JP2018185220A - 分析装置及び分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】エクソソームに対して複数種の検出対象抗原を簡便で短時間に識別できる分析装置を提供する。
【解決手段】分析装置１はレーザ光源２と光検出器１３と蛍光検出器１４，１５と検出信号生成回路２０とを備える。レーザ光源２は蛍光微粒子１２０が結合された抗原２０３または蛍光微粒子１３０が結合された抗原２０４を有するエクソソーム２００が捕捉されている試料分析用ディスク１００にレーザ光Ｌ１を照射する。光検出器１３は試料分析用ディスク１００により反射されたレーザ光を検出光Ｌ２として検出する。蛍光検出器１４は蛍光微粒子１２０の蛍光ＦＬ１を検出する。蛍光検出器１５は蛍光微粒子１３０の蛍光ＦＬ２を検出する。検出信号生成回路２０は検出光Ｌ２に基づいてゲート信号ＧＳを生成し、ゲート信号ＧＳに基づいて蛍光ＦＬ１，ＦＬ２から蛍光検出信号ＦＳ１，ＦＳ２を生成する。
【選択図】図７

Description

本発明は、抗原、抗体等の生体物質を分析するための分析装置及び分析方法に関する。

疾病と関連付けられている特定の抗原をバイオマーカーとして検出し、分析することにより、疾病の発見及び治療の効果等を定量的に分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。

特許文献１には、試料分析用ディスク上に固定された抗体と試料中の抗原とを結合させ、抗体を有する微粒子によって抗原を標識し、光ピックアップから照射されるレーザ光を走査することにより、試料分析用ディスク上に捕捉された微粒子を検出する分析装置が記載されている。特許文献１に記載されている分析装置は、光ディスク装置を検体検出用に利用したものである。

特開２０１５−１２７６９１号公報

近年、エクソソーム（exosome）と称されている微小な膜小胞が新たなバイオマーカーとして期待されている。一般的に、エクソソームは、種類の異なる複数の抗原を含んでいる。その中で、検出対象となる抗原は、脂質二重膜の表面に存在するたんぱく質であり、例えば、膜貫通型たんぱく質、接着分子、膜輸送たんぱく質、膜融合たんぱく質、糖たんぱく質等である。以下、検出対象となるたんぱく質を検出対象抗原と称する。

エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を識別することができれば、エクソソームの選択的な検出が可能になる。そのため、検出の疾患特異性を高めることができ、診断の精度及び確度を向上させることが期待できる。

しかしながら、従来は、エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を識別するためには、異なる抗体が固定された微粒子を用いて複数回の測定を実施しなければならない。このため、測定時間が長くなり、速やかに診断を行うことが困難であった。

本発明は、エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を、従来よりも簡便で短時間に識別することができる分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。

本発明は、第１の蛍光微粒子が結合された第１の抗原または第２の蛍光微粒子が結合された第２の抗原を有するエクソソームが捕捉されている試料分析用ディスクにレーザ光を照射するレーザ光源と、前記試料分析用ディスクにより反射されたレーザ光を検出光として検出する光検出器と、前記レーザ光が照射されることにより前記第１の蛍光微粒子から発光される第１の蛍光を検出する第１の蛍光検出部と、前記レーザ光が照射されることにより前記第２の蛍光微粒子から発光される第２の蛍光を検出する第２の蛍光検出部と、前記検出光に基づいてゲート信号を生成し、前記ゲート信号に基づいて前記第１の蛍光から第１の蛍光検出信号を生成し、前記ゲート信号に基づいて前記第２の蛍光から第２の蛍光検出信号を生成する検出信号生成回路とを備えることを特徴とする分析装置を提供する。

本発明は、第１の蛍光微粒子が結合された第１の抗原または第２の蛍光微粒子が結合された第２の抗原を有するエクソソームが捕捉されている試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、前記試料分析用ディスクにより反射されたレーザ光を検出光として検出し、前記レーザ光が照射されることにより前記第１の蛍光微粒子から発光される第１の蛍光、または、前記レーザ光が照射されることにより前記第２の蛍光微粒子から発光される第２の蛍光を検出し、前記検出光に基づいてゲート信号を生成し、前記ゲート信号に基づいて前記第１の蛍光から第１の蛍光検出信号を生成し、前記ゲート信号に基づいて前記第２の蛍光から第２の蛍光検出信号を生成することを特徴とする分析方法を提供する。

本発明の分析装置及び分析方法によれば、エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を、従来よりも簡便で短時間に識別することができる。

試料分析用ディスクのトラック領域の断面図である。 試料分析用ディスク上にエクソソームと複数の種類の蛍光微粒子とを捕捉する方法を説明するためのフローチャートである。 エクソソームの模式的な断面図である。 エクソソームが試料分析用ディスクのトラック領域上に捕捉されている状態を模式的に示す断面図である。 蛍光微粒子の模式的な断面図である。 蛍光微粒子が試料分析用ディスクのトラック領域上に捕捉されている状態を模式的に示す断面図である。 第１実施形態の分析装置を示すブロック図である。 第１実施形態の分析装置における検出信号生成回路の動作を説明するためのタイムチャートである。 実施例及び比較例のバックグラウンドノイズのスペクトルを示す図である。 第２実施形態の分析装置を示すブロック図である。 第２実施形態の分析装置における検出信号生成回路の動作を説明するためのタイムチャートである。 第３実施形態の分析装置を示すブロック図である。 第４実施形態の分析装置を示すブロック図である。

［エクソソーム及び蛍光微粒子の捕捉方法］
図１〜図６を用いて、試料分析用ディスク上にエクソソームと複数の種類の蛍光微粒子とを捕捉する方法の一例を説明する。図１は試料分析用ディスク１００の断面を示している。

図１に示すように、試料分析用ディスク１００の表面には、凸部１０１と凹部１０２とが半径方向に交互に配置されたトラック領域１０３が形成されている。凸部１０１及び凹部１０２は、内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。試料分析用ディスク１００は、例えばブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等または類似する円板形状を有する。

試料分析用ディスク１００は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂またはシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、試料分析用ディスク１００は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態または所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。

試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３における凸部１０１は光ディスクのランドに相当し、凹部１０２はグルーブに相当する。凹部１０２の半径方向のピッチに相当するトラックピッチは例えば３２０ｎｍである。

図３に示すように、エクソソーム２００は脂質二重膜２０１で覆われている。脂質二重膜２０１には、膜貫通型たんぱく質、膜表在性たんぱく質、膜結合性たんぱく質等の複数の種類の膜たんぱく質が表面分子として存在する。これらの膜たんぱく質の種類、個数、または脂質二重膜２０１における位置は、エクソソームの種類によって異なり、個体によっても異なる。エクソソームはこれらの表面分子を抗原とする抗原抗体反応により認識される。

抗原である表面分子として、ＣＤ９，ＣＤ８１，ＣＤ６３，ＨＥＲ２，ＣＤ１４７，ＥｐＣＡＭ，Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１等の他、様々なたんぱく質等の分子の存在が多くの論文で報告されている。なお、図３では、エクソソームを識別するための３種類のたんぱく質（検出対象抗原）を抗原２０３（第１の抗原）、抗原２０４（第２の抗原）、及び抗原２０２（第３の抗原）として図示している。抗原２０２は、例えば多くのエクソソームに存在するＣＤ９たんぱく質である。抗原２０３及び抗原２０４は、疾患との関連性が期待されるＨＥＲ２たんぱく質及びＣＤ１４７たんぱく質である。

エクソソーム２００の平均粒子径は約１００ｎｍである。エクソソーム２００の平均粒子径とは、エクソソーム２００の粒子径を任意の測定方法で測定した値の平均値を意味する。測定方法としては、例えばナノ粒子トラッキング法を用いた、エクソソーム２００が溶液中にある状態で観測する湿式の測定方法、または透過型電子顕微鏡でエクソソーム２００の形態を保ったまま観測する乾式の測定方法等がある。

図２のフローチャート及び図４を用いて、エクソソームの検出手順の一例を説明する。オペレータは、図２に示すフローチャートのステップＳ１にて、試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上にカートリッジを装着してウェルを形成する。具体的には、カートリッジの複数の貫通孔と試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３とによって複数のウェルが形成される。ウェルは、試料液及び緩衝液等の溶液を溜めるための容器として機能する。

オペレータは、ステップＳ２にて、エクソソームを捕捉するための抗体１１１（捕捉抗体）を含む緩衝液をウェルに注入する。緩衝液は適切な温度で適切な時間インキュベートされる。例えば、室温で一晩反応させることで充分な量の抗体１１１を試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上に固定することができる。

オペレータは、抗体１１１を含む緩衝液が注入されたウェルを、適切な時間、適切な温度でインキュベートさせる。緩衝液は炭酸緩衝液等が好適である。これにより、図４（ａ）に示すように、抗体１１１は、ウェルの底面を構成する試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上に固定される。抗体１１１は、ＣＤ９たんぱく質と特異的に結合する抗ＣＤ９抗体である。オペレータは、ウェルから固定されかなった残余の抗体１１１を含む緩衝液を排出し、ウェルを抗体を含まない別の緩衝液で洗浄する。トラック領域１０３に固定されなかった抗体１１１はこの洗浄によって除去される。

オペレータは、ステップＳ３にて、抗原２０２，２０３，２０４が存在しないエクソソームがトラック領域１０３上に非特異的に吸着することを防ぐため、トラック領域１０３をブロッキング処理する。具体的には、オペレータは、リン酸緩衝液等の緩衝液で希釈されたスキムミルクをウェルに注入し、ウェルを適切な時間、振盪させる。スキムミルクは、試料分析用ディスク１００またはウェルの表面を覆ったり、試料分析用ディスク１００またはウェルの表面に固定された抗体のたんぱく質が吸着する部位を塞いだりして、さらなるたんぱく質の吸着を防ぐ。これにより、エクソソームまたは微粒子の非特異的な吸着を防止する。このため、スキムミルクはブロッキング処理に好適である。なお、ブロッキング処理に用いる物質は、同様の効果を奏するものであればスキムミルクに限定されない。

オペレータは、ウェルからスキムミルクを含む緩衝液を排出し、ウェルを別の緩衝液で洗浄する。洗浄に用いる緩衝液としては、スキムミルクを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。また、洗浄を省略することも可能である。図４（ａ）に示すように、試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上にブロック層１１２が形成される。

オペレータは、ステップＳ４にて、エクソソーム２００を含む試料液をウェルに注入する。オペレータは、エクソソーム２００を含む試料液が注入されたウェルを、適切な温度で、適切な時間、例えば３７度で２時間インキュベートさせる。これにより、エクソソーム２００の抗原２０２と試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上に固定されている抗体１１１とが抗原抗体反応により特異的に結合する。

オペレータは、ウェルから試料液を排出し、ウェルを緩衝液で洗浄する。なお、抗体１１１と結合しないで試料液中に分散しているエクソソーム、及び、抗原抗体反応ではない非特異吸着によってウェル内に付着しているエクソソームは、この洗浄によって除去される。

図４（ｂ）に示すように、エクソソーム２００は、試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上に捕捉される。抗原２０２であるＣＤ９たんぱく質は大半のエクソソームに存在するため、大半のエクソソーム２００をトラック領域１０３上に捕捉することができる。なお、説明をわかりやすくするために、図１４（ｂ）等に示すエクソソーム２００は、図３に示すエクソソーム２００を簡略化して模式的に示している。また、エクソソームの粒子径は種々存在するが、図４（ｂ）及び後述する図６（ａ）、図６（ｂ）においてはエクソソーム２００の粒子径を全て同一で図示している。

オペレータは、ステップＳ５にて、標識となる蛍光微粒子１２０（第１の蛍光微粒子）を含む緩衝液をウェルに注入する。図５（ａ）に示すように、蛍光微粒子１２０の表面には、エクソソーム２００の特定のたんぱく質と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体１２１（第１の検出抗体）が形成されている。蛍光微粒子１２０の大きさは約２００ｎｍである。

抗体１２１は、ＨＥＲ２たんぱく質と特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体である。蛍光微粒子１２０は、外部からレーザ光が照射されることにより蛍光微粒子１２０に内包されている蛍光物質が励起され、波長λ１（第１の波長）の蛍光ＦＬ１（第１の蛍光）を発光する。

オペレータは、蛍光微粒子１２０を含む緩衝液が注入されたウェルを、適切な時間、適切な温度でインキュベートさせる。これにより、図６（ａ）に示すように、蛍光微粒子１２０の抗体１２１と、試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上に捕捉されているエクソソーム２００のうち、抗原２０３を有するエクソソーム２１０とが抗原抗体反応により特異的に結合する。蛍光微粒子１２０はエクソソーム２１０と結合した状態でトラック領域１０３上に捕捉される。

オペレータは、ウェルから緩衝液を排出し、ウェルを別の緩衝液で洗浄し、乾燥させる。なお、エクソソーム２００と結合しないで緩衝液中に分散している蛍光微粒子１２０は洗浄により除去される。

オペレータは、ステップＳ６にて、標識となる蛍光微粒子１３０（第２の蛍光微粒子）を含む緩衝液をウェルに注入する。図５（ｂ）に示すように、蛍光微粒子１３０の表面には、エクソソーム２００の特定のたんぱく質と抗原抗体反応により特異的に結合する抗体１３１（第２の検出抗体）が形成されている。蛍光微粒子１３０の大きさは約２００ｎｍである。

抗体１３１は、ＣＤ１４７たんぱく質と特異的に結合する抗ＣＤ１４７抗体である。蛍光微粒子１３０は、外部からレーザ光が照射されることにより蛍光微粒子１３０に内包されている蛍光物質が励起され、波長λ２（第２の波長）の蛍光ＦＬ２（第２の蛍光）を発光する。

オペレータは、蛍光微粒子１３０を含む緩衝液が注入されたウェルを、適切な時間、適切な温度でインキュベートさせる。これにより、図６（ｂ）に示すように、蛍光微粒子１３０の抗体１３１と、試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上に捕捉されているエクソソーム２００のうち、抗原２０４を有するエクソソーム２２０とが抗原抗体反応により特異的に結合する。蛍光微粒子１３０はエクソソーム２２０と結合した状態でトラック領域１０３上に捕捉される。

複数の蛍光微粒子を含む緩衝液、例えば蛍光微粒子１２０及び蛍光微粒子１３０を含む緩衝液を用いて、複数の蛍光微粒子１２０，１３０をトラック領域１０３上に一度に捕捉させることも可能である。しかしながら、複数の蛍光微粒子１２０，１３０をトラック領域１０３上に一度に捕捉させると、存在量が異なる２種類のたんぱく質を有するエクソソーム２００に対して、存在量の多いたんぱく質（例えばＣＤ１４７たんぱく質）と蛍光微粒子１３０が特異的に結合する。

そのため、存在量の少ないたんぱく質（例えばＨＥＲ２たんぱく質）と蛍光微粒子１２０が特異的に結合する確率を低下させるおそれがある。結合確率の低下は、存在量の少ないたんぱく質の検出精度を悪化させる要因となる。

そこで、抗体１２１として、抗体１３１よりも存在量の少ない抗体を選ぶことが好適である。例えば、ＣＤ１４７たんぱく質とＨＥＲ２たんぱく質を標的として検出する場合、抗体１２１を、ＣＤ１４７たんぱく質よりも存在量が少ない可能性が高いことが分かっているＨＥＲ２たんぱく質と特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体とすることが望ましい。

上記のように、存在量の少ないたんぱく質から順に蛍光波長の異なる蛍光微粒子を特異的に結合させることにより、存在量の少ないたんぱく質を有するエクソソームのほぼ全量を検出することが可能になる。存在量の多いたんぱく質を有するエクソソームに対しては全量に対して僅かな欠損が生じる可能性があるものの、常に同じ手順とすることにより再現性を確保することができる。

試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３上に捕捉されている複数の蛍光微粒子１２０，１３０を検出する分析装置を説明する。エクソソームを疾患との関連性が期待される複数の抗原とそれぞれ特異的に結合する複数の検出抗体で検出することで、より高い精度で疾患の状態を把握できる可能性がある。

［第１実施形態の分析装置］
図７を用いて、第１実施形態の分析装置を説明する。第１実施形態の分析装置１は、レーザ光源２と、コリメータレンズ３と、ビームスプリッタ４，５と、対物レンズ６と、集光レンズ７ａ，７ｂ，８，９と、波長分離プリズム１０と、バンドパスフィルタ１１，１２と、光検出器１３と、蛍光検出器１４，１５と、検出信号生成回路２０と、計測部１６とを備える。検出信号生成回路２０は、微粒子検出回路２１と、ゲート信号生成回路２２と、蛍光検出回路２３とを有する。なお、計測部１６は、外部装置が備える構成としてもよい。

レーザ光源２は、波長が例えば４０５ｎｍのレーザ光Ｌ１を射出する。コリメータレンズ３はレーザ光Ｌ１を平行光にする。ビームスプリッタ４（第１のビームスプリッタ）はレーザ光Ｌ１を透過させる。対物レンズ６はレーザ光Ｌ１を試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３、具体的にはトラック領域１０３の凹部１０２に集光させる。

レーザ光Ｌ１はトラック領域１０３で反射し、検出光Ｌ２として対物レンズ６を介してビームスプリッタ４へ入射する。ビームスプリッタ４は検出光Ｌ２をビームスプリッタ５（第２のビームスプリッタ）に向けて反射する。ビームスプリッタ５は検出光Ｌ２を透過させる。集光レンズ７ａ，７ｂは検出光Ｌ２を光検出器１３に向けて集光させる。光検出器１３は検出光Ｌ２の光量ＬＶ（検出光光量）を検出し、検出信号生成回路２０へ出力する。

トラック領域１０３の凹部１０２に蛍光微粒子１２０が捕捉されている場合、蛍光微粒子１２０にレーザ光Ｌ１が照射されることにより、蛍光微粒子１２０に内包されている蛍光物質が励起され、蛍光微粒子１２０は波長λ１の蛍光ＦＬ１を発光する。蛍光ＦＬ１は対物レンズ６を介してビームスプリッタ４へ入射する。ビームスプリッタ４は蛍光ＦＬ１をビームスプリッタ５に向けて反射する。

ビームスプリッタ５は蛍光ＦＬ１を波長分離プリズム１０に向けて反射する。波長分離プリズム１０は蛍光ＦＬ１を透過させる。バンドパスフィルタ１１（第１のバンドパスフィルタ）は、蛍光ＦＬ１を透過させる波長帯域（第１の波長帯域）を有し、波長帯域以外の波長の光を遮断する蛍光フィルタである。蛍光ＦＬ１は、光量及び光強度が検出光Ｌ２と比較して非常に小さいため、バックグラウンドノイズの影響を受けやすい。バンドパスフィルタ１１によりバックグラウンドノイズの影響を低減できる。

集光レンズ８は、蛍光ＦＬ１を蛍光検出器１４（第１の蛍光検出部）に向けて集光させる。蛍光検出器１４は、蛍光ＦＬ１の光量ＦＶ１（第１の蛍光光量）を検出し、検出信号生成回路２０へ出力する。

トラック領域１０３の凹部１０２に蛍光微粒子１３０が捕捉されている場合、蛍光微粒子１３０にレーザ光Ｌ１が照射されることにより、蛍光微粒子１３０に内包されている蛍光物質が励起され、蛍光微粒子１３０は波長λ２の蛍光ＦＬ２を発光する。蛍光ＦＬ２は対物レンズ６を介してビームスプリッタ４へ入射する。ビームスプリッタ４は蛍光ＦＬ２をビームスプリッタ５に向けて反射する。

ビームスプリッタ５は蛍光ＦＬ２を波長分離プリズム１０に向けて反射する。波長分離プリズム１０は蛍光ＦＬ２をバンドパスフィルタ１２（第２のバンドパスフィルタ）に向けて反射させる。バンドパスフィルタ１２は、蛍光ＦＬ２を透過させる波長帯域（第２の波長帯域）を有し、波長帯域以外の波長の光を遮断する蛍光フィルタである。蛍光ＦＬ２は、光量及び光強度が検出光Ｌ２と比較して非常に小さいため、バックグラウンドノイズの影響を受けやすい。バンドパスフィルタ１２によりバックグラウンドノイズの影響を低減できる。

集光レンズ９は、蛍光ＦＬ２を蛍光検出器１５（第２の蛍光検出部）に向けて集光させる。蛍光検出器１５は、蛍光ＦＬ２の光量ＦＶ２（第２の蛍光光量）を検出し、検出信号生成回路２０へ出力する。

図８の（ａ）及び（ｂ）に示すタイムチャートを用いて、検出信号生成回路２０の動作を説明する。検出信号生成回路２０の微粒子検出回路２１には光検出器１３から検出光Ｌ２の光量ＬＶが入力される。レーザ光Ｌ１はトラック領域１０３の凹部１０２に沿って走査される。レーザ光Ｌ１が蛍光微粒子１２０，１３０上を走査されると、検出光Ｌ２の光量ＬＶが変化する。例えば、図８の（ａ）及び（ｂ）では、レーザ光Ｌ１が蛍光微粒子１２０，１３０上を走査されると、検出光Ｌ２の光量ＬＶが減少する。

微粒子検出回路２１は、光量ＬＶが閾値を超えている期間にハイレベルとなるパルス信号である微粒子検出信号ＢＳを生成し、計測部１６及びゲート信号生成回路２２へ出力する。なお、微粒子検出回路２１は、光量ＬＶが閾値を超えた時点ｔ１を検出し、ゲート信号生成回路２２へ出力するようにしてもよい。

ゲート信号生成回路２２は、微粒子検出信号ＢＳの立ち上がりの時点ｔ１から期間Ｔａ後に立ち上がり、さらに期間Ｔｂ後に立ち下がるゲート信号ＧＳを生成し、蛍光検出回路２３へ出力する。期間Ｔｂはゲート信号ＧＳのパルス幅に相当する。期間Ｔａ、期間Ｔｂ、及び微粒子検出信号ＢＳのパルス幅Ｔｂｓは、（Ｔａ＋Ｔｂ）≦Ｔｂｓの関係を有することが好ましい。なお、Ｔａ＝０でもよい。

蛍光検出回路２３には、蛍光検出器１４から蛍光ＦＬ１の光量ＦＶ１が入力され、蛍光検出器１５から蛍光ＦＬ２の光量ＦＶ２が入力され、ゲート信号生成回路２２からゲート信号ＧＳが入力される。蛍光検出回路２３は、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間の光量ＦＶ１を抽出して蛍光検出信号ＦＳ１（第１の蛍光検出信号）を生成し、計測部１６へ出力する。また、蛍光検出回路２３は、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間の光量ＦＶ２を抽出して蛍光検出信号ＦＳ２（第２の蛍光検出信号）を生成し、計測部１６へ出力する。

計測部１６は、入力される微粒子検出信号ＢＳをカウントし、トラック領域１０３上に捕捉されている微粒子の総数を計測する。計測部１６は、入力される蛍光検出信号ＦＳ１と閾値とを比較し、閾値を超えた蛍光検出信号ＦＳ１をカウントすることにより、トラック領域１０３上に捕捉されている蛍光微粒子１２０の数を計測する。また、計測部１６は、入力される蛍光検出信号ＦＳ２と閾値とを比較し、閾値を超えた蛍光検出信号ＦＳ２をカウントすることにより、トラック領域１０３上に捕捉されている蛍光微粒子１３０の数を計測する。

トラック領域１０３上に捕捉されている微粒子の総数に対する蛍光微粒子１２０及び蛍光微粒子１３０の比率、または蛍光微粒子１２０と蛍光微粒子１３０との比率等を分析することにより、エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を識別することができる。

図９は、トラックピッチが３２０ｎｍの試料分析用ディスク１００を用いて、分析装置１で再生線速度４．９１７ｍ／ｓでエクソソームと結合した蛍光微粒子を検出したときのバックグラウンドノイズのスペクトルを示している。図９は、実施例として分析装置１によりゲート信号ＧＳを用いて検出した場合のバックグラウンドノイズのスペクトルと、比較例としてゲート信号ＧＳを用いずに蛍光検出信号ＦＳを連続的に検出した場合のバックグラウンドノイズのスペクトルとを示している。なお、実際に蛍光微粒子を検出した場合は、バックグラウンドノイズ上に広範な周波数帯域を有する微粒子検出信号が加わるため、比較が困難である。

ここでは、蛍光微粒子が存在しない試料分析用ディスク１００のノイズレベルは、蛍光微粒子の凝集が生じにくい安定した測定条件における蛍光微粒子の存在比率に基づいて生成されたゲートパルスを用いて測定される。安定した測定条件では蛍光微粒子の存在比率は２０％を超えない。この場合、ノイズレベルを１／５に低減できる。

従って、分析装置１によれば、エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を、従来よりも簡便で短時間に識別することができる。また、分析装置１によれば、検出光Ｌ２の光量に基づいてゲート信号ＧＳを生成し、ゲート信号ＧＳがハイレベルの期間における蛍光検出信号ＦＳ１，ＦＳ２を抽出することにより、バックグラウンドノイズの影響を低減できる。これにより、蛍光検出信号ＦＳ１，ＦＳ２が検出されない期間における誤検出を抑制できる。

［第２実施形態の分析装置］
図１０を用いて、第２実施形態の分析装置を説明する。なお、説明をわかりやすくするために、第１実施形態の分析装置１と同じ構成部には同じ符号を付す。

第２実施形態の分析装置３１は、レーザ光源２と、コリメータレンズ３と、ビームスプリッタ４，５と、対物レンズ６と、集光レンズ７ａ，７ｂ，８，９と、波長分離プリズム１０と、バンドパスフィルタ１１，１２と、光検出器１３と、蛍光検出器１４，１５と、検出信号生成回路４０と、計測部１６とを備える。

検出信号生成回路４０は、微粒子検出回路２１と、ゲート信号生成回路２２と、蛍光検出回路２３と、レーザ光源制御回路４１とを有する。即ち、第２実施形態の分析装置３１は、第１実施形態の分析装置１と比較して、検出信号生成回路４０がレーザ光源制御回路４１をさらに有している点で相違し、それ以外の構成は同じである。そこで、第１実施形態の分析装置１との相違点について説明する。

図１１の（ａ）及び（ｂ）に示すタイムチャートを用いて、検出信号生成回路４０の動作を説明する。図１１の（ａ）及び（ｂ）は図８の（ａ）及び（ｂ）に対応する。なお、説明をわかりやすくするために、図８の（ａ）及び（ｂ）と同じ信号には同じ符号を付す。

微粒子検出回路２１には光検出器１３から検出光Ｌ２の光量ＬＶが入力される。レーザ光Ｌ１はトラック領域１０３の凹部１０２に沿って走査される。レーザ光Ｌ１が蛍光微粒子１２０，１３０上を走査されると、検出光Ｌ２の光量ＬＶが変化する。例えば、図１１の（ａ）及び（ｂ）では、レーザ光Ｌ１が蛍光微粒子１２０，１３０上を走査されると、検出光Ｌ２の光量ＬＶが減少する。

微粒子検出回路２１は、光量ＬＶが閾値を超えている期間にハイレベルとなるパルス信号である微粒子検出信号ＢＳを生成し、計測部１６及びゲート信号生成回路２２へ出力する。なお、微粒子検出回路２１は、光量ＬＶが閾値を超えた時点ｔ１を検出し、ゲート信号生成回路２２へ出力するようにしてもよい。

ゲート信号生成回路２２は、微粒子検出信号ＢＳの立ち上がりの時点ｔ１から期間Ｔａ後に立ち上がり、さらに期間Ｔｂ後に立ち下がるゲート信号ＧＳを生成し、蛍光検出回路２３及びレーザ光源制御回路４１へ出力する。

レーザ光源制御回路４１は、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間にレーザ光Ｌ１の光量ＬＢ１を調整するためのレーザ駆動信号ＣＳをレーザ光源２へ出力する。レーザ光源２は、レーザ駆動信号ＣＳに基づいて、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間にレーザ光Ｌ１の光量ＬＶ１を増大させる。これにより、蛍光微粒子１２０から発光される蛍光ＦＬ１の光量ＦＶ１１、及び、蛍光微粒子１３０から発光される蛍光ＦＬ２の光量ＦＶ１２が増大する。よって、光量ＦＶ１１，ＦＶ１２のＳＮ比を増大させることができる。

蛍光検出回路２３には、蛍光検出器１４から蛍光ＦＬ１の光量ＦＶ１１が入力され、蛍光検出器１５から蛍光ＦＬ２の光量ＦＶ１２が入力され、ゲート信号生成回路２２からゲート信号ＧＳが入力される。蛍光検出回路２３は、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間の光量ＦＶ１１を抽出して蛍光検出信号ＦＳ１１を生成し、計測部１６へ出力する。また、蛍光検出回路２３は、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間の光量ＦＶ１２を抽出して蛍光検出信号ＦＳ１２を生成し、計測部１６へ出力する。

計測部１６は、入力される微粒子検出信号ＢＳをカウントし、トラック領域１０３上に捕捉されている微粒子の総数を計測する。計測部１６は、入力される蛍光検出信号ＦＳ１１と閾値とを比較し、閾値を超えた蛍光検出信号ＦＳ１１をカウントすることにより、トラック領域１０３上に捕捉されている蛍光微粒子１２０の数を計測する。また、計測部１６は、入力される蛍光検出信号ＦＳ１２と閾値とを比較し、閾値を超えた蛍光検出信号ＦＳ１２をカウントすることにより、トラック領域１０３上に捕捉されている蛍光微粒子１３０の数を計測する。

トラック領域１０３上に捕捉されている微粒子の総数に対する蛍光微粒子１２０及び蛍光微粒子１３０の比率、または蛍光微粒子１２０と蛍光微粒子１３０との比率等を分析することにより、エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を識別することができる。

従って、分析装置３１によれば、エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を、従来よりも簡便で短時間に識別することができる。また、分析装置３１によれば、検出光Ｌ２の光量に基づいてゲート信号ＧＳを生成し、ゲート信号ＧＳがハイレベルの期間における蛍光検出信号ＦＳ１１，ＦＳ１２を抽出することにより、バックグラウンドノイズの影響を低減できる。これにより、蛍光検出信号ＦＳ１１，ＦＳ１２が検出されない期間における誤検出を抑制できる。

また、分析装置３１によれば、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間のレーザ光Ｌ１の光量ＬＶ１を増大させることにより、蛍光検出信号ＦＳ１，ＦＳ２のＳＮ比が増大するため、蛍光微粒子１２０，１３０の蛍光検出精度を向上させることができる。

なお、レーザ光Ｌ１の出力を常にハイレベルにすることで蛍光光量を増大させることができるものの、レーザ光Ｌ１の駆動電流が増大してレーザ光源２を構成するレーザチップの温度が上昇するため、レーザチップの寿命が低下する。分析装置３１によれば、蛍光微粒子の存在を検出してレーザ光Ｌ１の出力を増大することができるため、蛍光検出のためにレーザ光Ｌ１の出力を増大させる時間を限定することができる。これにより、レーザチップの発熱を抑制することが可能となり、レーザチップの寿命の低下を防止できる。

分析装置３１は、光検出器１３が検出する検出光Ｌ２に基づいて、トラッキング制御及びフォーカス制御等のサーボ制御を実行する。ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間にレーザ光Ｌ１の光量ＬＶ１が増大すると、光検出器１３の受光レベルが飽和する場合がある。光検出器１３の受光レベルが飽和すると、所望のサーボ制御を実行できなくなる場合がある。

従って、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間では、検出光Ｌ２の検出を実行しない、またはレーザ光Ｌ１の光量ＬＶ１が増大する直前の状態を維持するように各回路を制御することが好ましい。ゲート信号ＧＳがハイレベルとなる期間は、サーボ制御が必要となる期間と比較して非常に短いため、サーボ制御に与える影響は小さい。

［第３実施形態の分析装置］
図１２を用いて、第３実施形態の分析装置を説明する。なお、説明をわかりやすくするために、第１実施形態の分析装置１と同じ構成部には同じ符号を付す。

第３実施形態の分析装置５１は、レーザ光源２と、コリメータレンズ３と、ビームスプリッタ４，５と、対物レンズ６と、集光レンズ７ａ，７ｂ，８と、バンドパスフィルタ５２と、回折格子５３と、光検出器１３と、蛍光検出器５４と、検出信号生成回路２０と、計測部１６とを備える。

回折格子５３は蛍光ＦＬ１と蛍光ＦＬ２とを分離させる。蛍光検出器５４は複数の蛍光検出部５５，５６を有する。蛍光検出部５５は蛍光ＦＬ１を検出し、蛍光検出部５６は蛍光ＦＬ２を検出する。蛍光検出部５５は蛍光検出器１４に対応し、蛍光検出部５６は蛍光検出器１５に対応する。

即ち、第３実施形態の分析装置５１は、第１実施形態の分析装置１と比較して、回折格子５３を備える点、及び蛍光検出器５４が複数の蛍光検出部５５，５６を有する点で相違する。具体的には、分析装置１では蛍光ＦＬ１と蛍光ＦＬ２とを波長分離プリズム１０により分離するのに対し、分析装置５１では回折格子５３により分離する。そのため、分析装置５１では波長分離プリズム１０及び集光レンズ９を構成から省略することができる。

また、分析装置１では複数の蛍光検出器１４，１５を備えるのに対し、分析装置５１では蛍光検出器５４が複数の蛍光検出部５５，５６を有する。そのため、複数の蛍光ＦＬ１，ＦＬ２を単体の蛍光検出器５４で検出することができる。バンドパスフィルタ５２は、蛍光ＦＬ１，ＦＬ２を透過させる波長帯域を有し、波長帯域以外の波長の光を遮断する蛍光フィルタである。

蛍光ＦＬ１，ＦＬ２は、光量及び光強度が検出光Ｌ２と比較して非常に小さいため、バックグラウンドノイズの影響を受けやすい。バンドパスフィルタ５２によりバックグラウンドノイズの影響を低減することができる。従って、分析装置５１では単体のバンドパスフィルタ５２とすることができる。上記の相違点以外は分析装置１の構成と同じである。

レーザ光源２はレーザ光Ｌ１を射出する。コリメータレンズ３はレーザ光Ｌ１を平行光にする。ビームスプリッタ４はレーザ光Ｌ１を透過させる。対物レンズ６はレーザ光Ｌ１を試料分析用ディスク１００のトラック領域１０３、具体的にはトラック領域１０３の凹部１０２に集光させる。

レーザ光Ｌ１はトラック領域１０３で反射し、検出光Ｌ２として対物レンズ６を介してビームスプリッタ４へ入射する。ビームスプリッタ４は検出光Ｌ２をビームスプリッタ５に向けて反射する。ビームスプリッタ５は検出光Ｌ２を透過させる。集光レンズ７ａ，７ｂは検出光Ｌ２を光検出器１３に向けて集光させる。光検出器１３は検出光Ｌ２の光量ＬＶを検出し、検出信号生成回路２０へ出力する。

トラック領域１０３の凹部１０２に蛍光微粒子１２０が捕捉されている場合、蛍光微粒子１２０にレーザ光Ｌ１が照射されることにより、蛍光微粒子１２０に内包されている蛍光物質が励起され、蛍光微粒子１２０は蛍光ＦＬ１を発光する。蛍光ＦＬ１は対物レンズ６を介してビームスプリッタ４へ入射する。ビームスプリッタ４は蛍光ＦＬ１をビームスプリッタ５に向けて反射する。

ビームスプリッタ５は蛍光ＦＬ１をバンドパスフィルタ５２に向けて反射する。バンドパスフィルタ５２は蛍光ＦＬ１を透過させる。回折格子５３は、蛍光ＦＬ１が蛍光検出器５４の蛍光検出部５５に照射されるように蛍光ＦＬ１を回折させる。集光レンズ８は蛍光ＦＬ１を蛍光検出部５５に向けて集光させる。蛍光検出器５４は、蛍光検出部５５により蛍光ＦＬ１の光量ＦＶ１を検出し、検出信号生成回路２０へ出力する。

トラック領域１０３の凹部１０２に蛍光微粒子１３０が捕捉されている場合、蛍光微粒子１３０にレーザ光Ｌ１が照射されることにより、蛍光微粒子１３０に内包されている蛍光物質が励起され、蛍光微粒子１３０は蛍光ＦＬ２を発光する。蛍光ＦＬ２は対物レンズ６を介してビームスプリッタ４へ入射する。ビームスプリッタ４は蛍光ＦＬ２をビームスプリッタ５に向けて反射する。

ビームスプリッタ５は蛍光ＦＬ２をバンドパスフィルタ５２に向けて反射する。バンドパスフィルタ５２は蛍光ＦＬ２を透過させる。回折格子５３は、蛍光ＦＬ２が蛍光検出器５４の蛍光検出部５６に照射されるように蛍光ＦＬ２を回折させる。集光レンズ８は蛍光ＦＬ２を蛍光検出部５６に向けて集光させる。蛍光検出器５４は、蛍光検出部５６により蛍光ＦＬ２の光量ＦＶ２を検出し、検出信号生成回路２０へ出力する。

分析装置５１の検出信号生成回路２０及び計測部１６の構成及び動作は、分析装置１の検出信号生成回路２０及び計測部１６の構成及び動作と同じである。

従って、分析装置５１によれば、エクソソームに対して複数の種類の検出対象抗原を、従来よりも簡便で短時間に識別することができる。また、分析装置５１によれば、検出光Ｌ２の光量に基づいてゲート信号ＧＳを生成し、ゲート信号ＧＳがハイレベルの期間における蛍光検出信号ＦＳ１，ＦＳ２を抽出することにより、バックグラウンドノイズの影響を低減できる。これにより、蛍光検出信号ＦＳ１，ＦＳ２が検出されない期間における誤検出を抑制できる。

［第４実施形態の分析装置］
図１３を用いて、第４実施形態の分析装置を説明する。なお、説明をわかりやすくするために、第１〜第３実施形態の分析装置１，３１，５１と同じ構成部には同じ符号を付す。

第４実施形態の分析装置６１は、レーザ光源２と、コリメータレンズ３と、ビームスプリッタ４，５と、対物レンズ６と、集光レンズ７ａ，７ｂ，８と、バンドパスフィルタ５２と、回折格子５３と、光検出器１３と、蛍光検出器５４と、検出信号生成回路４０と、計測部１６とを備える。

第４実施形態の分析装置６１は、第３実施形態の分析装置５１と比較して、第２実施形態の分析装置３１の検出信号生成回路４０を備える点で相違し、それ以外の構成及び動作は同じである。また、第４実施形態の分析装置６１の検出信号生成回路４０の構成及び動作は、第２実施形態の分析装置３１の検出信号生成回路４０と同じである。

従って、分析装置６１によれば、検出光Ｌ２の光量に基づいてゲート信号ＧＳを生成し、ゲート信号ＧＳがハイレベルの期間における蛍光検出信号ＦＳ１１，ＦＳ１２を抽出することにより、バックグラウンドノイズの影響を低減できる。これにより、蛍光検出信号ＦＳ１１，ＦＳ１２が検出されない期間における誤検出を抑制できる。

また、分析装置６１によれば、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間のレーザ光Ｌ１の光量ＬＶ１を増大させることにより、蛍光検出信号ＦＳ１，ＦＳ２のＳＮ比が増大するため、蛍光微粒子１２０，１３０の蛍光検出精度を向上させることができる。

なお、分析装置６１は、光検出器１３が検出する検出光Ｌ２に基づいて、トラッキング制御及びフォーカス制御等のサーボ制御を実行する。ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間にレーザ光Ｌ１の光量ＬＶ１が増大すると、光検出器１３の受光レベルが飽和する場合がある。光検出器１３の受光レベルが飽和すると、所望のサーボ制御を実行できなくなる場合がある。

従って、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間では、検出光Ｌ２の検出を実行しない、またはレーザ光Ｌ１の光量ＬＶ１が増大する直前の状態を維持するように各回路を制御することが好ましい。ゲート信号ＧＳがハイレベルとなる期間は、サーボ制御が必要となる期間と比較して非常に短いため、サーボ制御に与える影響は小さい。

以上説明した第１〜第４実施形態の分析装置１，３１，５１，６１及び分析方法は、エクソソーム以外、例えばウイルス、たんぱく質複合体、またはたんぱく質凝集体等の分析に適用してもよい。

本発明は、以上説明した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。

例えば、試料分析用ディスク１００上に３種類以上の蛍光微粒子を捕捉させるようにしてもよい。存在量の少ないたんぱく質から順に蛍光波長の異なる蛍光微粒子をエクソソームと特異的に結合させることにより、存在量の少ないたんぱく質を有するエクソソームのほぼ全量を検出することができる。また、最後に、多くのエクソソームに存在するたんぱく質と蛍光微粒子とを結合させるようにしてもよい。

分析装置３１，６１では、レーザ光源制御回路４１は、ゲート信号ＧＳがハイレベルになっている期間内において、上記の期間よりも短い期間にレーザ光Ｌ１の光量ＬＶ１を増大させるようにしてもよい。

１ 分析装置
２ レーザ光源
１３ 光検出器
１４ 蛍光検出器（第１の蛍光検出部）
１５ 蛍光検出器（第２の蛍光検出部）
２０ 検出信号生成回路
１００ 試料分析用ディスク
１２０ 蛍光微粒子（第１の蛍光微粒子）
１３０ 蛍光微粒子（第２の蛍光微粒子）
２００ エクソソーム
２０３ 抗原（第１の抗原）
２０４ 抗原（第２の抗原）
Ｌ１ レーザ光
Ｌ２ 検出光
ＦＬ１ 蛍光（第１の蛍光）
ＦＬ２ 蛍光（第２の蛍光）
ＧＳ ゲート信号
ＦＳ１ 蛍光検出信号（第１の蛍光検出信号）
ＦＳ２ 蛍光検出信号（第２の蛍光検出信号）

Claims (3)

1. 第１の蛍光微粒子が結合された第１の抗原または第２の蛍光微粒子が結合された第２の抗原を有するエクソソームが捕捉されている試料分析用ディスクにレーザ光を照射するレーザ光源と、
   前記試料分析用ディスクにより反射されたレーザ光を検出光として検出する光検出器と、
   前記レーザ光が照射されることにより前記第１の蛍光微粒子から発光される第１の蛍光を検出する第１の蛍光検出部と、
   前記レーザ光が照射されることにより前記第２の蛍光微粒子から発光される第２の蛍光を検出する第２の蛍光検出部と、
   前記検出光に基づいてゲート信号を生成し、前記ゲート信号に基づいて前記第１の蛍光から第１の蛍光検出信号を生成し、前記ゲート信号に基づいて前記第２の蛍光から第２の蛍光検出信号を生成する検出信号生成回路と、
   を備えることを特徴とする分析装置。
2. 前記検出信号生成回路は、前記ゲート信号に基づいて前記レーザ光の光量を調整するレーザ光源制御回路を有することを特徴とする請求項１に記載の分析装置。
3. 第１の蛍光微粒子が結合された第１の抗原または第２の蛍光微粒子が結合された第２の抗原を有するエクソソームが捕捉されている試料分析用ディスクにレーザ光を照射し、
   前記試料分析用ディスクにより反射されたレーザ光を検出光として検出し、
   前記レーザ光が照射されることにより前記第１の蛍光微粒子から発光される第１の蛍光、または、前記レーザ光が照射されることにより前記第２の蛍光微粒子から発光される第２の蛍光を検出し、
   前記検出光に基づいてゲート信号を生成し、
   前記ゲート信号に基づいて前記第１の蛍光から第１の蛍光検出信号を生成し、前記ゲート信号に基づいて前記第２の蛍光から第２の蛍光検出信号を生成する
   ことを特徴とする分析方法。

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