JP5813512B2 - リボフラビンの生産方法 - Google Patents
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Description
a)ヌクレオチド配列配列番号1を含むかまたはそれからなる、核酸分子;
b)アミノ酸配列配列番号2を含むかそれからなる、ポリアミノ酸分子(蛋白質)をコードする核酸分子;
c)a)またはb)の核酸分子と少なくとも70%の相同性を有する核酸分子;
d)ストリンジェントな条件下で、a)またはb)の核酸分子の1つとハイブリダイズする核酸分子;および
c)CcpCタイプの転写因子の機能/活性を有する蛋白質をコードし、変異した核酸分子が、CcpC野生型の活性と比較して、CcpC蛋白質の活性低下をもたらす少なくとも1つの遺伝子変異を示す、a)またはb)による核酸分子の断片および/または類似体、
からなる群から選択される、
とりわけ、CcpCタイプあるいはその相同体またはオルソログに由来する、「変異した」転写因子をコードする、−好ましくは単離された−変異した(修飾された)核酸分子に関する。
a)少なくともアミノ酸配列配列番号2を含むかそれからなるポリアミノ酸分子;
b)上記の特徴を有する核酸分子によりコードされるポリアミノ酸分子;
c)a)またはb)の分子と少なくとも70%の相同性を有するポリアミノ酸分子;および
d)CcpCタイプの転写因子の機能を有する、a)またはb)のポリアミノ酸分子の少なくとも1つの断片および/または類似体、
からなる群から選択される、ポリアミノ酸分子(蛋白質またはポリペプチド)、好ましくは、単離物として存在する分子であって、
ここでa)〜d)の蛋白質は野生型CcpCであり、−上述の通り−修飾されて、その結果として転写因子としての活性が低下する。
a)本発明にしたがって修飾された宿主細胞の提供、
b)宿主細胞におけるリボフラビンの合成を可能にする、好適な培地中および好適な培養条件での、修飾された宿主細胞の培養、および任意選択的に、
c)修飾された宿主細胞および/または培地からの、リボフラビンの単離
を含む、バイオテクノロジーによるリボフラビン合成方法にも関する。
[実施例]
CcpCの活性の変化を伴うリボフラビン生産量のシミュレーション
本発明による活性変化、とりわけ転写因子CcpCの活性低下を伴う、宿主細胞におけるリボフラビン合成の代謝フラックス分布を予測するために、第1ステップで、CcpCの活性変化を確認し、CcpCにより制御される遺伝子に及ぼすそれらの影響を、「Network Component Analysis」(NCA)および遺伝子発現時系列で定量化した。転写因子活性の影響を予測するために、開始フラックス分布の制御されたフラックスを転用し、次いで、二次凸最適化により、新しい代謝流れ分布を算出する。例として、グルコースを用いた好気生育中に、リボフラビン産生バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)菌株を使用して、シミュレーションを実施した。
CcpC−欠損菌株の発生
宿主細胞バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)における転写因子CcpCのノックアウト変異体を作製するために、バチルス・スブチリス(B.subtilis)のゲノムのオリジナルccpC遺伝子座に、抗生物質耐性遺伝子カセットを導入した。
選択されたリボフラビン過剰生産菌株へのccpCノックアウトのトランスファー
リボフラビンを過剰生産する選択されたバチルス・スブチリス(B.subtilis)菌株にccpCノックアウトをトランスファーするために、ファージPBS−1による形質導入を使用した(国際公開第07/051552号パンフレット、実施例6を参照されたい)。菌株BS5878のPBS−1ファージ溶菌液を作製した。形質導入に使用したリボフラビン生産株BS3914およびBS3917は、以下の通りに作製した:菌株BS3914およびBS3917は、リボフラビン−過剰生産菌株BS3534の子孫である(BS3534の構築に関しては、国際公開第2007/051552号パンフレットを参照されたい)。BS3534は、欧州特許第405370号明細書に記載され、またNRRLB−18502の番号で寄託された、菌株バチルス・スブチリス(B.subtilis)RB50に基づく。菌株BS3914およびBS3917において、リボフラビン遺伝子座に組み込まれたプラスミドpRF69を、ネオマイシン耐性遺伝子カセットに置き換えた。対応するPCR産物を作製するために、上述のPCR法を使用した。PCR産物は、バチルス・スブチリス(B.subtilis)168のゲノムDNA上のリボフラビンオペロンプロモーター(プライマー対p50;配列番号22およびp51;配列番号23)から上流に526bp長の3’領域、およびPCRを用いてネオマイシン耐性遺伝子カセット(プラスミドpUB110上のプライマーp9およびp10)と融合させた、バチルス・スブチリス(B.subtilis)168のゲノムDNA上のribD遺伝子(プライマー対p44;配列番号24およびp45;配列番号25)における502bp長の5’領域からなる。正確な反応条件は、さらに上に記述されている。精製したPCR産物を、コンピテントなバチルス・スブチリス(B.subtilis)168細胞の形質転換に使用した。選択は、100mg/lリボフラビンおよび2mg/lネオマイシンを含有するTBABプレートで行われた。成長したコロニーの遺伝子型は、PCRおよび配列決定を用いて確認した。確認され、単離された1つの形質転換細胞は、BS3813と名付けられた。菌株BS3534に構築物をトランスファーするために、BS3813のPBS−1ファージ溶菌液を作製した。このように作製された菌株は、BS3798と名付けられた。
Claims (10)
- 非修飾の微生物または野生型微生物におけるリボフラビン合成と比較して、少なくとも10%、リボフラビン合成を増加させるための、バチルス(Bacillus)属から選択される修飾されたリボフラビン産生微生物の使用であって、
前記修飾されたリボフラビン産生微生物が、活性なspo0A遺伝子を有し、
前記修飾されたリボフラビン産生微生物が、CcpCタイプの転写因子の発現および/または活性が、非修飾の微生物または野生型微生物と比較して、少なくとも25%減少し、
前記修飾されたリボフラビン産生微生物のCcpCをコードする遺伝子がノックアウトされていることを特徴とする、微生物の使用。 - 前記修飾されたリボフラビン産生微生物が、少なくとも1つの変異を、前記CcpCタイプの前記転写因子によって制御される少なくとも1つの遺伝子の1つまたは複数の結合配列に含むことを特徴とする、請求項1に記載の微生物の使用。
- 前記修飾されたリボフラビン産生微生物が、遺伝子citZおよび/またはcitBの結合配列に、少なくとも1つの変異を含むことを特徴とする、請求項2に記載の微生物の使用。
- 前記修飾されたリボフラビン産生微生物が、配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15による配列に、少なくとも1つの変異を含むことを特徴とする、請求項3に記載の微生物の使用。
- 前記CcpCタイプの前記転写因子をコードする遺伝子が、
a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸分子;
b)配列番号2の蛋白質をコードする核酸分子;及び
c)ストリンジェントな条件下で、a)またはb)の核酸分子の1つとハイブリダイズする核酸分子であって、前記ストリンジェントな条件が、42℃にて2時間〜4日間のインキュベーション、続いて室温にて2×SSC、0.1%SDS中で5〜15分間、2回の洗浄、さらに65〜68℃にて0.5×SSC、0.1%SDS中、または0.1×SSC、0.1%SDS中で15〜30分間、2回の洗浄を含む、核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含むことを特徴とする、請求項1に記載の微生物の使用。 - 前記リボフラビン産生微生物が、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquifaciens)及びバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の微生物の使用。
- バチルス(Bacillus)属から選択される修飾されたリボフラビン産生微生物の培養を含むことを特徴とする、リボフラビンを生産するための方法であって、
前記修飾されたリボフラビン産生微生物が、活性なspo0A遺伝子を有し、
前記修飾されたリボフラビン産生微生物が、CcpCタイプの転写因子の発現および/または活性が、非修飾の微生物または野生型微生物と比較して、少なくとも25%減少し、
前記修飾されたリボフラビン産生微生物の前記CcpCをコードする遺伝子がノックアウトされており、
リボフラビン合成が、非修飾の微生物または野生型微生物におけるリボフラビン合成と比較して、少なくとも10%増加される、方法。 - a)リボフラビン生産に好適な発酵条件で前記修飾されたリボフラビン産生微生物を培養するステップ、および、
b)培地および/または前記修飾されたリボフラビン産生微生物からリボフラビンを単離するステップ
を含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。 - 前記CcpCタイプの前記転写因子をコードする遺伝子が、
a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸分子;
b)配列番号2の蛋白質をコードする核酸分子;及び
c)ストリンジェントな条件下で、a)またはb)の核酸分子の1つとハイブリダイズする核酸分子であって、前記ストリンジェントな条件が、42℃にて2時間〜4日間のインキュベーション、続いて室温にて2×SSC、0.1%SDS中で5〜15分間、2回の洗浄、さらに65〜68℃にて0.5×SSC、0.1%SDS中、または0.1×SSC、0.1%SDS中で15〜30分間、2回の洗浄を含む、核酸分子からなる群から選択される核酸分子を含むことを特徴とする、請求項7に記載の方法。 - 前記リボフラビン産生微生物が、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquifaciens)およびバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
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