JPH03505672A - 高分子合成オペロンの相補アンチセンス オリゴヌクレオチド抗菌、バクテリヤ感染の処置方法 - Google Patents
高分子合成オペロンの相補アンチセンス オリゴヌクレオチド抗菌、バクテリヤ感染の処置方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
高分子合成オペロンの相補アンチセンス オリゴヌクレオチド抗菌、バクテリヤ
感染の処置方法
技術分野
この発明はメツセンジャRNAをバインドする非転写オリゴヌクレチオードに関
する。
より特別にはバクテリヤの高分子合成オペロンからトランスクライブされたメツ
センジャRNAをバインドする非転写オリゴヌクレチオードに関する。またこの
発明はバクテリヤに非転写オリゴヌクレチオードを導入することによるバクテリ
ヤ感染に関する。またこの発明はバクテリヤの高分子合成オペロンの遺伝子領域
内における特有のシーケンスに非転写オリゴヌクレチオードをバインドすること
によって、バクテリヤのアイデインナイフイケーションする方法に関する。また
この発明はMMSオペロンタンパク質生酸生成物めの認識シーケンスとして作用
することで知られているオリゴヌクレオチドを使用することによって生ずる高分
子合成オペロン遺伝子の競走的抑制によるバクテリヤ感染の取扱いに関する。
発明の背景
合成りNA、RNA及びバクテリヤのタンパク質を初期的に含む遺伝子は、高分
子合成オペロン(MMS)と命名されている単一ユニットに含まれていることは
知られている。この遺伝子は単一のトランスクリブションユニットの一部であっ
て、rpsUで初期的トランスレーションに含まれるリポソームタンパク質S2
1として、dnaGで初期DNA複製のタンパク質として、rpoDで初期トラ
ンスレーションを含むシグマ70としてコード化されている。オペロン構造体は
例えば大腸菌、ネズミチフス菌のようなグラム陰性バクテリヤ、及び枯草菌のよ
うなグラム陽性バクテリヤの両方に発見される。個々の構造的遺伝子は保全され
、大きな範囲の同族関係をもっている。他方オペロン内の構造的遺伝子間の遺伝
子間シーケンスは、各バクテリヤの種に対して特異である。MMSオペロンは遺
伝情報の流れを指向する中央情報処理とみなされる。オペロンの組織はある生理
遺伝条件下でセル内における高分子(DNA、RNA及びタンパク質)の合成情
報の座標、したがって初期遺伝子の共変動率のために必要である。各クラスの高
分子合成物が初期工程に変動され、MMSオペロンの変動は変動セル内における
成長に最も大きな役割を演する。
MMSオペロンは3つの構造的遺伝子を含んでいる。rpsU遺伝子は初期のメ
ツセンジャRNA (mRNA)のトランスレーションのために必要なリポソー
ムタンパク質S21としてコード化している。タンパク質S21は16S rR
NAの3′端部に位置するShine−Dalgarnoと呼ばれるmRNAリ
ポソームバインドに対して補足的なリポソームRNA (rRNA)のストレッ
チと相互に作用する。
コリシンE3は16s rRNAの3′端部から50ヌクレオチドを除去する。
E3処理されたリポソームは、初期のポリペプチドもその鎖の延長も実行するこ
とができない。再構成試験において、E3処理されたリポソームは321を除く
すべての3OSタンパク質をバインドする。RNAタンパク質の交鎖試験は、タ
ンパク質S21が16S rRNAの3′ドデカヌクレオチドと交鎖することを
示している。16SrRNAの3′端部の塩基対ポテンシャルはEコイルの初期
及びフェーズMS2mRNAトランスレーションの所期状態のために必要な30
S副ユニツトの機能的状態及び321の存在によって決まる。
DNA複製の初期はドナG遺伝子生成物のプリマス(primase)によって
合成されたブライミングRNAを必要とする。このタンパク質は複製のフェーズ
G4オリジンをバインドする。プリマスはまた複数エンザイム複合プリモリモサ
ムと共働してE、coliのフォーク状上木の雑種複製にオカザキ破片の当初合
成に着手することが知られている。
プリマスはE、 co l iのオリジンにDNA複製に着手するために必要な
ブライミングエンザイムである。ドナG遺伝子におけるpar B突然変異は雑
種における不正規部分を招き、感染性突然変異体として作用するDNA合成体と
細胞状の分割物として隔離する。このようにしてDNAの複製の着手に、ドナG
遺伝子がセル分割を調節する役割を演するようにみえる。rpoD遺伝子の生成
物シグマ−70は、RNA トランスクリブションの着手のための認識プロモー
タシーケンスの中に含まれる。シグマ−70はプロモータシーケンスのだめの特
異性を授けるコアポリメラーゼα、ββ′と共働する。シグマ−70はRNAポ
リメラーゼシグマ要素の大きな族のメンバである。このようにして高分子組成物
オペロン遺伝子は、共通のメカニズムの一部を占める。タンパク質核酸とMMS
オペロンの遺伝子生成物との共働をとおして、特殊な核酸シーケンスを連結する
。例えばS21はShi−ne−Da1garnoシーケンス/リポソームパイ
ンディングサイトを連結し、プリマスは複製のオリジンを連結し、シグマ−70
はプロモータシーケンスを連結する。このような相互作用はタンパク質、DNA
又はRNAそれぞれの合成物の生成をもたらす。
アンチセンスRNA5は遺伝子圧搾を自然に、しかも試験的に利用される。例え
ばアンチセンスRNAはバクテリオファージP22の開発において、プラスミド
DNAコピー数の制御で重要である。アンチセンスRNA5はDrosophi
−1a hsp23からm RN Aコードのvitroトランスレーションに
おける特殊な抑制と、Rous肉腫ウィルスの複製と、腫瘍遺伝子が指向された
際の373セルの増殖とを抑制するために試験的に使用されている。さらに短ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子表現を抑制できるので、全面的にアンチ
センスmRNAを使用する必要はない。これはクロラムフェニコールアセチルト
ランスファラーゼ遺伝子表現の抑制と、Nタンパク質当初サイトを抑制すること
によって、細胞状の口内ビールスの抗ウイルス活動を抑制することにみられる。
c−myc腫瘍遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Sフェーズ
へのエントリを抑制するが、G、からG、への進展の際は抑制しない。結局核増
殖の抑制は、アンチセンスオリゴヌクレオチドをPCNAサイクリンに使用する
ことによって示された。
抗生物質は人間を含む各種の動物の感染性疾患のために重要な薬品である。抗生
物質の大量の使用と効力は、最小のダメージをもって、または病原性有機体を宿
す真核細胞を細面から助けて、バクテリヤ(原核生物)の核成長を妨害する結果
をもたらす。すべての抗生物質は遺伝子伝達の通常の流れをもって干渉すること
によってバクテリヤを破壊する。
これはつぎのいずれか1つの抑制によって達成される。
DNA複製、すなわちDNAから5DNA (例えばノボビオシン及びナリジキ
ン酸)、トランスクリブション、すなわちDNAからRNA (例えばリフアン
ビン(Rifampin) )トランスレーションすなわちRNAからタンパク
質(例えばテトラサイクリン、エリスロマイシン及びカマニシン(Kamany
cin)) 、又は核壁合成物(例えばペニシリン)。
この発明は新しいクラスの抗生物質と、一般的に又は特別にバクテリヤ感染の処
置方法を提供するにある。この抗生物質はアンチセンスオリゴヌクレチオードシ
ーケンスであって、MMSオペロンからトランスクライブされたmRNAをバイ
ンドする。これはバクテリヤの成長と複製とを調節する基本的な構造ユニットで
干渉することによって、バクテリヤの感染を処置する方法である。
発明の概略
本発明の目的は、バクテリヤ感染の処置方法を提供するにある。
この発明の付加的目的は、バクテリヤ感染を処置するアンチセンスオリゴヌクレ
オチドを用いることにある。
この発明の他の目的は、バクテリヤを認識するための方法にある。
この発明の付加的目的は、バクテリヤにおける高分子合成物オペロンの作動を妨
げる抗生物質を提供するにある。
この発明の他の目的は、高分子オペロン遺伝子生成物ヌクレオチド承認部位で干
渉する競合抑制剤を用いることにある。
このように前記の目的を達成するに当り、この発明の1つの特徴により、アンチ
センスオリゴヌクレオチドを前MMSオペロンからのトランスクリプトされたm
RNAに結合する工程を含むMMSオペロンの表現を抑制する方法を提供するに
ある。アンチセンスオリゴヌクレオチドシーケンスは、m RN Aにおけるユ
ニークな遺伝子シーケンスに特別なものとすることができ、もしくはバクテリヤ
ひずみ又はこれらの組合わせ間で異種同形であるシーケンスをmRNAのリージ
ョンにとって特別なシーケンスとなることができる。
二の発明の他の特徴は、アンチセンスオリゴヌクレオチド抗生物質をMMSオペ
ロンからトランスクライブしたmRNAへ結合することにより、MMSオペロン
の表現を妨げることによって、バクテリヤ感染を処置する方法である。
提示実施例において、アンチセンスオリゴヌクレオチド抗生物質は、次のシーケ
ンスから選択することができる。
5’CATCCAAAGCAGTGGTAAAACTGTTT3’ (AOAM
MS−dnaG) 。
5’TCACCGATCGGCGTTTCCA3’ (AOAMMS−rpoD
) 。
5’GGCCCCGATTTTTAGCAA3’ (AOAMMS−Eco)
。
5’CTTGCGTAAGCGCCGGGG3’ (AOAMMS−5ty)及
び5’TATTCGATGCTTTAGTGC3’ (AOAMMS−Bsu)
、この発明の他の特徴は、ユニークな遺伝子間アンチセンスオリゴヌクレオチド
をMMSAオペロンからトランスクライブしたmRNAに結合する工程を有し、
種の特殊のMMSオリゴヌクレオチドと与えられたバクテリヤ種のMMSオペロ
ンからトランスクライブされたm RN Aとの間の結合量を決定するバクテリ
ヤの検出又は認識するための方法である。
バクテリヤ感染の処置又はバクテリヤの認識において、アンチセンスオリゴヌク
レオチドは少くともIOヌクレオチド(10mer)である。提示実施例では1
6ないし26merのオリゴヌクレオチドが使用される。
この発明の付加的な特徴は少くともlOヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌク
レオチド抗生物質を提供するにあり、前記オリゴヌクレオチドはMMSオペロン
からトランスクライブされたmRNAに結合する。抗生物質の1実施例ではさら
にバクテリヤへのオリゴヌクレオチドの吸収を確実にするためオリゴヌクレオチ
ドに連結された担体分子を有する。担体分子はアミノ酸でよく、l実施例ではロ
イシンである。他の実施例ではオリゴヌクレオチドの3′端部はバクテリヤ吸収
後エキソノクレアーゼによりオリゴヌクレオチドの減成を避けるため誘導される
。
他のさらに別の目的、特徴、利点は添付図面に関連してこの発明を開示する目的
をもって提示された実施例についての下記の説明から明らかになる。
図面の簡単な説明
第1図は図式的に示されたMMSオペロンを示し、トランスレーション(rps
U) 、複製(ドナG)、トランスクリプシヨン(rpoD)の開始に含まれる
3つの遺伝子を含む図面である。
第2図はE、coli MMSオペロンの調整の説明図である。
MMSオペロンにおける3つの遺伝子は閉鎖ボックス内に描かれている。cis
−作用調整シーケンスは、助触媒(Px。
P、、P、、 P、、Pa、 Pb、 Ph5) 、明暗境界線(T、、 T、
)、Lexa結合部位、ナツトeq及びRNAプロセッシング部位を有する。ト
ランス作用要素はそれらが作用すると思われるところに矢印で示されている。N
uSAタンパク質はrp。
D遺伝子の表現を増大するが、その作用部位は知られていない。グローバル調整
ネットワークがSOS、熱衝撃、有力なレスポンスを含むMMSオペロンと相互
作用をする。
orfxのための機能的役割は譲られなしくが、E、coli及びtyphim
uriumにおける近接Px、 orfxシーケンスの保存が可能なMMSオペ
ロン調整役割を支持している。いくつかの他の開放読取枠が、非譲渡機能をもっ
て上流側にあり、E、coli雑種上に一番近くマツプされた雑種が14kb離
れたCCa遺伝子である。
第3図は異る種におけるMMSオペロンの比較図である。
MMSオペロンの構造はE、coli、 S、typhimurium及びB、
5n−btilisに対して決定される。遺伝子はコードン(codon)決定
を含む基礎対(bp)内で与えられた寸法をもって開放ボックスによって示され
ている。遺伝子間シーケンスの寸法は、下記のように与えられる。除触媒(P)
の位置が示されている。AOAMMS−EcoはE、coli MM Sオペロ
ンrpsU−ドナG遺伝子間シーケンスの補助的なものである。AOAMMS−
5tyはS、TyphimuriumM M Sオペロンrps IJ−ドナG
遺伝子間シーケンスの補助的なものである。AOAMMS−BsuはB、sub
ti1isMMsオペロンrpsU−ドナG遺伝子シーケンスの補助的なもので
ある。
第4図はロイシンを付加的に含む5′形アンチセンスオリゴヌグレオチド抗生物
質を示す。
第5図は3′形アンチセンスオリゴヌクレオチド抗生物質を示す。
第6図はプリマス遺伝子のためのバクテリヤストレイン間の同族関係を示す。情
報はゲンバンク(Gen Bank)内のDNAシーケンスで作られ、このシー
ケンスはモレキュラバイオロジーインフォメーション リリーセスマルチアライ
ン(Molecular Biology Information Re5o
urces Mul−tialign)プログラムを使用し、タンパク質シーケ
ンスデータの相似サーチを完成する。このデータはタンパク質のアミノ末端をカ
ルボキシル末端部分へ横座標上で左から右へ整列される。数はタンパク質プライ
マリ シーケンスにおけるアミノ酸の位置を表わす、(a)において、B、 5
ub−tilisはE、coliと比較され、(b)においてS、typhim
uriumはE、coliと比較され、(c)においてB、5ubtilisは
S、typ−himuriumと比較される。(d)においてはS、 typh
imuriumとB、5ubtilisプリマスタンパク質シーケンスはアミノ
末端レジオンにおいてE、coliドナGと整列された。上方の文字は、整列さ
れた非現実的アミノ酸を表わし、下方の文字は非整列アミノ酸を表わしている。
ダッシュは整列した実際ベースを表わし、点はギャップを表わしている。データ
はプリマスタンパク質がアミノ末端レジオンにおいて、相似ドメインを占める。
これらのアミノ酸相似の領域を符号化するヌクレオチドシーケンスはまた非常に
異種同形である。
第7図はアンチセンス結合を示す1%アガローズ(aga−rose)ゲルの図
面である。
図面は寸法を計る必要はなく、この発明の特徴は寸法上誇張されているか、又は
明瞭にし、簡単にする目的で図形化して示されている。
詳細な記載
この技術分野における当業者には明らかなように、この発明の請求の範囲及び精
神から離れることなく、ここに開示された発明について種々の変更と変形がなさ
れる。
高分子合成物(MMS)オペロンは、初期トランスレーション、rpsU複製、
ドナG及びトランスクリブション、rpoDに含まれる遺伝子を有する。これら
の遺伝子は第1゜2図で単一の転写ユニット内に含まれており、核の主伝達高分
子の初期合成物中に含まれている。オペロンの組織はある生理遺伝状態下におい
いて、DNA、RNA及び核内におけるタンパク質の合成物の同位化初期遺伝子
の同期調整にとって必要である。各クラスの伝達高分子(DNA。
RNA及びタンパク質)の合成物がその初期工程に調整され、MMSオペロンの
調整は各生長において役割を最大に演する。
MMSオペロンにおいてcis作用調整シーケンスがコードレジオン内に生ずる
。ダラム陰性バクテリヤにおいて、これらはrpsU構造遺伝子内のナツトg部
位及びドナG構造遺伝子内の助触媒Pa、Pb、Phsを含む。B、subti
llisMMSオペロンの助触媒P6はP3.に対して符合化する遺伝子内にあ
る。他のcis作用調整シーケンスは、遺伝子間レジオン明暗境界線T、内に位
置し、RNAプロセッシング部位がドナG −rpo D遺伝子間シーケンス化
に生ずる。このようにして複cis作用調整シーケンスが、このオペロン構造内
の個々の遺伝子表現の差別相関レートと同じく非同位調整を許容する。
コードン使用は個々の遺伝子表現の相対的量に影響する。
コードン優先は核内における等受容tRNA種の相対的集中に反映する。レアコ
ードンの使用は調整遺伝子の低レベル表現を確実にする手段を提供する。ドナG
遺伝子は他のE、coli遺伝子のようにレア3連鎖コードンの数の10倍より
大きく、ドナG mRNAにおけるレアコードンの絶対数は、他の制御遺伝子(
すなわちIac I 、 trpR)のそれより小さい。レアコードンはまたS
、 tphimuriumドナG mRNA及びB、5nbtilisのドナE
遺伝子内に生ずる。MMSオペロン内に作用する付加的な並進調整メカニズムは
、5hine Dalga−rnoシーケンスに補助的な可変度でリボサム結合
部位を生ずることに依頼する。これはE、coliドナG遺伝子にみることがで
き、MMSmRNAのドナGタンパク質にリブサムを不充分に結合する結合リー
ド自由エネルギ内における差異による。これらの両並進的調整メカニズムとも、
レアコード使用及び変換リブサム結合親和性はこのオペロンにおける遺伝子の観
察した非同和性を部分的に述べている。E。
coli核内のMMSオペロンタンパク生成物のための一定の状態の相対的存在
度はプリマスのための321に対して40,000゜シグマ−70のためにほぼ
3000である。
3つのシーケンス化されたMMSオペロンの比較分析派、種々の興味深い特徴(
第3図)を表わす。すべてのオペロンは3つの開放読取枠を含み、オペロンのト
ランスクリブションは5′端部において各種の助触媒によって開始される。主た
る助触媒は重複するヌクレオチドシーケンス(−IO及び−35レジオン)をも
ちcis作用調整シーケンスは小さなレジオンでクラスタされるようにみえる。
各オペロンはドナGまたはドナEのDONA複製開始遺伝内の熱衝撃助触媒Ph
sを含む。E、coli及びS、tphimuriumオペロンは、外部助触媒
P、、 P、、 P、の上流に開放読取フレームorfxを含む。ただ7hpは
E、coliにおいて一35シーケンスPx、 P。
を分離し、これらのシーケンスは実際上、S、 tphimuriumオペロン
内において重複する。
MMSオペロン内の中央遺伝子は初期のDONA複製内に含まれる1つである。
ドナG遺伝子生成物、プリマスは各種の活動をもち、それは(i)プリモサムコ
ンプレックスといっしょでタンパク質−タンパク質の相互作用、(ii)タンパ
ク−核酸のオリジン承認のための相互作用、(iii)プライマRNAを合成す
るためのRNA重合作用、(iv )ドナG遺伝子内におけるパーBの突然変異
によって支持されたクロモサムの区割りにおける役割。ドナG遺伝子を直接トラ
ンスクライブする助触媒はない、5′トランスクリプション明暗境界線、不充分
なリボサム結合部位、レアコードンの発生、レアコードンのクリスタリングは、
この遺伝子の低レベル表現を保持するすべてのメカニズムである。自律的にプラ
スミドを複製する調整助触媒からドナG遺伝子を裏複表現するとホスト核を殺す
。ドナGの直接的な表現の調整は、Tn5突然変異誘発データからくる核生長を
生ずる。MMSオペロン助触媒をもつクローン化されたドナG遺伝子は、複数複
写プラスミド上でホスト核が受容する遅い率で生長する。Tn5をドナG助触媒
レジオンに加入した後、増大したドナG遺伝子表現をリードし、生長率は増大し
たドナG表現が生長するように示される制御レベルに復帰する。パーB突然変異
の隔離はまたクロモサム区画、核***、バクテリヤ核の生長内において、ドナG
のための直接的な役割を指示する。3つのシーケンス化されたMMSオペロンか
らDNA複製初期遺伝子によってコード化されたプリマスタンパク質は幾つかの
相似レジオン(第6図)を含む。
MMSオペロンは非常に複雑な制御下にあり、それは技術的に核生長の調整にと
って重要な制御をされるユニットが期待される。本質的に複雑な調整に付加して
、オペロンは熱衝撃、ストリンゼント応答、及びニスオーニスを含む各種のグロ
ーバルな調整ネットワークと相互作用をする。
このオペロンは単一ユニットとして、また並進的なストラドシック位置決め及び
並進的な制御信号によって独立したユニット・群として調整される方法を含む。
この事実すなわちオペロンはE、coli及びS、 typhimnrinmに
おけると同様であり、B、51htilisにおいて非常に小さくて、そのよう
な構造を発展させる選択的な利点のあることを指示している。
ここで使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、3つのデオキシリボムヌ
レオチド又はリボヌクレオチドより多くが含まれている高分子を規定している。
ここで使用する[異種同形シーケンス」という用語は、バクテリヤ種の中に保存
されたMMSオペロン内のシーケンスを規定し、そのようなシーケンスは種の変
化内の実際と近い。このようにしてこのシーケンスはその同一性が異ったタイプ
のバクテリヤをそれら自身から分離するのに使用することはできないが、各種の
バクテリヤ種を干渉させる単一エージェントによって攻撃することができ場所と
して用いることができる。
ここで使用する「ユニークな遺伝子間シーケンス」という用語は、特殊な遺伝子
間の非コード化DNAの部分を規定している。MMSオペロンにおいて、第3図
に示すように遺伝子間シーケンスはバクテリヤの異るストレインにとってユニー
クである。このようにして特異なシーケンスはバクテリヤの特殊なストレインに
対して特徴を発揮し、バクテリヤを同一化するのに用いられ、またはバクテリヤ
の機能を抑制するのに用いられる。
二二で使用する「アンチセンス」という用語は、オリゴヌクレオチドを限定し、
そのシーケンスはMMSオペロンの検出ストランドの補助となる。アンチセンス
オリゴヌクレオチドはMMSオペロンからトランスクライブされたメツセンジ
ャのRNA分子に補助的な形で結合しくワトラン・クリック(Watson−C
rick)基礎対によって複合体を形成)、MMSオペロンの単一ストランドD
NAを構成する。
ここで使用する「抗生物質」という用語は、MMSオペロンと干渉させて、バク
テリヤの成長を遅くし、それによって成長を阻止し、核の死を誘発することがで
きるオリゴヌクレオチドを意味する。
オリゴヌクレオチドの「微分化」はオリゴヌクレオチドの構造を特異な作用を行
うように変換する((1)5’端部に核内に吸収するように付加し、(2)3’
端部をイグリヌクレオリテイク破壊を免れるようにブロックすること)ことを意
味する。この工程はそれがバクテリヤ内にあるとき、さらに機能的で安定したオ
リゴヌクレオチドを提供する。例えば、3′端部がヌクレオチドと連鎖したホス
ホロジオエートを付加することによって、微分化できる。
この発明の1実施例において、アンチセンス オリゴヌクレオチドをMMSオペ
ロンからトランスグライブしたmRNAに結合する工程を有するMMSオペロン
の表現を抑止する方法を含む。この方法において、アンチセンス オリゴヌクレ
オチドをmRNAに結合し、このm RN AはMMSオペロンからトランスク
ライブされる。アンチセンスオリゴヌクレオチドのmRNAへの結合は、MMS
オペロンによってコード化されたタンパク質にトランスレートすることができる
。mRNAを微分化するために、mRNAの少片がアンチセンス オリゴヌクレ
オチドに結合されなければならない。
アンチセンス オリゴヌクレオチドは、ユニークな抗生物質シーケンスに特殊な
シーケンス、異種同形表現シーケンス及びそれらの組合わせからなる群から選ば
れる。
単一ストランドDNA又はMMSオペロンからトランスクライブされたm RN
Aにコード化された特殊なユニークな抗生物質シーケンスを結合することによ
って、抗生物質は抑制するためのターゲットとすることができ、特殊な型のバク
テリヤを殺すことができる。異種同形シーケンスを結合することによって、抗生
物質は異種同形シーケンスを含む広い範囲のバクテリヤをターゲットにすること
ができる。オリゴヌクレオチドの長さ、又は結合されるm RN Aの位置によ
り、オリゴヌクレオチドは重複し、ユニークなシーケンスと異種同形シーケンス
とを結合する。
m RN Aの作用を阻止するのに必要なオリゴヌクレオチドの長さは不知であ
るが、少くとも10ヌクレオチド(10mer)である。この発明の1実施例に
おいて、オリゴヌクレオチドは16ないし26merの範囲にある。
この発明の付加的な特徴は、バクテリヤの感染を処置する方法であって、前記M
MSオペロンからトランスクライブされたmRNAにアンチャンス オリゴヌク
レオチド抗生物質を結合して、MMSオペロンの表現を抑制する工程を有する。
アンチセンス オリゴヌクレオチド抗生物質は異種同形シーケンス、ユニークな
抗生物質シーケンスまたはそれらの組合わせのいずれかと結合される。シーケン
スの幾つかの例がMMSオペロンの作用を抑制するためにmRNAに結合され、
表1にみられるようにバクテリヤの感染を処置することができる。
表 1
MM5オペロンからトランスクライブされたmRNAに結合されるシーケンス
(])5’CATCCAAAGCAGTGGTAAAACTGTTT3’(AO
AMMS−d n a G)
(2)5’TCACCGATCGGCGTTTCCA3’ (AOAMMS−r
凹皿)(3)5’GGCCCCGATTTTTAGCAA3’ (AOAMMS
−Eco)(4) 5’CTTGCGTAAGCGCCGGGG3’ (A
OAMMS−3ty)(5)5’TATTCGATGCTTTAGTGC3’
(AOAMMS−Bsu)最初の2つのシーケンス(1)(2)は、バクテリヤ
の異種同形シーケンスに結合されて、他のタイプのバクテリヤには向かない。こ
れらのシーケンスはグラム陰性及びグラム非陰性バクテリヤを攻撃するので、広
いクラスのバクテリヤ感染を処置するのに使用される。最後の3つのシーケンス
(3) (4) (5)は特殊バクテリヤにおける特殊シーケンスに結合できる
ユニークな抗生物質シーケンスである。例えばシーケンス(3)はE、coli
に特効がある。このようにしてこのアンチセンスオリゴヌクレオチド抗生物質を
用いると、E、coliのMMSオペロンを抑止するが、他のバクテリヤのMM
Sオペロンは攻撃しない。シーケンス(4)は特にS、 typhimuriu
mのトランスクライブされたmRNAを結合し、シーケンス(5)は特にB、5
ubtilisのmRANを結合する。このようにしてアンチセンス オリゴヌ
クレオチド抗生物質(3) (4) (5)を用いることによって、特殊な抗生
物質が特殊なバクテリヤを殺すのに用いられる。このようにして特殊なバクテリ
ヤストレインの再生産に対してこれを殺し、又は干渉するための処置がターゲッ
トを定めることができる。
提示した実施例において、ユニークなシーケンス、アンチセンス オリゴヌクレ
オチド抗生物質の抗生物質シーケンスの使用は、DNA複製開始遺伝子(ドナG
又はドナE)(第3図)の5′側の抗生物質レジオンに対して補足的なものであ
る。MMSオペロンのこのレジオンは、複製開始遺伝子がオペロン内で低レベル
表現をもっているので選ばれる。さらにE、coli及びS、 typhimu
rium、この遺伝子は明暗境界線からその下流に位置し、他の助触媒によって
直接はトランスクライブされない。m RN Aともっと安定した相互作用をす
るために、アンチセンス オリゴヌクレオチド抗生物質の主シーケンスはGC基
礎対を最大にするように選ばれる。しかし通常シーケンスのユニークさとGC基
礎対の最大化はバランスをもって保持する。
この発明の他の実施例は、バクテリヤの同定方法であり、与えられた種のMMS
オペロンからトランスクライブされたmRNAにユニークな種の特殊な抗生物質
アンチ・センスオリゴヌクレオチドを結合する2種と、前記結合量を決定する工
程とを有する。ユニークなシーケンスは特殊なバクテリヤストレインとのみ結合
し、それによって異ったストレインとは結合せず、特殊なシーケンスをもつスト
レインと結合する。各バクテリヤのストレインはそれ自身のユニークな抗生物質
シーケンスをもち、このシーケンスは各ストレインをユニークに同定するのに用
いられる。MMSオペロンからトランスクライブされたmRNAは全オペロンを
測り、ユニークな抗生物質シーケンスを含む。これらのユニークなシーケンスと
結合するオリゴヌクレオチドを指定することによって、記相と処置はユニークな
シーケンスをもつバクテリヤストレインにおいて、MMSオペロンの作用に干渉
するように仕立てられる。このようにして各種のアンチセンス オリゴヌクレオ
チド プローブを用いることによって、バクテリヤは各個のストレインのための
タイプ化が可能である。結合量はラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、抗体、
化学物質を含む当業者には良く知られている各種の方法で決定される。例えばユ
ニークな種特殊抗生物質アンチセンス オリゴヌクレオチドは、ビオチンとラベ
ルされることができ、ストレッグ(Strep)アビジン複合体、又は蛍光物質
札によって同定される。
例えば表1シーケンス(3)のアンチセンス オリゴヌクレオチドはE、col
iに使用されることができ、シーケンス(4)のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドはS、typhimuriumの同定に使用することができ、シーケンス(5
)のアンチセンスオリゴヌクレオチドはB、5ubtilisの同定に使用する
ことができる。当業者は付加的なMMSオペロン抗生物質シーケンスは、シーケ
ンス化された付加的バクテリヤがアンチセンス オリゴヌクレオチドをユニーク
な抗生物質シーケンスに合成することによって同定することができることを知っ
ている。 バクテリヤのアンチセンス オリゴヌクレオチドの長さのタイプ化に
おいて、ユニークシーケンスに特別に嵌合するのに必要な寸法によって決定され
る。
オリゴヌクレオチドは少くとも10merである。l実施例ではシーケンスは、
16ないし26merの間にある。提示シーケンスの例は表1シーケンス(3)
(4) (5)にみられる。
アンチセンス オリゴヌクレオチド抗生物質をMMSオペロンからトランスクラ
イブされたmRANに結合することによってMMSオペロンの作用に効果的に干
渉させるために、アンチセンス オリゴヌクレオチド抗生物質はバクテリヤ核に
入らなければならない。あるオリゴヌクレオチドはあるバクテリヤ核(ハエモフ
イラス(Haemmaphillns) )によって取上げることができ、他の
オリゴヌクレオチドは吸収を確実にするために、変形される必要がある。このよ
うにして例えばアミノ酸のような担体分子をオリゴヌクレオチドに連鎖させる必
要がある。第4図においてオリゴヌクレオチドは、これに担体分子を付加するこ
とによって、5′端部が変形している。このアミノ酸をオリゴヌクレオチドに付
加することは、バクテリヤ内にオリゴヌクレオチドを確実に吸収させ、mRNA
分子へアンチセンス オリゴヌクレオチドが結合するのに干渉しない。
当業者はアンチセンス オリゴヌクレオチド抗生物質をバクテリヤ内に確実に吸
収させるために、他の方法を使用してもよいことがわかる。例えば他のアミノ酸
の付加が特殊のアミノ酸トランスポートシステムとして用いられることもできる
。共有連鎖によってオリゴヌクレオチドにラクトーゼを付加することがラクトー
ゼ透過酵素(lacオペロンY遺伝子の生成物)によってトランスポートされる
ことができる。バクテリヤにおける作用であると知られている他の角形トランス
ポートシステムが、バクテリヤ核内に吸収されることを確実にするために用いら
れる。
担体とともに、又は担体なしで、オリゴヌクレオチドをバクテリヤ核に入れると
、MMSオペロンによってトランスクライブされたm RN Aを結合するため
に必要な時間安定となっていることが重要である。この発明の1実施例において
、オリゴヌクレオチドはその退化を避けるために3′端部に誘導される(第5図
)。他の方法はイントラセルラ(intracellular)ライフを延ばし
、m RN Aの結合能力を増大するために、オリゴヌクレオチドの3′又は5
′端部を変更する方法として知られている。
オペロンからトランスクライブされたm RN Aに結合することによってMM
Sオペロンを抑制するための付加において、バクテリヤを抑制し、バクテリヤ感
染を処置するために、MMSオペロンの他の下流生成物を制御することができる
。例えばMMSオペロン内にコード化されたタンパク質の作用を抑制することは
、MMSオペロンの作用を抑制し、バクテリヤの死をリードする。
この発明の1実施例は、バクテリヤ感染処置のための方法であって、S21、プ
リマス及びシグマ−70からなる群から選ばれたタンパク質の作用を制御する工
程を有する。この方法はバクテリヤに競走的オリゴヌクレオチドを導入すること
により、MMSオペロンによってコード化されたタンパク質の承認部位を競走的
に抑止する工程を有する。
S21承認部位は16SrRNAの3′端部に位置するシャインーダラガルノ
(Shine−Dalagarno)シーケンスを含み、バクテリヤへの321
の結合を競走的に抑止するオリゴヌクレオチドを導入することによって抑止でき
る。例えばシーケンス5’GATCCACCTCCTTA3’のオリゴヌクレオ
チドは、16SrRNA(シャインーダラガルノ シーケンス)の3′端部であ
る。
プリマス承認部位は複製部位のフェーズG4レジオンを含む。このようにしてバ
クテリヤにこの承認部位と衝突する競走的オリゴヌクレオチドを導入することに
よって、バクテリヤの成長と復帰は抑止される。この競走的抑止材はバクテリヤ
フェーズG4oriのループmである5’GGCCGCCCCACATTGGG
CAGGTATCTGACCAGTAGAGGGGCGGCC3’である。
シグマ−70承認部位はコアポリマラーゼα、BB’を含み、この相互作用は助
触媒シーケンスに対して特殊性を与える。
この競走的な抑止材の例としては、5’TTGACATAAATACCACTG
GCGGTGATACT3’がある。
このシーケンスはバクテリヤフェーズlambda PL助触媒である。これは
E、coliにおける最も強い助触媒であり、RNAポリマラーゼと公知のよう
に最も強い結合をもっている。
このようにしてバクテリヤにこれらのシーケンスのための、競走的オリゴヌクレ
オチドの導入は、タンパク質承認部位と競走的相互作用をもたらし、このように
してS21、プリマス又はシグマ−70分子を承認部位に結合するのを避ける。
これは通常の核作用、成長及び複製を抑制する。バクテリヤへのこれらのオリゴ
ヌクレオチドの導入は、MMSオペロンの作用を***させ、バクテリヤ感染を効
果的に処置させる。
実施例I
核成長を抑止するために、E、coli及び13,5ul)tilisの接種材
料は単一の試験管内で混合され、E、coli (AOAMMS−Eco)への
アンチセンス オリゴヌクレオチドは、核接種材料に付加される。数時間の生長
後培養がグラムストレイレドされる。グラム陽性生物がみられ、グラム陽性生物
の休止がある。花冠試験において、B、5ubtilis (AOAMM S−
B s u )に対するアンチセンス オリゴヌクレオチドE、 col i及
びB、5ubtilisの混合接種材料を付加し、数時間の間生長する。順次グ
ラムストレインには、ファウンド陰性ロッドがある。これらの試験はバクテリヤ
有機体の種特殊アンチセンス オリゴヌクレオチド デミスを表わす。
実施例■
MMSオペロン(rpsU、 dnaG、 rpoD)内の表現されたシーケン
スは、保存された異種同形DNAシーケンスを含み、オリゴヌクレオチドはドナ
G遺伝子内の保存DNAシーケンスとして承認された。
AOAMMS−ドナG5’CATCCAAAGCAGTGGTAAAACTGT
TT3’は合成された(表11シーケンスl)、。
このオリゴヌクレオチドは端末ラベルが張られ、サザン(Southern)プ
ロッティング(blotting)におけるプルーブとして用いられる。DNA
は感染した患者の体液がらえられたサルモネラの12異った病原性ストレインか
ら隔離され、HindIIIで消化し、1%アガロスゲルでランする。この消化
された染色体DNAは端部−ラベル化ドナGオリゴヌクレオチドAOAMMSと
プルーブされた。
第7図にみられるように、サルモネラの異った病原性ストレインにおけるオリゴ
ヌクレオチドAOAMMS−ドナGの保存がある。サザンプロットはサルモネラ
(LT−2)(レーン1)の実験室制御ストレインにオリゴヌクレオチドAOA
MMS−ドナGの相似を示し、12の異った病原性ストレインが患者(レーン2
−13)の体液から保存される。人間のDNA (レーン14の陰性制#M)へ
の混合はなく、陽性制御として混合信号(レーン16)を示すプルーブにおいて
、DNAシーケンスをプラスミドは含む。レーン15はマーカとしてHindI
I[でカットしたラムダDNAをもっている。ずっと右方にはサザントランスフ
ァー前にアガローズゲル上に決定されたキロベース対内の寸法がある。
当業者はこの発明は目的達成に適し、端部と優れた説明がえられる。ここに述べ
られているオリゴヌクレオチド、抗生物質、混合物、方法、手段及び技術は提示
実施例を表わして模範となっており、その範囲を制限しはしない。それらの内部
の変更及び他の用法は当業者にとって、この発明の精神内に包含され、又は添付
クレームの範囲によって制限される。
F/(3,7
国際調査報告
に+e+sa+renal Ae+ll++1.+8.、PC’r10s891
028841ffi161Mml+e+u−^om+cabenNo、PCT/
υS89102884
Claims (29)
- 1.アンチセンス オリゴヌクレオチドをMMSオペロンからトランスクライブ されたmRNAに結合する工程を有するMMSオペロンの表現を抑制する方法。
- 2.アンチセンス オリゴヌクレオチドは、特異な遺伝子シーケンスヘの特異シ ーケンス、バクテリヤの異種同型シーケンス及びそれらの組合せを含む群から選 ばれる請求の範囲1に記載の抑制方法。
- 3.アンチセンス オリゴヌクレオチドは、少なくとも10merの請求の範囲 2に記載の抑制方法。
- 4.アンチセンス オリゴヌクレオチドは、16ないし26merの請求の範囲 3に記載の抑制方法。
- 5.アンチセンス オリゴヌクレオチド抗生物質をMMSオペロンからトランス クライブされたmRNAに結合することによって、MMSオペロンの表現を抑制 する工程を有するバクテリヤ感染を処置する方法。
- 6.アンチセンス オリゴヌクレオチドをMMSオペロンからトランスクライブ されたmRNAにおけるバクテリヤの異種シーケンスに結合する請求の範囲5に 記載の処置方法。
- 7.アンチセンス オリゴヌクレオチドは、5′CATCCAAAGCAGTG GTAAAACTGTTT3′及び5′TCACCGATCGGCGTTTCC A3′からなる群から選ばれる請求の範囲6に記載の処置方法。
- 8.アンチセンス オリゴヌクレオチド抗生物質を遺伝子間シーケンスに結合し 、この遺伝子間シーケンスはバクテリヤの各歪みに対してユニークである請求の 範囲5に記載の処置方法。
- 9.アンチセンス オリゴヌクレオチドは、E.coliからトランスクライブ されたmRNAに結合される5′GGCCCCGATTTTTAGCAA3′, S.typhimuriumからトランスクライブされたmRNAに結合される 5′CTTGCGTAAGCGCCGGGG3′及びB.subtilisから トランスクライブされたmRNAに結合される5′TATTCGATGCTTT AGTGC3′からなる群から選ばれる請求の範囲8に記載の処置方法。
- 10.アンチセンス オリゴヌクレオチド抗生物質を異種同形シーケンスとユニ ークな遺伝子シーケンスの両方に結合する請求の範囲5に記載の処置方法。
- 11.ユニークな遺伝子アンチセンス オリゴヌクレオチドをMMSオペロンか らトランスクライブされたmRNAに結合し、前記結合量を決定する工程を有す るバクテリヤの同定方法。
- 12.オリゴヌクレオチドは、5′GGCCCCGATTTTTAGCAA3′ 及びE.coliとして同定されたバクテリヤである請求の範囲11に記載の同 定方法。
- 13.オリゴヌクレオチドは、5′CTTGCGTAAGCGCCGGGG3′ 及びS.typhimuriumとして同定されたバクテリヤである請求の範囲 11に記載の同定方法。
- 14.オリゴヌクレオチドは、5′TATTCGATGCTTTATGC3′及 びB.subtilisとして同定されたバクテリヤである請求の範囲11に記 載の同定方法。
- 15.少なくとも10merのオリゴヌクレオチドを有し、前記オリゴヌクレオ チドはMMSオペロンの検出ストランドの補助であって、前記検出ストランドに よってトランスクライブされたmRNAに結合する抗生物質。
- 16.オリゴヌクレオチドは、5′GGCCCCGATTTTTAGCAA3′ ,5′CTTGCGTAAGCGCCGGGG3′,5′TATTCGATGC TTTAGTGC3′,5′CATCCAAAGCAGTAAAACTGTTT 3′,及び5′TCACCGATCGGCGTTTCCA3′からなる群から選 ばれる請求の範囲15に記載の抗生物質。
- 17.前記オリゴヌクレオチドに連鎖した担体分子を有し、前記坦体分子は前記 オリゴヌクレオチドをバクテリヤに確実に吸収させる請求の範囲15に記載の抗 生物質。
- 18.坦体分子はアミノ酸である請求の範囲15に記載の抗生物質。
- 19.前記オリゴヌクレオチドは該オリゴヌクレオチドの減成を避けるために、 3′端部で誘導される請求の範囲15に記載の抗生物質。
- 20.ヌクレオチドが連鎖されたホスホロジオエート(phos−phorot hioate)が誘導によって3′端部に付加される請求の範囲19に記載の抗 生物質。
- 21.S21プリマス及びシグマ−70からなる群から選ばれたタンパク質の機 能を抑制する工程を有するバクテリヤの感染を処置する方法。
- 22.バクテリヤに競争的なオリゴヌクレオチドを導入することにより、MMS オペロンによってコード化されたタンパク質の承認部位を競争的に抑制する工程 を有するバクテリヤの感染を処置する方法。
- 23.S21承認部位はバクテリヤに5′GATCACCTCCTTA3′を導 入することによって抑制される請求の範囲22に記載の処置方法。
- 24.プリマス承認部位はバクテリヤに5′GGCCGCCCACATTGGG CAGGTATCTGACCAGTAGAGGGCGGCC3′を導入すること によって抑制される請求の範囲22に記載の処置方法。
- 25.シグマ−70承認部位はバクテリヤに5′TTGACATAAATACC ATGGCGGTGATACT3′を導入することによって抑制される請求の範 囲22に記載の処置方法。
- 26.MMSオペロンを単一のストランド化したDNAを形成するように処理す る工程と、アンチセンス オリゴヌクレオチドをMMSオペロンの単一ストラン ド化したDNAにおいて、ユニークな遺伝子間シーケンスに結合する工程と、前 記結合量を測定する工程とを有するバクテリヤの同定方法。
- 27.オリゴヌクレオチドは、5′GGCCCCGATTTTTAGCAAC3 ′及びE.coliとして同定されたバクテリヤである請求の範囲26に記載の 同定方法。
- 28.オリゴヌクレオチドは、5′CTTGCGTAAGCGCCGGG3′及 びS.typhimuriumとして同定されたバクテリヤである請求の範囲2 6に記載の同定方法。
- 29.オリゴヌクレオチドは、5′TATTCGATGCTTTAGTC3′及 びB.subtilisとして同定されたバクテリヤである請求の範囲26に記 載の同定方法。
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