KR20180090594A

KR20180090594A - 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 발효인삼 제조방법

Info

Publication number: KR20180090594A
Application number: KR1020170015643A
Authority: KR
Inventors: 김성수; 김경탁; 이영경; 정지윤
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2017-02-03
Publication date: 2018-08-13
Also published as: KR101898513B1

Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 4-1-1(KCCM: 11953P), 이를 이용하여 발효시킨 발효인삼, 발효인삼의 제조방법 및 발효인삼을 포함하는 건강기능성 식품조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 균주 4-1-1(KCCM: 11953P)를 이용하여 발효시킨 발효인삼은 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT)함량에 대한 파낙사디올(Panaxadiol; PPD)의 함량이 월등히 증진되어 있고 특히 다양한 생리활성을 갖는 진세노사이드 Rd의 함량이 증진되어 있어 있으며 혈전 용해 활성이 우수하므로 종래 발효인삼 보다 기능성이 더욱 증진되어 소비자의 건강을 향상시킬 수 있는 효과가 있으며 따라서 건강기능성 식품의 원료로 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 발효인삼 제조방법{Novel Bacillus subtilis 4-1-1 and method for fermented ginseng using the same}

본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 균주 4-1-1(KCCM: 11953P) 및 이를 이용한 발효인삼 제조방법에 관한 것이다.

인삼은 주로 한국, 중국, 일본 등의 아시아 국가에서 생약의 형태로 정신 의학적 질환, 신경계 질환 및 당뇨병 등 여러 가지 질병에 대해 사용되어 왔으며, 인삼의 주요 성분인 사포닌은 강장, 강정, 진정조형 및 항고혈압 등에 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 현재 인삼의 사용은, 재배하여 채취한 상태 그대로의 수삼을 상온에서 건조시킨 백삼, 수삼을 98 ~ 100℃에서 가열 처리하여 제조되는 홍삼, 또는 120 ~ 180℃에서 가열 처리하여 제조되는 선삼, 흑삼 등의 열처리 인삼의 형태로 사용되고 있다.

인삼의 주요 효능을 나타내는 사포닌(saponin)은 30종류 이상의 진세노사이드(ginsenoside)로 구성되는데, 진세노사이드는 면역력강화, 항염증작용, 항알러지작용, 항암효과, 발기부전에 대한 효과, 혈압강하작용, 항콜레스테롤작용, 항혈전작용, 성인병 및 노화에 대한 예방 및 치료효과가 있다고 알려져 있다.

인삼의 사포닌은 트리테르페노이드(triterpenoid) 계열의 담마란(dammarane) 골격에 글루코즈(glucose), 아라비노즈(arabinose), 자일로즈(xylose), 람노즈(rhamnose) 등이 결합되어 있는 중성배당체이다. 인삼을 물과 알코올로 추출할 때 인삼의 진세노사이드 중에서 Rb1, Rb2, Rc, Rg1 등이 다량 존재하는 것이 알려져 있다. 그러나, 이러한 진세노사이드들은 체내에서 흡수가 잘 되지 않아 약학적 조성물 및 식품 조성물로서 이용되기에 적합하지 않다. 이러한 인삼 내의 진세노사이드들은 홍삼이나 흑삼 등으로 가공처리 되는 과정을 통해 자연계에서는 존재하지 않는 진세노사이드들로 변환됨으로써 체내에서 흡수가 잘 되어, 각종 질환의 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 적합하게 이용될 수 있다. 즉, 가공 처리 과정을 통해, 인삼의 진세노사이드 중 Rb1, Rb2, Rc, Rg1 등으로부터 글리코실 잔기가 이탈되면서, 진세노사이드 Rg2, Rg3, Rh2, Rh1 등이 생성되었다가, 다시 20번 위치의 탈수 과정을 통해 Rg5, Rk1, Rg6, Rk3, F4, Rh4가 생성되는 것으로 알려져 있다.

또한, 진세노사이드들은 유기산 첨가에 의해 가수분해가 진행되어 당이 떨어져 나가고 측쇄부분이 고리화(cyclization)되면서, 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT)이나 파낙사디올(Panaxadiol; PPD)이 형성된다. 진세노사이드가 체내로 들어올 경우, Rb1, Rb2, Rc, Rg1 등의 진세노사이드는 체내의 장내 미생물에 의해 분해가 되어 흡수가 가능하게 된다. 진세노사이드가 순차적으로 장내 미생물에 의해 분해가 되어, Rb1은 Rd, 화합물 K(Compound K), 프로토파낙사다이올로 순차적 전환이 되지만, 사람의 체질 및 식습관에 따라 미생물의 존재 유무와 보유 정도가 사실상 다르기 때문에 대사산물의 전환에 의한 흡수도 상당한 차이를 지니고 있으며, 그로 인한 효능에도 상당한 차이를 나타낼 수 있다.

따라서 대사산물의 전환에 의한 효능과 체내 흡수율의 차이를 없애기 위해, 미생물에 의한 인삼 내 진세노사이드의 전환을 통해 체내의 진세노사이드 흡수율을 높이고, 동시에 특정 형태로의 진세노사이드 전환을 통해 효능적으로 강화된 발효인삼에 대한 개발 필요성이 제기되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1331171호

따라서 본 발명자들은 진세노사이드의 체내 흡수율을 증진시키고 진세노사이드가 갖는 체내에서의 유용한 생리활성을 향상시킬 수 있는 기능성이 강화된 발효인삼 제조를 위한 신규한 균주를 분리 및 동정하였고, 발굴한 신균주를 이용하여 발효인삼을 제조하는 공정을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주(수탁번호 KCCM11953P)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주를 이용한 발효인삼의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 발효인삼을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 발효인삼을 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주(수탁번호 KCCM11953P)을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 균주는 청국장에서 분리된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 신규한 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주(수탁번호 KCCM11953P)를 이용하여 인삼을 발효시키는 단계를 포함하고, 상기 발효과정을 통해 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT) 함량에 대한 파낙사디올(Panaxadiol; PPD) 함량이 3~5의 비율로 증가된, 발효인삼의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주(수탁번호 KCCM11953P)는 인삼 100 중량부에 대해 1~5 중량부로 접종하여 발효시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효는 35~37℃의 온도에서 5~10일 동안 발효시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효과정을 통해 진세노사이드 Rb1, Rc, Re 및 Rg1의 함량은 감소되고, 진세노사이드 Rd 및 Rg2+Rh1의 함량은 증가될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 진세노사이드 Rd는 진세노사이드 Rc 또는 Rb1에서 전환된 것일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 발효인삼을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효인삼은 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT) 함량에 대한 파낙사디올(Panaxadiol; PPD) 함량이 3~5의 비율로 증가되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효인삼은 진세노사이드 Rb1, Rc, Re 및 Rg1의 함량은 감소되어 있고, 진세노사이드 Rd 및 Rg2+Rh1의 함량은 증가되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발효인삼은 혈전용해 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 발효인삼을 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈전으로 인한 동맥경화증, 허혈성 심질환, 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선 효과를 갖는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 균주 4-1-1(KCCM: 11953P)를 이용하여 발효시킨 발효인삼은 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT)함량에 대한 파낙사디올(Panaxadiol; PPD)의 함량이 월등히 증진되어 있고 특히 다양한 생리활성을 갖는 진세노사이드 Rd의 함량이 증진되어 있다. 따라서 본 발명의 발효인삼은 종래 발효인삼 보다 기능성이 증진되어 있어 소비자의 건강을 향상시킬 수 있는 효과가 있고, 건강기능성 식품의 새로운 원료로 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 11953P와 대조군 균주를 인삼 고체 배지에 접종하고, 배양한 후 배지 표면을 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 11953P와 대조군 균주를 인삼 고체 배지에 접종한 후, 발효시간에 따른 균의 증식정도를 균수 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 11953P와 대조군 균주를 이용하여 인삼을 발효하는 과정 중에서 진세노사이드의 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 11953P와 대조군 균주를 이용하여 인삼을 발효시키는 과정에서 발효된 배지에서 형성된 점진물의 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 11953P와 대조군 균주를 이용하여 인삼을 발효시키는 과정에서 발효 시간에 따른 점도 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 신균주 바실러스 서브틸리스 KCCM 11953P와 대조군 균주를 이용하여 제조한 인삼발효물에 대해 발효 시간에 따른 혈전용해능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 진세노사이드의 체내 흡수율을 증진시키고 진세노사이드가 갖는 체내 유용효과를 향상시킬 수 있도록 기능성이 강화된 발효인삼 제조에 적합한 신규 균주인 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P)을 최초로 분리 및 동정하였고 이를 이용한 발효인삼 제조방법, 상기 방법으로 제조된 발효인삼 및 상기 발효인삼을 포함하는 건강기능성 식품 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 명세서에서 "발효인삼"이라 함은 수삼, 백삼, 홍삼 등의 인삼에 미생물, 특히 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P) 균주를 접종하고, 배양하여 얻어진 생성물을 말하며, 수득한 생성물을 '발효인삼'으로 지칭되기도 한다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P) 균주는 청국장으로부터 분리 및 동정하였고, 서열분석 결과 종래 밝혀지지 않았던 신균주임을 확인하였으며, 이에 본 발명자들은 발굴한 신균주를 2016년 12월 01일자로 한국미생물자원센터에 기탁하였고 “KCCM 11953P”기탁번호를 부여받았다.

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P) 균주는 사포닌, 즉 진세노사이드의 생물전환능을 가지는 특징이 있으며, 특히 이를 이용하여 인삼을 발효시킬 경우, 발효된 인삼은 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT) 함량에 대한 파낙사디올(Panaxadiol; PPD) 함량이 3~5의 비율로 증가되어 있음을 확인하였다.

본 발명에서 상기 발효인삼에 제조되는 인삼은 특별히 한정된 것은 아니며, 인삼 그 자체 및 인삼 가공물을 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 산삼, 산삼 배양근, 산양삼, 수삼, 홍삼, 홍미삼, 백삼, 미삼, 인삼 열매, 인삼 잎, 인삼 뿌리 등을 사용하거나 인삼 추출액 및 인삼 분말 등을 사용할 수 있다. 상기 인삼의 원산지는 제한되지 아니하며, 예를 들어 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼, 베트남인삼 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 상기 인삼은 필요에 따라 통상의 방법으로 멸균시켜 사용할 수도 있다.

발효인삼의 제조에 사용되는 인삼의 형태로는 특별히 한정되지 않으며 예를 들면, 추출물, 분말 및 엑기스 형태일 수 있다. 상기 추출물은 열수추출법, 주정추출법 및 혼합추출법으로 제조할 수 있고, 분말은 건조인삼을 분쇄기를 이용하여 분쇄함으로써 제조하거나 추출물 분말을 사용할 수 있다. 상기에서 인삼의 분말화 정도는 특별히 한정되지는 않으며, 청국장 유래의 바실러스 속 균주가 인삼의 조직 또는 섬유소 내에 높은 효율로 침투할 수 있을 정도인 것이 바람직하다. 예를 들어, 인삼의 분말화 정도는 입자크기가 100∼150 메쉬 정도가 되도록 할 수 있다. 상기 엑기스는 감압증류법 이나 박막증류법으로 제조할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 인삼을 분쇄한 후 수용액을 제조하여 발효시킬 수도 있다.

본 발명에서 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P) 균주를 이용한 발효인삼은 상술한 인삼에 상기 균주를 접종하고 상기 균주의 적당한 발효온도인 35∼40℃에서 1일 내지 10일 동안 배양 및 발효시켜 수득할 수 있으며, 바람직하게는 35~37℃의 온도에서 5~10일 동안 발효시켜 수득할 수 있다.

발효를 위한 균주의 접종은 인삼 100 중량%에 대해 1~5 중량%로 접종하여 발효시킬 수 있으며, 이러한 발효과정을 통해 제조된 본 발명의 발효인삼에는 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT) 함량에 대한 파낙사디올(Panaxadiol; PPD) 함량이 3~5의 비율로 증가되어 있다.

앞서 기술한 바와 같이 인삼 내에는 일반적으로 Rb1, Rb2, Rc, Rg1 등의 진세노사이드가 다량 존재하고 있으나 이러한 진세노사이드들은 체내에서 흡수가 잘 되지 않는다는 문제점이 있다. 따라서 이러한 진세노사이드가 체내 흡수가 잘되도록 진세노사이드의 전환이 수반되어야 하는데, 특히 본 발명에서는 새롭게 분리된 본 발명의 신균주가 체내 흡수율이 우수한 진세노사이드인 Rd, Rg2, Rg3, Rh2, Rh1 등으로 효율적인 진세노사이드 전환을 유도할 수 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명의 신균주인 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P) 균주를 이용하여 발효된 발효인삼은 진세노사이드의 체내 흡수율이 우수하며 따라서 진세노사이드가 가지고 있는 유용한 생리활성을 더욱 증진시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 방법으로 제조된 발효 인삼을 대상으로 발효 전후에 따른 진세노사이드의 변화를 분석한 결과, 발효과정을 통해 인삼 내에 함유된 진세노사이드 Rb1, Rc, Re 및 Rg1의 함량은 감소되고, 진세노사이드 Rd 및 Rg2+Rh1의 함량은 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

특히 본 발명의 발효인삼은 진세노사이드 Rd 함량이 월등히 증가되어 있는 것으로 나타났는데, 진세노사이드 Rd는 관절염 개선, 연골 재생, 콜라겐 형성, 항암작용, 부신피질호르몬 촉진 작용 및 항비만 등 체내 유용한 기능을 갖는다. 그러나 진세노사이드 Rd는 일반적으로 인삼에 1% 미만으로 함유되어 있어 이의 함량을 증진시키려는 연구가 많이 진행되고 있는 실정이다. 이러한 점에서 본 발명의 신균주는 진세노사이드 Rd의 함량을 효과적으로 증진시킬 수 있는 역할을 한다.

상기 본 발명의 발효인삼에 함유된 진세노사이드 Rd는 발효과정을 통해 진세노사이드 Rb1 또는 Rc가 Rd로 전환된 것이다. 이는 발효과정에서 ginsenoside-α-arabinofuranase 효소에 의해 Rc가 Rd로 전환될 수 있고, Rb1이 β-glucosidase에 의해 당이 분해되어 Rd로 전환될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 발효 인삼은 별도의 정제를 통하지 않고 직접 식품으로서의 사용이 가능하다. 즉, 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 발효 인삼은 통상의 방법에 따라 농축시키거나 동결건조하고 분말화하여 그대로 식품에 적용할 수 있는데, 숙성과정을 통하여 얻어진 숙성액을 농축 또는 동결건조한 것을 그대로 식품에 적용 수 있으며, 또는 상기 숙성액을 원심분리하여 취한 상등액을 농축 또는 동결건조하는 단계를 거쳐 얻어진 것을 그대로 식품에 적용할 수도 있다.

또한 본 발명의 발효인삼은 일반적으로 풍미를 올리거나 맛과 향이 우수한 제품(예를 들어, 식품, 약품 등)으로 만들기 위해 여러 가지의 성분을 첨가, 배합하여 최종 제품화할 수 있다. 상기 제품이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하는 것으로, 그 종류에는 제한이 없으며, 상기 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P), 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 등을 함유하는 이외에 다른 성분의 첨가에는 특별한 제한이 없다. 또한 상기 첨가, 배합하는 성분으로는 각종 천연추출물이나 당질, 유화제, 감미료, 산미료, 과즙 등이 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 발효인삼을 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품 조성물을 제공할 수 있다.

나아가 본 발명의 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P)로 발효시켜 제조한 발효인삼은 혈전용해능이 우수한 효과가 있다.

혈전(thrombus)은 순환기계 질환의 발생과 진행에 그 중심적인 역할을 하기 때문에 혈전의 생성을 예방하고 생성된 혈전을 효과적으로 제거하는 것은 혈관성 질환 치료의 핵심적인 요소이다. 또한, 혈소판은 직경이 약 2 ~ 4 μm의 원반형 혈구세포로서 혈관 파손 시에 상해된 혈관 부위에 지혈, 혈전마개를 만들고 혈액 응고인자들에 의한 응고 과정을 촉진시킴으로서 혈관 파손 부위로부터 급격한 혈액의 손실을 방지하는 생체 방어기전을 갖는다. 그러나 폐쇄 혈관 내에서의 혈소판 활성화에 의한 혈소판의 점착, 응집, 방출 반응은 혈전 형성을 초래하게 되고 동맥경화증, 허혈성 심질환, 또는 뇌졸중과 같은 질환에도 관여하고 있음이 밝혀지고 있다.

이러한 점에서 본 발명의 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM: 11953P) 균주를 이용하여 제조된 발효인삼은 종래 다른 미생물을 이용하여 발효시킨 발효인삼에 비해 혈전 용해능이 더 우수하다는 것을 확인함에 따라, 본 발명의 발효인삼 또는 상기 발효인삼을 함유한 식품 조성물은 혈전으로 인한 동맥경화증, 허혈성 심질환, 또는 뇌졸중의 예방 및 개선 효과를 가질 수 있음을 알 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

인삼 발효를 위한 바실러스속 균주 분리 및 동정

<1-1> 인삼발효에 적합한 재래식 청국장 분석

본 발명자들은 인삼발효에 적합한 미생물을 청국장으로부터 새롭게 분리하기에 앞서, 먼저 인삼발효에 적합한 재래식 청국장을 선별하려고 장본가 재래식 청국장(전북 순창), 궁골 재래식 무염 청국장(충남 논산), 청양 재래식 청국장(충남 청양)을 각각 구매하여 각 청국장 내에 함유된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)균주를 발효균주로 이용하여 인삼을 발효시켰다. 이를 위해, 4년근 금산 인삼 분말 12.5 g을 250 mL 용기(bottle)에 넣고 인삼 분말의 중량 대비 3배의 증류수를 가하여 분말에 증류수를 모두 흡수시킨 후 121℃에서 15분간 멸균하고, 실온이 되었을 때 청국장을 증류수가 흡수된 금산 인삼 분말 중량 대비 10% 및 20중량%(w/w)의 양으로 첨가하고 혼합하여 37℃에서 72시간 발효시켰다. 발효가 완료된 후, 발효과정에 따른 진세노사이드를 분석하였다. 이때 하기 대조군은 청국장이 처리되지 않은 군을 사용하였다.

그 결과, 상기 표 1과 같이 순창 및 논산에서 제조된 청국장을 10 중량%로 첨가한 군을 제외한 다른 처리군에서는 Rb1이 발효 후 대조군에 비하여 유의차를 보이며 감소한 것으로 나타났고(p<0.05). Rc와 Rg3는 모든 처리군이 대조군과 차이를 보이며 감소하였으며 특히 Rc는 첨가한 청국장의 양이 증가할수록 감소폭이 큰 것으로 확인되었다(p<0.05). 한편, Rd는 전북 순창에서 제조된 청국장을 첨가한 처리군을 제외한 4개 처리군이 대조군보다 높게 나타났으며, 이 또한 첨가한 청국장의 함량이 높을수록 Rd 함량이 높아지는 것으로 나타났다(p<0.05).

따라서 이러한 결과를 토대로 볼 때, Rb1, Rc, Rg3의 함량은 감소시키고 반면 Rd의 함량을 증가시키기 위한 청국장으로는 충남 논산과 청양에서 제조된 청국장을 이용하는 것이 적합함을 알 수 있었고, 이들 청국장에 존재하는 바실러스속 균주를 사용할 경우, 진세노사이드의 전환을 도모하여 항암작용, 부신피질호르몬 촉진 작용 및 항비만 효과를 가지는 Rd의 함량을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 알 수 있었다.

<1-2> 인삼발효에 적합한 바실러스 속 균주 분리

상기 <1-1>의 실험을 통해 인삼발효에 적합한 충남 논산과 청양에서 제조된 청국장으로부터 바실러스 속 균주를 분리하기 위해, 먼저 청국장을 멸균수에 현탁하고 100℃에서 20분간 물중탕을 한 후, LB 고체 배지에 도말하여 콜로니 모양이 다른 균주들을 분리하였고, 단일 콜로니가 형성되기까지 nutrient broth 배지에서 계대 배양하였고, 그람 염색과 포자 염색을 수행하여 그람양성의 간균으로 포자를 형성하는 10종의 균주를 분리하였다. 이후 인삼발효를 위해 사용될 수 있는 균주를 선별하기 위해 조사포닌이 첨가된 액체 LB 배지에서 사포닌 전환능력을 시험하였고, 이를 위해 테스트 튜브에 5ml의 LB 액체배지를 만들고 멸균 처리된 조사포닌액을 3000ppm의 농도로 첨가시켰다. 조사포닌이 들어있는 LB 액체배지에 균주를 접종하였으며, 37℃에서 배양을 진행하였다. 48시간 후에 원심분리를 통해 사포닌이 녹아있는 배양상등액 200μl 샘플을 취하여 1.5ml 튜브에서 shibata법을 이용한 에틸에테르와 수포화부탄올의 사포닌 추출방법을 진행하였으며, 이렇게 추출된 결과물은 40% 아세토니트릴에 녹여서 HPLC분석을 진행하였다.

그 결과, 진세노사이드 Rd의 전환능이 가장 우수한 균주를 선별하였고 이를 “바실러스 서브틸리스 4-1-1”로 명명하였다.

<1-3> 인삼발효에 적합한 바실러스 속 균주의 동정

<1-2>에서 분리한 “바실러스 서브틸리스 4-1-1” 균주의 동정을 위해, 상기 배양하여 얻은 후보 바실러스 서브틸리스 4-1-1” 균주의 단일콜로니 1ul를 루프로 채취하여 슬라이드 위에 접종하고, CCHA 매트릭스 용액을 1ul 떨어뜨린 후, VITEK MS MALDI-TOF 기기에 넣고 미생물을 동정하였다. 또한, 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 바이오팩트에 의뢰하여 분석하였다.

분석결과, 동정한 균주는 그람 양성의 간균으로 포자를 형성하는 균주로 확인되었고, 16S rRNA의 유전자 서열을 NCBI 데이터베이스와 비교 분석한 결과, 동정된 “바실러스 서브틸리스 4-1-1” 균주는 바실러스 서브스틸리스 균주와 높은 서열 유사도를 나타내었으나 종래 규명되지 않은 신규 미생물임을 확인하였고, 이에 본 발명자는 상기 균주를 2016년 12월 01일자로 한국미생물자원센터에 기탁하여 “KCCM 11953P”기탁번호를 부여받았다. 또한 동정한 “바실러스 서브틸리스 4-1-1” 균주의 16S rRNA의 염기서열을 서열번호 1에 기재하였다.

< 실시예 2>

바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주의 생장능 및 진세노사이드 전환능 분석

<2-1> 인삼배지에서의 균주성장 외관분석

상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM 11953P) 균주를 인삼 고체배지에 접종한 후, 생장 정도를 분석하였다. 이를 위해 금산에서 재배된 4년근 인삼 분말(25 g)에 중량대비 3배의 증류수(75 g)를 500mL의 병에 넣어 121℃에서 15분동안 멸균하여 인삼 고체 배지를 제조하였다. 여기에 상기 본 발명의 바실러스 서브틸리스 4-1-1를 배지 중량 대비 1중량%로 접종하고 37℃에서 0-10일까지 배양하면서 배지의 표면 및 성상을 확인하였다. 이때 대조군으로 바실러스속에 속하는 다른 균주인 바실러스 서브틸리스 KCCM 41459를 본 발명의 균주와 동일한 조건으로 실험에 사용하였다.

분석 결과, 발효 3일 후 모든 배지에서 점질물이 생성되었는데 바실러스 서브틸리스 KCCM 41459 보다 본 발명의 균주를 접종한 실험군의 배지 표면에서 더 많은 균주가 증식되어 있는 것으로 나타났고, 발효 5일 후에도 본 발명의 균주 접종 군은 배지 표면에 균의 증식이 지속되었으며 점질물은 감소하는 것으로 나타났으며, 발효 7일부터는 표면에 광택이 생겼으며 점질물은 확인되지 않았다. 발효를 시작한지 10일 후에는 배지의 색이 더 짙어졌으며 광택이 많이 돌고 발효 용기를 기울이면 배지가 흐를 정도의 물성을 갖게 되었다. 바실러스속에 속하는 2가지 균주를 대비해 보면, 본 발명의 균주가 인삼고체배지에서 월등히 증식이 활발한 것을 알 수 있었다(도 1 참조).

<2-2> 균수측정

발효가 진행되는 과정에서 균수를 측정하여 분석하였는데, 분석 결과 접종 직후 균수는 2.92-3.74 log CFU/g 이었으나 발효 3일 후 균의 종류와 관계없이 9.22 log CFU/g 이상으로 증식하였다. 이후 발효 7일까지 균수는 10.05-10.47 log CFU/g 까지 점차 증가하였으며 발효 10일 후에는 9.83-10.43 log CFU/g으로 약간 감소하였으나 유의차는 나타나지 않았다(도 2 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 균주는 인삼 발효 과정 중에도 균의 증식이 원활히 진행되고 있음을 알 수 있었다.

<2-3> 진세노사이드 분석

본 발명의 동정 균주를 이용하여 발효시킨 인삼 내에서의 진세노사이드의 전환 정도를 분석하기 위해 HPLC 분석을 이용하여 진세노사이드의 성분 및 함량을 측정하였다. 먼저 이를 위해 발효 기간에 따라 인삼 배지를 동결건조하고 분말화하였으며, 발효 인삼 분말 0.5 g에 10 mL의 메탄올을 첨가한 다음, 30분간 초음파 추출을 하였다. 초음파 추출물을 3000rpm에서 10분간 원심분리한 뒤, 상등액을 0.45 ㎛ PTFE 필터로 여과하여 HPLC 분석에 이용하였다.

분석 결과, 상기 표 2, 표 3 및 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명의 균주를 이용한 군에서는 발효시간이 경과할수록 Rb1, Rc, Re, Rg1은 감소한 것으로 나타난 반면, Rd와 Rg2+Rh1은 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 대조군 균주의 경우, 발효기간이 증가할수록 Rb2, Rb3, Rd, Rg3, Rg2+Rh1가 소폭 증가하는 경향을 보였고, 반면 Rc, Re, Rg1은 감소하는 것으로 나타났다(p<0.05).

인삼발효가 진행됨에 따라 진세노사이드의 전환이 일어나는 것을 알 수 있었고, 특히 PPD 계열의 Rc는 감소하고 Rd가 증가한 반면 PPT계열인 Re와 Rg1은 감소 Rg2+Rh1은 증가하였다.

이에 본 발명자들은 진세노사이드의 전환 정도를 보다 정량적으로 확인하기 위하여 PPD/PPT 비율을 계산하였고 증감 정도를 비교하였다. 그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 접종한 직후 PPD/PPT 비율은 대조군 및 실험군 모두 2.01~2.05로 나타났으나 발효 7일 이후 PPD/PPT 비율은 본 발명의 균을 접종한 군이 4.35로 나타났고 반면 대조군은 3.71로 본 발명의 균주를 사용한 군에 비해 유의적으로 낮은 수치로 나타났다. 나아가 본 발명의 균주를 처리한 군은 발효 10일 이후에도 PPD/PPT 비율이 대조군에 비해 월등히 높게 유지되는 것으로 나타남에 따라 본 발명의 균주가 인삼 내에서 오랜 발효시간 동안에도 PPD/PPT 비율을 높은 수준으로 지속적으로 유지시킬 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

물성 및 기능성 평가

<3-1> 점질물 함량분석

본 발명의 바실러스 서브틸리스 4-1-1(KCCM 11953P)를 이용한 인삼 발효과정 중, 발효된 인삼 배지의 점질물 함량을 조사하였다. 이를 위해 인삼배지에 동량의 증류수를 첨가하고 25℃에서 30분간 균질화한 뒤 3000rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액 5mL을 얻었고 이를 105℃에서 증발 건조시켜 그 무게를 측정하였고 무게는 시료에 대한 건물량으로 나타내었다. 이때 대조군으로는 상기 실시예 2에서 사용한 바실러스 서브틸리스 KCCM 41459 균을 처리한 군을 사용하였다.

분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명을 사용한 군과 대조군은 발효 3일 후 점질물의 함량이 각각 7.120 % 및 6.253 % 으로 나타났으며 발효가 진행됨에 따라 5일 후 3.553 % 및 2.773 %으로 감소하였다. 한편, 발효 7일부터는 배지 중에 점질물이 없는 것으로 확인되었다. 점질물의 함량을 비교해 보았을 때 본 발명의 균주로 발효시킨 배지의 점질물이 대조군의 균주로 발효시킨 배지의 점질물 보다 약 1.14~1.27배 많이 생성되어 본 발명의 균주를 사용하였을 때 점질물의 형성이 활발히 일어난 것을 알 수 있었다.

참고로, 상기 점질물은 바실러스 균주의 발효대사산물로서 glutamic acid 약 5,000개가 중합된 γ-polyglutamic acid (PGA)와 과당의 중합체인 fructan 형태의 레반으로 구성되어 있으며, 이러한 점질물은 적용 제품의 품질특성에 중요한 영향을 미칠 수 있는데, 특히 PGA는 미생물 고분자물질의 일종으로 면역증진 효과, 항암효과 등의 생리활성기능을 가지고 있어 식품, 의약품뿐만 아니라 보습성이 뛰어나 화장품의 기능성 소재로 유용한 물질이다. 따라서 본 발명의 균주를 사용할 경우, 각종 생리활성기능을 가지고 있는 점질물의 형성을 촉진시킬 수 있어 보다 기능성이 우수한 각종 제품의 원료로 제공할 수 있다.

<3-2> 점도 비교

인삼 고체 배지는 발효시간에 맞춰 샘플링하여 점도 측정에 이용하였다. 배지의 점도는 rheometer(Ar2000, TA instruments, New Castle, DE, USA)를 사용하여 25℃에서 측정하였다. Shear rate는 0~100 1/s 범위에서 100 point를 측정하였다.

분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 발효에 사용한 균의 종류와 관계없이 shear rate 가 증가함에 따라 점도는 점차 낮아져 일정한 점도로 안정화되는 것으로 나타났다. 대조군의 경우, 발효한 배지의 점도는 초기 399.85 Pa.s였으나 발효가 진행될수록 224.9 Pa.s, 115.3 Pa.s, 83.4 Pa.s 및 66.9 Pa.s로 점차 낮아졌으며, 본 발명의 균주로 처리한 경우, 접종 직후 362.6 Pa.s인 것으로 나타났고 발효 3일 후 258.5 Pa.s, 발효 5일 후 96.8 Pa.s, 발효 7일 후 75.8 Pa.s 및 발효 10일 후 78.01 Pa.s로 본 발명의 균을 접종한 배지도 발효가 진행됨에 따라 초기 점도가 낮아지는 것으로 나타났다.

<3-3> 혈전용해능 분석

인삼 고체 배지의 혈전용해활성은 Astrup 등(1952)의 방법을 수정하여 측정하였는데, 구체적으로 50mM 인산완충용액(pH 7.4, 0.15M NaCl 포함)에 피브리노겐(fibrinogen)을 최종농도 0.3%가 되도록 완전히 용해시킨 용액 5 mL에 동량의 2% agarose(멸균한천용액) 5 mL을 첨가하여 혼합하였다. 혼합한 용액에 트롬빈(thrombin; 100NIH unit/mL) 500 ㎕을 첨가하여 충분히 혼합한 후 즉시 petri-dish에 붓고 60분 동안 실온에서 고화시켜 피브린 플레이트(fibrin plate)를 제조하였다. 활성측정을 위해 피브린 플레이트에 파스테르 파이펫(pasteur pipette)으로 지름 5 mm의 구멍을 7개 만들어 배지 1 g에 증류수 4 mL을 넣어 30분간 혼합한 뒤, 원심분리하여 상등액 20 ㎕를 주입하고 37℃에서 5시간 반응시킨 다음 이때 생성된 투명환의 면적을 계산하였으며, 대조구로서는 정제된 혈전용해효소인 플라즈민(plasmin; 1.0 unit/mL)을 사용하였다. 추출액의 혈전용해활성은 대조구의 용해면적에 대한 시료의 용해면적의 상대적인 비율로 환산하여 산출하였다.

분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 접종 직후에는 균의 종류과 관계없이 혈전용해능이 확인되지 않았다. 대조군으로 바실러스 서브틸리스 KCCM 41459를 사용한 군의 발효 배지는 발효 3일 후 85.0%로 나타났으며 발효가 지속됨에 따라 혈전용해 활성은 유사 또는 소폭 증가하였으나 유의적 차이는 보이지 않았다. 그러나 본 발명의 균주로 3일 발효한 인삼배지의 혈전 용해능은 100.0%로 양성대조군인 플라즈민(plasmin) 1.0 unit/mL 처리군과 동일한 효과를 보였으며 발효 5일 후에는 97.5%로 발효 3일 차에 비해 2.5% 낮아졌으나 발효 10일차까지 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 균주를 사용할 경우, 높은 혈전용해능 효과를 갖는 발효인삼을 제조할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11953P

20161201

<110> Korea food research institute <120> Novel Bacillus subtilis 4-1-1 and method for fermented ginseng using the same <130> NPDC59887 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KCCM11953P 16s RNA sequence <400> 1 atgcagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60 acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120 atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360 gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420 gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600 aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660 tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780 agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840 gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960 tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080 ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200 caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260 gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380 cccgaagtcg gtgaggtaac c 1401

Claims

신규한 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주(수탁번호 KCCM11953P).
제1항에 있어서,
상기 균주는 청국장에서 분리된 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주(수탁번호 KCCM11953P).
신규한 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주(수탁번호 KCCM11953P)를 이용하여 인삼을 발효시키는 단계를 포함하고, 상기 발효과정을 통해 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT) 함량에 대한 파낙사디올(Panaxadiol; PPD) 함량이 3~5의 비율로 증가된, 발효인삼의 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 바실러스 서브틸리스 4-1-1 균주(수탁번호 KCCM11953P)는 인삼 100 중량부에 대해 1~5 중량부로 접종하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 발효는 35~37℃의 온도에서 5~10일 동안 발효시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 발효과정을 통해 진세노사이드 Rb1, Rc, Re 및 Rg1의 함량은 감소되고, 진세노사이드 Rd 및 Rg2+Rh1의 함량은 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 진세노사이드 Rd는 진세노사이드 Rc 또는 Rb1에서 전환된 것을 특징으로 하는 방법.
제3항의 방법으로 제조된 발효인삼.
제8항에 있어서,
상기 발효인삼은 파낙사트리올(Panaxatriol; PPT) 함량에 대한 파낙사디올(Panaxadiol; PPD) 함량이 3~5의 비율로 증가되어 있는 것을 특징으로 하는 발효인삼.
제8항에 있어서,
상기 발효인삼은 진세노사이드 Rb1, Rc, Re 및 Rg1의 함량은 감소되어 있고, 진세노사이드 Rd 및 Rg2+Rh1의 함량은 증가되어 있는 것을 특징으로 하는 발효인삼.
제10항에 있어서,
상기 진세노사이드 Rd는 진세노사이드 Rc 또는 Rb1에서 전환된 것을 특징으로 하는 발효인삼.
제8항에 있어서,
상기 발효인삼은 혈전용해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 발효인삼.
제8항의 발효인삼을 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품 조성물.
제13항에 있어서,
상기 조성물은 혈전으로 인한 동맥경화증, 허혈성 심질환, 또는 뇌졸중의 예방 또는 개선 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품 조성물.