 있는 새로운 엘. 락티스 균주를 식별하였으며, 이들 발명자들은, 이들 균주가 내장 통증을 감소시키는 놀랍고도 예상외의 능력을 소유함을 보여주었다. 그러므로, 이들 엘. 락티스 균주는 내장 통증을 예방하고/거나 치료하기 위한 새로운 제제를 나타낸다.
더욱이, 본 발명자들은 소량의 GABA를 생성하는 엘. 락티스 균주, NCDO2727이 이러한 유리한 특성을 소유하지 않음을 실증하였다.
이에, 본 발명의 목적은 개체에서 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 24시간 이하의 배양 시간 내에 적어도 10 mM의 γ-아미노부티르산(GABA)을 생성할 수 있는 락토콕커스 락티스 균주이다.
바람직하게는, 본 발명의 락토콕커스 락티스 균주는 24시간 이하의 배양 시간 내에 적어도 10 mM의 GABA, 더욱 바람직하게는 20 mM의 GABA, 더욱 더 바람직하게는 40 mM의 GABA, 가장 바람직하게는 적어도 60 mM의 GABA를 생성할 수 있다(도 2a).
GABA를 생성하는 능력은 글루타메이트, 아르기닌, 글루코스 및 NaCl이 보충된 배지 M17에서 락토콕커스 락티스 균주를 발효기에서 배양함으로써 평가될 수 있다. 배양 첫 시간에서, pH는 6.6에서 유지되며, GAD가 유도 및 축적된다. 배양 7-8시간째에, 균주는 개별 치료를 위해 수집된 다음, pH는 4.6에서 저하되어 GABA 생성률을 정량화한다. GABA의 농도는 24시간까지 시간 경과에 따라 측정된다.
본 발명의 락토콕커스 락티스 균주의 균주에서 GAD 발현의 성장 및 유도를 가능하게 하는 배양 배지의 제조 및 배양 조건의 정의는 당업자에 의해 널리 알려져 있으며; 이러한 배양 배지는 각각의 특정 엘. 락티스 균주에 맞춰질 수 있고; 예를 들어, 균주 CNCM I-5388에 대해, 기본(basic) M17 배양 배지에의 아르기닌 및 NaCl의 첨가는 GAD의 발현을 유도하는 것으로 입증되었으며; 다른 균주, 예컨대 CNCM I-5386은 임의의 특정 화합물의 첨가 없이 이러한 M17 배양 배지에서 배양되었을 때 NCDO2118과 유사한 수준에서 GAD 발현을 증강시킬 수 있다.
본 발명에 따른 개체는 포유류 또는 조류이며; 예를 들어, 개체는 가축 사육으로부터의 동물, 예컨대 가금류 또는 애완동물일 수 있으며; 구체적인 구현예에 따르면, 개체는 인간이다.
바람직하게는, 본 발명의 균주 엘. 락티스는, 상기 균주에 의해 생성되는 피리도칼-5'-포스페이트(PLP: pyridocal-5'-phosphate)-의존적 효소 글루타메이트 데카르복실라제(GAD: glutamate decarboxylase)의 활성이 7시간 내지 8시간의 배양 시간에서 적어도 20 ㎛ole/분.mg의 단백질인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에서 락토콕커스 락티스 균주에 의해 생성되는 GAD의 활성은 7시간 내지 8시간의 배양 시간 내에 적어도 20 ㎛ole/분.mg의 단백질, 더욱 바람직하게는 40 ㎛ole/분.mg, 더욱 더 바람직하게는 60 ㎛ole/분.mg 및 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700 ㎛ole/분.mg, 가장 바람직하게는 적어도 820 ㎛ole/분.mg의 증가하는 순서이다.
바람직하게는, 본 발명의 균주 엘. 락티스는, pH 4.6에서 상기 균주에 의한 GABA 생성률은 8.5시간 내지 11.5시간의 배양 시간 내에 적어도 1 mmole/h/g 세포 건조 중량인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에서 GABA의 비생성률(specific production rate)은 8.5시간 내지 11.5시간의 배양 시간 내에 적어도 1 mmole/h/g의 세포 건조 중량, 더욱 바람직하게는 3 mmole/h/g의 세포 건조 중량, 가장 바람직하게는 적어도 7 mmole/h/g의 세포 건조 중량이다.
GAD 활성을 평가하는 방법은 실시예 1에 제시된 바와 같이 당업계에 알려져 있다. GABA 생성률은 8.5시간 내지 11.5시간(평균값)으로 계산된 비속도(specific rate)이다.
본 발명에서 균주 엘. 락티스는 CNCM I-5388, CNCM I-5386 및 NCDO2118, 바람직하게는 CNCM I-5388 및 CNCM I-5386으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 엘. 락티스 균주는 균주 CNCM I-5388이다.
균주 CNCM I-5388 및 CNCM I-5386은 부다페스트 조약에 따라 CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris)에, CNCM I-5386에 대해서는 2018년 11월 29일 및 CNCM I-5388에 대해서는 2018년 12월 13일에 기탁되었다.
본 발명의 엘. 락티스 균주는 내장 통증을 예방하거나 치료하는 데 특히 관심이 있다.
본 발명의 엘. 락티스 균주의 예방적 및 치료적 효과는 유리(free) 글루타메이트의 존재 하에 수득되고; 예를 들어, 유리 글루타메이트의 양은 109 cfu의 엘 락티스당 그리고 일일당 약 4 mg이거나 약 17 mg/kg bw/일이다.
실시예 2에 실증된 바와 같이, 당업계에서 유리 글루타메이트는 기저(basal) 및 스트레스-유도 결장직장 활성에 대해 임의의 유익한 또는 원치 않는 효과를 발휘하지 않는다.
절제하는(continent) 식이요법 배양에 따라, 전통적인 식이요법은 상이한 수준의 유리 글루타메이트를 제공한다(유리 글루타메이트의 평균 집단 섭취량은 5.5　mg/kg bw/일(고령의 오스트리아인) 내지 37 mg/kg bw/일(벨기에에서 유아) 범위이며; 고-수준의 섭취량은 벨기에에서 다른 어린이에 대해 82 mg/kg bw/일 이하, 덴마크 영아에 대해 77 mg/kg bw/일이고, 불가리아에서 다른 어린이에 대해 56 mg/kg bw/일 범위이며; 더욱이 천연 유리 글루타메이트 및 식이요법 단백질에 대해 81 내지 155 mg/kg bw/일의 범위가 성인에서 섭취될 수 있다. David R. Tennant, Ann. Nutr. Metab. 2018;73:21-28). 따라서, 이들 데이터에 따르면, 본 발명자들은, 본 발명의 엘. 락티스 균주가 복부 또는 내장 통증의 효율적인 예방 또는 감소를 발휘하기 위해 단독으로, 즉, 유리 글루타메이트의 첨가 없이 투여될 수 있다고 간주하였다.
대안적으로, 유리 글루타메이트-무함유(free) 식이요법 또는 특히 유리 글루타메이트가 불량한 식이요법의 경우, 본 발명의 엘. 락티스 균주는 유리 글루타메이트와 함께 투여될 수 있다. 이에, 구체적인 구현예에서, 본 발명의 또 다른 목적은 개체에서 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 균주 엘. 락티스와 10 내지 20　mg/kg　bw/일, 특히 17 mg/kg bw/일의 유리 글루타메이트의 조합이다.
본 발명의 상이한 양태에 대해, 내장 통증은 상처, 감염, 염증, 질환에 의해 또는 열적 자극, 기계적 자극, 전기적 자극, 화학적 자극 또는 방사성 자극에 의해 야기될 수 있다.
본 발명에서 내장 통증은 특히, 과민성 장 증후군(IBS)뿐만 아니라 구강 작열감 증후군(BMS)을 포함하여 만성 복부 및 골반 통증 장애에서 관찰되는 것이다. IBS 환자는 흥분성(provocative) 자극(즉, 직장 팽창)에 대한 유의하게 더 낮은 반응 역치, 정상적인 기관 기능 동안 증가된 민감성의 불평을 나타내고, 확대된 영역의 체부(복부) 연관통 구역에서 증가된 압통(tenderness)(즉, 내장 과민성과 체부 과민성 둘 다)을 제시한다. 기능적인 내장(위장) 장애는 변경된 중추신경계 가공 및/또는 탈조절된(dysregulated) 중추 조절로 인한 것이었다. 이러한 사건의 캐스케이드에서, 배근신경절(DRG: Dorsal Root Ganglia)에 위치한 1차성 구심 통각수용체(primary afferent nociceptor)의 내장 입력(visceral input)은 통증의 감지(perception)에서 변화를 담당한다. 그러나, 모든 만성 질환, 예컨대 간염, 위궤양, IBD(크론 질환 및 궤양성 대장염), 복부 및/또는 등 통증이 주된 불평사항인 IBS가 있으며, 모든 감지된 감각은 말초 감각(구심성) 뉴런에서의 활성에 의해 개시된다(Keszthelyi D. et al., 2012). 중요한 만성 통증 장애인 구강 작열감 증후군(BMS)에 관하여, 이는 미국에서 1백만명이 넘는 사람들에게 영향을 미친다(Miziara et al., 2009). BMS는 입술 및 혀, 주로 끝부분(tip) 및 앞쪽(anterior) 3분의 2를 수반하는 양성(작열통, 불쾌 미각 및 촉각 장애) 감각 증상과 음성(맛의 상실 및 지각이상(paraesthesia)) 감각 증상 둘 다를 특징으로 한다. BMS는 3개 유형으로 분류될 수 있다(Sun et al., 2013). 유형 1에서, 환자는 걸을 때 통증이 없지만 날이 지남에 따라 증상이 증가하는 것을 경험한다. 유형 2에서, 환자는 하루종일 지속되는 통증을 가지며; 이러한 유형은 환자 중 55%를 차지하고 심리학적 장애와 가장 강한 연관을 갖는다(Coculescu et al., 2014). 유형 3에서, 환자는 하루 동안 무통(pain-free) 기간을 갖는 간헐적 증상을 가진다. 더욱이, 이들 BMS 환자는 빈번하게는 우울증, 불안, 이따금 당뇨병, 심지어 영양/미네랄 결핍을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 내장 통증은 위장 장애, 예컨대 과민성 장 후군 또는 기저 치과 또는 의학적 원인의 부재 하에 구강 점막의 작열감을 특징으로 하는 구강 작열감 증후군에 의해 야기된다. 이는 또한, 기능적 및 기질적(organic) 소화 불량, 마약성 장 증후군(narcotic bowel syndrome), IBD, 결장암, 만성 췌장염, 게실염(diverticulitis), 충수염, 난소 낭종(ovarian cyst)을 갖는 경우이다.
내장 통증은 다양한 심리학적 스트레스 조건(급성 및 만성)에서 증가되는 것으로 알려져 있다.
급성 부분 구속 스트레스는 내장 민감성(과민성)을 증가시키고, 또한 민감성의 역치를 감소시킨다(이질통(allodynia)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 엘. 락티스 균주는 내장 통증이 심리학적 스트레스 사건 및/또는 불안과 연관이 있을 때 유용하다. 심리학적 스트레스 사건 및/또는 불안의 모델은 급성 부분 구속 스트레스(PRS)이다.
PRS는 경증 비-궤양유발(non-ulcerogenic) 모델로 간주되고(Williams et al., 1987), 에틸 에테르에 의한 가벼운(light) 마취 하에 동물 신체 움직임을 제약하는 것으로 구성된다. 이를 위해, 동물의 상부 전완(upper forelimb)을 흉곽(thoracic trunk)까지 테이프로 둘러 동물 신체 움직임을 2시간 동안 제약한다. 그 후에, 래트를 이의 홈 케이지에서 대체한다. 래트에서 PRS는, 부신피질자극호르몬 방출 인자(CRF: corticotrophin releasing factor)의 중추 방출과 연관된 직장 팽창에 대한 내장 과민성과 관련된(Gue et al., 1997) 부신피질자극 호르몬(ACTH: adrenocorticotropic hormone)과 코르티코스테론 혈장 농도(plasmatic concentration)의 증가(Sun et al., 2006), 뿐만 아니라 소화관 투과성 증가(Ait-Belgnaoui et al., 2005) 둘 다에 의해 반영된다.
사실상, 본 발명자들은, 높은 수준의 GABA를 생성하는 엘. 락티스 NCDO2118이 급성-스트레스 래트 모델에서 내장 과민성을 예방하는 반면, 낮은 수준의 GABA를 생성하는 엘. 락티스 NCDO2727은 이러한 효과를 유도할 수 없음을 보여주었다.
나아가, GABA를 생성할 수 없는 NCDO2118 ΔgadB 돌연변이체 균주는 동일한 모델에서 내장 과민성을 예방하는 데 실패하였다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명의 엘. 락티스 균주는, 이들 균주에 의해 발휘되는 효과가 10일, 더욱 바람직하게는 7일, 더욱 더 바람직하게는 5일, 가장 바람직하게는 4일의 심리학적 스트레스 사건 및/또는 불안과 연관된 내장 통증의 치료로부터 수득되는 것을 특징으로 한다.
사실상, 본 발명자들은, CNCM I-5388에 의해 발휘되는 유익한 효과가 5일의 급성 스트레스와 연관된 내장 통증의 치료로부터 수득되고, NCDO2118에 의해 발휘되는 효과가 10일의 이러한 치료로부터 수득됨을 보여주었다.
본 발명의 또 다른 양태는 구강 작열감 증후군(BMS)으로 인한 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 락토콕커스 락티스 균주이다.
본 발명의 목적은 또한, 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 특히 심리학적 스트레스 사건 및/또는 불안과 연관된 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 락토콕커스 락티스 균주로부터 수득되는 세포 분획이다.
상기 세포 분획은 특히, 본 발명의 엘. 락티스 배양물로부터 수득되는 박테리아 효소, 특히 GAD를 함유하는 조제물이다. 이는 또한, 이들 균주의 배양 상층액 또는 분획일 수 있다. 세포 분획은 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 비제한적 방식에서, 이들 방법은 일반적으로, 배양 후 수득된 박테리아의 용해 단계 및 상기 용해 단계 후 수득된 총 용해물로부터 상기 박테리아의 막을 함유하는 분획을 특히 원심분리 또는 여과에 의해 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 구강 작열감 증후군(BMS)으로 인한 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 락토콕커스 락티스 균주로부터 수득되는 세포 분획이다.
본 발명의 목적은 또한, 본 발명에 따른 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 락토콕커스 락티스 균주 또는 본 발명에 따른 세포 분획 및 선택적으로 바람직하게는 10 내지 20　mg/kg　bw/일, 특히 17 mg/kg bw/일 양의 유리 글루타메이트를 포함하는 조성물이다.
본 발명의 조성물에서, 상기 균주는 살아 있거나 죽어 있을 수 있는 전체 박테리아 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 균주는 박테리아 용해물 형태로 사용될 수 있다. 바람직하게는 박테리아 세포는 살아 있는 생존 가능한(viable) 세포로서 존재한다.
본 발명의 조성물은 투여, 특히 경구 투여에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 이는 예를 들어, 고체, 반고체, 액체 및 분말을 포함한다.
박테리아가 살아 있는 박테리아 형태로 존재하는 경우, 일일당 주어지는 조성물은, 적어도 106 콜로니 형성 단위(cfu)의 상기 엘. 락티스 균주, 바람직하게는 적어도 107 cfu, 더욱 더 바람직하게는 적어도 108 cfu, 가장 바람직하게는 적어도 109 cfu의 투여를 가능하게 하는 본 발명에 따른 엘. 락티스 균주의 함량을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 구강 작열감 증후군(BMS)으로 인한 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 락토콕커스 락티스 균주 또는 본 발명에 따른 세포 분획을 포함하는 조성물이다.
본 발명의 목적은 또한, 내장 통증을 예방하며 및/또는 치료하는 방법이며, 상기 방법은 상기 정의된 바와 같은 치료적 양의 본 발명의 락토콕커스 락티스 균주 또는 본 발명의 세포 분획을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료적 양의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용의 측면에서 당업자로부터 널리 알려져 있다.
본 발명의 목적은 또한, 내장 통증을 예방하며 및/또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 상기 정의된 본 발명의 락토콕커스 락티스 균주 또는 본 발명의 세포 분획의 용도이다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료 또는 예방은 특히, 내장 통증을 예방하며 및/또는 저하시키는 것을 포괄한다.
본 발명의 조성물은 식품, 예컨대 식품 보조제 및 기능성 식품을 포함하여 약학적 조성물 또는 영양학적 조성물일 수 있다. 식품은 유제품 및 발효 유제품을 포함한다.
약학적 조성물은 경구 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 시럽 발포성(effervescent) 조성물 및 스프레이일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 또한, 혀 밑에 투여되는 설하 정제 및 용액 조성물 및 뺨과 잇몸 사이에 배치되는 협측 정제와 같은 설하 및 협측 형태일 수 있다.
식품 보조제는 식량에서 통상 사용되는 화합물로부터 제조된 제품을 지정하지만, 통상 자양물(aliment)과 관련이 없는 정제, 분말, 캡슐, 부분 또는 임의의 다른 형태의 형태이고 개체의 건강에 유익한 효과를 갖는다.
기능성 식품은 개체의 건강에 유익한 효과를 또한 갖는 자양물이다. 특히, 식품 보조제 및 기능성 식품은 질환 또는 통증에 대해 보호적 또는 치유적인 생리학적 효과를 가질 수 있다.
조성물은 액체 형태일 수 있거나, 액체를 건조함으로써 수득되는 건조 분말 형태로 존재할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 생성물은 신선한 생성물이다. 심각한 열 처리 단계를 받지 않은 신선한 생성물은, 존재하는 박테리아 균주가 살아 있는 형태인 이점을 갖는다.
본 발명자들은 또한, 이전에 논의된 특정한 능력을 갖는 2개의 새로운 락토콕커스 락티스 균주를 식별하였다.
그러므로, 본 발명은 또한, 균주가 CNCM I-5388, CNCM I-5386으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 락토콕커스 락티스 균주를 제공한다.
본 발명은 또한, CNCM I-5388, CNCM I-5386으로 이루어진 군으로부터 선택되는 락토콕커스 락티스 균주로부터 수득되는 세포 분획을 포괄한다.
본 발명은 또한, 상기 정의된 바와 같은 상기 락토콕커스 락티스 균주 또는 상기 정의된 바와 같은 상기 세포 분획을 포함하는 조성물을 제공한다.
조성물은 상기 조성물의 건조 중량 그램당 적어도 106 콜로니 형성 단위(cfu), 바람직하게는 적어도 107 cfu, 더욱 바람직하게는 적어도 108 cfu, 가장 바람직하게는 적어도 109 cfu를 포함할 수 있다.
상기 정의된 바와 같은 조성물은 상기 정의된 바와 같은 식품을 포함하여 약학적 조성물 또는 영양학적 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 액체 형태일 수 있거나, 액체를 건조함으로써 수득되는 건조 분말 형태로 존재할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 생성물은 신선한 생성물이다.
본 발명의 목적은 상기 정의된 바와 같은 락토콕커스 락티스 균주 또는 세포 분획 및 약학적으로 허용 가능한 비히클을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며; 선택적으로 상기 조성물은 또한 유리 글루타메이트를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 조성물은 약제로서 사용하기 위한 것이다. 상기 약제의 제형은 스프레이 또는 정제 형태의 국소 치료가 혀 아래에서 용융될 수 있도록 맞춰진다.
상기 조성물은 내장 통증을 예방하며 및/또는 치료하는 데 특히 유용하다.
나아가, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 내장 통증을 예방하며 및/또는 치료하기 위한 치료 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 정의된 바와 같은 락토콕커스 락티스 균주 또는 세포 분획 또는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 정의된 바와 같은 내장 통증의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 선택적으로 유리 글루타메이트와 회합된, 본 발명의 락토콕커스 락티스 균주 또는 세포 분획에 관한 것이다.
본 발명은 후속하는 추가 설명으로부터 더욱 명확히 이해될 것이며, 이는 내장 통증을 감소시키기 위한 본 발명에서 엘. 락티스 균주의 용량을 예시하는 실시예, 뿐만 아니라 첨부된 도면을 참조한다.
도 1은 상이한 균주에서 gad 클러스터의 구조화를 도시한다.
도 2는 유리 글루타메이트(8 g/L), 아르기닌(5 g/L), 글루코스(45 g/L) 및 NaCl(300 mM)이 보충된 M17에서 엘. 락티스 NCDO2118(정사각형), CNCM I-5388(다이아몬드형), CNCM I-5386(삼각형) 또는 NCDO2727(원형)의 성장 동안 GABA 생성(mM)(a) 및 바이오매스 (g/L)(b)의 발생(evolution)을 도시한다. 독립적인 2벌(duplicate)(채워진 부호: 제1 실험 및 열린 부호: 제2 실험).
도 3은 CRD의 모든 팽창 압력(distension pressure)(15 내지 60 mmHg)에서 비히클-치료된 래트의 PRS-유도 결장직장 민감성에 미치는 유리 글루타메이트(식이요법 시 2 mg 및 엘 락티스와 공동-투여되는 2 mg)의 10-일 경구 투여의 효과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(열린 정사각형, 파선)에 대해 n=10; "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=10; "비히클+유리 글루타메이트" 군(검정색 원형, 파선)에 대해 n=11; "PRS+비히클+유리 글루타메이트" 군(검정색 원형, 실선)에 대해 n=11)으로 표현된다. * P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값(basal value).
도 4는 CRD의 모든 팽창 압력(15 내지 60 mmHg)에서 PRS-유도 내장 과민성에 미치는 엘. 락티스 NCDO2118 및 엘. 락티스 NCDO2727의 10-일 경구 투여의 효과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(백색 정사각형, 파선) 및 "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=9; "PRS+NCDO2118+유리 글루타메이트" 군(검정색 삼각형, 실선)에 대해 n=12; "PRS+NCDO2727+유리 글루타메이트" 군(검정색 별형, 실선)에 대해 n=8)으로 표현된다. *** P<0.001 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. + P<0.05; ++ P<0.01 vs. 비히클로 치료된 스트레스를 받은 동물에 대한 값이다.
도 5는 CRD의 모든 팽창 압력(15 내지 60 mmHg)에서 PRS-유도 내장 과민성에 미치는 엘. 락티스 NCDO2118 및 엘. 락티스 CNCM I-5388의 5-일 또는 10-일 경구 투여의 효과를 도시한다. a. 5일에서의 엘. 락티스 NCDO2118로 수득된 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(백색 정사각형, 파선)에 대해 n=11, "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=11 및 "PRS+NCDO2118+유리 글루타메이트" 군(검정색 삼각형, 실선)에 대해 n=11)으로 표현된다. ** P<0.01 유의하게 상이함 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. b. 5일에서의 엘. 락티스 CNCM I-5388로 수득된 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(백색 정사각형, 파선)에 대해 n=7; "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=7; "PRS++CNCM I-5388" 군(검정색/백색 다이아몬드형, 파선-점선) 및 "PRS+CNCM I-5388+유리 글루타메이트" 군(검정색 다이아몬드형, 실선)에 대해 n=7)으로 표현된다. ** P<0.05; ** P<0.01 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. c. 10일에서의 엘. 락티스 NCDO2118로 수득된 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(백색 정사각형, 파선)에 대해 n=9; "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=9; "PRS+NCDO2118+유리 글루타메이트" 군(검정색 삼각형, 실선)에 대해 n=12; "PRS+NCDO2118" 군(검정색/백색 삼각형, 파선-점선)에 대해 n=8)으로 표현된다. ** P<0.05; ** P<0.01 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. *** P<0.001 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. + P<0.05; ++ P<0.01 vs. 비히클로 치료된 스트레스를 받은 동물에 대한 값이다. d. 10일에서의 엘. 락티스 CNCM I-5388로 수득된 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(백색 정사각형, 파선)에 대해 n=7; "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=7; "PRS++CNCM I-5388" 군(검정색/백색 다이아몬드형, 파선-점선)에 대해 n=8 및 "PRS+CNCM I-5388+유리 글루타메이트" 군(검정색 다이아몬드형, 실선)에 대해 n=7)으로 표현된다. ** P<0.01 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. + P<0.05 vs. 비히클로 치료된 스트레스를 받은 동물에 대한 값이다.
도 6은 CRD의 모든 팽창 압력(15 내지 60 mmHg)에서 PRS-유도 내장 과민성에 미치는, GABA-생성 엘. 락티스 NCDO2118 및 비-GABA 생성 NCDO2118 ΔgadB 돌연변이체(109 cfu/일)의 효과를 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(백색 정사각형, 파선) 및 "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=13; "PRS+NCDO2118+유리 글루타메이트" 군(검정색 삼각형, 실선)에 대해 n=14; "PRS+ NCDO2118 ΔgadB+유리 글루타메이트" 군(역전된 삼각형, 파선-점선)에 대해 n=13)으로 표현된다. ** P<0.01; **** P<0.0001 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. ++ P<0.01; +++ P<0.001 vs. 비히클로 치료된 스트레스를 받은 동물에 대한 값이다. $ P<0.05 vs. NCDO2118로 치료된 스트레스를 받은 동물에 대한 값이다.
도 7은 CRD의 모든 팽창 압력(15 내지 60 mmHg)에서 PRS-유도 내장 과민성에 미치는 엘. 락티스 CNCM I-5388의 5-일 또는 10-일 경구 투여의 효과를 도시한다. a. 5일에서의 엘. 락티스 CNCM I-5388로 수득된 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(백색 정사각형, 파선)에 대해 n=10, "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=10, "PRS+CNCM I-5388" 군(백색 고리형, 실선)에 대해 n=10, "PRS+CNCM I-5388+유리 글루타메이트" 군(검정색 고리형, 실선)에 대해 n=9, "PRS+CNCM I-5388+유리 글루타메이트+저해제" 군(백색 마름모형, 실선)에 대해 n=9, "PRS+CNCM I-5388ΔgadB 돌연변이체+유리 글루타메이트" 군(검정색 마름모형, 실선)에 대해 n=9)으로 표현된다. **P<0.05; ** P<0.01; **** P<0.0001 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. +++ P<0.001 vs. 비히클로 치료된 스트레스를 받은 동물에 대한 값이다. b. 10일에서의 엘. 락티스 CNCM I-5388로 수득된 결과이다. 데이터는 평균 ± SEM("비히클" 군(백색 정사각형, 파선)에 대해 n=10, "PRS+비히클" 군(검정색 정사각형, 실선)에 대해 n=10, "PRS++CNCM I-5388" 군(백색 고리형, 실선)에 대해 n=9, "PRS+CNCM I-5388+유리 글루타메이트" 군(검정색 고리형, 실선)에 대해 n=9, "PRS+CNCM I-5388+유리 글루타메이트+저해제" 군(백색 마름모형, 실선)에 대해 n=9, "PRS+CNCM I-5388ΔgadB 돌연변이체+유리 글루타메이트" 군(검정색 마름모형, 실선)에 대해 n=9)으로 표현된다. **P<0.05; ** P<0.01; **** P<0.0001 vs. 비히클로 치료된 동물에 대한 기본값이다. + P<0.05; ++ P<0.01 vs. 비히클로 치료된 스트레스를 받은 동물에 대한 값이다.
실시예 1: 관심의 박테리아 현탁액의 생리학적 특징화
1. 재료 및 방법:
1.1. 박테리아 균주, 배지 및 배양 조건:
데이터 세트는 락토콕커스 락티스 아종 락티스에 속하는 4개 균주로 이루어진다. 2개의 균주, NCDO2118 및 NCDO2727을 식물로부터 단리한 한편, CNCM I-5388 및 CNCM I-5386은 유제품 기원을 갖는다(각각 원유(raw milk) 및 유장(whey)).
이들 균주에서, GABA 생합성에 관여하는 gad 클러스터는 kefA 유전자와 rnhB 유전자 사이의 염색체 상에 위치한다(도 1). gad 클러스터는 오페론 조절제, 글루타메이트/GABA 역수송체 및 글루타메이트 데카르복실라제를 각각 인코딩하는 gadR, gadC 및 gadB로 이루어진다. 동일한 클러스터 구조화는 CNCM I-5386을 제외하고는 이들 균주에서 보유된다. 사실상, 삽입 서열 IS981의 복사체는 gadCB 오페론의 프로모터에서 발견되었다. 이러한 삽입 서열은 아웃워드(outward) -35 프로모터 성분을 함유하고, 네이티브(native) -10 박스(box)로부터 올바른 거리에서의 이의 삽입은 프로모터의 강도 및 이의 조절을 변형시킬 수 있다. gadR, gadC 및 gadB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 98% 초과의 동일성을 갖는 4개 균주에서 고도로 유사하다(도 1).
박테리아 배양을 55 mM(8　g/L) 유리 글루타메이트, 29 mM(5 g/L) 아르기닌, 250 mM(45 g/L) 글루코스 및 300 mM NaCl이 보충된 배지 M17(표 1)에서 2-L Biostat B-플러스 생물반응기(Sartorius, Melsungen, Germany)에서 2벌로 수행하였다. 배양물을 30℃에서 인큐베이션하였다.
성분 g/L
트립톤 2.5
동물 조직의 펩신 분해물 2.5
콩가루의 파파인 분해물 5
육류 추출물 5
효모 추출물 2.5
아스코르브산 0.5
마그네슘 설페이트 0.5
소듐 글리세로포스페이트 19
표 1: 배지 M17의 조성이다.
발효를 산소-제한 조건 하에, 공기 방울 없이 기상 중 공기와 함께 수행하였다. pH를 8시간 동안 KOH의 첨가에 의해 6.6에서 유지시킨 다음, pH를 변형시키고 4.6에서 조절하였다.
배양물에, 유사한 배지 상에서 Erlenmeyer 플라스크에서 성장된 예비-배양물로부터의 세포를 접종하며, 지수기(exponential phase) 동안 수합하고, 농축시켜, 발효기에서 580 nm에서 0.25의 초기 광학 밀도(OD)를 수득하였다.
박테리아 성장을 580 nm에서 분광측색(spectrophotometric) 측정에 의해 추정하였다(Libra S11, Biochom, 1 유니티(Unity)의 흡광도는 0.3 g/L와 동등함).
샘플을 성장 배지 중 GABA 농도의 HPLC 측정을 위해 30분마다 수집하였다.
경구 투여용 세포 샘플을 하기와 같이 제조하였다. 세포를 pH 변형 전에(즉, NCDO2118 및 NCDO2727에 대해 7시간째에) 수합하였다.
대략 3x1011 세포에 필요한 부피의 배양물을 5000 g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리하여, 박테리아 세포를 펠렛화하였다.
세포를 0.9% NaCl로 2회 세척하며, 15% 글리세롤을 함유하는 0.9% NaCl에서 10x109 cfu/mL의 최종 농도까지 현탁시키고, 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다.
1.2. GABA 추출 및 정량화:
효소 검정의 배양 상층액 또는 반응 혼합물에서의 GABA 농도를 HPLC(Agilent Technologies 1200 Series, Waldbronn, Germany)에 의해 측정하였다.
HPLC 전에, 4 부피의 메탄올을 1 부피의 샘플에 첨가함으로써 단백질을 침전시켰다. 혼합물을 원심분리하고, HPLC 분석을 위해 상층액을 유지시켰다. 아미노산은 오르토프탈릭 알데하이드(OPA) 및 9-플루오레닐메틸-클로로포르미에이트(FMOC-C1)으로 자동적으로 유래되었다. 유도체를 40℃에서 Hypersil AA-ODS 컬럼(Agilent Technologies) 상에서 트리에틸아민(0.018%), 테트라하이드로푸란(0.3%) 및 아세토니트릴과 함께 아세테이트 완충액(pH 7.2)의 선형 구배에 의해 분리하였다. OPA 유도체에 대해 338 nm 및 FMOC 유도체에 대해 262 nm에서 다이오드 어레이 검출기를 사용하였다.
1.3. 글루타메이트 데카르복실라제(GAD) 활성:
50 mg의 박테리아 세포를 7시간의 배양 시 수합하였다. 세포를 0.2% KCl로 2회 세척하고, 4.5　mM MgCl2, 22% 글리세롤 및 1.5 mM DTT를 함유하는 소듐 아세테이트 완충액(100 mM, pH 4.6)에 현탁시켰다. 세포를 초음파처리(30초 및 60초 간격의 4 사이클, 6.5 m/s)에 의해 분해시키고, 치료 동안 얼음 상에 유지시켰다. 세포 찌꺼기를 10,000 g 및 4℃에서 15분 동안 원심분리에 의해 제거하였다.
상층액을 효소 검정에 사용하고, 추출물의 단백질 농도를 표준으로서 소 혈청 알부민을 이용한 브래드포드 방법에 의해 결정하였다.
효소 검정을 30℃에서 인큐베이션된 20 mM 소듐 글루타메이트, 2 mM 피리독살 포스페이트(PLP)로 구성된 0.5 mL의 기질 용액으로 실현시킨 다음, 0.5 mL 상층액과 혼합하였다. 4시간까지 30분마다, 100 μL를 샘플링하고, 5분 동안 끓여서 불활성시켜, 탈카르복실화 반응을 중단시켰다. 반응 혼합물을 후속적으로, GABA의 존재 하에 HPLC를 사용하여 분석하였다.
GAD 활성을 7시간 및 중성 pH 조건에서 측정하였다.
1 단위의 효소 활성을 본원에서, 분(min)당 및 mg의 단백질당 1 μmole의 글루타메이트를 전환시킨 효소의 양으로서 정의하였다.
2. 결과:
2.1. 시험관내 GABA 생성:
바이오매스 및 GABA 농도를 모두 NCDO2118, CNCM I-5388, CNCM I-5386 및 NCDO2727 균주(도 2)에 대한 배양물과 함께 측정하였다.
처음 8시간 내에, 박테리아 NCDO2118뿐만 아니라 CNCM I-5388, CNCM I-5386은 NCDO2727과 비교하여 pH 6.6에서 급속하게 성장하였다(성장 속도 약 0.7-0.8h-1). GABA는 모든 균주에 대해 낮은 수준에서 축적되었다. 그 후에 8시간째에, pH를 낮추고 4.6까지 제어하였으며, 이후에 성장은 중단되었고, 바이오매스는 저하되었다. 세포 생존력(viability)에서의 이러한 소실은 평판배양에 의해 확인되었다.
성장 억제에도 불구하고, NCDO2118 균주 또는 CNCM I-5388 및 CNCM I-5386에 의한 GABA의 생성은 GABA 생성 속도가 증가함에 따라 계속되었다(표 2). 최대 GABA 농도는 CNCM I-5388에 대해 24시간째에 60 mM에 도달하였다. 유사한 결과는 생물반응기에서 제2 배양으로 수득되었다(독립적인 2벌). 40-60 mM의 GABA 생성은 생물반응기로의 유리 글루타메이트의 초기 농도의 완전한 생물전환에 상응한다.
모든 4개 균주에서 gad 오페론 서열의 강한 유사성 및 구조화에도 불구하고, 유사한 배양 조건 하에 특징화된 NCDO2727 균주의 GABA 생성 패턴은, GABA 농도가 항상 0.2 mM 미만이고(도 2a) GABA 생성 속도가 낮기 때문에(표 2), 생성된 GABA의 매우 소량으로도 매우 상이하였다.
NCDO2118 NCDO2727 CNCM I-5388 CNCM I-5386
μ최대 (h-1) 0.71 ± 0.05 0.21 ± 0.04 0.81 ± 0.08 0.71 ± 0.05
ν 평균 GABA (mmole/g/h) 2.86 ± 0.39 0.02 ± 0.04 6.70 ± 2.67 1.09 ± 0.27
표 2: 생물반응기에서(2벌 중복에서) 엘. 락티스 NCDO2118, CNCM I-5388, CNCM I-5386 및 NCDO2727의 성장 동안 7시간 내지 11.5시간 사이에 계산된 GABA 생성의 비속도(specific rate)(mmole/g 세포 건조 중량/h).
2.2. 시험관내 GAD 활성:
높은 GAD 활성을 이의 높은 GABA 생성 능력과 일관되게 NCDO2118 균주에서 수득한 한편, NCDO2727 균주에서 그 양은 매우 낮았다(표 3). 중간 수준의 GAD 활성은 CNCM I-5386 균주에 대해 수득된 한편, 매우 높은 활성은 CNCM I-5388 균주에 대해 측정되었다. 그러나, 당업자는, 중성 pH 조건 하에 7시간째에, 생물반응기에서 축적된 낮은 GABA 생성에도 불구하고 NCDO2118 균주, CNCM I-5388 또는 CNCM I-5386에서의 GAD 활성이 높았음을 알 수 있으며, 이는 GABA 생성을 위한 효소적 장비가 이미 세포에서 발현되었지만 아직 활성이지는 않았음을 시사한다.
NCDO2118 NCDO2727 CNCM I-5388 CNCM I-5386
GAD 7시간 42.7 ± 5.9 0.6 ±0.4 826.2 ±93.0 20.7 ±4.3
표 3: 유리 글루타메이트(8 g/L), 아르기닌(5 g/L), 및 NaCl(300 mM)(생물반응기에서 2개의 배양 중복 각각에 대해 n=3)이 보충된 M17에서 7시간의 성장 후 엘. 락티스 균주의 비(specific) GAD 활성(μmole/분.mg의 단백질).
실시예 2: 래트에서 스트레스 모델(모델 IBS)에서 관심 엘. 락티스 균주의 효과
1. 재료 및 방법:
1.1. 　동물 및 수술적 시술:
성체 암컷 Wistar 래트(200-225 g)를 Janvier Labs(Le Genest St Isle, France)으로부터 구매하고, 표준 조건(온도 22±2± 및 12-h 명/암 사이클) 하에 폴리프로필렌 케이지에서 개별 사육하였다. 동물을 물 및 사료(표준 펠렛 2016, Envigo RMS SARL, Gannat, France)에 자유롭게 접근하게 하였다. 모든 실험은 유럽 지침 2010/63/UE에 응하여 지역 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인을 받았다.
0.6　mg/kg 아세프로마진(calmivet, Vetoquinol, Lure, France) 및 120 mg/kg 케타민(Imalgene 1000, Merial, Lyon, France)의 복강내 투여에 의한 일반적인 마취 하에, 동물을 이전에 기재된 기법에 따라 복부 횡문근(abdominal striated muscle) 근전도 검사(EMG: electromyography)를 위해 준비하였다(Morteau et al., 1994).
NiCr 와이어 전극(60　cm 길이 및 80　μm 직경)의 3개 쌍을 중앙선으로부터 측면으로 2 cm에서 횡문근에서 양방향으로 이식하였다. 전극의 유리(free) 단부(end)를 뒷목 상에서 밖으로 빼내고(exteriorise), 피부에 부착된 유리 튜브에 의해 보호하였다.
1.2. 　결장직장 팽창 시술 및 EMG 기록:
암컷 래트를, 이들 래트가 움직이거나 탈출하거나 뒤집을 수 없는 폴리프로필렌 터널(20　cm 길이 및 7　cm 직경)에 결장직장 팽창(CRD) 전 수일 동안 적응시켜, 해당 환경에 친숙하도록 하였다.
색전제거술 프로브(embolectomy probe)(Fogarty)로부터 취한 강성(rigid) 카테터 상에 고정된 4-cm 길이의 라텍스 풍선을 사용하였다.
기계적 자극인 CRD를 항문으로부터 1 cm에서 직장에서 풍선의 삽입 후 수행하였다. 튜브를 꼬리를 기초로 고정하였다. 풍선을 Distender Series IIR Barostat(G&J Electronics Inc, Toronto, Canada)에 연결함으로써 결장의 등압 팽창(isobaric distension)을 0 내지 60 mmHg에서 수행하였다.
제1 팽창을 15 mmHg의 압력에서 수행하였으며, 60 mmHg의 최대 압력이 도달될 때까지 15 mmHg의 증가분을 각각의 하기 단계에 추가하였고, 각각의 팽창 단계는 5분 동안 지속되었다.
복부 경련(cramp)과 관련된 횡문근 스파이크 버스트(spike burst)를, 저주파 신호(<3 Hz)를 제거하기 위해 짧은 시간 상수(0.03초)를 사용하여, 이식된 전극으로부터 뇌파 전위 기록(electroencephalograph) 기계(Mini VIII, Alvar, Paris, France) 상에서 기록하였다. EMG 기록은 수술 후 7일째에 시작하였다.
5분의 기간 동안의 수축 횟수는 내장 통증의 강도를 나타낸다.
1.3. 　스트레스 시술:
일주기 리듬(circadian rhythm)의 임의의 영향을 최소화하기 위해 모든 스트레스 세션을 동일한 일자(오전 10시 내지 낮 12시)에 수행하였다.
급성 스트레스의 상대적으로 경증 비-궤양유발 모델인 부분 구속 스트레스(PRS)를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(Williams et al., 1988).
암컷 래트를 디에틸-에테르로 진정시키고, 이의 앞쪽 어깨, 상부 전완 및 흉곽을 종이 테이프의 컨파이닝 하니스(confining harness)에서 감싸, 신체의 움직임을 제약하되 막지는 않았다.
그 후에, 동물을 이의 홈 케이지에서 2시간 동안 두었다.
1.4. 　실험 프로토콜:
경구 개비지(oral gavage)에 의한 10-일 치료에 기초하여 4개 시리즈의 실험을, 각각의 시리즈에 대해 EMG에 대해 갖춰진 7 내지 12마리의 암컷 래트로 구성된 3개 군을 사용하여 수행하였다.
래트에게 엘. 락티스 NCDO2118 또는 NCDO2727을 10일 동안 일일 1회 개비지에 의해 제공하였다. 세척된 박테리아 세포(109 cfu/일)를 사용하여, 래트에게 초기에 투여되는 GABA의 양을 최소화하였다. 다르게 언급되지 않는 한, 유리 글루타메이트(0.2% (w/v))를 개비지 혼합물에 첨가하여, 생체내 GABA 생성을 선호하게 하였다.
모든 조건에 대해, CRD에 대한 기저 복부 반응을 치료 제9일에 기록하였고, CRD에 대한 PRS-유도 내장 과민성을 치료 제10일에 기록하였다.
2시간 PBS 세션 후 20분째에 CRD 측정을 수행하였다.
비히클-치료 동물에서, 유리 글루타메이트(0.2% (m/v))는 그 자체로는 기저 및 스트레스-유도 결장직장 민감성에 아무런 효과를 갖지 않는 것으로 입증된다.
1.5. 통계학적 방법:
동물 실험에 대해, 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 보고된다. 소프트웨어 GraphPad Prism 6.0(GraphPad, San Diego, CA)을 통계학적 분석에 사용하였다. 일원 ANOVA(one-way ANOVA), 뒤이어 터키 다중 비교 검정(Tukey's Multiple Comparison test)을 수행하여, 상이한 동물군 사이에서 데이터를 비교하였다. 통계학적 유의성은 P < 0.05에서 허용되었다.
2. 결과:
2.1. 기저 및 스트레스-유도 결장직장 민감성에 미치는 유리 글루타메이트의 효과
기저 조건(즉, PRS 전) 하에 비히클로 치료된 래트에서, 점차적인 결장직장 팽창(CRD)은 복부 수축 빈도를 압력-의존적 방식으로 증가시켰다(도 3).
비히클과 비교하여, 유리 글루타메이트의 투여는 CRD에 대한 복부 반응에 영향을 미치지 않았다(도 3).
비히클-치료 래트에서, 2-시간 PRS는 기저 조건과 비교하여 복부 수축의 횟수를 유의하게 증가시켰으며; 유리 글루타메이트의 투여는 PRS 세션 후 측정된 CRD에 대한 내장 과민성 반응을 변형시키지 않았다(도 3).
그러므로, 유리 글루타메이트는 그 자체로는 기저 및 스트레스-유도 결장직장 민감성에 아무런 효과를 갖지 않았다.
2.2. 내장 과민성에 미치는 엘. 락티스 NCDO2118의 효과
CRD에 대한 스트레스-유도 내장 과민성에 미치는 엘. 락티스 NCDO2118 및 NCDO2727의 영향은 도 4에 도시되어 있다.
비히클-치료 래트에서, 2-시간 PRS는 30 mmHg로부터 적용된 모든 팽창 압력에 대해 기저 조건과 비교 시 복부 수축의 횟수를 유의하게 증가시켰다(P<0.001, 도 4).
중요하게는,엘. 락티스 NCDO2118의 10-일 경구 투여는 복부 수축(60 mmHg의 팽창 압력에 대해 P<0.01, 도 4)의 PRS-유도 증강을 억제시켰으며, CRD에 대한 유사-기저(quasi-basal) 민감성을 회복시켰다.
대조적으로, 엘. 락티스 NCDO2727의 경구 투여는 스트레스-유도 내장 과민성에 아무런 효과를 갖지 않았다(도 4).
결론적으로, 급성 구속 스트레스는 래트에서 팽창에 대한 결장 과민성을 유도하였고, 이러한 과민성 표현형은 10-일 매일 경구 투여(109 cfu/일) 후 엘. 락티스 NCDO2727이 아니라 엘. 락티스 NCDO2118에 의해 역전되었다.
실시예 3: 엘. 락티스 NCDO2118에 의한 스트레스-유도 내장 과민성의 예방은 생체내에서 GABA를 전달하는 이의 능력으로 인한 것이다
1. 재료 및 방법:
1.1. 　박테리아 균주
균주 NCDO2118 및 NCDO2727을 사용하였다.
엘. 락티스 NCDO2118 △gadB를 염색체에서 이중 교차(double crossing over)에 의해 작제하였다.
GABA 경로를 방해하기 위해, GAD 인코딩 유전자 gadB를 결실시켰다.
gadB 코딩 서열의 바로 업스트림 및 다운스트림 각각에서 829 bp 및 981 bp의 2개 단편을 PCR 증폭시켰으며, 이때 NCDO2118 염색체를 매트릭스로 사용하였다. 프라이머를 표 4에 나열한다. 2개 단편을 중첩(overlapping) PCR에 의해 융합하였다. pGhost9 벡터를 PCR 증폭시키고, 융합된 단편에 Gibson 조립 방법(New Englang Biolabs)을 사용하여 연결하였다. 생성된 플라스미드를 시퀀싱에 의해 확인하고, 엘. 락티스 NCDO2118에 도입하였다. 그 후에, gadB의 염색체 결실을 이전에 기재된 바와 같이 이중 교차에 의해 수득하였다(Maguin et al., 1996). 염색체 내로의 gadB 서열의 결실을 PCR에 의해 확인하였다.
균주의 배양 조건은 실시예 1에 기재된 것과 동일하다.
프라이머 명칭 5'-3' 서열 SEQ ID NO: 용도:
821-GBgadCR ggaattcgatTTAGATGCCATAGGAGGATTTTC 1 gabB 업스트림 서열의 증폭
894-GBgadC2F GATGAATATCGTACATCCTCCAATTTTTTAATG 2
892-GBkefA2F AAGCTTGATAAAACAAGAAAATATTCATGAAATTCAG 3 gabB 다운스트림 서열의 증폭
893-GBkefA2R GGAGGATGTACGATATTCATCTTAAGAAAAATCAAAAGC 4
822-GBpGhost9EVF catctaaATCGAATTCCTGCAGCCCG 5 pGhost9 백본의 증폭
891-GBpGh9EV2R TCTTGTTTTATCAAGCTTATCGATACCGTC 6
898-amt GadB(DCO) TTGGATTAGCTGCGGCATATTTTATCG 7 염색체 상으로의 gabB 결실의 확인
899-avl GadB(DCO) CCTTGTTGACCATAATGCAAAGCAGGT 8
표 4: 엘. 락티스 NCDO2118.1.2에서 gadB의 불활성화에 사용된 프라이머.
1.2. gad 오페론의 서열 분석:
NCDO2118 균주에서, gad 오페론 서열을 기탁 번호 CP009054 하에 NCBI-GenBank 데이터베이스에 기탁된 염색체 서열로부터 추출하였다.
NCDO2727 균주에서 gad 오페론을 증폭시키기 위해, 2개의 프라이머인 GadSeq_F(5'-TCCAGAAATAACAGCTACATTGACATAATG-3') 및 GadSeq_R(5'-TAACAGCCCCATTATCTAAGATTACTCC-3')을 사용하였다. Q5 High-Fidelity DNA 폴리머라제(NEB)를 사용하고 제조업체의 권고사항에 따라 25-μL 반응 혼합물에서 20 ng의 게놈 DNA를 이용하여 증폭을 수행하였다. PCR 조건은 98℃에서 3분의 초기 변성 단계, 뒤이어 98℃에서 10초, 64℃에서 30초, 및 72℃에서 3분의 30 사이클, 및 72℃에서 2분의 최종 신장 단계로 구성되었다.
그 후에, QIAquick 젤 추출 키트(QIAgen)를 사용하여 앰플리콘을 정제하였다.
서열을 표 5에 나열된 프라이머 세트를 이용하여 Eurofins Genomics에 의해 수행하였다. 오페론의 서열을 기탁 번호 MK225577 하에 NCBI-GenBank 데이터베이스에 기탁하였다.
gad 오페론의 서열을 Blast 정렬 알고리즘에 의해 비교하였다.
프라이머 명칭 5'-3' 서열 SEQ ID NO:
GabSeq_2_F AAAATATAGAAGGAGACTATTGCAAATAGC 9
GabSeq_2_R AAAAATTAATGGCCATCGTTGGTAGTTCTC 10
GabSeq_3_F TCTGTGCAGCAGAAATGGCGACGGTTGAA 11
GabSeq_3_R TCCCCATAAATTTTTCTTTTTCACTCGCAT 12
GabSeq_4_F CGGTTATTCCTCAAAAAGACTTATCATTAA 13
표 5: 엘. 락티스 NCDO2727에서 gad 오페론의 시퀀싱에 사용되는 프라이머.
2. 결과:
이러한 결실을 이용하고 그리고 동일한 배양 조건 하에, 돌연변이체는 야생형과 유사하게(0.65 h-1의 성장 속도) 성장할 수 있었다. 그러나, 이들 조건 하에, 어떠한 GABA도 생성되지 않았고(24시간째에 <0.29 mM) 어떠한 GAD 활성도 7시간째에 검출되지 않았다.
스트레스-유도 내장 과민성에 미치는 엘. 락티스 NCDO2118 치료의 유익한 효과(P<0.001)는, 동물이 NCDO2118 ΔgadB 동종동계(isogenic) 균주(도 6, P<0.05 NCDO2118 ΔgadB- vs. NCDO2118-치료 동물)를 받았을 때 역전되었다.
실시예 4: 래트에서 스트레스 모델(모델 IBS)에서 관심 엘. 락티스 균주와 내장 과민성에서 수득되는 효과의 비교
1. 재료 및 방법:
동물의 준비는 실시예 2에 기재된 것과 동일하다.
래트에게 엘. 락티스 NCDO2118 또는 CNCM I-5388을 4일 또는 9일 동안 일일 1회 개비지에 의해 제공하였다. 세척된 박테리아 세포(109 cfu/일)를 사용하여, 래트에게 초기에 투여되는 GABA의 양을 최소화하였다. 다르게 언급되지 않는 한, 유리 글루타메이트(0.2% (w/v))를 개비지 혼합물에 첨가하여, 생체내 GABA 생성을 선호하게 하였다.
2. 결과:
CRD에 대한 스트레스-유도 내장 과민성에 미치는 엘. 락티스 NCDO2118, CNCM I-5388 및 CNCM I-5388 Δgad의 시간 경과에 따른 영향을 도 5 및 도 7에 도시한다.
글루타메이트의 존재 하에 CNCM I-5388 및 NCDO2118은 스트레스에 대한 내장 과민성을 감소시킨다.
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COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) CNCMI-5386 20181129 COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM) CNCMI-5388 20181213
<110> INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE POUR L'AGRICULTURE, L'ALIMENTATION ET L'ENVIRONNEMENT INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE TOULOUSE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ECOLE D'INGENIEURS DE PURPAN ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER <120> LACTOCOCCUS LACTIS STRAINS FOR THE PREVENTION AND/OR THE TREATMENT OF VISCERAL PAIN <130> F539/191 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 1 ggaattcgat ttagatgcca taggaggatt ttc 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 2 gatgaatatc gtacatcctc caatttttta atg 33 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 3 aagcttgata aaacaagaaa atattcatga aattcag 37 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 4 ggaggatgta cgatattcat cttaagaaaa atcaaaagc 39 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 5 catctaaatc gaattcctgc agcccg 26 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 6 tcttgtttta tcaagcttat cgataccgtc 30 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 7 ttggattagc tgcggcatat tttatcg 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 8 ccttgttgac cataatgcaa agcaggt 27 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 9 aaaatataga aggagactat tgcaaatagc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 10 aaaaattaat ggccatcgtt ggtagttctc 30 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 11 tctgtgcagc agaaatggcg acggttgaa 29 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 12 tccccataaa tttttctttt tcactcgcat 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 13 cggttattcc tcaaaaagac ttatcattaa 30

Claims (17)

  1. 복부 또는 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 24시간 이하의 배양 시간에서 적어도 10 mM의 γ-아미노부티르산(GABA)을 생성할 수 있는 락토콕커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주.
  2. 복부 또는 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 7시간 내지 8시간의 배양 시간에서 적어도 20 ㎛ole/분.mg의 피리도칼-5'-포스페이트(PLP: pyridocal-5'-phosphate)-의존적 효소 글루타메이트 데카르복실라제(GAD: glutamate decarboxylase)를 생성하는 락토콕커스 락티스 균주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 균주는 CNCM I-5388, CNCM I-5386 및 NCDO2118로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 락토콕커스 락티스 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 균주는 유리(free) 글루타메이트의 존재 하에 투여되는 것을 특징으로 하는, 락토콕커스 락티스 균주.
  5. 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 락토콕커스 락티스 균주로부터 수득되는 세포 분획.
  6. 내장 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 락토콕커스 락티스 균주 또는 제4항에 정의된 바와 같은 세포 분획을 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 일일(day)당 적어도 106 콜로니 형성 단위(cfu: colony forming units)의 엘. 락티스(L. lactis) 균주의 투여를 가능하게 하는 상기 엘. 락티스 균주의 함량을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 유리 글루타메이트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 식품인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항, 또는 제5항, 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내장 통증은 심리학적 스트레스 사건 및/또는 불안과 연관되어 있는 것을 특징으로 하는, 락토콕커스 락티스 균주, 세포 분획 또는 조성물.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항, 또는 제5항, 또는 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 내장 통증은 구강 작열감 증후군(BMS: burning mouth syndrome)으로 인한 것임을 특징으로 하는, 제10항에 따른 이의 용도를 위한 락토콕커스 락티스 균주, 세포 분획 또는 조성물.
  12. 기탁번호 CNCM I-5388 및 CNCM I-5386으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 락토콕커스 락티스 균주.
  13. 제12항에 정의된 바와 같은 락토콕커스 락티스 균주로부터 수득되는 세포 분획.
  14. 제12항에 따른 락토콕커스 락티스 균주 또는 제13항에 따른 세포 분획을 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 조성물은 그램 건조 중량(gram dry weight)당 적어도 106 cfu를 포함하는 것을 특징으로 하는, 락토콕커스 락티스 균주를 포함하는 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 조성물은 식품인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  17. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 조성물.
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