KR20210092767A - 스타필로코쿠스 박테리아의 영양요구성 균주 - Google Patents

스타필로코쿠스 박테리아의 영양요구성 균주 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 성장을 위해 D-알라닌에 의존성인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아(예를 들어, 에스. 에피더미디스)를 제공한다. 한 측면에서, 본 개시내용은 2개의 불활성화된 알라닌 라세마제 유전자(Δalr1Δalr2); 및 불활성화된 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 유전자를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 제조 방법을 특징으로 한다. 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 집단을, 대상체에서 발진을 치료 또는 예방하는 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 발진을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다.

Description

스타필로코쿠스 박테리아의 영양요구성 균주
우선권 주장
본 출원은 2018 년 11 월 16 일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/768,485의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
발명의 배경
알라닌 라세마제는 박테리아 세포벽에서 펩티도글리칸 층의 생합성에서 주요 빌딩 블록인 l-알라닌의 d-알라닌으로의 전환을 촉매하는 피리독살 포스페이트-함유 동종이량체 효소이다. 알라닌 라세마제는 전형적으로 진핵생물에는 존재하지 않지만, 원핵생물 중에 편재하여, 이러한 효소가 신규 항미생물제의 개발을 위한 매력적인 표적이 되게 한다.
D-알라닌이 박테리아 세포벽 형성에 필수적이지만, 어떤 유전자가 D-알라닌 생합성 경로에서 중요한지를 결정하는 것은 보다 복잡한 것으로 입증되었다. 박테리아는 1 또는 2개의 알라닌 라세마제 유전자를 함유한다. 2개의 유전자를 갖는 종에서, 하나는 구성적으로 발현되고 동화작용하는 반면, 다른 하나는 유도성이고 이화작용한다(Strych, U. et al. 2007. BMC Microbiol. 7:40; Strych U. et al., Curr. Microbiol. 41:290-294; Strych U. et al., FEMS Microbiol. Lett. 196:93-98). 이들 유전자는 세포벽 생합성에 필요한 D-알라닌을 공급하고, 이들 박테리아 중 몇몇을 사용한 녹아웃 연구는 알라닌 라세마제 효소가 외인성 D-알라닌의 부재 하에 성장에 필수적이라는 것을 확립하였다(Franklin, F. C., and W. A. Venables. 1976. Mol. Gen. Genet. 149:229-237; Hols, P., et al. J. Bacteriol. 179:3804-3807; Palumbo, E.,et al. FEMS Microbiol. Lett. 233:131-138; Steen, A., et al. J. Bacteriol. 187:114-124; Wijsman, H. J. 1972. Genet. Res. 20:269-277).
이중 알라닌 라세마제 유전자 녹아웃 에스. 에피데미디스(S. epidemidis) 균주(SEΔalr1Δalr2)는 이전에 개발되었다. 그러나, 이중 녹아웃 균주는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 일부 다른 박테리아 종과 대조적으로 D-알라닌 영양요구성을 나타내지 않았다.
따라서, 본 개시내용은 성장을 위해 D-알라닌에 의존성인 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 박테리아에 대한 필요성을 다룬다.
발명의 요약
본 개시내용은 성장을 위해 D-알라닌에 의존성인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 2개의 불활성화된 알라닌 라세마제 유전자(Δalr1Δalr2); 및 불활성화된 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 유전자를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 성장을 위해 D-알라닌에 의존성이다. 또 다른 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 스타필로코쿠스 에피더미디스(에스. 에피더미디스(S. Epidermidis)) 및 그의 아종이다. 한 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 하나 이상의 추가의 돌연변이를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (i) D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 녹아웃을 포함하는 플라스미드를 스타필로코쿠스 균주(SEΔalr1Δalr2)의 감응성 세포 내로 형질전환시키는 단계; (ii) 형질전환된 세포에서 녹아웃 플라스미드의 존재를 검출하는 단계; (iii) 단계 (ii)에서 확인된 형질전환된 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 (iv) 단리된 콜로니를 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 제조 방법을 특징으로 한다. 한 실시양태에서, 방법은 단리된 콜로니를 D-알라닌 영양요구성에 대해 시험하는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 형질전환체에서의 녹아웃 플라스미드의 존재는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 검출된다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아는 스타필로코쿠스 에피더미디스(에스. 에피더미디스) 및 그의 아종이다. 한 실시양태에서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아는 상기 방법에 의해 제조된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 포함하는 키트를 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 집단을, 대상체에서 발진을 치료 또는 예방하는 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 발진을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다.
도 1은 삼중 유전자 녹아웃(SEΔalr1Δalr2Δdat)이 있는 에스. 에피더미디스 균주에서의 D-알라닌 영양요구성의 관찰을 나타낸다. SE1423 녹아웃 플라스미드로의 형질전환, 플라스미드 통합 및 플라스미드 백본의 제거 후에, 세포를 콜로니에 대해 플레이팅하였다. 25개의 콜로니를 2개의 상이한 플레이트 상에 패치하고, 플레이트를 30 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 좌측: TSA 플레이트; 우측: TSA + 안히드로테트라시클린(2 μg/mL) + D-알라닌(40 μg/mL). 3개의 클론(#7, #12 및 #18, 적색 원으로 강조됨)은 D-알라닌으로 보충된 TSA 상에서만 성장할 수 있었다.
도 2a 및 도 2b는 삼중 녹아웃 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)의 PCR 시험의 결과를 보여준다. TSA + 안히드로테트라시클린(2 μg/mL) + D-알라닌(40 μg/mL)의 플레이트 상의 패치로부터의 세포를 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다: 클론 #7; KO 클론 #12; KO 클론 #18; 야생형 SE; SE1423KO 플라스미드 DNA(벡터, 대조군으로서). 도 2a: 야생형 SE1423 유전자좌(2.3 Kb의 PCR 생성물) 및 SE1423 녹아웃(1.5 Kb의 PCR 생성물)을 구별하기 위해 프라이머 1423-5F 및 1423-3R을 사용하여 PCR을 수행하였다. 도 2b: 프라이머 1423-F 및 1423-R을 사용하여 PCR을 수행하여 야생형 SE1423 유전자좌에 특이적인 0.7 Kb의 PCR 생성물을 검출하였다. 예상된 바와 같이, PCR 생성물은 SE1423 녹아웃 플라스미드 및 추정 SE1423 녹아웃 SE 클론으로부터 생성되지 않았다. 결과는 클론 #7, #12 및 #18에서 성공적인 SE1423 결실을 확인하였다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하고 있는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 통상의 기술자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al.(eds.), Springer Verlag(1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991). 본원에 사용되는 바와 같이, 하기 용어들은, 달리 명시되지 않는 한, 하기에서 그들에게 부여한 의미를 갖는다.
단수를 나타내는 지시어는 그의 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하도록 본원에 사용된다. 예를 들어, 한 "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 "포함하지만 이에 제한되지 않는"이라는 구를 의미하도록 본원에 사용되고, 이와 상호교환가능하게 사용된다.
"또는"이라는 용어는, 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, "및/또는"이라는 용어를 의미하도록 본원에 사용되고, 이와 상호교환가능하게 사용된다.
"예컨대"라는 용어는 "예컨대, 그러나, 제한 없이"라는 구를 의미하도록 본원에 사용되고, 이와 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "영양요구성의" 또는 "영양요구성"은 유기체가 그의 성장에 필요한 특정한 유기 화합물을 합성하지 못하는 것을 지칭한다. 영양요구체(Auxotroph)는 이러한 특징을 나타내는 유기체이다.
본원에 사용된 용어 "alrA" 및 "alr"은 alrA 유전자의 정상 대립유전자를 포함하는 D-알라닌 라세마제 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "dat" 및 "SE1423"은 dat 유전자의 정상 대립유전자를 포함하는, D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 "폴리펩티드" 또는 "단백질"이라는 용어는 하나의 쇄로 함께 결합하는 아미노-산 잔기로 구성된 생물학적 분자, 또는 거대분자를 지칭한다. 본원에 사용된 폴리펩티드의 정의는 아미노산 잔기의 하나 이상의 장쇄로 구성된 단백질(일반적으로 고분자량) 및 소수의 아미노산의 소형 펩티드(일반적으로 저분자량)를 포괄하는 것으로 의도된다. 다른 실시양태에서, 단일 아미노산은 비록 기술상으로는 폴리펩티드는 아니지만, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
본 발명의 목적을 위해, "단리된"이라는 용어는 생물학적 물질(세포, 핵산 또는 단백질)이 그의 원래의 환경(그가 자연적으로 존재하는 환경)으로부터 제거되었다는 것을 표시한다. 예를 들어, 자연 상태로 식물 또는 동물 중에 존재하는 폴리뉴클레오티드는 단리된 것이 아니지만, 그가 자연적으로 존재하는 인접한 핵산으로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주된다.
"단리된 핵산 분자"(예컨대, 예를 들어, 단리된 프로모터)는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 예를 들어, 게놈 DNA와 관련하여, 용어 "단리된"은 게놈 DNA가 자연적으로 결합된 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 포함한다. 바람직하게는, "단리된" 핵산 분자에는 핵산 분자가 유래되는 유기체의 게놈 DNA 중에 자연적으로 그 핵산 분자 옆에 있는 서열이 없다.
본원에 사용된 용어 "유전자 요소"는 폴리펩티드를 코딩하는 영역 또는 숙주 세포에서의 폴리펩티드의 발현에 중요한 복제, 전사 또는 번역 또는 다른 과정을 조절하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 영역 및 발현을 조절하는 그에 작동가능하게 연결된 영역 둘 다를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는 것을 의미한다. 유전자 요소는 에피솜 요소로서; 즉, 숙주 세포 게놈과 물리적으로 독립적인 분자로서 복제하는 벡터 내에 포함될 수 있다. 이들은 플라스미드 내에 포함될 수 있다. 유전자 요소는 또한 숙주 세포 게놈 내에; 자연 상태가 아니라, 오히려, 특히 단리, 클로닝 및 정제된 DNA의 형태로 또는 벡터로의 숙주 세포 내로의 도입과 같은 조작 후에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 "프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 DNA 서열을 지칭하는 것으로 의도된다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 개시 부위에 근접한, 유전자의 5' 영역에 위치한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우에는, 전사 속도가 유도제에 반응하여 증가된다. 예를 들어, 프로모터는 특정 조직 유형(들)에서 결합된 코딩 영역의 전사에서만 활성이도록 조직-특이적 방식으로 조절될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 형질전환 또는 형질감염되었거나, 또는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 세포를 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드는 특히 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역 또는 단일-, 이중- 및 삼중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로, 이중-가닥 또는 삼중-가닥, 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 지칭한다. 또한, 본원에 사용된 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 이러한 영역 내 가닥들은 동일한 분자 또는 상이한 분자로부터의 것일 수 있다. 상기 영역은 하나 이상의 분자 모두를 포함할 수 있지만, 더욱 전형적으로는 분자 중 일부의 한 영역만을 수반한다. 삼중-나선 영역의 분자 중 하나는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 용어 폴리뉴클레오티드는 1개 이상의 변형된 염기를 함유하는 상기 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유에서 백본이 변형된 DNA 또는 RNA는 상기 용어가 본원에 의도되는 바와 같이 "폴리뉴클레오티드"이다. 또한, 단지 두 가지 예를 들자면 독특한 염기, 예컨대 이노신, 또는 변형된 염기, 예컨대 트리틸화 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는 그 용어가 본원에 사용되는 바와 같은 폴리뉴클레오티드이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 많은 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA에 대해 매우 다양한 변형이 가해졌음을 인식할 것이다. 본원에 사용된 용어 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 이러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태, 뿐만 아니라 특히 단순 및 복합 세포를 포함하는 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태를 포괄한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 종종 올리고뉴클레오티드(들)로 지칭되는 짧은 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 종종 본원에 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "방사선 요법"은 암 세포를 사멸시키기 위해 강한 에너지의 빔을 사용하는 암 치료의 유형을 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "화학요법"은 암 세포를 사멸시키는 약물을 사용하는 암 치료의 유형을 지칭하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "발진"은 방사선 요법 또는 화학요법의 임의의 피부-관련 부작용을 지칭한다. 발진은 전형적으로 가벼운 낙설, 뾰루지, 거칠음, 팽팽함의 느낌, 및 가능하게는 피부 상의 가려움 및 작열감을 특징으로 한다. 이는 반점구진성 발진(습진-유사 해면상 피부염), 가려움증, 태선양 반응, 건선, 여드름모양 발진, 백반증-유사 병변, 자가면역 피부 질환(예를 들어, 수포성 유사천포창, 피부근염, 원형 탈모증), 사르코이드증 또는 손발톱 및 구강 점막 변화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
II. 조성물
본 개시내용은 D-알라닌 영양요구체인 삼중 녹아웃 스타필로코쿠스 박테리아를 기재한다. 본 개시내용은 이중 알라닌 라세마제 유전자 녹아웃 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat, SE1423) 녹아웃을 갖도록 유전자 변경된 조작된 스타필로코쿠스 박테리아, 예컨대 예를 들어, 스타필로코쿠스 에피더미디스를 제공한다. 본 개시내용은 원하는 D-알라닌 영양요구성을 갖는 삼중 녹아웃 에스. 에피더미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)를 제공한다.
D-알라닌은 펩티도글리칸 층 구조를 갖는 박테리아를 위한 필수 성분이다. D-알라닌의 본질은 펩티도글리칸 가닥의 가교에서 디펩티드 D-알라닐-D-알라닌의 핵심적인 역할에 기인한다. 본 개시내용에 기재된 바와 같이, 이중 알라닌 라세마제 유전자 녹아웃 에스. 에피데미디스 균주(SEΔalr1Δalr2)는 이전에 개발되었다. 그러나, 이중 녹아웃 균주는 바실루스 서브틸리스, 에스케리키아 콜라이 및 일부 다른 박테리아 종과 대조적으로 D-알라닌 영양요구성을 나타내지 않았다. 에스. 에피더미디스에서 글루타메이트 라세마제(L-글루타메이트 및 D-글루타메이트의 상호전환) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(D-알라닌 및 D-글루타메이트의 상호전환)의 존재는 알라닌 라세마제에 대한 우회를 제공할 수 있는 것으로 믿어졌다. 따라서, 본 개시내용은 D-알라닌 영양요구성을 나타내는 이중 녹아웃 균주(SEΔalr1Δalr2)에서의 알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat, SE1423)의 녹아웃을 제공한다.
본 개시내용은 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제의 활성이 감소되어 세포가 D-알라닌 영양요구체로 되도록, dat 유전자, 또는 그의 상동체에 결실을 갖도록 유전자 조작된 박테리아 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 박테리아 세포는 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제의 활성이 감소되어 세포가 D-알라닌 영양요구체가 되도록 dat 오페론에 영향을 미치는 또 다른 유전자 또는 오페론에서의 결실을 포함하도록 유전자 조작된다.
박테리아 균주
본 발명은 유전자 변경된 미생물, 예를 들어 박테리아를 제공한다. 본원에 기재된 방법이 임의의 스타필로코쿠스 박테리아 세포에서 dat의 단백질 상동체를 코딩하는 유전자를 불활성화 또는 녹아웃시킴으로써, 또는 이러한 단백질의 발현 또는 활성을 달리 불활성화시킴으로써 수행될 수 있는 것으로 생각된다. 스타필로코쿠스 속으로의 균주의 지정은 클러스터를 형성하고, 카탈라제를 제조하고, 적절한 세포벽 구조(펩티도글리칸 유형 및 테이코산 존재 포함) 및 30-40 mol% 범위의 DNA의 G + C 함량을 갖는 그람-양성 코쿠스일 것을 요구한다. 예는 에스. 아르겐테우스(S. argenteus), 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 슈바이체리(S. schweitzeri), 에스. 시미아에(S. simiae)를 포함하는 에스. 아우레우스 군; 에스. 아우리쿨라리스(S. auricularis)를 포함하는 에스. 아우리쿨라리스 군; 에스. 카르노수스(S. carnosus), 에스. 콘디멘티(S. condimenti), 에스. 마실리엔시스(S. massiliensis), 에스. 피시페르멘탄스(S. piscifermentans), 에스. 시물란스(S. simulans)를 포함하는 에스. 카르노수스 군; 에스. 카피티스(S. capitis), 에스. 카프라에(S. caprae), 에스. 에피더미디스, 에스. 사카롤리티쿠스(S. saccharolyticus)를 포함하는 에스. 에피더미디스 군; 에스. 데브리에세이(S. devriesei), 에스. 헤몰리티쿠스(S. haemolyticus), 에스. 호미니스(S. hominis)를 포함하는 에스. 헤몰리티쿠스(S. haemolyticus) 군; 에스. 아그네티스(S. agnetis), 에스. 크로모게네스(S. chromogenes), 에스. 펠리스(S. felis), 에스. 델피니(S. delphini), 에스. 히이쿠스(S. hyicus), 에스. 인터메디우스(S. intermedius), 에스. 루트라에(S. lutrae), 에스. 미크로티(S. microti), 에스. 무스카에(S. muscae), 에스. 슈도인터메디우스(S. pseudintermedius), 에스. 로스트리(S. rostri), 에스. 슐레이페리(S. schleiferi)를 포함하는 에스. 히이쿠스-인터메디우스 군; 에스. 루그두넨시스(S. lugdunensis)를 포함하는 에스. 루그두넨시스 군; 에스. 아를레타에(S. arlettae), 에스. 코흐니이(S. cohnii), 에스. 에쿠오룸(S. equorum), 에스. 갈리나룸(S. gallinarum), 에스. 클로시이(S. kloosii), 에스. 레에이(S. leei), 에스. 네팔렌시스(S. nepalensis), 에스. 사프로피티쿠스(S. saprophyticus), 에스. 숙시누스(S. succinus), 에스. 크실로수스(S. xylosus)를 포함하는 에스. 사프로피티쿠스 군; 에스. 플레우레티이(S. fleurettii), 에스. 렌투스(S. lentus), 에스. 시우리(S. sciuri), 에스. 스테파노비시이(S. stepanovicii), 에스. 비툴리누스(S. vitulinus)를 포함하는 에스. 시우리 군; 에스. 시물란스(S. simulans)를 포함하는 에스. 시물란스 군; 에스. 파스테우리(S. pasteuri), 에스. 와르네리(S. warneri)를 포함하는 에스. 와르네리 군을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 스타필로코쿠스 박테리아는 스타필로코쿠스 에피더미디스이다.
유전자 구축물
본 발명은 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어, (Sambrook et al. 2001)에 기재되어 있는 것을 이용한다. pJB38(Boss et al., 2013)을 녹아웃 벡터의 플라스미드 백본으로서 사용하였으며, 이는 pJB38, 대립유전자 교환 이. 콜라이-스타필로코쿠스 셔틀 벡터에 기초하고, 기능성을 개선시키기 위해 플라스미드 상의 추가의 설계 특징을 추가로 포함한다(Bose, J.L., et al. Applied and environmental microbiology. 2013;79(7):2218-2224). 특이적 프라이머를 SE1423 녹아웃을 만들기 위해 설계하였다(표 1).
Figure pct00001
표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 클로닝 숙주로서 Top10 이. 콜라이를 사용하여 pJB38 내의 EcoRI-SalI 부위에서 중첩 PCR 생성물을 클로닝함으로써 플라스미드를 구축하였다. 클론을 선택하고, 프라이머 1423-5F 및 1423-3R(표 1)을 사용하여 PCR에 의해 스크리닝하여 PCR 생성물을 검출하였다. 정확한 SE1423 녹아웃 플라스미드(pJB-1423KO)의 클론을 dam-/dcm- 이. 콜라이 균주 Gm2163 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 2개의 Gm2163 형질전환체 클론으로부터 퀴아젠 미디 프렙 키트(Qiagen Midi Prep Kit)를 사용함으로써 단리하고, 상기와 같이 EcoRI 및 SalI을 사용한 제한 소화에 의해 체크하였다.
재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 용도
본 발명의 스타필로코쿠스 박테리아는 그대로 사용될 수 있거나, 또는 질환을 치료하기 위한 치료 폴리펩티드를 발현하도록 변형될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 스타필로코쿠스 박테리아는 피부 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 스타필로코쿠스 박테리아는 피부 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현하도록 변형될 수 있다.
발진은 암 치료, 예컨대 방사선 요법 또는 화학요법의 사용의 가장 흔한 부작용 중 하나이다. 연구는 화학요법 약물 예컨대 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제, 또는 면역 체크포인트 억제제의 사용이 치료된 환자의 대략 30-100 %에서 발진의 징후로 이어진다는 것을 나타낸 바 있다(Fabbrocini et al., Skin Appendage Disord. 2015, 1(1):31-7, 및 Sibaud et al., Am J Clin Dermatol. 2018, 19(3):345-361, 본원에 참고문헌으로 포함됨). EGFR 억제제의 예는 모노클로날 항체 세툭시맙(에르비툭스(Erbitux)®) 및 파니투무맙(벡티빅스(Vectibix)®), 및 소분자 티로신 키나제 억제제 에를로티닙(타르세바(Tarceva)®) 및 게피티닙(이레사(Iressa)®)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. EGFR 억제제의 예는 세포독성 T 림프구-관련 항원-4(CTLA-4), 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 또는 프로그램화된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 표적화하는 모노클로날 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 약물의 사용에 의해 나타나는 발진 상태는 이들 환자의 삶의 질에 영향을 미칠 수 있고, 때때로 요법의 중단으로 이어질 수 있다.
따라서, 한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 측면 또는 실시양태 중 어느 하나의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 집단을, 대상체에서 발진을 치료 또는 예방하는 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 발진을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다. 한 실시양태에 따르면, 발진을 갖는 대상체는 암 치료를 받고 있다. 한 실시양태에 따르면, 암 치료는 방사선 요법이다. 한 실시양태에 따르면, 암 치료는 화학요법이다. 한 실시양태에 따르면, 화학요법은 표피 성장 인자 억제제를 포함한다. 한 실시양태에 따르면, 화학요법은 체크포인트 억제제를 포함한다.
제제
본 발명에 따라 사용하기 위한 제제는 원하는 폴리펩티드의 치료 유효량을 생성하기 위해, 임의의 제약학상 유효량의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아, 예를 들어, 적어도 약 0.01 중량%, 약 0.05 중량%, 약 0.1 중량%, 약 0.2 중량%, 약 0.3 중량%, 약 0.4 중량%, 약 0.5 중량%, 약 0.6 중량%, 약 0.7 중량%, 약 0.8 중량%, 약 0.9 중량%, 약 1.0 중량%, 약 1.5 중량%, 약 2.0 중량%, 약 3.0 중량%, 약 4.0 중량%, 약 5.0 중량%, 약 6.0 중량%, 약 7.0 중량%, 약 8.0 중량%, 약 9.0 중량%, 약 10.0 중량%, 약 11.0 중량%, 약 12.0 중량%, 약 13.0 중량%, 약 14.0 중량%, 약 15.0 중량%, 약 16.0 중량%, 약 17.0 중량%, 약 18.0 중량%, 약 19.0 중량%, 약 20.0 중량%, 약 25.0 중량%, 약 30.0 중량%, 약 35.0 중량%, 약 40.0 중량%, 약 45.0 중량%, 약 50.0 중량% 이상의 유전적으로 조작된 미생물, 예를 들어, 박테리아를 포함할 수 있고, 그의 상한이 약 90.0 중량%의 유전적으로 조작된 미생물, 예를 들어 박테리아라는 것이 추가로 명백할 것이다.
대안적 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제제는, 예를 들어 적어도 약 0.01 중량% 내지 약 30 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 20 중량%, 약 0.01 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 30 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 15 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 10 중량%, 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.2 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.3 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.4 중량% 내지 약 5 중량%, 약 0.5 중량% 내지 약 5 중량%, 약 1 중량% 내지 약 5 중량%, 또는 그 이상의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 포함할 수 있다.
III. 방법
본 개시내용은 (i) D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 녹아웃을 포함하는 플라스미드를 스타필로코쿠스 균주(SEΔalr1Δalr2)의 감응성 세포 내로 형질전환시키는 단계; (ii) 형질전환된 세포에서 녹아웃 플라스미드의 존재를 검출하는 단계; (iii) 단계 (ii)에서 확인된 형질전환된 세포를 인큐베이션하는 단계; 및 (iv) 단리된 콜로니를 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 제조 방법을 특징으로 한다. 바람직한 실시양태에서, 형질전환체에서의 녹아웃 플라스미드의 존재는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 검출된다. 특정 실시양태에서, 방법은 단리된 콜로니를 D-알라닌 영양요구성에 대해 시험하는 것을 추가로 포함한다.
IV. 키트
본 발명은 또한 키트를 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 키트는 (a) 본 발명의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아 및 (b) 그의 사용 지침을 포함한다. 본 발명의 조성물은 상기 문헌에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 성장을 위해 D-알라닌에 의존성인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이에 의해 추가로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용 뿐만 아니라 도면은 그 전문이 명백하게 본원에 참고문헌으로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 범위 내의 실시양태를 추가로 기재하고 입증한다. 본 실시예는 단지 예시 목적으로 제공된 것이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는데, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 그의 많은 변형도 가능하기 때문이다.
본 발명은 한 실시양태에서 발현 플라스미드가 항생제의 사용 없이 유지될 수 있는 스타필로코쿠스 에피더미디스(에스. 에피더미디스) 발현 시스템의 생성을 기재한다. 본 실험은 D-알라닌 영양요구체 에스. 에피더미디스 균주를 개발하기 위한 연장된 노력을 입증한다. 이중 알라닌 라세마제 유전자 녹아웃 에스. 에피더미디스 균주(SEΔalr1Δalr2)는 이전에 개발되었다. 그러나, 이중 녹아웃 균주는 바실루스 서브틸리스, 에스케리키아 콜라이 및 일부 다른 박테리아 종과 대조적으로 D-알라닌 영양요구성을 나타내지 않았다. 에스. 에피더미디스에서 글루타메이트 라세마제(L-글루타메이트 및 D-글루타메이트의 상호전환) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(D-알라닌 및 D-글루타메이트의 상호전환)의 존재는 에스. 아우레우스 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)에서 보고된 바와 같이 알라닌 라세마제에 대한 우회를 제공할 수 있는 것으로 믿어졌다. 따라서, 본 발명은 D-알라닌 영양요구성을 나타내는 삼중 녹아웃 에스. 에피더미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)를 개발하기 위한 이중 녹아웃 균주(SEΔalr1Δalr2)에서의 알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자(dat, SE1423)의 녹아웃을 기재한다.
실시예 1: SE1423(D-알라닌 아미노트랜스퍼라제)의 결실을 위한 벡터
pJB38(Boss et al., 2013)을 녹아웃 벡터의 플라스미드 백본으로서 사용하였다. 특이적 프라이머를 SE1423 녹아웃을 제조하기 위해 설계하였다(표 1).
표 1. SE1423 녹아웃을 위한 프라이머
Figure pct00002
·프라이머 1423-5F/1423-3R을 사용한 중첩 PCR: 1.5 Kb
·프라이머 1423-5F/1423-3R을 사용한 야생형으로부터의 PCR 생성물: 2.3 Kb
·F: 정방향 프라이머
·R: 역방향 프라이머
·클로닝을 위한 부가된 제한 부위는 밑줄친 볼드체 문자로 나타낸다.
5' 및 3' 플랭킹 영역의 PCR 생성물을 각각 0.5 Kb 및 1.0 Kb로 생성하였다. 이어서, 이들을 중첩 PCR에서 주형으로서 사용하여 5' 및 3' 플랭킹 영역 둘 다를 포괄하는 큰 PCR 생성물(1.5 Kb)을 생성하였다. 중첩 PCR 생성물을 클로닝 숙주로서 Top10 이. 콜라이를 사용하여 pJB38 내의 EcoRI-SalI 부위에서 클로닝하였다. 클론을 선택하고, 프라이머 1423-5F 및 1423-3R을 사용하여 PCR에 의해 스크리닝하여 1.5 Kb의 PCR 생성물을 검출하였다. 플라스미드 DNA를 또한 단리하고, EcoRI 및 SalI에 의해 소화시켜 벡터 백본(7.0 Kb) 및 삽입물(1.5 Kb)의 두 단편을 검출하였다. 정확한 SE1423 녹아웃 플라스미드(pJB-1423KO)의 클론을 dam-/dcm- 이. 콜라이 균주 Gm2163 내로 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA를 2개의 Gm2163 형질전환체 클론으로부터 퀴아젠 미디 프렙 키트를 사용하여 단리하고, 상기와 같이 EcoRI 및 SalI로의 제한 소화에 의해 체크하였다.
실시예 2. 삼중 녹아웃 균주( SEΔalr1Δalr2Δdat )의 생성
Gm2163으로부터 단리된 pJB-1423KO 플라스미드를 TAS + 클로람페니콜의 플레이트(10 μg/mL)를 사용하여 에스. 에피더미디스 균주(SEΔalr1Δalr2)의 감응성 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환체 내의 pJB-1423KO 플라스미드의 존재는 프라이머 1423-5F(EcoRI) 및 1423-3R(SalI)을 사용하여 1.5 Kb의 PCR 생성물을 검출함으로써 확인하였다. 시험된 모든 26개의 클론에서, 1.5 Kb의 PCR 생성물이 관찰된 반면, 2.3 Kb의 PCR 생성물은 SE 숙주 세포로부터의 세포 용해물을 함유하는 반응에서 관찰되었다. 2개의 확인된 클론의 세포를 TSA + Cm(10 μg/mL) + D-알라닌(40 μg/mL)의 새로운 플레이트 상에 스트리킹하였다. 상동 재조합을 통한 플라스미드 통합을 위해 플레이트를 43 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 단리된 콜로니를 다시 스트리킹하여 43 ℃에서 정제하였다. 4개의 단리된 콜로니를 250-mL 용량의 진탕 플라스크에서 50 mL TSB + D-알라닌(40 μg/mL) 내로 접종하여 상동 재조합의 제2 라운드를 통해 플라스미드 백본을 루프 아웃시켰다. 배양물을 30 ℃에서 24 시간 동안 진탕시켰다. 0.5 mL 배양물의 분취액을 50 mL 신선한 배지를 함유하는 플라스크로 옮겼다. 전달을 3 회 반복하였다. 플라스크로부터의 세포를 TSA + 안히드로테트라시클린(ATC 2 μg/mL) + D-알라닌(DA, 40 μg/mL) 상에 플레이팅하였다. 30 ℃에서 2 일 동안 인큐베이션한 후, 10-5 희석의 배양물 100 μl로 플레이팅된 플레이트 상에서 약 100-200개의 콜로니가 형성되었다. 콜로니의 추가의 분석은 하기에 기재된다.
실시예 3. 삼중 녹아웃 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)에서의 D-알라닌 영양요구성 시험
TSA+ATC+DA 플레이트로부터 총 25개의 단리된 콜로니를 TAS 플레이트 및 TAS+ATC+DA 플레이트 상에 패치하였다. 플레이트를 30 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 모든 클론은 D-알라닌 보충된 플레이트(TSA+ATC+DA) 상에서 잘 성장하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 3개의 클론(#7, #12 및 #18)은 D-알라닌 보충 없이 TSA 상에서 성장하지 못하였고, 이것은 D-알라닌 영양요구성을 나타낸다. TSA+ATC+DA 플레이트 상의 패치로부터의 세포가 TSA 플레이트 상에 다시 패치될 때 영양요구성 표현형이 다시 관찰되었다. 상동 재조합의 제2 라운드가 SE1423을 녹아웃시키지 않으면서 플라스미드 백본의 제거를 발생시킬 수 있기 때문에 TSA+ATC+DA 플레이트로부터의 일부 클론은 야생형 SE1423 유전자좌를 보유할 것으로 예상되었음을 주목한다.
D-알라닌 영양요구체인 클론을 추가로 분석하였다. 이들 1423KO SE 클론이 TSA+Cm(10 μg/mL) 상에 패치될 때, 이들은 성장하지 않았으며, 이는 클로람페니콜 선택 마커를 포함하는 플라스미드 백본의 상동 재조합의 제2 라운드 동안의 제거를 나타낸다. 프라이머 JB-Cm-F 및 JB-Cm-R(표 1)을 사용한 PCR은 또한 항생제 내성 마커의 손실을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음). 프라이머 1423-5F 및 1423-3R을 사용한 PCR은 이들 KO 클론에서 1.5 Kb의 PCR 생성물을 검출한 반면, SE 숙주로부터의 PCR 생성물은 예상된 바와 같이 2.3 Kb였다(도 2a). 야생형 SE 세포는 프라이머 1423-F 및 1423-R(둘 다 SE1423 코딩 서열에 특이적임)을 사용하여 0.7 Kb의 PCR 생성물을 제조하였고; 이 PCR 생성물은 KO 플라스미드 DNA로부터 및 추정 KO 클론으로부터 검출되지 않았다(도 2b).
따라서, 모든 실험 데이터에 기초하여, SE1423(dat, D-알라닌 아미노트랜스퍼라제)은 이중 알라닌 라세마제 유전자 녹아웃 균주에서 성공적으로 결실되어, 삼중 녹아웃 에스. 에피더미디스 균주(SEΔalr1Δalr2Δdat)를 생성하는 것으로 결론지을 수 있다. 또한, 원하는 D-알라닌 영양요구성이 삼중 녹아웃 균주에서 관찰되었다.
D-알라닌은 박테리아 세포 펩티도글리칸의 합성에 필요하다. 비. 서브틸리스 및 이. 콜라이에서 D-알라닌 영양요구성에 대한 알라닌 라세마제 유전자(들)를 결실시키는 것은 충분하였다. 그러나, 에스. 에피더미디스에서 이러한 표현형을 발달시키기 위해, 2개의 알라닌 라세마제 유전자(alr1, alr2) 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제 유전자 dat(SE1423)가 녹아웃되어야 한다. 분명히, 글루타메이트 라세마제 및 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제의 조합은 에스. 아우레우스 MRSA132(Moscoso et al., 2017) 및 리스테리아 모노시토게네스(Thompson et al., 1998)에서 보고된 바와 같이 알라닌 라세마제에 대한 실행 가능한 우회를 제공한다. 에스. 에피더미디스 게놈이 제3의 추정 알라닌 라세마제 상동체(SE1769)를 함유하지만, 이러한 연구에서 사용된 실험 조건 하에 D-알라닌 영양요구성을 위해 이러한 유전자를 녹아웃시키는 것이 필요하지 않다.
D-알라닌 영양요구성 에스. 에피더미디스 균주의 성공적인 개발로, 다음 단계는 선택 마커로서 알라닌 라세마제 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 균주를 형질전환시키는 것이다. 형질전환체는 D-알라닌 숙주 영양요구성의 플라스미드 상보성에 의해 선택될 것이다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태들에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 또는 단지 일상적일 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위를 포괄하는 것으로 의도된다.
참고문헌
문헌 [Bose JL et al., 2013. Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology 79:2218-2224.]
문헌 [Moscoso M et al., 2017. Protective efficacy of a D-alanine auxotroph Staphylococcus aureus as a vaccine candidate against staphylococcal disease. 27th ECCMID, April 22, 2017, Vienna, Austria.]
문헌 [Thompson R et al., 1998. Pathogenicity and immunogenicity of a Listeria monocytogenes strain that requires D-alanine for growth. Infection and Immunity 66:3552-3561.]
문헌 [Fabbrocini G et al., 2015. Acneiform Rash Induced by EGFR Inhibitors: Review of the Literature and New Insights, 1(1):31-7.]
문헌 [Sibaud V et al., 2018. Dermatologic Reactions to Immune Checkpoint Inhibitors : Skin Toxicities and Immunotherapy, 19(3):345-361.]
SEQUENCE LISTING <110> AZITRA INC <120> AUXOTROPHIC STRAINS OF STAPHYLOCOCCUS BACTERIUM <130> 129062-00920 <140> PCT/US2019/061439 <141> 2019-11-14 <150> 62/768,485 <151> 2018-11-16 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 atgcgaattc atgagcgata cttatttgaa tc 32 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 ctatgcgatt gaatatactt ttccttagca tcctcttcat taac 44 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 gttaatgaag aggatgctaa ggaaaagtat attcaatcgc atag 44 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 agctgtcgac agcagcatac caatgtcaat c 31 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 catacgaaga tcgaggctac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 gtaccaactt gtccgtcttg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 ttgatttaga caattggaag ag 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 aagtacagtc ggcattatct c 21

Claims (16)

  1. 2개의 불활성화된 알라닌 라세마제 유전자(Δalr1Δalr2); 및
    불활성화된 D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 유전자
    를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 스타필로코쿠스 박테리아가 성장을 위해 D-알라닌에 의존성인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
  3. 제1항에 있어서, 스타필로코쿠스 박테리아가 스타필로코쿠스 에피더미디스(에스. 에피더미디스) 및 그의 아종인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
  4. 제1항에 있어서, 스타필로코쿠스 박테리아가 하나 이상의 추가의 돌연변이를 추가로 포함하는 것인 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
  5. (i) D-알라닌 아미노트랜스퍼라제(dat) 녹아웃을 포함하는 플라스미드를 스타필로코쿠스 균주(SEΔalr1Δalr2)의 감응성 세포 내로 형질전환시키는 단계;
    (ii) 형질전환된 세포에서 녹아웃 플라스미드의 존재를 검출하는 단계;
    (iii) 단계 (ii)에서 확인된 형질전환된 세포를 인큐베이션하는 단계; 및
    (iv) 단리된 콜로니를 정제하는 단계
    를 포함하는 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 단리된 콜로니를 D-알라닌 영양요구성에 대해 시험하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 형질전환체에서의 녹아웃 플라스미드의 존재가 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 검출되는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 재조합 스타필로코쿠스 박테리아가 스타필로코쿠스 에피더미디스(에스. 에피더미디스) 및 그의 아종인 방법.
  9. 제5항의 방법에 의해 제조된 재조합 스타필로코쿠스 박테리아.
  10. 제1항 내지 제4항 또는 제9항 중 어느 한 항의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아를 포함하는 키트.
  11. 제1항 내지 제4항 또는 제9항 중 어느 한 항의 재조합 스타필로코쿠스 박테리아의 집단을, 대상체에서 발진을 치료 또는 예방하는 유효량으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 발진을 치료 또는 예방하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 발진을 갖는 대상체가 암 치료를 받고 있는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 암 치료가 방사선 요법인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 암 치료가 화학요법인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 화학요법이 표피 성장 인자 억제제를 포함하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 화학요법이 체크포인트 억제제를 포함하는 것인 방법.
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US6703025B1 (en) * 1998-08-31 2004-03-09 Inhibitex, Inc. Multicomponent vaccines
BR112016007919A2 (pt) * 2013-10-11 2017-12-05 Fund Profesor Novoa Santos vacinas atenuadas vivas
EP3148569B1 (en) * 2014-05-30 2022-07-06 Azitra, Inc. Therapeutic treatment of skin disease with recombinant commensal skin microorganisms
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