JP2022513599A - Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の栄養要求性株 - Google Patents
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Abstract
本開示は、成長に関してＤ－アラニンに依存する組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌（例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を提供する。１つの局面において、本開示は、２種の不活性化アラニンラセマーゼ遺伝子（Δａｌｒ１Δａｌｒ２）；および不活性化Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子を含む組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を特徴とする。別の局面において、本開示は、組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を作製する方法を特徴とする。別の局面において、本開示は、被験体において発疹を処置または防止する方法であって、上記方法は、本明細書で記載される局面または実施形態のうちのいずれか１つの組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の集団を、上記被験体において発疹を処置または防止するために有効な量で上記被験体に投与する工程を包含する方法を特徴とする。
Description
優先権の主張
本出願は、２０１８年１１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／７６８，４８５号（その内容全体は、全ての目的のためにその全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
本出願は、２０１８年１１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／７６８，４８５号（その内容全体は、全ての目的のためにその全体において本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。
発明の背景
アラニンラセマーゼは、細菌細胞壁におけるペプチドグリカン層の生合成において重要な構築ブロックである、ｌ－アラニンをｄ－アラニンに変換することを触媒するピリドキサールリン酸含有ホモダイマー酵素である。アラニンラセマーゼは、代表的には、真核生物には存在しないが、原核生物の中では広範に分布し、これは、この酵素を、新規な抗菌物質の開発のための魅力的な標的にしている。
アラニンラセマーゼは、細菌細胞壁におけるペプチドグリカン層の生合成において重要な構築ブロックである、ｌ－アラニンをｄ－アラニンに変換することを触媒するピリドキサールリン酸含有ホモダイマー酵素である。アラニンラセマーゼは、代表的には、真核生物には存在しないが、原核生物の中では広範に分布し、これは、この酵素を、新規な抗菌物質の開発のための魅力的な標的にしている。
Ｄ－アラニンは、細菌細胞壁形成に必須であるが、どの遺伝子がＤ－アラニン生合成経路において極めて重要であるかを決定することは、より複雑であることが判明した。細菌は、１種または２種のアラニンラセマーゼ遺伝子のいずれかを含む。２種の遺伝子を有する種では、一方は、構成的に発現されかつ同化性である一方で、他方は、誘導性でありかつ異化性である（Ｓｔｒｙｃｈ， Ｕ．ら， ２００７． ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７：４０； Ｓｔｒｙｃｈ Ｕ．ら， Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４１：２９０－２９４； Ｓｔｒｙｃｈ Ｕ．ら， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９６：９３－９８）。これらの遺伝子は、細胞壁生合成に必要とされるＤ－アラニンを供給し、これらの細菌のうちのいくつかでのノックアウト研究は、アラニンラセマーゼ酵素が外因性Ｄ－アラニンの非存在下での増殖に必須であることを確立した（Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｆ． Ｃ．， ａｎｄ Ｗ． Ａ． Ｖｅｎａｂｌｅｓ． １９７６． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １４９：２２９－２３７； Ｈｏｌｓ， Ｐ．ら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：３８０４－３８０７； Ｐａｌｕｍｂｏ， Ｅ．ら， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２３３：１３１－１３８； Ｓｔｅｅｎ， Ａ．ら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８７：１１４－１２４； Ｗｉｊｓｍａｎ， Ｈ． Ｊ． １９７２． Ｇｅｎｅｔ． Ｒｅｓ． ２０：２６９－２７７）。
二重アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウトＳ．ｅｐｉｄｅｍｉｄｉｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）を、以前に開発した。しかし、その二重ノックアウト株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびいくつかの他の細菌種とは対照的に、Ｄ－アラニン栄養要求性を示さなかった。
従って、本開示は、成長に関してD－アラニンに依存するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の必要性に対処する。
従って、本開示は、成長に関してD－アラニンに依存するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の必要性に対処する。
Ｓｔｒｙｃｈ， Ｕ．ら， ２００７． ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７：４０
Ｓｔｒｙｃｈ Ｕ．ら， Ｃｕｒｒ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４１：２９０－２９４
Ｓｔｒｙｃｈ Ｕ．ら， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９６：９３－９８
Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｆ． Ｃ．， ａｎｄ Ｗ． Ａ． Ｖｅｎａｂｌｅｓ． １９７６． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １４９：２２９－２３７
Ｈｏｌｓ， Ｐ．ら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７９：３８０４－３８０７
発明の要旨
本開示は、成長に関してＤ－アラニンに依存する組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌に関する。
本開示は、成長に関してＤ－アラニンに依存する組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌に関する。
１つの局面において、本開示は、２種の不活性化アラニンラセマーゼ遺伝子（Δａｌｒ１Δａｌｒ２）；および不活性化Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子を含む組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を特徴とする。１つの実施形態において、上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、成長に関してＤ－アラニンに依存する。別の実施形態において、上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびその亜種である。１つの実施形態において、上記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、１またはこれより多くのさらなる変異をさらに含む。
別の局面において、本開示は、組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を作製する方法であって、上記方法は、（ｉ）Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）ノックアウトを含むプラスミドを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）のコンピテント細胞に形質転換する工程；（ｉｉ）上記ノックアウトプラスミドの存在を、形質転換した細胞において検出する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において識別した上記形質転換した細胞をインキュベートする工程；および（ｉｖ）単離したコロニーを精製する工程、を包含する方法を特徴とする。１つの実施形態において、上記方法は、上記単離されたコロニーをＤ－アラニン栄養要求性に関して試験する工程をさらに包含する。別の実施形態において、形質転換体におけるノックアウトプラスミドの存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して検出される。さらに別の実施形態において、組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびその亜種である。１つの実施形態において、上記組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、前述の方法によって生成される。
別の局面において、本開示は、本明細書で記載される局面または実施形態のうちのいずれか１つの組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を含むキットを特徴とする。
別の局面において、本開示は、被験体において発疹を処置または防止する方法であって、上記方法は、上記被験体に、本明細書で記載される局面または実施形態のうちのいずれか１つの組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の集団を、上記被験体において発疹を処置または防止するために有効な量において投与する工程を包含する方法を特徴とする。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語のうちの多くの一般的な定義を、当業者に提供する： Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版． １９９４）； Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編， １９８８）； Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， 第５版， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒら（編）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段特定されなければ、以下に帰する意味を有する。
Ｉ．定義
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語のうちの多くの一般的な定義を、当業者に提供する： Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版． １９９４）； Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編， １９８８）； Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， 第５版， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒら（編）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段特定されなければ、以下に帰する意味を有する。
冠詞「ａ（１つの、ある）」および「ａｎ（１つの、ある）」は、その冠詞の文法上の対象の１つまたは１つより多い（すなわち、少なくとも１つ）に言及するために本明細書で使用される。例示すると、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１より多くの要素を意味する。
用語「含む、包含する」とは、語句「が挙げられるが、これらに限定されない」を意味するために本明細書で使用され、その語句と交換可能に使用される。
用語「または」とは、文脈が明らかに別のことを示さなければ、用語「および／または」を意味するために本明細書で使用され、その用語と交換可能に使用される。
用語「のような、例えば」とは、語句「例えば、が挙げられるが、これらに限定されない」を意味するために本明細書で使用され、その語句と交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、用語「栄養要求性の」または「栄養要求性」とは、生物がその成長に必要とされる特定の有機化合物を合成できないことをいう。栄養要求性株は、この特徴を示す生物である。
本明細書で使用される場合、用語「ａｌｒＡ」および「ａｌｒ」とは、ａｌｒＡ遺伝子の通常のアレルを含む、Ｄ－アラニンラセマーゼ遺伝子に言及する。
本明細書で使用される場合、用語「ｄａｔ」および「ＳＥ１４２３」とは、ｄａｔ遺伝子の通常のアレルを含む、Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子に言及する。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、生物学的分子、または鎖の中で一緒に結合するアミノ酸残基から構成される高分子に言及する。本明細書で使用されるポリペプチドの定義は、アミノ酸残基の１またはそれより多くの長鎖から構成されるタンパク質（概してより高分子量）およびいくつかのアミノ酸の小さなペプチド（概してより低分子量）を包含することが意図される。他の実施形態において、１個のアミノ酸は、技術的にはポリペプチドではないものの、本発明の範囲内にあるとも考えられる。
本発明の目的に関する用語「単離された」とは、生物学的物質（細胞、核酸またはタンパク質）の本来の環境（それが天然に存在する環境）から除去されたその生物学的物質を示す。例えば、植物または動物において天然の状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されていないが、これが天然に存在する隣接する核酸から分離されたその同じポリヌクレオチドは、「単離された」と考えられる。
「単離された核酸分子」（例えば、単離されたプロモーターなど）は、その核酸の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されているものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、用語「単離された」は、そのゲノムＤＮＡが天然に関連付けられている染色体から分離されている核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸分子は、その核酸分子が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてその核酸分子に天然に隣接している配列を含まない。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的エレメント」とは、宿主細胞においてポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、あるいは複製、転写もしくは翻訳、またはそのポリペプチドの発現にとって重要な他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、あるいはポリペプチドをコードする領域およびこれに作動可能に連結された発現を調節する領域の両方を含むポリヌクレオチドに言及することが意味される。遺伝的エレメントは、エピソームエレメントとして；すなわち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立した分子として複製するベクター内に含まれ得る。それらは、プラスミド内に含まれ得る。遺伝的エレメントはまた、それらの天然の状態ではなく、むしろ、とりわけ、精製されたＤＮＡの形態においてもしくはベクターにおいて、単離、クローニングおよび宿主細胞への導入のような操作後に、宿主細胞ゲノム内に含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指向するＤＮＡ配列に言及することが意味される。代表的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近い、遺伝子の５’領域に位置する。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、転写の速度は、誘導因子に応答して増大する。例えば、プロモーターは、これが特定の組織タイプにおいて関連するコード領域を転写することにおいてのみ活性であるように、組織特異的様式で調節され得る。
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、形質転換もしくはトランスフェクトされているか、または外因性ポリヌクレオチド配列による形質転換もしくはトランスフェクションの能力がある細胞に言及することが意味される。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、一般に、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドに言及し、これらは、改変されていないＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよいし、改変されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。従って、例えば、本明細書で使用される場合のポリヌクレオチドは、とりわけ、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域または１本鎖、２本鎖および３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖もしくは、より代表的には、２本鎖、もしくは３本鎖、または１本鎖および２本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子に言及する。さらに、本明細書で使用される場合のポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域に言及する。このような領域にある鎖は、同じ分子に由来してもよいし、異なる分子に由来してもよい。上記領域は、上記分子のうちの全てまたは１もしくはこれより多くを含んでいてもよいが、より代表的には、上記分子のうちのいくつかの領域のみが関わる。三重螺旋領域の分子のうちの１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、用語ポリヌクレオチドは、１個もしくはこれより多くの改変された塩基を含む、上記で記載されるとおりのＤＮＡまたはＲＮＡを含む。従って、安定性に関してまたは他の理由に関して改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるように「ポリヌクレオチド」である。さらに、２例だけ挙げると、通常でない塩基（例えば、イノシン）または改変された塩基（例えば、トリチル化塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で使用されるようにポリヌクレオチドである。非常に種々の改変が、当業者に公知の多くの有用な目的に役立つＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われていることが認識される。本明細書で使用される場合の用語ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのこのような化学的に、酵素的にまたは代謝的に改変された形態、ならびにウイルスおよび細胞（とりわけ、単純な細胞および複雑な細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な形態を含む。用語ポリヌクレオチドはまた、しばしばオリゴヌクレオチドとしても言及される短いポリヌクレオチドを含む。「ポリヌクレオチド」および「核酸」はしばしば、本明細書で交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、用語「放射線療法は、強烈なエネルギーの線を使用して、がん細胞を殺滅するがん処置のタイプに言及することが意味される。
本明細書で使用される場合、用語「化学療法」とは、薬物を使用して、がん細胞を殺滅するがん処置のタイプに言及することが意味される。
本明細書で使用される場合、用語「発疹」とは、放射線療法または化学療法の任意の皮膚関連副作用に言及する。発疹は、代表的には、軽度の落屑、丘疹、ざらつき、つっぱり感、ならびにおそらく皮膚の掻痒および熱感によって特徴づけられる。これは、斑状丘疹状発疹（湿疹のような海綿状を呈する炎症性皮膚炎）、掻痒感、苔癬様反応、乾癬、ざ瘡様発疹、白斑様病変、自己免疫皮膚病（例えば、水疱性類天疱瘡、皮膚筋炎、円形脱毛症）、サルコイドーシスまたは爪および口腔粘膜の変化が挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＩ．組成物
本開示は、Ｄ－アラニン栄養要求性株である三重ノックアウトＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を記載する。本開示は、二重アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウトおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ， ＳＥ１４２３）ノックアウトを有するように遺伝的に変化している、操作されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのような）を提供する。本開示は、所望のＤ－アラニン栄養要求性を有する三重ノックアウトＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２Δｄａｔ）を提供する。
本開示は、Ｄ－アラニン栄養要求性株である三重ノックアウトＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を記載する。本開示は、二重アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウトおよびアラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ， ＳＥ１４２３）ノックアウトを有するように遺伝的に変化している、操作されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのような）を提供する。本開示は、所望のＤ－アラニン栄養要求性を有する三重ノックアウトＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２Δｄａｔ）を提供する。
Ｄ－アラニンは、ペプチドグリカン層構造を有する細菌にとって必須の構成要素である。Ｄ－アラニンが必須であることは、ペプチドグリカン鎖の架橋においてジペプチド Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニンの重要な役割から来ている。本開示に記載されるように、二重アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウトＳ．ｅｐｉｄｅｍｉｄｉｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）を、以前に開発した。しかし、その二重ノックアウト株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびいくつかの他の細菌種とは対照的に、Ｄ－アラニン栄養要求性を示さなかった。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおけるグルタミン酸ラセマーゼ（Ｌ－グルタミン酸およびＤ－グルタミン酸を相互変換する）およびＤ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（Ｄ－アラニンおよびＤ－グルタミン酸を相互変換する）の存在は、アラニンラセマーゼの迂回路を提供し得ると考えられた。従って、本開示は、Ｄ－アラニン栄養要求性を示す二重ノックアウト株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）においてアラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ， ＳＥ１４２３）のノックアウトを提供する。
本開示は、Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼの活性が低減され、それによって、細胞をＤ－アラニン栄養要求性株とするように、ｄａｔ遺伝子またはそのホモログにおいて欠失を有する遺伝的に操作された細菌宿主細胞を提供する。別の実施形態において、細菌細胞は、Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼの活性が低減され、それによって、細胞をＤ－アラニン栄養要求性株とするように、ｄａｔオペロンに影響を及ぼす別の遺伝子またはオペロンにおいて欠失を含むように遺伝的に操作される。
細菌株
本発明は、遺伝的に変化した微生物、例えば、細菌を提供する。本明細書で記載される方法は、任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌細胞において、その細胞におけるｄａｔのタンパク質ホモログをコードする遺伝子を不活性化もしくはノックアウトすることによって、またはこのタンパク質の発現もしくは活性を別の方法で不活性化することによって行われる得ることが企図される。株をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に割り当てることは、クラスターを形成し、カタラーゼを生成し、適切な細胞壁構造を有する（ペプチドグリカンタイプおよびタイコ酸の存在を含む）グラム陽性球菌およびＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量が３０～４０モル％の範囲であることを必要とする。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ群（Ｓ．ａｒｇｅｎｔｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒｉ、Ｓ．ｓｉｍｉａｅを含む）； Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ群（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓを含む）； Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ群（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ、Ｓ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｐｉｓｃｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓを含む）； Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ群（Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．ｃａｐｒａｅ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓを含む）； Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ群（Ｓ．ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓを含む）； Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ－ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ群（Ｓ．ａｇｎｅｔｉｓ、Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｆｅｌｉｓ、Ｓ．ｄｅｌｐｈｉｎｉ、Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｌｕｔｒａｅ、Ｓ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｓ．ｍｕｓｃａｅ、Ｓ．ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｒｏｓｔｒｉ、Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉを含む）； Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ群（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを含む）； Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ群（Ｓ．ａｒｌｅｔｔａｅ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．ｋｌｏｏｓｉｉ、Ｓ．ｌｅｅｉ、Ｓ．ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｓｕｃｃｉｎｕｓ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓを含む）； Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ群（Ｓ．ｆｌｅｕｒｅｔｔｉｉ、Ｓ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ、Ｓ．ｓｔｅｐａｎｏｖｉｃｉｉ、Ｓ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓを含む）； Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ群（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓを含む）； Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ群（Ｓ．ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉを含む）。１つの実施形態において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓである。
本発明は、遺伝的に変化した微生物、例えば、細菌を提供する。本明細書で記載される方法は、任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌細胞において、その細胞におけるｄａｔのタンパク質ホモログをコードする遺伝子を不活性化もしくはノックアウトすることによって、またはこのタンパク質の発現もしくは活性を別の方法で不活性化することによって行われる得ることが企図される。株をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属に割り当てることは、クラスターを形成し、カタラーゼを生成し、適切な細胞壁構造を有する（ペプチドグリカンタイプおよびタイコ酸の存在を含む）グラム陽性球菌およびＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量が３０～４０モル％の範囲であることを必要とする。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓ．ａｕｒｅｕｓ群（Ｓ．ａｒｇｅｎｔｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒｉ、Ｓ．ｓｉｍｉａｅを含む）； Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓ群（Ｓ．ａｕｒｉｃｕｌａｒｉｓを含む）； Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ群（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｃｏｎｄｉｍｅｎｔｉ、Ｓ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｐｉｓｃｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓを含む）； Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ群（Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓ．ｃａｐｒａｅ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓを含む）； Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ群（Ｓ．ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓを含む）； Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ－ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ群（Ｓ．ａｇｎｅｔｉｓ、Ｓ．ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｆｅｌｉｓ、Ｓ．ｄｅｌｐｈｉｎｉ、Ｓ．ｈｙｉｃｕｓ、Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｌｕｔｒａｅ、Ｓ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｓ．ｍｕｓｃａｅ、Ｓ．ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｓ．ｒｏｓｔｒｉ、Ｓ．ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉを含む）； Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ群（Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを含む）； Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ群（Ｓ．ａｒｌｅｔｔａｅ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ｅｑｕｏｒｕｍ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．ｋｌｏｏｓｉｉ、Ｓ．ｌｅｅｉ、Ｓ．ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｓｕｃｃｉｎｕｓ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓを含む）； Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ群（Ｓ．ｆｌｅｕｒｅｔｔｉｉ、Ｓ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｓ．ｓｃｉｕｒｉ、Ｓ．ｓｔｅｐａｎｏｖｉｃｉｉ、Ｓ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓを含む）； Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ群（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓを含む）； Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ群（Ｓ．ｐａｓｔｅｕｒｉ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉを含む）。１つの実施形態において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓである。
遺伝子構築物
本発明は、標準的な分子生物学技術、例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら ２００１）に記載されるものを利用する。ｐＪＢ３８（Ｂｏｓｓら， ２０１３）は、ｐＪＢ３８（アレル交換Ｅ．ｃｏｌｉ－ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌシャトルベクター）に基づき、機能性を改善するために、プラスミド上に追加のデザイン特徴をさらに含むノックアウトベクターのプラスミド骨格として使用した（Ｂｏｓｅ， Ｊ．Ｌら．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１３；７９（７）：２２１８－２２２４）。特異的プライマーを、ＳＥ１４２３ノックアウトを作製するためにデザインした（表１）。
本発明は、標準的な分子生物学技術、例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら ２００１）に記載されるものを利用する。ｐＪＢ３８（Ｂｏｓｓら， ２０１３）は、ｐＪＢ３８（アレル交換Ｅ．ｃｏｌｉ－ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌシャトルベクター）に基づき、機能性を改善するために、プラスミド上に追加のデザイン特徴をさらに含むノックアウトベクターのプラスミド骨格として使用した（Ｂｏｓｅ， Ｊ．Ｌら．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１３；７９（７）：２２１８－２２２４）。特異的プライマーを、ＳＥ１４２３ノックアウトを作製するためにデザインした（表１）。
プラスミドは、クローニング宿主としてＴｏｐ１０ Ｅ．ｃｏｌｉを使用して、標準的な分子生物学技術を使用して、ｐＪＢ３８におけるＥｃｏＲＩ－ＳａｌＩ部位で重複するＰＣＲ生成物をクローニングすることによって、構築される。クローンを選択し、プライマー１４２３－５Ｆおよび１４２３－３Ｒ（表１）を使用するＰＣＲによってスクリーニングして、ＰＣＲ生成物を検出した。正確なＳＥ１４２３ノックアウトプラスミド（ｐＪＢ－１４２３ＫＯ）のクローンを、ｄａｍ－／ｄｃｍ－ Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｇｍ２１６３へと形質転換した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用することによって２つのＧｍ２１６３形質転換体クローンから単離し、上記のように、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩでの制限消化によってチェックした。
組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の使用
本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を、疾患を処置するために、そのまま使用し得るか、または治療用ポリペプチドを発現するように改変され得る。１つの例では、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、皮膚の疾患または障害を処置するために使用され得る。別の実施形態において、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、皮膚の疾患または障害を処置するために治療用ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現するように改変され得る。
本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を、疾患を処置するために、そのまま使用し得るか、または治療用ポリペプチドを発現するように改変され得る。１つの例では、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、皮膚の疾患または障害を処置するために使用され得る。別の実施形態において、本発明のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、皮膚の疾患または障害を処置するために治療用ポリペプチドまたはそのフラグメントを発現するように改変され得る。
発疹は、がん処置（例えば、放射線療法または化学療法）の使用の最も一般的な副作用のうちの１つである。研究は、化学療法薬（例えば、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）インヒビター、または免疫チェックポイントインヒビター）の使用が、その処置された患者のうちのおよそ３０～１００％において発疹の出現をもたらすことを示した（Ｆａｂｂｒｏｃｉｎｉら， Ｓｋｉｎ Ａｐｐｅｎｄａｇｅ Ｄｉｓｏｒｄ． ２０１５， １（１）：３１－７、およびＳｉｂａｕｄら， Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２０１８， １９（３）：３４５－３６１（本明細書に参考として援用される））。ＥＧＦＲインヒビターの例としては、モノクローナル抗体 セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））およびパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、ならびに低分子チロシンキナーゼインヒビター エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））およびゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＧＦＲインヒビターの例としては、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）またはプログラムされた死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）を標的化するモノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの薬物の使用によって現れる発疹状態は、これらの患者のクオリティー・オブ・ライフに影響を及ぼし得、ときおり、その治療の中止をもたらし得る。
よって、１つの局面において、本開示は、被験体において発疹を処置または防止する方法であって、上記方法は、上記被験体に、本明細書で記載される局面または実施形態のうちのいずれか１つの組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の集団を、上記被験体において発疹を処置または防止するために有効な量において投与する工程を包含する方法を特徴とする。１つの実施形態によれば、発疹を有する被験体は、がん処置を受けている最中である。１つの実施形態によれば、上記がん処置は、放射線療法である。１つの実施形態によれば、上記がん処置は、化学療法である。１つの実施形態によれば、上記化学療法は、上皮増殖因子インヒビターを含む。１つの実施形態によれば、上記化学療法は、チェックポイントインヒビターを含む。
製剤
本発明に従う使用のための製剤は、治療上有効な量の所望のポリペプチドを生成するために、任意の薬学的に有効な量の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌、例えば、遺伝的に操作された微生物、例えば、細菌の重量で少なくとも約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、約１０．０％、約１１．０％、約１２．０％、約１３．０％、約１４．０％、約１５．０％、約１６．０％、約１７．０％、約１８．０％、約１９．０％、約２０．０％、約２５．０％、約３０．０％、約３５．０％、約４０．０％、約４５．０％、約５０．０％またはこれより多くを含み得、その上限は、遺伝的に操作された微生物、例えば、細菌の重量で約９０．０％であることは、さらに明らかである
本発明に従う使用のための製剤は、治療上有効な量の所望のポリペプチドを生成するために、任意の薬学的に有効な量の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌、例えば、遺伝的に操作された微生物、例えば、細菌の重量で少なくとも約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約６．０％、約７．０％、約８．０％、約９．０％、約１０．０％、約１１．０％、約１２．０％、約１３．０％、約１４．０％、約１５．０％、約１６．０％、約１７．０％、約１８．０％、約１９．０％、約２０．０％、約２５．０％、約３０．０％、約３５．０％、約４０．０％、約４５．０％、約５０．０％またはこれより多くを含み得、その上限は、遺伝的に操作された微生物、例えば、細菌の重量で約９０．０％であることは、さらに明らかである
代替の実施形態において、本発明に従う使用のための製剤は、例えば、組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の重量で、少なくとも約０，０１％～約３０％、約０．０１％～約２０％、約０．０１％～約５％、約０．１％～約３０％、約０．１％～約２０％、約０．１％～約１５％、約０．１％～約１０％、約０．１％～約５％、約０．２％～約５％、約０．３％～約５％、約０．４％～約５％、約０．５％～約５％、約１％～約５％、またはこれより多くを含み得る。
ＩＩＩ．方法
本開示は、（ｉ）Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）ノックアウトを含むプラスミドを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株のコンピテント細胞（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）へと形質転換する工程；（ｉｉ）形質転換した細胞において上記ノックアウトプラスミドの存在を検出する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において識別した形質転換した細胞をインキュベートする工程；および（ｉｖ）単離したコロニーを精製する工程を包含する組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を作製する方法を特徴とする。好ましい実施形態において、形質転換体におけるノックアウトプラスミドの存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して検出される。ある特定の実施形態において、上記方法は、Ｄ－アラニン栄養要求性に関して単離したコロニーを試験する工程をさらに包含する。
本開示は、（ｉ）Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）ノックアウトを含むプラスミドを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株のコンピテント細胞（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）へと形質転換する工程；（ｉｉ）形質転換した細胞において上記ノックアウトプラスミドの存在を検出する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において識別した形質転換した細胞をインキュベートする工程；および（ｉｖ）単離したコロニーを精製する工程を包含する組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を作製する方法を特徴とする。好ましい実施形態において、形質転換体におけるノックアウトプラスミドの存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して検出される。ある特定の実施形態において、上記方法は、Ｄ－アラニン栄養要求性に関して単離したコロニーを試験する工程をさらに包含する。
ＩＶ．キット
本発明はまた、キットを提供する。１つの局面において、本発明のキットは、（ａ）本発明の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌および（ｂ）その使用説明書を含む。本発明の組成物は、上で記載される。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、成長に関してＤ－アラニンに依存する組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を含む。
本発明はまた、キットを提供する。１つの局面において、本発明のキットは、（ａ）本発明の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌および（ｂ）その使用説明書を含む。本発明の組成物は、上で記載される。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、成長に関してＤ－アラニンに依存する組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を含む。
本発明は、以下の実施例によってさらに例証され、その実施例は、さらなる限定とした解釈されるべきではない。本出願全体を通じて引用される全ての図面ならびに全ての参考文献、特許および公開された特許出願、ならびに図面の内容は、それらの全体において本明細書に明示的に参考として援用される。
以下の実施例は、本発明の範囲内の実施形態をさらに記載し、示す。実施例は、単に例証する目的で示され、本発明の限定として解釈されるべきではない。なぜならその多くのバリエーションは、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく可能だからである。
本発明は、１つの実施形態において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）発現系の生成を記載し、それによって、発現プラスミドは、抗生物質の使用なしに維持され得る。本実験は、Ｄ－アラニン栄養要求性株であるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株を開発しようとする長期にわたる努力を示す。二重アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウトＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）を以前に開発した。しかし、その二重ノックアウト株は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびいくつかの他の細菌種とは対照的に、Ｄ－アラニン栄養要求性を示さなかった。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおけるグルタミン酸ラセマーゼ（Ｌ－グルタミン酸およびＤ－グルタミン酸を相互変換する）およびＤ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（Ｄ－アラニンおよびＤ－グルタミン酸を相互変換する）の存在は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにおいて報告されるように、アラニンラセマーゼの迂回路を提供し得ると考えられた。従って、本発明は、Ｄ－アラニン栄養要求性を示す三重ノックアウトＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２Δｄａｔ）を開発するために、二重ノックアウト株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ， ＳＥ１４２３）のノックアウトを記載する。
実施例１： ＳＥ１４２３（Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ）の欠失のためのベクター
ｐＪＢ３８（Ｂｏｓｓら， ２０１３）を、ノックアウトベクターのプラスミド骨格として使用した。特異的プライマーを、ＳＥ１４２３ノックアウトを作製するために設計した（表１）。
ｐＪＢ３８（Ｂｏｓｓら， ２０１３）を、ノックアウトベクターのプラスミド骨格として使用した。特異的プライマーを、ＳＥ１４２３ノックアウトを作製するために設計した（表１）。
５’および３’隣接領域のＰＣＲ生成物を生成した（それぞれ、０．５Ｋｂおよび１．０Ｋｂ）。次いで、それらを、重複ＰＣＲにおいてテンプレートとして使用して、５’および３’隣接領域両方を含む大きなＰＣＲ生成物（１．５Ｋｂ）を生成した。その重複ＰＣＲ生成物を、クローニング宿主としてＴｏｐ１０ Ｅ．ｃｏｌｉを使用して、ｐＪＢ３８においてＥｃｏＲＩ－ＳａｌＩ部位でクローニングした。クローンを選択し、プライマー１４２３－５Ｆおよび１４２３－３Ｒを使用するＰＣＲによってスクリーニングして、１．５ＫｂのＰＣＲ生成物を検出した。プラスミドＤＮＡをまた単離し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩによって消化して、ベクター骨格（７．０Ｋｂ）および挿入物（１．５Ｋｂ）の両方のフラグメントを検出した。正確なＳＥ１４２３ノックアウトプラスミド（ｐＪＢ－１４２３ＫＯ）のクローンを、ｄａｍ－／ｄｃｍ－ Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｇｍ２１６３へと形質転換した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用することによって２つのＧｍ２１６３形質転換体クローンから単離し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩでの制限消化（上記のとおり）によってチェックした。
実施例２． 三重ノックアウト株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２Δｄａｔ）の生成
Ｇｍ２１６３から単離したｐＪＢ－１４２３ＫＯプラスミドを、ＴＡＳ＋クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）のプレートを使用して、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株のコンピテント細胞（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）へと形質転換した。形質転換体におけるｐＪＢ－１４２３ＫＯプラスミドの存在を、プライマー１４２３－５Ｆ（ＥｃｏＲＩ）および１４２３－３Ｒ（ＳａｌＩ）を使用して、１．５ＫｂのＰＣＲ生成物を検出することによって確認した。試験した全ての２６個のクローンにおいて、１．５ＫｂのＰＣＲ生成物を観察した一方で、２．３ＫｂのＰＣＲ生成物を、ＳＥ宿主細胞に由来する細胞溶解物を含む反応において観察した。２つの確認したクローンの細胞は、ＴＳＡ＋Ｃｍ（１０μｇ／ｍＬ）＋Ｄ－アラニン（４０μｇ／ｍＬ）の新しいプレート上で画線培養した。プレートを、相同組換えを介するプラスミド組み込みに関して、４３℃において２４時間、インキュベートした。単離したコロニーを、４３℃において精製のために再び画線培養した。４個の単離されたコロニーを、２回目の相同組換えを介してプラスミド骨格を除外するために、２５０ｍＬ バッフル付き振盪フラスコ中で５０ｍＬ ＴＳＢ＋Ｄ－アラニン（４０μｇ／ｍＬ）へと接種した。その培養物を、３０℃において２４時間振盪した。０．５ｍＬ 培養物のアリコートを、５０ｍＬ 新鮮培地を含むフラスコへと移した。移動を３回反復した。そのフラスコからの細胞を、ＴＳＡ＋アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ ２μｇ／ｍＬ）＋Ｄ－アラニン（ＤＡ， ４０μｇ／ｍＬ）上でプレートした。３０℃でのインキュベーションの２日後に、約１００～２００個のコロニーは、１０－５希釈において１００μｌの培養物でプレートしたプレート上に形成された。上記コロニーのさらなる分析を、以下に記載する。
Ｇｍ２１６３から単離したｐＪＢ－１４２３ＫＯプラスミドを、ＴＡＳ＋クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）のプレートを使用して、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株のコンピテント細胞（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）へと形質転換した。形質転換体におけるｐＪＢ－１４２３ＫＯプラスミドの存在を、プライマー１４２３－５Ｆ（ＥｃｏＲＩ）および１４２３－３Ｒ（ＳａｌＩ）を使用して、１．５ＫｂのＰＣＲ生成物を検出することによって確認した。試験した全ての２６個のクローンにおいて、１．５ＫｂのＰＣＲ生成物を観察した一方で、２．３ＫｂのＰＣＲ生成物を、ＳＥ宿主細胞に由来する細胞溶解物を含む反応において観察した。２つの確認したクローンの細胞は、ＴＳＡ＋Ｃｍ（１０μｇ／ｍＬ）＋Ｄ－アラニン（４０μｇ／ｍＬ）の新しいプレート上で画線培養した。プレートを、相同組換えを介するプラスミド組み込みに関して、４３℃において２４時間、インキュベートした。単離したコロニーを、４３℃において精製のために再び画線培養した。４個の単離されたコロニーを、２回目の相同組換えを介してプラスミド骨格を除外するために、２５０ｍＬ バッフル付き振盪フラスコ中で５０ｍＬ ＴＳＢ＋Ｄ－アラニン（４０μｇ／ｍＬ）へと接種した。その培養物を、３０℃において２４時間振盪した。０．５ｍＬ 培養物のアリコートを、５０ｍＬ 新鮮培地を含むフラスコへと移した。移動を３回反復した。そのフラスコからの細胞を、ＴＳＡ＋アンヒドロテトラサイクリン（ＡＴＣ ２μｇ／ｍＬ）＋Ｄ－アラニン（ＤＡ， ４０μｇ／ｍＬ）上でプレートした。３０℃でのインキュベーションの２日後に、約１００～２００個のコロニーは、１０－５希釈において１００μｌの培養物でプレートしたプレート上に形成された。上記コロニーのさらなる分析を、以下に記載する。
実施例３． 三重ノックアウト株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２Δｄａｔ）におけるＤ－アラニン栄養要求性に関する試験
ＴＳＡ＋ＡＴＣ＋ＤＡプレートからの合計２５個の単離されたコロニーを、ＴＡＳプレート上におよびＴＡＳ＋ＡＴＣ＋ＤＡプレート上にパッチ状にまとめた。プレートを、３０℃において一晩インキュベートした。全てのクローンを、Ｄ－アラニン補充プレート（ＴＳＡ＋ＡＴＣ＋ＤＡ）上で十分に増殖させた。図１に示されるように、３個のクローン（＃７、＃１２および＃１８）は、Ｄ－アラニン補充なしのＴＳＡ上では増殖できず、Ｄ－アラニン栄養要求性を示した。栄養要求性の表現型を、ＴＳＡ＋ＡＴＣ＋ＤＡプレート上のパッチからの細胞をＴＳＡプレート上で再びパッチ上にまとめたときに、再び観察した。ＴＳＡ＋ＡＴＣ＋ＤＡプレートからの幾つかのクローンが、野生型ＳＥ１４２３遺伝子座を保持することが予測されたことに留意のこと。なぜなら第２回の相同組換えが、ＳＥ１４２３をノックアウトすることなく、プラスミド骨格の除去を生じ得たからである。
ＴＳＡ＋ＡＴＣ＋ＤＡプレートからの合計２５個の単離されたコロニーを、ＴＡＳプレート上におよびＴＡＳ＋ＡＴＣ＋ＤＡプレート上にパッチ状にまとめた。プレートを、３０℃において一晩インキュベートした。全てのクローンを、Ｄ－アラニン補充プレート（ＴＳＡ＋ＡＴＣ＋ＤＡ）上で十分に増殖させた。図１に示されるように、３個のクローン（＃７、＃１２および＃１８）は、Ｄ－アラニン補充なしのＴＳＡ上では増殖できず、Ｄ－アラニン栄養要求性を示した。栄養要求性の表現型を、ＴＳＡ＋ＡＴＣ＋ＤＡプレート上のパッチからの細胞をＴＳＡプレート上で再びパッチ上にまとめたときに、再び観察した。ＴＳＡ＋ＡＴＣ＋ＤＡプレートからの幾つかのクローンが、野生型ＳＥ１４２３遺伝子座を保持することが予測されたことに留意のこと。なぜなら第２回の相同組換えが、ＳＥ１４２３をノックアウトすることなく、プラスミド骨格の除去を生じ得たからである。
Ｄ－アラニン栄養要求性株であるクローンを、さらに分析した。これらの１４２３ＫＯ ＳＥクローンを、ＴＳＡ＋Ｃｍ（１０μｇ／ｍＬ）上でパッチ状にまとめた場合、それらは増殖しなかった。これは、クロラムフェニコール選択マーカーを含むプラスミド骨格の第２回の相同組換えの間の除去を示す。プライマーＪＢ－Ｃｍ－ＦおよびＪＢ－Ｃｍ－Ｒ（表１）を使用するＰＣＲはまた、抗生物質耐性マーカーの喪失を確認した（データは示さず）。プライマー１４２３－５Ｆおよび１４２３－３Ｒを使用するＰＣＲは、これらのＫＯクローンにおいて１．５ＫｂのＰＣＲ生成物を検出した一方で、ＳＥ宿主に由来するＰＣＲ生成物は、予測されるように、２．３Ｋｂであった（図２Ａ）。野生型ＳＥ細胞は、プライマー１４２３－Ｆおよび１４２３－Ｒ（ともに、ＳＥ１４２３コード配列に特異的）を使用して、０．７ＫｂのＰＣＲ生成物を生成した；このＰＣＲ生成物は、ＫＯプラスミドＤＮＡから、および推定ＫＯクローンから検出されなかった（図２Ｂ）。
従って、全ての実験データに基づいて、ＳＥ１４２３（ｄａｔ， Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ）を、成功裡に二重アラニンラセマーゼ遺伝子ノックアウト株において欠失し、三重ノックアウトＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２Δｄａｔ）を生成したことが結論づけられ得る。さらに、所望のＤ－アラニン栄養要求性が、三重ノックアウト株にいて観察された。
Ｄ－アラニンは、細菌細胞ペプチドグリカンの合成に必要とされる。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉでは、Ｄ－アラニン栄養要求性のためにアラニンラセマーゼ遺伝子を欠失することは十分であった。しかし、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓにおいてこの表現型を確立するには、２種のアラニンラセマーゼ遺伝子（ａｌｒ１、ａｌｒ２）およびＤ－アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子ｄａｔ（ＳＥ１４２３）を、ノックアウトしなければならない。明らかに、グルタミン酸ラセマーゼおよびＤ－アラニンアミノトランスフェラーゼの組み合わせは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＭＲＳＡ１３２（Ｍｏｓｃｏｓｏら， ２０１７）およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら， １９９８）において報告されるように、アラニンラセマーゼへの実行可能な迂回路を提供する。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓゲノムは第３の推定アラニンラセマーゼホモログ（ＳＥ１７６９）を含むが、この研究において使用される実験条件下でＤ－アラニン栄養要求性のためにこの遺伝子をノックアウトすることは必要ではない。
Ｄ－アラニン栄養要求性Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株の成功裡の開発に伴って、次の工程は、選択マーカーとしてアラニンラセマーゼ遺伝子を含む発現ベクターを使用してその株を形質転換することである。形質転換体は、Ｄ－アラニン宿主栄養要求性のプラスミド補完によって選択される。
均等物
当業者は、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または単に慣用的な実験法を使用して確認し得る。このような均等物は、以下の請求項によって包含されることが意図される。
参考文献
当業者は、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または単に慣用的な実験法を使用して確認し得る。このような均等物は、以下の請求項によって包含されることが意図される。
参考文献
Claims (16)
- 組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌であって、
２種の不活性化アラニンラセマーゼ遺伝子（Δａｌｒ１Δａｌｒ２）；および
不活性化Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子、
を含む組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌。 - 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、成長に関してＤ－アラニンに依存する、請求項１に記載の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌。
- 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびその亜種である、請求項１に記載の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌。
- 前記Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、１またはこれより多くのさらなる変異をさらに含む、請求項１に記載の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌。
- 組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を作製する方法であって、前記方法は、
（ｉ）Ｄ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）ノックアウトを含むプラスミドを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株（ＳＥΔａｌｒ１Δａｌｒ２）のコンピテント細胞に形質転換する工程；
（ｉｉ）形質転換した細胞において前記ノックアウトプラスミドの存在を検出する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において識別された前記形質転換した細胞をインキュベートする工程；および
（ｉｖ）単離したコロニーを精製する工程、
を包含する方法。 - 前記単離したコロニーを、Ｄ－アラニン栄養要求性に関して試験する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
- 形質転換体におけるノックアウトプラスミドの存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して検出される、請求項５に記載の方法。
- 前記組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）およびその亜種である、請求項５に記載の方法。
- 請求項５に記載の方法によって生成される、組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌。
- 請求項１～４または９のいずれか１項に記載の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌を含むキット。
- 被験体において発疹を処置または防止する方法であって、前記方法は、前記被験体に、請求項１～４または９のいずれか１項に記載の組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細菌の集団を、前記被験体において発疹を処置または防止するために有効な量において投与する工程を包含する方法。
- 発疹を有する前記被験体は、がん処置を受けている最中である、請求項１１に記載の方法。
- 前記がん処置は、放射線療法である、請求項１２に記載の方法。
- 前記がん処置は、化学療法である、請求項１２に記載の方法。
- 前記化学療法は、上皮増殖因子インヒビターを含む、請求項１４に記載の方法。
- 前記化学療法は、チェックポイントインヒビターを含む、請求項１４に記載の方法。
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