KR20210027408A - 콜히친 유도체의 방법 및 용도 - Google Patents

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KR20210027408A
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KR1020217002821A
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잭 투스진스키
마리아 페르난데스
Original Assignee
알버타 헬스 서비시즈
유니버시티 라발
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Abstract

본 발명은 콜히친 유도체(들), 이의 염증 치료를 위한 방법(들) 및 용도(들)에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 상기 콜히친 유도체는 화학식 I의 화합물이다:

Description

콜히친 유도체의 방법 및 용도
본 출원은 전반적으로 콜히친 유도체, 이의 방법 및 용도에 관한 것이다.
염증 상태(inflammatory conditions)는 전 세계적으로 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치며, 표적 분자 의학은 이 분야에서 보다 안전하고 효과적인 약물 및 치료 요법을 개발하는 것을 목표로 하고 있다. 콜히친(colchicine)은 염증과 관련된 분자 경로를 표적으로 할 수 있기 때문에, 염증 질환 치료에 널리 사용되는 유사분열 억제제(antimitotic agent)에 해당한다. 예를 들어, 건선성 관절염(psoriatic arthritis)(P. Seidemann, B. Fjellner, A. Johannesson, J. Rheumatol. 14 (1987) 777-779) 및 백혈구 파쇄성 혈관염(leukocyte-cytoclastic vasculitis)(J.P. Callen, J. Am. Acad. Dermatol. 13 (1987) 193-200)의 치료에 유용한 효과가 보고되었다. 또한, 최근 연구에 따르면, 콜히친은 세포내 튜불린 단량체에 결합하여 중합을 방지함으로써(G.O. Borisy, E.W. Taylor, J. Cell. Biol. 34 (1967) 533-548), 백혈구-내피 세포 유착(S.J. Rosenman, A.A. Ganji, W.M. Gallatin, F.A.S.E.B. J. 5 (1991)1603-1609) 및 T 세포 활성화(Y.A. Mekory, D. Baram, A. Goldberg, A. Klajman, Cell. Immunol. 120 (1989) 330-340)를 억제한다.
콜히친의 일반적인 용도는 통풍(gout)과 가족성 지중해열(Familial Mediterranean Fever; FMF) 치료에 이용하는 것이다. 실제로, FMF 환자는 일반적으로 평생 콜히친 요법을 받고 있다. 그러나 콜히친의 사용은 효능과 치료-제한적 부작용 사이의 낮은 치료 지수로 인해 여전히 문제가 남아있다.
따라서, 약물의 개발뿐만 아니라, 상기 기술된 단점 중 적어도 하나를 제거 또는 완화하거나 유용한 대안을 제공하는 이들의 용도 및/또는 사용 방법에 대한 필요성이 존재한다.
일 관점에서, 화학식 I의 화합물이 제공된다:
Figure pct00001
여기서: Z는 O 또는 S이고; X1은 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹에서 선택되고; R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 치환 또는 비치환 이종 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리(carbocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로고리(heterocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로방향족(heteroaromatic) 그룹에서 선택되며;
이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머(tautomer), 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합이다.
다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 헤테로방향족 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로고리 그룹에서 선택된다. 다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 할로알킬, 치환 또는 비치환 하이드록시알킬, 치환 또는 비치환 시아노알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬카보닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴, 알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-사이클로알킬, 알킬렌-O-헤테로사이클로알킬, 알킬렌-O-알킬렌-사이클로알킬, 또는 알킬렌-O-알킬렌-헤테로사이클로알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 치환 또는 비치환 C2-C6 알케닐, 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬카보닐, C1-C6 알킬렌-O-알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 또는 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴에서 선택된다. 다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 또는 치환 또는 비치환 알킬아릴에서 선택된다. 다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 또는 치환 또는 비치환 알킬아릴에서 선택된다. 다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 비치환 C1-C6 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 메틸, 에틸 또는 프로필에서 선택된다. 다른 관점에서, R2는 메틸이다. 다른 관점에서, R3는 에틸 또는 프로필이다.
다른 관점에서, X1은 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹이다. 다른 관점에서, X1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 또는 치환 또는 비치환 알키닐에서 선택된다. 다른 관점에서, X1은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, X1은 비치환 C1-C6 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, X1은 메틸 또는 에틸에서 선택된다. 다른 관점에서, X1은 메틸이다. 다른 관점에서, X1은 OR10이고, R10은 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 치환 또는 비치환 알킬 그룹, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로방향족 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로고리 그룹에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 치환 또는 비치환 알킬, CH2OH, 치환 또는 비치환 할로알킬, 치환 또는 비치환 하이드록시알킬, 치환 또는 비치환 시아노알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴, 알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-사이클로알킬, 알킬렌-O-헤테로사이클로알킬, 알킬렌-O-알킬렌-사이클로알킬, 또는 알킬렌-O-알킬렌-헤테로사이클로알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 또는 치환 또는 비치환 알키닐에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 또는 치환 또는 비치환 C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 비치환 C1-C6 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 메틸 또는 에틸에서 선택된다. 다른 관점에서, R10은 메틸이다.
다른 관점에서, X1은 치환 또는 비치환 이종 그룹이다. 다른 관점에서, X1은 -CR4R5R6에서 선택되고, 여기서 R4, R5, 및 R6는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종 그룹에서 선택된다. 다른 관점에서, R4, R5, 및 R6는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 아미도 그룹에서 선택된다. 다른 관점에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, 또는 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되고, R6는 -NR(CO)CR7R8R9이며, 여기서 R은 H 및 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되고, R7, R8, 및 R9은 각각 독립적으로 H, 할로 그룹, 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. 다른 관점에서, R7, R8, 및 R9은 플루오로 그룹에서 선택될 수 있다. 다른 관점에서, X1은 -CH2NH(CO)CF3이다.
다른 관점에서, Z는 O이다. 다른 관점에서, Z는 S이다.
다른 관점에서, 상기 화합물은:
Figure pct00002
이고,
이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합이다.
다른 관점에서, 상기 화합물은:
Figure pct00003
이고,
이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합이다.
다른 관점에서, 상기 화합물은:
Figure pct00004
이고,
이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합이다.
다른 관점에서, 상기 화합물은:
Figure pct00005
이고,
이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합이다.
다른 관점에서, 상기 화합물은:
Figure pct00006
이고,
이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합이다.
다른 관점에서, 상기 화합물은:
Figure pct00007
이고,
이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합이다.
다른 관점에서, 상기 화합물은 화학식 I 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다. 다른 관점에서, C7에서의 배열이 S-배열이다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친(colchicine)-결합 부위에서 β-튜불린에 결합한다. 다른 관점에서, 상기 β-튜불린은 β-VI, β-V, 및/또는 β-I이다. 다른 관점에서, 상기 β-튜불린은 β-VI이다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친의 결합 에너지보다 작은 결합 에너지를 갖는다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친보다 독성이 적다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친에 비해 호중구를 보다 특이적으로 표적한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친보다 낮은 용량으로 세포내 칼슘 농도 증가를 억제한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친보다 약 10배 이상 낮은 용량으로 세포내 칼슘 농도 증가를 억제한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친보다 약 10배 내지 약 100배 낮은 용량으로 세포내 칼슘 농도 증가를 억제한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 약 0.1 μM의 용량으로 세포내 칼슘 농도 증가를 억제한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친보다 낮은 용량으로 염증매개체(inflammatory mediator)의 생성을 억제한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친보다 약 10배 이상 낮은 용량으로 염증매개체의 생성을 억제한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 콜히친보다 약 10배 내지 약 100배 낮은 용량으로 염증매개체의 생성을 억제한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 약 0.1 μM의 용량으로 염증매개체의 생성을 억제한다. 다른 관점에서, 상기 염증매개체는 IL-8, IL-1, 초산화물(superoxide), 또는 이의 조합에서 선택된다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 세포내 칼슘 농도 및 염증매개체 생성 중 적어도 어느 하나의 억제와 관련하여 선형적(monotonic) 또는 비선형적(non-monotonic) 용량 반응을 나타낸다. 다른 관점에서, 상기 염증매개체는 IL-8, Il-1, 초산화물(superoxide) 생성, 또는 이의 조합에서 선택된다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 백혈구의 모집을 억제한다.
또 다른 관점에서, 염증 치료를 위한 본원에 기재된 화합물이 제공된다. 다른 관점에서, 상기 염증은 염증 질환, 염증 상태, 염증 장애, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 다른 관점에서, 상기 염증은 호중구-유발 염증을 포함한다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 가성통풍(pseudogout), 통풍, 심혈관 질환, 혈관염, 또는 이들의 조합과 관련된 염증이다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 심혈관 질환과 관련된다. 다른 관점에서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증(coronary atherosclerosis)이다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 통풍과 관련된다.
또 다른 관점에서, 통풍 치료를 위한 본원에 기재된 화합물이 제공된다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 요산 일나트륨(MSU)-유도 염증에 대응하여 면역 기능의 억제 효과를 갖는다. 다른 관점에서, 상기 면역 기능의 억제 효과는 세포내 칼슘 생성, IL-1 생성, IL-8 생성, 초산화물 생성, 또는 이들의 조합에서 선택되는 매개체를 통해 영향을 받는다. 다른 관점에서, 상기 면역 기능은 호중구에 관한 것이다. 다른 관점에서, 상기 억제 효과는 콜히친보다 더 강한 억제 효과를 갖는다. 다른 관점에서, 상기 억제 효과는 콜히친보다 약 10배 이상 크다. 다른 관점에서, 상기 억제 효과는 약 0.1μM의 농도에서 발생한다. 또 다른 관점에서, 심혈관 질환 치료를 위한 본원에 기재된 화합물이 제공된다. 다른 관점에서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증이다.
또 다른 관점에서, 본원에 기재된 화합물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 항-통풍제를 더 포함한다. 다른 관점에서, 상기 항-통풍제는 비스테로이드 항염증제(NSAIDS), 관절내 글루코코르티코이드, 잔틴 산화효소 억제제, 재조합 비인간 우리카아제 효소, 요산 배설 촉진제, 요산뇨제, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 다른 관점에서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함한다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 본원에 기재된 둘 이상의 화합물을 포함한다. 또 다른 관점에서, 염증 치료를 위한 본원에 기재된 화합물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 다른 관점에서, 상기 염증은 염증 질환, 염증 상태, 염증 장애, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 다른 관점에서, 상기 염증은 호중구-유발 염증을 포함한다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 가성통풍, 통풍, 심혈관 질환, 혈관염, 또는 이들의 조합과 관련된 염증이다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 심혈관 질환과 관련된다. 다른 관점에서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증이다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 통풍과 관련된다. 또 다른 관점에서, 통풍 치료를 위한 본원에 기재된 화합물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또 다른 관점에서, 본원에 기재된 화합물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 관점에서, 본원에 기재된 화합물이 2 이상 존재한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 경구 및/또는 비경구로 투여된다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여된다. 또 다른 관점에서, 본원에 기재된 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 경구 및/또는 비경구로 투여된다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여된다. 다른 관점에서, 상기 염증은 염증 질환, 염증 상태, 염증 장애, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 다른 관점에서, 상기 염증은 호중구-유발 염증을 포함한다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 가성통풍, 통풍, 심혈관 질환, 혈관염, 또는 이들의 조합과 관련된 염증이다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 심혈관 질환과 관련된다. 다른 관점에서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증이다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 통풍과 관련된다. 다른 관점에서, 상기 포유동물은 인간이다.
또 다른 관점에서, 포유동물의 염증 치료를 위한 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물의 용도가 제공된다. 다른 관점에서, 본원에 기재된 화합물이 2 이상 존재한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 경구 및/또는 비경구로 투여 가능하다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여 가능하다. 또 다른 관점에서, 포유동물의 염증 치료를 위한 치료적 유효량의 본원에 기재된 조성물의 용도가 제공된다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 경구 및/또는 비경구로 투여 가능하다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여 가능하다. 다른 관점에서, 상기 염증은 염증 질환, 염증 상태, 염증 장애, 또는 이들의 조합에서 선택된다. 다른 관점에서, 상기 염증은 호중구-유발 염증을 포함한다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 가성통풍, 통풍, 심혈관 질환, 혈관염, 또는 이들의 조합과 관련된 염증이다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 심혈관 질환과 관련된다. 다른 관점에서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증이다. 다른 관점에서, 상기 호중구-유발 염증은 통풍과 관련된다. 다른 관점에서, 상기 포유동물은 인간이다.
또 다른 관점에서, 본원에 기재된 화합물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 통풍을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 관점에서, 본원에 기재된 화합물이 2 이상 존재한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 경구 및/또는 비경구로 투여된다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여된다. 또 다른 관점에서, 본원에 기재된 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 통풍을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 경구 및/또는 비경구로 투여된다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여된다. 다른 관점에서, 상기 포유동물은 인간이다. 다른 관점에서, 상기 통풍은 만성 통풍 및/또는 급성 통풍에서 선택된다. 다른 관점에서, 통풍의 치료는 하나 이상의 통풍 증상의 치료를 포함한다. 다른 관점에서, 상기 하나 이상의 통풍 증상은 통풍 발작, 통풍결절(tophus) 형성, 통풍성 관절염, 통풍-관련 염증, 및/또는 통풍과 관련된 관절 파괴에서 선택된다. 다른 관점에서, 상기 하나 이상의 통풍 증상은 통풍성 염증 및/또는 염증과 관련된 통증에서 선택된다.
또 다른 관점에서, 포유동물의 통풍 치료를 위한 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물의 용도가 제공된다. 다른 관점에서, 본원에 기재된 화합물이 2 이상 존재한다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 경구 및/또는 비경구로 투여 가능하다. 다른 관점에서, 상기 화합물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여 가능하다. 또 다른 관점에서, 포유동물의 통풍 치료를 위한 치료적 유효량의 본원에 기재된 조성물의 용도가 제공된다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 경구 및/또는 비경구로 투여 가능하다. 다른 관점에서, 상기 조성물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여 가능하다. 다른 관점에서, 상기 포유동물은 인간이다. 다른 관점에서, 상기 통풍은 만성 통풍 및/또는 급성 통풍에서 선택된다. 다른 관점에서, 통풍의 치료는 하나 이상의 통풍 증상의 치료를 포함한다. 다른 관점에서, 상기 하나 이상의 통풍 증상은 통풍 발작, 통풍결절 형성, 통풍성 관절염, 통풍-관련 염증, 및/또는 통풍과 관련된 관절 파괴에서 선택된다. 다른 관점에서, 상기 하나 이상의 통풍 증상은 통풍성 염증 및/또는 염증과 관련된 통증에서 선택된다.
또 다른 관점에서, βVI-튜불린 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 염증 치료 방법이 제공된다. 다른 관점에서, 상기 βVI-튜불린 억제제는 본원에 기재된 화합물이다. 다른 관점에서, 상기 염증은 백혈구 침윤과 관련된다. 다른 관점에서, 상기 백혈구 침윤은 호중구 및/또는 단핵구의 침윤을 포함한다. 다른 관점에서, 상기 염증은 통풍과 관련된다. 다른 관점에서, 상기 염증은 죽상동맥경화증과 관련된다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 상세한 설명으로부터 다양한 변경 및 변형이 당업자에게 명백할 것이므로, 본 발명의 실시양태를 나타내는 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시로서 주어진 것으로 이해되어야 한다.
단지 예시로서, 실시예들이 도면을 참조하여 설명될 것이다.
도 1은 화합물 (2) 및 ( 3)을 만들기 위한 합성 도식을 나타낸다.
도 2는 화합물 (4) 및 ( 5)를 만들기 위한 합성 도식을 나타낸다.
도 3은 화합물 (6) 내지 ( 38)을 만들기 위한 합성 도식을 나타낸다.
도 3A는 콜히친의 R 위치에서(50) 내지 (54) 변형된 콜히친의 구조를 나타낸다.
도 4는 티오콜히친의 R 및 R1 위치에서 (39), (3 a-c), (4 a-c) 및 (5 a-c) 변형된 티오콜히친의 구조를 나타낸다.
도 4A 내지 4D는 콜히친 및 티오콜히친 유도체의 예를 나타낸다.
도 5는 콜히친 결합 부위 내에서 발견된 잔기 간의 차이를 보여준다. 도 5A는 콜히친[pdb code 1SA0]에 대한 결합 표면 내에 포함된 잔기는 기준 β1-튜불린 서열에서 검정색 글자로 표시되고, 3가지 타입 사이의 차이는 중간 회색 글자로 표시되고, 나머지 글자는 회색으로 표시되며, 대시는 서열 사이의 동일한 위치를 나타낸다. 도 5B는 β-튜불린[pdb code 1SA0]에 나타낸 용매 접근 가능 표면을 보여주고, 콜히친 결합 표면을 구성하는 잔기는 검정색으로 표시되며, 세 가지 결합 부위 모델간에 차이를 나타내는 잔기는 검정색 막대로 표시되고, 콜히친은 분자 구조로 표시되며, A-고리와 X 및 Y 위치가 명확하게 표시된다.
도 6은 타입-I(상단), 타입-II(중간) 및 타입-III(하단) β-튜불린 결합 부위에 결합하는 콜히친 및 그 유도체의 계산된 ΔG [kcal mol- 1]를 나타내며, 각 유도체((3)-D-20) 및 콜히친(CH)에 대한 박스 플롯은 10번의 독립적인 도킹 포즈의 에너지 평가에서 생성되었으며, 세선은 5% 및 95% 신뢰값으로 표시된다.
도 7은 요산 일나트륨(MSU) 자극된 인간 호중구에 의한 칼슘 저장 동원에 대한 콜히친 및 콜히친 유도체의 영향을 나타낸다. 도 7A 및 7D는 콜히친의 영향, 도 7B는 콜히친 유도체(91)의 영향을 보여준다. 도 7C는 콜히친 유도체 TPO의 영향을 보여준다. 도 7E-J는 콜히친(도 7D)과 비교하여, 콜히친 유도체 28a, 39, 47a, 89, 14 및 43의 영향을 보여준다. 도 7K-L은 다양한 용량에서 콜히친의 영향을 보여준다. 도 7M-P는 콜히친(도 7K-L)과 비교하여, 다양한 용량에서의 콜히친 유도체 (43) (도 7M-N) 및 (47a) (도 7O-P)의 영향을 보여준다. 도 7Q 및 7R은 각각 콜히친 유도체 (47a) 및 (43)의 영향을 보여준다. 도 7S는 도 7A, 7B, 7Q 및 7R에서 시험된 화합물의 억제 활성의 비교를 보여준다. 도 7T 및 7U는 세포질 칼슘 농도의 fMLP 유도 증가에 대한 콜히친 및 유도체 (91) 및 ( 43)의 영향을 보여준다. 도 7V 및 7W는 세포질 칼슘 농도의 MSU-유도 증가에 대한 콜히친 및 유도체 (91) 및 ( 43)의 영향을 보여준다.
도 8은 요산 일나트륨(MSU) 자극된 인간 호중구에 의한 IL-8(도 8A 내지 8G 및 8L) 또는 IL-1(도 8H 내지 8K)의 방출에 대한 콜히친 및 콜히친 유도체의 영향을 보여준다. 도 8A는 콜히친 유도체 ( 43)의 영향을 보여준다. 도 8B는 콜히친 유도체 (47a)의 영향을 보여준다. 도 8C는 콜히친의 영향을 보여준다. 도 8D는 콜히친 유도체 ( 91)의 영향을 보여준다. 도 8E는 콜히친 유도체 (47a)의 영향을 보여준다. 도 8F는 콜히친 유도체 ( 43)의 영향을 보여준다. 도 8G는 도 8C 내지 F에서 시험된 화합물의 억제 활성의 비교를 보여준다. 도 8H는 콜히친의 영향을 보여준다. 도 8I는 콜히친 유도체 ( 91)의 영향을 보여준다. 도 8J는 콜히친 유도체 ( 43)의 영향을 보여준다. 도 8K는 도 8H 내지 J에서 시험된 화합물의 억제 활성의 비교를 보여준다. 도 8L은 MSU의 부재 하에, 콜히친 유도체 (43) 또는 (47a)와 함께 배양된 인간 호중구에서 IL-8 생산의 기초 수준을 보여준다.
도 9는 요산 일나트륨(MSU) 자극된 인간 호중구에 의한 초산화물 생성에 대한 콜히친 및 콜히친 유도체의 영향을 보여준다. 도 9A는 콜히친의 영향을 보여준다. 도 9B는 콜히친 유도체 ( 91)의 영향을 보여준다. 도 9C는 콜히친의 영향을 보여준다. 도 9D는 콜히친 유도체 ( 91)의 영향을 보여준다. 도 9E는 콜히친 유도체 (47a)의 영향을 보여준다. 도 9F는 콜히친 유도체 ( 43)의 영향을 보여준다. 도 9G는 도 9C 내지 F의 화합물의 억제 활성의 비교를 보여준다. 도 9H는 MSU의 부재 하에, 콜히친 유도체 (43) 또는 (47a)로 자극된 인간 호중구에서 초산화물 생성의 기초 수준을 보여준다.
도 10은 각각 콜히친 유도체 (91) 또는 콜히친 유도체 (43)를 피하 주사한 마우스에서 2시간 동안의 콜히친 유도체 (91) (도 10A) 또는 콜히친 유도체 (43) (도 10B)의 혈장 농도를 나타낸다.
도 11은 각각 콜히친 유도체 (91) 또는 콜히친 유도체 (43)를 피하 주사한 후 2시간 동안 마우스의 순환하는 백혈구에서 콜히친 유도체 (91) (도 11A) 또는 콜히친 유도체 (43) (도 11B)의 농도를 나타낸다.
도 12는 요산 일나트륨(MSU)을 주사한 마우스의 등쪽 공기 주머니로의 백혈구 모집에 대한 콜히친 및 콜히친 유도체 ( 91)의 영향을 보여준다.
도 13은 요산 일나트륨(MSU)을 주사한 마우스의 등쪽 공기 주머니로의 백혈구 모집에 대한 콜히친 및 콜히친 유도체 ( 91)의 치료 효과를 보여준다.
도 14는 요산 일나트륨(MSU)을 주사한 마우스의 등쪽 공기 주머니로의 백혈구 모집에 대한 콜히친 유도체 (43)의 치료 효과를 보여준다.
도 15는 인간 호중구에서 β-튜불린 발현의 웨스턴 블랏을 나타낸다.
도 16은 콜히친이 βIII 튜불린과 어떻게 상호작용하는지 보여준다.
도 17은 콜히친 유도체 (91) (CCI)가 βIII 튜불린과 어떻게 상호작용하는지 보여준다.
도 18은 콜히친 유도체 ( 89)가 βIII 튜불린과 어떻게 상호작용하는지 보여준다.
도 19는 야생형 및 LDLR KO 마우스의 체중에 대한 고지방 식이 및 CCI의 영향을 나타낸다: C57BL/6 마우스는 8주 동안 대조군 식이(CD) 또는 고지방 식이(HF)를 공급받았으며, 0.5μmol/kg CCI 또는 비히클(DMSO)을 주 3회 피하주사 하였다. 마우스는 일주일에 3번 무게를 쟀다. 2주와 8주 사이에 각 마우스 그룹의 체중 증가가 그래프에 표시되었다.
도 20은 고지방 식이를 공급한 야생형 및 LDLR KO 마우스의 혈청에서 트리글리세라이드 수준에 대한 CCI의 영향을 나타낸다: C57BL/6 마우스는 8주 동안 대조군 식이(CD) 또는 고지방 식이(HF)를 공급받았으며, 0.5μmol/kg CCI 또는 비히클(DMSO)을 주 3회 피하주사 하였다. 8주간의 식이 후 혈액을 채취하고, 혈청을 준비하였으며, 분석할 때까지 동결시켰다.
도 21은 고지방 식이를 공급한 야생형 및 LDLR KO 마우스의 혈청에서 콜레스테롤 수치에 대한 CCI의 영향을 나타낸다. C57BL/6 마우스는 8주 동안 대조군 식이(CD) 또는 고지방 식이(HF)를 공급받았으며, 0.5μmol/kg CCI 또는 비히클(DMSO)을 주 3회 피하주사 하였다. 8주간의 식이 후 혈액을 채취하고, 혈청을 준비하였으며, 분석할 때까지 동결시켰다.
도 22는 고지방 식이를 공급한 LDLR KO 마우스의 대동맥에서 죽상경화성 병변의 발생에 대한 CCI의 영향을 나타낸다. 도 22A: C57BL/6 마우스는 8주 동안 대조군 식이(CD) 또는 고지방 식이(HF)를 공급받았으며, 주 3회 0.5μmol/kg CCI 또는 비히클(DMSO)을 피하주사 하였다. 대동맥을 수득하고 절개하여 수단(Sudan) IV 염색으로 대동맥 병변 en face 분석을 수행하였다. 수단 IV는 지질, 트리글리세라이드 및 지단백질을 염색하는 지용성 염료이다. 도 22B는 'en face 분석'에서 염색된 플라크에 의해 덮인 대동맥궁(aortic arch)의 전체 면적의 백분율을 보여준다. 도 22C는 'en face 분석'에서 염색된 플라크에 의해 덮인 하행 대동맥(descending aorta)의 전체 면적의 백분율을 보여준다.
도 23은 고지방 식이를 공급한 LDLR KO 마우스에서 사이토카인의 혈청 수준에 대한 CCI의 영향을 보여준다: C57BL/6 마우스는 8주 동안 대조군 식이(CD) 또는 고지방 식이(HF)를 공급받았으며, 주 3회 0.5μmol/kg CCI 또는 비히클(DMSO)을 피하주사 하였다. 8주간의 식이 후 혈액을 채취하고, 혈청을 준비하였으며, Luminex 분석으로 분석할 때까지 동결시켰다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 참조로 포함된다.
정의
본 발명의 화합물, 조성물, 방법 및 용도를 설명할 때, 하기 용어들은 달리 명시되지 않는 한 하기의 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 “콜히친 유도체”는 본원에 기재된 임의의 유도체를 포함할 수 있으며, 예를 들어 적절한 경우 티오콜히친 유도체도 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “치료적 유효량”은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 찾고자 하는 조직, 시스템, 포유동물(예를 들어, 인간)과 같은 동물에서의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 활성 화합물 또는 약학적 제제의 양을 의미한다. 장애, 상태 및/또는 질병을 치료하기 위해 제공되는 경우, 포유동물을 포함하는 대상체에게 투여될 때 증상(들)을 치료하는 것과 같은 원하는 결과를 달성할 수 있는 양이다.
본 발명의 화합물은 비대칭 중심, 카이랄 축 및 카이랄 평면을 가질 수 있고(상기 기재된 바와 같다. 예를 들면, E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereo-chemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, pages 1119-1190), 라세미체, 라세미 혼합물 및 개별 부분입체 이성질체로서 존재할 수 있고, 광학 이성질체를 포함하는 모든 가능한 이성질체 및 이들의 혼합물이 본 발명에 포함된다. 또한, 본원에 개시된 화합물은 토토머로 존재할 수 있고, 비록 하나의 토토머 구조만이 묘사될 수 있지만, 두 토토머 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것을 의미한다.
일반적으로 수소 또는 H와 같은 특정 원소에 대한 언급은, 적절하다면, 해당 원소의 모든 동위원소를 포함하는 것을 의미한다.
용어 “알킬 그룹”이 단독으로 또는 “할로알킬 그룹” 및 “알킬아미노 그룹”과 같은 다른 용어 내에서 사용되는 경우, 예를 들어 1개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 특정 실시양태에서는 1개 내지 약 12개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 탄소 라디칼을 포괄한다. 다른 실시양태에서, 알킬 그룹은 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 갖는 “저분자량 알킬” 그룹이다. 이러한 그룹의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소-아밀, 헥실 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적인 실시양태에서, 저분자량 알킬 그룹은 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다.
용어 “알케닐 그룹”은 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄소 라디칼을 포함한다. 용어 “알케닐 그룹”은 컨쥬게이트 및 비-컨쥬게이트 탄소-탄소 이중결합 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 알케닐 그룹은 예를 들면 2개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 특정 실시양태에서 2개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 실시양태에서, 알케닐 그룹은 2개 내지 약 4개의 탄소 원자를 갖는 “저분자량 알케닐” 그룹이다. 알케닐 그룹의 예로는 에테닐, 프로페닐, 알릴, 프로페닐, 부테닐 및 4-메틸 부테닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 용어 “알케닐 그룹” 및 “저분자량 알케닐 그룹”은 “시스” 및 “트랜스” 배향 또는 대안적으로 “E” 및 “Z” 배향을 갖는 그룹을 포함한다.
용어 “알키닐 그룹”은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중결합을 갖는 선형 또는 분지형 탄소 라디칼을 의미한다. 용어 “알키닐 그룹”은 컨쥬게이트 및 비-컨쥬게이트 탄소-탄소 삼중결합 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 알키닐 그룹은 예를 들면, 2개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 특정 실시양태에서 2개 내지 약 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 실시양태에서, 알키닐 그룹은 2개 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 “저분자량 알키닐” 그룹이다. 일부 예로는 2개 내지 약 4개의 탄소 원자를 갖는 저분자량 알키닐 그룹이다. 이러한 그룹의 예는 프로파르길, 부티닐 등을 포함한다.
용어 “할로”는 플루오린, 클로린, 브로민 또는 아이오딘 원자와 같은 할로겐을 의미한다.
용어 “할로알킬 그룹”은 알킬 탄소 원자 중 임의의 하나 이상이 상기 정의된 할로로 치환된 그룹을 포함한다. 구체적으로, 모노할로알킬, 디할로알킬 및 퍼할로알킬을 포함하는 폴리할로알킬 그룹이 포함된다. 예를 들면, 모노할로알킬 그룹은 그룹 내에 아이오도, 브로모, 클로로 또는 플루오로 원자를 가질 수 있다. 디할로 및 폴리할로알킬 그룹은 2개 이상의 동일한 할로 원자 또는 상이한 할로 그룹의 조합을 가질 수 있다. “저분자량 할로알킬 그룹”은 1-6개의 탄소 원자를 갖는 그룹을 포함한다. 일부 실시양태에서, 저분자량 할로알킬 그룹은 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 할로알킬 그룹의 예는 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 헵타플루오로프로필, 디플루오로클로로메틸, 디클로로플루오로메틸, 디플루오로에틸, 디플루오로프로필, 디클로로에틸 및 디클로로프로필을 포함한다.
용어 “하이드록시알킬 그룹”은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 1개 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 그룹을 포함하며, 이들 중 어느 하나는 하나 이상의 하이드록실 그룹으로 치환될 수 있다. 실시양태에서, 하이드록시알킬 그룹은 1개 내지 6개의 탄소 원자 및 하나 이상의 하이드록실 그룹을 갖는 “저분자 하이드록시 알킬” 그룹이다. 이러한 그룹의 예는 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 하이드록시프로필, 하이드록시부틸 및 하이드록시헥실을 포함한다.
용어 “알콕시 그룹”은 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 1개 내지 약 10개의 탄소 원자의 알킬 부분을 각각 갖는 선형 또는 분지형 옥시-포함 그룹을 포함한다. 실시양태에서, 알콕시 그룹은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 “저분자량 알콕시” 그룹이다. 이러한 그룹의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 및 tert-부톡시를 포함한다. 특정 실시양태에서, 저분자량 알콕시 그룹은 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. “알콕시” 그룹은 추가로 플루오로, 클로로 또는 브로모와 같은 하나 이상의 할로 원자로 치환되어 “할로알콕시” 그룹을 제공한다. 다른 실시양태에서, 저분자량 할로알콕시 그룹은 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 이러한 그룹의 예는 플루오로메톡시, 클로로메톡시, 트리플루오로메톡시, 트리플루오로에톡시, 플루오로에톡시 및 플루오로프로폭시를 포함한다.
용어 “방향족 그룹” 또는 “아릴 그룹”은 하나 이상의 고리를 갖는 방향족 그룹을 의미하며, 여기서 상기 고리는 매달린 방식으로 함께 부착되거나 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방향족 그룹은 1개, 2개 또는 3개의 고리이다. 단일고리 방향족 그룹은 고리에 4개 내지 10개의 탄소 원자, 일반적으로 4개 내지 7개의 탄소 원자, 더욱 일반적으로 4개 내지 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 전형적인 다중고리 방향족 그룹은 2개 또는 3개의 고리를 가지고 있다. 2개의 고리를 갖는 다중고리 방향족 그룹은 고리에 일반적으로 8개 내지 12개의 탄소 원자, 바람직하게는 8개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 방향족 그룹의 예는 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 바이페닐, 페난트릴, 안트릴 또는 아세나프틸을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 “헤테로원자”는 탄소 이외의 원자를 의미한다. 일반적으로 헤테로원자는 황, 인, 질소 및 산소 원자로 구성된 군에서 선택된다. 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 그룹은 다른 헤테로원자를 포함할 수 있다.
용어 “헤테로방향족 그룹” 또는 “헤테로아릴 그룹”은 하나 이상의 고리를 갖는 방향족 그룹을 의미하며, 여기서 상기 고리는 매달린 방식으로 함께 부착되거나 융합될 수 있고, 여기서 상기 방향족 그룹은 하나 이상의 헤테로원자를 갖는다. 단일고리 헤테로방향족 그룹은 고리에 4개 내지 10개의 구성원 원자, 전형적으로 4개 내지 7개의 구성원 원자, 더욱 전형적으로 4개 내지 6개의 구성원 원자를 포함할 수 있다. 전형적인 다중고리 헤테로방향족 그룹은 2개 또는 3개의 고리를 갖는다. 2개의 고리를 갖는 다중고리 방향족 그룹은 고리에 일반적으로 8개 내지 12개의 구성원 원자, 보다 일반적으로 8개 내지 10개의 구성원 원자를 갖는다. 헤테로 방향족 그룹의 예로는 피롤, 이미다졸, 티아졸, 옥사졸, 푸란, 티오펜, 트리아졸, 피라졸, 이속사졸, 이소티아졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 트리아진, 인돌, 벤조푸란, 벤조티오펜, 벤즈이미다졸, 벤즈티아졸, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 “탄소고리 그룹”은 포화 또는 불포화 탄소고리 탄화수소 고리를 의미한다. 탄소고리 그룹은 방향족이 아니다. 탄소고리 그룹은 단일고리 또는 다중고리이다. 다중 탄소고리 그룹은 융합, 스피로 또는 브리지 고리 시스템일 수 있다. 단일 탄소고리 그룹은 고리에 4개 내지 10개의 탄소 원자, 일반적으로 4개 내지 7개의 탄소 원자, 보다 일반적으로는 5개 내지 6 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 바이사이클릭 탄소고리 그룹은 고리에 8개 내지 12개의 탄소 원자, 일반적으로 9개 내지 10개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
용어 “헤테로고리 그룹”은 고리에 탄소 원자 및 1개 이상의 헤테로원자를 포함하는 포화 또는 불포화 고리 구조를 의미한다. 헤테로고리 그룹은 방향족이 아니다. 헤테로고리 그룹은 단일고리 또는 다중고리이다. 다중 헤테로고리 그룹은 융합, 스피로 또는 브리지 고리 시스템일 수 있다. 단일 헤테로고리 그룹은 고리에 4개 내지 10개의 구성원 원자(즉, 탄소 원자 및 적어도 1개의 헤테로원자를 포함), 전형적으로 4개 내지 7개, 및 보다 전형적으로는 5개 내지 6개의 구성원 원자를 포함할 수 있다. 바이사이클릭 헤테로고리 그룹은 고리에 8개 내지 18개의 구성원 원자, 전형적으로 9개 또는 10개의 구성원 원자를 포함할 수 있다. 대표적인 헤테로고리 그룹의 예로서 피롤리딘, 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 피페리딘, 1,4-다이옥산, 모르폴린, 티오모르폴린, 피페라진, 3-피 롤린 등을 포함한다.
용어 “이종 그룹”은 탄소 원자 및 적어도 하나의 헤테로원자를 포함하는 비-수소 구성원 원자의 포화 또는 불포화 사슬을 의미한다. 이종 그룹은 일반적으로 1개 내지 25개의 구성원 원자를 가지고 있다. 보다 전형적으로, 사슬은 1개 내지 12개의 구성원 원자, 1개 내지 10개, 가장 일반적으로는 1개 내지 6개의 구성원 원자를 포함한다. 사슬은 선형 또는 분지형일 수 있다. 전형적인 분지형 이종 그룹은 하나 또는 두 개의 분지, 더 일반적으로 하나의 분지를 가지고 있다. 일반적으로 이종 그룹은 포화이다. 불포화 이종 그룹은 하나 이상의 이중결합, 하나 이상의 삼중결합 또는 둘 다를 가질 수 있다. 전형적인 불포화 이종 그룹은 하나 또는 두 개의 이중결합 또는 하나의 삼중결합을 가지고 있다. 보다 전형적으로, 불포화 이종 그룹은 하나의 이중결합을 갖는다.
용어 “탄화수소 그룹” 또는 “하이드로카빌 그룹”은 1개 내지 25개의 탄소 원자, 전형적으로 1개 내지 12개의 탄소 원자, 보다 일반적으로 1개 내지 10개의 탄소 원자, 가장 일반적으로 1개 내지 8개의 탄소 원자의 사슬을 의미한다. 탄화수소 그룹은 선형 또는 분지형 사슬 구조를 가질 수 있다. 전형적인 탄화수소 그룹은 하나 또는 두 개의 분지, 일반적으로 하나의 분지를 가지고 있다. 일반적으로 탄화수소 그룹은 포화이다. 불포화 탄화수소 그룹은 하나 이상의 이중결합, 하나 이상의 삼중결합 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 전형적인 불포화 탄화수소 그룹은 1개 또는 2개의 이중결합 또는 1개의 삼중결합을 가지며; 보다 전형적으로 불포화 탄화수소 그룹은 하나의 이중결합을 갖는다.
“불포화”라는 용어가 임의의 그룹과 함께 사용되는 경우, 그룹은 완전히 불포화되거나 부분적으로 불포화될 수 있다. 그러나, 용어 “불포화”가 본원에 정의된 특정 그룹과 함께 사용되는 경우, 용어는 그 특정 그룹의 제한을 유지한다. 예를 들면, 본원에 정의된 “탄소고리 그룹”의 제한에 기초한 불포화 “탄소고리 그룹”은 방향족 그룹을 포함하지 않는다.
단독으로 또는 “카복시알킬 그룹”과 같은 다른 용어와 함께 사용되는 용어 “카복시 그룹” 또는 “카복실 그룹”은 -(C=O)-O-를 의미한다.
단독으로 또는 “아미노카보닐 그룹”과 같은 다른 용어와 함께 사용되는 용어 “카보닐 그룹”은 -(C=O)-를 의미한다.
용어 ”알킬카보닐 그룹”은 알킬 그룹으로 치환된 치환된 카보닐 그룹을 의미한다. 특정 실시양태에서, “저분자량 알킬카보닐 그룹”은 카보닐 그룹에 부착된 상기 기재된 바와 같은 저분자량 알킬 그룹을 갖는다.
용어 “아미노알킬 그룹”은 1개 내지 약 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 그룹을 포함하며, 이들 중 어느 하나는 하나 이상의 아미노 그룹으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노알킬 그룹은 1개 내지 6개의 탄소 원자 및 1개 이상의 아미노 그룹을 갖는 “저분자량 아미노알킬” 그룹이다. 이러한 그룹의 예로는 아미노메틸, 아미노에틸, 아미노프로필, 아미노부틸 및 아미노헥실을 포함한다.
용어 “알킬아미노알킬 그룹”은 독립적으로 알킬그룹으로 치환된 질소 원자를 갖는 아미노알킬 그룹을 포함한다. 특정 실시양태에서, 알킬아미노알킬 그룹은 1개 내지 6개의 탄소 원자의 알킬 그룹을 갖는 “저분자량 알킬아미노알킬” 그룹이다. 다른 실시양태에서, 저분자량 알킬아미노알킬 그룹은 1개 내지 3개의 탄소 원자의 알킬 그룹을 갖는다. 적합한 알킬아미노알킬 그룹은 N-메틸아미노메틸, N,N-디메틸-아미노에틸, N,N-디에틸아미노메틸 등과 같이 모노 또는 치환된 디알킬일 수 있다.
용어 “아랄킬 그룹”은 아릴-치환된 알킬 그룹을 포함한다. 실시양태에서, 아랄킬 그룹은 1개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹에 부착된 아릴 그룹을 갖는 “저분자량 아랄킬” 그룹이다. 다른 실시양태에서, 저분자량 아랄킬 그룹 페닐은 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬 부분에 부착된다. 이러한 그룹의 예는 벤질, 디페닐메틸 및 페닐에틸을 포함한다. 상기 아랄킬에서 아릴은 추가로 할로, 알킬, 알콕시, 할로알킬 및 할로알콕시로 치환될 수 있다.
용어 “아릴알케닐 그룹”은 아릴-치환된 알케닐 그룹을 포함한다. 실시양태에서, 아릴알케닐 그룹은 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 그룹에 부착된 아릴 그룹을 갖는 “저분자량 아릴알케닐” 그룹이다. 이러한 그룹의 예는 페닐에테닐을 포함한다. 상기 아릴알케닐에서 아릴은 추가로 할로, 알킬, 알콕시, 할로알킬 및 할로알콕시로 치환될 수 있다.
용어 “아릴알키닐 그룹”은 아릴-치환된 알키닐 그룹을 포함한다. 실시양태에서, 아릴알키닐 그룹은 2개 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 그룹에 부착된 아릴 그룹을 갖는 “저분자량 아릴알키닐” 그룹이다. 이러한 그룹의 예는 페닐에티닐을 포함한다. 상기 아릴알키닐에서 아릴은 추가로 할로, 알킬, 알콕시, 할로알킬 및 할로알콕시로 치환될 수 있다. 용어 벤질 및 페닐메틸은 상호 대체 가능하다.
용어 “알킬티오 그룹”은 2가 황 원자에 부착된 1개 내지 10개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형 알킬 그룹을 포함하는 그룹을 포함한다. 특정 실시양태에서, 저분자량 알킬티오 그룹 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. “알킬티오”의 예는 메틸티오 (CH3S-)이다.
용어 “알킬아미노 그룹”은 용어 “N-알킬아미노” 및 “N,N-디알킬아미노”를 포함하는, 1개의 알킬 그룹 및 2개의 알킬 그룹으로 치환된 아미노 그룹을 의미한다. 실시양태에서, 알킬아미노 그룹은 질소 원자에 부착된 1개 내지 6개의 탄소 원자의 1개 또는 2개의 알킬 그룹을 갖는 “저분자량 알킬아미노” 그룹이다. 다른 실시양태에서, 저분자량 알킬아미노 그룹은 1개 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 적합한 “알킬아미노” 그룹은 N-메틸아미노, N-에틸아미노, N,N-디메틸아미노, N,N-디에틸아미노 등과 같은 모노 또는 디알킬아미노일 수 있다.
용어 “아릴아미노 그룹”은 N-페닐아미노와 같은 1개 또는 2개의 아릴 그룹으로 치환된 아미노 그룹을 의미한다. “아릴아미노” 그룹은 그룹의 아릴 고리 부분이 추가로 치환될 수 있다.
용어 “헤테로아릴아미노”는 N-티에닐아미노와 같은 1개 또는 2개의 헤테로아릴 그룹으로 치환된 아미노 그룹을 의미한다. “헤테로아릴아미노” 그룹은 그룹의 헤테로아릴 고리 부분이 추가로 치환될 수 있다.
용어 “아랄킬아미노 그룹” 1개 또는 2개의 아랄킬 그룹으로 치환된 아미노 그룹을 나타낸다. 다른 실시양태에서, N-벤질아미노와 같은 페닐-C1-C3-알킬아미노 그룹이 있다. “아랄킬아미노” 그룹은 그룹의 아릴 고리 부분이 추가로 치환될 수 있다.
용어 “알킬아미노알킬아미노 그룹”은 1개 또는 2개의 알킬아미노 그룹으로 치환된 알킬아미노 그룹을 의미한다. 실시양태에서, C1-C3-알킬아미노-C1-C3-알킬아미노 그룹이 있다.
용어 “아릴티오 그룹'은 2가 황 원자에 부착된 6개 내지 10개의 탄소 원자의 아릴 그룹을 포함한다. “아릴티오”의 예로 페닐티오가 있다. 용어 “아랄킬티오 그룹”은 2가 황 원자에 부착된 상기 기재된 바와 같은 아랄킬 그룹을 포함한다. 특정 실시양태에서 페닐-C1-C3-알킬티오 그룹이 있다. “아랄킬티오”의 예는 벤질티오가 있다.
용어 “아릴옥시 그룹”은 산소 원자에 부착된 임의로 치환된 상기 정의된 바와 같은 아릴 그룹을 포함한다. 이러한 그룹의 예에는 페녹시가 포함된다.
용어 “아랄콕시 그룹”은 산소 원자를 통해 다른 그룹에 부착된 산소-포함 아랄킬 그룹을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아랄콕시는 상기 기재된 바와 같은 저분자량 알콕시 그룹에 부착된 임의로 치환된 페닐 그룹을 갖는 “저분자량 아랄콕시” 그룹이다.
용어 “사이클로알킬 그룹”은 포화된 탄소고리 그룹을 포함한다. 특정 실시양태에서, 사이클로알킬 그룹은 C3-C6 고리를 포함한다. 실시양태에서, 사이클로펜틸, 사이클로프로필 및 사이클로헥실을 포함하는 화합물이 있다.
용어 “사이클로알케닐 그룹”은 하나 이상의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 탄소고리 그룹을 포함하고; 상기 이중결합은 컨쥬게이트 또는 비-컨쥬게이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. “사이클로알케닐” 및 “사이클로알킬디에닐” 화합물은 용어 “사이클로알케닐”에 포함된다. 특정 실시양태에서, 사이클로알케닐 그룹은 C3-C6 고리를 포함한다. 예로는 사이클로펜테닐, 사이클로펜타디에닐, 사이클로헥세닐 및 사이클로헵타디에닐을 포함한다. “사이클로알케닐” 그룹은 저분자 알킬, 하이드록실, 할로, 할로알킬, 니트로, 시아노, 알콕시, 저분자 알킬아미노 등과 같은 1개 내지 3개의 치환기를 가질 수 있다.
본원에 기재된 그룹들과 함께 사용되는 용어 “적합한 치환기”, “치환기” 또는 “치환된”은 화학적으로 및 약학적으로 허용되는 그룹, 즉, 본 발명의 화합물의 치료 활성을 무효화하지 않는 부분을 지칭한다. 본 발명의 화합물 상의 치환기 및 치환 패턴은 화학적으로 안정하고, 당업계에 공지된 기술 및 이러한 방법에 의해 쉽게 합성될 수 있는 화합물을 제공하기 위해 당업자에 의해 선택될 수 있는 것으로 이해되며, 상기 방법은 아래에 설명되어 있다. 치환기가 그 자체가 하나 이상의 그룹으로 치환되는 경우, 안정한 구조가 생성되는 한, 이러한 다중 그룹은 동일한 탄소/구성원 원자 또는 상이한 탄소/ 구성원 원자에 있을 수 있는 것으로 이해된다. 일부 적합한 치환기의 예시로는 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 하이드록시알킬, 벤질, 카보닐, 할로, 할로알킬, 퍼플루오로알킬, 퍼플루오로알콕시, 알킬, 알케닐, 알키닐, 하이드록시, 옥소, 머캅토, 알킬티오, 알콕시, 아릴 또는 헤테로아릴, 아릴옥시 또는 헤테로아릴옥시, 아랄킬 또는 헤테로아랄킬, 아랄콕시 또는 헤테로아랄콕시, HO--(C=O)--, 아미도, 아미노, 알킬- 및 디알킬아미노, 시아노, 니트로, 카바모일, 알킬카보닐, 알콕시카보닐, 알킬아미노카보닐, 디알킬아미노카보닐, 아릴카보닐, 아릴옥시카보닐, 알킬술포닐 및 아릴술포닐을 포함한다. 전형적인 치환기는 방향족 그룹, 치환된 방향족 그룹, 메틸 그룹과 같은 알킬 그룹을 포함하는 탄화수소 그룹, 벤질과 같은 치환된 탄화수소 그룹, 및 메톡시 그룹과 같은 알콕시 그룹을 포함하는 이종 그룹을 포함한다.
용어 “융합된”은 2개 이상의 탄소/구성원 원자가 2개의 인접한 고리에 공통인 것을 의미하며, 예를 들어 고리는 “융합된 고리”이다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성되는 본 발명의 화합물의 통상적인 비독성 염을 포함한다. 예를 들면, 이러한 통상적인 비독성 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 설파민산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로부터 유도된 염; 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시-벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄디설폰산, 옥살산, 이세티온산, 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 제조 된 염을 포함한다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 부분을 포함하는 본 발명의 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 염기성 화합물의 염은 이온 교환 크로마토그래피로, 또는 유리 염기를 적절한 용매 또는 다양한 용매 조합에서 원하는 염-형성 무기산 또는 유기산의 화학양론적 양 또는 과량으로 반응시켜 제조된다. 이와 유사하게, 산성 화합물의 염은 적절한 무기 또는 유기 염기와의 반응에 의해 형성된다.
본 발명은 본 발명의 화합물 및 이들의 혼합물의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 및 전구약물을 포함한다.
용어 “상태”는 예를 들면, 포유동물의 웰빙 상태와 관련된 표준 신체 상태와 일치하지 않는 포유동물의 신체 상태(전체 또는 하나 이상의 부분)를 나타낸다. 본원에 기술된 상태는 이에 제한되는 것은 아니나, 장애 및 질환을 포함하며, 여기서, 용어 “장애”는 예를 들면, 포유동물 또는 그 일부의 기능적 이상과 관련된 포유동물의 상태를 나타내며, 용어 ”질환”은 예를 들면, 포유동물의 신체 또는 그 일부의 정상적인 기능을 손상시키며, 일반적으로 징후와 증상을 구별함으로써 나타나는 포유동물 상태를 의미한다. 전형적으로, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 염증 상태를 치료하는 데 유용하고, 전형적으로 치료되는 염증 상태는 호중구-유발 염증 요소를 갖는다.
용어 “호중구-유발” 염증은 호중구와 관련된 염증을 의미한다. 염증의 다인성 특성을 감안할 때, 이 용어를 사용함으로써 호중구는 염증의 드라이버 또는 매개체이며, 적어도 일부의 염증/염증 병인에 기여하는 유일한 드라이버 또는 매개체일 필요는 없는 것으로 이해된다. 예를 들면, 많은 경우 단핵구 및/또는 대식세포와 같은 다른 면역 세포도 염증의 원인이 될 수 있다. 호중구-유발 염증은 호중구-유발 염증 질환, 호중구-유발 염증 장애, 호중구-유발 염증 상태 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 호중구-유발 염증은 호중구에 의해 분비되는 사이토카인이 IL-1 및/또는 IL-8과 같은 병리학적 효과를 갖는 상태를 나타낼 수 있다.
이러한 상태의 예로는 건선, 염증성 장 질환, 천식, 심장 및 신장 재관류 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 혈전증, 사구체신염, 류마티스 관절염, 골관절염, 수막염, 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중을 포함한 뇌졸중, 신경외상/폐쇄성 두부 손상, 내독소혈증 및/또는 독성 쇼크 증후군, 내독소 또는 염증성 장 질환에 의해 유발된 염증 반응과 같은 기타 급성 또는 만성 염증 질환 상태, 결핵, 죽상경화증, 근육 퇴화, 다발성 경화증, 악액질, 골 흡수, 건선성 관절염, 라이터증후군, 통풍, 외상성 관절염, 풍진 관절염, 급성 활막염, 당뇨병, 췌장 β 세포 질환, 알츠하이머 병, 가성통풍, 심혈관 질환 및 혈관염을 포함한다. 일반적으로 상기 상태는 통풍, 가성통풍, 심혈관 질환, 혈관염 또는 죽상경화증이이다. 본원에 사용된 “치료”, “치료하는” 또는 “치료법”은 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근 방식이다. 본원에 기술된 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상 결과는 검출 가능 여부에 관계없이 증상(들)의 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 및/또는 질병 상태의 개선 또는 완화를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 따라서 “치료” 또는 “치료법”은 장애의 병리를 변경하려는 의도로 수행되는 개입으로 간주될 수 있다. 구체적으로, 치료 또는 치료법은 질병 또는 장애의 병리를 직접 예방하거나, 늦추거나, 감소시킬 수 있거나, 대상체를 다른 치료제에 의한 치료 또는 치료법에 더 민감하게 만들 수 있다.
용어 “만성 통풍”은 재발성 또는 연장된 통풍 발작(gout attack; 구어적으로 “gout flare”라고도 함), 통풍결절 형성, 만성 염증성 관절염 및/또는 통풍과 관련된 관절 파괴를 갖는 대상체에 존재하는 통풍을 포함한다.
용어 “급성 통풍”은 통풍 발작과 같은 적어도 하나의 통풍 증상을 가졌거나 갖고 있는 대상체에 존재하는 통풍을 포함한다.
용어 “통풍 관련 염증” 또는 “통풍서 관절염”은 요산결정에 대한 면역 반응으로 인해 무증상적일 수 있는 국소 또는 전신 염증을 의미한다.
본 발명의 화합물과 관련하여 용어 “투여”(예를 들어, 화합물 “투여”)는 화합물 또는 화합물의 전구 약물을 치료가 필요한 동물의 시스템에 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물 또는 이의 전구 약물이 하나 이상의 다른 활성제제(예를 들어, 항-통풍제 등)와 조합하여 제공되는 경우, “투여” 및 이의 변형된 용어들은 각각 화합물 또는 이의 전구 약물 및 기타 제제의 동시 및 순차적 도입을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 “통풍을 치료하는” 또는 “통풍의 치료”는 통풍 상태를 앓고 있는 포유동물에게 투여하는 것을 의미하고, 염증을 제한 및/또는 염증과 관련된 통증을 완화함으로써 통풍성 관절염 상태를 완화시키는 효과를 의미한다.
칼슘인산염결정 축적(calcium pyrophosphate crystal deposition; CPPD) 질환으로도 알려진 용어 “가성통풍(pseudogout)”은 관절에 자연적으로 일어나고 고통스러운 부종을 일으키는 관절염의 한 유형이다. CPP 결정이 활액에서 형성되어 염증과 통증을 유발할 때 발생한다.
용어 “포함하는”, “갖는” 및 “포함”, 및 이들의 다양한 어미는 지시된 구성요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않는 개방형을 의미한다.
용어 “구성되는”은 폐쇄적이거나 제한적인 의미를 가지며, “본질적으로 구성되는”은 명시된 구성 요소를 포함하지만, 불순물로 존재하는 물질, 구성요소를 제공하는 데 사용된 공정의 결과로 존재하는 피할 수 없는 물질, 본 발명의 기술적 효과를 달성하는 것이 아닌 목적으로 추가된 구성요소 이외의 다른 구성요소는 제외하는 것을 의미한다. 예를 들면, 문구 “본질적으로 구성되는”을 사용하여 정의된 조성물은 임의의 공지된 약학적으로 허용가능한 첨가제, 부형제, 희석제, 담체 등을 포함한다. 전형적으로, 한 세트의 성분으로 본질적으로 구성된 조성물은 5 중량% 미만, 전형적으로 3 중량% 미만, 보다 전형적으로 1 중량% 미만의 비-특정 성분을 포함할 것이다.
본원에 개시된 요소를 기재할 때, “a”, “an”, “the”, 및 “said”는 요소 중 하나 이상이 있음을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 용어 “및/또는”은 하나 이상의 연관되고 열거된 항목의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
본원에 포함되는 것으로 정의된 임의의 구성요소는 단서적 또는 부정적 제한에 의해 청구된 발명으로부터 명시적으로 제외될 수 있다고 이해될 것이다. 예를 들면, 일 측면에서, 특정 작용기는 본원에 기재된 화합물에서 명시적으로 제외될 수 있다.
마지막으로, “실질적으로”, “약” 및 “대략”과 같은 정도의 용어는 최종 결과가 크게 변경되지 않도록 수정된 용어의 합리적인 편차를 의미한다. 이 편차가 수정하는 단어의 의미를 무효화하지 않는 경우 이러한 차수 용어는 수정된 용어의 최소 ±5% 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 본원에 제공된 모든 범위는 명시적으로 언급되었는지 여부에 관계없이 범위의 끝과 중간 범위 지점을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, “X와 Y 사이” 및 “약 X와 Y 사이”와 같은 문구는 X와 Y를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, “약 X와 Y 사이”와 같은 문구는 “약 X와 약 Y 사이”를 의미한다. 본원에 사용된 “약 X 내지 Y”와 같은 문구는 “약 X 내지 약 Y”를 의미한다.
콜히친 유도체
콜히친 유도체(들), 유도체(들)를 포함하는 조성물, 이의 투여 방법(들) 및 이의 용도(들)가 염증 치료를 위해 제공된다.
콜히친 유도체는 화학식 I의 화합물로 표시된다:
Figure pct00008
여기서: Z는 O 또는 S이고; X1은 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹에서 선택되고; R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 치환 또는 비치환 이종 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리(carbocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로고리(heterocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로방향족(heteroaromatic) 그룹에서 선택되며; 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머(tautomer), 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합이다.
다른 실시양태에서, R2 및 R3가 모두 메틸인 경우, X1은 메틸이 아니다.
화학식 I의 특정 실시양태에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 헤테로방향족 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로고리 그룹에서 선택된다. 보다 특정한 실시양태에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 할로알킬, 치환 또는 비치환 하이드록시알킬, 치환 또는 비치환 시아노알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬카보닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴, 알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-사이클로알킬, 알킬렌-O-헤테로사이클로알킬, 알킬렌-O-알킬렌-사이클로알킬, 또는 알킬렌-O-알킬렌-헤테로사이클로알킬에서 선택된다. 다른 실시양태에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 치환 또는 비치환 C2-C6 알케닐, 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬카보닐, C1-C6 알킬렌-O-알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 또는 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴에서 선택된다. 보다 특정한 실시양태에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 또는 치환 또는 비치환 알킬아릴에서 선택된다. 추가 실시양태에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 또는 치환 또는 비치환 알킬아릴에서 선택된다. 추가 실시양태에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. 추가 실시양태에서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택된다.
실시양태에서, X1은 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹이다. 추가 실시양태에서, X1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 또는 치환 또는 비치환 알키닐에서 선택된다. 특정 실시양태에서, X1은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 구체적으로 비치환 C1-C6 알킬과 같은 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. 보다 특정한 실시양태에서, X1은 메틸 또는 에틸에서 선택된다.
다른 실시양태에서, X1은 치환 또는 비치환 이종 그룹이다. 추가 실시양태에서, X1은 -CR4R5R6에서 선택되고, 여기서 R4, R5, 및 R6는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종 그룹에서 선택된다. 구체적으로, R4, R5, 및 R6는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 아미도 그룹일 수 있다. 특정 실시양태에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, 또는 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되고, R6는 -NR(CO)CR7R8R9이며, 여기서 R은 H 및 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되고, R7, R8, 및 R9은 각각 독립적으로 H, 할로 그룹, 및 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. R7, R8, 및 R9은 할로에서 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로, R7, R8, 및 R9은 플루오로 그룹에서 선택될 수 있다.
다른 실시양태에서, X1은 OR10이고, R10은 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹에서 선택된다. 추가 실시양태에서, R10은 치환 또는 비치환 알킬 그룹, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로방향족 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로고리 그룹에서 선택된다. 구체적으로, R10은 치환 또는 비치환 알킬, CH2OH, 치환 또는 비치환 할로알킬, 치환 또는 비치환 하이드록시알킬, 치환 또는 비치환 시아노알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴, 알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-사이클로알킬, 알킬렌-O-헤테로사이클로알킬, 알킬렌-O-알킬렌-사이클로알킬, 또는 알킬렌-O-알킬렌-헤테로사이클로알킬에서 선택된다.
다른 실시양태에서, R10은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 또는 치환 또는 비치환 알키닐에서 선택된다. 다른 실시양태에서, R10은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 또는 치환 또는 비치환 C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐에서 선택된다.
추가 실시양태에서, R10은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 구체적으로는, 비치환 C1-C6 알킬과 같은 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. 더욱 구체적인 실시양태에서, R10은 메틸 또는 에틸에서 선택된다.
특정 실시양태에서, 콜히친 유도체는 화학식 IA의 화합물을 포함한다:
Figure pct00009
화학식 IA의 경우, R2, R3 및 X1은 화학식 I에 대해 위에서 언급한 바와 같을 수 있다.
특정 실시양태에서, 콜히친 유도체는 화학식 IB의 화합물을 포함한다:
Figure pct00010
화학식 IB의 경우, R2, R3 및 X1은 화학식 I에 대해 위에서 언급한 바와 같을 수 있다.
다른 실시양태에서, 콜히친 유도체는 화학식 IC의 화합물을 포함한다:
Figure pct00011
화학식 IC의 경우, R3 및 X1은 화학식 I에 대해 위에서 언급한 바와 같을 수 있다.
다른 실시양태에서, 콜히친 유도체는 화학식 ID의 화합물을 포함한다:
Figure pct00012
화학식 ID의 경우, R3 및 X1은 화학식 I에 대해 위에서 언급한 바와 같을 수 있다.
화학식 I 및 IA 내지 ID의 특정 실시양태에서, X1은 메틸 또는 메톡시이다. 다른 실시양태에서, R3는 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. 추가 실시양태에서, R3는 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택되고, 보다 구체적으로는 R3는 에틸이다.
본원에 기재된 콜히친 유도체는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합의 형태일 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 화학식 I 및 IA 내지 ID의 화합물은 C7에서 S-배열을 갖는다. 화학식 I 및 IA 내지 ID의 화합물의 특정 예들은 도 1 내지 4 및 4A 내지 4D에 제시되어 있다.
본원에 기재된 특정 화합물은 예를 들어 다음과 같이 제조될 수 있다:
a) 화학식 IV의 화합물을 ROCl과 반응시켜:
Figure pct00013
다음을 형성:
Figure pct00014
여기서: R은 치환 또는 비치환 알킬에서 선택될 수 있고, X1은 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
본원에 기재된 특정 화합물은 다음과 같이 제조될 수 있다:
a) 화학식 IV의 화합물을 R2Br과 반응시켜:
Figure pct00015
다음을 형성:
Figure pct00016
여기서: X1 및 R2는 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
본원에 기재된 특정 화합물은 다음과 같이 제조될 수 있다:
a) 화학식 VII의 화합물을 R2Br과 반응시켜:
Figure pct00017
다음을 형성:
Figure pct00018
여기서: X1 및 R3는 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
보다 구체적인 X1 그룹은 예를 들면, 화학식 VI 또는 VIII를 반응시켜 첨가될 수 있으며, 여기서 -(CO)X1은 HO(CO)CR4R5R6를 포함하는 -(CO)OR이고, 여기서 R4, R5, 및 R6는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종 그룹에서 선택된다. 구체적으로, R4, R5, 및 R6는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 아미도 그룹에서 선택된다. 특정 실시양태에서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, 또는 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되고, R6는 -NR(CO)CR7R8R9이며, 여기서 R7, R8, 및 R9은 각각 독립적으로 H, 할로 그룹, 치환 또는 비치환 알킬에서 선택된다. R7, R8, 및 R9은 할로 그룹에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로는, R7, R8, 및 R9은 플루오로 그룹에서 선택될 수 있다.
본원에 기재된 특정 화합물은 예를 들어 다음과 같이 제조될 수 있다:
a) 화학식 VIA의 화합물을 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDCI), hydroxybenzotriazole (HOBt) 및 CF3NHCH2COOH (F3CglyOH) 와 반응시켜:
Figure pct00019
다음을 형성:
Figure pct00020
여기서: R2는 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
본원에 기재된 특정 화합물은 다음과 같이 제조될 수 있다:
a) 화학식 VIIA의 화합물의 하이드록실 그룹을 보호하여
Figure pct00021
보호기(PG)를 형성:
Figure pct00022
b) 화학식 VIIB의 화합물을 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDCI), hydroxybenzotriazole (HOBt) 및 CF3NHCH2COOH (F3CglyOH) 와 반응시키고, 탈보호를 통해 다음을 형성:
Figure pct00023
본원에 기재된 특정 화합물은 예를 들어 다음과 같이 제조될 수 있다:
a) 화학식 XX의 화합물을 RO(C=O)Cl과 반응시켜:
Figure pct00024
다음을 형성:
Figure pct00025
여기서: R2, R3 및 R10은 상기 정의된 바와 같을 수 있다.
본원에 기재된 특정 화합물은 다음과 같이 제조될 수 있다:
a) 화학식 XXII 의 화합물의 하이드록실 그룹을 보호하여
Figure pct00026
보호기(PG)를 형성:
Figure pct00027
b) 화학식 XXIIB의 화합물을 R10O(C=O)Cl과 반응시키고, 탈보호를 통해 다음을 형성:
Figure pct00028
일반적으로, 본원에 기재된 화합물은 문헌에 공지되거나 본원에 예시된 반응 및 표준 조작을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 통풍과 같은 염증 상태(들), 질환(들) 및/또는 장애(들)의 치료에 유용하다. 치료되는 통풍은 예를 들면, 만성 통풍 및/또는 급성 통풍일 수 있다. 특히, 본원에 기재된 화합물은 통풍 발작, 통풍과 관련된 관절 파괴와 같은 적어도 하나의 통풍 증상을 치료할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 화합물은 통풍성 염증을 제한 및/또는 염증과 관련된 통증을 완화시킬 수 있다.
통풍은 염증성 관절염의 가장 고통스럽고 흔한 형태 중 하나로 알려져 있다. 통풍, 비만 및 신부전을 포함하는 고요산혈증의 주요 위험 요인을 촉진하는 상태의 증가로 인해 유병률(서구 국가에서 3-6%)이 전세계적으로 증가하고 있다. 요산 일나트륨(MSU) 결정은 통풍성 관절염의 원인으로, 순환중인 요산의 농도가 용해도(>6 mg/mL)를 초과할 때 관절과 연조직에서 형성되어 극심한 통증을 유발하는 강력한 내재 면역 반응을 유발한다.
통풍 발작의 초기 이벤트는 조직 상주 대식세포의 MSU-유발 활성화와 관절 내 세포 사멸을 포함한다. 이러한 세포 이벤트는 염증 반응을 유도하고 증폭시키는 전염증성 사이토카인의 방출로 이어진다. IL-1과 IL-8은 통풍의 병인에서의 사이토카인으로 확인되었다. IL-1은 내피 세포(예: E-셀렉틴) 표면의 부착 분자 발현 증가 및 케모카인 방출을 포함하여 통풍 발작의 초기 분자 이벤트를 조율한다. IL-8은 호중구에 대한 가장 강력한 화학유인물질 중 하나이며, 심한 통증 및 영향을 받은 관절의 부종을 포함하는 통풍의 전형적인 증상을 유발하는 호중구의 대량 유입을 촉진한다. 모집된 호중구는 MSU에 의해 스스로 활성화되고, 차례로, 염증 반응을 증폭시키는 전염증성 사이토카인, 활성 산소종(ROS), 프로테아제 및 호중구 세포 밖 덫(NET)을 방출한다. 높은 호중구 농도에서, NET은 MSU와 상호작용하여, 통풍 발작의 해결에 기여하는 응집된 NET(aggregated NETs)라는 복합체를 형성한다.
통풍의 치료는 병인의 두 가지 주요 측면, 즉 MSU 결정과 염증의 발달을 타겟으로 한다. 전자에 사용되는 약물에는 잔틴 산화효소 억제제(XOI)가 포함되고, 후자의 경우 콜히친, 비스테로이드 항염증제(NSAIDS) 또는 코르티코스테로이드가 포함된다. 콜히친은 또한 요산염 저하 요법 개시로 통풍 발작을 예방하는 데 사용되며, XOI에 과민한 일부 환자에서 다양한 기간 동안 예방을 위해 사용된다. 통풍 발작의 빈도와 발생은 예측할 수 없지만, 요산염 저하 요법을 시작한 후 약 4년 동안 환자가 통풍 발작을 겪는 것은 드문 일이 아니다. 평균 60%의 환자가 첫 발작 후 1~2년 이내에 통풍 발작을 겪는다.
많은 환자들이 사용 가능한 항염증제에 대한 상대적인 사용 금지 사유와 관련된 여러 동반질병을 앓기 때문에, 통풍의 치료가 어렵다. 또한 대부분의 항염증제는 MSU-유발 염증의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 특이성이 부족하다. 대조적으로, 콜히친은 호중구의 MSU-유발 활성화를 억제하지만 박테리아 펩타이드 fMLP에 의해 유도된 호중구의 특정 반응을 억제하지 않기 때문에, 통풍과 관련된 분자 경로에 대해 어느 정도의 특이성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 콜히친에 대한 치료적으로 안전한 용량의 범위는 매우 적으며, 이 약물에 대한 순응도가 떨어지는 주요 원인인 위장 시스템에 주요 독성을 나타낸다.
본원에 기술된 콜히친 유도체는 호중구와 같은 조혈 세포, 통풍 발작시 풍부한 염증 세포에 대해 덜 독성이고 더 특이적이다. PCT 공개 WO2011022805(Tuszynski 등)에 유사분열 억제제인 콜히친의 유사체가 암 치료에 덜 독성인 것이 설명되어 있다.
유리하게는, 본원에 기재된 콜히친 유도체의 항염증 활성은 콜히친의 항염증 활성과 비할 수 있을 뿐만 아니라, 콜히친의 항염증 특성이 없는 용량에서도 보존될 수 있다(예를 들어, 본원에 기재된 콜히친 유도체는 콜히친보다 더 낮은 용량에서 항염증 효과를 제공할 수 있으며(예를 들어 적어도 약 10배 더 낮음), 따라서 일 측면에서 콜히친보다 더 강력하다). 아래의 실시예에서 확인할 수 있듯이, 화합물 (91), 43 및 47a는 0.1μM의 낮은 용량에서 세포내 칼슘 농도의 증가를 억제할 수 있다. 대조적으로, 콜히친은 10μM 농도에서 칼슘 동원에서 유사한 억제를 유도했다(도 7A, E, K 및 L). 예기치 않게, 콜히친 유도체 (91), (47a) 및 ( 43)은 콜히친에서는 효과가 없는 것으로 나타난 용량인 콜히친에 비해 약 10배 내지 약 100배 낮은 농도에서 세포내 칼슘 저장의 동원을 상당히 감소시킬 수 있다(도 7).
콜히친이 다른 염증성 질환에 미치는 효과는 재발성 심낭염과 가족성 지중해열(FMF)의 치료에서 나타났다(Slobodnock et al. The American Journal of Medicine (2015)). 지중해 지역 출신 인구의 200 ~ 1,000명 중 1명에게 주로 영향을 미치는 유전성 장애인 FMF 환자는 평생 콜히친 치료를 받는다. 콜히친은 FMF에 대한 보편적인 치료법이다(https://www.fmffoundation.org/fmf). 심낭염과 관련하여 현재 유럽 가이드 라인에서는 1 ~ 2일 동안 매일 2mg의 콜히친을 투여한 다음 유지 용량을 투여할 것을 권장한다(Slobodnock et al. The American Journal of Medicine (2015)). 콜히친 유도체에 대한 다른 2차 시장은 가성통풍, 관상동맥 죽상경화증, 혈관염 또는 이들의 조합과 같은 호중구-매개 염증과 관련된 질병을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 가성통풍과 관련하여 CPP 관절염의 예방 및 급성 치료에 콜히친이 제안되어왔다(Slobodnock et al. The American Journal of Medicine (2015)). 더욱이, 호중구를 포함하는 복잡한 면역-염증 경로가 죽상경화판의 발달, 성장 및 불안정성에 연루된 관상동맥 죽상경화증에서, 콜히친은 죽상경화증의 진행 및 불안정성과 관련된 염증매개체의 혈중 농도를 억제하고 콜레스테롤-결정-유도 호중구-매개 염증을 예방하는 것으로 보고되었다(Nidorf et al. 2014). 본원에 제시된 결과와 관련하여, CCl 및 기타 콜히친 유도체들은 통풍뿐만 아니라 다른 염증성 질환, 상태 및/또는 장애, 예를 들면, 재발성 심낭염, FMF, 건선, 염증성 장 질환, 천식, 심장 및 신장 재관류 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 혈전증, 사구체신염, 류마티스 관절염, 골관절염, 수막염, 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중을 포함한 뇌졸중, 신경외상/폐쇄성 두부 손상, 내독소혈증 및/또는 독성 쇼크 증후군, 내독소 또는 염증성 장 질환에 의해 유발된 염증 반응과 같은 기타 급성 또는 만성 염증 질환 상태, 결핵, 죽상경화증, 근육 퇴화, 다발성 경화증, 악액질, 골 흡수, 건선성 관절염, 라이터증후군, 통풍, 외상성 관절염, 풍진 관절염, 급성 활막염, 당뇨병, 췌장 β 세포 질환, 알츠하이머 병, 가성통풍, 심혈관 질환 및 혈관염의 치료에 사용될 것으로 예상된다. 일반적으로 상기 상태는 통풍, 가성통풍, 심혈관 질환, 혈관염 또는 죽상경화증이다.
통풍 치료와 관련하여, 콜히친은 이 염증성 질환의 발병 기전과 관련하여 가장 높은 특이성을 나타내는데, 통풍 발작과 관련된 주요 백혈구인 호중구의 염증 작용을 대부분 약화시키기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 이 알칼로이드의 투여는 효능과 치료-제한 부작용 사이의 낮은 치료 지수로 인해 여전히 도전적이다. 뜻밖에도, 본원에 기재된 콜히친 유도체는 콜히친과 비교하여 호중구에 대해 증가된 특이성을 제공할 수 있고, 또한 더 낮은 용량에서 콜히친과 유사한 항염증 활성을 가질 수 있다. 즉, 본원에 기재된 콜히친 유도체는 콜히친과 동일한 항염증 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌지만, 놀랍게도 콜히친보다 훨씬 더 강력했다. 이러한 예상치 못한 결과는 본원에 기술된 콜히친 유도체가 더 낮은 용량으로 투여되도록 하는 이점을 제공하는 한편, 이들의 증가된 특이성은 독성 및 바람직하지 않은 이차효과의 가능성을 감소시킨다. 만성 신장 질환을 앓고 있는 통풍 환자에게 특히 관련이 있으며, 이 환자들은 콜히친을 포함한 통풍 발작 치료에 사용되는 대부분의 항염증제에 금기사항이 있기 때문이다. 만성 간 장애 환자에게도 마찬가지이다. 본원에 기재된 콜히친 유도체는 더 낮은 용량으로 투여될 수 있고 더 높은 특이성을 가질 수 있어서 독성 가능성을 감소시키기 때문에, 이들은 위장 합병증과 같은 콜히친 투여로 인한 성가신 부작용이 적다.
본 발명의 화합물은 포유동물, 일반적으로 인간과 같은 동물에게 단독으로 또는 약학적 조성물에서 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 선택적으로 알룸과 같은 공지된 어쥬번트와 조합하여, 표준 제약 관행에 따라 투여될 수 있다. 화합물은 경구 또는 정맥 내, 근육 내, 복강 내 및 피하 투여 경로를 포함하는 비경구로 투여될 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 경구 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물의 경구 사용을 위해, 선택된 화합물은 예를 들어 정제 또는 캡슐 형태로, 또는 수용액 또는 현탁액으로서 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 유당, 옥수수 전분 등의 담체와 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제가 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해 유용한 희석제는 유당 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 필요한 경우, 활성 성분은 유화제 및 현탁제와 결합된다. 원하는 경우 특정 감미료 및/또는 향미제가 첨가될 수 있다. 근육 내, 복강 내, 피하 및 정맥 내 사용을 위해 일반적으로 활성 성분의 멸균 용액을 준비하고, 용액의 pH를 적절하게 조정하고 완충해야 한다. 정맥 사용의 경우, 제제를 등장성으로 만들기 위해 용질의 총 농도를 제어해야 한다.
본 발명의 화합물은 또한 치료되는 통풍에 대한 특별한 유용성을 위해 선택된 다른 치료제와 조합 및/또는 병용투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 항-통풍제(들)와 동시에 또는 순차적으로 조합 및/또는 병용투여될 수 있다.
항-통풍제의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, 비스테로이드 항염증제(NSAIDS), 관절내 글루코코르티코이드, 잔틴 산화효소 억제제, 재조합 비인간 우리카아제 효소, 요산 배설 촉진제, 요산뇨제, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 화합물은 또한 다른 관련 적응증을 치료하기 위한 성분과 병용투여되는 경우와 같이 다른 요법과 함께 유용할 수 있다.
잔틴 산화효소 억제제는 효소 잔틴 산화효소를 억제하여 혈청 요산 수치를 감소시키는 화합물을 포함한다. 잔틴 산화효소의 예로는 이에 제한되는 것은 아니나, 페북소스타트, 프로폴리스, 옥시퓨리놀, 티소퓨린 또는 이노시톨 및 알로푸리놀을 포함한다.
재조합 비인간 우리카아제 효소에는 라스부리카제 또는 페글로티카제가 포함된다.
요산 배설 촉진제 또는 요산뇨제는 요산이 신장에서 혈류로 다시 흡수되는 것을 막아서 배설물의 순증가로 이어지게 하여 체내에 축적된 요산의 빠른 배설을 촉진하는 화합물을 의미한다. 이러한 요산 배설 촉진제 또는 요산뇨제의 예는 프로베네시드, 벤즈브로마론, 설핀피라존, 구아이페네신, 로사르탄, 아토르바스타틴, 암로디핀, 부신피질자극호르몬 또는 페노피브레이트를 포함한다.
NSAIDS는 이에 제한되는 것은 아니나, 디클로페낙, 인토메타신, 나프록센, 설린닥, 루미라콕시브 또는 Cox-2 선택적 저해제를 포함한다. Cox-2 선택적 저해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 에토리콕시브, 셀레콕시브(SC-58635), 5-브로모-2-(4-플루오로페닐)-3-(4-(메틸설포닐)페닐)-티오펜(DUP-697), 플로수리드(CGP-28238), 멜록시캄, 6-메톡시-2 나프틸아세트산(6-MNA), MK-966 (Vioxx), 나부메톤 (6-MNA 전구약물), 니메수리드, N-[2-(사이클로헥실옥시)-4-니트로페닐]-메탄설폰아마이드(NS-398), SC-5766, SC-58215, 또는 3-포밀아미노-7-메틸설포닐아미노-6-페녹시-4H-1-벤조피란-1-온(T-614)을 포함한다.
항염증제는 코르티코스테로이드일 수 있다. 코르티코스테로이드는 이에 제한되는 것은 아니나, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 덱사메타손, 플루티카손프로피오네이트, 6α,9α-디플루오로-17-[(2-퓨라닐카보닐)옥시]-11β-하이드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카보티오산 S-플루오로메틸 에스터, 6α,9α-디플루오로-11β-하이드록시-16α-메틸-3-옥소-17.알파.-프로피오닐옥시-안드로스타-1,4-디엔-17β-카보티오산 S-(2-옥소-테트라하이드로-퓨란-3S-일)에스터, 베클로메타손 에스터, 17-프로피오네이트 에스터 또는 17,21-디프로피오네이트 에스터, 부데소니드, 플루니소리드, 모메타손 에스터, 프로에이트 에스터, 트리암시놀론 아세토나이드, 로플레포니드, 시클레소니드, 부틱소코르트 프로피오네이트, RPR-106541, ST-126, 플루티카손 프로피오네이트, 6α,9α-디플루오로-11β-하이드록시-16α-메틸-17α-[(-4-메틸-1,3-티아졸-5-카보닐)옥시]-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카보티오산 S-플루오로메틸 에스터 및 6α,9α-디플루오로-17α-[(2-퓨라닐카보닐)옥시]-11β-하이드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카보티오산 S-플루오로메틸 에스터, 또는 6α,9α-디플루오로-17α-[(2-퓨라닐카보닐)옥시]-11β-하이드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카보티오산 S-플루오로메틸 에스터를 포함한다.
고정 용량으로 제형화되는 경우, 이러한 조합 제품은 아래에 설명된 용량 범위 내에서 본 발명의 화합물을 사용하고 승인된 용량 범위 내에서 다른 약학적 활성제(들)를 사용한다. 본원에 기재된 화합물은 조합 제형이 부적절할 때 공지된 약학적으로 허용가능한 제제(들)와 함께 순차적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물이 인간 대상체에 투여될 때, 1일 투여량은 일반적으로 처방 의사에 의해 결정될 것이며, 일반적으로 환자의 연령, 체중 및 반응 및 환자의 증상 중증도에 따라 투여량이 달라질 수 있다.
하나의 예시적인 적용에서, 적절한 양의 화합물이 통풍 치료를 받고 있는 포유동물에게 투여된다. 투여는 1일 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중 초과; 1일 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중; 1일 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 250 mg/kg 체중; 또는 1일 약 0.001 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중의 양으로 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 특히 경구로 사용될 수 있다.
임의의 용량 조합이 사용될 수 있다. 조합은 순차적으로 또는 동시에 사용될 수 있다.
β- 튜불린 콜히친 결합 부위
5개의 가장 널리 알려진 인간 β-튜불린 이소타입의 모델이 밝혀졌으며, 콜히친 결합 부위가 이소타입 특이성을 기반으로 한 약물 설계에 가장 유망한 것으로 확인되었다. 이 결합 부위를 주형으로 사용하고, 이소타입 간의 고유한 변이와 각 β-튜불린 이소타입상의 콜히친 결합 부위가 기하학적 특성과 생화학적 특성이 모두 다르다는 사실에 기초하여, PCT 공개 WO2011022805에 기재된 콜히친 유도체는 관심 있는 β-튜불린 이소타입에 우선적으로 결합하도록 조작되었다. 본원에 기술된 바와 같이, 암세포에서 과발현되는 튜불린의 이소타입인 β-III 튜불린에 우선적으로 결합하는 콜히친 유사체가 생성되었으며, 이들 유도체는 저용량에서 종양 성장을 억제하는 데 탁솔보다 더 강력한 것을 확인하였다.
상기 기재된 접근법을 사용하여, 콜히친의 구조를 수정하여 β-VI 튜불린 이소타입에 결합하는 능력을 높였다. β-VI 튜불린은 호중구와 같은 면역 세포에서 발현되는 주요 β-튜불린 이소타입 중 하나이기 때문에 타겟으로서 중요하다(도 15 참조). 더욱이, β-VI 튜불린에 대한 결합은 이 이소타입이 조혈 세포에 특이적이기 때문에 비-조혈 세포와의 오프-타겟 효과를 최소화한다. β-VI 튜불린 이소타입은 특히 콜히친 결합 영역에서 다른 것과 매우 구별되며, 인체에서 좁은 분포를 가지고 있어 결합하는 약물에 대해 높은 수준의 특이성과 선택성을 제공한다.
본원에 기술된 콜히친 유도체는 βVI, βV에 우선적으로 결합하고, βI 튜불린에 대한 친화성은 더 낮다. 본원에 기술된 계산 방법은 통풍성 염증과 같은 염증 상태에 관여하는 세포에 대해 증가된 특이성을 갖는 콜히친 유도체를 제공하고, 또한 뜻밖에도 콜히친보다 훨씬 낮은 농도에서 활성화되어 콜히친의 바람직하지 않은 부작용을 피할 수 있다.
콜히친 결합을 시험하였다. 콜히친 결합 부위를 구성하는 잔기의 서열은 모든 인간 튜불린 이소타입 중에서 가장 큰 변이(77.8% 동일성)를 나타낸다(Huzil J.T. et al., Nanotechnology. 2006:17:S90-S100). 이 결합 부위는 콜키시노이드, 벤즈이미다졸 (Laclette J.P. et al., Biochem Biophys Res Commun. 1980; 92:417-23; Tahir S.K., Biotechniques. 2000; 29:156-60; Russell G.J. et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 1995; 35:1153-9; 및 Hoebeke J. et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 1976; 69:319-24) 및 포도필로톡신(Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202)을 포함한 여러 천연 화합물과 상호작용하여, 여러 결합 형태에 적용 가능하게 함이 밝혀졌다(Garland D.L., Biochemistry. 1978; 17:4266-72; Sackett D.L. et al., Biochemistry, 1993; 32:13560-5; Andreu J.M. et al., Biochemistry. 1982; 21:6465-76; Chaudhuri A.R. et al., J. Mol. Biol., 2000; 303:679-92). 콜히친은 독성 또는 거의 독성 수준에서만 관찰되는 매우 강한 유사분열 억제 활성을 가지며, 통풍 치료제로서의 사용을 제한하는 한편, 조혈 세포에서 발현되는 튜불린 이소타입에 대한 선택성이 증가된 유사한 화합물의 비교를 위한 표준으로 본원에서 사용된다.
컴퓨터 스크리닝을 이용하여, β-튜불린 이소타입 친화성(특히 β-VI에 대한 친화성)을 기반으로 더 나은 항염증 특성을 가질 수 있는 콜히친 유도체를 확인하였다. 이들 유도체(예를 들면, 유도체 91, 47a 및 43)의 항염증 특성은 본원에 기재된 in vitro 및 in vivo 시험을 통해 검증되었다. 예를 들면, 특정 β-튜불린 이소타입에 대해 더 높은 친화성을 갖는 콜히친 유도체, 예를 들어 본원에 기재된 화합물 91(예를 들어, 도 7 참조)은 염증 세포에 대한 효과에서 콜히친 독성의 단점 없이, 콜히친보다 우수한 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 약 10배 내지 약 100배 낮은 농도에서 칼슘 동원 억제). 본원에 기재된 유도체의 항염증 특성은 하기 실시예에 요약되어 있다.
튜불린과 여러 리간드의 상호작용에 관한 구조 정보가 많지만, 튜불린의 형태는 시간이 지남에 따라 붕괴되고 약물의 결합 자체가 단백질 자체 내에서 상당한 형태 변화를 일으킬 수 있다(Luduena R.F. et al., Biochem. 1995; 34:15751-9; Chaudhuri A.R. et al., J. Mol. Biol., 2000; 303:679-92; 및 Schwarz P.M. et al., Biochem. 1998; 37:4687-92). 따라서, 결합 부위의 특정 고정된 형태를 사용한 모델링 예측은 신뢰할 수 없다. 콜히친 결합의 경우 특히 그러하며, 결합되지 않은 형태의 β-튜불린은 콜히친 결합 공동(cavity)의 완전한 부재를 보여준다(Nogales E. et al., Nature. 1995; 375:424-7). 이 한계를 극복하기 위해 먼저 인간 β-튜불린 이소타입 전체에서 발견되는 콜히친 결합 부위의 세 가지 대표적인 모델이 만들어졌다. 둘째, 시뮬레이션된 어닐링 방법을 통해 콜히친 결합 부위의 입체 구조 공간을 샘플링하려는 체계적인 도킹 절차가 수행되었다.
조혈 세포에서 발현되는 β-튜불린 이소타입에 대한 특이성을 증가시킬 수 있는 모델 시스템을 설계하기 위해, 컴퓨터 모델링 방법을 사용하여 콜히친에 대한 몇 가지 변형이 도입되었다. 이소타입 간의 차이를 조사하기 위해 결정 구조에서 결합된 콜히친 아래에 위치한 공동을 조사했다. 특히, 여러 C3-디메틸티오콜히친 유도체와 C1-디메틸콜히친 유도체가 합성되었다.
궁극적으로 튜불린-이소타입 특이적 약물은 현재 처방되는 약물보다 부작용이 적어야 한다. 이는 이들이 염증과 관련된 특정 β-튜불린 이소타입을 발현하는 세포에서만 미세소관에 결합하고 파괴하기 때문이다. 이러한 결과는 모델링으로 더 나은 약물을 생성할 가능성이 높고, 튜불린을 이용하여 합리적인 약물 설계가 가능함을 시사한다.
상기 개시는 일반적으로 본 발명을 설명한다. 보다 완전한 이해는 다음 특정 실시예를 참조하여 얻을 수 있다. 이들 실시예는 오로지 예시의 목적으로 설명되며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 상황에 따라 편의를 제안하거나 제공할 수 있으므로, 형태 변경 및 등가물 대체가 고려된다. 본원에서, 특정 용어가 사용되나 이러한 용어는 제한 목적이 아닌 설명적인 의미로 사용된다.
실시예
실시예 1- 콜히친 유도체의 합성 및 분석
재료 및 방법
본 발명에 사용된 모든 화학적 화합물과 콜히친 N-[(7S)-1,2,3,10-tetramethoxy-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide ( 1)은, Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada)에서 구입하였다.
콜히친 화합물의 합성
합성 도식은 도 1 내지 도 3을 참조한다.
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-1-((methyl)carbonyloxy)-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (2) 및 N-[(7S)-1-hydroxy-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (3). ( 2)와 ( 3)의 합성은 Blade-Font (A. Blade-Font, Afinidad, 36 (1979) 329-331)에서 채택되었으며, 도 1에 나타내었다.
N-[(7S)-1-((ethyl)carbonyloxy)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (4) 및 N-[(7S)-1-(((methyl)ethyl)carbonyloxy)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (5).
1 mmol의 ( 2)를 2.5 mL of 수산화나트륨 용액에 용해시켰다. 용액을 0℃로 냉각시켰다. 1 mmol의 CH3CH2COCl 또는 (CH3)CH(CH3)COCl을 3.5 mL 아세톤에 용해시키고, 화합물 (4) 또는 ( 5)에 첨가하였다. 용액을 15시간 동안 방치한 다음, 알칼리수 25 mL를 첨가하였다. 클로로포름을 이용하여 생성된 생성물을 추출하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. ( 4)와 ( 5)의 합성은 도 2에 나타내었다.
N-[(7S)-1-(ethoxy)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (6);
N-[(7S)-1-(ethoxy-1-methyl)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (7);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-1-(2-methylpropoxy)-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (7a);
N-[(7S)-1-(butoxy)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (7b);
N-[(7S)-1-((but(3-en)oxy)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (7c);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-1-(propanoxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (8);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-1-((prop(2-en)oxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (9);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-1-((phenyl)methoxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (10);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-1-(((3-methoxy)propan)oxy)(3-methoxy))-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (11);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-1-((phenyl(3-chloro))methoxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (12);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-1-((pyridin(3))yl)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (13);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-1-((phenyl(2-chloro))methoxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (14);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-9-oxo-1-(((phenyl(4-chloro))methoxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (15);
N-[(7S)-2,3,10-trimethoxy-1-((methyl)cyclohexane)-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (16).
1 mmol의 (2) 화합물을 2.5 mL 수산화나트륨 용액에 용해시키고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 1 mmol의 브로마이드 유도체(예를 들어, ( 6)의 경우 1-bromoethane, ( 7)의 경우 2-bromopropane, (7a)의 경우 1-bromo-2-methylpropane, (7b)의 경우 1-bromo-butane, (7c)의 경우 4-bromobut-1-ene, ( 8)의 경우 1-bromopropane, ( 9)의 경우 3-bromoprop-1-ene, (10)의 경우 (bromomethyl)benzene, ( 11)의 경우 1-methoxy -2-bromoethane, ( 12)의 경우 1-bromomethyl-3-chlorobenzene, ( 13)의 경우 3-(bromomethyl)pyridine, (14)의 경우 1-bromomethyl-2-chlorobenzene, ( 15)의 경우 1-bromomethyl-4-chlorobenzene, 및 ( 16)의 경우 (bromomethyl)cyclohexane)를 3.5 mL 아세톤에 용해시켰다. 각 용액을 15시간 동안 방치하였다. 그 다음, 알칼리수 25 mL를 첨가하였다. 클로로포름을 이용하여 화합물을 추출하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. (6- 16)의 합성은 도 3에 나타내었다.
N- deacetyl -N-(N- trifluoroacetylaminoacyl ) colchicine 제조를 위한 일반적 절차
메탄올 (50 mL) 및 2N HCl (25 mL)에 용해된 유도체 (6-16) 3 mmol을 1일간 교반하면서 90℃에서 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, NaHCO3로 중화시켰다. 생성물을 메틸렌 클로라이드로 추출하고, 염수로 세척하였다. 추출물을 Na2SO4로 건조시키고, 증발시켰다. 탈아세틸화 화합물 (17- 27)은 CH2Cl2에서 결정화되었다.
탈아세틸화 화합물 (17-27) 1 mmol과 [(trifluoroacetyl)amino]acetic acid (1 mmol)을 실온에서 디클로로메탄(6 mL)에 용해시켰다. Dicyclohexylcarbodiimide (1 mmol)를 첨가하였다. 2시간 후, 현탁액을 0℃로 냉각하고 여과하였다. 생성물 (28-38)을 디클로로메탄/메탄올(1:0 내지 0:1)로 용리하는 실리카 겔 컬럼 상에서 크로마토그래피 하였다. (28- 38)의 결정화는 디클로로메탄:에틸 에테르(1:1)로 수행되었다.
분석적인 검토
(2) C(23)H(25)O(7)N(1); M, 427 필요, 실측치 EIMS m/e 427.1 (M+); (3) C(21)H(23)O(6)N(1); M, 385 필요, 실측치 EIMS m/e 385.1 (M+); (4) C(24)H(27)O(7)N(1); M, 441 필요, 실측치 EIMS m/e 441.1 (M+); (5) C(25)H(29)O(7)N(1); M, 455 필요, 실측치 EIMS m/e 455.0 (M+); (6) C(23)H(27)O(6)N(1); M, 413 필요, 실측치 EIMS m/e 413.1 (M+); 분석 계산 C% 66.83, H% 6.55, N% 23.22, 실측치: C% 66.82, H% 6.54, N% 23.22; (7) C(24)H(29)O(6)N(1); M, 427 필요, 실측치 EIMS m/e 427.1 (M+); 분석 계산 C% 67.44, H% 6.77, N% 3.22, 실측치: C% 67.41, H% 6.73, N% 3.21; (8) C(24)H(29)O(6)N(1); M, 427 필요, 실측치 EIMS m/e 427.1 (M+); 분석 계산 C% 67.44, H% 6.79, N% 32.78, 실측치: C% 67.44, H% 6.80, N% 32.77; (9) C(24)H(27)O(6)N(1); M, 425 필요, 실측치 EIMS m/e 425.1 (M+); 분석 계산 C% 67.76, H% 6.35, N% 3.29, 실측치: C% 67.77, H% 6.33, N% 3.28; (10) C(28)H(28)O(6)N(1); M, 475 필요, 실측치 EIMS m/e 475.2 (M+); 분석 계산 C% 70.88, H% 5.91, N% 2.95, 실측치: C% 70.87, H% 5.92, N% 2.93; (11) C(24)H(29)O(7)N(1); M, 443 필요, 실측치 EIMS m/e 443.1 (M+); 분석 계산 C% 65.01, H% 6.54, N% 3.16, 실측치: C% 65.02, H% 6.53, N% 3.11; (12) C(28)H(27)O(6)N(1)Cl(1); M, 509 필요, 실측치 EIMS m/e 509.1 (M+); 분석 계산 C% 71.04, H% 6.13, N% 2.93, 실측치: C% 71.05, H% 6.12, N% 2.95; (13) C(27)H(28)O(6)N(2); M, 476 필요, 실측치 EIMS m/e 476.1 (M+); 분석 계산 C% 68.06, H% 5.88, N% 5.88, 실측치: C% 68.09, H% 5.86, N 5.89%; (14) C(28)H(28)O(6)N(1)Cl(1); M, 509 필요, 실측치 EIMS m/e 509.1 (M+); 분석 계산 C% 66.01, H% 5.50, N% 2.94, Cl% 6.87, 실측치: C% 66. 03, H% 5.51, N% 2.95, Cl% 6.88; (15) C(24)H(29)O(7)N(1); M, 509 필요, 실측치 EIMS m/e 509.1 (M+); 분석 계산 C% 65.01, H% 6.09, N% 3.16, Cl% 7.90, 실측치: C% 65.02, H% 6.07, N% 3.10, Cl% 7.92; (16) C(28)H(34)O(6)N(1); M, 495 필요, 실측치 EIMS m/e 495.2 (M+); 분석 계산 C% 70.02, H% 7.09, N% 2.91, 실측치: C% 70.04, H% 7.08, N% 2.93; (17) C(21)H(25)O(5)N(1); 분석 계산 C% 67.92, H% 7.27, N% 3.77, 실측치: C% 67.93, H% 7.28, N% 3.78; (18) C(22)H(27)O(5)N(1) 분석 계산 C% 68.57, H% 7.01, N% 3.77, 실측치: C% 68.59, H% 7.03, N% 3.79; (19) C(22)H(27)O(5)N(1); 분석 계산 C% 68.63, H% 7.04, N% 3.78, 실측치: C% 68.62, H% 7.05, N% 3.79; (20) C(22)H(25)O(5)N(1); 분석 계산 C% 68.92, H% 6.52, N% 3.65, 실측치: C% 68.94, H% 6.53, N% 3.67; (21) C(26)H(26)O(5)N(1); 분석 계산 C% 72.22, H% 6.01, N% 3.24, 실측치: C% 72.21, H% 6.04, N% 3.23; (22) C(22)H(27)O(6)N(1); 분석 계산 C% 65.83, H% 6.73, N% 3.49, 실측치: C% 65.82, H% 6.73, N% 3.48; (23) C(26)H(25)O(5)N(1)Cl(1); 분석 계산 C% 66.95, H% 5.36, N% 3.02, Cl 7.51, 실측치: C% 66.93, H% 5.34, N% 3.01, Cl 7.53; (24) C(22)H(26)O(5)N(1); 분석 계산 C% 81.25, H% 6.77, N% 3.64, 실측치: C% 81.26, H% 6.78, N% 3.66; (25) C(26)H(26)O(5)N(1)Cl(1); 분석 계산 C% 66.80, H% 5.56, N% 2.99, Cl% 7.49, 실측치: C% 66.81, H% 5.55, N% 2.98, Cl% 7.48; (26) C(22)H(27)O(5)N(1); 분석 계산 C% 77.92, H% 7.01, N% 3.63, 실측치: C% 77.93, H% 7.03, N% 3.65; (27) C(26)H(32)O(5)N(1); 분석 계산 C% 71.23, H% 7.30, N% 3.19, 실측치: C% 71.22, H% 7.32, N% 3.20; (28) C(25)H(27)O(7)N(2)F(3); 분석 계산 C% 57.25, H% 5.15, N% 5.18, F% 10.85, 실측치: C% 57.25, H% 4.99, N% 5.34, F% 10.86; (29) C(26)H(29)O(7)N(2)F(3); 분석 계산 C% 57.99, H% 5.39, N% 5.20, F% 10.59, 실측치: C% 56.38, H% 5.3, N% 5.3, F% 10.87; (30) C(26)H(29)O(7)N(2)F(3); 분석 계산 C% 57.99, H% 5.39, N% 5.20, F% 10.59, 실측치: C% 57.58, H% 5.32, N% 5.28, F% 10.59; (31) C(26)H(27)O(7)N(2)F(3); 분석 계산 C% 57.99, H% 5.39, N% 5.20, F% 10.56, 실측치: C% 57.99, H% 5.88, N% 5.28, F% 10.55; (32) C(30)H(28)O(7)N(2)F(3); 분석 계산 C% 59.92, H% 4.66, N% 4.65, F% 9.46, 실측치: C% 59.71, H% 4.65, N% 4.37, F% 9.49; (33) C(26)H(29)O(7)N(2)F(3); 분석 계산 C% 57.99, H% 5.39, N% 5.20, F% 10.59, 실측치: C% 56.38, H% 5.21, N% 4.68, F% 9.55; (34) C(30)H(27)O(7)N(2)Cl(1)F(3); 분석 계산 C% 56.77, H% 4.28, N% 4.13, F% 8.41, 실측치: C% 56.74, H% 4.29, N% 4.12, F% 8.43; (35) C(26)H(27)O(7)N(2)F(3); 분석 계산 C% 58.20, H% 4.86, N% 4.69, F% 9.56, 실측치: C% 58.12, H% 4.87, N% 4.69, F% 9.57; (36) C(30)H(28)O(7)N(2)Cl(1)F(3); 분석 계산 C% 58.06, H% 4.15, N% 4.12, F% 8.41, 실측치: C% 58.06, H% 4.14, N% 4.13, F% 8.40; (37) C(26)H(28)O(7)N(2)Cl(1)F(3); 분석 계산 C% 54.54, H% 4.87, N% 4.73, F% 9.25, 실측치: C% 54.53, H% 4.88, N% 4.72, F% 9.26; (38) C(30)H(34)O(7)N(2)F(3); 분석 계산 C% 60.91, H% 5.75, N% 4.73, F% 9.64, 실측치: C% 60.79, H% 5.67, N% 4.63, F%9.67.
티오콜히친 ( Thiocolchicine ) 화합물 합성(도 4)
티오콜히친, N-[(7S)-1,2,3-trimethoxy-10-methylsulfanylo-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (39): 콜히친(1) (1 mmol)을 70-80℃에서 10 mL 메탄올/디메틸포름아미드(1:1)에 용해시켰다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 소듐 메탄티오에이트(2 mmol)를 첨가하였다. 혼합 용액을 밤새 교반하였다. 물(20 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 CH2Cl2 (10 mL)로 추출한 다음, Na2SO4로 건조하고, 농축하였다. 에틸 에테르/아세톤(1:1)으로부터 잔류물을 결정화하여 71% 수율로 생성물(39)을 얻었다.
N-[(7S)-3-hydroxy-1,2-dimethoxy-3-hydroxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (40): 10 mL 메탄올을 사용하여 1 mmol 티오콜히친 ( 39)을 용해시키고, 0.2N의 염산 30 mL를 첨가하였다. 메탄올을 증발시키고, 냉각시킨 다음, 수산화나트륨 용액을 pH 값이 11이 될 때까지 첨가하고, 생성된 알칼리 용액을 비-페놀성 물질로부터 제거하기 위하여 클로로포름으로 추출하였다. 수산화나트륨 용액(빨간색)을 염산으로 산성화하고, 클로로포름으로 추출하였다. 건조 및 증발 후, ( 40)의 수율은 58%였다.
N-[(7S)-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-3-(prop(2-en)oxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (41), N-[(7S)-3-ethoxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (42), 및 N-[(7S)-3-propoxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]acetamide (43): 1 mmol의 (40) 화합물을 1N의 수산화나트륨 용액 2.5 mL에 용해시켰다. 생성된 용액을 0℃로 냉각하고, 화합물 ( 41)을 얻기 위해 3-bromoprop-1-ene (1 mmol)을; 화합물 ( 42)을 얻기 위해 1-bromoethane (1 mmol)을; 또는 화합물 ( 43)을 얻기 위해 1-bromopropane (1mmol)을, 3.5 mL 아세톤에 용해시키고 냉각된 용액에 첨가하였다. 용액을 15시간 동안 방치한 다음, 알칼리수 25 mL를 첨가하였다. 클로로포름을 사용하여 생성된 생성물을 추출하고, 황산마그네슘으로 건조하였다. ( 41)의 수율은 68%였고, ( 42)의 수율은 71%였다.
N- deacetyl -N-(N- trifluoroacetylaminoacyl ) thiocolchicine의 제조
N-[(7S)-3-hydroxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]amine (44);
N-[(7S)-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-3-(prop(2-en)oxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]amine (45);
N-[(7S)-3-ethoxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]amine (46);
N-[(7S)-3-hydroxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]-N-[(trifluoroacetyl)glycyl]acetamide (47);
N-[(7S)-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-3-(prop-2-enoxy)-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]-N-[(trifluoroacetyl)glycyl]acetamide (48);
N-[(7S)-3-ethoxy-1,2-dimethoxy-10-methylsulfanyl-9-oxo-5,6,7,9-tetrahydrobenzo[α]heptalen-7-yl]-N-[(trifluoroacetyl)glycyl]acetamide (49).
각각의 유도체 (44-46) 및 (47- 49)는 유사한 방식으로 제조되었다. 1 mmol의 적절한 유도체 (40) 또는 (41) 또는 ( 42)를 2N HCl(10 mL)과 함께 메탄올(20 mL)에 용해시키고, 90℃에서 가열하고, 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, NaHCO3로 중화한 다음, CH2Cl2로 추출하였다. 추출물을 Na2SO4로 건조시키고 증발시켰다. 결정화는 (1:1) CH2Cl2/CH3OH에서 이루어졌다. 탈아세틸화 화합물(44), (45), ( 46)의 수율은 각각 58%, 63% 및 71%였다.
1 mmol의 탈아세틸화 화합물 (44) 또는 (45) 또는 (46) 및 N-trifluoroacetyloamino acid (1 mmol)를 실온에서 용해시키고, 디클로로메탄(6 mL)을 교반하면서 첨가하였다. Dicyclohexylcarbodiimide (1 mmol)를 현탁액에 첨가하고, 2시간 후 0℃로 냉각하고 여과하였다. 각각의 화합물 (47) 또는 (48) 또는 (49)는 디클로로메탄:에틸 에테르(1:1) 용액으로부터 결정화되었다. (47), (48), 및 ( 49)의 수율은 각각 64%, 67% 및 75%였다.
(39), (40-42), (44-46) 및 (47-49) 화합물 분석
콜히친 (1): M.p. 275℃; (39): M.p. 250℃ -252℃; C(22)H(25)N(1)O(5)S(1)에 대한 분석 계산: C% 63.60, H% 6.06, N% 3.37, S% 7.72; 실측치: C% 63.71, H% 6.15, N% 3.42, S% 7.79; (40): M.p. 306℃; C(21)H(23)O(5)N(1)S(1)에 대한 분석 계산: C% 62.8, H% 5.8, N% 3.5, S% 8.0, 실측치: C% 62.9, H% 5.8, N% 3.3, S% 7.5; M, 401.1 필요, 실측치 EIMS m/e 401.1 (M+); (41): M.p. 306℃; C(24)H(27)O(5)N(1)S(1)에 대한 분석 계산, C% 65.3, H% 6.12, N% 3.17, S% 7.24, 실측치: C% 65.07, H% 6.59, N% 3.21, S% 7.28; M, 454.5 필요, 실측치 EIMS 454.5 (M+Na+); 442.5; (42): M.p. 273℃; C(23)H(27)O(5)N(1)S(1)에 대한 분석 계산, C% 64.33, H% 18.64, N% 3.26, S% 7.45, 실측치: C% 64.4, H% 18.9, N% 3.27, S% 7.61; M, 452.6 필요, 실측치 EIMS 452.6 (M+Na+); (44): M.p. 281℃; C(19)H(21)O(4)N(1)S(1)에 대한 분석 계산, C% 63.51, H% 5.91, N% 3.88, S% 8.92, 실측치: C% 63.55, H% 5.83, N% 3.75, S% 8.93; (45): M.p. 254℃; C(22)H(25)O(4)N(1)S(1)에 대한 분석 계산, C% 65.8, H% 6.77, N% 3.52, S% 7.99, 실측치: C% 65.83, H% 6.49, N% 3.63, S% 8.31; (46): M.p. 276℃; C(21)H(25)O(4)N(1)S(1)에 대한 분석 계산, C% 65.81, H% 6.50, N% 3.6, S% 8.24, 실측치: C% 65.12, H% 6.54, N% 3.57, S% 8.27; (47): M.p. 284℃; C(23)H(23)O(6)N(2)S(1)F(3)에 대한 분석 계산, C% 55.42, H% 4.61, N% 2.92, S% 6.42, F% 11.44, 실측치: C% 55.43, H% 4.62, N% 2.91, S% 6.42, F% 11.44; (48): M.p.324℃; C(26)H(27)O(6)N(2)S(1)F(3)에 대한 분석 계산, C% 56.52, H% 4.89, N% 5.07, S% 5.79, F% 10.3, 실측치: C% 56.52, H% 4.87, N% 7.01, S% 5.79, F% 10.32; (49): M.p. 256℃; C(25)H(27)O(6)N(2)S(1)F(3)에 대한 분석 계산, C% 57.03, H% 5.13, N% 5.32, S% 6.08, F% 10.87, 실측치: C% 53.67, H% 4.5, N% 5.32, S% 6.05, F% 10.85.
콜히친 유도체의 구체적인 합성
화합물 (2)
Figure pct00029
물(2000 mL)에 용해된 1(30.0 g) 및 나트륨 티오메톡사이드(30.0 mL) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 농축하여 조 생성물(crude product)을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(20.0 g, 65%)을 얻었다.
화합물 (6), (17) 및 (28)
Figure pct00030
1(1.0 g, 2.51 mmol) 및 아세틸 클로라이드(3 mL)를 테트라클로라이드(1 mL)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 40시간 동안 교반하였다. 조 생성물은 다음 단계에서 직접 사용되었다.
메탄올/물에 용해된 2(crude) 및 수산화리튬(4 eq.)의 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 수성 상을 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 재결정화를 통해 생성물을 얻었다(0.2 g, 21%, 2 단계).
DMF(20 mL)에 용해된 3(800 mg, 2.01 mmol), 브로모에탄(450 mg, 4.16 mmol) 및 탄산칼륨(1.2 g, 8.31 mmol)의 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.5 g, 60%)을 얻었다.
THF(15 mL)에 용해된 4(700 mg, 1.69 mmol), (Boc)2O(3.7 g, 16.95 mol) 및 DMAP(83 mg, 0.68 mmol)의 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(15 mL)에 용해된 5(crude) 및 나트륨 메톡사이드(365.0 mg, 6.76 mmol) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 물을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.6 g)을 얻었다.
디클로로메탄(5 mL)에 용해된 6(600 mg, 1.27 mmol) 및 트리플루오로아세트산(5 mL) 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.45 g, 96%)을 얻었다.
디클로로메탄(3mL)에 용해된 7(50 mg, 0.13 mmol), EDCI(39 mg, 0.20 mmol), HOBT(27 mg, 0.20 mmol), F3CGlyOH(28 mg, 0.16 mmol) 및 트리에틸아민(54 mg, 0.54 mmol) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(22 mg, 31%)을 얻었다.
화합물 (11), (22) 및 (33)
Figure pct00031
1(1.0 g, 2.51 mmol), 및 아세틸클로라이드(3 mL) 용액을 테트라클로라이드(1 mL)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 40시간 동안 교반하였다. 조 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올/물에 용해된 2(crude) 및 수산화리튬(4 eq.) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 수성 상을 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 재결정화를 통해 생성물을 얻었다(0.2g, 21%, 2 단계).
DMF(20 mL)에 용해된 3(800 mg, 2.01 mmol), 1-bromo-2-methoxyethane(580 mg, 4.16 mmol) 및 탄산칼륨(1.15 g, 8.31 mmol) 혼합물을 75℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.5 g, 54%)을 얻었다.
THF (10 mL)에 용해된 4 (500 mg, 1.13 mmol), (Boc)2O (2.5 g, 11.29 mmol) 및 DMAP (55 mg, 0.45 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올 (15 mL)에 용해된 5 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (244.0 mg, 4.52 mmol) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 물을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.45 g)을 얻었다.
디클로로메탄 (5 mL)에 용해된 6 (0.6 g, 1.20 mmol) 및 트리플루오로아세트산 (5 mL) 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.45 g, 94%)을 얻었다.
디클로로메탄 (3 mL)에 용해된 7 (65 mg, 0.16 mmol), EDCI (46 mg, 0.24 mmol), HOBT (32 mg, 0.24 mmol), F3CGlyOH (42 mg, 0.24 mmol) 및 트리에틸아민 (65 mg, 0.65 mmol) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(25 mg, 28%)을 얻었다.
화합물 (13), (24) 및 (35)
Figure pct00032
1 (1.0 g, 2.51 mmol), 및 아세틸 클로라이드 (3 mL) 용액을 테트라클로라이드 (1 mL)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 40시간 동안 교반하였다. 조 생성물을 다음 단계에서 직접 사용하였다.
메탄올/물에 용해된 2 (crude) 및 수산화리튬 (4 eq.) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 수성 상을 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 재결정화를 통해 생성물을 얻었다(0.2 g, 21%, 2 단계).
DMF (20 mL)에 용해된 A mixture of 3 (1.0 g, 2.6 mmol), 3-(chloromethyl)pyridine (0.64 g, 3.9 mmol) 및 탄산칼륨 (1.08 g, 7.8 mmol) 혼합물을 90℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.7 g, 58%)을 얻었다.
THF (20 mL)에 용해된 4 (700 mg, 1.47 mmol), (Boc)2O (3.2 g, 14.71 mol) 및 DMAP (72 mg, 0.59 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 무로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물(0.7 g, 87%)을 얻었다.
메탄올 (10 mL)에 용해된 5 (0.7 g, 1.22 mmol) 및 나트륨 메톡사이드 (131.0 mg, 2.43 mmol) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
디클로로메탄 (10 mL)에 용해된 6 (crude) 및 트리플루오로아세트산 (10 mL) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.3 g)을 얻었다.
디클로로메탄 (3 mL)에 용해된 7 (50 mg, 0.13 mmol), EDCI (44 mg, 0.23 mmol), HOBT (31 mg, 0.23 mmol), F3CGlyOH (39 mg, 0.23 mmol) 및 트리에틸아민 (47 mg, 0.46 mmol) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(22 mg, 32%)을 얻었다.
화합물 (40), (44) 및 (47)
Figure pct00033
인산 (120 mL)에 용해된 1 (4.0 g) 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 얼음에 붓고, 15% 수용성 수산화나트륨을 첨가하여 pH 5로 조정한 다음, 디클로로메탄으로 여러 번 추출하였다. 결합된 유기층을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 아세톤으로 결정화하여 정제하여 표제 화합물(1.8 g, 67%)을 수득하였다.
THF (20 mL)에 용해된 2 (600 mg, 1.50 mmol), (Boc)2O (3.3 g, 14.96 mmol) 및 DMAP (73 mg, 0.60 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(10 mL)에 용해된 3 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (120.0 mg, 2.3 mmol) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하였으며, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었고, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
디클로로메탄(10 mL)에 용해된 4 (crude) 및 트리플루오로아세트산 (10 mL) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.4 g)을 얻었다.
0℃로 냉각된 디클로로메탄 (3 mL)에 용해된 5 (50 mg, 0.14 mmol) 및 이미다졸 (9 mg, 0.14 mmol) 용액에 tert-부틸디메틸실릴 클로라이드(21 mg, 0.14 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(30 mg, 45%)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 6 (30 mg, 0.06 mmol), EDCI (24 mg, 0.13 mmol), HOBT (17 mg, 0.13 mmol), F3CGlyOH (22 mg, 0.13 mmol) 및 트리에틸아민 (26 mg, 0.26 mmol) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이는 추가 정제 없이 다음 단계에 직접 사용되었다.
THF (3 mL)에 용해된 7 (crude) 용액에 TBAF (28 mg, 0.11 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(20 mg)을 얻었다.
화합물 47a
Figure pct00034
물(2000 mL)에 용해된 1 (30.0 g) 및 나트륨 티오메톡사이드 (30.0 mL) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 디클로로메탄으로 추출하고, 유기층을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(20.0 g, 65%)을 얻었다.
THF (220 ml)에 용해된 2 (15.0 g, 36.0 mmol), (Boc)2O (79.0 g, 361.0 mmol) 및 DMAP (1.8 g, 14.0 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(400 mL)에 용해된 3 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (4.0 g, 74.0 mmol) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 물을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(15.0 g)을 얻었다.
디클로로메탄(20 mL)에 용해된 4 (15.0 g, 31.8 mmol) 및 트리플루오로아세트산 (20 ml) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(11.0 g, 85%)을 얻었다.
디클로로메탄(200 mL)에 용해된 5 (11.0 g, 29.0 mmol), EDCI (11.3 g, 59.0 mmol), HOBT (2.0 g, 59.0 mmol), F3COGlyOH (7.6 g, 44.0 mmol) 및 트리에틸아민 (11.9 g, 118.0 mmol) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(12.0 g, 77%)을 얻었다.
화합물 (40), (41), (45) 및 (48)
Figure pct00035
인산(120 mL)에 용해된 1 (4.0 g) 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 얼음에 붓고, 15% 수용성 수산화나트륨을 첨가하여 pH 5로 조정한 다음, 디클로로메탄으로 여러 번 추출하였다. 결합된 유기층을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 아세톤으로 결정화하여 정제하여 표제 화합물(1.8 g, 67%)을 수득하였다.
아세톤(3 mL)에 용해된 2 (50 mg, 0.12 mmol), 3-bromoprop-1-ene (23 mg, 0.19 mmol) 및 탄산칼륨 (52 mg, 0.37 mmol) 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(30 mg, 55%)을 얻었다.
THF (20 mL)에 용해된 3 (500 mg, 1.13 mmol), (Boc)2O (2.5 g, 11.31 mol) 및 DMAP (55 mg, 0.45 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(10 mL)에 용해된 4 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (120.0 mg, 2.21 mmol) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출한 다음, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
디클로로메탄(10 mL)에 용해된 5 (crude) 및 트리플루오로아세트산 (10 mL) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.4 g)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 6 (50 mg, 0.13 mmol), EDCI (48 mg, 0.25 mmol), HOBT (34 mg, 0.25 mmol), F3CGlyOH (43 mg, 0.25 mmol) 및 트리에틸아민 (63 mg, 0.63 mmol) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(25 mg, 36%)을 얻었다.
화합물 (40), (42), (46) 및 (49)
Figure pct00036
인산(120 mL)에 용해된 1 (4.0 g) 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 얼음에 붓고, 15% 수용성 수산화나트륨을 첨가하여 pH 5로 조정한 다음, 디클로로메탄으로 여러 번 추출하였다. 결합된 유기층을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 아세톤으로 결정화하여 정제하여 표제 화합물(1.8 g, 67%)을 수득하였다.
아세톤(3 mL)에 용해된 2 (50 mg, 0.12 mmol), 브로모에탄 (21 mg, 0.19 mmol) 및 탄산칼륨 (52 mg, 0.37 mmol) 혼합물을 2시간동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(35 mg, 65%)을 얻었다.
THF (20 mL)에 용해된 3 (500 mg, 1.16 mmol), (Boc)2O (2.5 g, 11.63 mol) 및 DMAP (57 mg, 0.47 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(10 mL)에 용해된 4 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (122.0 mg, 2.26 mmol) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하였으며, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었고, 이는 다음 단계에 직접 사용되었다.
디클로로메탄(10 mL)에 용해된 5 (crude) 및 트리플루오로아세트산 (10 ml) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.4 g)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 6 (50 mg, 0.13 mmol), EDCI (49 mg, 0.26 mmol), HOBT (35 mg, 0.26 mmol), F3CGlyOH (44 mg, 0.26 mmol) 및 트리에틸아민 (65 mg, 0.65 mmol) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(25 mg, 36%)을 얻었다.
화합물 (6a), (17a) 및 (28a)
Figure pct00037
THF (300 mL)에 용해된 1 (20.0 g, 0.05 mmol), (Boc)2O (109.3 g, 0.50 mol) 및 DMAP (2.4 g, 0.02 mol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(400 mL)에 용해된 2 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (5.4 g, 0.1 mol) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 물을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 농축하여 조 생성물을 얻었고, 이를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(20.0 g, 87%).
디클로로메탄(10 mL)에 용해된 3 (2.95 g, 6.46 mmol) 및 트리플루오로아세트산 (10 mL) 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(2.1 g, 91%)을 얻었다.
디클로로메탄(5 mL)에 용해된 4 (200 mg, 0.56 mmol), DCC (138 mg, 0.67 mmol), DMAP (82 mg, 0.67 mmol), 및 트리에틸아민 (115 mg, 1.12 mmol) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(110 mg, 39%)을 얻었다.
화합물 (83)
Figure pct00038
1 (1.0 g, 2.51 mmol), 및 아세틸클로라이드(3 mL) 용액을 테트라클로라이드(1 mL)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 40시간 동안 교반하였다. 조 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올/물에 용해된 2 (crude) 및 수산화리튬 (4 eq.) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 수성 상을 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 재결정화를 통해 생성물을 얻었다(0.2g, 21%, 2 단계).
DMF (20 mL)에 용해된 3 (800 mg, 2.01 mmol), 브로모에탄 (450 mg, 4.16 mmol) 및 탄산칼륨 (1150 mg, 8.31 mmol) 혼합물을 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸아세테이트로 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.5 g, 60%)을 얻었다.
THF (15 mL)에 용해된 4 (700 mg, 1.69 mmol), (Boc)2O (3.7 g, 16.95 mol) 및 DMAP (83 mg, 0.68 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(15 mL)에 용해된 5 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (365.0 mg, 6.76 mmol) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 물을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.6 g)을 얻었다.
디클로로메탄(5 mL)에 용해된 6 (600 mg, 1.27 mmol) 및 트리플루오로아세트산 (5 mL) 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.45 g, 96%)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 7 (50 mg, 0.13 mmol) 및 트리에틸아민 (27 mg. 0.27 mmol) 용액에 methyl carbonochloridate (19 mg, 0.20 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(15 mg, 26%)을 얻었다.
화합물 (84)
Figure pct00039
1 (1.0 g, 2.51 mmol), 및 아세틸클로라이드 (3 mL) 용액을 테트라클로라이드(1 mL)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 40시간 동안 교반하였다. 조 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올/물에 용해된 2 (crude) 및 수산화리튬 (4 eq.) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 수성 상을 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 재결정화를 통해 생성물을 수득하였다(0.2g, 21%, 2 단계).
DMF (20 mL)에 용해된 3 (800 mg, 2.01 mmol), 1-브로모-2-메톡시에탄 (580 mg, 4.16 mmol) 및 탄산칼륨 (1.15 g, 8.31 mmol) 혼합물을 75℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸 아세테이트로 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.5 g, 54%)을 얻었다.
THF (10 mL)에 용해된 4 (500 mg, 1.13 mmol), (Boc)2O (2.5 g, 11.29 mmol) 및 DMAP (55 mg, 0.45 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(15 mL)에 용해된 5 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (244.0 mg, 4.52 mmol) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 물을 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.4 g)을 얻었다.
디클로로메탄(5 mL)에 용해된 6 (0.6 g, 1.20 mmol) 및 트리플루오로아세트산 (5 m1) 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.45 g, 94%)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 7 (50 mg, 0.12 mmol) 및 트리에틸아민 (25 mg, 0.25 mmol) 용액에 methyl carbonochloridate (18 mg, 0.19 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(16 mg, 28%)을 얻었다.
화합물 (85)
Figure pct00040
1 (1.0 g, 2.51 mmol), 및 아세틸클로라이드(3 mL) 용액을 테트라클로라이드(1 mL)에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 40시간 동안 교반하였다. 조 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올/물에 용해된 2 (crude) 및 수산화리튬 (4 eq.) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 수성 상을 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 재결정화를 통해 생성물을 얻었다(0.2g, 21%, 2 단계).
DMF (20 mL)에 용해된 3 (1.0 g, 2.6 mmol), 3-(클로로메틸)피리딘 (0.64 g, 3.9 mmol) 및 탄산칼륨 (1.08 g, 7.8 mmol) 혼합물을 90℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 에틸아세테이트로 추출하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(0.7 g, 58%)을 얻었다.
THF (20 mL)에 용해된 4 (700 mg, 1.47 mmol), (Boc)2O (3.2 g, 14.71 mol) 및 DMAP (72 neg. 0.59 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물(0.7 g, 87%)을 얻었다.
메탄올(10 mL)에 용해된 5 (0.7 g, 1.22 mmol) 및 나트륨 메톡사이드 (131.0 mg, 2.43 mmol) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
디클로로메탄(10 mL)에 용해된 6 (crude) 및 트리플루오로아세트산 (10 ml) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.3 g)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 7 (50 mg, 0.12 mmol) 및 트리에틸아민 (35 mg, 0.35 mmol) 용액에 methyl carbonochloridate (16 mg, 0.17 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 무로 세척하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(12 mg, 21%)을 얻었다.
화합물 (89)
Figure pct00041
인산(120 mL)에 용해된 1 (4.0 g) 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 얼음에 붓고, 15% 수용성 수산화나트륨을 첨가하여 pH 5로 조정한 다음, 디클로로메탄으로 여러 번 추출하였다. 결합된 유기층을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 아세톤으로 결정화하여 정제하여 표제 화합물(1.8 g, 67%)을 수득하였다.
THF (20 mL)에 용해된 2 (600 mg, 1.50 mmol), (Boc)2O (3.3 g, 14.96 mmol) 및 DMAP (73 mg, 0.60 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(10 mL)에 용해된 3 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (120.0 mg, 2.3 mmol) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
디클로로메탄(10 mL)에 용해된 4 (crude) 및 트리플루오로아세트산(10 mL) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.4 g)을 얻었다.
0℃로 냉각된 디클로로메탄(3 mL)에 용해된 5 (50 mg, 0.14 mmol) 및 lm (9 mg, 0.14 mmol) 용액에 tert-부틸디메틸클로로실란(21 mg, 0.14 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(30 mg, 45%)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 6 (100 mg, 0.13 mmol) 및 트리에틸아민 (64 mg, 0.64 mmol) 용액에 methyl carbonochloridate (40 mg, 0.42 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(50 mg, 45%)을 얻었다.
테트라하이드로퓨란(3 mL)에 용해된 7 (50 mg, 0.09 mmol) 용액에 TBAF (29 mg, 0.11 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(20 mg, 51%)을 얻었다.
화합물 90
Figure pct00042
인산(120 mL)에 용해된 1 (4.0 g) 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 얼음에 붓고, 15% 수용성 수산화나트륨을 첨가하여 pH 5로 조정한 다음, 디클로로메탄으로 여러 번 추출하였다. 결합된 유기층을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 아세톤으로 결정화하여 정제하여 표제 화합물(1.8 g, 67%)을 수득하였다.
아세톤(3 mL)에 용해된 2 (50 mg, 0.12 mmol), 3-bromoprop-1-ene (23 mg, 0.19 mmol) 및 탄산칼륨 (52 mg, 0.37 mmol) 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(30 mg, 55%)을 얻었다.
THF (20 mL)에 용해된 3 (500 mg, 1.13 mmol), (Boc)2O (2.5 g, 11.31 mol) 및 DMAP (55 mg, 0.45 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(10 mL)에 용해된 4 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (120.0 mg, 2.21 mmol) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
디클로로메탄(10 mL)에 용해된 5 (crude) 및 트리플루오로아세트산 (10 mL) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.4 g)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 6 (50 mg, 0.13 mmol) 및 트리에틸아민 (25mg, 0.25 mmol) 용액에 methyl carbonochloridate (24 mg, 0.25 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(20 mg, 35%)을 얻었다.
화합물 (91)
합성 경로 A
Figure pct00043
인산(120 mL)에 용해된 1 (4.0 g) 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 얼음에 붓고, 15% 수용성 수산화나트륨을 첨가하여 pH 5로 조정한 다음, 디클로로메탄으로 여러 번 추출하였다. 결합된 유기층을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 아세톤으로 결정화하여 정제하여 표제 화합물(1.8 g, 67%)을 수득하였다.
아세톤(3 mL)에 용해된 2 (50 mg, 0.12 mmol), 브로모에탄(21 mg, 0.19 mmol) 및 탄산칼륨(52 mg, 0.37 mmol) 혼합물을 2시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 여과하고 여액을 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(35 mg, 65%)을 얻었다.
THF (20 mL)에 용해된 3 (500 mg, 1.16 mmol), (Boc)2O (2.5 g, 11.63 mol) 및 DMAP (57 mg, 0.47 mmol) 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 물로 세척하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
메탄올(10 mL)에 용해된 4 (crude) 및 나트륨 메톡사이드 (122.0 mg, 2.26 mmol) 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, 건조 및 농축하여 조 생성물을 얻었으며, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
디클로로메탄(10 mL)에 용해된 5 (crude) 및 트리에틸아민 (10 mL) 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 농축하여 생성물(0.4 g)을 얻었다.
디클로로메탄(3 mL)에 용해된 6 (50 mg, 0.13 mmol) 및 트리에틸아민 (25 mg, 0.25 mmol) 용액에 methyl carbonochloridate (24 mg, 0.25 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 세척하고 농축하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 크로마토그래피로 정제하여 원하는 생성물(20 mg, 35%)을 얻었다.
합성 경로 B
Figure pct00044
단계 1 - 산분해 ( Acidolysis )
Figure pct00045
THC (1 g)를 따뜻한 농축 아인산 (85%) (40 ml)에 용해시키고, 약 12시간 동안 교반하였다. 용액을 클로로포름으로 약 5회 추출하였다. 생성된 클로로포름 분획을 물로 세척한 다음, 회전 증발기로 증발시켜 가수분해 생성물을 생성시켰다.
가수분해 생성물을 아세톤에 용해시키고, K2CO3 수용액을 첨가하였다. 생성된 용액을 증발시키고, 더 많은 아세톤을 첨가한 다음, 증발시켜서 칼륨 염 (3-Demethylthiocolchicine)을 수득하였다.
단계 2 - ether (3- Ethoxythiocolchicine )의 합성
Figure pct00046
단계 1의 칼륨 염 (3-Demethylthiocolchicine)을 아세톤 (75 ml)에 용해시키고, 2배 몰 과량의 에틸 요오드화물을 첨가하였다. 생성된 용액을 교반하고, 환류 하에 약 5시간 동안 환류(비등)시켰다. 용액을 증발시키고, 아세토니트릴을 첨가한 다음 용액을 다시 증발시켜 남은 에틸 요오드화물을 제거하여 3-ethoxythiocolchicine을 수득하였다.
단계 3 - 아마이드 결합의 가수분해
Figure pct00047
3-ethoxythiocolchicine를 5M HCl (100 ml)에 용해시키고, 환류(비등)시켰으며, 비등 교반하고 TLC로 모니터링하였다. 약 5시간 후, 반응 혼합물을 클로로포름으로 7회 추출하였다. 생성된 클로로포름 분획을 물로 세척하고, 증발 건조시켰다. 생성물을 메탄올에 용해시키고, 미량의 물을 제거하기 위해 3회 증발시켰다. 생성물을 아세토니트릴에 용해시키고, 증발 건조시켜 amine (3-ethoxydeacetylthiocolchicine)을 수득하였다.
단계 4
Figure pct00048
건조 amine (3-ethoxydeacetylthiocolchicine)을 THF (50 ml)에 용해시키고, TEA (triethylamine) (1.5 ml)를 첨가하였다. 이 용액에, methyl chloroformate (0.5 g)를 첨가하고, 실온에서 약 5시간 동안 교반하였으며, TLC로 모니터링하였다. 생성된 용액을 증발 건조시키고, 클로로포름에 용해시키고, 0.2 M HCl로 2회 추출한 다음, 물로 1회 추출하였다. 생성된 클로로포름 분획을 증발 건조시키고, 아세토니트릴에 용해시킨 다음, 다시 증발 건조시켰다. 생성물 (CR-42-024 = (91))을 실리카 겔 상의 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 용리액은 0-5% 헥산을 함유하는 헥산/에틸 아세테이트의 혼합물이었다.
TPO
하기 서술된 일부 실험예에서, 콜히친 유도체 TPO (Kerekes P, Sharma PN, Brossi A, Chignell CF, Quinn FR (1985) Synthesis and biological effects of novel thiocolchicines. 3. Evaluation of N-acyldeacetylthiocolchicines, N-(alkoxycarbonyl) deacetylthiocolchicines, and O-ethyldemethylthiocolchicines. New synthesis of thiodemecolcine and antileukemic effects of 2-demethyl- and 3-demethylthiocolchicine. J Med Chem 28:1204-1208에 개시, 본원에 전체가 참조로 포함됨)는 ( 91)과 비교하여 통풍과 관련된 염증에 대한 유효성을 결정하는 데 사용되었다.
Figure pct00049
실시예 2 - 통풍성 염증의 시험관 내( in vitro ) 연구
일련의 시험관 내 실험은 MSU-유도 호중구 활성화에서 콜히친 유도체인 (91) (일부 도면에서 “CCl”로 지칭됨)로 수행되었다. CH-35 (43) 및 CR42-003 (47a)과 같이 ( 91)과 유사한 구조를 갖는 콜히친 유도체의 효과를 보여주는 실험도 수행되었다. 화합물 생성에 사용된 스캐폴드인 콜히친의 구조를 하기 표 1에 표시된 위치에서 변형하여 CCl (91), CH-35 (43) 및 CR-42-003 (47a)을 생성하였다. 요약하면, 아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 건강한 기증자로부터 인간 호중구를 분리하고 (91), (43) 및 (47a)의 존재 또는 부재하에 통풍의 원인 물질, MSU로 자극하였다. 평가된 주요 호중구 반응은 세포질 칼슘 수준 (도 7), 전염증성 사이토카인 (예를 들어, IL-8 또는 IL-1) 생성 (도 8) 및 과산화물 생성 (도 9)이었다.
Figure pct00050
화합물 R1 R2 R3 βVI 결합 자유 에너지 (kcal/mol)
콜히친 -OCH3 -NHCOCH3 -OCH3 -42.03
CR-42-003 -OCH3 -NHCOCH2NHCOCF3 -SCH3 -42.21
CH-35 -OCH2CH2CH3 -NHCOCH3 -SCH3 -47.63
CCI -OCH2CH3 -NHCOOCH3 -SCH3 -51.70
표적 아이소폼, βVI에 대한 화합물의 높은 친화성 상호작용에 대한 필요성과 민감한 기관 또는 조직에서 오프-타겟 튜불린 아이소폼에 대해 가능한 가장 낮은 친화성 사이의 균형을 맞추기 위해 화합물을 알고리즘 접근법으로 선택하여, 원하는 표적에 대해 개선된 특이성/선택성을 갖는 화합물을 선택하였다. 관심 있는 세포에서 β-튜불린 이소타입에 대한 콜히친의 친화도를 증가시킬 가능성이 더 높은 화학적 변형을 식별하기 위해 이 접근법에서 사용하는 주요 매개변수는 다음과 같다: (i) β-튜불린 이소타입에 대한 콜히친의 상이한 친화도 및 (ii) 서로 다른 세포 유형 간의 이러한 β-튜불린 이소타입 발현의 양적 및 질적 차이.
약물 도킹 및 튜불린의 개별 잔기와 리간드의 상호작용 모드에 대한 자세한 지식을 통해, 표적 세포 유형에서의 발현에 따라 선택한 튜불린 이소타입에 대한 개선된 특이성과 선택성을 유도하는 변형을 결정할 수 있었다. 계산 작업은 평형화된 인간 구조가 생성되는 스캐폴드로서 소 튜불린을 사용하는 인간 튜불린 이소타입의 상동성 모델링에 기반했다는 점에 유의해야 한다. 인간과 소 튜불린 간의 서열 유사성이 매우 높기 때문에, 얻은 결과에 대한 신뢰 수준이 매우 높다. 표 1에 제시된 세 가지 화합물의 구조 및 예상 결합 에너지와 본원에서 연구된 세 가지 화합물은 물론, 이들과 구조적으로 밀접하게 관련된 콜히친 유도체의 화학적 합성에 대한 세부 사항은 본원에 설명되어 있으며, 그 내용이 참조로 포함되는 미국 특허 번호 9,458,101에서 찾을 수 있다.
재료 및 방법
재료
인간 β-튜불린 이소타입 β-I에 대한 항체 (MAB8527) 및 베타-III에 대한 항체 (MAB1195)는 R&D System에서 구입하였으며, 베타-II (ab155311) 및 베타-V (ab82366)는 Abcam에서 구입하였고, 베타-IVb (WH0010383M2), 항-PI3 키나아제 p85 (ABS1856) 항체는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 베타-VI (LS-C338196) 항체는 LS Bio에서 구입하였고, horseradish peroxidase-labeled donkey anti-mouse immunoglobulins (IgGs) (715-035-150) 및 horseradish peroxidase-labeled donkey anti-rabbit immunoglobulins (IgGs) (711-035-152)은 Jackson Immunoresearch에서 구입하였다. 랫트 항-마우스 CD45 Fitc (11-0451-82)와 Fura-2-acetoxymethyl ester (Fura-2AM)는 Invitrogen에서 구입하였다. 콜히친, 덱스트란 T500, 아프로티닌, 류펩틴 및 시트크롬 C는 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. Western Lightning Chemiluminescence Plus ECL kit는 PerkinElmer에서 구입하였고, Ficoll-Paque는 Wisent Bioproducts에서 구입하였다. Triclinic MSU 결정은 사내(in-house)에서 합성하였다. 내독소 오염은 Limulus amebocyte lysate 분석으로 배제되었다.
인간 호중구의 분리
건강한 성인 지원자의 정맥혈에서 호중구를 분리하였다. 요약하면, isocitrate를 함유한 튜브에서 정맥혈을 얻었고, 적혈구 세포를 2% 덱스트란에 침전시키고, 호중구를 Ficoll-Paque 쿠션에서 원심분리하여 무균 정제하였다. 오염된 적혈구를 저장성 용해로 제거하고, 호중구를 1.6 mM의 CaCl2를 함유하고 Mg2 +가 없는 HBSS에 재현탁시켰다.
세포내 칼슘 동원을 확인하기 위한, MSU 및 콜히친 또는 콜히친 유도체로의 인간 호중구 자극
인간 호중구 (1 × 107 cells/ml)를 1 μM Fura-2AM 및 표시된 농도의 콜히친과 함께 사전배양 하였다(도 7A); 1 mg/ml MSU 첨가 전, (91) (CCI) (도 7B), TPO (도 7C) 또는 희석제 (DMSO). 또한, 추가 콜히친 유도체에 대해서도 유사한 실험이 수행되었다. 특히, 인간 호중구는 MSU (1 mg/ml) 첨가 전, 10μM의 콜히친 (도 7D), D1= (28a) (도 7E 및 7J), D2= (39) (도 7F), D3= (47a) (도 7G 및 7J), D4= (89) (도 7H)로 자극되었다. 추가 실험에서, 인간 호중구는 10μM 콜히친, 1μM CH-22= (14), 3μM CH-35= (43) 또는 희석제 DMSO (도 7I 및 7J)로 자극되었다. 추가 실험에서, 인간 호중구는 0.1 μM 또는 10μM 콜히친 (도 7K 및 7L), 0.01 μM, 0.1 μM 또는 1μM 또는 10μM의 유도체 (43) (도 7M 및 7N), 또는 0.01 μM, 0.1 μM 또는 1μM 또는 10μM의 유도체 (47a) (도 7O 및 7P)로 자극되었다. 추가 실험에서, 인간 호중구는 1 mg/ml MSU 첨가 전, 0.1 μM 또는 1μM 또는 10μM의 유도체 (43) (도 7Q), 또는 0.1 μM 또는 1μM 또는 10μM의 유도체 (47a) (도 7R)로 자극되었다. 도 7S는 도 7A, 7B, 7Q 및 7R에서 테스트된 화합물에 대해 표시된 농도에서 화합물의 효능의 플롯을 나타낸다.
호중구 (1 × 107 cells/ml)를 37℃에서 30분 동안 1 μM Fura-2AM 및 표시된 농도의 (91) (CCI), TPO, 28a, 39, 47a, 89, 14, 43 또는 콜히친에서 배양하고, HBSS에서 1회 세척하였으며, 5 × 106 cells/ml의 농도로 재현탁하고, 분광형광계(Fluorolog-SPEX from Jobin Yvon)의 온도-제어(37℃) 큐벳 구획으로 옮겼다.
인간 호중구의 칼슘 수준 측정
세포내 칼슘 농도는 분광형광계로 측정되었고, 곡선아래면적으로 표시된다 (MSU 주입 후 최대 100초까지).
세포질 칼슘의 변화는 MSU 또는 HBSS (음성 대조군) 첨가 후, 340 및 380 nm의 두 여기 파장과 510 nm의 방출 파장을 이용하여 측정되었다. 유리 내부 칼슘 농도는 340 및 380 nm에서 얻은 형광 값의 비율로부터 추정되었다. 결과는 시간함수(자극 첨가에 관하여 0-100초)로, 세포내 칼슘 농도의 곡선아래면적으로 계산하였다.
MSU에 대한 반응의 특이성 결정: 인간 호중구에서 세포질 칼슘의 fMLP -유도 증가
인간 호중구 (1 × 107 cells/ml)를 상기 기재된 바와 같이 분리하고, 10-7 M fMLP (도 7T 및 7U) 또는 1 mg/ml MSU (도 7V 및 7W) 첨가 전, 1 μM Fura-2AM 및 표시된 농도의 콜히친, CCI (91) or CH-35 ( 43)과 함께 사전배양 하였다. 세포내 칼슘 농도는 분광형광계로 측정되었으며, 곡선아래면적으로 표시된다.
CXCL8 /IL-8 또는 IL-1 방출을 확인하기 위한, MSU 및 콜히친 또는 콜히친 유도체로의 인간 호중구 자극
인간 호중구를 상기 기재된 바와 같이 분리하고, 표시된 농도의 콜히친 (43) (도 8A), (47a) (도 8B) 또는 DMSO와 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. MSU (1 mg/ml) 또는 완충액 (RPMI)을 세포에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 더 배양하였다. 세포를 원심분리(400 x g, 2분)하고, 상층액을 수득하여 16,000 × g, 5분간 다시 원심분리하였다. 추가 실험에서, 인간 호중구를 1 mg/ml MSU와 함께 3시간 동안 배양하기 전에, 표시된 농도의 콜히친 (도 8C), CCI (91) (도 8D), CR42-003 (47a) (도 8E) 또는 (43) (도 8F)과 함께 배양하였다. 도 8G는 도 8C-F에서 테스트된 표시된 농도에서 화합물의 효능의 플롯을 나타낸다. MSU 자극 전에 CR42-003 (47a) 및 CH-35 ( 43)의 존재 하에서 IL-8 생산의 기초 수준도 결정되었다 (도 8L). IL-1β의 경우, 백색 RPMI에서 인간 호중구 (2x107 cells/ml)를 250 U/ml TNFα로 프라이밍하고, 1 mg/ml MSU 첨가 전에 표시된 농도의 콜히친 (도 8H), CCI (91) (도 8I), CH-35 (43) (도 8J)과 함께 37℃에서 30분 동안 배양한 다음, 37℃에서 3시간 동안 배양한다. 도 8K는 도 8H-J에서 테스트된 화합물에 대해 표시되 농도에서 화합물의 효능을 비교한 결과를 보여준다. 그 다음, 세포를 상기 기재된 바와 같이 원심분리하여 수득하였다. 세포외 CXCL8/IL-8 또는 IL-1β는 ELISA (Invitrogen)로 정량화되었다. 모든 샘플은 반복 측정되었다.
인간 호중구의 CXCL8 /IL-8 또는 IL-1 수준 측정
자극된 호중구에 의해 분비된 CXCL8/IL-8 또는 IL-1의 양은 Invitrogen에서 상업적으로 입수 가능한 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 (human IL-8 cytoset, no. CHC1303 및 IL-1β (no. 88-7261-88))를 사용하여 결정되었다.
초산화물 생성을 확인하기 위한, MSU 및 콜히친 또는 콜히친 유도체로의 인간 호중구 자극
인간 호중구를 상기 기재된 바와 같이 분리하고, 125 μM 시토크롬 C 또는 완충액 (HBSS)의 존재 하에 1 mg/ml MSU로 37℃에서 10분간 자극 전에, 표시된 농도의 콜히친 (도 9A), (91) (CCI) (도 9B), 또는 희석제 (DMSO)화 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 추가 실험에서, 인간 호중구는, 1 mg/ml MSU 자극 전에, 표시된 농도의 콜히친 (도 9C), CCI (91) (도 9D), (47a) (도 9E) 또는 (43) (도 9F)과 함께 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 도 9G는 도 9C-9F에서 테스트된 화합물에 대한 표시된 농도에서 화합물의 효능의 플롯을 보여준다. MSU 자극 전, (47a) 및 (43)의 존재 하에 ROS 생성의 기초 수준도 측정되었다 (도 9H). 결과는 MSU 대조군에 의해 생성된 초산화물의 비율로 표시된다.
인간 호중구의 초산화물 수준 측정
초산화물 생성은 시토크롬 C의 환원 분석을 이용하여 측정되었다. 처음 10분 동안 판독된 550 nm와 540 nm에서의 광학 밀도 판독 값 사이의 차이에 시토크롬 C 흡광 계수를 곱하여 1 x 106 cells에서 생성된 nmol O2의 수를 얻었다. 결과는 nmol O2 /1 x 106 cells/ml로 표시된다.
웨스턴 블랏 분석
호중구 현탁액 (2 × 107 cells/ml)을 동일한 부피의 2× 비등 변형 Laemmli 샘플 완충액 (1× 버퍼: 62.5 mM Tris·HCl (pH 6.8), 4% (wt/vol) 도데실 황산 나트륨 (SDS), 5% (vol/vol) β-mercaptoethanol, 8.5% (vol/vol), 글리세롤, 2.5 mM orthovanadate, 10 μg/ml 류펩틴, 10 μg/ml 아프로티닌 및 0.025% 브로모페놀 블루)으로 직접 옮기고, 7분 동안 가열하였다. 단백질을 환원 조건 하에서 10% 아크릴 아마이드 겔의 SDS-PAGE로 분리하고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 차단제 및 항체를 Tris-완충 식염수 Tween 20 (TBST) 용액 (25 mM Tris·HCl, pH 7.8, 190 mM NaCl, 0.15% vol vol Tween-20)에 희석하였다. 1차 및 2차 항체는 제조사의 권장 농도로 사용하였다. PVDF 막을 항-β-튜불린 이소타입-특이적 항체로 면역블랏팅하기 전에 차단 용액 (5% wt/vol dried milk in TBST)에서 배양하였다. Horseradish peroxidase-labeled donkey anti-mouse IgG 및 donkey anti-rabbit IgG는 TBST 용액에 희석하였다. 화학발광 시약을 사용하여 최대 노출 시간이 5분인 항체를 검출하였다. 제시된 모든 면역블랏은 동일 단백질 로딩을 위해 항-PI3 키나아제 p85 항체로 조정되었다.
결과
(91) ( CCI )은 콜히친보다 낮은 농도에서 MSU -유도 칼슘 동원을 억제함
MSU에 의해 시작된 호중구에서의 가장 초기 분자 이벤트 중 하나는 세포내 칼슘 저장의 동원이기 때문에, 이 초기 신호전달 이벤트에 대한 (91) (CCI), (43) 및 (47a)의 효과를 평가하였다. 간단히, 및 상기 상세히 기재된 바와 같이, 인간 호중구를 (91) (CCI), (43) 또는 (47a)의 농도 범위로 배양하기 전에 형광 칼슘 지표 Fura-2와 함께 배양하고, MSU로 자극하였다. Fura-2는 세포내 저장으로부터의 방출에 기인한 세포질 칼슘의 증가를 모니터링한다. 테스트된 (91) (CCI), (43) 또는 (47a)의 농도는 0.1 내지 10 μM 범위였다. 비교 목적으로, 동일한 농도의 콜히친으로 동일한 실험을 수행하였다.
도 7A-C에 나타난 바와 같이, (91) (CCI)는 0.1μM의 낮은 농도에서도 세포내 칼슘 농도의 증가를 유의하게 억제하는 반면, TPO는 높은 농도에서 억제를 나타냈다. 그에 반해서, 콜히친은 10μM의 농도에서만 칼슘의 동원을 유의하게 억제할 수 있었다. 따라서, ( 91)은 콜히친보다 약 100배 낮은 농도에서 세포내 칼슘 저장의 동원을 유의하게 감소시킬 수 있으며, 따라서 칼슘 동원의 억제에 있어서 콜히친보다 약 100배 더 강력하다. 다른 콜히친 유도체 28a, 39, 47a, 14, 및 43은 콜히친과 비교할 때(도 7E), ( 89)를 제외하고(도 7H), 인간 호중구의 칼슘 수준 감소와 관련하여 호중구-억제 효과를 나타냈다(도 7E-J). 이는 세포질이 없는 칼슘 농도의 증가를 나타내는 그래프 선의 기울기의 증가(첫 번째 스파이크 이후)로 알 수 있다 (도 7D-I).
참고로, 콜히친 (도 7K 및 7L)과 비교할 때, 콜히친 유도체 ( 91)에 대한 결과와 유사한 결과가 0.1μM의 낮은 농도에서 콜히친 유도체 (43) (도 7M 및 7N)과 (47a) (도 7O 및 7P)에서 확인되었다. 따라서, 91, 47a 및 43과 같은 콜히친 유도체들은 콜히친에 요구되는 것 보다 훨씬 낮은 농도 (예를 들어, 약 100배 낮은)에서, 인간 호중구에서 MSU-유도 칼슘 동원 증가를 억제하는 능력을 입증한다 (도 7).
추가 실험에서, 도 7B 및 7Q-S에 나타난 바와 같이, 유도체는 0.01 내지 10 μM의 농도 범위에서 테스트되었다. 비교 목적으로, 동일한 농도의 콜히친으로 동일한 실험을 수행하였다. CCI (91) (도 7B) 및 CH-35 (43) (도 7R)은 0.1 μM 농도에서 세포질 칼슘의 증가를 유의하게 감소시키는 것으로 확인되었다. 도 7R에 나타난 바와 같이, CH-35 ( 43)는 0.1μM, 1μM 및 10μM에서 세포내 칼슘 농도 증가를 유의하게 억제시킬 수 있었다. CH-35 ( 43)는 전형적인 선형적 용량 반응을 나타내며, 그 효과는 농도-의존적이다. 반면, CCI ( 91)는 비선형적 용량 반응을 나타내며, 10 μM 농도에서 MSU-유도 세포질 칼슘 증가에 큰 영향을 미치지 않는다. 도 7S에 나타난 바와 같이, 0.1μM에서 유도체 및 콜히친의 억제 활성을 비교한 결과, MSU-유도 세포질 칼슘 증가를 유의하게 감소시키는 데 있어서, CCI (91) 및 CH-35 ( 43)가 콜히친보다 강력한 것이 확인되었다. 따라서, CCl (91) 및 CH-35 ( 43)는 콜히친과 비교하여 더 낮은 농도에서 그들의 억제제 활성을 유지한다.
MSU에 의한 호중구 활성화에 대한 CCI ( 91)의 특이성을 평가하기 위하여, CCI ( 91)가 관련 없는 자극에 대한 호중구 반응을 억제시킬 수 있는지 여부를 확인하였다. 박테리아 자극에 대한 호중구 활성화가 숙주의 생존에 영향을 미치기 때문에, 박테리아 자극을 선택하였다. 요약하면, 인간 호중구를 박테리아 펩타이드 fMLF로 활성화시키기 전에, 10 μM CCI ( 91)와 함께 배양하였다. 도 7T 및 7U에 나타난 바와 같이, fMLF에 의한 호중구 활성화는 세포질에서 칼슘 농도의 유의한 상승을 유도하였다. 그러나, CCI ( 91)의 존재 하에서 세포질 칼슘 반응은 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 CCI ( 91)에 의한 호중구 활성화 억제가 MSU에 대해 어느 정도 선택성을 나타냄을 보여주었다.
(91) ( CCI )는 콜히친보다 낮은 농도에서 MSU -유도 CXCL8 /IL-8 또는 IL-1 방출을 억제함
(91) (CCI), (43) 또는 (47a)가 MSU에 대한 반응으로 칼슘의 동원을 약화시키는 능력은 이 신호전달 이벤트의 다운스트림에서 호중구 반응에 미치는 영향의 결정을 유도하였다. 칼슘 동원과 같은 초기 신호전달 이벤트는 MSU에 의한 Src 키나아제 활성화에 의존하므로, MSU에 의해 유도된 CXCL8/IL-8의 Src-의존성 생성이 (91) (CCI)에 의해 억제되는지 여부를 확인하였다. 또한, IL-1은 내피 세포 부착 분자의 발현과 함께 호중구의 대량 모집을 촉진하는 전염증성 사이토카인의 합성을 유도하므로, CCl (91) 및 CH-35 ( 43)가 IL-1의 생성을 약화시키는 능력을 평가하였다. 요약하면, 상기 기재된 바와 같이, 호중구를 표시된 농도의 (91) (CCI), (43), (47a) 및 콜히친 또는 DMSO와 함께 배양하고, MSU로 자극하거나 페놀이 없는 RPMI (음성 대조군)에서 3시간 동안 배양하였다. 그 다음, 무세포 상청액을 수득하고, 활성화된 호중구에 의해 방출된 CXCL8/IL-8 또는 IL-1의 released by the activated neutrophils의 양을 ELISA로 결정하였다.
도 8A-B에 나타난 바와 같이, 콜히친 유도체 (43)(도 8A) 또는 콜히친 유도체 (47a) (도 8B)와 함께 사전 배양된 호중구에 의한 IL-8 방출의 현저한 감소가 0.1μM의 낮은 농도에서 관찰되었다.
추가 실험에서, 도 8D-F에 나타난 바와 같이, CCI (91), CR42-003 (47a) 및 CH-35 ( 43)와 함께 사전 배양된 호중구에 의한 IL-8 방출의 현저한 감소가 0.1μM 내지 10 μM의 낮은 농도에서 관찰되었다 (도 8D-F). 반면, 콜히친은 1 및 10 μM에서만 IL-8 방출을 유의하게 억제하였다 (도 8C). 0.1 μM에서 유도체들의 억제 활성을 비교한 결과 (도 8G), 콜히친이 더 이상 호중구 이펙터 기능을 약화시킬 수 없는 농도에서, CCI ( 91)가 MSU-유도 IL-8의 생성 증가를 감소시키는 데 있어서 CH-35 (43) 및 CR42-003 (47a) 보다 더 강력한 것이 밝혀졌다.
시험관 내 분석 결과, CCI (91) 및 CH-35 ( 43)가 MSU에 대한 반응으로 세포질 칼슘의 증가와 ROS 생성을 약화시키는 것으로 나타났기 때문에 (아래 참조), IL-1 생산과 관련한 분석은 CCI (91) 및 CH-35 (43)로 수행하였다. MSU-유도 IL-1 생성에 대한 CCI (91) 및 CH-35 ( 43)의 효과는 IL-8에 대해 설명된 바와 동일하되 약간의 수정을 가한 실험적 접근법을 이용하여 확인하였다. 성숙한 IL-1의 생산과 분비는 두 가지 자극이 필요하다. 따라서, 인간 호중구를 MSU로 자극하기 전에 TNF-α로 프라이밍하였다. 10 μM의 CCI (91), CH-35 (43) 또는 콜히친으로 처리한 세포에 의한 IL-1 생산의 감소가 관찰되었다 (도 8H-J). CCI ( 91)는 임계 농도가 0.1 μM인 가장 강력한 화합물인 반면, CH-35 ( 43)는 1μM에서 효과적인 것이 뚜렷하게 나타났다 (도 8I 및 8J). 콜히친과 비교할 때, 두 화합물 모두 더 강력했다 (도 8K). 종합하면, 화합물들은 호중구에서 MSU-유도 IL-1 생산의 억제와 관련하여 높은 효능을 가지고 있다.
더욱이, 도 8L에 나타난 바와 같이, CR42-003 (47a)과 또는 CH-35 (43) 단독으로 배양된 호중구의 상청액에서 측정된 IL-9의 양은 음성 대조군 (HBSS에 포함된 호중구)의 양과 유사하다. 이는 CR42-003 (47a) 또는 CH-35 (43) 모두 IL-8 방출에 의해 확인된 호중구에 대한 비특이적 효과를 나타내지 않음을 시사한다.
콜히친 또는 콜히친 유도체로 자극된 인간 호중구의 초산화물 수준
칼슘-의존적이고, MSU에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있으며, 염증이 있는 관절에 손상을 줄 수 있는 추가적인 호중구 이펙터 기능은 ROS의 생성이다. (91) (CCI), (43) 및 (47a)는 칼슘의 동원을 억제하기 때문에, (91) (CCI), (43) 및 (47a)는 또한 호중구에서 MSU-유도 ROS 생성을 조절할 수 있다. 요약하면, 상기 기재된 바와 같이, 인간 호중구를 (91) (CCI), (43) 또는 (47a)와, 또는 비교 목적으로 콜히친과 함께 배양하고, MSU로 자극하였다.
도 9A-B에 나타난 바와 같이, (91) (CCI)은 MSU에 의해 유발된 초산화물 생성을 유의하게 감소시켰다. (91) (CCI)은 0.1μM의 농도에서 초산화물 생성을 억제하는 반면, 콜히친이 MSU-유도 초산화물 생성을 억제할 수 있는 최저 농도는 1μM이다. 따라서, (91) (CCI)은 콜히친보다 약 10배 낮은 농도로 인간 호중구에서 MSU-유도 초산화물 생성을 억제하고, 따라서, 인간 호중구에서 MSU-유도 초산화물 생성 억제에 대해 콜히친보다 약 10배 더 강력하다.
추가 실험에서, 도 9D-9F에 나타난 바와 같이, CCI (91), CR42-003 (47a) 및 CH-35 ( 43)는 0.1 μM의 농도에서 MSU에 의해 유발된 초산화물 생성을 유의하게 감소시켰다. 대조적으로, 콜히친 억제 용량은 1 μM의 더 큰 임계값을 가진다 (도 9C). 0.1 μM에서 유도체와 콜히친의 억제 활성을 비교한 결과 (도 9G), MSU-유도 ROS 생성 증가를 감소시키는 데 있어서 CCI ( 91)와 CH-35 ( 43)가 콜히친 및 CR42-003 (47a) 보다 훨씬 더 강력한 것으로 확인되었다. 또한, 도 9H에 나타난 바와 같이, 호중구가 CR42-003 (47a)와 함께 또는 CH-35 (43) 단독으로 배양될 때 측정된 초산화물의 양은 음성 대조군 (HBSS에 포함된 호중구)과 유사하다. 이는 CR42-003 (47a)와 CH-35 (43) 모두 초산화물 생성에 의해 확인된 호중구에 대한 비특이적 효과를 나타내지 않음을 시사한다.
실시예 3 - ADMET 예측
상기 기술된 시험관 내 발견과 유도체 (91) 및 (89) 사이에서 관찰된 인간 호중구의 염증 반응에 대한 다양한 효과를 기반으로, 유도체 ( 91)의 생체 내 기능을 평가하기 전에, 통풍 치료를 위한 잠재적 약물로서 ( 91)의 사용을 평가하기 위해, 이러한 유도체들 사이에서 ADMET 예측을 결정하였다.
ADMET Predictor 7.2 (Simulations Plus, CA)는 약동학(pharmacokinetics)을 위한 업계 표준 예측 소프트웨어이다. ADMET 특성을 예측하기 위해, 화합물 구조에서 실행되었다. 하기 표 2는 ADMET 위험 지수를 보여준다. 각 위험 지수는 지수 값이 높을수록 화합물이 약동학 또는 독성 문제로 인해 약물로서 실패할 위험이 증가함을 나타내는 점수이다. CYP_Risk는 대사 경향 모델의 집합이다. TOX_MUT_Risk는 S. typhimurium에서 변이원성 모델의 집합이다. TOX_Risk는 독성 경향 모델의 집합이다. ADMET_Risk는 여러 요인들을 결합한 전체 위험 점수이다. 점수에 기여하는 특정 요소는 주석에 기재되었다. 이 분석은 생체 내 행동에 대한 신뢰할 수 있는 in-silico 프록시이다. 각 위험 지수에서, ( 89)의 위험 점수가 ( 91)의 점수보다 높은 것으로 나타났다. 따라서, ( 89)는 ADMET 요소로 인해 약물로서 실패할 가능성이 더 높을 것으로 예상된다.
Name CYP_Risk TOX_MUT_Risk TOX_Risk ADMET_Risk
CCI-001 0.39a 0.0 1.0b 1.39c
TP01 1.49d 1.0e 2.0f 3.49g
aP450 산화
b급성 랫트 독성
cP450 산화, 급성 랫트 독성
dP450 산화, CYP1A2와의 상호작용
e S . typhimurium의 한 균주의 변이원성
f급성 랫트 독성, SGOT 및 SGPT 상승
gP450 산화, CYP1A2와의 상호작용, 급성 랫트 독성, SGOT 및 SGPT 상승
따라서, ADMET 예측은 ( 91)에 비해 ( 89)의 독성 위험이 명확하게 증가하여 동물 실험에서 실패할 가능성이 높은 후보임을 보여준다.
실시예 4 - 생체 내 연구
시험관 내에서 콜히친 유도체들의 효과를 확인한 후 (상기 참조), 생체 내 MSU-유도 염증에서 CCl (화합물 91)로 일련의 실험을 수행하였다. 요약하면, 아래에서 더 자세히 설명하는 바와 같이, 마우스에 MSU를 주사하여 통풍과 같은 염증을 유도하였다. 마우스에 CCl (화합물 91) 또는 CH-35 (화합물 43)를, 단독으로 또는 MSU 주사 전 또는 후 추가로 주사하여, CCl의 혈장 반감기 (화합물 91; 도 10A)와 CH-35의 혈장 반감기를 확인하였으며 (화합물 43; 도 10B), CCl (화합물 91) 또는 CH-35 (화합물 43)가 순환 백혈구에 흡수되는지 여부를 확인하여 (각각 도 11A 및 B), MSU-유도 염증 반응과 관련하여, 콜히친 대비 CCl (화합물 91) 또는 CH-35 (화합물 43)의 효과를 비교하였다 (도 12, 13 및 14).
A. 마우스에서 콜히친 유도체의 혈장 반감기 결정
사용된 실험 모델 및 혈장 내 CCl 또는 CH-35 농도 측정
마우스에 5 μmol/kg의 (91) (CCI) 또는 CH-35 (43)를 피하주사하고, 주사 후 15, 30, 45, 60 또는 120분에 희생시켰다. 35% Tyrode's 완충액 pH 6.5 및 20% 시트레이트-덱스트로스 용액 (ACD)을 사용하여 심장 천자로 혈액을 채취하고, 15분 동안 실온에서 2500 × g로 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 혈장의 화합물 농도(도 10A 및 B)는 질량 분석법으로 결정하였다. (91) (CCI) 또는 CH-35 ( 43)의 농도는 동시에 채취된 5마리 마우스의 혈장(ng/ml)에서 측정된 (91) (CCI) 또는 CH-35 (43)의 양의 평균으로 표현된다.
B. 순환하는 백혈구에서 콜히친 유도체의 농도 결정
사용된 실험 모델 및 순환 백혈구 내 CCl 또는 CH-35의 농도 측정
마우스에 5 μmol/kg의 (91) (CCI) 또는 CH-35 (43)를 피하주사하고, 주사 후 15, 30, 45, 60 또는 120분에 희생시켰다. 심장 천자로 혈액을 채취하고, 원심분리하여 순환 백혈구를 얻었다. 백혈구의 화합물 농도는 (도 11A 및 B) 질량 분석법으로 결정하였다. (91) (CCI) 또는 CH-35 ( 43)의 농도는 동시에 채취된 5마리 마우스의 순환하는 백혈구(ng/ml)에서 측정된 (91) (CCI) 또는 CH-35 ( 43)의 양의 평균으로 표현된다.
C. 공기 주머니 모델에서 (91) ( CCI )을 MSU 유도 5분 전 투여시 MSU -유도 백혈구 모집을 억제함
사용된 실험 모델 및 공기 주머니(air-pouch) 내 백혈구 측정
야생형 마우스 (CD-1 mice)에서 콜히친과 콜히친 유도체의 항염증 활성의 생체 내 평가를 수행하였다. 피하로 공기를 주입하여 7일 동안 마우스의 등쪽에 공기 주머니를 생성시켰다. 공기의 1차 주입 7일 후, 공기 주머니에 MSU (1.5mg/ml) 또는 희석제 (PBS)를 주입하기 5분 전에, 표시된 양의 (91) (CCI), 콜히친 또는 DMSO (비히클)를 포함하는 10 μl/g의 HBSS를 피하로 주사하였다. MSU 투여 7시간 후, 2ml의 PBS + 0.5 M EDTA로 2회, 1 ml의 PBS + 0.5 M EDTA로 1회 씻어내어 공기 주머니의 삼출물을 채취하고, 모집된 백혈구의 수를 유세포 분석으로 결정하였다. 백혈구는 항-CD45 및 항-Ly6G 항체로 염색되었다.
D. 공기 주머니 모델에서 (91) 또는 ( 43)을 MSU 주입 1.5시간 후 투여시 MSU-유도 백혈구 모집을 억제함
사용된 실험 모델 및 공기 주머니(air-pouch) 내 백혈구 측정
야생형 마우스에서 콜히친 및 콜히친 유도체의 항염증 활성의 생체 내 평가를 수행하였다. 피하로 공기를 주입하여 7일 동안 마우스의 등쪽에 공기 주머니를 생성시켰다. 공기의 1차 주입 7일 후, 공기 주머니에 MSU (1.5mg/ml) 또는 희석제 (PBS)를 주입하기 1.5시간 전에, 표시된 양의 (91), (43), 콜히친 또는 DMSO (비히클)를 포함하는 10 μl/g의 HBSS를 피하로 주사하였다. MSU 투여 7시간 후, 2ml의 PBS + 0.5 M EDTA로 2회, 1 ml의 PBS + 0.5 M EDTA로 1회 씻어내어 공기 주머니의 삼출물을 채취하고, 모집된 백혈구의 수를 유세포 분석으로 결정하였다. 백혈구는 항-CD45 및 항-Ly6G 항체로 염색되었다.
결과
순환하는 (91) ( CCI ) 또는 (43) (CH- 35)의 반감기 및 이의 백혈구에서의 농도
CCI 또는 CH-35 ( 43)의 생체 내 항염증 활성을 평가하기 전에, 마우스 혈장에서 이들의 반감기와 2시간 동안 순환하는 백혈구에서의 농도를 측정하였다.
도 10A에 나타난 바와 같이, 혈장 샘플의 질량 분석에 따르면 (91) (CCI)의 농도는 15분 (80 ng/ml)에서 정점에 도달한 다음, 60분까지 이 농도의 ¼ 미만으로 감소한 것으로 나타났다(t ½= 13.3 min). (91) (CCI)의 농도 감소가 관찰되었지만, 혈장에서 최소 2시간 동안 지속되었다. 이와 유사하게, 순환하는 CH-35 ( 43)의 최고 농도는 주입 후 15분에서 정점에 도달하였다 (도 10B). 그러나, CCI ( 91)와 달리, 약물 주입 약 50분 후에 혈장 내 CH-35 ( 43)의 양은 감지할 수 없는 수준으로 떨어졌다. 따라서, 혈장에서 CH-35 ( 43)의 농도는 투여 1시간 이내에 현저하게 감소하였다. 종합하면, CCI (91) 및 CH-35 ( 43)의 반감기가 매우 짧은 것을 의미하며, 이는 다른 구획으로의 이들의 흡수가 빠르다는 것을 시사한다.
도 11A에 나타난 바와 같이, 순환하는 백혈구에서 (91) (CCI)의 농도는 15분에서 정점에 도달하였고, 이들 세포에서 분석된 마지막 시점(2시간)까지 지속되었다. 이와 유사하게, 도 11B에 나타난 바와 같이, 순환하는 백혈구에서 CH-35 ( 43)의 농도는 15분에서 정점에 도달하였고, 이들 세포에서 분석된 마지막 시점(2시간)까지 지속되었다. 그러므로, CH-35 ( 43)는 피하 주사 후 최소 2시간 동안 순환하는 백혈구에서 지속될 수 있다.
(91) ( CCI ) 또는 (43) CH-35는 생체 내에서 MSU -유도 염증을 감소시킴
(91) (CCI) 또는 CH-35 ( 43)의 생체 내 항염증 활성을 MSU-유도 염증의 공기 주머니 모델에서 평가하였다. 등족 공기 강(cavity)은 관절의 활액 내벽 (예를 들어, 섬유아세포 및 대식세포) 및 백혈구 모집의 동일한 프로파일과 필수적 세포 특징을 공유하므로, 이 모델을 선택하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, MSU는 5μmol/kg 농도의 콜히친에 의해 억제된 7시간 동안 공기 주머니에 백혈구의 모집을 유도하였다. 약 10배 낮은 농도에서, (91) (CCI)은 MSU 투여 전에 주입된 경우, 여전히 백혈구 모집을 억제할 수 있었다. 제시된 바와 같이, 콜히친의 5 μmol/kg에 비해 현저하게 낮은 용량인 0.5 μmol/kg에서 백혈구 모집을 억제하는 CCI ( 91)의 능력이 입증되었지만, 콜히친의 이 용량은 이 시리즈에서 유의미하지 않았다. 0.5 μmol/kg의 용량에서, 콜히친은 생체 내 MSU-유도 백혈구 모집을 유의하게 억제하는 효능을 잃었다. 반대로, CCI (91)는 비선형적 용량 반응 곡선 때문에, 5 μmol/kg의 농도에서 콜히친보다 더 효과적이지 않을 수 있다.
(91) (CCI)의 치료적 잠재력을 확인하기 위하여, 공기 주머니 실험을 변형하고, 공기 주머니에 MSU를 첨가한 후에 0.5μmol/kg (91) (CCI)을 주입하였다. 도 13에 나타난 바와 같이, 이러한 실험 조건 하에서 백혈구 모집의 현저한 감소가 관찰되었으며, 이는 (91) (CCI)이 MSU가 이미 염증 반응을 유발한 다음 투여되었을 때, MSU-유도 염증을 여전히 완화시킬 수 있음을 의미한다. 대조적으로, 0.5μmol/kg의 농도에서 콜히친은 생체 내 MSU-유도 백혈구 모집을 더 이상 유의하게 억제할 수 없었다 (도 13). 오히려 예상치 않게, (91) (CCI)이 콜히친의 유효 용량보다 약 10배 낮은 농도에서 MSU-유도 백혈구 모집을 억제한다. 추가 실험에서, 도 13에 제시된 CCl (91)에서 얻은 결과와 비교하기 위하여, 도 14에 나타난 바와 같이, CH-35 ( 43)는 유사하게 테스트 되었다. 도 14의 결과에 따르면, 백혈구가 공기 주머니로 유입되는 것을 억제하는 데 있어서, CH-35 ( 43)는 CCI (91) 보다 덜 강력하다. 백혈구 모집을 유의하게 감소시키는 CH-35 ( 43)의 최저 농도는 2.5 μmol/kg였다. 따라서, CH-35 ( 43)는 MSU에 의해 유발된 염증 동안 백혈구의 모집을 억제할 수 있다. 종합하면, 이러한 결과들은 CH-35 (43) 및 CCl (91) 모두 콜히친보다 낮은 농도에서 생체 내 백혈구 모집을 억제할 수 있지만, CCI ( 91)가 생체 내 MSU-유도 백혈구 모집의 억제에 대한 가장 강력한 화합물임을 의미한다.
실시예 5 - 호중구에서 베타- 튜불린 이소타입의 발현 프로파일
방법
호중구 현탁액 (2 × 107 cells/ml)을 동일한 부피의 2× 비등 변형 Laemmli 샘플 완충액 (1× 버퍼: 62.5 mM Tris·HCl (pH 6.8), 4% (wt/vol) 도데실 황산 나트륨 (SDS), 5% (vol/vol) β-mercaptoethanol, 8.5% (vol/vol), 글리세롤, 2.5 mM orthovanadate, 10 μg/ml 류펩틴, 10 μg/ml 아프로티닌 및 0.025% 브로모페놀 블루)으로 직접 옮기고, 7분 동안 가열하였다. 단백질을 환원 조건 하에서 10% 아크릴아마이드 겔의 SDS-PAGE로 분리하고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮겼다. 차단제 및 항체를 Tris-완충 식염수 Tween 20 (TBST) 용액 (25 mM Tris·HCl, pH 7.8, 190 mM NaCl, 0.15% vol vol Tween-20)에 희석하였다. 1차 및 2차 항체는 제조사의 권장 농도로 사용하였다. PVDF 막을 항-β-튜불린 이소타입-특이적 항체로 면역블랏팅하기 전에 차단 용액 (5% wt/vol dried milk in TBST)에서 배양하였다. Horseradish peroxidase-labeled donkey anti-mouse IgG 및 donkey anti-rabbit IgG는 TBST 용액에 희석하였다. 화학발광 시약을 사용하여 최대 노출 시간이 5분인 항체를 검출하였다. 제시된 모든 면역블랏은 동일 단백질 로딩을 위해 항-PI3 키나아제 p85 항체로 조정되었다.
결과
백혈구에서 β-튜불린 이소타입의 발현 프로파일은 mRNA 수준에서 조사되었다. βVI의 mRNA 발현은 대부분 조혈 세포로 제한되는 반면, β-튜불린 I, IV 및 V mRNA는 널리 어디에서나 발현되며, β-II 및 -III mRNA는 뇌로 제한된다. 다양한 β-튜불린 이소타닙에 대한 콜히친의 구별되는 결합 친화도를 기반으로 하여, 콜히친 유도체를 개발하는 데 합리적인 디자인 접근법을 사용하였으며, 호중구에서 이들 이소타입의 mRNA 발현 프로파일이 그들의 단백질 수준의 발현과 상관관계가 있는지 여부를 확인하였다. 요약하면, 새로 분리된 인간 호중구를 용해시키고, 베타-I, 알파/베타-II, 베타-III, 베타-IV, 베타-V 및 베타-VI 튜불린에 대한 상업적으로 이용 가능한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏으로 분석하였다. βII 및 βIV에는 각각 βIIa, βIIb 및 βIVa, βIVb라는 2가지 변이가 있으나, 그 서열은 매우 유사하고 구조도 마찬가지이다. 도 15에 나타난 바와 같이, 인간 호중구는 베타-I, 알파/베타-II, 베타-IV 및 베타-VI를 발현하지만, 베타-III 및 베타-V는 발현하지 않는다. βV에 대해 관찰되는 밴드는 비특이적이다 (양성 대조군으로 확인됨(데이터는 표시되지 않음)). β-VI의 발현이 대부분 조혈 세포로 제한되기 때문에, 이 β-튜불린 이소타입에 대해 더 높은 친화도를 갖는 콜히친 유도체들이 본원에 기재된 분석을 위해 선택되었다.
낮은 농도에서 MSU-유도 반응을 억제하는 능력을 CH-35 ( 43)에 부여할 가능성이 가장 높은 β-튜불린 이소타입을 확인하기 위하여, 콜히친, CCl (91), CR42-003 (47a) 및 CH-35 ( 43)의 결합 자유 에너지(kcal/mol)를 하기 표 3에서 비교하였다.
bI bIIa bIIb bIII bIVa bIVb bV bVI
콜히친 -29.596 -37.899 -32.519 -38.816 -30.962 -37.443 -51.387 -42.031
CR42-003 -56.623 -47.450 -40.010 -38.238 -30.26 -33.287 -47.264 -42.213
CCI -53.106 -34.397 -39.109 -48.44 -32.035 -43.974 -63.818 -47.627
CH-35 -52.431 -33.74 -39.818 -40.612 -40.865 -49.547 -63.964 -51.702
상기 표 3에 나타난 바와 같이, CH-35 ( 43)는 콜히친 및 CR42-003 (47a)에 비해 βIVb 및 βVI에 대해 현저하게 낮은 결합 자유 에너지를 갖는다. 이러한 데이터는, βIVb 및 βVI에 대한 CH-35 ( 43)의 높은 친화도가 테스트된 분석에서 콜히친 및 CR42-003 (47a)에 비해 더 낮은 농도에서 CH-35 (43)를 활성화시킬 가능성이 가장 높은 것을 시사한다. 또한, CCl ( 91)과 관련하여, 콜히친 및 CR42-003 (47a)에 비해 βIVb 및 βVI에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. CCl ( 91)과 CH-35 (43)의 차이점은, CCl ( 91)와 달리 CH-35 ( 43)는 선형적 용량 관계를 갖는다는 점이다. βIVb 또는 βVI는 CCl ( 91)에 비해 CH-35 ( 43)에 대해 결합 자유 에너지가 상당히 높은 호중구에서 발현되는 유일한 두 가지 β-튜불린 이소타입이기 때문에, 결합 자유 에너지 데이터는 βIVb 또는 βVI 또는 둘 다에 대한 CH-35 ( 43)의 더 높은 친화성 때문일 수 있음을 시사한다.
검토
통풍 치료에 사용되는 약물 중 콜히친은 통풍 발작과 관련된 주요 백혈구인 호중구의 대부분의 염증 작용을 완화시키기 때문에 염증성 질환의 병인과 관련하여 가장 큰 특이성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 이의 투여는 효능과 치료 제한 부작용 사이의 낮은 치료 지수로 인해 여전히 도전적이다. 합리적 약물 설계 접근법을 사용하여 콜히친 유사체, (91) (CCI)을 개발하였으며, 콜히친보다 약 10배 내지 100배 낮은 농도에서 생체 내 MSU-유도 염증과 시험관 내 MSU-유도 호중구 반응을 억제하였다. 참고로, 다른 콜히친 유도체 43 및 47a는 본원에 기재된 바와 같이 91과 동일한 용량에서 호중구 반응을 감소시키는 데 비슷하게 효과적이었다.
CCI (91) 및 ( 43)은 시험관 내 및 생체 내에서 콜히친보다 약 10배 내지 약 100배 낮은 용량으로 항염증 활성을 유지했다. 또한, 이들 화합물은 MSU에 의해 유도된 염증 반응의 개시 후에 투여될 때 항염증 특성을 나타내며, 이는 이들의 치료적 잠재력을 의미한다.
in vitro 및 in vivo에서 MSU-유도 호중구 활성화를 콜히친보다 낮은 농도에서 약화시키는 (91) (CCI)의 능력은 부분적으로는 튜불린 이소타입 특이성에 의해 설명될 수 있다. (91) (CCI)의 in silico 분석에 따르면, 호중구에서 발현되는 β-튜불린 이소타입 중 하나인 β-VI 튜불린에 우선적으로 결합하는 것으로 나타났다. 또한, β-VI 튜불린 이소타입은 특히 콜히친 결합 영역에서 다른 것과 매우 구별되어, 결합하는 약물에 대해 높은 수준의 특이성과 선택성을 제공한다. (91) (CCI)와는 대조적으로, 콜히친은 어디에나 발현되는 β-튜불린 이소타입인 β-IV 튜불린에 대해 가장 높은 친화도를 갖는다. 콜히친은 MSU-유도 활성화 및 백혈구 모집을 억제할 수 있지만, 대부분의 다른 세포 유형에 의해 발현되는 β-튜불린 이소타입(들)에 결합하는 능력으로 인해 바람직하지 않은 부작용과 관련된다. 따라서, β-VI 튜불린에 대한 (91) (CCI)의 특이적 결합은 호중구에서의 활성을 최대화하면서 비-조혈 세포와의 오프-타겟 효과를 최소화할 가능성이 높으며, 이는 이 이소타입이 이들 세포에서 발현되지 않기 때문이다.
시험관 내 분석에 따르면, (91) (CCI)이 MSU에 의해 활성화되는 가장 상류 신호전달 이벤트 중 하나인 세포질 칼슘의 증가를 억제하는 것으로 나타났다. 콜히친이 더 이상 효과적이지 않은 농도(약 100배 낮은 용량)에서 이 분자 이벤트를 억제하는 (91) (CCI)의 능력은 (91) (CCI)에 의해 우선적으로 결합된 β-튜불린 이소타입이 MSU-유도 세포 내 칼슘 저장 동원에서 더 중요한 역할을 할 가능성이 높음을 강력하게 시사한다. (91) (CCI)은 in silico 분석에 의해 예측된 바와 같이, βVI, βV에 우선적으로 결합하고, βI-튜불린에 대한 친화도는 더 낮다. MSU-유도 초산화물 생성과 같은 세포 내 칼슘 동원의 하류의 이펙터 기능에 대해서도 동일한 추론이 확장될 수 있다. 본원에서는 (91) (CCI)이 콜히친보다 약 10배 낮은 용량으로 MSU에 반응하여 인간 호중구에 의한 초산화물 생성을 억제한다는 직접적인 증거를 제공한다. 마찬가지로 MSU에 의해 유도된 IL-8의 방출도 (91) (CCI)에 의해 감소된다. (91) (CCI)은 콜히친보다 약 10배 낮은 농도까지 IL-8의 방출을 억제하는데 특히 효과적이다. 따라서, (91) (CCI)은 MSU-유도 염증을 치료하기 위해 더 낮은 용량으로 투여될 수 있으며, 이는 약물 관련 부작용의 위험을 줄인다. 낮은 농도에서 (91) (CCI)에 의한 IL-8 생성의 억제는 통풍과 매우 관련이 있으며, 이는 IL-8이 호중구에 대해 가장 강력한 화학유인물질 중 하나이기 때문이다. 마찬가지로, 초산화물 생성의 감소는 통풍 병인과 관련이 있으며, 이는 초산화물이 관절에 이차적인 손상을 일으키기 때문이다.
시험관 내 관찰에 따르면, (91) (CCI)이 MSU-유도 호중구 반응을 억제함이 확인되었으며, 생체 내에서 MSU-유도 염증을 완화시키는 CCI의 능력이 확인되었다. (91) (CCI)이 MSU 전 또는 후에 투여될 때 MSU-유도 백혈구 모집을 억제하는 것이 본원에 제시되었다. 후자는, 시험관 내 실험에서 MSU를 투여한 후 약 1시간 30분에 주사했을 때 (91) (CCI)의 항염증 활성이 보존되었기 때문에 (91) (CCI)을 치료적으로 사용할 수 있음을 의미한다. 본원의 실험에서, (91) (CCI)이 생체 내에서 항염증 활성을 유지한 최저 용량은 0.5μmol/kg였다.
마우스에서 사용된 약물의 인간 등가 용량 추정치를 얻기 위해, 일 관점에서, 마우스에서 사용되는 농도를 약 12.3으로 나눌 수 있다 (Nair , A.B . and Jacob, S. 2016. A simple practice guide for dose conversion between animals and human, J Basic Clin Pharma : 7: 27 -31). 마우스에서 MSU-유도 백혈구 모집을 효과적으로 억제하는 콜히친의 용량은 5μmol/kg이다 (Chia , E.W ., Grainger, R. and Harper, J.L . 2008. British Journal of Pharmacology: 153: 1288 -95). 이 용량은 통풍 환자에게 투여되는 인간 용량보다 10배 더 높기 때문에 인간 등가 용량으로 간주된다. 보외법(extrapolation)에 의해, 그리고 본원의 실험에 기초할 때, (91) (CCI)는 통풍 발작에 현재 사용되는 콜히친 용량보다 약 10배 낮은 용량으로 인간의 MSU-유도 염증을 완화시킬 수 있을 것으로 예상된다.
통풍 발작 동안 관절로의 호중구 대량 유입 때문에 인간 호중구가 표적이 되었으며, 이 백혈구에서 베타-튜불린 이소타입의 발현을 결정하였다. 호중구는 β-I, β-II, β-IV 및 β-VI 튜불린을 발현하지만, β-III 및 β-V 튜불린은 발현하지 않는다. 이러한 단백질 발현 패턴은 이미 보고된 β-튜불린 이소타입의 mRNA 발현 프로파일과 매우 연관성이 있다. β-VI 튜불린의 mRNA는 조혈 세포 및 골수, 흉선 및 태아 간과 같이 많은 수의 백혈구를 보유하는 기관으로 제한된다. 그런, β-III 및 β-V 튜불린의 mRNA는 백혈구에서 검출되지 않는다. β-I, β-II, 및 β-IV 튜불린 이소타입 mRNA의 수준은 백혈구에서 β-VI 보다 현저히 낮다. 호중구와 대부분의 다른 세포 유형에서 서로 다른 β-튜불린 이소타입의 기능적 중요성은 아직 알려지지 않았지만, 기능적 중복성과 특이성 모두에 대한 증거가 존재한다. 전자와 관련하여, 이종 미세소관으로의 중합하는 대부분의 β-튜불린 이소타입의 능력은 기능적 중복성을 뒷받침한다. 후자와 관련하여, 튜불린병증(tubulinopathies)으로 알려진 질병 그룹의 뚜렷한 표현형은 튜불린 이소타입이 뚜렷한 기능적 역할을 한다는 것을 시사한다. 튜불린병증은 상이한 β-튜불린 이소타입의 돌연변이로 인해 유발될 수 있다. 또한, β-튜불린 이소타입의 조직-특이적 및 발달 단계-특이적 발현은 이러한 단백질에 대한 비-중복, 기능적 역할을 시사한다.
백혈구에서 β-VI 튜불린의 기능은 아직 알려지지 않았지만, 백혈구 발현 프로파일이 백혈구에 대해 어느 정도 기능적 특이성을 반영하고, β-VI 튜불린-특이적 약물이 비-조혈 세포에 대한 더 낮은 오프-타겟 효과를 나타낼 수 있음을 이유로, 이 이소타입은 타겟이 되었다. βVI에 대해 콜히친보다 상대적으로 상당히 더 높은 친화도를 가질 것으로 예측되는 3가지 유도체들의 효능을 테스트하였으며, 시험관 내 및 생체 내에서 MSU에 의한 인간 호중구의 활성화를 억제하였다. 시험관 내에서 조사된 이펙터 기능은 통풍의 병인, 즉, IL-1 및 IL-8의 방출과 초산화물의 생성에서 역할을 하는 기능이다. 매우 효과적인 호중구 화학유인물질인 IL-8과 관련하여, 이 사이토카인에 대한 중화 항체는 토끼 모델에서 MSU에 의해 유도된 호중구 유입을 상당히 감소시킨다. 반면에 IL-1은, 내피 세포 및 활막 세포와 같은 관절에서의 다른 세포 유형에 의한 부착 분자의 발현을 유도하여 통풍에서 역할을 한다. 초산화물과 관련하여, 이 활성 산소 종은 관절의 양쪽 옆에 붙은 조직 손상과 관련이 있다. 본원에 제공된 데이터는 CCI (91) 및 CH-35 ( 43)가 시험관 내에서 콜히친보다 현저히 낮은 약 10배에서 약 100배 낮은 농도로 MSU에 의해 유도된 ROS의 생성 및 IL-8의 방출을 감소시키는 것을 시사한다. 이러한 호중구 반응을 감소시키는 이들 유도체의 능력은 통풍 발작을 일으키는 주요 분자 이벤트를 표적으로 할 수 있음을 의미한다.
시험관 내 관찰은 CCI (91) 및 CH-35 ( 43)가 콜히친보다 현저히 높은 효율로 생체 내 MSU-유도 염증을 완화시킬 수 있는지 여부의 결정을 유도하였다. 염증의 공기 주머니 모델을 이용할 때, 본원에 제공된 데이터는 시험관 내 CCI (91) 및 CH-35 ( 43)의 억제 활성은 생체 내 MSU-유도 염증을 감소시키는 이들의 능력을 반영함을 시사한다. CCI ( 91)와 관련하여, 콜히친이 MSU 투여 전에 주입될 때보다 약 10배 낮은 임계 용량에서, MSU가 주입된 공기 주머니로의 백혈구의 모집을 억제한다. 그러나, 고농도에서는 CCI ( 91)는 백혈구 유입 억제에 있어서 덜 효과적이라는 점이 주목된다. 칼슘 및 ROS in vitro 분석에서 유사한 비선형적 경향이 관찰되었다. 이 비선형적 용량 반응은 CCI ( 91)이 내분비 교란 약물과 같이 오프-타겟 작용이 원인이 된 비선형적 용량 반응을 갖는 다른 약물에 대해 보고된 바와 같은 다른 β-튜불린 이소타입 이외의 리간드에 결합하는 것을 가장 잘 반영한다.
MSU에 대한 반응으로 백혈구의 모집을 현저하게 감소시키는 데 있어서, CCI가 콜히친보다 더 강력한 것을 보여주었고, 이의 치료적 잠재력이 평가되었다. MSU 주입 1.5시간 후 CCI ( 91)의 피하 투여는 공기 주머니로의 백혈구의 모집을 현저하게 감소시켰다. 따라서, CCI ( 91)는 MSU-유도 염증 개시 후 완화시킬 수 있다. 놀랍게도, 콜히친은 CCI ( 91)와 이 특성을 공유했지만, CCI ( 91)는 활성이 유지된 농도인 0.5 μmol/kg에서 콜히친은 항염증 활성을 잃었다. 비록 CCI ( 91)보다 높은 농도인 2.5μmol/kg이기는 하나, CH-35 ( 43)에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다. CCI ( 91)와 달리, CH-35 ( 43)는 in vitro 및 in vivo 모두에서 선형적 용량 반응을 나타낸다. 종합하면, 이러한 결과는 생체 내 MSU-유도 염증 감소에 있어서, CCI ( 91)가 CH-35 (43) 보다 더 강력한 것을 의미한다.
CCI (91) 및 CH-35 ( 43)의 반감기는 짧지만, 백혈구 모집이 정점에 도달하기 7시간 전에 투여되는 경우, 두 유도체는 모두 MSU-유도 백혈구 모집을 감소시킬 수 있다. 이는 백혈구, 특히 호중구에 의한 이들 화합물의 흡수 및 잔류에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. 콜히친은 단핵 세포에 비해 호중구에 우선적으로 축적된다. 주사 후 2시간까지 순환하는 백혈구에서 CCI ( 91)의 잔류가 관찰되었다 (예비 데이터). CCI (91) 및 CH-35 ( 43)의 약동학의 완전한 특성화는 이들 화합물의 작용 메커니즘에 대한 추가적 통찰력을 제공할 수 있다.
호중구는 감염으로부터 숙주를 보호하는 데 있어서 중요한 역할을 하기 때문에, 염증 완화를 위한 호중구의 표적화는 도전이었다. CCI ( 91)는 세포질 칼슘 증가 및 활성 산소 종 생성과 같은 특정 항-박테리아 반응을 줄이면서 MSU-유도 염증을 선택적으로 억제한다 (데이터는 표시되지 않음). 박테리아 펩타이드 fMLF를 이용하여, CCI ( 91)가 존재할 때 이 박테리아 펩타이드에 반응하는 호중구의 능력에 대한 증거가 제공되었다. 이 관찰은, CCI ( 91)는 MSU에 대한 호중구 자극을 감소시키면서 박테리아 감염의 위험을 증가시키지 않아야 하며, 포밀 펩타이드 수용체에 의해 매개되는 선천성 면역이 βVI 튜불린에 완전히 의존하지 않을 수도 있다는 것을 시사한다. 베타-VI 튜불린은 다른 베타-튜불린 이소타입과 공유하는 박테리아 방어에서 중복적인 역할을 하거나, 또는 베타-VI 튜불린은 이러한 방어에 전혀 필요하지 않다. CCI (91) 및 CH-35 ( 43)도 다른 베타-튜불린 이소타입에 대해 증가된 친화도를 갖는 것으로 추정된다는 점이 주목된다.
요약하면, MSU-유도 염증을 억제하고, 통풍 발작시 통풍 환자의 증상을 완화시킬 수 있는 신규하고 덜 독성인 항염증제가 개발되었다. 이러한 약물의 개발은 통풍 환자의 주요 미충족 임상 요구를 해결한다. 콜히친은 매우 좁은 치료 지수를 가지며, 약물-약물 상호작용으로 인한 유해한 부작용과 관련이 있다. 또한, 통풍은 동반질환(예를 들어, 만성 신장 질환(CKD)) 환자에서 더 자주 나타난다. 통풍 환자의 약 54%가 CKD를 앓고 있다. CKD 환자는 콜히친을 신중하게 투여해야 하는데, 이 약물은 신장 장애로 인해 이러한 환자에서 독성 수준까지 더 쉽게 축적되기 때문에, 콜히친의 사용을 어렵게 만든다. 동반질환(Co-morbidity)은 또한, 급성 통풍 발작과 연관된 염증 및 통증을 감소시키기 위해 사용할 수 있는 콜히친 이외의 약물 선택을 크게 제한한다. 과민 및 동반질환 때문에 현재의 치료법을 받을 수 없는 환자는 새롭고 덜 독성인 치료적 접근법 개발에 원동력이다. NSAID 및 코르티코스테로이드와 같은 대체 항염증제가 있지만, 이들 화합물 자체도 부작용이 존재한다. 따라서, 본원에 제시된 결과는 낮은 유효 용량의 CCl이 치료 범위를 넓히고, 콜히친 및 기타 항염증제와 관련된 부작용을 줄일 수 있음을 보여준다. 통풍 환자의 약 12%가 이용 가능한 모든 치료 방식에 대해 불응성이다(공개되지 않은 관찰). (91) (CCI)은 매우 낮은 용량으로도 활성을 나타내므로, (91) (CCI)가 다른 약물과의 상호작용에 의한 독성을 일으킬 가능성은 거의 없다. 이 가설은 상기 나타낸 바와 같이, (91) (CCI)이 콜히친 및 ( 89)와 같은 다른 콜히친 유도체들보다 덜 독성인 것을 보여주는 랫트를 대상으로 한 급성 염증 독성 연구에 의해 뒷받침된다. (91) (CCI)의 최대 허용 용량은 콜히친보다 3배 높다. 이 약물은 통풍 환자, 특히 신장 기능 저하로 인해 약물을 제거할 수 없는 CKD를 갖는 환자에게 특히 중요하다. 따라서, (91) (CCI)은 콜히친보다 안전한 항염증제이며, 통풍 환자에게 더 안전한 대안이다.
실시예 6 - 튜불린 결합 연구
재료 및 방법
튜불린 모델 준비
인간 β-튜불린 이소타입에 대한 컨센서스 서열은 이전에 기술되었다(Huzil J.T. et al., Nanotechnology. 2006:17:S90-S100). 콜히친 결합 부위를 구성하는 잔기는 1SA0 pdb 좌표 내 B 사슬을 조사하여 결정하였다(Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202.). PyMol v1.0 (Delano WL. The PyMOL Molecular Graphics System. 2002)을 사용하여, 콜히친에서 6 Å 이내에서 발견되는 원자를 갖는 잔기를 선택하였다. 이 잔기의 서브세트로부터, 콜히친 결합 부위 내에서 발견되는 접촉 잔기의 최소 세트가 정의되었다(도 5A 및 5B). 이 감소된 접촉 세트를 기반으로, βI, βIIa, βIIb, βIII, βIVa, βIVb 및 βV에 대한 1차 서열을 조사하여, 튜불린 이소타입을 3개의 콜히친 결합 부위 중 하나에 배치하였다; 타입 I (βI 및 βIV), 타입 II (βII) 및 타입 III (βIII 및 βV) (도 5A). 1SA0 B 사슬 좌표로부터 얻은 주형 β-튜불린 구조를 (Ravelli et al., 2004, Nature, 428, 198-202), PyMol v1.0 (Delano WL. The PyMOL Molecular Graphics System. 2002)에서 확인된 변이 기능을 사용하여 표준 컨포머 라이브러리로부터 적절한 잔기를 대체하여 모델을 생성하는 데 사용하였다.
각 결합 부위 모델의 최소화는 CHARMm (Chemistry at HARvard Molecular Mechanics) molecular force field (Brooks B.R., Brooks CLr, Mackerell AD.J. et al., CHARMM: The biomolecular simulation program. J. Comput. Chem. 2009)를 사용하여 GROMACS molecular dynamics (MD) package (version 3.2.1) (Lindahl F. et al., GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis. J Mol. Mod. 2001; 7:306-17)에서 수행되었다. Convergence criteria for Steepest Descents and Conjugate Gradient 최소화는 0.05 kcal mol-1 Å-1의 구배로 설정되었다. 최소화 후, 완전 용매화된 주기적 상자(100x100x100 Å)에서 짧은 시뮬레이션 어닐링 실행(100 ps)을 수행하였다. 제한되지 않은 전하는 소듐 이온과 균형을 이루고, particle-mesh Ewald's (PME)를 이용하여 장저리 정전기를 계산하였다.
콜히친 유도체
튜불린에 결합된 콜히친의 구조는 pdb structural file 1SA0 (Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202)로부터 추출하여, MarvinSketch (ChemAxon, Hungary)로 가져왔다. C1 및 C3 메톡시 그룹의 유도체화(도 2-4)는 3D drawing tools을 이용하여 빌딩 수정을 통해 수행되었다. 그 다음, 각 유도체들을 MDL Molfiles (Symyx Technologies, U.S.A.) 3D 좌표로 내보냈다.
콜히친 매개변수화 및 최소화
콜히친 및 이의 유도체 구조는 Discovery Studio v2.1 (Accelrys, Inc., U.S.A.)에서 구현된 CHARMm force field (Brooks B.R., Brooks CLr, Mackerell AD.J. et al., CHARMM: The biomolecular simulation program. J. Comput. Chem. 2009)를 사용하여 준비 및 매개변수화 되었다. 타입 I, II 및 III 결합 부위 모델에 각 유도체를 재도입시키기 전에, in vacuo 최소화 단계를 수행하였다. 초기 콜히친 좌표는 결정학적 구조에서 얻어졌기 때문에, 고조파 제한(10 kcal mol- 1)이 3개 고리 각각에 포함된 탄소 원자에 배치되었다. 평균 제곱근 편차 (RMS) 구배가 0.05 kcal mol-1 Å-1 미만이 될 때까지, CHARMm forcefield 및 Adopted Basis set Newton Raphson (ABNR) 프로토콜을 사용하여, 수소가 첨가되고, 결합 순서가 고정되고, 원자 위치가 최적화되었다. 특정 콜히친 유도체들은 약간 다르게 제조되었다; 개별 시스템은 GROMACS를 이용하여 TIP3 워터 박스에 배치되고, 최소화되었다. 짧은 평형 후, 세 가지 개별 조건에 대한 시스템 에너지를 얻었다. 용매화된 튜불린-콜히친 복합체 E(P+L)에 대한 에너지는 콜히친이 콜히친 결합 부위 E(P-L)에 결합되지 않은 튜불린 콜히친 시스템에서 얻은 에너지에서 차감되었다. E(P-L) 케이스에서 콜히친과 튜불린 사이의 비-결합 상호작용이 도입되지 않았는지 확인하기 위하여, 대형 워터 박스를 사용하였다.
컴퓨터를 이용한 콜히친 스크리닝
타입 I, II 및 III 결합 부위에 대한 20개의 콜히친 유도체의 도킹은 Discovery Studio v2.1 (Accelrys, Inc., U.S.A.)에서 구현된 CDOCKER (Wu G. et al., J. Comput Chem. 2003; 24:1549-62)를 사용하여 수행되었다. 요약하면, CHARMm force field (Brooks B.R., Brooks CLr, Mackerell AD.J. et al., CHARMM: The biomolecular simulation program. J. Comput. Chem. 2009)와 함께 시뮬레이션된 어닐링 MD 접근법을 사용하여 유도체의 형태학적 검색을 수행하였다. 입력 부위 구의 선택은 전체 콜히친 결합 부위에 대해 정의되었다. 그 다음, 각 유도체를 온도 T=700K로 가열하고, T=300K로 어닐링 하였다. 20개 콜히친 유도체 각각에 대해 이러한 사이클을 10회 수행하여, 600개의 포즈를 생성하였다. 그 다음, 각 형태는 상기 설명된 ABNR 방법을 이용하여 국소 에너지 최소화를 거쳤다.
결합 에너지 평가
MM-GBSA (Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area)를 사용하여, 진공 정전기를 이용한 각 시스템에 대한 결합 에너지를 평가하고, Generalized Born model을 사용하여 용매화를 근사치로 계산하였다. 결합 에너지는 시스템의 총 위치 에너지를 얻고 유도체와 빈 이량체의 에너지를 빼서 계산하였다:
Figure pct00051
특정 콜히친 유도체의 경우, 에너지는 약간 다르게 결정되었다:
Ebind = E(P-L) - E(P+L)
정제된 튜불린 이소타입에 대한 약물 결합
Phosphocellulose chromatography (Fellous A., et al., Eur. J. Biochem. 1977; 78:167-74)에 의한 bulk microtubule protein로부터 튜불린을 정제하였다. 이어서, αβII 및 αβIII 튜불린 이량체는 이전에 기술된 바와 같이(Banerjee A. et al., J. Biol. Chem. 1992; 267:13335-9; and Baneljee A. et al., J. Biol. Chem. 1988; 263:3029-34), 단일클론 항체를 이용한 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 운동 형광 측정을 위해, 500 μL 분취량의 튜불린(0.1 mg/ml)을 일련의 약물 농도 존재 하에 석영 형광 큐벳(경로 길이 0.5 cm)에서, 37℃에서 배양하였다. 동역학은 튜불린에 비해 과량의 약물을 사용하여 유사-1차 조건 하에 수행되었다. 사용된 여기 및 방출 파장은 각각 380 nm 및 437 nm였다.
수정된 형광 값은 시간(
Figure pct00052
) 함수로 플롯팅되고, 곡선에 맞춰졌다:
Figure pct00053
이러한 조건 하에서,
Figure pct00054
는 약물과 튜불린 이소타입 간의 상호작용 정도의 좋은 지표이다.
Figure pct00055
대
Figure pct00056
의 예상 선형 플롯은 기울기
Figure pct00057
를 갖는다.
Figure pct00058
값은 각각 αβII, 및 αβIII, 132 및 30 M-1s-1에 대해 이전에 보고된 값의 함수로 플롯팅되었다(Banerjee A. et al., J. Biol. Chem. 1992; 267:13335-9).
결과
이소타입 서열 분석
튜불린의 3차 구조는 3가지 별개의 도메인으로 나눌 수 있다: 도메인 I (잔기 1-198), 도메인 II (잔기 199-373) 및 도메인 III (잔기 374-428) (Nogales E. et al., Nature. 1995; 375:424-7). βI, βIIa, βIIb, βIII, βIVa, βIVb 및 βV 이소타입은 이러한 도메인 내에서 각각 87.4%, 88.1% 및 96.3% 동일성을 공유한다. 파클리탁셀 결합과 관련된 잔기의 경우(Nogales E. et al., Nature. 1995; 375:424-7), β-튜불린 이소타입 간의 전체 동일성과 비교할 때 예상보다 더 큰 91.7% 서열 동일성을 나타냈다. 평균보다 높은 경향은 Vinca 결합 부위 (Gigant B. et al., Nature. 2005:435:519-22) (92.3% 동일성) 및 GDP 결합 부위 (Nogales E. et al., Nature. 1995; 375:424-7) (100% 동일성)에서 계속된다. 콜히친 결합 표면(Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202)은 18개 잔기로 구성된 것으로 밝혀졌다: V236, C239, L246, A248, K252, L253, N256, M257, T312, V313, A314, A315, V316, N348, K350, T351, A352 및 I368 (도 5A). 파클리탁셀 및 Vinca 결합 부위와는 대조적으로 조사된 7개 β-튜불린 이소타입 사이에서 77.9% 동일성을 공유한다.
일반적으로, 결합 부위는 주로 비극성이며, 잔기 K252 및 K350에 의해 표면의 외부 립에 약간의 양전하가 도입된다. 콜히친 결합 표면 내 특정 치환은 C236S (βIII 및 βV), A315T (βIII 및 βV), V316I (βII), 및 T351V (βIII 및 βV)인 것으로 밝혀졌다(도 5A). 이 부위 내 치환의 이소타입 분포에 기초하여, β-튜불린 이소타입은 3가지 클래스로 나뉜다. 타입-I 결합 부위는 표준 βI 서열을 특징으로 하며, 대부분의 경우, βII 및 βIV 이소타입을 포함한다. 타입-II 결합 부위는 βII 이소타입에서만 발견되는 V316I 치환을 제외하고는 타입-I 부위와 동일하다. 타입-III 결합 부위는 가장 큰 변이 (C236S, A315T 및 T351V)를 가지며, βIII 및 βV 이소타입을 포함한다. 타입-II 및 타입-III 결합 부위 내에서 발견되는 치환이 βI-튜부린 구조에 맵핑되는 경우(Lowe J. et al., J. Mol. Biol. 2001; 313:1045-57), 모두 콜히친 A-고리를 둘러싼 영역 내에 위치하는 것으로 관찰되었다 (도 5B). 이러한 치환 중 어느 것도 표면의 전하를 변경시키지 않았지만, C239S 및 A315T는 A-고리, 특히 3개의 비극성 페놀 메톡시 그룹과 상호작용하는 표면의 극성을 변경시켰다.
콜히친 유도체
도 2-4에 설명된 바와 같이, 기본 콜히친 및 티오콜히친 스캐폴드에 몇 가지 변형이 이루어졌다. 이러한 변형은, C1-디메틸콜히친 및 C3-디메틸콜히친에 대한 알칸/알켄, 에스터/에터, 방향족 변형(도 3 및 3A) 또는 C3-디메틸티오콜히친에 대한 알칸/알켄 변형(도 4)으로 구성된다. 이소타입 결합 부위의 클래스 사이의 공간적 및 화학적 차이를 조사하기 위해, 특정 변형을 선택하였다. C1에서의 변형은 잔기 315, 316 및 351 사이에서 발견된 차이를 조사하기 위해 디자인된 반면, C3에서의 변형은 주로 공동-결정(co-crystal)에서 관찰되고 콜히친 아래에 위치한 비극성 공동(cavity)을 조사하기 위해 디자인되었다(Ravelli R.B. et al., Nature. 2004; 428:198-202).
콜히친 유도체의 도킹
콜히친 유도체를 컴퓨터를 이용하여 프로빙 하는 데 사용되는 기본 전략은 여러 리간드 배향의 생성을 포함하며, MD 기반 시뮬레이션 어닐링 및 가장 가파른 하강 및 컨쥬게이트 기울기 최소화를 통합하는 최종 개선 단계가 이어진다. CDOCKER (Accelrys, Inc., U.S.A.)을 사용하여, 각 콜히친 유도체에 대한 총 10개의 복제품을 생성시키고, 결합 부위 모델의 중심 주위에 무작위로 분포시켰다. 유도체의 최초 배치 후, 각각 MD 기반 시뮬레이션 어닐링 및 최소화에 의한 최종 개선을 거쳐, 3개의 결합 부위 모델 각각에서 각 유도체 및 콜히친에 대한 10개의 도킹 포즈가 산출되었다. 도킹 절차의 마지막 단계는 Discovery Studio의 Score Ligand Poses protocol을 사용하여 개선된 도킹 포즈의 점수를 매기는 것이다. 결합 에너지 점수를 도출하기 위해, 각 실험에서 10개 포즈에 대해 평균 에너지 값이 사용되었다. 이 절차로 에너지 평가가 수행된 630개 리간드 컨포머가 산출되었다.
결합 에너지 결정
결합 에너지는 도킹 단계에서 결정된 각각의 완전한 시스템의 총 위치 에너지를 계산한 다음, 결합된 리간드와 아포-이량체의 에너지를 빼서 결정되었다(표 4 내지 6). 각 콜히친 유도체에 대한 평균 결합 에너지를 플롯팅하였을 때, 모든 모델에서 경향이 일관되었으며, 타입-I, 타입-II 또는 타입-III 결합 부위 사이에 뚜렷한 차이가 없었다 (도 6; CH는 콜히친을 나타냄). 그러나, 모든 모델에서, C1 위치의 에스터/에터 및 방향족 유도체들은 콜히친과 비교할 때 높은 결합 에너지를 나타낸 한편, C1 및 C3 위치의 알칸/알켄 및 티오콜히친 유도체들은 우수한 결합 친화도를 가졌다 (표 4 및 도 6). 이 플롯은 또한 각 유도체들에 대한 결합 에너지의 범위를 보여주며, 이는 도킹 적합의 전반적인 적합성을 시사한다 (도 6). 특히, 콜히친보다 높은 결합 에너지를 나타내는 유도체는 결합 에너지에서 더 큰 분포를 갖는 경향이 있는 반면, 전체 결합 에너지가 낮은 유도체는 더 좁은 분포를 갖는다. 이러한 경향은 C1 위치에서 각 작용기의 극성과 관련이 있는 것으로 보인다. 이러한 변형이 시험관 내에서 갖는 역할을 조사하기 위해, 모든 콜히친 유도체를 합성하고 튜불린 결합 분석에서 테스트하였다.
이러한 계산으로부터, 콜히친 아미드 그룹의 변형이 튜불린과의 결합을 증가시킨다는 것이 분명해졌다(표 5 및 6). 이 결과는 또한 특정 유도체((40), (42), (43))에 대한 변형이 평균적으로 가장 낮은 에너지를 갖는 것을 시사한다.
콜히친 유도체 결합에 대한 계산 및 실험 값. CH는 콜히친이다. 처음 세 개의 열은 10개의 계산 도킹 실험의 평균 값을 나타낸다. 표준 오류가 있는 세 가지 결합 부위 모델에 대한 평균 결합 에너지 (BE) [kcal mol-1]가 제시된다. 4열 및 5열은 αβII 및 αβIII 이소타입에 대한 kon rates [M-1 s-1]이다.
Drug Type I (BE) Type II (BE) Type III (BE)
Figure pct00059
αβII
Figure pct00060
αβIII
CH -14.47±0.45 -14.95±0.36 -16.29±0.21 132±5 30±2
(2) -16.06±0.18 -18.78±0.44 -10.45±1.24 35.9 9.4±1.0
(3) -13.89±1.08 -11.42±0.43 -17.99±0.57 36.6† 12±2.4
(4) -14.63±1.45 -14.65±0.82 -14.73±1.60 33.2 21.3±5.2
(5) -7.04±1.36 -10.09±1.17 -12.75±1.93 X‡ X
(6) -16.15±0.85 -19.04±0.31 -16.36±1.25 45.7 15.3±2.2
(7) -18.72±0.27 -17.24±1.33 -20.92±0.14 45.2 10.8±0.7
(7a) -10.83±1.07 -15.75±1.52 -17.19±1.69 41.9±0.4 10±0.4
(8) -17.9±0.91 -17.54±0.73 -21.52±0.36 67.7 14.9±0.6
(9) -16.27±0.58 -15.37±0.57 -15.32±1.69 50.4 13.7±0.7
(10) -12.92±0.79 -11.59±1.08 -14.2±0.69 74.9 15.1±0.4
(11) -13.44±0.87 -16.83±0.63 -16.44±0.76 37.9 9.2±0.7
(12) -9.07±0.95 -8.02±0.70 -15.42±0.91 54.2 16
(13) -10.84±1.15 -6.91±1.51 -8.78±1.63 35.1 11.6
(14) -11.85±1.32 -7.67±0.91 -10.65±0.93 X 16.5
(15) -10.02±0.97 -7.24±0.94 -8.82±0.22 49.4 14.1
(16) -8.9±1.85 -9.18±1.08 -7.32±0.63 35.7 9.1
(40) -17.06±0.33 -10.15±1.31 -19.84±0.32 201.2±10.5 66.9±1.4
(41) -12.2±0.94 -10.79±0.86 -12.7±0.53 185.2±7.8 65.5±1.3
(42) -13.34±0.42 -12.3±0.78 -12.6±1.52 138.3±6.5 53.4±0.8
(43) -14.51±0.63 -13.02±1.05 -17.25±0.34 301.4±20.1 98.5±3.4
*표준 pH에서 용해되지 않음
†표준 편자 없음
‡데이터 부족
콜히친 유도체 결합에 대한 계산 값. 세 가지 결합 부위 모델에 대한 평균 결합 에너지 (BE) [kcal mol- 1]가 제시된다.
Drug Binding Drug Binding
(8) -245.00 (40) -390.00
(55) -455.00 (67) -70.00
(56) -195.00 (68) -625.00
(57) -700.00 (69) -485.00
(7) -470.00 (42) -330.00
(58) -265.00 (70) -385.00
(59) 110.00 (71) -300.00
(60) -520.00 (72) -660.00
(7a) -575.00 (43) -290.00
(61) -515.00 (73) -455.00
(62) -505.00 (74) -415.00
(63) -475.00 (75) -665.00
(9) -255.00
(64) -390.00
(65) -240.00
(66) -545.00
표준 콜히친과 관련하여, 인간 b-튜불린 이소타입(I, IIa, III, IVa)에서 ChemRoutes 콜히친 유도체의 상대적 결합 자유 에너지 계산. 단위는 kJ/mol이다.
Drug Type I (BE) Type IIa (BE) Type III (BE) Type IVa (BE)
(83) 1.18 -7.76 -12.07 -10.21
(84) 7.00 -0.21 -8.70 5.40
(85) 13.51 -12.97 1.12 0.42
(89) 4.50 -10.43 -16.65 -15.38
(90) 1.04 -10.66 -13.01 -6.79
(91) -6.92 -20.69 -25.44 -12.86
실시예 7 - 결합 역학
(91) (CCI)의 어떤 측면이 상기 기재된 예상치 못한 결과에 기여할 수 있는지 결정하기 위해, 도킹 실험(본원에 참조된 PCT 공개 No. WO2011022805에 설명됨)이 수행되었고, 콜히친 유도체와 튜불린 이소타입 β-III 사이에 결합 에너지가 X1 위치의 변형과 관련하여 in vitro 및 in vivo에서 관찰된 효과에 기여할 수 있는지 여부를 확인하였다.
하기 표 7에 나타낸 콜히친 유도체의 3D 구조는 유연한 리간드 및 굳은 수용체 조건 하에서 Autodock4 프로그램을 사용하여 βIII 튜불린의 콜히친 결합 부위(콜히친 결합 부위의 베타 VI에 대해 구조적으로 동일)에 도킹되었다. AutoDock4는 약물 후보가 알려진 3D 구조의 수용체에 결합하는 방식을 예측하도록 디자인되었고, 두 가지 주요 프로그램으로 구성된다: autodock은 표적 단백질을 설명하는 그리드의 세트에 리간드 도킹을 수행하고, autogrid는 이러한 그리드를 미리 계산한다. 리간드의 초기 구조는 Amber12: EHT force field (in MOE2013.0802)를 사용하여 1차 최소화되었고, GAMESS-US version 2010-10-01에서 RHF/cc-pVDZ 이론 수준에 기초하여 완전히 최적화되었다. βIII 튜불린 서열 데이터(TBB3_HUMAN)는 UniProt ID (Q13509)에서 얻었고, 상동성 모델은 MOE2013.0802에 의한 RCSB Protein Data Bank (1SA0.pdb)의 튜불린 구조를 기반으로 βIII 튜불린에 대해 구축되었다.
사용된 화합물 (또는 콜히친 또는 티오콜히친 백본에 대한 구조적 변형) 이 나열되고, 구조적으로 표시된다.
화합물 이름/
구조적 변형 		구조
콜히친
Figure pct00061
(91) ( CCI )
Figure pct00062
(89)
Figure pct00063
결과
상기 설명한 도킹 실험의 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
이름/구조적 변형 결합 에너지
(Kcal/ mol ) 		βIII와 상호작용
콜히친 -5.97 도 16 참조
(91) ( CCI ) -6.2 도 17 참조
(89) -5.42 도 18 참조
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 콜히친 및 (91) (CCI)와 ( 89)의 비교는 OH 그룹이 튜불린에 대한 결합 에너지를 5.97 및 -6.2 에서 -5.42 Kcal/mol로 증가시켰음을 보여준다. 따라서, OH를 갖는 것은 결합 에너지를 증가시키고, 튜불린에 대한 친화도를 감소시키는 원인이 될 수 있다. 이에 따라, OH가 결여된 (91) (CCI)은 결합 에너지가 감소하고 튜불린에 대한 친화도가 증가하여, 본원에 제시된 in vitro 및 in vivo 결과에서 기능적 반응을 증가시켰다.
실시예 8 - 죽상경화증의 마우스 모델
서론
신-내막 병변으로 인해 동맥이 좁아지는 죽상경화증은 만성 질환이다(1). 호중구와 같은 면역 세포는 죽상경화성 병변의 발병, 진행 및 불안정성에 중요한 역할을 한다(2). 이러한 병변이 파열되면, 심근경색 및 뇌졸중을 포함한 여러 심혈관 합병증을 유발한다. 염증은 죽상경화증에서 핵심적인 역할을 하기 때문에, 염증 완화는 이 분야에서 많은 관심을 끌고 있는 치료적 접근법이다. 예를 들면, IL-1β를 억제하는 약물은 죽상경화증의 결과를 개선한다.
본 연구에서, 호중구와 관련된 염증이 두 질병의 병인에 역할을 하기 때문에, 통풍 모델에서 테스트된 콜히친 유도체가 죽상경화증을 치료하는 데 이용될 수 있음이 확인되었다. 죽상경화증의 치료에 이러한 유도체들을 사용하는 이점은 콜히친보다 훨씬 낮은 용량으로도 활성이 있고, 결과적으로 독성이 적다는 점이다.
이러한 데이터에 따르면, 본원에 기술된 콜히친 유도체는 호중구-매개 염증을 수반하는 질병과 같은 다른 염증-매개 질병에서 역할을 수행할 수 있을 것으로 예상된다.
방법
동물 및 식이
LDLR KO 마우스를 무작위로 4개 그룹으로 나누고, 대조군 식이(CD) (그룹 1 및 2) 또는 고지방 (그룹 3 및 4) 식이를 공급하였다. 고지방(HF) 식이는 총 콜레스테롤 0.2%, 총 지방 21%중량 (지방에서 42%), 총 지방산 >60%를 포함하고, 수크로오스가 높았다 (34%중량). 동물과 사료의 무게를 매주 측정하였다.
CCI 처리
그룹 2 및 4의 마우스에 0.5 μmol/kg 용량의 CCI를 피하로(s.c), 주 3회, 8주 동안 투여하였다. CCI의 용량은 통풍의 공기 주머니 모델에서 백혈구 모집을 유의하게 감소시키는 최저 용량으로 선택하였다.
혈장 지질 측정
8주간 식이 후, 마우스로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액으로부터 혈청을 준비하고, 분석 전까지 냉동하였다. 혈청 트리글리세리드 및 콜레스테롤은 당사의 Multidisciplinary and Microbiology Laboratory Service에 의해 마우스의 혈청에서 측정되었다.
총 병변 영역의 정량화
모든 마우스에서 수득한 대동맥에 대해 대동맥 병변 'en face' 분석 및 Sudan IV 염색을 수행하였다. ImageJ의 'region of interest' tool을 사용하여 마우스 간에 대동맥 가지와 하행 대동맥의 지질 염색 영역 백분율을 비교하였다.
사이토카인 측정
8주간 식이 후 마우스에서 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액으로부터 혈청을 준비하고, 분석 전까지 냉동하였다. 혈청의 사이토카인 수준은 Luminex assay으로 측정되었다. 분석된 사이토카인은 Eotaxin (CCL11), CCL21, G-CSF (CSF-3), RANKL, VEGF-A, IL-1 beta, IL-6 및 MCP-1 (CCL2)였다. 이들 사이토카인은 ApoE KO 마우스에서 죽상경화증의 발생을 반영하는 것으로 보고된 사이토카인 시그니처를 기반으로 선택하였다. LDLR KO 모델은 죽상경화증의 염증 측면이 이 모델에서 더 잘 나타나기 때문에 사용되었다.
결과
도 19는, CCI로 처리하고 CD 또는 HF 식이를 공급한 마우스가 8주 동안 약물을 처리하지 않고 동일한 식이를 공급한 마우스와 유사한 정도로 체중이 증가되었음을 보여준다. 이는 CCI가 생체 내 MSU-유도 백혈구 모집을 감소시키는 용량에서 마우스가 8주 동안 약물을 견뎌냈다는 것을 의미한다. 마우스는 정상적으로 행동했고, 어떠한 고통의 징후도 보이지 않았다.
CD 식이를 공급한 마우스와 비교할 때, 8주 동안 HF 식이를 공급한 LDLR KO 마우스의 혈청에서 트리글리세리드의 양이 유의하게 증가된 것을 관찰되었다 (도 20). 트리글리세리드의 수준은 HF 식이만 공급한 마우스보다 8주 동안 HF 식이를 공급한 CCI-처리 마우스에서 더 낮았다.
CD 식이를 공급한 마우스와 비교할 때, 8주 동안 HF 식이를 공급한 LDLR KO 마우스의 혈청에서 콜레스테롤의 양이 유의하게 증가된 것이 관찰되었다 (도 21). 콜레스테롤 수준은 HF 식이만 공급한 마우스보다 HF 식이를 공급한 CCI-처리 마우스에서 더 낮았다.
도 22A는 8주 동안 HF 식이를 공급한 마우스에서 죽상경화성 병변이 발생했음을 보여준다(빨간색으로 염색됨). HF 식이에서 CCI-처리 마우스의 대동맥 궁 또는 하행 대동맥에서 염색된 병변 영역의 백분율은 HF 식이만 공급한 마우스보다 낮았다. 'en face assay'에서 염색된 플라크로 덮힌 대동맥 궁의 전체 면적의 백분율을 각 마우스에 대해 확인하였다 (도 22B). 병변은 고지방 식이와 본 화합물(HF + CCI)을 공급한 LDLR KO 마우스에서 대동맥 궁의 총 면적은 HF 식이(HF)를 공급한 마우스보다 작은 퍼센트를 차지했다. 'en face assay'에서 염색된 플라크로 덮힌 하행 대동맥의 전체 면적의 백분율을 각 마우스에 대해 확인하였다 (도 22C). 병변은 고지방 식이와 본 화합물(HF + CCI)을 공급한 LDLR KO 마우스에서 하행 대동맥의 총 면적은 HF 식이(HF)를 공급한 마우스보다 작은 퍼센트를 차지했다. HF+CCI 그룹의 대부분의 마우스는 하행 대동맥의 총 면적의 1% 미만을 차지한다. 반면, HF 식이 그룹에서는 병변이 1,2 내지 8%의 면적을 차지한다.
RANKL을 제외하고 CD를 공급한 마우스에 비해 8주 동안 HF 식이를 공급한 마우스의 혈청에서 모든 사이토카인 수준의 증가가 관찰되었다 (도 23). RANKL의 수준은 8주간 HF 식이 후 감소하였다. CCI는 8주 동안 HF 식이를 공급한 LDLR KO 마우스의 혈청에서 이들 사이토카인 수준에 유의한 영향을 미치지 않았다.
토론
죽상경화증은 동맥벽의 만성 질환이다(1). 여러 염증 세포와 매개체가 이 질병의 시작 및 진행에 기여한다(2-4). 따라서, 이 질병의 염증 성분은 잠재적인 치료 표적이다. 본 발명자들은 LDLR KO 마우스 모델에서 죽상경화증의 진행 및/ 발병을 늦추는 콜히친 유도체 CCI의 능력을 테스트했다. 종합하면, 본 연구 결과에 따르면, CCI가 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 혈청 수준과 죽상경화성 플라크로 염색된 대동맥의 백분율 면적을 포함하여 이 만성 염증성 질환과 관련된 여러 변수를 감소시킨다는 점에서, 죽상경화증의 발병 및/또는 진행에 영향을 미칠 가능성이 있음을 나타낸다. 또한, 본 연구는 적어도 2개월 동안 마우스가 잘 견딘다는 추가 증거를 제공한다. CCI는 콜히친과 비교하여 독성이 낮고, 죽상경화증의 몇 가지 신뢰할 수 있는 지표를 감소시키는 경향이 있으므로, 인간에서 이 질병을 치료할 수 있는 유망한 치료 대안이 된다.
참고문헌
1. Shapiro, MD and Fazio, S. From Lipids to Inflammation. 2016. Circulation Research 118:732-749.
2. Hartwig, H; Silvestre R; Daemen M; Lutgens, E and Soehnlein, O. Neutrophils in atherosclerosis. Hamostaseologie 2015; 35: 121-127.
3. Stefan Mark Nidorf and Peter Lindsay Thompson. Why Colchicine Should Be Considered for Secondary Prevention of Atherosclerosis: An Overview. 2019. Clinical Therapeutics 41: 41-48.
4. Lin B, Pillinger M, Shah B, et al. Use of colchicine in atherosclerotic heart disease. 2018. Curr Res Integr Med 3(S1):2-4.

Claims (151)

  1. 염증 치료를 위한 화학식 I의 화합물:
    Figure pct00064

    여기서:
    Z는 O 또는 S이고;
    X1은 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹에서 선택되고;
    R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 치환 또는 비치환 이종 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리(carbocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로고리(heterocyclic) 그룹, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로방향족(heteroaromatic) 그룹에서 선택되며;
    이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머(tautomer), 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합.
  2. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 헤테로방향족 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로고리 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 할로알킬, 치환 또는 비치환 하이드록시알킬, 치환 또는 비치환 시아노알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬카보닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴, 알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-사이클로알킬, 알킬렌-O-헤테로사이클로알킬, 알킬렌-O-알킬렌-사이클로알킬, 또는 알킬렌-O-알킬렌-헤테로사이클로알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 치환 또는 비치환 C2-C6 알케닐, 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬카보닐, C1-C6 알킬렌-O-알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 또는 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 또는 치환 또는 비치환 알킬아릴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬, 또는 치환 또는 비치환 알킬아릴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 비치환 C1-C6 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제1항에 있어서, R2 및 R3는 각각 독립적으로 메틸, 에틸 또는 프로필에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R2 는 메틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R3는 에틸 또는 프로필인 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X1는 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹인 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제13항에 있어서, X1은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 또는 치환 또는 비치환 알키닐에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제14항에 있어서, X1은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제14항에 있어서, X1은 비치환 C1-C6 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제16항에 있어서, X1은 메틸 또는 에틸에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제17항에 있어서, X1은 메틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X1은 OR10이고, R10은 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종(heterogeneous) 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제19항에 있어서, R10은 치환 또는 비치환 알킬 그룹, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 방향족 그룹, 치환 또는 비치환 헤테로방향족 그룹, 치환 또는 비치환 탄소고리 그룹, 또는 치환 또는 비치환 헤테로고리 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 제19항에 있어서, R10은 치환 또는 비치환 알킬, CH2OH, 치환 또는 비치환 할로알킬, 치환 또는 비치환 하이드록시알킬, 치환 또는 비치환 시아노알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 치환 또는 비치환 알키닐, 치환 또는 비치환 사이클로알킬, 치환 또는 비치환 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 알킬헤테로사이클로알케닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 알킬아릴, 치환 또는 비치환 알킬헤테로아릴, 알킬렌-O-알킬, 알킬렌-O-사이클로알킬, 알킬렌-O-헤테로사이클로알킬, 알킬렌-O-알킬렌-사이클로알킬, 또는 알킬렌-O-알킬렌-헤테로사이클로알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 제19항에 있어서, R10은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 알케닐, 또는 치환 또는 비치환 알키닐에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 제19항에 있어서, R10은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬, 또는 치환 또는 비치환 C2-C6 알케닐, 또는 C2-C6 알키닐에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  24. 제19항에 있어서, R10은 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  25. 제19항에 있어서, R10은 치환 또는 비치환 C1-C6 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제19항에 있어서, R10은 비치환 C1-C6 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 제19항에 있어서, R10은 메틸 또는 에틸에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 제27항에 있어서, R10은 메틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, X1은 치환 또는 비치환 이종 그룹인 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 제29항에 있어서, X1은 -CR4R5R6에서 선택되고, R4, R5, 및 R6는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 탄화수소 그룹, 또는 치환 또는 비치환 이종 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  31. 제30항에 있어서, R4, R5, 및 R6는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 아미도 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  32. 제30항에 있어서, R4 및 R5는 각각 독립적으로 H, 또는 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되고, R6는 -NR(CO)CR7R8R9이며, 여기서 R은 H 및 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되고, R7, R8, 및 R9은 각각 독립적으로 H, 할로 그룹, 및 치환 또는 비치환 알킬에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  33. 제32항에 있어서, R7, R8, 및 R9은 플루오로 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  34. 제33항에 있어서, X1은 -CH2NH(CO)CF3인 것을 특징으로 하는 화합물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 O인 것을 특징으로 하는 화합물.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 S인 것을 특징으로 하는 화합물.
  37. 제1항에 있어서, 하기의 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00065
    ,
    이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합.
  38. 제1항에 있어서, 하기의 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00066
    ,
    이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합.
  39. 제1항에 있어서, 하기의 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00067
    ,
    이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합.
  40. 제1항에 있어서, 하기의 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00068
    ,
    이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합.
  41. 제1항에 있어서, 하기의 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00069
    ,
    이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합.
  42. 제1항에 있어서, 하기의 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
    Figure pct00070
    ,
    이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 수화물, 이의 용매화물, 이의 토토머, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 조합.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 I 및/또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 화합물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, C7에서의 배열이 S-배열인 것을 특징으로 하는 화합물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친(colchicine)-결합 부위에서 β-튜불린에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 β-튜불린은 β-VI, β-V, 및/또는 β-I인 것을 특징으로 하는 화합물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 β-튜불린은 β-VI인 것을 특징으로 하는 화합물.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친의 결합 에너지보다 작은 결합 에너지를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친보다 독성이 적은 것을 특징으로 하는 화합물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친에 비해 호중구를 보다 특이적으로 표적하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친보다 낮은 용량으로 세포내 칼슘 농도 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친보다 약 10배 이상 낮은 용량으로 세포내 칼슘 농도 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친보다 약 10배 내지 약 100배 낮은 용량으로 세포내 칼슘 농도 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 약 0.1 μM의 용량으로 세포내 칼슘 농도 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친보다 낮은 용량으로 염증매개체(inflammatory mediator)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친보다 약 10배 이상 낮은 용량으로 염증매개체의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  57. 제55항에 있어서, 상기 화합물은 콜히친보다 약 10배 내지 약 100배 낮은 용량으로 염증매개체의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 약 0.1 μM의 용량으로 염증매개체의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증매개체는 IL-8, IL-1, 초산화물(superoxide), 또는 이의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  60. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 세포내 칼슘 농도 및 염증매개체 생성 중 적어도 어느 하나의 억제와 관련하여 선형적(monotonic) 또는 비선형적(non-monotonic) 용량 반응을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 염증매개체는 IL-8, Il-1, 초산화물(superoxide) 생성, 또는 이의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 백혈구의 모집을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증은 염증 질환, 염증 상태, 염증 장애, 또는 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 염증은 호중구-유발 염증을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  65. 제64항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 가성통풍(pseudogout), 통풍, 심혈관 질환, 혈관염, 또는 이들의 조합과 관련된 염증인 것을 특징으로 하는 화합물.
  66. 제64항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 심혈관 질환과 관련된 것을 특징으로 하는 화합물.
  67. 제66항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증(coronary atherosclerosis)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  68. 제64항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 통풍과 관련된 것을 특징으로 하는 화합물.
  69. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 통풍 치료용인 것을 특징으로 하는 화합물.
  70. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화합물은 요산 일나트륨(MSU)-유도 염증에 대응하여 면역 기능의 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  71. 제70항에 있어서, 상기 면역 기능의 억제 효과는 세포내 칼슘 생성, IL-1 생성, IL-8 생성, 초산화물 생성, 또는 이들의 조합에서 선택되는 매개체를 통해 영향을 받는 것을 특징으로 하는 화합물.
  72. 제71항에 있어서, 상기 면역 기능은 호중구에 관한 것임을 특징으로 하는 화합물.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제 효과는 콜히친보다 더 강한 억제 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화합물.
  74. 제73항에 있어서, 상기 억제 효과는 콜히친보다 약 10배 이상 큰 것을 특징으로 하는 화합물.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제 효과는 약 0.1μM의 농도에서 발생하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  76. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 심혈관 질환 치료용인 것을 특징으로 하는 화합물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증인 것을 특징으로 하는 화합물.
  78. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 항-통풍제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 상기 항-통풍제는 비스테로이드 항염증제(NSAIDS), 관절내 글루코코르티코이드, 잔틴 산화효소 억제제, 재조합 비인간 우리카아제 효소, 요산 배설 촉진제, 요산뇨제, 또는 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 둘 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 치료용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  84. 제83항에 있어서, 상기 염증은 염증 질환, 염증 상태, 염증 장애, 또는 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 염증은 호중구-유발 염증을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  86. 제85항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 가성통풍, 통풍, 심혈관 질환, 혈관염, 또는 이들의 조합과 관련된 염증인 것을 특징으로 하는 조성물.
  87. 제85항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 심혈관 질환과 관련된 것을 특징으로 하는 조성물.
  88. 제87항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증인 것을 특징으로 하는 조성물.
  89. 제85항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 통풍과 관련된 것을 특징으로 하는 조성물.
  90. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 통풍 치료용인 것을 특징으로 하는 조성물.
  91. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물이 2 이상 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 화합물은 경구 및/또는 비경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 화합물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 염증을 치료하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 상기 조성물은 경구 및/또는 비경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제95항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증은 염증 질환, 염증 상태, 염증 장애, 또는 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제91항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증은 호중구-유발 염증을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 가성통풍, 통풍, 심혈관 질환, 혈관염, 또는 이들의 조합과 관련된 염증인 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제99항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 심혈관 질환과 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증인 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제99항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 통풍과 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제91항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 포유동물의 염증 치료를 위한 치료적 유효량의 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  106. 제105항에 있어서, 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물이 2 이상 존재하는 것을 특징으로 하는 용도.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 상기 화합물은 경구 및/또는 비경구로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
  108. 제105항 또는 제106항에 있어서, 상기 화합물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
  109. 포유동물의 염증 치료를 위한 치료적 유효량의 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  110. 제109항에 있어서, 상기 조성물은 경구 및/또는 비경구로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
  111. 제109항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
  112. 제105항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증은 염증 질환, 염증 상태, 염증 장애, 또는 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  113. 제105항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증은 호중구-유발 염증을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  114. 제113항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 가성통풍, 통풍, 심혈관 질환, 혈관염, 또는 이들의 조합과 관련된 염증인 것을 특징으로 하는 용도.
  115. 제113항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 심혈관 질환과 관련된 것을 특징으로 하는 용도.
  116. 제115항에 있어서, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 죽상경화증인 것을 특징으로 하는 용도.
  117. 제113항에 있어서, 상기 호중구-유발 염증은 통풍과 관련된 것을 특징으로 하는 용도.
  118. 제105항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 용도.
  119. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 통풍을 치료하는 방법.
  120. 제119항에 있어서, 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물이 2 이상 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  121. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 화합물은 경구 및/또는 비경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 제119항 또는 제120항에 있어서, 상기 화합물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 치료적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 통풍을 치료하는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 조성물은 경구 및/또는 비경구로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  125. 제123항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 제119항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제119항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통풍은 만성 통풍 및/또는 급성 통풍에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 제119항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 통풍의 치료는 하나 이상의 통풍 증상의 치료를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 하나 이상의 통풍 증상은 통풍 발작, 통풍결절(tophus) 형성, 통풍성 관절염, 통풍-관련 염증, 및/또는 통풍과 관련된 관절 파괴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 제128항에 있어서, 상기 하나 이상의 통풍 증상은 통풍성 염증 및/또는 염증과 관련된 통증에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 포유동물의 통풍 치료를 위한 치료적 유효량의 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  132. 제131항에 있어서, 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 따른 화합물이 2 이상 존재하는 것을 특징으로 하는 용도.
  133. 제131항 또는 제132항에 있어서, 상기 화합물은 경구 및/또는 비경구로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
  134. 제131항 또는 제132항에 있어서, 상기 화합물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
  135. 포유동물의 통풍 치료를 위한 치료적 유효량의 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  136. 제135항에 있어서, 상기 조성물은 경구 및/또는 비경구로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
  137. 제135항에 있어서, 상기 조성물은 정맥 내 및/또는 복강 내로 투여 가능한 것을 특징으로 하는 용도.
  138. 제131항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 용도.
  139. 제131항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 통풍은 만성 통풍 및/또는 급성 통풍에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  140. 제131항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 통풍의 치료는 하나 이상의 통풍 증상의 치료를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  141. 제140항에 있어서, 상기 하나 이상의 통풍 증상은 통풍 발작, 통풍결절 형성, 통풍성 관절염, 통풍-관련 염증, 및/또는 통풍과 관련된 관절 파괴에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  142. 제140항에 있어서, 상기 하나 이상의 통풍 증상은 통풍성 염증 및/또는 염증과 관련된 통증에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  143. βVI-튜불린 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 조혈세포 운동성 및/또는 모집을 감소시키는 방법
  144. 제143항에 있어서, 상기 βVI-튜불린 억제제는 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  145. 제143항 또는 제144항에 있어서, 상기 조혈세포는 호중구 및/또는 단핵구와 같은 백혈구인 것을 특징으로 하는 방법.
  146. βVI-튜불린 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 염증 치료 방법.
  147. 제146항에 있어서, 상기 βVI-튜불린 억제제는 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 제146항 또는 제147항에 있어서, 상기 염증은 백혈구 침윤과 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
  149. 제148항에 있어서, 상기 백혈구 침윤은 호중구 및/또는 단핵구의 침윤을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  150. 제146항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증은 통풍과 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 제146항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증은 죽상동맥경화증과 관련된 것을 특징으로 하는 방법.
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