KR102475100B1 - 각질세포 단백질 유래 고 기능성 펩타이드 제조 방법 - Google Patents

Abstract

천연 발효물 유래 고 기능성 펩타이드로서 피부 주름 억제 활성을 나타내는 신규의 펩타이드가 개시된다. 본 발명은 글리신(Glycine, Gly)-글루타민(Glutamin)-발린(Valine, Val)-세린(Serine, Ser)의 아미노산 서열로 이루어지는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 제공한다.

Description

각질세포 단백질 유래 고 기능성 펩타이드 제조 방법{PREPARING METHOD OF HIGHLY FUNCTIONAL PEPTIDE DERIVED FROM KERATINOCYTE PROTEIN}

본 발명은 고 기능성 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연 발효물 유래 고 기능성 펩타이드에 관한 것이다.

피부는 인체에서 가장 큰 조직으로 햇빛이나 물리, 화학적 자극으로부터 신체 내부를 보호해 주는 기능을 하며, 이는 인간의 생명유지를 위해 절대적으로 필요하며 끊임없이 재생되어 항상성을 유지시킨다. 피부는 바깥쪽으로부터 표피, 진피, 피하지방 순서대로 구성되어 있으며, 가장 얇은 조직인 표피는 피부의 보습과 보호를 담당하는 중요한 기능을 담당하고 있고, 수분 손실, 손상과 세균 침입 등을 방지하는 역할을 맡고 있다. 피부는 신체를 전부 감싸고 있는 조직으로 다양한 기능을 가지고 있다. 신체 내부와 외부 사이에서 장벽 기능을 가지고 있으므로, 랑게르한스섬에 의한 면역 체계를 갖추고 있고 표피에 의한 수분 조절기능을 가지고 있다. 또한, 적절한 햇빛으로 비타민 D를 합성하고 지질의 저장고와 땀샘으로의 배설 기능도 수행한다. 건강한 피부에서의 정상적인 분화과정에 의해 생성된 각질층은 피부의 보습을 유지하고 외부환경의 자극으로부터 보호하는 기능을 가지고 있다. 이러한 기능을 피부 장벽 기능이라 하며 표피의 가장 중요한 역할이라고 할 수 있다.

화장료의 가장 큰 관심 분야 중 하나는 노화와 관련된 노화, 색소침착, 탄력감소, 피부건조화, 탈모, 모발의 윤기 부족 등이다. 피부는 노화를 통해 다양한 변화를 맞게 된다. 먼저 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고, 피부에 탄력을 주는 세포외 기질(Extracellular matrix; ECM) 성분이 변화하게 되는데, 그 중 세포외 기질의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 노화 생성과 밀접한 관계를 가지게 되고, 피부결합조직을 이루고 있는 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 프로티오글리칸(proteoglycans), 글루코스아미노글리칸(glucosaminoglycan), 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin) 등은 산화되어 그 기능을 잃어버림으로써 피부가 탄력을 잃고 노화이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화되어 간다.

각질층은 외부 환경으로부터 우리 몸을 보호하고 우리 신체 내의 체액이 외부로 소실되는 것을 막는 최 전방의 방어막으로서의 기능을 수행한다. 각질형성세포 (keratinocytes)가 분화하는 동안 그 세포막은 ‘각질세포막(cornified envelope)’이라는 독특한 구조물로 대체된다. 각질세포막에는 여러 불용성 단백질들이 교차 결합(cross-link)하여 구조체를 형성하며, 세포 외부의 지질막에 둘러싸인 상태에서 지질막을 구성하는 일부 지질성분과 공유결합을 이루어 물리적인 장벽을 형성하여 외부의 위협으로부터 인체를 보호할 수 있게 한다. 특히 각질 조직 내 존재하는 다양한 구조 단백질 (Structural protein) 표피 조직의 형성과 장벽 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 각질세포 내 구조 단백질의 부재로 인해 야기되는 다양한 피부 질환이 존재한다.

세포외 기질의 결합조직섬유에는 아교섬유(교원섬유, collagen fiber), 세망섬유(reticular fiber), 탄력섬유(탄성섬유, elastic fiber)가 있으며, 이 중 피부결합조직의 70% 정도를 차지하고 있는 콜라겐은 피부의 섬유아세포(fibroblast)에서 대부분 형성된다. 나이가 들면서 피부결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는데 이는 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부노화 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다.

콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 해독 후 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 인자(Factor)들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라게나아제(Collagenase)와 같은 기질금속단백질 분해효소들(Matrix metalloproteases; MMP)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 노화이 많아지고 깊어지게 된다. 결과적으로 피부노화 현상은 세포의 비균질화, 엘라스틴의 소실, 콜라겐의 파괴, 콜라겐 합성의 감소 및 지연 등에 의해 나타난다. 따라서 피부노화 현상은 피부 표피에서도 일어나지만 이보다는 진피에서 일어나는 현상이라고 볼 수 있다.

이러한 피부노화에 대한 문제점을 해결하기 위한 다양한 화장료 조성물이 연구되고 있고, 피부의 노화완화 효과는 일부에서 가시적인 성과를 보이고 있다. 예컨대, 피부노화 및 기미, 색소침착 개선을 위해 널리 사용되고 있는 레티노이드류, 그 중에서도 레티놀(retinol)에 대한 피부노화 제거 임상 결과들이 다양하게 보고되고 있고, 레티놀을 함유한 화장료는 일광에 의해 형성된 피부노화살이나 피부처짐, 탄력감소 등을 효과적으로 개선하였다.

최근 들어 인간의 수명이 길어지고 삶의 수준이 향상됨에 따라, 건강하고 아름다워지고자 하는 사람들의 관심이 매우 증대되고 있으며 이는 피부노화와 관련된 기능성화장품 및 기능성식품, 미용분야의 시장이 최근에 급격히 증가하는 것으로 잘 알 수 있다.

국내 피부 노화 관련 기술은 선진국과 기술격차가 큰 편이며, 한국노화학회를 중심으로 진행중인 노화 연구는 대부분 노화 기전 등 기초 연구로서 항산화 활성 억제에 초점을 맞추고 있으며, 항 노화 과학 분야의 전반적인 경쟁력 수준은 세계 최고 기술보유국(미국) 대비 75% 수준이며, 기술격차는 4.5년으로 나타났고, 기술경쟁력 수준이 가장 높은 분야는 노화제어 기술개발 분야이며, 세계 최고 기술보유국 대비 74.5% 수준, 국내 노화연구 분야는 매우 다양하며, 이중 뇌신경, 혈관, 관절, 인식 및 지각, 암, 당뇨 및 비만 등의 분야가 활발한 연구영역으로 자리잡고 있으나, 피부 관련 노화 연구는 다른 연구 분야에 비해 관심도와 투자 및 연구가 미흡한 상황이며 노화라는 관점에서 체계적이고 통합적인 연구가 부재한 실정이어서 이에 대한 개선이 필요한 상황이다.

최근 20대 후반의 젊은 여성까지 항노화 제품 사용이 확대되면서 이들을 항노화 제품을 적극적으로 개발, 출시하고 있는 상황이다. 특히, 화장품 업계에서 소비자의 다양한 욕구를 충족시키고자, 화장품 분야에 한정되지 않고 뉴트리코스메틱스, 영양보조제, 에스테틱, 고기능성화장품, 미용시술 등으로 영역을 확대하고 있다. 노화 기전에 관한 연구부터, 고령자의 사회, 의학 및 복지 관련 정책 개발 지원 등 정책 연구까지 노화를 주제로 한 광범위한 연구를 수행을 하고 있으며, 특히 발효와 관련한 항노화 기술 개발 및 제품화에 많은 인력과 제화를 투자하고 있는 상황이다.

피부노화 및 노화를 효과적으로 방지 또는 개선하기 위해서는 효능이 정확하게 검증된 원료를 이용한 신규 노화 개선 조성물 개발이 필요하며, 효능의 검증은 분자생물학적 메카니즘으로 규명되고 인체 대상 임상시험으로 검증하는 것이 중요하다.

본 발명은 천연 발효물 유래 고 기능성 펩타이드로서 피부 주름 억제 활성을 나타내는 신규의 펩타이드와, 이를 함유하는 피부 주름 억제용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

상기 문제를 해결하기 위하여 본 발명은, 글리신(Glycine, Gly)-글루타민(Glutamin)-발린(Valine, Val)-세린(Serine, Ser)의 아미노산 서열로 이루어지는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 제공한다.

또한 글리신(Glycine, Gly)-글루타민(Glutamine)-아스파틱산(Aspartic acid, Asp)-프롤린(Proline, Pro)의 아미노산 서열로 이루어지는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 제공한다.

또한 상기 펩타이드는 2-(4-니트로페닐)술포닐에톡시카르보닐-아미노산(Nsc-아미노산)을 중간체로 활용하여 합성된 것을 특징으로 하는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 제공한다.

또한 상기 피부 주름 억제 활성은 엘라스타제 억제를 통해 나타나는 것을 특징으로 하는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 제공한다.

또한 상기 피부 주름 억제 활성은 콜라겐 생성을 통해 나타나는 것을 특징으로 하는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 제공한다.

상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 펩타이드를 함유하는 피부 주름 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 테트라 펩타이드는 엘라스타제 억제 또는 콜라겐 생성을 통해 우수한 피부 주름 억제 활성을 나타내어, 화장품 조성물로서 다양한 활용성을 가질 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 전체적인 펩타이드 합성 과정을 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 3에서 Collagen 생성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3 내지 5는 본 발명의 실시예 4에서 세포 증식능 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 7은 본 발명의 실시예 5에서 각각 Sample 10 및 34 테트라 펩타이드의 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8 및 9는 본 발명의 실시예 6에서 열 및 광 안전성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 바람직한 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

본 발명자들은 인삼 열매 발효물에서 유래된 특정 아미노산 서열의 테트라 펩타이드가 엘라스타제 억제 또는 콜라겐 생성을 통해 우수한 피부 주름 억제 활성을 나타내는 사실을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명은 글리신(Glycine, Gly)-글루타민(Glutamin)-발린(Valine, Val)-세린(Serine, Ser)의 아미노산 서열(서열번호 1)로 이루어지는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드와, 글리신(Glycine, Gly)-글루타민(Glutamine)-아스파틱산(Aspartic acid, Asp)-프롤린(Proline, Pro)의 아미노산 서열(서열번호 2)로 이루어지는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 개시한다.

본 발명은 다른 양태로서, 상기 테트라 펩타이드를 함유하는 피부 주름 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 테트라 펩타이드는 전체 화장료 조성물 대비 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 1 중량% 함량으로 함유될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 젤 타입, 스킨 타입, 크림 타입, 연고 타입 등으로 적용될 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 상기의 조성물은 그것의 타입에 따라 적절한 통상의 연화제, 유화제, 증점제 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 물질들을 첨가하여, 공지의 방법에 의해 적절하게 제조될 수 있다.

상기 젤 타입 조성물은 트리메틸올프로판, 폴리에틸렌 글리콜 또는 글리세린 등의 연화제, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 이소세틱알콜 등의 용매, 정제주 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 스킨 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 부틸렌 글라이콜, 글리세린, 알란토인, 메틸 파라벤, 이디티에이-2-소디움, 잔탄검, 디메티콘, 폴리 에틸렌 글라이콜-60 하이드로제네이트 카스톨 오일, 폴리 소르베이트 60 및 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 크림 타입 조성물은 스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 베헤닐 알콜, 아라키딜 알콜, 이소스테아릴 알콜, 이소세틸 알콜 등의 지방 알콜, 레시틴, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 소프파티질세린, 소프파티딜이노시톨 등의 리피드, 이들의 유도체, 글리세릴 스테아레이트, 소르비탄 팔미테이트, 소리비탄 스테아레이트 등의 유화제, 아보카도 오일, 살구 오일, 바바수 오일, 유리지치 오일, 동백 오일 등의 천연 지방 또는 오일, 프로필렌글리콜 등의 용매 및 정제수 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

상기 연고 타입 조성물은 연화제, 유화제 및 마이크로크리스탈린납, 파라핀, 세레신, 밀납, 경납, 바세린 등의 왁스를 첨가하여 제조할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 주름개선 성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 피부주름개선 성분으로는 비타민 C, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 세럼, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 엣센스, 팩, 헤어토닉, 헤어트리트먼트, 샴푸 또는 린스로 제형화 될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc, Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로 로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다. 다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.

제조예 : 인삼 열매 발효물 제조

건조된 인삼열매 200 g에 정제수 2 kg을 첨가하여 120℃에서 6시간 동안 열수 추출하였으며, 추출 후 당도 6 내지 8 birx인 인삼 열매 추출물을 사용하였다. 추출 후 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei, 한국세포주 은행에서 구입) 균주를 배양하여 상기 인삼열매 열매 추출물에 spectrophotometer로 측정한 농도가 1.0×10⁹ cfu/ml인 배양액 1 중량%를 접종하고, 37℃에서 3일간 발효하였으며, 배양에 사용된 배지는 글루코오스 0.6 중량%, 효소 추출물 0.3 중량%, 소이톤 0.1 중량% 및 증류수로 구성된 배지를 사용하였다. 발효 후 발효액을 4,000 rpm, 10분 동안 원심분리하여 유산균과 배양액을 분리한 후, 배양액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 인삼 열매 발효물을 제조하였다.

실시예 1 : 펩타이드 라이브러리의 합성

상기 제조된 인삼 열매 발효물로부터 정제 및 분리하여 총 42종의 펩타이드 서열을 도출하였으며, 해당 펩타이드의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

표 1의 펩타이드를 합성하기 위한 펩타이드 라이브러리를 구축하기 위해 19개의 nsc-아미노산(nsc-Ala, nsc-Arg(pbf), nsc-Asp(OtBu), nsc-Asn(trt), nsc-Gly, nsc-Glu(OtBu), nsc-Gln(trt), nsc-His(trt), nsc-Ser(tBu), nsc-Thr(tBu), nsc-Tyr(tBu), nsc-Trp(Boc), nsc-Leu, nsc-Ile, nsc-Val, nsc-Phe, nsc-Met, nsc-Lys(Boc), nsc-Pro)이 부착된 클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin: CTL resin, Novabiochem Cat No. 01-64-0021)을 96웰 테프론 반응기에 시리즈 별로 각 19 라인에 50 mg을 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 1 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름아마이드(DMF) 1 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 제조된 트라넥삼산-펩티딜 레진은 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P2O5하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조하였다. 제조된 레진에 탈루용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid: TFA) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀 5%, EDT(1,2-Ethanedithiol) 2.5% 및 TIS(Triisopropylsilane) 1% 포함] 30 ml를 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 얼음 수조 안에서 1 시간 반응을 유지하였다. 레진을 여과하고, 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 이 후 테트라 펩타이드를 수득하였다. 펩타이드 합성에 대한 전체적인 모식도는 도 1에 나타내었다.

상기 합성 및 정제 결과 서로 다른 서열의 테트라 펩타이드 42종을 얻었다(표 1). 합성된 테트라 펩타이드의 수율은 펩타이드의 서열에 차이에 따른 물성 차에 의해 상이하나 대략 20% 대의 평균 수율을 보였다. 컬럼 분리 시 elution 시간도 역시 상이하나 6~8분대에서 피크를 확인할 수 있었다.

Sample	서열	Sample	서열
1	MSYQ	22	FSSG
2	QKKQ	23	GQLE
3	PTPQ	24	ELPE
4	PPVD	25	EQQE
5	DCVK	26	LELP
6	VKTS	27	GQLK
7	KTSG	28	KHLE
8	SGGS	29	EHQE
9	GSGY	30	EGQL
10	GQVS	31	LEVP
11	GYVS	32	PEEQ
12	SQQV	33	QMGQ
13	TQTS	34	GQDP
14	CAPQ	35	QLKY
15	QPSY	36	YLEQ
16	YGGG	37	EQQE
17	SSGG	38	TKGE
18	GGSG	39	VLLP
19	GSSG	40	VEHQ
20	GCFS	41	QQKQ
21	CFSS	42	EVQW

실시예 2 : 테트라 펩타이드의 스크리닝

테트라 펩타이드의 피부 주름 억제 효과를 확인하기 위해 엘라스타제 억제 시험을 진행하였다. 기질로서 N-succinyl-(L-Aal)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 30분간 p-nitroanilide의 생성량을 측정하였다. 각 시험 펩타이드와 음성, 양성대조군을 100 μg/ml씩 시험관에 취하고 pancreatic solution(Type I: from porcine pancreas 유래, 0.6 unit/ml, Sigma Aldrich, USA)용액 50 μg/ml을 가한 후 기질로 50 mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(LAla)3-p-nitroanilide(1 mg/ml)을 100 μg/ml을 첨가하여 30분간 반응시키고 microplate reader를 이용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해활성은 하기 수학식 1과 같이 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

[수학식 1]

42종의 합성 펩타이드를 처리한 뒤 엘라스타제 활성 억제효과를 측정하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

Sample	엘라스타제 저해율 (%)	Sample	엘라스타제 저해율 (%)
1	79.4	22	69.1
2	88.7	23	73.2
3	69.3	24	90.5
4	72.5	25	53.6
5	118.4	26	78.2
6	66.3	27	56.0
7	44.5	28	79.3
8	49.6	29	66.3
9	56.3	30	69.7
10	33.9	31	70.6
11	78.5	32	64.0
12	49.3	33	55.6
13	59.0	34	34.5
14	77.2	35	60.5
15	63.5	36	72.3
16	67.1	37	64.2
17	77.0	38	59.3
18	103.5	39	60.7
19	58.3	40	55.7
20	55.2	41	72.3
21	47.4	42	49.5
무처리군	100	양성대조군 (Ursonic acid)	28.8

표 2를 참조하면, 엘라스타제 저해능(%)이 우수한 합성 테트라 펩타이드 의 경우는 기존의 엘라스타제 억제 기능성 소재인 Ursonic acid에 비해서도 우수한 것으로 파악되었다. 이러한 결과로부터 피부에 주름 생성을 유발시키는 요인이 적용되었을 때 합성된 테트라 펩타이드가 엘라스타제 억제 효과를 통해 주름 생성을 억제해 피부 노화방지에 효과가 있음이 확인된다.

스크리닝에 의해 좋은 역가를 보인 후보 펩타이드는 별도 그룹으로 구분하여 대량 합성 이후 실험을 수행하였다.

실시예 3 : 테트라 펩타이드의 세포 내 collgen 생성능 시험

엘라스타제 억제능 시험에서 선별된 sample 10, sample 34, 2종에 대해 세포 내 collagen 생성능 시험을 진행하였다. 시험에 사용할 사람 진피섬유아세포 Human dermal fibroblst(HDF) 세포는 Medium 106 (cascade biologics, M-106-500) 에 1X LSGS(Low Serum Growth Supplement, cascade biologics S-003-10)을 첨가한 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24-웰 플레이트에 1X 10⁵ cells/well의 농도로 세포를 배양하고 세포의 부착을 확인한 뒤, 대조군에는 아무것도 처리하지 않고 용매만 넣었으며, 디쉬에는 4여종의 실험군과 대조군으로 TGF를 10 μg/ml의 농도가 되도록 처리를 하였다. 각각의 디쉬에 시험물질을 가한 뒤 2일 동안 배양하였다. 2일 뒤, 배지를 채취하여 Procollagen Type I C-peptide(이하 PIP) EIA kit (takara MK101) 을 통해 Collagen 생성을 측정하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 2종의 실험군을 농도별로 처리한 뒤 collagen 생성를 측정한 결과, 콜라겐 생성량이 대부분의 실험군에서 대조군인 TGF에 비해 부족하지만 음성 대조군에 비해서는 높은 콜라겐 생성량을 확인하였다. 이러한 결과로부터 피부에서의 collagen 생성을, 단일 원료를 이용한 경우에 비해 테트라 펩타이드의 서열에 따라 collagen 생성을 증가시켜 피부의 주름을 억제할 수 있음이 확인된다.

실시예 4 : 테트라 펩타이드의 세포 증식 촉진능 확인 시험

실시예 2 및 3에서 선별된 2종의 테트라 펩타이드에 대하여 세포 증식능을 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였고, 그 결과를 도 3 내지 5에 나타내었다. 세포 증식능 실험은 MTT assay를 이용하여 측정하였다.

3T3세포, HACAT세포 및 DP 세포를 24웰 플레이트에 각 웰 당 4 X 10⁴ cells/24well의 세포수가 되도록 seeding 한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건으로 항온 배양하였다. PBS(phosphate buffer saline)로 2회 세척하고, 각각의 시료를 10 ug/ml로 처리하고 대조군인 TGF-β(Transforming Growth fctor-β)를 100 ng/ml 처리하여 24시간 동안 항온 배양하였다. 배양 후 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 0.5% in DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)를 배양 배지와 1:9(v/v)로 혼합하여 첨가한 후 2시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양한다. 이후 생성된 포르마잔(frmazan)을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 ELISA를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 3 내지 도 5를 참조하면, HACAT 세포, 3T3세포 및 DP 세포에 대하여, 저농도에서 고농도까지 처리한 2종의 펩타이드는 농도 의존적으로 모든 피부 세포에서 세포 증식능이 있는 것으로 확인되었으며 세포들의 현미경적인 관찰에서도 별다른 변화가 관찰되지 않았다.

이를 통해 본 발명에 따른 테트라 펩타이드는 피부 관련 세포에 독성이 전혀 없음을 알 수 있으며, 피부 세포 증식 효과가 있는 것으로 보인다. 따라서 본 발명에 따른 테트라 펩타이드를 함유하는 화장료 조성물을 피부에 처리하여도 큰 영향을 끼치지 않으리라는 것을 예측할 수 있다.

실시예 5 : 테트라 펩타이드의 HPLC 분석

선별된 2종의 테트라 펩타이드를 정확하게 분석 및 정량하기 위한 HPLC 분석 조건을 확립하였다.

각 펩타이드를 waters사의 HPLCwaters 2695)와 waters의 C18(Waters Xterra MS C18 column(L : 250 mm, LD : 4.6 mm, 5 μm)) 컬럼을 이용하여 분석하였다. 이때 HPLC의 검출기의 파장은 216nm 파장을 이용하였다. HPLC의 이동상의 용매로는 0.1% 삼불소 아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA)이 포함된 아세토니트릴(Acetonitile, ACN)과 0.1% TFA가 포함된 water를 이용하였으며, 시간에 따라 ACN의 농도를 변화시킴으로서 펩타이드의 순도분석을 관찰하였다고, 그 결과를 도 6 및 7에 나타내었다. 펩타이드 물질 분석에 필요한 조건은 하기 표 3에 나타내었다.

Condition of HPLC analysis
Column	waters Xterra MS column (L : 250 mm, LD : 4.6 mm, 5 μm)
Detector	waters 2487 dual Absorbance detector
Detection wavelength	216 nm
Flow rate	1.0 mL/min
Injection volume	50 μL
Mobile phase conditions for HPLC gradient-elution	Program order	Time (min)	0.1% TFA in D.W (%)	0.1% TFA in ACN (%)
	1	0	100	0
	2	10	75	25
	3	20	50	50
	4	30	25	75
	5	40	0	100
	6	45	100	0

도 6 및 7을 참조하면, HPLC 분석 결과 테트라 펩타이드 2종이 상기 HPLC 분석 조건에서 정확하게 확인이 가능하며 정확한 농도를 알 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 6 : 테트라 펩타이드의 열·광 안정성 확인

상기 2종의 테트라 펩타이드의 열 및 광 안전성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 진행하였고, 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.

시료가 각각 10 mg/ml이 되도록 각각의 시료를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 용해하여 유리 바이알에 분주하여 넣은 후 50℃에서 4주간 보관하며 열에 의한 조성물 내 펩타이드의 손실을 측정하고 동일한 방법으로 일광 조건에서 안정성 여부를 측정하였다.

도 9 및 도 10을 참조하면, 열에 의한 펩타이드 손실을 측정하고 일광 조건에서 안정성 여부를 측정한 결과, 2종의 테트라 펩타이드에서 4주까지 단지 10% 미만의 펩타이드 손실을 나타내어 열 및 일광 보관 기간에 있어 높은 안정성을 갖는다는 것을 확인하였다.

실시예 7 : 테트라 펩타이드를 포함한 화장품 조성물 제조

테트라 펩타이드가 함유된 크림 타입 조성물을 하기 방법으로 제조하였다. 크림 타입 조성물로서 Sample 10의 테트라 펩타이드를 1 중량부로 포함하여 하기 표 4와 같이 제형을 구성하였다.

1) [수상B] 제조

물을 가온하여 60 내지 70℃로 교반하면서 분말상 원료를 순차적으로 서서히 투입하여 점증이 될 때까지 디스퍼 믹서로 교반하여 고르게 풀어준 후 식혀주며, 공정 용이성을 위해 사전에 준비해둔다.

2) [수상A] 제조

분말상 원료를 글리세린에 충분히 함침시킨 후, 물을 첨가하여 50 내지 60℃로 가온하여 디스퍼 믹서로 골고루 녹여준다.

3) [수상A] + [수상B] 혼합 교반 제조

미리 준비해 둔 수상B를 수상A에 첨가하여 고르게 섞어주면서 가온한다. 65 내지 75℃가 유지될 수 있도록 준비해둔다.

4) [유상] 혼합 교반 제조

각 원료를 개별 비이커에 평량하여 가온 교반하여 녹여준다(80℃ 이상). 녹여진 상은 75℃ 이상 온도가 유지될 수 있도록 준비해둔다.

5) 전체 크림 제조

준비된 수상 혼합물에 유상을 서서히 투입 첨가하여 약 10분간 강하게 교반(6,000rpm)하여 유화 공정을 진행한다. 이때 온도는 65~75℃로 유지할 수 있도록 한다.

완료 후, 첨가제 A를 준비하여 pH 조정 및 중화 공정을 진행한다. 이 때, 내용물의 점도가 상승하므로, 강하게(6,000rpm) 골고루 5분 이상 교반해준다.

50℃ 이하로 내용물이 식으면 첨가제 B를 넣고 서서히 2분 정도 섞어주며(3,000~4,000rpm), 40℃ 이하가 되면 첨가제 C와 첨가제 D를 순차적으로 첨가하여 2분 정도 천천히(3,000~4,000rpm) 교반 후, 탈기/여과 공정을 거쳐 내용물을 수거한다.

완료 후, pH 조정 및 중화 공정을 진행한다. 이 때, 내용물의 점도가 상승하므로, 강하게(6,000rpm) 골고루 5분 이상 교반 해준다.

50℃ 이하로 내용물이 식으면 보존제를 넣고 서서히 2분 정도 섞어주며(3,000~4,000rpm), 40℃ 이하가 되면 테트라 펩타이드와 향료를 첨가하여 2분 정도 천천히(3,000~4,000rpm) 교반 후, 탈기/여과 공정을 거쳐 내용물을 수거한다.

제조된 크림은 저온(4℃)과 고온 (50℃), 상온 (25℃), 일광조건에서 보관하여 크림의 안정성을 확인하였으며 모든 조건에서 4주 동안 크림의 변색, 변취, 상변화, pH 변화와 같은 현상들이 발견되지 않았으며 이를 통해 크림의 안정성이 유지되는 것을 확인하였다. 특히 테트라 펩타이드의 안정성이 유지되어 HPLC 분석 결과 모든 조건에서 4주 동안 90% 이상의 함량이 유지되는 것을 확인하였다.

구분	원료명 / 성분명	성분명 (Ingredients) / INCI 명칭	중량부
수상A	DI WATER	Water	48.04
	GLYCERIN	Glycerin	10.00
	Keltrol F	Xanthan Gum	0.10
	Adenosine	Adenosine	0.04
수상B	DI Water	Water	30.00
	beta-glucan	beta-glucan	0.20
	Carbopol 940	Carbomer	0.02
유상	Kalcol 6870	Cetearyl Alcohol	2.50
	GMS-105	Glyceryl Stearate	1.50
	Arlacel 165V	Glyceryl Stearate, Peg-100 Stearate	1.20
	Tween 80	Polysorbate 80	1.00
	Arlacel 83	Sorbitan Sesquioleate	0.70
	Phytosqualane	Squalane	5.00
	DUB MCT	Caprylic/Capric Triglyceride	3.00
첨가제A	DI Water	Water	3.00
	L-Arginine (pH 4.50 ~ 5.50)	Arginine	0.50
첨가제B	1,2-Hexanediol	1,2-Hexanediol	2.00
첨가제C	Lutein Solution	Lutein	1.00
첨가제D(향료)	Perfume	Fragrance	0.10
후첨 펩타이드	GQVS	Peptide	0.1

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> A & PEP INC. <120> PREPARING METHOD OF HIGHLY FUNCTIONAL PEPTIDE DERIVED FROM KERATINOCYTE PROTEIN <130> NP20-11155 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetra Peptide <400> 1 Gly Gln Val Ser 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetra Peptide <400> 2 Gly Gln Asp Pro 1

Claims (6)

1. 글리신(Glycine, Gly)-글루타민(Glutamin)-발린(Valine, Val)-세린(Serine, Ser)의 아미노산 서열로 이루어지는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 피부 주름 억제용 화장료 조성물.
2. 글리신(Glycine, Gly)-글루타민(Glutamine)-아스파틱산(Aspartic acid, Asp)-프롤린(Proline, Pro)의 아미노산 서열로 이루어지는 피부 주름 억제 활성을 나타내는 테트라 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 피부 주름 억제용 화장료 조성물.
   
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