KR102302827B1 - 크리스퍼 간섭을 이용한 유전자 발현 억제용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 크리스퍼 간섭을 이용하여 유전자의 발현을 억제할 수 있는 크리스퍼-dCas12a 벡터 시스템에 관한 것으로, 시아노박테리아를 타겟으로함으로써 친환경적으로 이산화탄소를 저감 및 제거하기 위한 이산화탄소 고효율 광전화에 유용한 물질의 대사 흐름을 조절하는데 이용될 수 있으며, 종래의 유전자 발현시스템에 비해 시간 제약이 적고 경제성이 우수하며, 시아노박테리아에서 독성이 감소되므로 생산성에 유리한 특성이 있으므로, 이를 대사공학 연구에도 활용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 크리스퍼 간섭을 이용한 유전자 발현 억제에 관한 것으로, 구체적으로, 시아노박테리아에서 유전자의 발현을 억제할 수 있는 크리스퍼-dCas12a 벡터 시스템에 관한 것이다.
현재 바이오산업에서 고부가 산물을 생산하기 위해 산업 미생물을 대사공학적으로 조작하여 야생형이 생산하지 못하는 산물을 효율적으로 생산하는 기술이 널리 이용되고 있다. 이러한 기술의 핵심은 타겟 물질을 효율적 및 경제적으로 생산해야 한다는 것이다. 이 때 사용되는 대사공학적 방법으로는 플라스미드 또는 지놈상에 이형 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 돌연변이를 만드는 기술들이 있다. 특히 최근에는, CRISPR을 이용하여 표적 유전자의 삽입 또는 돌연변이를 빠르게 얻어 낼 수 있는 기술이 각광받고 있다.
짧은 회문구조 반복서열(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPR) 및 CRISPRassociated(Cas) 단백질은 진정세균(Eubacteria) 및 고세균(Archaea)에서 적응 면역 시스템(Adaptive immune system)에 관여한다. CRISPR-Cas 시스템은 인간을 비롯한 생물체에서 표적 유전자 편집 도구로 개발되어 사용되어 왔다. CRISPR는 Cas와 sgRNA을 이용하여 타겟 위치(target site)에 유전자 삽입 및 변형을 쉽고 빠르게 만들어 낼 수 있으나, CRISPR는 타겟 위치가 아닌 자리에 돌연변이를 일으킬 가능성이 있다. 따라서, 최근에는 더 진보된 기술로 CRISPRi가 사용되고 있다. CRISPR 간섭(CRISPR interference; CRISPRi)는 표적 유전자 편집 대신 유전자의 발현 조절을 목적으로 CRISPR-Cas 시스템을 사용하기 위하여, Cas의 DNA 절단 효소활성을 결핍(제거)시킨 dCas을 이용하여 타겟 위치에 유전자 억제를 유도할 수 있는 시스템이다. 이 기술의 장점은 돌연변이를 만들지 않고도 표적 위치의 유전자 발현을 억제할 수 있어, 유전자 변형을 일으키지 않고도 유전자 조절이 가능하며, 다양한 생명체에서 유전자 발현의 DNA 서열 특이적 조절을 위한 효율적인 도구로 사용되고 있다.
Type II CRISPR 시스템에서 유래된 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 DNA 절단 활성이 제거된 Cas9(SpdCas9)은 CRISPRi에서 가장 많이 연구되고 가장 널리 사용되는 단백질이다. 상기 CRISPRi 시스템은 SpdCas9 단백질, CRISPR RNA(crRNA) 및 trans-activating RNA(tracrRNA)로 작동한다. SpCas9-crRNA-tracrRNA 복합체는 표적 DNA의 비주형(nontemplate) 가닥에 결합하여 RNA 중합효소(RNA polymerase)에 의한 전사를 억제한다. 또한, 표적 DNA의 절단 및 분해에 관여하는 Cas3 단백질의 결실을 요구하는 Type I CRISPR 시스템 유래의 다중(multimeric) CRISPRi 시스템 또한 보고되었다. Type I 및 II CRISPR 시스템 유래 상기 CRISPRi 시스템은 효율적, 가역적 및 다중으로 유전자 전사를 억제할 수 있으나, 특정한 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif; PAM) 서열 및 crRNA 이외에 tracrRNA를 필요로 한다는 점에서 적용에 한계가 있다.
최근, Type V-A CRISPR 시스템이 인간 세포의 표적 게놈 편집 도구로 밝혀졌다. 이는 단일 Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 단백질과 그 동족(cognate) crRNA로 구성되어 있으며 추가로 tracrRNA 필요 없이 작동한다. 표적 DNA의 하류(downstream)에 구아니딘이 풍부한(guanidine-rich) PAM 서열을 인식하는 Cas9과는 대조적으로, Cpf1은 표적 DNA의 상류(upstream)에 티미딘이 풍부한(thymidine-rich) PAM 서열을 인식한다. 또한, Cpf1은 표적 DNA를 절단하여 점착 말단(staggered end)을 생성하나, Cas9은 평활 말단(blunt end)을 만드므로, Cas 단백질 기반 시스템의 적용이 어려운 부분에서 사용이 가능하다. Type V-A CRISPR-Cpf1은 Cas9 기반 게놈 편집 도구의 매력적인 대안으로, 현재까지 DNA 절단 활성이 제거된 Cpf1인 Francisella novicida U112(FndCpf1)의 PAM 서열과 DNA 결합 활성이 보고되었다. 단, 최근 공개 서열 데이터베이스를 검색하여 Cpf1 계열 단백질의 다양성이 연구되었으나, 소수 Cpf1 계열 단백질의 PAM 서열만이 확인되었으며, CRISPRi로 개발되지는 못했다. 대한민국 특허공개 제10-2015-0107739는 CRISPR 시스템을 이용한 유전자 산물의 발현 변경에 관한 것이나, Cas9 단백질을 이용하므로, 전술한 Cas 기반 시스템의 단점을 그대로 갖는다.
최근 게놈 서열결정 기법 및 분석 방법의 진보는 다양한 범위의 생물학적 기능 및 질환과 연관된 유전적 요인을 목록화하고 매핑하는 능력을 상당히 가속화시켰다. 개별적인 유전 요소의 선택적인 변동을 허용함으로써 원인이되는 유전 변이의 체계적인 역조작(reverse engineering)을 가능하게 할 뿐만 아니라, 합성 생물학, 생명공학, 및 의학 응용 분야를 진전시키기 위하여, 정확한 게놈 표적화 기술이 필요하다. 게놈-편집 기법, 예컨대 디자이너 징크 핑거(designer zinc finger), 전사 활성자-유사 이펙터(transcription activator-like effector; TALE), 또는 귀소 메가뉴클레아제(homing meganuclease)가 표적화된 게놈 변동을 생성하는 데 이용가능하지만, 신규 전략과 분자 메커니즘을 이용하고, 입수가능하며, 설정하기 쉽고, 확장성이 있으며, 진핵세포 게놈 내의 다수의 위치를 표적화할 수 있는 새로운 게놈 조작 기술에 대한 필요성이 계속 남아 있다.
최근 크리스퍼기술의 파급효과로 인해 미래 시장에 관심이 증가추세에 있다. 질병치료 이외에 크리스퍼 기술로서 유전체 교정, 유전공학, 유전자 라이브러리, 유전자 재조합 식품, 크리스퍼 플라스미드, 인간줄기 세포, 세포주 공학 등 활용분야에 크리스퍼 시장규모가 시간이 갈수록 증가추세의 흐름에 따라 세계각국에서 기술의 상용화 및 우의 선점을 하기 위하여 연구개발이 활발이 이루어 지고 있다. 이에 따라 동물세포에서부터 미생물에 이르기까지 Cas9 크리스퍼 기술에 대한 다양한 적용연구가 진행되고 있는 가운데 시아노박테리아에 적합한 접근 연구도 활발히 진행되고 있다. 그것의 한 예로 Cas9 및 Cas12a 단백질의 차이에 따라 Synechocystis sp. PCC 6803균주내에서 유전자 조절발현과 균의 생존 현상을 모니터링을 수행한 연구가 보고된 바 있다. 이런 추세속에 이산화탄소 광전환의 이용 및 효율을 극대화를 위한 대사공학적 흐름을 제어할 수 있는 크리스퍼 유전자 발현 조절 시스템과 같은 유전자 툴 개발이 시급하다. 태양에너지를 활용한 광합성 능력을 바탕으로 이산화탄소 고정화를 통한 유용물질의 합성생물학 기술개발이 활발한 가운데 유전자 재조합이 가능한 시아노박테리아의 효율적인 광전환 생물학적 접급은 광합성 외의 미생물균주의 배양에서 생길 수 있는 경제적인 한계를 극복할 수 있는 기술이다. 시아노박테리아에서 대사흐름 분자매커니즘의 연구가 뚜렷히 밝혀져 있지 않은 가운데 대사공학기술과 시스템 생물학 기법의 적용이 상당히 요구되고 있다. 또한 시아노박테리아에서 기존의 유전자 도입방법은 장시간이 소요되는 점과 외래유전자 도입 효율의 낮은점이 있으며, Cas9 크리스퍼 단백질 유전자 조절 시스템은 시아노박테리아의 필수성장유전자의 연구에서 생장저해 리스크를 가지고 있다. 이에 더하여 Cas9 단백질 크리스퍼 시스템은 시아노박테리아 균주에 독성이 있음이 보고된 바 있다.
본 발명의 목적은 유전자 발현 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자 발현 억제용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 유전자 발현 억제용 키트를 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 dCas12a 및 crRNA를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 dCas12a를 암호화하는 핵산 서열, crRNA를 암호화하는 핵산 서열 및 프로모터를 포함하는 유전자 발현 억제용 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물 또는 벡터를 포함하는 유전자 발현 억제용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 벡터를 형질전환하는 단계를 포함하는 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 크리스퍼-dCas12a 벡터 시스템의 크리스퍼 간섭을 통한 유전자 발현 억제 용도는 시아노박테리아 타겟형 시스템이므로, 이를 친환경적으로 이산화탄소를 저감 및 제거하기 위한 이산화탄소 고효율 광전화에 유용한 물질의 대사 흐름을 조절하는데 이용될 수 있으며, 종래의 유전자 발현시스템에 비해 시간 제약이 적고 경제성이 우수하며, 시아노박테리아에서 독성이 감소되므로 생산성에 유리한 특성이 있으므로, 이를 대사공학 연구에도 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 시아노박테리아 유전자 발현 조절 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 벡터의 crRNA에서 DR(direct repeat)의 길이 (19nt, 23nt 또는 36nt)에 따른 시아노박테리아 균주에서의 타겟 유전자의 발현 저해 정도를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 벡터의 crRNA에서 프로토스페이서의 방향성 (T 가닥 방향 또는 NT 가닥 방향)에 따른 시아노박테리아 균주에서의 타겟 유전자의 발현 저해 정도를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 벡터의 크리스퍼 dCas12a 시스템 구현을 시아노박테리아의 표현형을 통해 확인한 도이다:
a: 크리스퍼 dCas12a 단백질의 타겟 유전자 발현 저해 기전 모식도;
b: nbl A 유전자의 발현 정도에 따른 표현형; 및
c: dCas12a의 mRNA 발현 수준.
도 5는 본 발명의 벡터의 멀티 유전자 발현 저해 효과를 확인한 도이다:
a: 벡터 내의 멀티 타겟 유전자 어레이(array) 모식도;
b: nbl A 유전자의 발현 정도에 따른 표현형;
c: 형광 세기로 확인한 eyfp 유전자 발현 저해 정도; 및
d: 형광 세기로 확인한 gfp 유전자 발현 저해 정도.
도 2는 본 발명의 벡터의 crRNA에서 DR(direct repeat)의 길이 (19nt, 23nt 또는 36nt)에 따른 시아노박테리아 균주에서의 타겟 유전자의 발현 저해 정도를 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 벡터의 crRNA에서 프로토스페이서의 방향성 (T 가닥 방향 또는 NT 가닥 방향)에 따른 시아노박테리아 균주에서의 타겟 유전자의 발현 저해 정도를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명의 벡터의 크리스퍼 dCas12a 시스템 구현을 시아노박테리아의 표현형을 통해 확인한 도이다:
a: 크리스퍼 dCas12a 단백질의 타겟 유전자 발현 저해 기전 모식도;
b: nbl A 유전자의 발현 정도에 따른 표현형; 및
c: dCas12a의 mRNA 발현 수준.
도 5는 본 발명의 벡터의 멀티 유전자 발현 저해 효과를 확인한 도이다:
a: 벡터 내의 멀티 타겟 유전자 어레이(array) 모식도;
b: nbl A 유전자의 발현 정도에 따른 표현형;
c: 형광 세기로 확인한 eyfp 유전자 발현 저해 정도; 및
d: 형광 세기로 확인한 gfp 유전자 발현 저해 정도.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.
일 측면에서, 본 발명은 DNA 절단 활성이 불활성화된(nuclease-deactivated) Cas12a 단백질(dCas12a); 및 반복적인 염기 서열(direct repeat, DR) 및 프로토스페이서(protospacer)를 포함하는 crRNA(CRISPR RNA)를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, dCas12a는 서열번호 1의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 반복적인 염기 서열은 10nt 내지 46nt의 길이일 수 있으며, 15 내지 22nt의 길이인 것이 더욱 바람직하며, 19nt 길이인 것이 가장 바람직하다.
일 구현예에서, 주형 DNA의 T 가닥 방향의 프로토스페이서일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 유전자 발현 억제용 조성물은 시아노박테리아의 유전자 발현 억제용 조성물일 수 있으며, 시아노박테리아는 시네코코커스 일롱게투스(Synechococcus elongatus)일 수 있다.
일 구현예에서, crRNA는 서로 다른 반복적인 염기 서열 및 프로토스페이서가 둘 이상 순차적으로 반복될 수 있으며, 상기 프로토스페이서가 서로 상이한 둘 이상의 타겟 유전자에 상보적일 수 있고, 다중 유전자 발현을 동시에 억제할 수 있다.
본 발명에서, 반복적인 염기 서열(direct repeat, DR) 및 타겟 DNA와 혼성화하는 핵산인 프로토스페이서를 반복적으로 연결하고, 각각의 반복적인 염기 서열 및/또는 프로토스페이서를 목적하는 유전자에 적합하도록 변형함에 따라 다중 유전자를 억제하는 crRNA를 제작할 수 있다. 상기 crRNA는 타겟 DNA와 혼성화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로토스페이서"는 타겟 DNA와 혼성화되는 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "혼성화"는 하나 이상의 핵산이 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 핵산 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "발현"은 핵산이 DNA 주형으로부터(예를 들어, mRNA 또는 기타 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 이후에 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "절단"은 핵산 분자의 공유 결합 백본(covalent backbone)의 파손(breakage)을 의미한다.
본 발명의 유전자 발현 억제용 조성물은 DNA 절단 활성이 불활성화된(nuclease-deactivated) Cas12a 단백질(dCas12a)을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터 및 crRNA를 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 세포 또는 유기체에 도입되거나, dCas12a 단백질 및 crRNA를 포함하는 혼합물 또는 이들이 복합체를 이루는 리보핵산단백질 형태로 세포 또는 유기체에 도입되거나, dCas12a 단백질 및 crRNA를 함께 포함하는 벡터로 세포 또는 유기체에 도입될 수 있다.
본 발명에서, 상기 crRNA의 구체적 서열은 Cas12a 단백질의 종류(유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에서, 상기 Cas12a 단백질 등의 엔도뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법으로 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 엔도뉴클레아제는 세포의 핵 내 전달을 위하여 통상적으로 사용되는 요소를 N-말단 또는 C-말단(또는 이를 암호화하는 핵산 분자의 5' 말단 또는 3' 말단)에 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 정제된 단백질 형태로 사용되거나, 이를 암호화하는 DNA, 또는 상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다.
상기 표적 DNA의 상류(upstream)에 TTN (A 또는 C)으로 이루어진 PAM(protospacer adjacent motif)을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "상류(upstream)"는 염기 서열의 특정 위치를 기준으로, 5' 방향쪽에 위치하는 서열을 의미하며, "하류(downstream)"은 염기 서열의 특정 위치를 기준으로, 3' 방향쪽에 위치하는 서열을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 DNA 절단 활성이 불활성화된 Cas12a 단백질(dCas12a)을 암호화하는 핵산 서열; 반복적인 염기 서열 및 프로토스페이서를 포함하는 crRNA를 암호화하는 핵산 서열; 및 상기 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 발현 억제용 재조합 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, dCas12a를 암호화하는 핵산 서열은 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, crRNA는 서로 다른 반복적인 염기 서열 및 프로토스페이서가 둘 이상 순차적으로 반복됨으로써 다중 유전자 발현을 동시에 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 벡터는 시아노박테리아용 유전자 발현 억제용 재조합 벡터
일 구현예에서, 반복적인 염기 서열은 10nt 내지 46nt의 길이일 수 있으며, 19nt 길이인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 주형 DNA의 T 가닥 방향의 프로토스페이서일 수 있다.
본 발명에서, 핵산 서열은 "외생성"일 수 있으며, 이는 벡터가 유입되는 박테리아에 이종이거나, 서열이 박테리아의 서열과는 상동성이나, 서열이 통상적으로 발현되지 않는 박테리아 세포 핵산내에 위치한다는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파아지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 크로모좀 (예를 들어, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기법을 통해 벡터를 잘 작제할 수 있을 것이다 (예를 들어, 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Maniatis et al, 1989 and Ausubel et al, 1994] 참조).
본 발명에서, 용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 임의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 일부 경우에, RNA 분자는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 또 다른 경우에, 이들 서열은 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보좀의 생성시 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 특정 박테리아 세포에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열이다. 전사 및 번역을 좌우하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 수행하며, 하기 기술된 핵산 서열을 함유할 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 발현될 목적 생성물을 암호화하는 핵산은 각 박테리아 세포에 대한 적합한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 이는 조정 서열 예컨대, 본 명세서에 걸쳐 기술된 조정 서열, 리보좀 결합 부위, 및 전사 종료 시그날을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 이는 유전자 엘리먼트를 함유할 수 있으며, 여기에 조정 단백질 및 분자 예컨대, RNA 중합효소 및 그밖의 전사 인자가 결합되어 핵산 서열의 특정 전사를 개시할 수 있다. 문구 "작동적으로 위치하는", "작동적으로 연결된", "조절하" 및 "전사 조절하에서"는 프로모터가 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하기 위해 핵산 서열과 관련하여 적당한 작용 부위 및/또는 방향으로 위치함을 의미한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 출발 부위를 정위시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 추가적인 프로모터 엘리먼트는 전사 개시 빈도를 조정한다. 전형적으로, 이는 출발 부위로부터 100bp 이하의 업스트림 영역에 위치하나, 많은 프로모터가 또한, 출발 부위의 다운스트림의 작용성 엘리먼트를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 코딩 서열을 프로모터의 "조절하에" 있기 위해, 전사 해독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단이 선택된 프로모터의 "다운스트림" (즉, 3')에 위치한다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고, 암호화된 RNA의 발현을 촉진시킨다. 프로모터 엘리먼트 사이의 공간은 매우 다양할 수 있어서, 프로모터 기능은 엘리먼트들이 서로에 대해 역행되거나 이동하는 경우에도 보존된다. 프로모터에 따라, 개별 엘리먼트는 공동으로 또는 개별적으로 작용하여 전사를 활성화시키는 것임이 자명하다. 프로모터는 "인핸서"와 함께 사용될 수 있거나 없으며, 이는 핵산 서열의 전사 활성화와 관련된 시스-작용 조정 서열을 나타낸다. 프로모터는 핵산 서열과 자연적으로 관련되어 있을 수 있으며, 이는 코딩 세그먼트 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비코딩 서열을 분리함으로써 획득될 수 있다. 이러한 프로모터는 "내생성"으로서 불릴 수 있다. 유사하게는, 인핸서는 핵산 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 관련된 것일 수 있다. 대안적으로, 천연 환경하에서 핵산 서열과 정상적으로 관련되지 않은 재조합 또는 이종 프로모터의 조절하에 코딩 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 특정 이점들이 달성될 수 있다. 재조합 또는 이종 인핸서, 오퍼레이터 또는 기타 조정 서열은 또한 이의 자연 환경에서의 핵산 서열과 정상적으로 관련되지 않은 인핸서, 오퍼레이터 또는 기타 조정 서열을 나타낸다. 이러한 프로모터, 인핸서, 오퍼레이트 또는 그밖의 조정 서열은 다른 유전자의 프로모터, 인핸서, 오퍼레이트 또는 그밖의 조정 서열, 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 분리된 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 또는 그 밖의 조정 서열, 및 "자연 발생적"이지 않은 즉, 발현을 변화시키는 상이한 전사 조정 영역의 상이한 엘리먼트 및/또는 변이를 함유하는 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 또는 그 밖의 조정 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 벡터를 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 함유함으로써 실험관내 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 세포에 확인가능한 변화를 부여하여 발현 벡터를 함유하는 세포를 용이하게 확인시켜 줄 것이다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 허용하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재하에 이의 선택을 가능하게 하는 것인 반면, 음성 선택 마커는 이의 존재로 인해 이의 선택을 방지하는 것이다. 양성 선택 마커의 예로는 약물 내성 마커가 있다. 일반적으로, 약물 선택 마커의 유입이 형질전환체의 클로닝 및 확인을 보조하며, 예를 들어, 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 젠티마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 제오신 및 카나마이신에 대한 내성을 유여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 영양요구체가 결여된 유전자에 의해 기능적으로 보완되는 보완 방법이 또한 이용된다. 수행 조건에 기초하여 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커 이외에, 비색 형광 분석을 기초로 하는 GFP 및 YFP와 같은 스트리닝 마커를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려될 수 있다. 또한, 루시퍼라아제를 이용하는 마커가 리포터 유전자로서 이용될 수 있다. 당업자는 또한, 가능하게는 FACS 분석과 함께 면역학적 마커를 어떻게 이용할지에 대해 알 고 있을 것이다. 사용된 마커는 유전자 생성물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 그렇게 중요하지 않다. 또한, 선택 및 스크리닝 마커의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 벡터를 포함하는 시아노박테리아의 유전자 발현 억제용 키트에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 타겟 유전자에 상보적인 프로토스페이서를 포함하는 제 7항의 벡터를 제작하는 단계; 및 시아노박테리아에 상기 벡터를 형질전환하는 단계를 포함하는, 시아노박테리아에서 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 벡터는 반복적인 염기 서열 및 하나 이상의 서로 다른 타겟 유전자에 상보적인 프로토스페이서가 둘 이상 순차적으로 반복되는 crRNA를 포함함으로써 하나 이상의 서로 다른 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 형질전환은 목적하는 유전자(핵산)를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 열충격법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 유전자 발현 억제용 조성물을 세포 또는 유기체에 처리하는 단계를 포함하는 세포 또는 유기체에서 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 세포는 원핵 세포일 수 있으며, 시아노박테리아일 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 시아노박테리아 유전자 발현 조절 벡터 시스템 제작
pTrc 프로모터 작동하에 유전자 발현가능한 pSe3Bb1c-GFP 벡터를 EcoRI 및 XhoI 처리한 뒤, BglⅡ 및 XhoI를 처리한 코돈 최적화된 dCas12a 단백질 코딩 유전자 단편을 라이게이션하여 삽입하였다 (pSe3Bb1c-dCas12a). 그 후, BglⅡ 및 XhoI를 처리한 crRNA (J23119, leader sequence, direct repeat, eyfp protospacer P1 및 terminator) 및 eyfpDNA 단편을 순차적으로 BamHI 및 XhoI를 처리한 pSe3Bb1c-dCas12a에 T4 라이게이즈를 이용하여 삽입함으로써 벡터 Syne dCas12a-guide crRNA E. coli DH10B pSyne7942-dCas12a-crRNA-eYFP를 제작하였다 (도 1).
실시예 2. 타겟 유전자 발현 저해 최적화 crRNA 길이 선별
crRNA의 DR(direct repeat) 길이에 따른 유전자 발현 저해 정도를 확인하기 위해, 19nt, 23nt 또는 36nt 길이의 DR을 가지는 각각 crRNA를 포함하도록 상기 실시예 1과 같이 Syne dCas12a-guide crRNA E. coli DH10B pSyne7942-dCas12a-crRNA-eYFP 벡터를 제작한 뒤, 이를 각각 시아노박테리아 (Synechococcus elongatus)에 도입하여 형질전환된 균주를 제작하였다. 제작된 세 종류의 형질전환 균주에서 eYFP의 형광 세기 및 dCas12a의 mRNA 발현 수준(전사 수준)을 비교한 결과, 19nt, 23nt 또는 36nt 길이의 DR을 가지는 각각 crRNA를 포함하는 벡터로 형질전환된 균주는 dCas12a 단백질만 발현하는 균주의 형광 세기보다 각각 78%, 63.7% 및 49.3% 감소되었으며, dCas12a의 mRNA 발현 수준도 각각 90%, 80% 및 80% 감소하여, 타겟 유전자의 발현을 가장 현저히 억제하는 crRNA의 길이 조건은 19nt으로 나타났다 (도 2).
실시예 3. 타겟 유전자 발현 저해 최적화 crRNA 방향성 선별
시아노박테리아 지놈상의 리포터 유전자 eYFP, dCas12a 및 crRNA의 크리스퍼 복합체를 이루기 위해 필수적인 프로토스페이서 (protospacer) (dCas12a 및 타겟 유전자의 인식 서열 PAM 5-TTN-3’후반부의 23bp 서열)의 방향 (주형 DNA의 T 가닥 또는 NT 가닥)에 따른 타겟 유전자의 발현 저해 효과를 형질전환 균주에서 eYFP의 형광 세기 및 dCas12a의 mRNA 발현 수준을 통해 비교한 결과, dCas12a 단백질만 발현한 균주의 형광 세기에 비해 T 가닥(strand) 방향인 경우 61.9% 감소하였고, NT 가닥 방향인 경우 29.7% 감소하였다. 또한, dCas12a의 mRNA 발현 수준도 각각 75.5% 및 53% 감소하여, crRNA의 프로토스페이서가 T 가닥의 방향일 때 시네코코스 일롱게투스 내 유전자 발현 저해를 NT 가닥 방향보다 현저히 억제하는 것으로 타났다 (도 3).
실시예 4. 시아노박테리아의 표현형을 통한 크리스퍼 dCas12a 시스템 구현 확인
시네코코커스 일롱게투스 균주에서 틸라코이드 막 내의 광수확 색소(light harvest pigment)인 피코빌리솜(phycobilisome) 단백질 복합체는 광합성을 하는데 중요한 물질이나, 질소(N)가 부족한 환경에서는 상기 색소들을 분해하여 N을 얻기 위해 피코빌리솜 단백질 분해 프로테이즈(phycobilisome protein degradation protease) (코딩 유전자: nbl A)가 증가한다. 이와 같이 nbl A 유전자의 발현이 증가하면 시아노박테리아의 표현형은 밝은 노란색으로 변한다 (백화 현상, clorosis). 이에, 본 발명의 벡터를 이용한 크리스퍼 dCas12a 시스템이 잘 구현되는지 확인하기 위해, nbl A를 타겟으로 하는 크리스퍼 dCas12a-guide crRNA P2 또는 P2'를 포함하는 벡터로 형질전환한 균주의 표현형이, dCas12a 단백질만 포함된 균주 또는 야생형의 표현형보다 더 녹색으로 나타나 (도 4b), 본 발명의 크리스퍼 dCas12a 시스템이 시아노박테리아의 색상 변화 (백화 현상)을 저해하는 것을 알 수 있다. 또한, dCas12a의 mRNA 발현 수준도 98.2% 감소한 것으로 나타났다 (도 4c).
실시예 5. 멀티 유전자 발현 저해 확인
본 발명의 벡터가 멀티 유전자 발현 조절이 가능한지 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 제작한 벡터의 crRNA 부위에서 eyfp (P1), nblA (P2) 및 gfp (P3) 유전자를 타겟팅할 수 있도록 프로토스페이서를 array 1은 eyfp, array 2는 eyfp 및 nblA, 및 array 3는 eyfp, nblA 및 gfp의 타겟 유전자 프로토스페이서를 포함하도록 제작하고 (도 5a) 이들 각각을 형질전환한 시네코코커스 일롱게투스 균주들을 일정시간 배양한 후, dCas12a-crRNA 시스템을 작동시키기 위해 IPTG 유도시켜 각 균주들의 타겟 유전자 발현 저해 정도를 형광 세기 및 표현형 (nblA 유전자의 경우)으로 확인하였다.
그 결과, 표현형 (nblA crRNA P2)의 경우 N 결핍 조건에서 dCas12a 단백질만 포함된 균주 또는 야생형 균주에 비해 녹색을 띄고 있어, array 형태로 발현되는 crRNA array 2 및 3 모두 nblA 유전자의 발현이 억제된 것으로 나타났다 (도 5b). 또한, array 1 내지 3에 포함된 eyfp (eyfp crRNA P1)도 dCas12a 단백질만 포함된 균주 또는 야생형 균주에 비해 형광 세기가 각각 62.4%, 76.3% 및 76.2% 감소하는 것으로 나타나, array 형태로 발현되는 crRNA가 작동하는 것을 확인할 수 있었다 (도 5c). 또한, array 3에 포함된 gfp crRNA P3의 gfp 유전자 발현 저해도 형광으로 확인한 결과, dCas12a 단백질만 발현되는 균주보다 형광 세기가 81.3% 감소하는 것으로 나타났다 (도 5d). 이를 통해, array 형태로 존재하는 crRNA가 시아노박테리아 지놈 상의 멀티 타겟 유전자들의 발현을 저해하는 것을 알 수 있다.
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<223> dCas12a
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Met Ser Ile Tyr Gln Glu Phe Val Asn Lys Tyr Ser Leu Ser Lys Thr
1 5 10 15
Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys
20 25 30
Ala Arg Gly Leu Ile Leu Asp Asp Glu Lys Arg Ala Lys Asp Tyr Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Gln Ile Ile Asp Lys Tyr His Gln Phe Phe Ile Glu Glu
50 55 60
Ile Leu Ser Ser Val Cys Ile Ser Glu Asp Leu Leu Gln Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Val Tyr Phe Lys Leu Lys Lys Ser Asp Asp Asp Asn Leu Gln Lys
85 90 95
Asp Phe Lys Ser Ala Lys Asp Thr Ile Lys Lys Gln Ile Ser Glu Tyr
100 105 110
Ile Lys Asp Ser Glu Lys Phe Lys Asn Leu Phe Asn Gln Asn Leu Ile
115 120 125
Asp Ala Lys Lys Gly Gln Glu Ser Asp Leu Ile Leu Trp Leu Lys Gln
130 135 140
Ser Lys Asp Asn Gly Ile Glu Leu Phe Lys Ala Asn Ser Asp Ile Thr
145 150 155 160
Asp Ile Asp Glu Ala Leu Glu Ile Ile Lys Ser Phe Lys Gly Trp Thr
165 170 175
Thr Tyr Phe Lys Gly Phe His Glu Asn Arg Lys Asn Val Tyr Ser Ser
180 185 190
Asn Asp Ile Pro Thr Ser Ile Ile Tyr Arg Ile Val Asp Asp Asn Leu
195 200 205
Pro Lys Phe Leu Glu Asn Lys Ala Lys Tyr Glu Ser Leu Lys Asp Lys
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Ile Asn Tyr Glu Gln Ile Lys Lys Asp Leu Ala Glu
225 230 235 240
Glu Leu Thr Phe Asp Ile Asp Tyr Lys Thr Ser Glu Val Asn Gln Arg
245 250 255
Val Phe Ser Leu Asp Glu Val Phe Glu Ile Ala Asn Phe Asn Asn Tyr
260 265 270
Leu Asn Gln Ser Gly Ile Thr Lys Phe Asn Thr Ile Ile Gly Gly Lys
275 280 285
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290 295 300
Asn Leu Tyr Ser Gln Gln Ile Asn Asp Lys Thr Leu Lys Lys Tyr Lys
305 310 315 320
Met Ser Val Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Thr Glu Ser Lys Ser
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Asp Leu Ser Gln Gln Val Phe Asp Asp Tyr Ser Val Ile Gly Thr Ala
405 410 415
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Pro Ser Lys Lys Glu Gln Glu Leu Ile Ala Lys Lys Thr Glu Lys Ala
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Lys Tyr Leu Ser Leu Glu Thr Ile Lys Leu Ala Leu Glu Glu Phe Asn
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Lys His Arg Asp Ile Asp Lys Gln Cys Arg Phe Glu Glu Ile Leu Ala
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485 490 495
Asp Asn Leu Ala Gln Ile Ser Ile Lys Tyr Gln Asn Gln Gly Lys Lys
500 505 510
Asp Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Asp Asp Val Lys Ala Ile Lys Asp
515 520 525
Leu Leu Asp Gln Thr Asn Asn Leu Leu His Lys Leu Lys Ile Phe His
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Ile Ser Gln Ser Glu Asp Lys Ala Asn Ile Leu Asp Lys Asp Glu His
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Phe Tyr Leu Val Phe Glu Glu Cys Tyr Phe Glu Leu Ala Asn Ile Val
565 570 575
Pro Leu Tyr Asn Lys Ile Arg Asn Tyr Ile Thr Gln Lys Pro Tyr Ser
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Asp Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Glu Asn Ser Thr Leu Ala Asn Gly
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Asp Asp Lys Tyr Tyr Leu Gly Val Met Asn Lys Lys Asn Asn Lys Ile
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Phe Asp Asp Lys Ala Ile Lys Glu Asn Lys Gly Glu Gly Tyr Lys Lys
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Ile Val Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Ala Asn Lys Met Leu Pro Lys Val
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Phe Phe Ser Ala Lys Ser Ile Lys Phe Tyr Asn Pro Ser Glu Asp Ile
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Leu Arg Ile Arg Asn His Ser Thr His Thr Lys Asn Gly Ser Pro Gln
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Phe Tyr Arg Glu Val Glu Asn Gln Gly Tyr Lys Leu Thr Phe Glu Asn
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Ile Ser Glu Ser Tyr Ile Asp Ser Val Val Asn Gln Gly Lys Leu Tyr
770 775 780
Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Ala Tyr Ser Lys Gly Arg
785 790 795 800
Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Trp Lys Ala Leu Phe Asp Glu Arg Asn
805 810 815
Leu Gln Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Tyr
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Ile Ala Asn Lys Asn Lys Asp Asn Pro Lys Lys Glu Ser Val Phe Glu
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Tyr Asp Leu Ile Lys Asp Lys Arg Phe Thr Glu Asp Lys Phe Phe Phe
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His Cys Pro Ile Thr Ile Asn Phe Lys Ser Ser Gly Ala Asn Lys Phe
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Asn Asp Glu Ile Asn Leu Leu Leu Lys Glu Lys Ala Asn Asp Val His
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Val Asp Gly Lys Gly Asn Ile Ile Lys Gln Asp Thr Phe Asn Ile Ile
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Leu Thr Ala Pro Phe Glu Thr Phe Lys Lys Met Gly Lys Gln Thr Gly
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aaaatatttc atatatctca atctgaagat aaagcgaata tacttgataa agatgaacat 1680
ttttatcttg tgtttgaaga atgttatttt gaacttgcga atatagtgcc gctttataat 1740
aaaatacgta attatataac gcaaaaaccg tattctgatg aaaaatttaa acttaatttt 1800
gaaaattcta cgcttgcgaa tgggtgggat aaaaataaag aaccggataa tacggcgata 1860
ctttttataa aagatgataa atattatctt ggggtgatga ataaaaaaaa taataaaata 1920
tttgatgata aagcgataaa agaaaataaa ggggaagggt ataaaaaaat agtgtataaa 1980
cttcttccgg gggcgaataa aatgcttccg aaagtgtttt tttctgcgaa atctataaaa 2040
ttttataatc cgtctgaaga tatacttcgt atacgtaatc attctacgca tacgaaaaat 2100
gggtctccgc aaaaagggta tgaaaaattt gaatttaata tagaagattg tcgtaaattt 2160
atagattttt ataaacaatc tatatctaaa catccggaat ggaaagattt tgggtttcgt 2220
ttttctgata cgcaacgtta taattctata gatgaatttt atcgtgaagt ggaaaatcaa 2280
gggtataaac ttacgtttga aaatatatct gaatcttata tagattctgt ggtgaatcaa 2340
gggaaacttt atctttttca aatatataat aaagattttt ctgcgtattc taaagggcgt 2400
ccgaatcttc atacgcttta ttggaaagcg ctttttgatg aacgtaatct tcaagatgtg 2460
gtgtataaac ttaatgggga agcggaactt ttttatcgta aacaatctat accgaaaaaa 2520
ataacgcatc cggcgaaaga agcgatagcg aataaaaata aagataatcc gaaaaaagaa 2580
tctgtgtttg aatatgatct tataaaagat aaacgtttta cggaagataa attttttttt 2640
cattgtccga taacgataaa ttttaaatct tctggggcga ataaatttaa tgatgaaata 2700
aatcttcttc ttaaagaaaa agcgaatgat gtgcatatac tttctatagc gcgtggggaa 2760
cgtcatcttg cgtattatac gcttgtggat gggaaaggga atataataaa acaagatacg 2820
tttaatataa tagggaatga tcgtatgaaa acgaattatc atgataaact tgcggcgata 2880
gaaaaagatc gtgattctgc gcgtaaagat tggaaaaaaa taaataatat aaaagaaatg 2940
aaagaagggt atctttctca agtggtgcat gaaatagcga aacttgtgat agaatataat 3000
gcgatagtgg tgtttgaaga tttgaatttt gggtttaaac gtgggcgttt taaagtggaa 3060
aaacaagtgt atcaaaaact tgaaaaaatg cttatagaaa aacttaatta tcttgtgttt 3120
aaagataatg aatttgataa aacggggggg gtgcttcgtg cgtatcaact tacggcgccg 3180
tttgaaacgt ttaaaaaaat ggggaaacaa acggggataa tatattatgt gccggcgggg 3240
tttacgtcta aaatatgtcc ggtgacgggg tttgtgaatc aactttatcc gaaatatgaa 3300
tctgtgtcta aatctcaaga atttttttct aaatttgata aaatatgtta taatcttgat 3360
aaagggtatt ttgaattttc ttttgattat aaaaattttg gggataaagc ggcgaaaggg 3420
aaatggacga tagcgtcttt tgggtctcgt cttataaatt ttcgtaattc tgataaaaat 3480
cataattggg atacgcgtga agtgtatccg acgaaagaac ttgaaaaact tcttaaagat 3540
tattctatag aatatgggca tggggaatgt ataaaagcgg cgatatgtgg ggaatctgat 3600
aaaaaatttt ttgcgaaact tacgtctgtg cttaatacga tacttcaaat gcgtaattct 3660
aaaacgggga cggaacttga ttatcttata tctccggtgg cggatgtgaa tgggaatttt 3720
tttgattctc gtcaagcgcc gaaaaatatg ccgcaagatg cggatgcgaa tggggcgtat 3780
catatagggc ttaaagggct tatgcttctt gggcgtataa aaaataatca agaagggaaa 3840
aaacttaatc ttgtgataaa aaatgaagaa tattttgaat ttgtgcaaaa tcgtaataat 3900
tag 3903
Claims (16)
- DNA 절단 활성이 불활성화된(nuclease-deactivated) Cas12a 단백질(dCas12a); 및
19nt의 길이의 반복적인 염기 서열(direct repeat, DR) 및 주형 DNA의 T 가닥 방향의 프로토스페이서(protospacer)를 포함하는, 시아노박테리아에서 유전자 발현을 억제하기 위한, crRNA(CRISPR RNA)를 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, crRNA는 서로 다른 반복적인 염기 서열 및 프로토스페이서가 둘 이상 순차적으로 반복되는, 유전자 발현 억제용 조성물.
- 제 5항에 있어서, 다중 유전자 발현을 동시에 억제할 수 있는, 유전자 발현 억제용 조성물.
- DNA 절단 활성이 불활성화된 Cas12a 단백질(dCas12a)을 암호화하는 핵산 서열;
19nt의 길이의 반복적인 염기 서열 및 주형 DNA의 T 가닥 방향의 프로토스페이서를 포함하는 crRNA를 암호화하는 핵산 서열; 및
상기 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 시아노박테리아용 유전자 발현 억제용 재조합 벡터. - 제 7항에 있어서, crRNA는 서로 다른 반복적인 염기 서열 및 프로토스페이서가 둘 이상 순차적으로 반복되는, 유전자 발현 억제용 재조합 벡터.
- 제 8항에 있어서, 다중 유전자 발현을 동시에 억제할 수 있는, 유전자 발현 억제용 재조합 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항의 조성물 또는 제 7항의 벡터를 포함하는, 시아노박테리아용 유전자 발현 억제용 키트.
- 1) 타겟 유전자에 상보적인 프로토스페이서를 포함하는 제 7항의 벡터를 제작하는 단계; 및
2) 세포 또는 유기체에 상기 벡터를 형질전환하는 단계를 포함하는, 시아노박테리아용 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법. - 제 14항에 있어서, 벡터는 반복적인 염기 서열 및 하나 이상의 서로 다른 타겟 유전자에 상보적인 프로토스페이서가 둘 이상 순차적으로 반복되는 crRNA를 포함하는, 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법.
- 제 15항에 있어서, 하나 이상의 서로 다른 타겟 유전자의 발현을 억제하는, 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방법.
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KR1020190170825A KR102302827B1 (ko) | 2019-12-19 | 2019-12-19 | 크리스퍼 간섭을 이용한 유전자 발현 억제용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020190170825A KR102302827B1 (ko) | 2019-12-19 | 2019-12-19 | 크리스퍼 간섭을 이용한 유전자 발현 억제용 조성물 |
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KR20210078894A KR20210078894A (ko) | 2021-06-29 |
KR102302827B1 true KR102302827B1 (ko) | 2021-09-14 |
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ID=76626612
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KR1020190170825A KR102302827B1 (ko) | 2019-12-19 | 2019-12-19 | 크리스퍼 간섭을 이용한 유전자 발현 억제용 조성물 |
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KR (1) | KR102302827B1 (ko) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR101896847B1 (ko) * | 2017-09-22 | 2018-09-07 | 한국생명공학연구원 | DNA 절단 활성이 불활성화된 Cpf1을 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물 및 그 용도 |
-
2019
- 2019-12-19 KR KR1020190170825A patent/KR102302827B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101896847B1 (ko) * | 2017-09-22 | 2018-09-07 | 한국생명공학연구원 | DNA 절단 활성이 불활성화된 Cpf1을 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물 및 그 용도 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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Scientific Reports. 2016, 6, Article number: 39681. |
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KR20210078894A (ko) | 2021-06-29 |
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