CN104797265A - 含有特定的加氏乳杆菌株或其处理物的压力性肠紊乱的减轻剂 - Google Patents

含有特定的加氏乳杆菌株或其处理物的压力性肠紊乱的减轻剂 Download PDF

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Abstract

本申请提供加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株(例如低温耐性衍生株)及其制造法，特征在于含有该衍生株、其菌体处理物或它们的混合物作为有效成分的压力性肠紊乱的减轻剂、包含该减轻剂的食品添加剂、动物添加剂、动物饲料和药物组合物。

Description

含有特定的加氏乳杆菌株或其处理物的压力性肠紊乱的减轻剂
技术领域
本发明涉及含有某特定的加氏乳杆菌株的活菌体或杀菌体或者其处理物作为有效成分的、待检体的肠管中的水分过剩分泌的减轻剂(或抑制剂)、或者压力性肠紊乱、特别是压力性腹泻症状的减轻剂(或抑制剂)。
本发明还涉及新型的低温耐性加氏乳杆菌株及其制造法。
本发明进一步涉及包含上述的低温耐性加氏乳杆菌株或其处理物作为有效成分的、压力性肠紊乱的减轻剂(或抑制剂)。
本发明还涉及含有上述减轻剂(或抑制剂)的、食品添加剂或动物饲料添加剂、或者食品或药物组合物。
背景技术
表示加氏乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌对于压力抑制作用、胃肠疾病有效的可能性的现有技术文献，可见以下例示的几篇。
例如，日本特开2009-102292号公报(专利文献1)中记载了：以作为副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)的乳酸菌FERM P-19169作为有效成分，基于细胞因子产生调节作用、感染防御作用、肥育作用或腹泻抑制作用的压力抑制剂。该文献中记载了，压力抑制是指：通过抑制由引起压力的外部刺激即应力产生的生物体的非特异性反应，能够缓和食欲减退、消化不良、失眠、健康状态不良、传染病等症状。
日本特开2009-100692号公报(专利文献2)和日本特开2008-212140号公报(专利文献3)中记载了一种哺乳动物用乳酸菌制剂，其特征在于含有具有压力减轻作用的加氏乳杆菌属微生物；通过对哺乳动物给予特定的乳酸菌，发挥出优异的压力减轻效果，能够预防和治疗起因于压力的腹泻病等消化器官疾病。
日本专利第4350170号公报(专利文献4)中记载了一种药学调制物，其为人和动物的胃肠紊乱的预防和/或处置中所需要的药学调制物，其特征在于，微生物维持其生存性的至少一种药学上能够接受的载体介质中包含具有保藏编号NCIMB 40564的干酪鼠李糖乳杆菌(Lactobacilluscaseirhamnosus)LB21的能够生存的微生物株。
日本特开2011-200211号公报(专利文献5)中记载了含有加氏乳杆菌MCC1183株的抗溃疡剂，该药剂用于起因于幽门螺杆菌的胃溃疡或十二指肠溃疡的预防或治疗。
日本特表2009-511471号公报(专利文献6)中记载了选自乳酸菌的至少一种益生菌细菌(Probiotic bacteria)株在制造用于自体免疫疾病的治疗和/或预防的药学组合物中的应用；该自体免疫选自由多发性硬化症(MS)、***反应、干癣、风湿性关节炎(rhematoid arthritis)、克罗恩(氏)病(Crohn’s disease)、溃疡性大肠炎、I型糖尿病、炎症性肠病和全身性红斑狼疮等脏器特异性自体免疫(organ specific autoimmunity)所组成的组；另外，乳酸菌株选自由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)和加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)组成的组。
日本专利4853986号公报(专利文献7)中记载了以加氏乳杆菌SBT2055(称为LG2055)(FERM P-15535)的菌体或其发酵产物作为有效成分的炎症性肠病和/或肠易激综合征的预防和治疗剂；另外，通常对于肠易激综合征的治疗，进行心理性压力的控制并且根据症状实施从整肠药、缓泻药至抗精神病药的阶段性药物治疗。
泽田大辅等、第13次肠内细菌学会(平成21年)、东京、日本(非专利文献1)中记载了由加氏乳杆菌CP2305株的活菌体带来的压力缓和作用，例如改善压力性腹痛。
Daisuke Sawada et al.,The 10th Symposium on Lactic Acid Bacteria(2011年)、荷兰、Federation of European Microbiological Societies(FEMS)和Netherlands Society for Microbiology(NVvM)(非专利文献2)中，记载了对于肠易激综合征(IBS)患者给予CP2305株活菌体，但对于腹泻症状缓和则没有记载。
日本特开2003-95963号公报(专利文献8)中记载了利用加氏乳杆菌的菌体或其发酵产物的炎症性肠病或肠易激综合征的预防和治疗剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-102292号公报
专利文献2：日本特开2009-100692号公报
专利文献3：日本特开2008-212140号公报
专利文献4：日本专利第4350170号公报
专利文献5：日本特开2011-200211号公报
专利文献6：日本特表2009-511471号公报
专利文献7：日本专利4853986号公报
专利文献8：日本特开2003-95963号公报
非专利文献
非专利文献1：泽田大辅等，第13次肠内细菌学会(平成21年)、东京、日本
非专利文献2：Daisuke Sawada et al.,The 10th Symposium on Lactic AcidBacteria(2011年)、荷兰、Federation of European Microbiological Societies(FEMS)和Netherlands Society for Microbiology(NVvM)
发明内容
发明要解决的问题
有记载称，作为乳酸菌的一种的加氏乳杆菌株对于炎症性肠病、肠易激综合征等胃肠紊乱的预防或治疗是有效的。另外，还记载了推定这样的胃肠紊乱与压力的关系。但是，一直以来，关于加氏乳杆菌株边抑制胃肠紊乱特别是压力而将过剩的肠运动保持正常边具有水分过剩分泌抑制作用、以及显著地预防、改善或治疗压力性腹泻症状的压力性肠紊乱的减轻作用的(低温耐性)乳酸菌并没有记载。并且，一直以来，关于加氏乳杆菌株在暴露于脑内压力荷尔蒙分泌这样的压力的状况下，边将过剩的肠运动保持正常边显著地改善压力性腹泻症状，也没有记载。特别是，对于区别于IBS患者的健康人的由压力负荷导致的压力性腹泻的抑制(减轻或缓和)，也没有记载。本发明的目的在于，将加氏乳杆菌的活菌体或杀菌体或者其处理物应用于与水分过剩分泌或水分过剩分泌相关的压力性紊乱例如压力性腹泻或压力性腹痛的预防和治疗。
进而，对于成为制造上问题的低温下具有耐性的压力性肠紊乱等有效果的乳酸菌，还不为人知。
用于解决问题的方案
本发明包含以下的特征。
(1)一种肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或者炎症性肠病的减轻剂，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株(NITE BP-1405)衍生的衍生株、它们的菌体处理物、或它们的混合物作为有效成分。
(2)一种肠管中的水分过剩分泌或者压力性腹泻的减轻剂，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、其菌体处理物或者它们的混合物作为有效成分。
(3)一种肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻或压力性肠紊乱的减轻剂，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)的杀菌体、其菌体处理物或者它们的混合物作为有效成分。
(4)根据(1)或(2)所述的减轻剂，其中，前述CP2305株、前述CP2305s株、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株(NITE BP-1405)衍生的衍生株为活菌体或杀菌体。
(5)根据(1)～(4)的任一项所述的减轻剂，其中，所述菌体处理物为干燥菌体、破坏菌体、破碎菌体或发酵乳。
(6)根据(1)～(5)的任一项所述的减轻剂，其具有阻碍由压力导致的骨盆(副交感)神经活动的抑制的作用。
(7)根据(1)～(6)的任一项所述的减轻剂，其具有通过抑制大肠氯离子通道而抑制水分分泌的作用。
(8)根据(1)～(7)的任一项所述的减轻剂，其为压力性腹泻的改善剂。
(9)一种动物饲料的制造方法，其包括将(1)～(8)的任一项所述的减轻剂与动物饲料成分配混而制造动物饲料的工序。
(10)一种动物饲料，其含有加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株(NITE BP-1405)衍生的衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物或者它们的混合物。
(11)一种食品添加剂或动物饲料添加剂，其含有(1)～(10)的任一项所述的减轻剂。
(12)一种食品添加物，其含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERMBP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物或者它们的混合物。
(13)一种饮食品，其含有加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物或者它们的混合物。
(14)根据(13)所述的饮食品，其为功能性饮食品。
(15)一种功能性饮食品的制造方法，其包括：将(1)～(8)的任一项所述的减轻剂与食品用的载体、赋形剂或稀释剂混合，根据情况进一步混合食品添加剂，从而制造功能性饮食品。
(16)一种药物组合物，其用于预防、减轻或抑制、或者治疗肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或炎症性肠病，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株的活菌体或者杀菌体、它们的菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
(17)一种药物组合物，其用于预防、减轻或抑制、或者治疗肠管中的水分过剩分泌或压力性腹泻，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERMBP-11331)、其菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
(18)一种药物组合物，其用于预防、减轻或抑制、或者治疗肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)的杀菌体、其菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
(19)一种药物组合物，其用于预防、减轻或抑制、或者治疗肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或者炎症性肠病，其包含(1)～(8)的任一项所述的减轻剂，以及药学上能够允许的载体、赋形剂或稀释剂。
(20)一种乳酸菌，其具有与加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)同等以上的压力性肠紊乱的减轻作用，并且与CP2305株不同。
(21)根据(20)所述的乳酸菌，其中，所述压力性肠紊乱的减轻作用以后述的实施例3所述的腹泻评分计，具有与加氏乳杆菌CP2305株(FERMBP-11331)或加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)同等以上的压力性腹泻抑制作用。
(22)一种乳酸菌，通过后述的实施例3所述的方法对腹泻评分进行评价时，与安慰剂比较，显著(与安慰剂比较p＜0.05)地抑制压力性腹泻并且与CP2305株(FERM BP-11331)不同。
(23)根据(20)～(22)的任一项所述的乳酸菌，其具有在冰上保持5小时时的生存率为60％以上的低温耐性。
(24)根据(20)～(23)的任一项所述的乳酸菌，其具有阻碍由压力导致的骨盆(副交感)神经活动的抑制的作用。
(25)根据(19)～(24)的任一项所述的乳酸菌，其具有通过抑制大肠氯离子通道而抑制水分分泌的作用。
(26)根据(20)～(25)的任一项所述的乳酸菌，其特征在于，上述乳酸菌为属于加氏乳杆菌种的乳酸菌。
(27)根据(20)～(26)的任一项所述的乳酸菌，其中，所述乳酸菌为加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)的衍生株或加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)的衍生株。
(28)根据(20)～(27)的任一项所述的乳酸菌，其用于预防或减轻肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征、腹泻型肠易激综合征或者炎症性肠病。
(29)一种乳酸菌低温耐性株的制造方法，其包括：将乳酸菌暴露于10℃以下的温度，选拔生存的低温耐性株，进行育种，根据需要重复该操作，以及对生存的低温耐性株进行回收。
(30)根据(29)所述的方法，其中，乳酸菌为属于加氏乳杆菌种的乳酸菌、或者加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)。
(31)一种乳酸菌，其包含加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株。
(32)一种乳酸菌，其具有在冰上保持5小时时的生存率为60％以上的低温耐性。
(33)根据(32)所述的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌为属于加氏乳杆菌种的乳酸菌。
(34)一种肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征、腹泻型肠易激综合征或者炎症性肠病的预防或减轻剂，其特征在于，含有(20)～(27)和(31)～(33)的任一项所述的乳酸菌作为有效成分。
此处，上述(21)的“后述的实施例3所述的腹泻评分”，具体而言，是指用本说明书实施例3所述的方法评价的腹泻评分，简单地说明则是指粪便重量(i值)×粪便评分(ii值)的10次的总和。i值为测定的粪便的重量(g)，ii值是由图5所示的粪便评分标准决定的评分(即，评分1：普通便；评分2：稍有腹泻便；评分3：形状走样的腹泻便；评分4：没有形状的腹泻便)。
进而另外，上述(22)的“后述的实施例3所述的方法”简单地说明则是如下方法，包括：使大鼠(4周龄、雄)自由摄取相对于CRF-1(商标)饵料25g配混了菌数2.0×1010个的试验菌体的冷冻干燥粉末的试验菌体配混饵料3周，将促肾上腺皮质素释放因子(CRF；Corticotropin Releasing Factor)溶液对该大鼠以125μg/kg腹腔内给予，使之诱导压力性腹泻，对于CRF给予后的100分钟的粪便状况，使用腹泻评分(上述)进行评价(各组19只)，基于该结果对于试验菌体的压力性腹泻抑制进行评价。
本发明的加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)衍生的株或由CP2305s株衍生的株、它们的菌体处理物、或者它们的混合物由于阻碍压力诱导性骨盆(副交感)神经活动的抑制而将肠运动保持正常、以及有效地抑制待检体的压力性腹泻，所以对于压力性肠紊乱的预防、减轻或治疗是有效的。特别是，本发明的加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的株(例如低温耐性株)、它们的菌体处理物或者它们的混合物由于阻碍了压力诱导性骨盆(副交感)神经活动的抑制而将肠运动保持正常，显著地抑制待检体的肠管中的水分过剩分泌，以及有效地抑制待检体的压力性腹泻等，因此对于压力性肠紊乱的预防、减轻或治疗是有效的。
附图说明
图1：该图表示对加氏乳杆菌CP2305株实施冷休克而得到的低温耐性株(CP2305s、A～D)的活菌率。
图2：该图表示加氏乳杆菌CP2305株的活菌体、杀菌体和衍生株CP2305s杀菌体对于CRF诱导腹泻模型的影响。安慰剂为不含有CP2305株的阴性对照。另外，*表示显著性水平p小于0.05。
图3：该图表示CRF诱导后的结肠氯离子通道关联基因表达变化。显示出在CP2305株给药组中抑制了在安慰剂组中CRF给药后增加的氯离子通道关联基因。图中，Agt表示血管紧张素原(angiotensinogen)(丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂(serpin peptidase inhibitor)，分支A(clade A)，成员8(member 8))；Adcy5表示腺苷酸环化酶5(adenylate cyclase 5)；Adora1表示腺苷受体A1(Adenosine receptor A1)；Ngf表示神经生长因子(nerve growth factor)(β多肽(beta polypeptide))；Igf2表示类胰岛素生长因子2(insulin-like growth factor 2)；Igf1表示类胰岛素生长因子1(insulin-like growth factor 1)。
图4：该图表示CP2305株给药对于骨盆(副交感)神经的影响。
图5：该图表示用于算出本发明的实验中的腹泻评分的、粪便评分标准的图。根据粪便的“水分状况”·“形状”将粪便评分按照1～4的4级进行评价(表中的粪便的颜色不作为粪便评分标准的对象，但作为用于表示本发明效果的参考信息而添加。)。
图6：该图表示各种乳酸菌给药对于CRF诱导腹泻模型的影响。乳酸菌为加氏乳杆菌CP2305株的活菌体、公知保藏菌株A(加氏乳杆菌(L.gasseri))和市售活菌制剂B(包含嗜酸乳杆菌(L.acidophilus))。安慰剂为不含有CP2305株的阴性对照。另外，*表示显著性水平p小于0.05。
图7：该图表示各种乳酸菌的杀菌发酵乳的给予对大肠的神经刺激诱导的离子运输的影响。纵轴表示将离子分泌的百分比表示为以安慰剂(阴性对照)的离子分泌为100％时的值。图中，A：公知保藏菌株A(加氏乳杆菌(L.gasseri))、B：嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、C：假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、D：德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、E：嗜热链球菌(S.thermophilus)、F：高加索奶粒乳杆菌(L.kefirgranum)。#表示显著性水平p小于0.05。
图8：该图表示CP2305株、公知保藏菌株A(加氏乳杆菌(L.gasseri))和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)的各杀菌体的给予对于大鼠大肠(远端结肠)的神经刺激诱导的离子运输带来的影响。纵轴表示将离子分泌的百分比以安慰剂(阴性对照)的离子分泌作为100％时的值。*表示显著性水平p小于0.05。
图9：该图表示CP2305株的活菌体和杀菌体、CP2305株的活菌发酵乳和杀菌发酵乳的给予对于大鼠大肠(远端结肠)的离子运输的影响。纵轴表示将离子分泌的百分比以安慰剂(阴性对照)的离子分泌作为100％时的值。#表示显著性水平p小于0.05。
具体实施方式
进一步对于本发明具体地说明。
＜肠管中的水分过剩分泌的抑制剂＞
本发明提供待检体的肠管中的水分过剩分泌的抑制剂，其特征在于，加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)(以下，也简单地称为“CP2305株”。)的活菌体或杀菌体、其菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
＜低温耐性加氏乳杆菌株＞
本发明还提供加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)(以下，也简单地称为“CP2305s株”。)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株(例如，低温耐性衍生株)。
通过使用包括：使加氏乳杆菌株暴露于10℃以下的温度，选拔生存的低温耐性株进行育种，根据需要将该操作重复1次以上，对生存的低温耐性株进行回收的方法，能够制造低温耐性株。通过该操作，在冷休克后，能够得到活菌率为约60％以上、优选为约70％以上、进而优选为约80％以上、85％以上、90％以上的低温耐性株。
通过这样的冷休克法，能够得到包括加氏乳杆菌CP2305s株(NITEBP-1405)的数种低温耐性株(图1)。该加氏乳杆菌CP2305s株被本申请人于2012年8月14日以NITE BP-1405国际保藏于作为根据布达佩斯条约规定的国际保藏单位独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(〒292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)。
需要说明的是，作为母株的加氏乳杆菌CP2305株被本申请人于2007年9月11日以FERM BP-11331国际保藏于作为根据布达佩斯条约规定的国际保藏单位独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)。该株现在被转移至国际保藏单位独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(〒292-0818日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)保管。
＜压力性肠紊乱等的减轻剂＞
本发明进而提供肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征、腹泻型肠易激综合征或炎症性肠病的减轻剂，其特征在于，其含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITEBP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株(例如低温耐性衍生株)、它们的菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
CP2305株、CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的衍生株(例如低温耐性衍生株)可以为活菌体或杀菌体的任一者。
本说明书中的“待检体”为属于哺乳类和鸟类的动物，优选为人等灵长类、牛、马、绵羊、山羊、猪、鸡、火鸡等家畜动物，赛马等竞技用动物，狗、猫等宠物等。
与CP2305株、CP2305s株同样地，由CP2305株或CP2305s株的其他衍生株也具有与母株同等以上的压力性肠紊乱的减轻作用、以及肠管中的水分过剩分泌的抑制作用，并且能够得到与前述株不同的属于加氏乳杆菌种的乳酸菌。这样的衍生株能够通过对母株照射紫外线、在变异原性物质的存在下培养母株、在最佳温度以外的温度下进行培养、在有机溶剂存在下进行培养等对于母株而言非一般的条件下放置母株而制作。作为变异原性物质，可列举出例如：3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶[4,3-b]吲哚(Trp-P-1)、2-氨基-6-甲基咪唑基-5H-吡啶[1,2-a-3’,2’-d]-咪唑(Glu-P-1)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑[4,5-f]喹啉(MeIQ)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4NQO)、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)等。目标的衍生株可以通过例如如下指标来选拔：(1)具有与加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)同等以上的压力性肠紊乱的减轻作用，例如具有压力性肠紊乱的减轻作用以腹泻评分计与前述株同等以上的压力性腹泻抑制作用；(2)在冰上保持5小时以上时的生存率为60％以上；(3)具有阻碍由压力导致的骨盆(副交感)神经活动的抑制的作用；(4)具有通过抑制大肠氯离子通道而抑制水分分泌的作用。本发明也涉及这样的具有(1)的特性、和(2)～(4)的任一特性的乳酸菌。
关于关联的公知加氏乳杆菌株，已知有具有炎症性肠病或肠易激综合征的预防·治疗效果的加氏乳杆菌SBT 2055株(FERM P-15535)(日本特开2003-95963号公报)。该菌是从日本人的肠分离·培养的乳酸菌，报告了在使用了DDS诱导溃疡性大肠炎模型的活菌的试验中，与对照组相比较，血便、便血被抑制。另外已知，改善肠内菌群而降低腹泻发病的加氏乳杆菌OLL2716株(FERM BP-6999)(日本特开2004-305128号公报)。该实施例中，记载了在仔牛的饲养期间腹泻的发生率(导入至试验牧场后2周以内腹泻的发生率)降低。但是，这些公知加氏乳杆菌株，如以下记载，是与CP2305株、其低温耐性衍生株的CP2305s株明显不同的株。
本发明的作为CP2305株的低温耐性株的CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的衍生株(例如低温耐性衍生株)的活菌体和杀菌体、以及该株的菌体处理物也意外地具有抑制从肠管的水分过剩分泌的作用且具有显著地抑制压力性腹泻的效果(参照图1和图2)。在将母株加氏乳杆菌CP2305株的杀菌发酵乳与公知的保藏加氏乳杆菌株、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、嗜热链球菌(S.thermophilus)和高加索奶粒乳杆菌(L.kefirgranum)的杀菌发酵乳进行比较时，该作用是格外显著的(图7)。从肠管的水分过剩分泌的抑制通过对CRF给予大鼠的结肠组织的基因表达进行详尽的分析，证明CP2305株抑制大肠氯离子通道而抑制水分的转移(参照图3)。对于该CP2305株，这次还通过对神经支配下部大肠的骨盆(副交感)神经的电运动进行测定而证明具有阻碍压力诱导性骨盆(副交感)神经活动的抑制的作用。通过CP2305株的给予，待检体的压力时的肠管功能恢复正常而被维持。因此，CP2305株具有显著地减轻压力性肠紊乱的腹泻症状这样特别的效果。上述的CP2305s株及其低温耐性株等衍生株另外也具有减轻压力性肠紊乱特别是压力性腹泻的作用效果。
本发明的加氏乳杆菌CP2305株、加氏乳杆菌CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株可以通过使用乳酸菌的培养中通常使用的培养基，在适当的条件下进行培养而调制。培养所使用的培养基只要是含有碳源、氮源、无机盐类等且能够有效地进行乳酸菌的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基的任一者；只要是本领域技术人员，则可以适宜选择适合于使用的菌株的公知的培养基。作为碳源，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、废糖蜜等。另外，作为氮源，可以使用酪蛋白的水解物、乳浆蛋白质水解物、大豆蛋白质水解物等有机含氮物。作为无机盐类，可以使用磷酸盐、钠、钾、镁等。作为适合于乳酸菌的培养的培养基，可列举出例如：MRS液体培养基、GAM培养基、BL培养基、BLB液体培养基(Briggs Liver Broth)、动物奶、脱脂奶、乳性乳清等。可以优选使用经灭菌的MRS培养基。
另外，本发明的CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株的培养在20℃～50℃、优选25℃～42℃、更优选约37℃下、厌氧的培养条件下进行。温度条件可以通过恒温槽、覆套式电阻加热器(mantle heater)、加热套等进行调节。此处，厌氧条件下是指菌能够增殖程度的低氧环境下；例如：通过使用厌氧腔室、厌氧箱或者加入了脱氧剂的密闭容器或袋等，或者简单地将培养容器密闭而制成厌氧条件。培养可以为静置培养、震荡培养、箱培养等任一培养方式。另外，培养时间可以设为3小时～100小时或其以上，优选设为约10小时～50小时。培养起始时的培养基的pH优选维持在3.5～8.0。
培养后，能够从培养液中得到通过过滤、离心分离等分离技术分离的活菌体、或者含有活菌体的培养液。另外，能够通过将这些活菌体或其培养液利用高压釜等施加公知的杀菌处理而得到杀菌体。另外，可以由活菌体或活菌体培养液制作菌体处理物，根据需要实施杀菌处理。
菌体处理物是通过对菌体实施干燥处理、破坏或破碎处理、发酵处理等物理的、化学的、生物学的处理等而得到的。因此，本发明中使用的菌体处理物的例子为干燥菌体、破坏菌体、破碎菌体、发酵处理物(例如、发酵乳)等。
干燥菌体可以通过对从上述培养液分离的菌体、根据需要实施杀菌处理的菌体再实施干燥处理而得到。作为干燥处理，可列举出例如：滚筒干燥、喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥等。
破坏菌体或破碎菌体可以对菌体通过破碎、磨碎、酶处理、化学处理、溶解等处理而得到。破坏菌体或破碎菌体由破坏或破碎的菌体的固体成分和可溶性成分的全部成为本质，例如，可以通过对破坏物或破碎物直接实施冷冻干燥而得到。破坏或破碎可以通过公知的手法例如物理的破碎、酶溶解处理、化学处理等而进行。物理的破碎可以通过湿式或干式的任一者进行，可以通过使用了均化器、球磨机、珠磨机、砂磨机、行星磨等的搅拌，使用喷气磨、法式压滤壶(French press)、细胞破碎机等而进行。酶溶解处理可以例如使用溶菌酶等酶，破坏菌的细胞结构而进行。化学处理可以使用甘油脂肪酸酯、大豆磷脂等表面活性剂破坏菌的细胞结构来进行。优选为物理的破碎。
用于调制破碎物的具体的方法包括例如：将菌的悬浊液在公知的砂磨细胞破碎机(DYNO-MILL破碎装置(Shinmaru Enterprises Corporation.(日本国、大阪、堺))等)中，使用玻璃珠，以圆周速度10.0～20.0m/s(例如约14.0m/s)、处理流速0.1～10L/10分钟(例如约1L/10分钟)、破碎槽温度10～30℃(例如约15℃)进行1～7次(例如3～5次)处理，对菌体进行破碎。另外，例如可以将菌的悬浊液在公知的湿式喷气磨细胞破碎机(JN20 Nano Jet Pul(常光(日本国、神奈川、川崎))等)中，以排出压力50～1000Mpa(例如270MPa)、处理流速50～1000(例如300ml/分钟)，进行1～30次(例如10次)处理，对菌体进行破碎。另外，也可以在公知的干式行星磨细胞破碎机中，使菌体粉末在各种珠(例如氧化锆制10mm珠、氧化锆制5mm珠、氧化铝制1mm珠)共存下，以转速50～10000rpm(例如240rpm、190rpm)进行30分钟～20小时(例如5小时)处理，对菌体进行破碎。也可以将菌体粉末在公知的干式喷气磨细胞破碎机(Nano JetMizer等)中，以供给速度0.01～10000g/分钟(例如0.5g/分钟)、排出压力1～1000kg/cm2(例如6kg/cm2)的压力进行多次处理，对菌体进行破碎。
发酵乳可以通过在生牛奶、脱脂乳粉或豆奶等中接种菌株，在乳酸菌发酵条件下进行发酵而得到。对于得到的发酵产物，可以根据需要实施过滤、稀释、浓缩等处理。
上述的菌体和菌体处理物可以直接使用或者实施杀菌处理而制成杀菌体。杀菌处理包括例如：利用高能量射线照射的杀菌、加热杀菌、加压杀菌、高压釜杀菌等公知的处理。优选的杀菌法为高压釜杀菌。该方法包括：在高压釜(高压蒸汽灭菌器)内将活菌或含有活菌的培养液在例如约10分钟～1小时、加压水蒸汽下、例如110℃～140℃的温度下进行杀菌。
由于上述的特性，本发明的CP2305株、CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株、或者其菌体处理物作为如下记载的肠管内的水分过剩分泌、压力性肠紊乱、压力性腹泻、肠易激综合征、腹泻型肠易激综合征或者炎症性肠病的减轻剂是有用的。
说明书中“压力性腹泻”是指暴露于分泌脑内压力荷尔蒙这样的压力的状况下，即，伴随着起因于压力的肠管中的水分过剩分泌的症状，有伴随着腹痛的情况和不伴随腹痛的情况。
说明书中“压力性腹痛”是指暴露于分泌脑内压力荷尔蒙这样的压力的状况下，即，起因于压力的肠管中产生的腹痛。
因此，特别是，在相对于健康人的起因于压力的压力性的症状这一点，说明书中，“压力性腹泻”和“压力性腹痛”区别于肠易激综合征(IBS)的患者。
说明书中，将“压力性腹泻”和“压力性腹痛”合起来称为“压力性肠紊乱”。
因此，说明书中，“压力性肠紊乱的腹泻症状”是指压力性腹泻的症状。
说明书中“肠管的水分过剩分泌”与是否起因于压力无关，是指肠管中的水分过剩分泌。
说明书中“肠易激综合征”是指肠易激综合征在肠的粘膜没有炎症、息肉·肿瘤等(称为器质性病变)，只是肠的活动变得过强而导致腹痛、通便异常(特别是腹泻、便秘·腹泻的重复交替型)等症状表现的疾病。特别是，腹泻型肠易激综合征由于大肠的知觉过敏而在肠内容物通过时引起过敏的反应，促进排出的收缩运动被过剩地诱导，腹泻症状频发且伴随有慢性的腹痛，苦于由压力导致的持续的不安而精神疾病的并发率提高。诊断标准为RomeIII所规定，与压力环境的有无无关且QOL低的患者。
说明书中，“炎症性肠病”是指主要在消化管引起原因不明的炎症的慢性疾病的总称，主要包括溃疡性大肠炎、克罗恩(氏)病这2种疾病。由于压力而恶化，伴随有腹泻症状。
本发明的减轻剂(或抑制剂)，对于包含CP2305株、CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等的衍生株、其菌体处理物、或者它们的混合物的有效成分，不限定于以下的含量，每份该减轻剂含有例如约0.1重量％～100重量％、优选含有约10重量％～约90重量％。
上述减轻剂(或抑制剂)除了上述有效成分之外可以包含：赋形剂、稀释剂或载体、根据需要的其他添加物。其形态可以为固体形态或液体形态的任一者。固体形态为例如粉末、颗粒、片、小丸等任意的形状。另外，液体形态为例如悬浊液、乳浊液、发酵液(例如发酵乳)等形状。
赋形剂、稀释剂或载体为以下所述的食品、动物饲料或药品中通常使用的物质。其他的添加物不一定必要，然而添加时，可列举出以下记载的例如：防腐剂、pH调节剂、乳化剂、抗氧化剂、着色剂等。
＜食品或动物饲料＞
本发明进一步提供含有上述的加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物、或它们的混合物、或者上述减轻剂(或抑制剂)的食品添加剂或动物饲料添加剂。
上述减轻剂(或抑制剂)除了有效成分之外包含赋形剂、稀释剂或载体、及其他的添加物的情况下，可以作为食品添加剂或动物饲料添加剂而使用。这些食品添加剂或动物饲料添加剂可以为固体形态或液体形态的任一者。固体形态为例如粉末、颗粒、片、小丸、凝胶、胶囊等任意的形状。另外，液体形态为例如悬浊液、乳浊液、发酵液(例如发酵乳)等形状。赋形剂、稀释剂或载体为食品或动物饲料中通常使用的物质；另外，其他的添加物可列举出例如：防腐剂、pH调节剂、乳化剂、着色剂、营养辅助剂、(天然或人工)甜味剂、调味料、香料等。
食品添加剂或动物饲料添加剂可以不限定于以下的含量而以每份添加剂含有例如约1重量％～约50重量％、优选为约5重量％～约20重量％上述减轻剂。
食品添加剂或动物饲料添加剂可以向食品或动物饲料中添加，用于减轻待检体的肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或者炎症性肠病而使用。
本发明进一步提供动物饲料的制造方法，其包括：包含上述的减轻剂(或抑制剂)的动物饲料或者将上述的减轻剂(或抑制剂)与动物饲料成分配混，从而制造具有减轻待检体的肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或炎症性肠病的效果的动物饲料。
即，向用于制造动物饲料的饲料成分中，配混有效量的本发明的减轻剂，根据需要制剂化成任意的剂型，从而制造动物饲料。
本发明进一步提供功能性饮食品的制造方法，其包括：将包含上述的加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITEBP-1405)、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物、或它们的混合物、或者上述的减轻剂的饮食品、功能性饮食品，或者将上述的减轻剂与食品用载体、赋形剂或稀释剂混合，根据情况进一步混合食品添加物，从而制造具有减轻待检体的肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或炎症性肠病的效果的功能性饮食品。
动物饲料或功能性饮食品中，对于上述减轻剂的配混量，本领域技术人员可以考虑饲料、饮食品的形态、所追求的效果(即，抑制待检体的肠管中的水分过剩分泌、压力性肠紊乱、压力性腹泻等)而适宜决定。动物饲料或者功能性饮食品中的CP2305株、CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株的、杀菌体或者活菌体和/或菌体处理物的总量不限定于以下，对于该菌的活菌量，相当于105～1014cfu/g，优选为106～约1013cfu/g，更优选为107～1012cfu/g的量，或者，该菌的量为例如0.001重量％～10重量％、优选为0.01～5重量％的量。对于该有效量，本领域技术人员可以根据添加量与腹泻症状的减轻效果的关系而适宜设定。
动物饲料的剂型在为固体形态时包括例如粉末、颗粒、片、小丸等任意的形状；另外，为液体形态时，为例如悬浊液、发酵乳等形状。
功能性食品的剂型在为固体形态时包括例如粉末、颗粒、片、小丸、凝胶、胶囊等任意的形状；另外，为液体形态时，为例如悬浊液、乳浊液、发酵乳等形状。
上述的剂型中，片、小丸和胶囊根据需要可以用肠溶性物质单层或多层地涂覆以成为肠溶性。肠溶性物质为在胃液等酸性区域的pH下不溶解，在中性区域的pH下溶解的物质，可列举出例如：羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯、虫胶、玉米醇溶蛋白、乳铁蛋白、羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素醋酸琥珀酸酯、羧甲基乙基纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素等。
赋形剂、稀释剂或载体不限定于以下的物质，可列举出：水、乳发酵液、碳酸水、乙醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、水溶性糊精、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素、淀粉、果胶、黄原胶、***胶、酪蛋白、明胶、琼脂、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、甘露醇、山梨糖醇、乳糖等。
在动物饲料或功能性饮食品的制造中，可以使用饲料或饮食品通常使用的各种添加物。对于添加物，不限定于以下的物质，可列举出：着色剂(植物色素、合成色素等)、香料(天然香料等)、甜味剂(甜叶菊、阿巴斯甜等)、防腐剂(醋酸钠、山梨酸等)、乳化剂(软骨素硫酸钠、丙二醇脂肪酸酯等)、抗氧化剂(EDTA二钠、维生素C等)、pH调节剂(柠檬酸等)、化学调味料(肌苷酸钠、谷氨酸钠等)、增稠剂(黄原胶等)、膨胀剂(碳酸钙等)、消泡剂(磷酸钙)、粘结剂(多磷酸钠等)、营养强化剂(钙强化剂、维生素A等)等。其他地，可以配混各种营养素、各种维生素、矿物质、食物纤维、酸味剂、稳定剂、香料、天然物提取物等。配混量为发挥作为添加物的效果的量，能够适宜选择。
＜药物组合物＞
本发明进一步提供用于预防、减轻或抑制、或者治疗压力性肠紊乱的药物组合物，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
或者，本发明提供包含上述的减轻剂(或抑制剂)、药学上能够允许的载体、赋形剂或稀释剂的用于预防、减轻或抑制、或者治疗待检体的压力性肠紊乱特别是水分过剩分泌、压力性腹泻的药物组合物。
在任一药物组合物中，本发明的有效成分均具有抑制压力性肠紊乱、特别是水分过剩分泌、压力性腹泻的效果。
CP2305株、CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株(以上，活菌体或杀菌体)、或者其菌体处理物如上述，具有阻碍压力诱导性骨盆(副交感)神经抑制的作用即具有将由抗压力导致的肠管运动维持正常的作用，以及具有通过抑制大肠氯离子通道来抑制肠管中的水分过剩分泌的作用，抑制、减轻或改善压力性腹泻。压力对压力带来过敏的肠紊乱并使该紊乱的症状恶化。本发明的CP2305株、CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等的衍生株、(以上，为活菌体或杀菌体)、或者其菌体处理物由于抑制压力性肠紊乱、特别是压力性肠紊乱的频发的腹泻症状，所以对于压力性肠紊乱的预防、减轻或抑制、或者治疗是有效的。可以确认，该效果与市售的任一种加氏乳杆菌株制剂相比较均高。
药物组合物只要能够发挥出上述效果则能够制剂化成任一剂型。例如：片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、粉剂、糖浆剂、干糖浆剂、液剂、悬浊剂、乳浊剂、发酵乳剂等，优选为经口制剂、栓剂等，特别优选为经口制剂。
可以根据剂型向本发明的有效成分中配混药学上允许的通常使用的赋形剂、载体、稀释剂、崩解剂、粘结剂、润湿剂、稳定剂、缓冲剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、酸味剂、着色剂等添加物，按照常规方法而制造。这些物质的例子为上述的物质。
药物组合物中的上述CP2305株、CP2305s株、或者由CP2305株或CP2305s株的低温耐性衍生株等衍生株、和/或菌体处理物的总量不限定于以下的量，作为该菌的活菌量，相当于为105～1012cfu/g、优选为106～约1012cfu/g，更优选为107～1012cfu/g的量；或者，作为该菌的量，例如为0.001重量％～10重量％，优选为0.01～5重量％的量。对于该有效量，本领域技术人员可以基于添加量与腹泻症状的减轻效果的关系而适宜设定。
优选的给药法为口服给药或栓剂给药。
本发明的药物组合物对于肠管中的水分过剩分泌、压力性肠紊乱、肠易激综合征或炎症性肠病的预防、压力时的腹泻症状的恶化的预防、减轻或治疗是有效的。
实施例
以下，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明的范围不受这些实施例的限定。
[实施例1]
＜低温耐性株的育种＞
向在内径15mm的聚丙烯(polypropylene)制的容量15ml的试管中加入的10ml的培养液(食品添加剂培养基)中接种加氏乳杆菌CP2305株(菌数103个～104个)，在37℃下进行19小时培养。
19小时的培养后，将该内径15mm的聚丙烯制的容量15ml的试管***至为试管内的液面以上的充分量的冰中，(冰上)快速冷却并保持5小时。将该培养和冷却重复80次，育种出低温耐性高的株。
本说明书中，“冰上”是指在内径15mm的聚丙烯制的容量15ml的试管内加入10ml的培养液，在为试管内的液面以上的充分量的冰中***试管而进行冷却的状态。
需要说明的是，本说明书中使用的“食品添加剂培养基”的组成如下述(表1)。
[表1]
食品添加剂培养基的组成
组成 含量(g/l)
酪蛋白蛋白胨+(Casein Pepton PLUS)(Organotechie公司制) 10
Bacterion-KS(Maruha Nichiro Foods，Inc.制) 10
HF-55(群荣化学工业公司制) 30
醋酸钠(结晶)(日本合成化学公司制)(CH3COONa·3H2O) 5
磷酸氢二钾(无水)(太平洋化学产业公司制) 4.5
硫酸镁(7水合物)(富田制药公司制) 1
酵母提取物(Ohly公司 酵母＝KAT) 5
Sunsoft Q-17S(太阳化学工业公司制) 1
＜低温耐性株的评价＞
对于本发明的低温耐性株的评价中的上述低温耐性株的生存性的评价，如下述的式子，用暴露于低温前后的活菌率(本说明书中也称为“生存率”。)进行评价。具体而言，将评价对象株(菌数103个～104个)接种至在内径15mm的聚丙烯制的容量15ml的试管中加入的10ml的培养液(食品添加剂培养基)中，在37℃下进行19小时培养。19小时的培养后，将该内径15mm的聚丙烯制的容量15ml的试管，***至为试管内的液面以上的充分量的冰中(冰上)进行快速冷却，在冰上保持5小时之后，将快速冷却前(低温暴露前)的活菌数与在冰上保持5小时后(暴露于低温后)的活菌数进行比较，用下述式对活菌率进行评价。
优选活菌率表现出至少60％以上，优选65％以上，进而优选70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的活菌率(参照下述式)的株。
活菌率(％)＝暴露于低温后的活菌数/暴露于低温前的活菌数×100
对于上述活菌数的计数方法，将培养液涂抹至MRS琼脂培养基或附有BCP的平板计数琼脂培养基，在37℃微好氧下进行48小时培养，计数菌落并测定活菌数，从而进行评价。
通过上述育种和评价，得到了表现出60％以上的活菌率的CP2305s株等的多种耐性株(图1)。
[实施例2]
＜低温耐性株的制造方法＞
需要说明的是，作为低温耐性株的制造方法，例如：CP2305株在10℃以下表现出生存率降低的倾向。因此，作为低温耐性株的制造方法，将对象株在培养液(例:食品添加剂培养基)中、适度的培养温度(例:37℃左右)、适度的培养时间(例:19小时左右)下进行培养，之后，将培养液在10℃以下，优选为7℃以下，更优选为5℃以下，进而优选为3℃以下、2℃以下、1℃以下的温度下暴露适度的时间(例：5小时)，另外，根据需要，重复进行它们的培养、暴露于低温，由此制造在目标温度的低温下具有耐性的株。
[实施例3]
将SD雄大鼠(4周龄、Charles River Laboratories制)在每12小时的明暗周期下(8点开始点灯12小时)下饲育1周后，使之如下自由摄取3周试验菌体配混饵。
a)饵使用Oriental Yeast Co.,ltd.的CRF-1粉末饵。
b)相对于上述饵(CRF-1)25g配混包含有菌数2.0×1010个的试验菌体的冷冻干燥粉末(相对于饵CRF-1：25g配混冷冻干燥粉末0.25g)，作为试验菌体配混饵。
c)使之自由摄取3周试验菌体配混饵。
d)该试验的菌体摄食量被推定为大约2.0×1010个/天。
e)使各组19只摄取。
3周后，将CRF(Corticotropin Releasing Factor，Anaspec制、USA)溶液以125μg/kg进行腹腔内给药，使之诱导压力性腹泻，将CRF给药后的100分钟的粪便状况，按照以下记载的腹泻评分进行评价，从而对试验菌体的压力性腹泻抑制进行评价。
腹泻评分的定义如下。
(a)每隔10分钟采集CRF给药后100分钟的粪便10次。
(b)将各次采集的粪便的重量以g单位计进行测定(各次的粪便重量(i值))。例如，某次的粪便重量为0.4g时，i值＝0.4。
(c)对于各次采集的粪便，由粪便的水分状况和形状，根据图5所示的粪便评分标准，以各次的粪便评分进行数值化(各次的粪便评分(ii值))
(d)求出各次的粪便重量(i值)×各次的粪便评分(ii值)。
(e)将各次求出的、粪便重量(i值)×粪便评分(ii值)的10次的总和定义为“腹泻评分”。
(f)由此，对于CRF给药后100分钟的粪便状况，包括安慰剂(只有CRF-1)进行评价(通过Dunnet的多重比较进行评价)。
结果，本发明的加氏乳杆菌CP2305株的活菌体和杀菌体与安慰剂(只有CRF-1)相比较，显著地抑制了压力性腹泻(图2)。
[实施例4]
基于上述实验和所定义的腹泻评分，确认了下述的效果。
结果，加氏乳杆菌CP2305s株(杀菌体)与安慰剂(只有CRF-1)相比较，显著地抑制了压力性腹泻(图2)。腹泻抑制效果与CP2305株(活菌体和杀菌体)相比较，具有同等的效果。
由上述实施例3的结果证明，乳酸菌得到了实施例3中的腹泻评分中11以下的乳酸菌。腹泻评分优选为10以下，进而优选为9以下。
进而，由实施例3的结果证明，得到了腹泻评分中相对于安慰剂的腹泻评分的降低比率为90％以下的乳酸菌。腹泻评分的降低比率优选为85％以下，更优选为80％以下(腹泻评分降低比率＝评价对象株腹泻评分/安慰剂腹泻评分×100)。
[实施例5]
作为比较对象的保藏菌株A菌体(L.gassei)的结果为给予了与CP2305株相同菌数的结果。另外，市售活菌制剂B(L.acidphilus)的结果是将人1天摄取用量的重量，以大鼠的体重换算，以与每单位体重等量进行给予的结果(图6)。由本结果证明，CP2305株比现有的被视为具有腹泻抑制作用的市售活菌剂等更加具有抑制压力性腹泻的作用；由于CP2305s株也具有与CP2305株同样的压力性腹泻的抑制效果，所以能够证明CP2305s株的优异性。
[实施例6]
进一步，另外在CRF给药4小时后实施解剖，对于结肠组织用ISOGEN(NIPPON GENE CO.,LTD.)和RNeasy Mini Kit(Qiagen,USA)提取总RNA之后，对于基因表达用大鼠全基因组3版(Rat whole genome ver.3)(G4847B,Agilent,USA)详细地进行分析。结果确认，在CP2305株给药组中抑制了在安慰剂组中CRF给药后增加的氯离子通道关联基因(图3)。因此可以认为，CP2305株抑制氯离子通道且控制了水分的移动；另外，可以认为具有同样的腹泻抑制效果的CP2305s株也抑制氯离子通道且控制了水分的移动。
[实施例7]
将SD系雄大鼠(4周龄、株式会社纪和动物制)在每12小时的明暗周期下(8点开始点灯12小时)进行1周饲育后，使之自由摄取CP2305株配混饵或未配混对照粉饵3周。实验当天使大鼠断食3小时之后，用乌拉坦麻醉，在颈静脉***静脉给药用的插管，之后，用银电极吊起神经支配下部大肠的骨盆(副交感)神经，测定其电活动。在测定值稳定的时期，颈静脉给予CRF溶液(1μg/kg)并电生理学地测定骨盆神经的电活动(PNA)的变化。对于数据，以每5分钟每5秒的放电频率的平均值进行分析，以刚颈静脉给药之前的值(0分钟值)作为100％，用百分率表示。结果确认，通过给予压力荷尔蒙(CRF)，抑制了神经支配大鼠大肠的骨盆(副交感)神经活动。进而确认，CP2305株的给予阻碍压力诱导的骨盆(副交感)神经抑制(图4)。因此可以认为，通过CP2305株的给予压力时的肠管功能保持正常，另外，具有同样的腹泻抑制效果的CP2305s株也具有同样的效果。
[实施例8]
将SD大鼠(体重380～400g、日本SLC公司制)麻醉后，断头、放血屠宰后，按照解剖学的标准摘出远端结肠(distal colon)，在立体显微镜下将环肌和纵肌层剥离，制作包含粘膜下神经丛的粘膜-粘膜下神经丛标本。将标本安装在测定面积0.64cm2的Ussing chamber(CHM2,WPI,FL,USA)，测定标本的粘膜侧-浆膜侧间产生的电位差和短路电路short-circuit current(ISC)。对组织在1分钟施加3秒10mV的指令脉冲，由短路电流的变化量求出膜电导系数(Gt)。在基线(basel)ISC和Gt稳定是，对于粘膜下神经进行电刺激(25V,持续0.5ms(duration of 0.5ms),5Hz,120s)，确认组织的状态。之后，向粘膜侧给予试验乳酸菌的菌体或发酵乳的稀释溶液(500μg/ml)，测定ISC和Gt的变化，评价试验物质对于由神经刺激诱导产生的Cl-/HCO3 -分泌的影响。
对于各种乳酸菌的杀菌发酵乳的影响进行评价的结果显示，CP2305株的杀菌发酵乳与公知保藏菌株A(L.gasseri)及其他的5菌株(B～F)相比，更强地抑制离子分泌，控制水分分泌，有助于腹泻抑制(图7)。
[实施例9]
进而，为了进行只有菌体对大鼠大肠(远端结肠)的神经刺激诱导的离子运输带来的影响，调制各种乳酸菌的杀菌体，进行给予的结果，CP2305株杀菌体与公知保藏菌株A(加氏乳杆菌(L.gasseri))杀菌体和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)杀菌体相比较，显著地抑制离子分泌，较强地有助于腹泻抑制(图8)。
进而另外，为了调查CP2305株的活菌体、活菌发酵乳、杀菌体、杀菌发酵乳的给予对于大鼠大肠(远端结肠)的神经刺激诱导的离子运输带来的影响，结果显示其所有的形态中，特别是CP2305株杀菌体较强地有助于腹泻抑制(图9)。
产业上的可利用性
本发明的加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由CP2305株或CP2305s株的衍生株(例如低温耐性衍生株)、其菌体处理物、或者其混合物能够阻碍压力诱导性骨盆(副交感)神经活动的抑制并使肠运动保持正常，抑制、减轻或改善待检体的压力性肠紊乱、特别是该紊乱的压力性腹泻症状。

Claims (34)

1.一种肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或者炎症性肠病的减轻剂，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株(NITE BP-1405)衍生的衍生株、它们的菌体处理物、或它们的混合物作为有效成分。
2.一种肠管中的水分过剩分泌或者压力性腹泻的减轻剂，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、其菌体处理物或者它们的混合物作为有效成分。
3.一种肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻或压力性肠紊乱的减轻剂，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)的杀菌体、其菌体处理物或者它们的混合物作为有效成分。
4.根据权利要求1或2所述的减轻剂，其中，所述CP2305株、所述CP2305s株、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株(NITEBP-1405)衍生的衍生株为活菌体或杀菌体。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的减轻剂，其中，所述菌体处理物为干燥菌体、破坏菌体、破碎菌体或发酵乳。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的减轻剂，其具有阻碍由压力导致的骨盆(副交感)神经活动的抑制的作用。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的减轻剂，其具有通过抑制大肠氯离子通道而抑制水分分泌的作用。
8.根据权利要求1～7的任一项所述的减轻剂，其为压力性腹泻的改善剂。
9.一种动物饲料的制造方法，其包括将权利要求1～8的任一项所述的减轻剂与动物饲料成分配混而制造动物饲料的工序。
10.一种动物饲料，其含有加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株(NITE BP-1405)衍生的衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物或者它们的混合物。
11.一种食品添加剂或动物饲料添加剂，其含有权利要求1～10的任一项所述的减轻剂。
12.一种食品添加物，其含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)、加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERMBP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物或者它们的混合物。
13.一种饮食品，其含有加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株的活菌体或杀菌体、它们的菌体处理物或者它们的混合物。
14.根据权利要求13所述的饮食品，其为功能性饮食品。
15.一种功能性饮食品的制造方法，其包括：将权利要求1～8的任一项所述的减轻剂与食品用的载体、赋形剂或稀释剂混合，根据情况进一步混合食品添加剂，从而制造功能性饮食品。
16.一种药物组合物，其用于预防、减轻或抑制、或者治疗肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或炎症性肠病，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株的活菌体或者杀菌体、它们的菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
17.一种药物组合物，其用于预防、减轻或抑制、或者治疗肠管中的水分过剩分泌或压力性腹泻，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERMBP-11331)、其菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
18.一种药物组合物，其用于预防、减轻或抑制、或者治疗肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱，其特征在于，含有加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)的杀菌体、其菌体处理物、或者它们的混合物作为有效成分。
19.一种药物组合物，其用于预防、减轻或抑制、或者治疗肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征或者炎症性肠病，其包含权利要求1～8的任一项所述的减轻剂，以及药学上能够允许的载体、赋形剂或稀释剂。
20.一种乳酸菌，其具有与加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)同等以上的压力性肠紊乱的减轻作用，并且与CP2305株不同。
21.根据权利要求20所述的乳酸菌，其中，所述压力性肠紊乱的减轻作用以说明书的实施例3所述的腹泻评分计，具有与加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)同等以上的压力性腹泻抑制作用。
22.一种乳酸菌，通过说明书的实施例3所述的方法对腹泻评分进行评价时，与安慰剂比较，显著地(与安慰剂比较p<0.05)抑制压力性腹泻并且与CP2305株(FERM BP-11331)不同。
23.根据权利要求20～22的任一项所述的乳酸菌，其具有在冰上保持5小时时的生存率为60％以上的低温耐性。
24.根据权利要求20～23的任一项所述的乳酸菌，其具有阻碍由压力导致的骨盆(副交感)神经活动的抑制的作用。
25.根据权利要求19～24的任一项所述的乳酸菌，其具有通过抑制大肠氯离子通道而抑制水分分泌的作用。
26.根据权利要求20～25的任一项所述的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌为属于加氏乳杆菌种的乳酸菌。
27.根据权利要求20～26的任一项所述的乳酸菌，其中，所述乳酸菌为加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、加氏乳杆菌CP2305株(FERMBP-11331)的衍生株或加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)的衍生株。
28.根据权利要求20～27的任一项所述的乳酸菌，其用于预防或减轻肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征、腹泻型肠易激综合征或者炎症性肠病。
29.一种乳酸菌低温耐性株的制造方法，其包括：将乳酸菌暴露于10℃以下的温度，选拔生存的低温耐性株，进行育种，根据需要重复该操作，以及对生存的低温耐性株进行回收。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，乳酸菌为属于加氏乳杆菌种的乳酸菌、或者加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)。
31.一种乳酸菌，其包含加氏乳杆菌CP2305s株(NITE BP-1405)、或者由加氏乳杆菌CP2305株(FERM BP-11331)或CP2305s株衍生的衍生株。
32.一种乳酸菌，其具有在冰上保持5小时时的生存率为60％以上的低温耐性。
33.根据权利要求32所述的乳酸菌，其特征在于，所述乳酸菌为属于加氏乳杆菌种的乳酸菌。
34.一种肠管中的水分过剩分泌、压力性腹泻、压力性肠紊乱、肠易激综合征、腹泻型肠易激综合征或者炎症性肠病的预防或减轻剂，其特征在于，含有权利要求20～27和31～33的任一项所述的乳酸菌作为有效成分。
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