KR20210081645A - 천연 발효물 유래 고 기능성 펩타이드 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

인삼열매에서 높은 단백질과 펩타이드를 함유하고 있음을 밝히고,인삼열매 발효물에 있어 펩타이드 또는 단백질 함량을 증대시킬 수 있는 방법이 개시된다. 본 발명은 인삼열매 추출물을 포함하는 발효 배지에 바실러스 속 균주를 접종 및 발효하여 수득되는 발효물을 용매 분획하여 펩타이드 또는 단백질 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

천연 발효물 유래 고 기능성 펩타이드 제조 방법{PREPARING METHOD OF HIGHLY FUNCTIONAL PEPTIDE DERIVED FROM NATURAL FERMENTATION EXTRACTS}
본 발명은 고 기능성 펩타이드 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연 발효물 유래 고 기능성 펩타이드 제조 방법에 관한 것이다.
발효는 미생물이 가지고 있는 효소가 원재료를 변화시켜 이로운 성분을 만들어내는 과정을 뜻한다. 발효 과정 중에는 유효 성분들이 추출되며 기능성 물질의 함량이 증가한다. 그리고, 발효기술은 생물전환, 생합성, 생촉매 등의 용어와 의미상 중복성을 가지며, 미생물이 갖고 있는 효소적 기능을 이용하여 전구물질로부터 원하는 산물을 제조하는 기술을 의미한다. 따라서, 생체기능을 세포 또는 효소 단계에서 이용하는 발효 기술은 유용물질 생산을 주요 목적으로 하여 현재의 생물공업을 구성하는 주요한 공정과정이라 할 수 있다.
발효 식품이 자연적으로 발생하는 미생물을 활용하는 1차원적인 발효 기술을 활용했다면 발효 화장품은 더 앞선 기술을 필요로 한다. 또한, 단순히 전통적인 발효방법을 이용한 것이 1세대 발효라면 2세대 발효는 효능물질의 실용화 기술개발이었고, 유용한 생리활성 물질만을 대량으로 생산할 수 있는 고도의 발효생산기술을 통하여 화장품 기능성 소재산업의 기틀을 마련한 생물전환 발효 기술이 3세대 발효기술로서 자리매김하고 있다.
우리나라 국민들은 김치, 된장 등 발효식품을 많이 이용하기 때문에 발효라는 개념이 매우 친숙하며 발효 원료를 이용한 화장품 역시 거부감 없이 사용하고 있다. 그리고 일반 대중에게도 발효기술을 이용하여 새로운 소재를 개발할 경우 기존 소재와 완전히 새로운 효능을 보이거나 유해한 많은 성분들이 안전한 성분으로 변화된다고 알려져 있어 발효 화장품에 대한 선호도가 높으며, 이에 따른 기술개발도 타 선진국에 비해 뒤지지 않는 수준이다. 하지만, 현재 화장품에 적용되는 많은 발효소재들이 천연발효 또는 자연숙성에 가까운 발효 방법을 사용하는 것으로 알려져 있다.
최근 국내 발효 기술의 연구 트랜드는 천연발효 또는 자연숙성에 가까운 발효 방법을 사용하는 것으로 알려져 있으며, 자연발효란 가공하지 않은 다양한 원료를 있는 그대로 두고 물과 바람, 대지, 계절 등 자연의 힘을 이용하여 피부에 유용한 성분을 자연스럽게 생산하는 방식으로, 비록 시간이 오래 걸리지만 다양한 물질들을 얻을 수 있어 보습과 항산화, 주름개선, 세포활성, 피부결 개선 등의 효과를 얻을 수 있다는 것이 강점이다. 그러나, 천연발효 또는 자연숙성 방식의 발효는 생산 배치(batch) 별로 일정한 품질의 발효생성물을 얻기 어려우며, 품질의 관리도 어려운 단점이 있다.
우리나라 발효화장품 시장은 최근 3~4년간 40%씩 고공성장을 거듭하고 있는 중이며, 2012년에는 약 4,500억 원, 2013년 약 6,500억 원, 2014년 약 1조 원(추정치) 규모를 달성할 것으로 전망하고 있다.
발효물은 크게 발효여과물(Ferment Filtrate)과 발효용해물(Ferment Lysate)로 분류될 수 있는데, 발효여과물은 발효가 완료된 후 여과장치를 통해 미생물을 제거한 상등액(supernatant)을 활용하는 것이고, 발효용해물은 발효 완료 후 미생물을 열, pH, 효소(Lysozyme), 고압 등을 이용, 균을 사멸시켜 활용하는 방법이다.
한편, 인삼(Panax ginseng C.A.Meyer의 뿌리)은 전 세계적으로 각종 질병에 상용되는 전통적인 약재중의 하나로, 최근에는 항스트레스, 면역기능증강, 활력증진 그리고 항암작용을 하는 약재로 사용되고 있으며M 인삼의 대표적인 약리성분은 배당체의 하나인 사포닌(ginsenoside)으로, 현재까지 30여 가지의 진세노사이드가 있는 것으로 알려져 있다.
최근 인삼의 항산화 효과, 항주름 효과, 피부노화 억제 효과가 있음이 알려지면서 현재에는 다양한 기능성을 가진 인삼 관련 미용관련 제품이 고가로 판매되고 있으며 그 수요도 점차 증가되고 있으나, 인삼은 그 세대기간이 4~6년으로 길며 6년을 재배하여야 1뿌리 당 100~150 g(fresh weight)의 수삼이 수확되고 연작이 불가능하다고 알려져 있다.
인삼 화장품의 경우 국내 소비자의 인삼에 대한 높은 선호도를 기반으로 오랜 기간동안 다양한 업체에서 해당 제품을 생산하여 왔고, 가장 대표적인 인삼화장품 제조 기업으로는 아모레퍼시픽사(상표명 설화수)과 한국담배인삼공사(상표명 동인비)가 대표적으로 손꼽히며, 각자 독자적인 제품군을 구축하여 소비자들의 좋은 반응을 받고 있다. 이들 기업들은 과거 인삼, 홍삼 추출액 등을 주요 성분으로 활용하였으나, 최근에는 사포닌이나 진세노사이드의 성분 만을 분리하여 처방하는 방식을 통해 품질을 개량하고 있으며, 국내의 소비자 외에 해외 수출을 통해 해외 고객들의 요구도 충족시키고 있다.
인삼 부산물의 일종인 인삼열매(Ginseng berry)는 인삼에 비해 저렴한 가격으로 쉽게 구할 수 있는 원자재이나, 인삼 자체에 비해 뒤지지 않는 효능과 높은 함량으로 유효성분들이 함유되어 있다.
인삼열매가 주목을 받기 시작한 것은 '진세노사이드 Re'라는 인삼열매의 독특한 사포닌이 당뇨병과 비만을 예방한다는 미국 시카고의대의 연구 결과가 2002년 미국 의학학술지 '당뇨병(Diabetes)'에 발표되면서이다. 연구팀이 당뇨병에 걸리게 조작한 쥐에게 인삼열매를 투여하자 공복 시 혈당 수치가 유의하게 감소됐다. 또한, 실험용 쥐의 콜레스테롤 수치와 체중이 감소했고 에너지 소비율은 증가함을 확인하였다.
특히, 인삼열매는 주름을 개선하고 피부 탄력을 높이는 효과도 확인되었다. 인삼열매 내에는 항산화 효과가 뛰어난 비타민 E와 안토시아닌 성분이 풍부하게 함유돼 있어 노화 방지 효과가 인삼 뿌리보다 더 우수한 것으로 밝혀졌으며, 인삼열매 사포닌의 주 성분인 진세노사이드 Re는 식물성 에스트로겐과 비슷한 역할을 해 여성 갱년기 증상을 완화하는 데도 도움을 준다고 알려져 있다.
인삼열매의 경우 유효성분을 다량 함유해 국내외에서 미용 재료, 제약 원료, 사료 첨가제 등으로 활용가능하며, 인삼 생산량 증가로 부산물 역시 증가 추세이고, 친환경 인삼 재배와 발효 기술 등이 발달하고, 부산물 활용의 제약 요인인 안전성 기준 완화로 산업 소재화 가능성이 증대하고 있는 상황이다. 인삼 부산물의 산업적 이용 가치를 고려해 다양한 용도와 응용방법 개발이 필요하며, 특히 기존에 잘 알려진 진세노사이드 계열 뿐만 아니라, 인삼열매내에 기능성 펩타이드에 대한 연구를 통해 인삼 부산물인 인삼열매의 효용성을 확대하는 연구의 필요성이 절실하다.
진세노사이드는 인삼의 주요 성분으로 의약품이나 건강기능 식품, 그리고 화장품의 기능성 성분으로 많이 활용되어 왔지만, 최근의 연구결과에 따르면 일부 진세노사이드에서 강한 세포독성이 발견되었다는 사실이 확인되면서 유해성 논란에 휩싸이게 되었다. 또한, Jin-Ho Chung 등(Food and Chemical Toxicology 118 (2018) 645.652)은 Rg3 배양액에 쥐의 평활근(내장의 벽을 구성하는 근육) 세포를 배양해 독성을 확인하였으며, Rg3 농도가 10 μM 이상인 배양액에서 심장 평활근 세포의 세포사(apoptosis)를 유발하였으며, 그 보다 농도가 낮은 1 μM에서도 평활근의 활동에 부정적인 영향을 확인하였으며, 그 메카니즘은 Rg3가 평활근 세포의 근육 수축·이완을 담당하는 'F-actin' 단백의 결합 상태를 무너뜨리고, F-actin에 결합한 'Bmf' 단백도 분리하여 유리된 Bmf 단백은 세포의 미토콘드리아로 이동하고, 미토콘드리아 내 에너지 생산활동을 방해해 세포사를 유도하게 되는 것으로 확인하였다. 따라서, 항암 효과가 있다고 알려진 Rg3에는 상당히 강한 세포 독성이 있으며, 암세포만을 선택적으로 죽이지 않고 정상 세포도 함께 파괴한다는 점을 논문을 통해 확인하였다.
물론 인삼 내에는 Rg3 외에 다양한 진세노사이드가 존재하며 이들 모두의 독성을 확인한 것이 아니기 때문에 인삼이 인체에 유해하다고 생각할 수 없지만 현재 진세노사이드 일변도인 인삼유효 성분에서 벗어나 인삼의 다른 성분에 대한 연구가 필요한 것도 사실이다.
인삼 혹은 인삼의 부산물에는 진세노사이드 외에 다양한 기능성 성분들이 있으며, 특히 인삼 다당체(Polysaccharides)의 면역 기능성에 대해서는 많은 연구가 이루어져 있다. 건강기능식품에서 인삼 다당체 추출물이 개별인증되어 활용되고 있으나, 인삼의 단백질이나 펩타이드에 대해서는 연구가 많이 부족한 것이 현실이며 인삼의 효능을 발휘하는 성분으로 파악되지 않은 상태이다.
본 발명은 인삼열매 발효물 내 다양한 기능성을 갖는 펩타이드를 분리하는 방법과, 그 방법으로 분리되는 기능성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 인삼열매(Panax Ginseng Berry)에 균을 접종 및 발효시킨 후 여과하여 미생물을 제거하는 단계를 포함하여 인삼열매 발효물 내 기능성 펩타이드를 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 발효는 30 내지 50℃에서 2 내지 4일간 수행되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 균은 바실러스 속(Bacullus sp.) 균인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 용매 분획 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 (글리신-알라닌)n(n은 2 내지 10의 정수)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 글리신-알라닌-글리신-알라닌-글리신-알라닌의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 피부 주름 개선 및 항노화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 피부세포 생장을 촉진하여 피부세포의 재생속도를 증가시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 기능성 펩타이드는 인간 섬유아세포주 내 콜라겐 생성을 촉진하고, 콜라겐 분해효소(MMP-1)의 활성을 억제하여 피부 주름 개선 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 인삼열매 발효물 및 상기 기능성 펩타이드는 인간 피부 각질 세포주 증식 촉진 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 방법에 따라 분리된 기능성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 인삼열매의 발효를 통해 인삼열매 내 단백질과 펩타이드의 패턴이 전환되는 것을 확인하였으며, 또한, 분리정제를 통해 펩타이드 함량이 증가될수록 높은 주름 개선 활성을 보이는 것도 확인하였다. 특히, 우수한 효능을 보이는 펩타이드를 최종적으로 분리하여 단일 펩타이드의 독성, 효능, 물성 등을 확인하였다.
본 발명을 통해 제공되는 인삼열매로부터 유래된 기능성 펩타이드는 화장품 조성물로서 다양한 활용성을 가질 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 인삼열매 발효 정제물의 제조 과정을 나타낸 모식도,
도 2는 본 발명의 실험예 2의 인삼열매 발효물 분획 후 단백질 정량 결과를 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명의 실험예 3의 인삼열매 발효물 컬럼 분리 정제 후 TLC 결과를 촬영한 사진,
도 4는 본 발명의 실험예 4의 인삼열매 발효물 컬럼 분리 정제 후 단백질 함량 확인 결과를 나타낸 그래프,
도 5은 본 발명의 실험예 5의 인삼열매 발효물의 정제 단계 별 target peptide 함량 확인 결과를 나타낸 그래프,
도 6은 본 발명에 따른 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 그래프(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala),
도 7은 본 발명에 따른 실험예 6의 인삼열매 펩타이드(ApepHexapeptide-01) NMR 및 FAB-mass 분석 결과를 나타낸 그래프(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala),
도 8는 본 발명의 실험예 8의 인삼열매 추출, 발효 분획물의 MMP-1 저해능 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 9은 본 발명의 실험예 9의 인삼열매 발효물, 분획물, 정제물의 세포 내 콜라겐 생성 촉진효과 결과를 나타낸 그래프,
도 10 및 도 11 본 발명의 실험예 10(인삼열매 정제물)의 세포 증식능을 3T3 세포 및 HACAT 세포에서 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 12 및 도 13는 본 발명의 Hexapeptide AP-1의 광 안정성 및 열 안정성 측정 결과를 나타낸 그래프.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 피부노화 및 주름을 효과적으로 방지 또는 개선하기 위해서 항산화 효능이 확인된 원료와 피부 노화 방지에 효과가 있는 화장료 조성물을 개발하기 위하여 연구를 거듭한 결과, 인삼열매 열매 추출물을 발효시키거나, 인삼열매 발효물에서 유래된 펩타이드를 사용하는 경우, 콜라겐 분해 효소(Matrix Metalloproteinase-1)의 활성 저해, 세포 내 콜라겐 생성 촉진 및 표피 세포 증식 촉진 효능을 향상시킬 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서, 본 발명은 인삼열매 발효물 또는 인삼열매 발효 정제물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물의 제공을 위한 방법으로, 인삼열매(Panax Ginseng Berry)에 균을 접종 및 발효시킨 후 여과하여 미생물을 제거하는 단계를 포함하여 인삼열매 발효물 내 기능성 펩타이드를 분리하는 방법을 개시한다.
본 발명에서 상기 인삼열매(Panax ginseng Berry)는 두릅나무과에 속하는 여러해살이풀이며, 약용으로 많이 재배되고 있다. 상기 인삼열매는 4년생 이상의 인삼에서만 열리며 다양한 약리 작용이 밝혀져 있으며, 화장료로 개발되어 피부미용과 노화방지를 위해 활용되고 있다.
본 발명에서 상기 인삼열매 발효물은 인삼열매를 건조, 추출한 후 발효한 발효물을 의미하며, 인삼열매 추출물은 다양한 질환에 효과가 있는 약재로 활용되었고, 사포닌 등의 다양한 효능을 가진 성분이 풍부하여 항암, 항산화, 항암, 간질환 개선 등의 효능이 확인되고 있는 약제이다.
본 발명의 인삼열매 발효물 또는 인삼열매 발효 정제물은 피부에 작용하여, 피부 주름 개선, 피부 노화 완화에 도움을 주는 원료이며, 효능이 있는 특정 성분을 정제함으로 정제 전과 비교하여 그 효과가 더욱 증강될 수 있으며, 인삼열매 발효물 및 인삼열매 발효 정제물을 함께 사용할 수 있다.
본 발명은 일 양태로서 인삼열매 발효물 내 기능성 펩타이드를 분리하는 방법을 제공하고, 상기 인삼열매 발효물 내 기능성 펩타이드를 분리하는 방법은 인삼열매(Panax Ginseng Berry)에 균을 접종 및 발효시킨 후 여과하여 미생물을 제거하는 단계를 포함한다.
이하 상기 인삼열매 발효물 제조방법을 통해 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명에서 상기 인삼열매 열매 추출물에 미생물을 접종하고 발효시켜 발효물을 제조하는 단계는 인삼열매 열매의 기능성 물질의 함량을 증가시키기 위한 단계이다.
상기 인삼열매 열매 추출물은 당업계에 공지된 통상의 추출 방법, 예를 들어 용매 추출법을 사용하여 제조될 수 있다. 용매 추출법을 이용한 혼합 추출물 제조시 사용되는 추출 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 이들의 혼합물인 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이중 물, 알코올 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것이 바람직하며, 추출 용매로 알코올을 사용하는 경우 알코올은 탄소 수가 1 내지 4인 저급알코올인 것이 바람직하고, 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 것이 더 바람직하며, 더욱 더 바람직하게는 에탄올일 수 있다.
또한, 상기 인삼열매 열매 추출물을 에탄올로 추출하는 경우, 예를 들어, 99.5%(v/v) 에탄올을 인삼열매의 5 내지 20배 중량으로 첨가하고, 상온에서 18 내지 30시간 동안 추출할 수 있고, 상기 인삼열매 추출물의 당도는 4 내지 10 brix, 바람직하게는 6 내지 8 birx일 수 있다.
또한, 상기 인삼열매 추출물을 열수 추출로 추출하는 경우, 예를 들어, 정제수를 인삼열매 열매의 5 내지 20배 중량으로 첨가하고, 100 내지 140℃로 4 내지 8시간 동안 추출할 수 있으며, 상기 인삼열매 열매 추출물의 당도는 4 내지 10 brix, 바람직하게는 6 내지 8 birx일 수 있다.
본 발명에서 상기 미생물은 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주 또는 이들의 혼합 균주로 발효될 수 있으며, 상기 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주는 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)일 수 있고, 상기 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주는 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei)일 수 있고, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 메틸로트로피쿠스의 혼합 균주일 수 있다.
상기 발효란 미생물이 가지고 있는 효소가 원재료를 변화시켜 이로운 성분을 만들어내는 과정을 말하며, 발효 과정 중에는 유효 성분들이 추출되며 기능성 물질의 함량이 증가한다. 또한, 본 발명에서 상기 발효는 상기 미생물 균주의 배양액을 107 내지 1010 cfu/㎖로 조절하여, 상기 인삼열매 열매 추출물에 대하여 0.1 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 5 중량%를 접종할 수 있고, 1 내지 5일, 바람직하게는 2 내지 4일 동안, 25 내지 45℃, 바람직하게는 30 내지 40℃에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 미생물 배양 및 발효 시 배지 조성은 글루코오스 0.2 내지 1 중량%, 효소 추출물 0.1 내지 0.5 중량%, 소이톤(soytone) 0.05ㅍ0.3 중량% 및 증류수(잔량)일 수 있다.
본 발명에서 상기 발효물에서 상기 미생물을 제거하여 인삼열매 발효물을 제조하는 단계는 인삼열매 발효물의 추가 발효를 방지하기 위해 미생물을 제거하는 단계로서, 상기 미생물 제거는 원심분리 및 여과를 통해 제거될 수 있으며, 예를 들어, 상기 발효물을 원심분리기를 통해 미생물을 분리한 후, 0.1 내지 0.3 ㎛ 필터로 여과하여 미생물을 제거할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 인삼열매 발효 정제물의 제조 과정을 나타낸 모식도이다.
도 1을 참조하면, 인삼열매 발효물을 용매 분획하는 단계는 인삼열매 발효물을 정제하여 펩타이드를 추출하는 단계로서 상기 용매 분획은 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물을 통해 순차적으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 용매 분획 후 컬럼을 통해 정제할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 인삼열매 발효 정제물은 인삼열매에서 유래된 헥사 펩타이드(Hexapeptide)일 수 있고, 상기 헥사 펩타이드는 글리신(Glycine, Gly)-알라닌(Alanine, Ala)-글리신(Glycine, Gly)-알라닌(Alanine, Ala)-글리신(Glycine, Gly)-알라닌(Alanine, Ala)일 수 있다.
본 발명에서 상기 화장료 조성물은 상기 인삼열매 발효물 또는 상기 인삼열매 발효 정제물을 1 내지 90 중량% 포함할 수 있고, 바람직하게는 1 내지 20 중량% 포함할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 상기 인삼열매 발효물 및 상기 인삼열매 발효 정제물을 포함할 수 있고, 각각 1 내지 20 중량% 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 콜라게나제, MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)과 같은 콜라겐 분해 효소의 활성을 저해하는 효과가 매우 우수한 것으로 확인이 되었으며, 또한 세포 내 콜라겐 생성을 촉진하는 효과와 피부세포의 재생능을 향상시키는 효과 또한 매우 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명에 따른 상기 화장료 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등으로 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.
상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제주 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 주름개선 성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 피부주름개선 성분으로는 비타민 C, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에서 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 세럼, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 샴푸 또는 린스로 제형화될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc, Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.
구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로 로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다. 다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 인삼열매 발효물 또는 인삼열매 발효 정제물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 인삼열매 발효물 또는 인삼열매 발효 정제물을 포함함으로써 콜라겐 분해 효소(Matrix Metalloproteinase-1)의 활성을 저해하고, 세포 내 콜라겐의 생성을 촉진하며, 표피 세포를 증식시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 제조예 및 실험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
제조예 1
건조된 인삼열매 200 g에 정제수 2 kg을 첨가하여 120℃에서 6시간 동안 열수 추출하였으며, 추출 후 당도 6 내지 8 birx인 인삼열매 열매 추출물을 사용하였다. 추출 후 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei, 한국세포주 은행에서 구입) 균주를 배양하여 상기 인삼열매 열매 추출물에 spectrophotometer로 측정한 농도가 1.0×109 cfu/ml인 배양액 1 중량%를 접종하고, 37℃에서 3일간 발효하였으며, 배양에 사용된 배지는 글루코오스 0.6 중량%, 효소 추출물 0.3 중량%, 소이톤 0.1 중량% 및 증류수로 구성된 배지를 사용하였다. 발효 후 발효액을 4,000 rpm, 10분 동안 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리한 후, 배양액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 인삼열매 발효물을 제조하였다.
제조예 2
상기 제조예 1에서 미생물로 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus, Apep microrganism S001, 한국세포주 은행에서 구입)를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 인삼열매 발효물을 제조하였다.
제조예 3
상기 제조예 1에서 미생물로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, Apep microrganism K007, 한국세포주 은행에서 구입)를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 인삼열매 발효물을 제조하였다.
제조예 4
상기 제조예 1에서 미생물로 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus, Apep microrganism S001, 한국세포주 은행에서 구입) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, Apep microrganism K007, 한국세포주 은행에서 구입)를 1:1 중량부로 혼합한 혼합균주를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 인삼열매 발효물을 제조하였다.
제조예 5
건조된 인삼열매 200 g에 70%(v/v) 에탄올 2 kg을 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 추출하였으며, 추출 후 당도 6 내지 8birx인 인삼열매 열매 추출물을 사용하였다. 추출 후 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei, 한국세포주 은행에서 구입) 균주를 배양하여 상기 인삼열매 열매 추출물에 spectrophotometer로 측정한 농도가 1.0×109 cfu/ml인 배양액 1 중량%를 접종하고, 37℃에서 3일간 발효하였으며, 배양에 사용된 배지는 글루코오스 0.6 중량%, 효소 추출물 0.3 중량%, 소이톤 0.1 중량% 및 증류수로 구성된 배지를 사용하였다. 발효 후 발효액을 4,000rpm, 10분 동안 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리한 후, 배양액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 인삼열매 발효물을 제조하였다.
제조예 6
상기 제조예 5에서 미생물로 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus, Apep microrganism S001, 한국세포주 은행에서 구입)를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 인삼열매 발효물을 제조하였다.
제조예 7
상기 제조예 5에서 미생물로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, Apep microrganism K007, 한국세포주 은행에서 구입)를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 인삼열매 발효물을 제조하였다.
제조예 8
상기 제조예 5에서 미생물로 바실러스 메틸로트로피쿠스(Bacillus methylotrophicus, Apep microrganism S001, 한국세포주 은행에서 구입) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, Apep microrganism K007, 한국세포주 은행에서 구입)를 1:1 중량부로 혼합한 혼합균주를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 인삼열매 발효물을 제조하였다.
제조예 9
건조된 인삼열매 200 g에 정제수 2 kg을 첨가하여 120℃에서 6시간 동안 열수 추출하여 당도 6 내지 8birx인 인삼열매 열매 추출물을 제조하였다.
제조예 10
건조된 인삼열매 200 g에 70%(v/v) 에탄올 2 kg을 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 추출하여 당도 6 내지 8birx인 인삼열매 열매 추출물을 제조하였다.
정제예
1) 상기 제조예 4에서 제조한 인삼열매 발효물에 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 n-헥산 분획물, 디클로로메탄 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물로 분리하여 분획물을 제조하였다.
2) 분리된 물 분획물을 감압 농축한 후, 실리카 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 이때 컬럼은 실리카 컬럼(Silica column)을 사용하였고, 이동상 용매는 증류수 CH2Cl2: Water 90 : 10, 80 : 20 순으로 1L 씩 변화시켜 진행하여 fr1(1), fr2(2), fr3(3), fr4(4), fr5(5), fr6(6-7), fr7(8-10), fr8(11), fr9(12), fr10(13-15)으로 분리하였다.
3) 분리된 fr.1을 Prep. HPLC(C18 ODS column, 3ml/min)를 하여 정제하였다. 용매는 용매 A : Water in 0.1% TFA, 용매 B : 아세토나이트릴(ACN) in 0.1% TFA, 98:2 조건으로 진행하여 comp1을 인삼열매 발효 정제물에서 정제하였다.
실험예 1
상기 제조예 1 내지 10에서 제조된 인삼열매 발효물의 피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해 하기 방법에 따라 생체 외(in vitro) 콜라게나아제(collagenase) 활성 저해 실험을 진행하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
[실험 방법]
(1) 콜라겐을 인산 완충액에 녹여 준비한다(100 ppm). 이때 양성 대조군으로 아데노신을 같은 농도로 준비한다.
(2) 100 mM Tris-cl buffer, 100 mM CaCl2 및 0.25 mg/ml 콜라게나제가 포함된 mixture를 준비하고, 상기 각각의 시험물질 및 양성대조군을 상기 mixture에 5%(v/v)의 농도로 첨가하여 반응을 진행시킨다.
(3) 25 mM 시트르산을 400 ㎕/tube 첨가하여 반응을 종료시킨다.
(4) 이후 에틸아세테이트를 1.5 ㎖/tube 첨가하고, 볼텍싱(vortexing)한 후 상등액을 취하여 황산나트륨 150 mg/ep-tube에 옮기고, 볼텍싱 후 원심분리(10,000rpm, 3분)한다.
(5) 상등액 300 ㎕/ep-tube를 취하여 석영 96well 플레이트에 옮긴 후 320 nm에서 흡광도를 측정한다.
구분 콜라게나제 억제능 (%)
대조군 (무처리군) 100
제조예 1 77
제조예 2 71
제조예 3 69
제조예 4 62
제조예 5 69
제조예 6 63
제조예 7 64
제조예 8 58
제조예 9 88
제조예 10 91
대조군 (아데노신) 59
상기 표 1을 참조하면, 모든 발효물(제조예 1 내지 8)에서 콜라게나제 억제능을 확인할 수 있으며, 발효하지 않은 경우(제조예 9 및 10)보다 콜라게나제 억제능이 우수함을 확인할 수 있다.
또한, 락토바실러스 속 균주를 사용한 경우(제조예 1 및 제조예 5)보다 바실러스 속 균주를 사용한 경우(제조예 2 내지 4 및 제조예 6 내지 8)의 콜라게나제 억제능이 우수하며, 단독 균주를 사용한 경우(제조예 1, 2, 3, 5, 6 및 7)보다 혼합균주를 사용한 경우(제조예 4 및 8)의 콜라게나제 억제능이 우수한 것을 알 수 있다.
또한, 열수 추출한 경우(제조예 1 내지 4)보다 에탄올 추출한 경우(제조예 5 내지 8)보다 콜라게나제 억제능이 우수한 것을 알 수 있다.
실험예 2
제조예 10의 인삼열매 열매 추출물, 제조예 8 인삼열매 발효물 및 정제예에서 분리한 분획물의 단백질 함량을 로우리방법(lowry methods)를 이용하여 측정하였으며, 측정 결과를 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.
구분 단백질 정량값 (mg/ml) 분획중 단백질량 (mg) 계 (%)
제조예 9
(인삼열매 추출물)		 0.219 49.427 -
제조예 4
(인삼열매 발효물)		 0.321 72.657 -
정제예
(헥산, n-Hex)		 0.032 0 0.00
정제예
(디클로로메탄, CH2Cl2)		 0.046 0 0.00
정제예 (에틸아세테이트) 0.099 2.498 3.67
정제예
(부탄올, n-BuOH)		 0.302 16.767 24.63
정제예
(물)		 0.759 48.814 71.70
계 - 68.079 100
상기 표 2 및 도 2를 참조하면, 인삼열매 열매 추출물(제조예 10)에 비해 인삼열매 발효물(제조예 8)의 단백질 함량이 정량 값이 약 147% 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 인삼열매 발효 분획물(정제예)은 물 분획물의 단백질 함량이 가장 높은 것을 확인할 수 있다.
또한, 인삼열매 발효물(제조예 8)보다 인삼열매 발효 물 분획물 (정제예)의 단백질 함량(mg/ml)이 2.36배 이상인 것을 확인할 수 있다.
실험예 3
상기 정제예에서 분리된 fr.1 내지 10 대하여 실리카겔 박막크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC)를 디클로로메탄 : 99.5%(v/v) 메탄올(2:1) 혼합 용매 하에 실시하였으며, 이에 따른 TLC 패턴을 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, 분리된 물질을 확인한 결과 210 UV에서 확인할 수 있으며, lowry에서 함량을 확인한 결과 단백질임을 확인할 수 있고, 이에 따라 단백질 정제 조건을 확인할 수 있다.
실험예 4
상기 정제예에서 분리된 물(물 층), fr.1, prep1에 포함된 단백질 함량을 로우리 방법(lowry methods)을 이용하여 측정하였으며, 측정 결과를 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다.
구분 단백질 정량값
(펩타이드 함량, mg/ml)		 총 단백질량 (mg)
정제 예 (물층) 0.759 26.077
정제 예 (Slica column -fr.1) 2.31 48.814
정제 예 (HPLC Prep1) 2.66 143.7848
상기 표 3 및 도 4를 참조하면, HPLC(High Pressure Liquid Chromatography)를 통한 분리정제 진행 시 단백질 함량이 높아짐은 확인하였으나, 일정수준 이상으로는 단백질 함량이 높아지지 않는 것을 확인할 수 있다.
실험예 6
제조예 4에 따른 인삼열매 발효물, 정제예의 물 층, fr.1 및 prep.1 내지 4에 포함된 타겟 펩타이드(Hexapeptide AP-1) 함량을 상기 정제예와 동일한 HPLC를 이용하여 측정하였으며, 측정 결과를 하기 표 4 및 도 5에 나타내었다.
HPLC분석결과 target peptide
인삼열매 발효물 Unknown
water 층 2.16
Silica gel column 4.21
HPLC prep.1 93.1
prep.2 4.21
prep.3 1.54
prep.4 Unknown
상기 표 4 및 도 5을 참조하면, 인삼열매 발효물(제조예 4) 및 prep.4(정제예)의 경우는 타겟 펩타이드가 나타나지는 않았으나, 상이한 펩타이드가 존재하였으며, prep 1 (정제예)의 경우 타겟 펩타이드의 함량이 HPLC함량 확인을 통해 93%까지 향상된 것을 확인할 수 있었고 이 결과를 도 6에 나타내었다.
실험예 7
HPLC 정제 후 확보된 comp1 구조를 확인하기 위하여 하기 실험방법에 따라 실험을 진행하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
[실험 방법]
100 ppm으로 시료를 준비한 후, Mass(FAB-Mass)를 이용하여 Mass를 측정하였다. 이후 600 MHz NMR(Agilent Technologies(DD2 600 MHz FT NMR))을 이용하여, 1H, 13C, HMBC, HMQC, COSY 및 DEPT를 측정하여 구조를 확인하였다.
도 7를 참조하면, Hexapeptide AP-1 경우 1H NMR와 13C NMR과 2D NMR을 통해 정확한 구조를 파악하였으며, 1H NMR에서 δ 1.260에서 CH3가 어려개 겹친 peak를 확인하였으며 , d3.7011 3.804에서 CH2의 피크들을 d4.237,4.197에서 CH의 피크를 확인하였다. 또한, DEPT를 통해 C * 6, CH * 3, CH2 * 3, CH * 3을 확인하여 총 CH, CH2, CH3의 개수를 파악하였으며, 2D-NMR을 통해 각 C, CH, CH2, CH3의 결합을 확인하였다. 이를 통해 FAB-Mass 통해 확인한 분자량인 403과 비교 확인하였을 때, Gly-Ala이 반복적으로 붙어 있는 구조임을 확인하였다. 그 후 펩타이드 합성을 진행하였으며, 합성된 펩타이드와 발효물에서 분리, 정제한 펩타이드를 HPLC를 통해 비교하여 동일한 시간대에 피크가 나오는 것을 확인하였다.
실험예 8
Matrix methaloprotease-1(MMP-1, collagenase) 생성을 저해하는 물질은 콜라겐을 보호하여 피부조직의 기계적 특성을 유지시켜 탄력과 피부가 늘어지는 것을 방지하기 때문에 원료에 대한 MMP-1 생성을 저해하는 활성을 측정하여 활성을 갖는 원료는 주름을 개선하고 탄력 있는 피부를 위한 화장품 개발에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 평가할 수가 있다. 이에, 상기 제조예 4의 인삼열매 발효물, 제조예 10의 인삼열매 열매 추출물 및 정제예의 분획물의 MMP-1 생성 저해능 시험을 하기와 같은 방법으로 진행하였고, 이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다. 대조군으로 레티놀을 이용하였다.
[실험 방법]
사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media, Sigma)에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, Sigma)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 2 X 105 cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 실험군과 대조군으로 레티놀을 10 ug/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Matrix Metalloproteinase-1(MMP-1), Human,biotrak,ELISA kit (GE healthcare RPN2610)을 통해 MMP-1의 생성저해능을 측정하였다.
도 8를 참조하면, 생성되는 MMP-1의 발현 양이 대부분의 실험군에서 줄어드는 것을 확인하였으며 실험군 내에서도 조성물 내 기능성 원료성분의 조합 및 조성물에 따라 차이가 있는 것으로 확인되었다. 특히 인삼열매 발효 후 분획 시 물층(정제예)에 가장 MMP-1 발현을 저해하는 물질이 많이 분포되어 있는 판단된다. 이러한 결과로부터 피부에 MMP-1생성을 유발하는 UV가 요인으로 적용되었을 때, 인삼열매 발효물 및 인삼열매 발효 정제물을 혼합하여 사용하는 것이 더 유용한 결과를 나타내어 MMP-1생성을 저해하여 피부의 피부노화을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.
실험예 9
상기 제조예 4의 인삼열매 발효물, 정제예의 물층, fr1 및 comp1 (Hexapeptide AP-1)의 세포 내 콜라겐 생성능을 하기와 같은 방법으로 진행하였고, 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다. 대조군으로 형질전환 성장 인자 베타(transforming growth factor beta: TGFβ)를 사용하였다.
[실험 방법]
시험에 사용할 사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 Medium 106 (cascade biologics, M-106-500) 에 1X LSGS(Low Serum Growth Supplement, cascade biologics S-003-10)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 1X 105 cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 실험군과 대조군으로 TGFβ를 각각 1mg/ml 및 10μg/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Procollagen Type I C-peptide(이하 PIP) EIA kit (takara MK101) 을 통해 Collagen 생성량을 측정하였다.
도 9을 참조하면, 모든 실험군과 대조군에서 콜라겐 생성량이 증가하는 것을 확인하였고, 정제되지 않은 경우 (인삼열매 발효물)보다 정제된 경우(정제예 물층, fr1 및 comp1 (Hexapeptide AP-1)가 우수한 콜라겐 생성효과가 있음을 확인할 수 있고, 또한 가장 많이 정제된 comp1 (Hexapeptide AP-1) 가 가장 높은 콜라겐 생성효과가 있음을 알 수 있다.
이러한 결과로부터 피부에서의 collagen 생성을 촉진하는 성분이 인삼열매 열매 내에 다량 포함되어 있는 것으로 추측되며, 인삼열매 발효물 및 인삼열매 발효 정제물을 혼합하여 사용하는 것이 collagen 생성을 증가시켜 피부의 피부노화을 억제할 수 있을 것으로 사료된다.
실험예 10
정제예의 comp1의 세포 증식능을 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였고, 그에 대한 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다. 세포 증식능 실험은 MTT assay를 이용하여 측정하였다.
[실험 방법]
3T3세포 및 HACAT세포를 24웰 플레이트에 각 웰당 4 X 104 cells/24well의 세포수가 되도록 seeding 한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2조건으로 항온 배양하였다. PBS(phosphate buffer saline)로 2회 세척하고, 각각의 시료를 농도별(1mg~1ug/mL)로 처리하여 24시간 동안 항온 배양하였다. 배양 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 0.5% in DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)를 배양 배지와 1:9(v/v)로 혼합하여 첨가한 후 2시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양한다. 이후 생성된 포르마잔(frmazan)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 ELISA를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 10 및 도 11를 참조하면, HACAT 세포 및 3T3세포에 대하여, 저농도에서 고농도까지 처리한 1종의 펩타이드(comp1)이 농도 의존적으로 세포 증식능이 있는 것으로 확인되었으며 세포들의 현미경적인 관찰에서도 별다른 변화가 관찰되지 않았다.
이를 통해 본 발명의 화장료 조성물은 피부 관련 세포에 독성이 전혀 없음을 알 수 있으며 피부 세포 증식효과가 있는 것으로 보인다. 따라서 본 발명의 화장료 조성물을 피부에 처리하여도 큰 영향을 끼치지 않으리라는 것을 예측할 수 있다.
실험예 11
정제예의 comp1의 열 및 광안전성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였고, 그에 대한 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
[실험 방법]
시료가 각각 10 mg/mL이 되도록 각각의 시료를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 용해하여 유리 바이알에 분주하여 넣은 후 50℃에서 4주간 보관하며 열에 의한 조성물 내 펩타이드의 손실을 측정하고 동일한 방법으로 일광 조건에서 안정성 여부를 측정하였다.
도 12 및 도 13를 참조하면, 열에 의한 펩타이드 손실을 측정하고 일광 조건에서 안정성 여부를 측정한 결과, 모든 1종의 펩타이드(comp1)에서 4주까지 단지 10% 미만의 펩타이드 손실을 나타내어 열 및 일광 보관 기간에 있어 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인하였다.
화장료 조성물 제조예
크림 타입 조성물은 아래와 같은 방법을 제조하였다. 크림 타입 조성물에는 앞의 Hexapeptide AP-1을 조성물의 1% 중량비로 포함하여 제형을 구성하였다(하기 표 5 참조).
1) [수상B] 제조
물을 가온하여 60 내지 70℃로 교반 하면서 분말상 원료를 순차적으로 서서히 투입하여 점증이 될 때 까지 디스퍼 믹서로 교반하여 고르게 풀어준 후, 식혀준다. 공정 용이성을 위해 사전에 준비해둔다.
2) [수상A] 제조
분말상 원료를 글리세린에 충분히 함침 시킨 후, 물을 첨가하여 50 내지 60℃로 가온하여 디스퍼 믹서로 골고루 녹여준다.
3) [수상A] + [수상B] 혼합 교반 제조
미리 준비해 둔 수상B를 수상A에 첨가하여 고르게 섞어주면서 가온한다. 65 내지 75℃가 유지될 수 있도록 준비해둔다.
4) [유상] 혼합 교반 제조
각 원료를 개별 비이커에 평량하여 가온 교반하여 녹여준다. (80℃ 이상) 녹여진 상은 75℃ 이상 온도가 유지될 수 있도록 준비해둔다.
5) 전체 크림 제조
준비된 수상 혼합물에 유상을 서서히 투입 첨가하여 약 10분간 강하게 교반(6,000 rpm)하여 유화 공정을 진행한다. 이때 온도는 65 내지 75℃로 유지할 수 있도록 한다.
완료 후, 첨가제 A를 준비하여 pH 조정 및 중화 공정을 진행한다. 이 때, 내용물의 점도가 상승하므로, 강하게(6,000 rpm) 골고루 5분 이상 교반해준다.
50℃ 이하로 내용물이 식으면 첨가제 B를 넣고 서서히 2분 정도 섞어주며(3,000 내지 4,000 rpm), 40℃ 이하가 되면 첨가제 C와 첨가제 D를 순차적으로 첨가하여 2분 정도 천천히(3,000 내지 4,000 rpm) 교반 후, 탈기/여과 공정을 거쳐 내용물을 수거한다.
완료 후, pH 조정 및 중화 공정을 진행한다. 이 때, 내용물의 점도가 상승하므로, 강하게(6,000 rpm) 골고루 5분 이상 교반해준다.
50℃ 이하로 내용물이 식으면 보존제를 넣고 서서히 2분 정도 섞어주며(3,000 내지 4,000 rpm), 40℃ 이하가 되면 인삼열매 펩타이드와 향료를 첨가하여 2분 정도 천천히(3,000 내지 4,000 rpm) 교반 후, 탈기/여과 공정을 거쳐 내용물을 수거한다.
Figure pat00001
제조된 크림은 저온(4℃)과 고온 (50℃), 상온 (25℃), 일광조건에서 보관하여 크림의 안정성을 확인하였으며 모든 조건에서 4주 동안 크림의 변색, 변취, 상변화, pH 변화와 같은 현상들이 발견되지 않았으며, 이를 통해,크림의 안정성이 유지되는 것을 확인하였다. 특히 인삼열매 펩타이드의 안정성이 유지되어 HPLC 분석 결과 모든 조건에서 4주 동안 90% 이상의 함량이 유지되는 것을 확인하였다(하기 표 6 참조).
구분 저온 (4℃) 상온 (25℃) 고온 (50℃) 일광
1주 후 99 98 98 97
2주 후 99 95 96 96
3주 후 98 95 95 95
4주 후 98 93 93 94
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 인삼열매(Panax Ginseng Berry)에 균을 접종 및 발효시킨 후 여과하여 미생물을 제거하는 단계를 포함하여 인삼열매 발효물 내 기능성 펩타이드를 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발효는 30 내지 50℃에서 2 내지 4일간 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균은 바실러스 속(Bacullus sp.) 균인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 용매 분획 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 (글리신-알라닌)n(n은 2 내지 10의 정수)의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 글리신-알라닌-글리신-알라닌-글리신-알라닌의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 피부 주름 개선 및 항노화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 피부세포 생장을 촉진하여 피부세포의 재생속도를 증가시키는 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 기능성 펩타이드는 인간 섬유아세포주 내 콜라겐 생성을 촉진하고, 콜라겐 분해효소(MMP-1)의 활성을 억제하여 피부 주름 개선 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 인삼열매 발효물 및 상기 기능성 펩타이드는 인간 피부 각질 세포주 증식 촉진 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 분리된 기능성 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
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