KR20210006353A - 상피 세포 및 골수 세포 모두를 활성화시키는 tlr3 리간드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 TLR3 수용체를 발현하는 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 2개의 상보적 가닥을 갖고, 폴리 A의 적어도 하나의 블록 및 폴리 U의 상보적 블록을 포함하며, 각 가닥은 50 내지 200개의 염기, 바람직하게는 55 내지 200개의 염기의 길이를 갖는 것인 이중-가닥 RNA (dsRNA), 및 약학적으로 허용 가능한 비히클, 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 폴리 A의 적어도 하나의 블록을 포함하는 하나의 가닥 및 폴리 U의 상보적 블록을 포함하는 상보적 가닥을 포함하는 2개의 상보적 가닥, 및 가능하다면 A, U, G, I 또는 C 중 다른 뉴클레오티드와의 키메라 형태를 갖는 짧고 정의된 (short and defined) 이중-가닥 RNA (dsRNA)를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 TLR3 양성 암 치료에 사용하기 위한 조성물 및 관련 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 TLR3 리간드로 작용하고, 상피 세포 및 골수 세포 모두를 활성화시키는 dsRNA에 관한 것이다.
TLR3은 dsRNA의 결합을 통한 바이러스 감염 검출에 전념하는 것으로 보이는 엔도-리소좀에서 주로 발현되는 패턴 인식 수용체 (pattern recognition receptor)이다. 실제로 바이러스에 의해 게놈 물질 (dsRNA 바이러스) 또는 수명 주기의 중간체 (ssRNA 바이러스, DNA 바이러스)로 생성되는 dsRNA는 TLR3을 활성화시키는 것으로 나타났다. 더욱이, 조직 파괴 중에 유리된 몇몇 척추동물 내인성 dsRNA는 TLR3을 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, TLR3을 활성화시키는 합성 dsRNA가 디자인되었다. 이들은 폴리(I:C), 폴리(A:U) 및 이의 변이체 예컨대 폴리I:폴리C12U (Ampligen®)를 포함한다.
TLR3의 야생형 및 돌연변이체에 의한 TLR3-결합 분석 및 TLR3-의존성 신호전달 분석, dsRNA-결합 TLR3에 의한 결정학 연구 및 야생형 및 TLR3-/- 마우스에서 dsRNA 반응의 인 비보 (in vivo) 분석을 포함한, dsRNA를 사용한 광범위한 실험은 모두 TLR3을 활성화시키는데 필요한 구조적 특징을 정의하는데 기여하였다 (Botos, I. et al., Biochim . Biophys . Acta 1789, 667-674, 2009). TLR3에 대한 효능제 리간드는 다음과 같은 특징을 갖는 dsRNA이다: (1) 상기 dsRNA는 이노신을 포함할 수 있는, 비변형된 리보스로 구성되어야 함; (2) 정확한 서열이 중요한 것으로 보이지 않음; (3) 신호전달 유닛을 나타내는 동종이량체에서 TLR3의 세포외 도메인에 있는 RNA-결합 부위들 간 거리에 의해 대략 50 bp (48 Å)의 최소 길이가 부과되는 것으로 보임; (4) 줄기-루프 구조를 접어서 형성하는 단일-가닥 RNA가 또한 TLR3을 활성화시킬 수 있음; (5) dsRNA는 먼저 신호전달의 제1 단계를 나타내는 TLR3 이량체화를 유발하기 전에, 세포 내에서, 즉 스캐빈저 수용체 결합 (scavenger receptors binding)을 통해 효율적으로 내재화되어야 함. 인간의 TLR3에 매우 특이적인 것으로 보이는 폴리(A:U)와 대조적으로, 폴리(I:C)는 세포질 dsRNA 수용체들 RIG-I, MDA5 및 PKR에 결합 및 이를 활성화시킨다.
암 및 다른 질병에서 TLR3을 표적화하는 이점은 상피, 골수, 중간엽 및 내피 세포들을 포함하는 다양한 타입의 세포들의 조합된 활성화로 인해 발생할 가능성이 가장 높다. 면역 및 비-면역 인간 세포는 폴리(I:C)에 대한 반응에서 염증성 사이토카인 (cytokine)을 생성하거나 또는 생성하지 않는 것으로 나타났고, 이는 인간에서 TLR3 리간드 자체보다는 세포 타입에 의존하는 것으로 가정되었다.
TLR3에 대한 dsRNA를 포함하는 조성물은 상품화되어 있다. 예를 들어, 길이가 다른 dsRNA의 혼합물인 상용 폴리(A:U) 조성물이 존재하고, 상기 길이는 통상적으로 약 200 내지 8000개의 염기쌍을 갖는다.
본 발명의 목적은 골수 세포 및 상피 세포 모두를 활성화시키는데 효과적이어서, 암 세포의 사멸을 유도하는 짧은 dsRNA를 제조하는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 골수 세포를 활성화시키고, 상피암 (epithelial cancer) 세포의 사멸을 유발할 수 있는 이러한 짧은 dsRNA를 갖는 것이다.
다른 목적은 dsRNA 분자의 전부는 아닐지라고, 거의 전부가 미리 결정된 구성을 가지며, 활성을 가짐으로써, 결정되지 않은 혼합물보다 규제 기관의 요건을 더 쉽게 획득하고, 상기 dsRNA 용량을 향상시킬 수 있는 dsRNA 조성물을 제안하는 것이다.
또 다른 목적은 표적 세포에 침투시키기 위해 형질감염 제제 (transfection agent)를 반드시 필요로 하는 것은 아닌 dsRNA를 제안하는 것이다.
치료를 위한 새로운 임상 TLR3 리간드를 개발하기 위한 노력의 일환으로, 본 발명자들은 골수 세포를 활성화시키고 상피암 세포의 사멸을 유발하는 능력에 대해 정의된 dsRNA를 스크리닝하고, 이들 목적 및 다른 목적에 반응할 수 있는 dsRNA를 서술할 수 있었다.
본 발명은 폴리 A의 적어도 하나의 블록 또는 호모폴리머 및 폴리 U의 상보적 블록을 포함하는, 짧고 결정된 길이의 dsRNA, 구체적으로 각 가닥이 50 내지 200개의 뉴클레오티드 또는 염기를 갖는 dsRNA를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 각 가닥의 길이는 약 55 내지 약 100, 150 또는 200개의 염기, 특히 약 60 내지 약 70, 80, 90 또는 100개의 염기이다. 유리하게는, 상기 조성물 중의 모든 가닥 또는 실질적으로 모든 가닥은 미리 결정된 길이를 갖는다. 바람직하게, 상기 가닥 및 dsRNA는 합성이다.
합성은 짧고 결정된 길이의 dsRNA 가닥을 생성하는 기밀 방식 (privileged mode)이다. 본 발명의 dsRNA 가닥은 합성을 통해 수득되는, 합성 dsRNA 가닥일 수 있다. 관례적으로, 이와 같이 수득된 가닥 및 dsRNA는 합성에 적합하다. 다른 합성 방법이 본 출원에 개시되어 있다. 본 발명에 따른 가닥의 짧고 결정된 길이는 본원에서 예시된 바와 같이 아크릴아미드 겔 (acrylamide gel)에서 전기영동 (electrophoresis)과 같은 표준 방법에 의해 제어될 수 있다.
합성 방법은 본 발명의 짧고 정의된 dsRNA 가닥을 유리하게 생성할 수 있게 한다. 이들 방법은 원하는 정확한 길이를 가진 dsRNA 가닥을 유리하게 생성할 수 있게 한다. 이들 방법은 모든 가닥이 동일한 길이를 갖고 및/또는 모든 dsRNA가 동일한 길이를 가진 가닥으로 이루어진 조성물을 유리하게 생성할 수 있게 한다. 그러나, 일부 가닥들의 길이의 소정의 제한된 변형이 허용 가능하고, 이는 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있으며, 상기 가닥들은 합성에 의해 또는 다른 방법에 의해 생성된다. 특히, 이러한 변형이 상기 조성물의 기능 또는 효능을 실질적으로 변화시키지 않는 한, 이러한 변형은 승인되고 포함된다. 일 구체예에서, 상기 변형 조성물 (variant composition)은 여전히 골수 세포를 활성화시키고, 상피암 세포의 사멸을 유발한다. 다른 구체예에서, 상기 변형 조성물은, 모든 가닥이 동일한 길이를 갖고 및/또는 모든 dsRNA가 동일한 길이를 가진 가닥으로 이루어진 조성물과 실질적으로 동일한 수준으로, 여전히 골수 세포를 활성화시키고, 상피암 세포의 사멸을 유발한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 결정된 길이를 가진 가닥을 유의하고 효율적인 비율로, 특히 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5% 이상 또는 약 100%의 비율로 포함한다. 상기 조성물은 상기 퍼센트를 포함한, 이러한 유의하고 효율적인 비율의 결정된 길이를 가진 가닥으로 필수적으로 구성된 dsRNA 활성 성분 (active principle)을 포함한다고 할 수 있다.
상기 dsRNA에서, 폴리 A 및 폴리 U 블록은 A, U, G, I, C, 폴리 A, 폴리 U, 폴리 G, 폴리 I 또는 폴리 C 중 하나 이상의 염기, 및 상보적 뉴클레오티드 또는 블록에 조합될 수 있다. 하나의 가닥 (그 다음에는 상보적 가닥이 있음)에 대한 예시되는 구조는 하기와 같다: 폴리 A - 폴리 I, 폴리 A - 폴리 C, 폴리 I - 폴리 A, 폴리 C - 폴리 A, 폴리 I - 폴리 A - 폴리 I, 폴리 C - 폴리 A - 폴리 C, 폴리 A - 폴리 I - 폴리 A, 폴리 A - 폴리 C - 폴리 A.
"호모폴리머 (Homopolymer)"는 적어도 2개의 동일하고 연속적인 염기의 서열을 의미한다.
따라서, 폴리 A/I 또는 A/C 및 폴리 U/C 또는 U/I의 블록으로 이루어진 상보적 가닥이 포함된다. 이들은 또한, 폴리 A/I : 폴리 U/C 또는 폴리 A/C : 폴리 U/I로 지정될 수 있다. 특징에 따르면, 폴리 A/I 또는 폴리 U/C 가닥은 50개 초과 내지 약 200개의 염기의 미리 결정된 길이를 갖는다. 바람직하게, 상기 가닥의 길이는 약 55 내지 약 200개의 염기, 특히 약 60 내지 약 100개의 염기이다.
상기 가닥은 구체적으로 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90개의 A 또는 U를 각각 포함하는 A 또는 U의 하나 이상의 블록 (바람직하게는 1개 또는 2개)을 포함할 수 있고; 이러한 블록은 선택적으로 A (Q = A인 경우)/U (Q = A인 경우), G, I 및 C 중 다른 염기를 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 미만으로 함유할 수 있다.
본 발명은 구체적으로, 하기 식 (I) (하나의 가닥만 표시됨)에 따른, A 또는 U의 적어도 하나의 블록을 포함하는 적어도 하나의 가닥 및 상보적 가닥 (따라서, 상보적 블록 U 또는 A를 가짐)을 갖는, 50bp 내지 약 200bp (최선으로는 약 55 내지 약 100, 150 또는 200, 바람직하게는 약 60 내지 약 120, 바람직하게는 약 70 내지 약 100, 예컨대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90)로 이루어진 길이의 dsRNA를 사용하고, 상기 dsRNA는 A 및 U의 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱더 바람직하게는 적어도 70% 또는 75% (또는 심지어 적어도 80, 85, 90 또는 95%)를 포함하며:
(I)
[P]a [Q]b [R]c
- Q는 A 또는 U의 호모폴리머를 나타내고, b는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 초과의 정수이며; 이러한 블록은 선택적으로 A (Q = A인 경우)/U (Q = A인 경우), G, I 및 C 중 다른 염기를 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 미만으로 함유할 수 있고;
- a, b 및 c는 다수의 염기 또는 뉴클레오티드를 나타내므로, a + b + c는 상기 가닥 또는 dsRNA의 길이를 나타내며;
- a 및 c는 독립적으로 0, 또는 a + b + c = 50 내지 200, 바람직하게는 60 내지 120, 더욱 바람직하게는 70 내지 100이 되는 정수일 수 있고; a, b 및 c는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며;
- a = 1이면, Q = A인 경우, P는 U, G, I 및 C 중 하나의 염기로 이루어지고; 상보성 (complementarity)의 결과로서, Q = U인 경우, P는 A, G, I 및 C 중 하나의 염기로 이루어지며;
- a > 1이면, P는 A, U, G, I 및 C 중 적어도 1개 또는 2개의 염기로 이루어지는 것으로서, A, U, G, I 및 C 중 적어도 2개의 무작위 조합, A, U, G, I 및 C 중 염기의 1개의 블록, A, U, G, I 및 C 중 상이한 염기의 적어도 2개의 블록, 또는 A, U, G, I 및 C 중 염기의 적어도 1개의 블록과 A, U, G, I 및 C 중 적어도 하나의 다른 염기의 혼합물의 구성 중 하나이고;
- c = 1이면, R = A인 경우, R은 U, G, I 및 C 중 하나의 염기로 이루어지고; 상보성의 결과로서, R = U인 경우, P는 A, G, I 및 C 중 하나의 염기로 이루어지며;
- c > 1이면, R은 A, U, G, I 및 C 중 적어도 1개 또는 2개의 염기로 이루어지는 것으로서, A, U, G, I 및 C 중 적어도 2개의 무작위 조합, A, U, G, I 및 C 중 염기의 1개의 블록, A, U, G, I 및 C 중 상이한 염기의 적어도 2개의 블록, 또는 A, U, G, I 및 C 중 염기의 적어도 1개의 블록과 A, U, G, I 및 C 중 적어도 하나의 다른 염기의 혼합물의 구성 중 하나이고;
- P 및 R은 염기 및/또는 서열 길이의 측면에서 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
일 변형에서, 식 (I)에서, b는 적어도 10의 정수이다.
식 (I)에서, 여기에서 Q = A 또는 U, b는 특히 약 35 내지 약 200, 특히 약 50 내지 약 200, 최선으로는 약 55 내지 약 100, 150 또는 200, 바람직하게는 약 60 내지 약 120, 바람직하게는 약 70 내지 약 100, 예컨대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90일 수 있다. 폴리 A의 블록은 U, G, I 및 C 중 다른 염기를 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 미만으로 함유할 수 있다. 폴리 U의 블록은 이에 대해 상보적이며, 상응하는 A, G, I 및/또는 C를 포함할 것이다.
상기 식 (I)의 일 구체예 및 하기 그의 구체예에서, 폴리 A의 블록 또는 폴리 A의 블록들은 U, G, I 및 C 중 다른 염기를 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 미만으로 함유할 수 있다. 따라서, 해당하는 폴리 U의 블록 또는 폴리 U의 블록들은 상보적이고, A, G, I 중 페어링 염기 (pairing bases)를 가질 것이다.
일 구체예에서, 상기 식 (I)은 폴리 A:폴리 U를 형성한다. 이 경우, 예를 들어, a = c = 0, Q = A 및 b가 적어도 50, 또는 적어도 약 50, 특히 약 50 내지 약 200, 최선으로는 약 55 내지 약 100, 150 또는 200, 바람직하게는 약 60 내지 약 120, 바람직하게는 약 70 내지 약 100, 예컨대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90을 갖는 것으로 충분하다.
본 발명은 또한 A, U, I, G, C의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 O-메틸화 뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 등의 사용을 포함한다.
다른 구체예에서, 상기 식 (I)은 폴리 P-폴리 A-폴리 R을 형성한다. 상보적 가닥은 폴리 P'-폴리 U-폴리 R'이고, 여기서 P' 및 R'는 상기 위치에서 각각 P 또는 R의 상보적 염기 또는 염기들이다.
다른 구체예에서, 상기 식 (I)은 폴리 A-폴리 X-폴리 A를 형성하고, 상기 X는 U, G, I, C, 폴리 U, 폴리 G, 폴리 I, 폴리 C 또는 이들의 임의의 조합 및 가능하다면 A 또는 폴리 A 삽입을 나타낼 수 있다. 상보적 가닥은 폴리 U-폴리 Y-폴리 U일 것이고, Y는 상기 위치에서 X의 상보적 염기 또는 염기들이다.
다른 구체예에서, 상기 식 (I)은 폴리 P-폴리 A를 형성한다. 상보적 가닥은 폴리 P'-폴리 U일 것이고, P'는 상기 위치에서 P의 상보적 염기 또는 염기들이다.
다른 구체예에서, 상기 식 (I)은 폴리 A-폴리 R을 형성한다. 상보적 가닥은 폴리 U-폴리 R'일 것이고, R'는 상기 위치에서 R의 상보적 염기 또는 염기들이다.
하기 구체예에서, 식들, a, b 및 c는 상기와 동일한 의미를 가질 수 있다. A 및 U는 염기 A 및 U를 나타낸다.
제1 구체예에서, 상기 dsRNA는 식 (II)을 갖는다:
[A]b
[U]b
특히, b = 50 내지 200, 최선으로는 약 55 내지 약 100, 150 또는 200, 바람직하게는 약 60 내지 약 120, 바람직하게는 약 70 내지 약 100, 예컨대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90.
제2 구체예에서, 상기 dsRNA는 식 (III)을 갖는다:
[P]a [A]b [R]c
[Y]a [U]b [Z]c
P 및 R은 독립적으로 G, I 및/또는 C 중에서 선택되고, Y 및 Z는 상보적 염기이다.
특히,
b = 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대, 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
a 및 c는 독립적으로 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40이다.
특히,
b = 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
a 및 c는 독립적으로 약 5 내지 약 50, 특히 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40이다.
특히,
b = 10 내지 100 사이의 정수이고,
a 및 c는 독립적으로 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40이다.
특히,
b = 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
a 및 c는 독립적으로 약 10 내지 약 50이다.
제3 구체예에서, 상기 dsRNA는 식 (IV)을 갖는다:
[A]b [R]c
[U]b [Z]c
R은 G, I 및/또는 C 중에서 선택되고, Z는 상보적 염기이다.
특히,
b = 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
c = 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40, 바람직하게는 약 30 내지 약 40, 예컨대 약 35, 약 40, 약 45.
특히,
b = 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
c = 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40, 바람직하게는 약 30 내지 약 40, 예컨대 약 35, 약 40, 약 45.
특히,
b = 10 내지 100, 또는 약 35 내지 약 100 사이의 정수이고,
c = 약 30 내지 약 50, 바람직하게는 약 30 내지 약 40, 예컨대 약 35, 약 40, 약 45.
특히,
b = 10, 15, 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
c = 약 10 내지 약 50.
제4 구체예에서, 상기 dsRNA는 식 (V)을 갖는다:
[P]a [A]b
[Y]a [U]b
P는 G, I 및/또는 C 중에서 선택되고, Y는 상보적 염기이다.
특히,
b = 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
a = 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40, 바람직하게는 약 30 내지 약 40, 예컨대 약 35, 약 40, 약 45.
특히,
b = 10 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
a = 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40, 바람직하게는 약 30 내지 약 40, 예컨대 약 35, 약 40, 약 45.
특히,
b = 10 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100 사이의 정수이고,
a = 약 30 내지 약 50, 바람직하게는 약 30 내지 약 40, 예컨대 약 35, 약 40, 약 45.
특히,
b = 10 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
a = 약 10 내지 약 50.
일 구체예에서, 상기 dsRNA는 식 (VI)을 갖는다:
[P]a [A]b [R]c
[Y]a [U]b [Z]c
P 및 R은 독립적으로 I 및 C 중에서 선택되고, Y 및 Z는 상보적 염기이고,
b = 약 20, 25 또는 30 내지 약 100 사이의 정수이며,
a 또는 c 중 하나는 0일 수 있고, a 및 c는 동시에 0은 아니며, 약 10 내지 약 50이다.
이들 식 (II), (III), (IV), (V), (VI)의 일 구체예에서, 폴리 A의 블록 또는 호모폴리머 또는 폴리 A의 블록들 또는 호모폴리머들은 U, G, I 및 C 중 다른 염기를 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 미만으로 함유할 수 있다. 물론 U의 상보적 블록(들)은 상보적 염기를 통합할 것이다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 조성물은 폴리 A/I 가닥 및 폴리 U/C 가닥을 포함하고, 상기 가닥들 모두는 50개 초과 내지 약 200개의 염기의 동일한 미리 결정된 길이를 갖는다. 바람직하게, 상기 가닥들 모두의 길이는 약 55 내지 약 200개의 염기, 특히 약 60 내지 약 100개의 염기이다. 예를 들어, 상기 가닥들 모두는 각각 약 60, 70, 80, 90 또는 100개의 염기를 갖는다.
용어 "이중-가닥 (double-stranded)"은 리보뉴클레오티드가 상보적 리보뉴클레오티드에 수소 결합하여 (염기쌍을 이룸) 이중-가닥 구조를 형성하는 부분을 의미한다. 이는 상기 가닥들 모두가 쌍을 이루는 중첩이라 할 수 있다. 바람직하게, 전체 가닥들이 쌍을 이룬다 (상보적 가닥들의 100%가 쌍을 이룸). 그러나 본 발명은 가닥 길이의 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.5%가 쌍을 이룬 (이중-가닥 형태) dsRNA를 포함한다. 동일한 조성물에서, 다양한 %로 쌍을 이룬 dsRNA를 가질 수 있다. 상기 dsRNA TLR3 효능제의 몇 퍼센트가 이중-가닥 형태로 존재하는지의 결정은 염기쌍을 이룬 뉴클레오티드의 수를 분자 중 총 뉴클레오티드의 수로 나눔으로써 달성된다. 따라서, 3' 및 5' 말단 모두에 2개의 뉴클레오티드 오버행 (overhangs)을 함유하는 21개의 염기쌍 분자는 염기쌍을 이룬 42개의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 못한 4개의 뉴클레오티드를 갖게 되어, 이는 42/46 또는 91.3%가 이중-가닥 또는 쌍을 이룬다.
dsRNA 배치 (batch)의 적합성 (conformity)은 알려진 수단에 의해 제어될 수 있다. 아크릴아미드 겔을 사용한 실시예 1 및 10에 기재된 방법이 일례이다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 dsRNA가 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5% 초과로 쌍을 이루거나 또는 완전히 (약 100%) 쌍을 이룬 이러한 dsRNA의 세트를 포함하고, 예컨대 상기 dsRNA는 폴리 A/I 가닥 및 폴리 U/C 가닥을 포함하며, 상기 가닥들 모두는 50개 초과 내지 약 200개의 염기의 동일한 미리 결정된 길이를 갖고, 바람직하게, 상기 가닥들 모두의 길이는 약 55 내지 약 200개의 염기, 특히 약 60 내지 약 100개의 염기이다. 예를 들어, 상기 가닥들 모두는 각각 약 60, 70, 80, 90 또는 100개의 염기를 갖는다.
상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 비히클, 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 무균 (sterile)이다.
본 발명에서, 용어 "포함하다 (comprise)"는 "필수적으로 구성되다 (consist essentially of)" 또는 "구성되다 (consist of)"로 대체될 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 약물로서의 조성물이다.
본 발명의 다른 목적은 TLR3 수용체를 발현하는 인간 또는 동물의 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 조성물이다.
본 발명의 다른 목적은 약물로서 사용하기 위한 조성물이다.
다른 목적은 TLR3 수용체를 발현하는 인간 또는 동물의 암 치료용 약물의 제조를 위한 조성물의 용도이다.
상기 조성물 중에 함유된 dsRNA는 TLR3 수용체의 효능제로서 제공된다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 인간 또는 동물의 골수 세포에서 염증을 유도한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 예를 들어, 인간 또는 동물의 골수 세포에 의한 TNF-알파 및/또는 타입 I 인터페론의 생성을 유도한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 상피암 세포의 사멸을 유발한다.
일 구체예에서, 상기 조성물은 염증 및 암세포 사멸을 모두 유도한다.
본 발명의 다른 목적은 인간 또는 동물의 골수 세포를 활성화, 특히 TNF-알파 생성 및 ISRE-리포터 유전자 활성화, 및 상피암 세포의 사멸을 유발하는 약물로서의 조성물이다.
본 발명의 다른 목적은 골수 세포 (마크로파지 및 수지상 세포)에 의해 발현되는 TLR3을 특이적으로 활성화하고, 염증성 사이토카인의 분비를 유도하며, 염증의 TLR3-의존성 활성화 및 인간 또는 포유동물의 암세포의 사멸을 유발하는 약물로서의 조성물이다.
다른 목적은 TLR3을 발현하는 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 dsRNA 및 화학요법제를 포함하는 약학적 조성물이고, 여기서 본 발명에 따른 dsRNA 및 화학요법제는 포유동물 또는 인간에게 동시, 개별적 또는 순차적으로 투여된다.
본 발명의 다른 목적은 암 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 골수 세포를 활성화한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 골수 세포에 의한 TNF-알파의 생성을 유도한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 TLR3 다운스트림의 NF-Kb- 및 ISRE-의존성 신호전달 경로를 유발한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 상피암 세포의 사멸을 유발한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 특히 TNF-알파 생성과 함께 골수 세포를 활성화하고, 상피암 세포의 사멸을 유발한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 골수 세포 (마크로파지 및 수지상 세포)에 의해 발현된 TLR3을 특이적으로 활성화시켜서, 염증성 사이토카인의 분비를 유도하고, TLR3-의존성 염증 및 인간 또는 포유동물의 암세포의 사멸을 유발한다.
본 발명자들은 RAW 마우스 마크로파지 세포주에 의한 TNF-알파의 생성을 유발하는 능력에 대해 다양한 염기 조성물, 2개의 가닥 상에 뉴클레오티드의 분포 및 서열들을 사용하여 일련의 합성 dsRNA를 스크리닝하였다. 시험된 처음 47개의 dsRNA의 서열은 하기 표 1에 제시되어 있다. 천연 아크릴아미드 겔에서 상용 폴리(A:U) 및 9개의 서열 345, 397, 398, 415, 418, 405, 411, 412, 413의 분석은, 상이한 길이들을 갖는 dsRNA의 혼합물인 상용 폴리(A:U)와는 반대로, 각 합성 50bp dsRNA에 대해 예상되는 크기로 단일 주요 밴드가 검출 가능하다는 것을 보여 주었다 (도 1). 상기 47개의 합성 dsRNA가 마우스 마크로파지 Raw 세포에 의한 TNF-알파의 생성을 활성화하는 능력을 시험했을 때, 효과적이지는 않았지만, 50bp 폴리(A:U) 서열 (이후 서열 412로 명명) (도 2)은 상용 고분자량의 폴리(A:U) 만큼 효과적이었다. 따라서, 서열 412는 마크로파지에 의해 효과적으로 내재화되었고, TLR3 다운스트림의 NF-Kb 신호전달 경로를 유발할 수 있었다. 놀랍게도, 50bp 폴리(A:U)의 A 및 U가 2개의 가닥 상에 분포되었을 때 (서열 413), TNF-알파 분비는 관찰되지 않았다. 예기치 않게, 50bp 폴리(I:C) (서열 411)는 TNF-알파 생성을 유발할 수 없었다.
본 발명자들은 다음에 TLR3 WT 및 TLR3 KO 인간 비-소세포암 상피 세포 NCI-H292의 사멸을 유발하는 서열 412의 능력을 평가하였다. 형질감염 시약이 없는 경우, 서열 412는 염증 반응 (도 3)이나 NCI-H292 세포의 사멸 (도 4)을 활성화할 수 없다. 그러므로 마크로파지와는 대조적으로, 서열 412는 내재화되지 않았거나, 또는 NF-kB TLR3 신호전달 경로를 활성화할 수도 상피암 세포를 사멸시킬 수도 없었다.
그 다음에 70bp (서열 432) 및 90bp (서열 452)의 폴리(A:U)가 사용되었다. 다시, 이들 합성 서열 모두는 천연 폴리아크릴아미드 겔에서 분석했을 때 단일 주요 밴드를 나타냈다 (도 5). 서열 432 및 452는, TNF-알파의 생성 (도 6) 및 ISRE-루시퍼라제 리포터 유전자의 활성화 (도 7)에 의해 예시된 바와 같이 Raw 세포의 염증 반응을 유발하는데, 서열 412 만큼 효과적이었다. 더욱이, 서열 432 및 452는 형질감염 시약이 없이, TLR3-의존성 염증 (도 8) 및 인간 암세포 NCI-H292의 아폽토시스 반응 (도 9)을 예기치 않게 유발하였다.
본 발명자들은 60bp (서열 422) 및 80bp (서열 442)의 폴리(A:U), 3개의 키메라 70bp 폴리 A/I:U/C: 10개의 폴리(I:C) 그 다음에 50개의 폴리(A:U) 그 다음에 10개의 폴리(I:C)의 서열 (서열 I10A50I10) (532), 35개의 폴리(A:U) 그 다음에 35개의 폴리(I:C)의 서열 (서열 A35I35) (533), 10개의 폴리(A:U) 그 다음에 50개의 폴리(I:C) 그 다음에 10개의 폴리(A:U)의 서열 (서열 A10I50A10) (534), 및 70 pb 폴리(I:C)의 서열 (535)을 추가로 시험하였다 (표 2). 다시, 천연 아크릴아미드 겔은 각 합성 dsRNA에 대해 예상되는 크기의 단일 주요 밴드를 보여준다 (도 10).
하기를 관찰하였다: (1) 70bp의 키메라 532 및 533이 Raw 세포에 의한 mTNFa의 분비를 유도하는데 가장 강력했음 (도 11), (2) 이들은 NCI-H292 세포에 의한 IL-6의 분비를 유발하는데 매우 효과적이었음 (도 12); (3) 또한, 이들은 NCI-H292 세포를 사멸시키는데 70bp 폴리(A:U) (432) 만큼 효과적이었음 (도 13). 주목할만한 것은 70bp 폴리(I:C) (535)나 I:C-풍부 키메라 70bp dsRNA (534) 모두 Raw 세포에 의한 TNF-알파의 분비를 유의하게 활성화시키지 못했다 (도 11).
따라서, 본 발명에 따른 잘 정의된 합성 폴리(A:U), 예컨대 70bp 및 80bp, 및 70bp A:U-풍부 키메라 서열 예컨대 532 및 533은 골수 세포를 활성화하여 염증성 사이토카인의 분비를 유도하고 염증의 TLR3-의존성 활성화 및 암세포의 사멸을 유발하는 독특한 능력을 갖는다.
dsRNA 422, 432, 442, 452, 532 및 533은 본 발명에 따른 dsRNA의 바람직한 예들이다. 다른 예는 하기와 같다 (상보적 가닥 C 또는 I, 각각 U 또는 A를 가짐):
5' (I)10 - (U)50 - (I)10 3'
5' (A)60 - (I)10 3'
5' (A)50 - (I)20 3'
5' (A)20 - (I)50 3'
5' (I)5 - (A)60 - (I)5 3'
5' (I)15 - (A)40 - (I)15 3'
5' (I)20 - (A)30 - (I)20 3'
5' (I)25 - (A)20 - (I)25 3'
5' (I)5 - (A)50 - (I)15 3'
5' (I)13 - (A)64 - (I)13 3'
5' (I)10 - (A)70 - (I)10 3'
다른 예는 하기와 같다 (상보적 가닥 C 또는 I, 각각 U 또는 A를 가짐):
5' (A)10 - (I)60 3'
5' (I)30 - (A)10 - (I)30 3'
따라서, 본 발명은 상기 조성물 중에 함유된 dsRNA의 고유한 집단으로서 특정 dsRNA들 중 하나를, 유의하고 효과적인 비율로, 특히 상기 조성물 중에 포함된 전체 dsRNA의 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.5 이상의 비율로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
정의
"TLR3", "TLR3 단백질" 및 "TLR3 수용체"는 상호 교환적으로 사용되고, 본원에서 Toll-유사 수용체 (Toll-like receptor: TLR) 패밀리의 구성원인 Toll 유사 수용체 3을 지칭하기 위해 사용된다. 이의 아미노산 서열은 NCBI 유전자 ID 7098로 기재되어 있다. Toll 유사 수용체 3은 병원체 인식과 선천성 면역의 활성화에 근본적인 역할을 하는 Toll-유사 수용체 (TLR) 패밀리의 구성원이다. 이 수용체는 태반 및 췌장에서 가장 풍부하게 발현되고, 백혈구의 수지상 부분집단으로 제한된다. 이는 바이러스 감염과 관련된 dsRNA를 인식하고, NF-κB의 활성화 및 타입 I 인터페론의 생성을 유도한다.
"암 (cancer)"은 체내 비정상 세포의 성장, 분열 또는 증식을 의미한다. 특히, TLR3을 발현하는 암이 포함된다. 암세포에서 TLR3 발현의 결정은 당업자의 능력 범위 내에 있고, 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 정량적 PCR (예를 들어, Roche Molecular Diagnostics의 LightCycler® System 사용) 등과 같이, 당업자가 이용 가능한 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 특히, 본 발명에 의해 포함되는 암은 하기로부터 선택된다: 상피암 예컨대 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 간암종, 신경모세포종 (neuroblastoma), 두경부암, 난소암, 신장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 췌장암, 식도암, 위암, 소장암, 결장암 또는 흑색종 암 및 중간엽암 예컨대 중피종 또는 육종 암, 보다 구체적으로 비-소세포 폐암.
본원에서 사용되는, 용어 "대상 (subject)" 또는 "환자 (patient)"는 포유동물, 동물 또는 인간, 특히 인간과 같은 온혈 동물을 지칭하고, 이들은 본원에 기재된 하나 이상의 질병 및 병태에 걸리거나, 또는 이에 걸릴 가능성이 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "치료하다", "치료하는", "치료된" 또는 "치료"는 증상을 제거하거나 또는 감소시키는 것이 목적인 요법적 치료 (therapeutic treatment)를 지칭한다. 유익하거나 또는 원하는 임상 결과에는 증상의 제거, 증상의 완화, 병태 정도의 감소, 병태의 안정화 (즉, 악화되지 않는) 상태, 병태 진행의 지연 또는 서행, 질병 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상의 발병, 재발 또는 확산의 예방을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 소정의 구체예에서, 상기 용어는 증상의 발병 전에 본원에 제공된 화합물로 치료 또는 이의 투여를 지칭한다. 상기 용어는 특정 질병의 증상의 억제 또는 감소를 포함한다. 특히 질병의 가족력이 있는 대상은 소정의 구체예에서 치료 요법에 대한 후보자이다. 또한, 특정 질병에 대한 유전적 성향이 나타난 대상은 소정의 구체예에서 치료 요법에 대한 후보자이다. 또한, 증상이 재발한 병력이 있는 대상은 치료에 대한 잠재적인 후보자이다. 이와 관련하여, 용어 "치료"는 용어 "예방적 치료 (prophylactic treatment)"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본원에 기재된 질병 및 병태의 치료를 필요로 하는 대상의 식별은 당업자의 능력 및 지식 내에 있다. 당 분야의 임상 기술자는 임상 시험, 신체 검사 및 병력/가족력을 사용하여 이러한 치료가 필요한 대상을 쉽게 식별할 수 있다.
본원에서 사용되는, "약학적으로 허용 가능한 부형제 (pharmaceutically acceptable excipient)"는 포유동물, 특히 인간에게 적절하게 투여될 때, 유해, 알레르기 또는 다른 비정상적인 반응을 일으키지 않는 분자 실재물 및 조성물을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 모든 타입의 제제화 보조제를 지칭한다.
본 개시내용의 목적을 위해, 동일 시간에 (예: 동시에) 투여하는 것은 약물들을 동일 제제 또는 별도의 제제로 함께 투여하는 것을 의미하고, 상기 투여는 몇 분 내지 몇 시간 간격일 수 있지만, 1일을 초과하지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 다른 시간에 (예: 순차적으로) 투여하는 것은 병용 요법의 약물들을 수 시간 내지 수일, 수주 내지 심지어 수개월 간격으로 투여하는 것을 의미한다. 그러므로, 소정의 구체예에서, 치료를 받은 대상에서 약물들 모두를 조합하여 치료 효과가 발생하는 한, 병용 요법을 받는 대상에게 동일 시간에 (예: 동시에) 또는 다른 시간에 (예: 동일자 또는 상이한 일자에, 임의의 순서로, 순차적으로) 약물 모두를 투여받을 수 있다. 일부 구체예에서, 약물들의 조합은 1회 투여를 위해 동시에 제공될 것이지만, 다른 투여는 동일자 또는 상이한 일자에, 임의의 순서로, 순차적 투여를 포함할 것이다. 2개의 약물이 동시에 투여되는 경우, 이들은 각각이 조합의 각 약물을 포함하는, 별개의 약학적 조성물로서 투여될 수 있거나, 또는 이들 약물들 모두를 포함하는 단일 약학적 조성물로서 투여될 수 있다.
TLR3 효능제 제제 및 전달 시스템
TLR3 효능제는 반대 지시가 없는 한, 본 문헌에서 본 발명에 따른 dsRNA를 의미한다.
바람직하게, 상기 TLR3 효능제는 약학적으로 허용 가능한 조성물로 제제화된다. 본원에 기재된 약학적으로 허용 가능한 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트 및/또는 비히클을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트 및 비히클은 이온교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 버퍼 물질, 에컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해물, 예컨대 프로타민 설페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트, 포타슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 (wool fat)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 약학적 조성물은 경구, 직장, 비강, 국소 (협측 및 설하 포함), 질내 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 및 피부내 포함) 투여에 적합한 것들을 포함한다. 소정의 구체예에서, 본원의 식의 화합물이 경피로 투여된다 (예: 경피 패치 또는 이온영동 (iontophoretic) 기술을 사용). 다른 제제는 편리하게 단위 제형, 예컨대 정제 및 서방형 캡슐, 및 리포솜으로 제시될 수 있고, 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA (17th ed. 1985)를 참조한다. 이러한 제조 방법은 하나 이상의 보조 성분들을 구성하는 담체와 같은 성분들을 투여될 분자와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 조성물은 활성 성분을 액체 담체, 리포솜 또는 나노입자를 포함하는 미분된 고체 담체 또는 모두와 균일하고 친밀하게 결합시킨 다음, 필요한 경우 산물을 성형함으로써 제조된다.
소정의 구체예에서, 상기 조성물은 종양에 투여된다. 이는 예를 들어, 종양 부위와의 장기간 접촉을 위한 겔 또는 패치와 같은 적절한 제제를 사용하여 표면에 적용될 수 있거나, 또는 예를 들어, 임플란트를 사용하여 종양 덩어리 내에 적용될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 주사 가능한 조성물을 사용하여 종양에 주사될 수 있다.
소정의 바람직한 구체예에서, 상기 화합물은 경구로 투여된다. 경구 투여에 적합한 조성물은, 미리 결정된 양의 활성 성분을 각각 함유하는 캡슐, 사세 또는 정제와 같은 개별 유닛으로; 분말 또는 과립으로; 수성 액체 또는 비-수성 액체의 용액 또는 현탁액으로; 또는 수중유형 액체 에멀젼 또는 유중수형 액체 에멀젼으로 제시되거나, 또는 리포솜 중에 및 볼루스 등으로 패킹될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐은 이러한 현탁액을 함유하는데 유용할 수 있고, 이는 화합물의 흡수 속도를 유익하게 증가시킬 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 이상의 보조 성분들과 함께, 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 적절한 기계에서, 선택적으로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 표면 활성제 또는 분산제와 혼합된, 자유-유동 형태 예컨대 분말 또는 과립의 활성 성분을 압축하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤시킨 분말 화합물의 혼합물을 적절한 기계에서 성형함으로써 제조될 수 있다. 상기 정제는 선택적으로 코팅 또는 스코어링 (scoring)될 수 있고, 그 안의 활성 성분의 지연 또는 제어 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 약학적으로 활성인 성분들, 예컨대 본원에 기재된 것 및 당 분야에 알려져 있는 다른 화합물들의 지연 또는 제어 방출 조성물을 제제화하는 방법은 당 분야에 알려져 있고, 몇몇 등록된 미국 특허에 기재되어 있으며, 이들은 US 4,369,172 및 US 4,842,866을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 화합물을 장 (intestine)으로 전달하기 위해 코팅이 사용될 수 있다 (예: U.S. 특허 제6,638,534호, 제5,217,720호, 및 제6,569,457호, 제6,461,631호, 제6,528,080호, 제6,800,663호 참조).
경구 사용을 위한 정제의 경우에, 통상적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐 형태로 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액이 경구로 투여되는 경우, 상기 활성 성분은 유화제 및/또는 현탁화제와 조합된다. 원하는 경우, 소정의 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다. 계면활성제 예컨대 소듐 라우릴 설페이트는 용해 및 흡수를 증진시키는데 유용할 수 있다.
소정의 구체예에서, 상기 조성물은 다른 분자 예컨대 항체, 다른 단백질 또는 펩티드, 지질 또는 당, 또는 다른 수용체 리간드와 공유적 또는 비-공유적으로 연결된다.
경구 투여에 적합한 조성물은 풍미 기반, 통상적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트 중에 성분들을 포함하는 로젠지 (lozenges); 및 비활성 기반 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 중에 활성 성분을 포함하는 파스틸 (pastilles)을 포함한다.
소정의 구체예에서, 상기 조성물은 나노입자와 공유적 또는 비-공유적으로 연결된다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 산화방지제, 버퍼, 정균제 (bacteriostats) 및 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 무균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 무균 현탁액을 포함한다. 상기 제제는 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들어, 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 무균 액체 담체, 예를 들어 주사용 수 (water for injections)를 첨가하는 것만을 필요로 하는 냉동 건조된 (동결건조된) 상태로 보관될 수 있다. 임시 (extemporaneous) 주사 용액 및 현탁액은 무균 분말, 과립 및 정제로 제조될 수 있다. 이러한 주사 용액은 예를 들어, 무균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 (가령, 예를 들어 Tween 80) 및 현탁화제를 사용하여 당 분야에 알려져 있는 기술에 따라 제제화될 수 있다. 상기 무균 주사 가능한 제제는 또한 비-독성 비경구로 허용 가능한 희석제 또는 용매 중의 무균 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비히클 및 용매에는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균의 고정 오일 (fixed oils)은 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로 사용된다. 이를 위해, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함한 임의의 블랜드의 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 이의 글리세리드 유도체가 특히 폴리옥시에틸화 버전의 올리브유 또는 피마자유와 같은 천연의 약학적으로 허용 가능한 오일과 같이 주사제 제조에 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있다.
약학적 조성물은 직장 또는 질내 투여를 위한 좌약 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 화합물을 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로, 상기 직장에서 용융되어 활성 성분을 방출하는 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조될 수 있다. 이러한 물질은 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
약학적 조성물의 국소 투여는 원하는 치료가 국소 적용에 의해 쉽게 접근할 수 있는 부위 (점막 및 중피 표면 포함) 또는 장기를 포함할 때 특히 유용하다. 피부에 국소 적용하기 위해, 상기 약학적 조성물은 담체 중에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유하는 적절한 연고로 제제화될 것이다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체는 미네랄 오일, 액체 바세린, 화이트 바세린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 대안으로서, 상기 약학적 조성물은 담체 중에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유하는 적절한 로션 또는 크림으로 제제화될 수 있다. 적합한 담체는 미네랄 오일, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알코올 및 물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 대안으로서, 상기 약학적 조성물은 적절한 겔로 제제화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 좌약 제제에 의해 또는 적절한 관장 제제로 하부 장관 (lower intestinal tract)에 국소로 적용될 수 있다. 국소-경피 패치 및 이온영동 투여가 또한 서술된다.
약학적 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 약학적 제제 분야에서 잘 알려진 기술에 따라 제조되고, 벤질 알코올 또는 다른 적절한 보존제, 생체이용률을 증진시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 당 분야에 알려져 있는 다른 가용화제 또는 분산화제를 사용하여, 식염수 중 용액으로 제조될 수 있다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 에어로졸 제제는 또한 US 6,811,767에 기재된 것들을 포함한다.
pH-민감성 또는 음전하를 띤 리포솜은 dsRNA와의 복합체보다는 오히려 dsRNA를 포획한다. 상기 dsRNA 및 지질 모두는 유사하게 전하를 띠기 때문에, 복합체 형성보다는 반발이 발생한다. 따라서, 상기 dsRNA는 이러한 리포솜의 수성 내부 중에 포획된다. 한 가지 주요 타입의 리포솜 조성물은 천연-유래 포스파티딜콜린 이외에 인지질을 포함한다. 예를 들어, 중성 리포솜 조성물은 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포솜 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 융합성 리포솜은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)으로부터 형성된다. 다른 타입의 리포솜 조성물은 포스파티딜콜린 (PC) 가령, 예를 들어 대두 PC 및 난 (egg) PC로부터 형성된다. 다른 타입은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다. 핵산을 포함하는 리포솜이 예를 들어, WO 96/40062, US 5,264,221, US 5,665,710에 기재되어 있다.
또한, 본원에는 TLR3 효능제 또는 TLR3 효능제를 포함하는 조성물로 함침되거나 또는 이를 함유하는 이식 가능한 약물 방출 장치가 기재되고, 상기 TLR3 효능제는 상기 장치로부터 방출되고, 치료적으로 활성이다.
TLR3 효능제 조합 조성물
본원에 기재된 TLR3 효능제를 사용한 치료는 선택적으로 암 치료에 유용한 하나 이상의 다른 요법제와 유리하게 조합될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 TLR3 효능제는 암 치료에 유용한 다른 요법제와 함께 또는 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 상기에 기재된 TLR3 효능제 조성물은 암 치료에 유용한 다른 요법제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 다른 요법제는 동일하거나 또는 바람직하게는 별도의 용기에 있을 수 있다. 이러한 제제는 TLR3 효능제인 다른 뉴클레오티드 서열의 다른 dsRNA; 세포독성 및 종양파괴성 (tumoricidal) TLR3 리간드 복합체에 사용하기 위해 상기에 언급된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포독소 (cytotoxins); 세포독성 및 종양파괴성 TLR3 리간드 복합체; 종양 항원 또는 종양 증식 단백질을 표적으로 하는 활성제; 시스플라틴 (CDDP), 카보플라틴, 옥살리플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 캄프토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부설판, 니트로스우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포사이드 (VP16), 타르녹시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 겜시타블렌, 나벨빈, 파메실-단백질 트란스퍼라제 억제제, 트란스플라티넘, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 또는 이들의 임의의 유사체 또는 유도체 변형체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 화학요법제; 특정 암, 예컨대 유방암 치료를 위한 요법제 및 요법제들의 조합: 독소루비신, 에피루비신, 독소루비신과 시클로포스파미드의 조합 (AC), 시클로포스파미드, 독소루비신 및 5-플루오로우라실 (espace ajoute)의 조합 (CAF), 시클로포스파미드, 에피루비신 및 5-플루오로우라실의 조합 (CEF), Herceptin™, 타목시펜, 타목시펜 및 세포독소의 조합, 도세탁셀 및 파클리탁셀을 포함한 탁산, 탁산 + 독소루비신 및 시클로포파미드의 조합; 결장암의 경우: 5-FU 및 류코보린의 조합, 5FU 및 레바미솔의 조합, 이리노테칸 (CPT-11) 또는 이리노테칸, 5-FU 및 류코보린의 조합 (IFL) 또는 옥살리플라틴; 전립선암의 경우: 방사성동위원소 (즉, 팔라듐, 스트론튬-89 및 이리듐), 류프롤라이드 또는 다른 LHR 효능제, 비스테로이드성 안티안드로겐 (플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드), 스테로이드성 안티안드로겐 (시프로테론 아세테이트), 류프롤라이드 및 플루타나이드의 조합, 에스트로겐 예컨대 DES, 클로로트리아니센, 에티닐 에스트라디올, 접합된 에스트로겐 U.S.P., DES-디포스페이트, 세컨드-라인 (second-line) 호르몬 요법제 예컨대 아미노글루테티미드, 히드로코르티손, 플루타미드 도피법 (flutamide withdrawal), 프로게스테론, 및 케토코나졸, 저용량 프레드니손, 또는 다른 화학요법제 또는 PSA 수준의 감소 및 증상의 주관적 개선을 발휘하는 것으로 보고된 활성제의 조합, 도세탁클, 파클리탁셀, 에스트라무스틴/도세탁셀, 에스트라무스틴/에토포사이드, 에스트라무스틴/빈블라스틴, 및 에스트라무스틴/파클리탁셀; 흑색종의 경우: 다카르바진 (DTIC), 니트로소우레아 예컨대 카르무스틴 (BCNU) 및 로무스틴 (CCNU), 빈카 알칼로이드, 백금 화합물 및 탁산을 포함한 적당한 단일 작용제 활성을 갖는 제제, 다트머스 요법 (Dartmouth regimen) (시스플라틴, BCNU 및 DTIC), 인터페론 알파 (IFN-A), 및 인터루킨-2 (IL-2); 난소암의 경우: 파클리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 헥사메틸멜라민, 타목시펜, 이포스파미드, 파클리탁셀 (탁솔) 또는 도세탁셀 (탁소테레) 및 시스플라틴 또는 카보플라틴의 조합, 시클로포스파미드 및 시스플라틴의 조합, 시클로포스파미드 및 카보플라틴의 조합, 5-플루오로우라실 (5FU) 및 류코보린의 조합, 에토포사이드, 리포솜 독소루비신, 게루시타빈 또는 토포테칸; 폐암의 경우: 시스플라틴, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 미토마이신, 독소루비신 및 에토포사이드의, 단독 또는 조합, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴/에토포사이드 및 시스플라틴의 조합 (CAV/EP), 시스플라틴 및 비노렐빈의 조합, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 겜시타빈, 및 카보플라틴 및 파클리탁셀의 조합을 포함한다.
일 양상에서, 다른 요법제는 면역 체크포인트 억제제이다. 이는 생물학적 요법제 또는 소분자일 수 있다. 바람직하게, 상기 체크포인트 억제제는 모노클로날 항체, 인간화 항체, 전장 인간 항체, 융합 단백질 또는 이들의 조합이다. 상기 항체는 경로에 관여하는 임의의 단백질, 보다 구체적으로 수용체 또는 리간드에 관한 것일 수 있다. 알려진 바와 같이, 면역 체크포인트 억제제는 암세포에 대한 면역 반응을 회복시킬 수 있다. 특히, 상기 억제제는 상호작용하는 단백질들 간의 상호작용을 방해 또는 지연하거나, 또는 억제하여, 면역 반응, 특히 T 세포가 종양 세포를 사멸시키도록 한다. 추가의 일 양상에서, 상기 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 또는 이들의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질을 억제한다. 추가의 일 양상에서, 상기 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 또는 이들의 조합일 수 있는 체크포인트 단백질의 리간드와 상호 작용한다.
본 발명은 PD1/PD-L1 및/또는 PD1/PD-L2 경로를 차단, 억제 또는 감소시키는 항체의 병용 사용을 포함한다. 현재 시판되거나 임상 평가 중인 경로를 차단하는 적어도 5개의 제제가 있으며, 이들 중 적어도 하나는 본 발명과 조합하여 유용할 수 있다. 이들 제제는 BMS-936558 (항-PD-L1 mAb, 니볼루맙/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb, 이전에 MDX-1106 (WO 2006/121168의 항체 5C4), MK-3475 (항-PD1 mAb, 람브롤리주맙 또는 펨브롤리주맙, Keytruda®, Merck), MPDL3280A/RG7446 (항-PD-L1 mAb, Roche/Genentech), AMP-224 (항-PD-L2를 포함하는 이뮤노아드헤신 (immunoadhesin), Amplimmune 및 GSK), 피들리주맙 (항-PD1 mAb, CT-011, CureTech/TEVA - WO 2009/101611)이 있다.
인간화 항체 h409의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 MK-3475 DNA 구조체의 경우, 모두 American Type Culture Collection Patent Depository (10801 University Bld., Manassas, VA)에 기탁되었다. h409A-I 1의 중쇄를 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드는 2008년 6월 9일자로 기탁되고, 081469_SPD-H로 식별되었으며, h409AI 1의 경쇄를 코딩하는 DNA를 함유하는 플라스미드는 2008년 6월 9일자로 기탁되고, 0801470_SPD-L-I 1로 식별되었다.
추가로 알려진 PD-1 항체 및 다른 PD-1 억제제는 AMP-224 (GSK로 라이센스된 B7-DC/IgG1 융합 단백질), WO 2012/145493에 기재된 AMP-514, WO2011/066389 및 US2013/034559에 기재된 항체 MEDI-4736 (AstraZeneca/Medimmune에 의해 개발된 항-PD-L-1), WO2010/077634에 기재된 항체 YW243.55.S70 (항-PD-L1), BMS-936559로도 알려져 있고, WO2007/005874에 기재된 Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 항-PD-L1 항체인 MDX-1105, 및 WO2006/121168, WO2009/014708, WO2009/114335 및 WO2013/019906에 기재된 항체 및 억제제를 포함한다. 본원에 언급된 임의의 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 통합된다. 항-PD1 항체의 추가 예는 WO2015/085847에 개시되어 있고, 예를 들어 서열 번호: 6, 서열 번호: 7 및 서열 번호: 8의 경쇄 가변 도메인 CDR1, 2 및 3을 갖는 항체, 및 서열 번호: 3, 서열 번호: 4 및 서열 번호: 5의 중쇄 가변 도메인 CDR1, 2 및 3을 갖는 항체이고, 상기 서열 번호의 언급은 WO2015/085847에 따른 넘버링이다.
본 발명은 또한 CD152로도 알려진 CTLA-4 (세포독성 T-림프구-결합 단백질 4)에 대한 항체의 병용 사용을 포함하고, 이는 CD28 패밀리 수용체의 다른 억제제 구성원이며, T 세포에서 발현된다. CTLA-4에 결합하고 이를 억제하는 항체는 당 분야에 알려져 있다. 일례에서, 상기 항체는 인간 IgG 항체인 이필리무맙 (상품명 Yervoy®, Bristol-Myers Squibb)이다.
다른 조합에서, TLR3 리간드는 OX40, ICOS, GITR, 4-1BB 또는 CD40과 같은 자극성 체크포인트 경로의 효능제이다.
다른 조합에서, TLR3 리간드와 결합하는 제제는 종양 미세환경을 표적으로 하는 분자, 예컨대 형질전환 성장 인자-베타 신호전달 경로의 억제제 (즉, 갈루니세르팁)이다.
본원에 기재된 TLR3 효능제 조성물을 사용하는 방법은 또한 항-혈관신생제 (anti-angiogenic agent)와의 병용 치료를 포함할 수 있다. 따라서, 상기에 기재된 TLR3 효능제 조성물은 또한 항-혈관신생제를 포함할 수 있다. 새로운 혈관 형성 (혈관신생)은 종양 성장 및 전이성 전염 과정에서 근본적인 이벤트이다. 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor: VEGF) 경로는 이 과정의 주요 조절인자들 중 하나로 잘 수립되었다. 상기 VEGF/VEGF-수용체 축은 중복되고 별개의 리간드-수용체 결합 특이성, 세포-타입 발현 및 기능을 가진 다수의 리간드 및 수용체로 구성된다. 상기 VEGF-수용체 경로의 활성화는 기존 혈관계로부터 내피 세포 성장, 이동 및 생존을 촉진하는 신호전달 과정의 네트워크를 유발한다. 또한, VEGF는 혈관 투과성을 매개하고, 악성 삼출물과 관련이 있다. 상기 VEGF-관련 유전자 패밀리는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E 및 태반 성장 인자 (PIGF)-1 및-2로 지칭되는 6개의 분비된 당단백질을 포함한다. VEGR 경로에 작용하는 다수의 예시되는 항-혈관신생제가 알려져 있으며, 소분자 억제제, 중화 항체 안티센스 전략, VEGF-관련 유전자 패밀리 (예: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E 단백질)에 대한 RNA 압타머 및 리보자임을 포함하는 것들 중 하나가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 길항적 특성을 가진 VEGF의 변형체가 또한 WO 98/16551에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 병용 요법과 관련하여 유용한 추가의 예시되는 항-혈관신생제는 US 6,524,583의 표 D에 열거되어 있다. 특히 바람직한 항-혈관신생제는 VEGFR1, VEGFR-2,3 PDGFR-베타, Flt-3, c-Kit, p38 알파 및 FGFR-1을 포함하나 이에 한정되지 않는 수용체 티로신 키나제에 의한 신호전달을 억제한다. 추가의 항-혈관신생제는 예컨대 EGFR, HER-2, COX-2 또는 HIF-1과 같이 VEGF 발현 및 생성의 다양한 조절인자들 중 하나 이상을 억제하는 제제를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 제제 부류는 탈리도마이드 또는 유사체 CC-5013을 포함한다.
일 양상에서, 상기 다른 요법제는 베바쿠지맙 (Avastin) (mAb, VEGF-A 억제, Genentech); IMC-1121B (mAb, VEGFR-2 억제, ImClone Systems); CDP-791 (페길화 DiFab, VEGFR-2, Celltech); 2C3 (mAb, VEGF-A, Peregrine Pharmaceuticals); PTK-787 (TKI, VEGFR-1,-2, Novartis); AEE788 (TKI, VEGFR-2 및 EGFR, Novartis); ZD6474 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, EGFR AstraZeneca); AZD2171 (TKI, VEGFR-1, -2, AstraZeneca); SU11248 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR Pfizer); AG13925 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); AG013736 (TKI, VEGFR-1,-2, Pfizer); CEP-7055 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, Cephalon); CP-547,632 (TKI, VEGFR-1,-2, Pfizer); VEGF-트랩 (가용성 혼성 수용체 VEGF-A, P1GF (태반 성장 인자) Aventis/Regeneron); GW786024 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, GlaxoSmithKline); Bay 93-4006 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR Bayer/Onyx); 및 AMG706 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, Amgen)을 포함하는 티로신 키나제 억제제 (TKI) 및 모노클로날 항체 (mAb)의 선택된 VEGF/VEGFR 억제제인, 인돌아민 옥시다제 억제제를 포함하는 면역 조절제이다. 가장 바람직한 것은 VEGFR1, VEGFR-2,3 PDGFR-베타, Flt-3, c-Kit, p38 알파 및 FGFR-1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 수용체 티로신 키나제를 억제하는 티로신 키나제 억제제이다. 바람직한 예는 SU11248 (Pfizer) 및 Bay 93-4006 (sorefanib, Bayer)을 포함한다.
본원에 기재된 TLR3 효능제 조성물을 사용하는 방법은 또한 아폽토시스 유발 제제 (pro-apoptotic agent)와의 병용 치료를 포함할 수 있다. 따라서, 상기에 기재된 TLR3 효능제 조성물은 또한 아폽토시스 유발 제제를 포함할 수 있다. 약학적 제제에 의한 조절에 대한 표적으로서 유용한 다수의 단백질이 당 분야에 알려져 있고, Green and Kroemer, J. (2005) Clin. Investig. 115(10):2610-2617에서 검토된 것을 포함한다. 아폽토시스 유발 약학적 제제의 예는 하기를 포함한다: 미토콘드리아 외부막 투과를 유도하는 약물 예컨대 오블리미르센 (Bcl-2 안티센스 올리고뉴클레오티드, Genta), EGCG (Bcl-2를 표적으로 하는 소분자, Burnham Inst./Mayo Clinic), 고시폴 (Bcl-2를 표적으로 하는 소분자, Univ. Michigan), LY2181308 (수르비빈을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (Eli Lilly/Isis), 및 비소 트리옥사이드; p53 활성을 조절하는 약물 예컨대 아드벡신 INGN201 (p53을 조절하는 아데노바이러스, Introgen), SCH58500 (p53을 조절하는 아데노바이러스, Schering-Plough), ONYX-015 (p53을 조절하는 E1B 돌연변이된 아데노바이러스, Onyx Pharma.); 카스페이스 (caspases) 및/또는 내인성 억제제 또는 카스페이스를 조절하는 약물 예컨대 AEG35156 (XIAP를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, Aegara/Hybridon); cIAP1-2를 조절하는 약물 예컨대 비리나판트; 사멸 수용체 및/또는 이들의 리간드를 조절하는 약물, 예컨대 TNF-알파 폴리펩티드, HGS-ETR1 (TRAIL-R1을 표적으로 하는 효능적 mAb, Human Genome Sciences), HGS-ETR2 및 HGS-TR2J (TRAIL-R2를 표적으로 하는 2개의 효능적 mAbs, Human Genome Sciences); PRO1764 (가용성 TRAIN 리간드, Genentech/Amgen); 및 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)를 표적으로 하는 약물, 예컨대 AG014699 (소분자, Cancer Res. Tech.); 프로테오좀을 표적으로 하는 약물, 예컨대 보르테조밉 (Velcade) (26S 프로테오좀 억제제, Millennium Pharma.); 및 키나제 억제제, 예컨대 헤르셉틴 (HER2를 표적으로 하는 mAb, Roche), 센툭시맙 (HER1을 표적으로 하는 mAb, Imclone/BMS), 게피티닙 (Iressa) 및 에를로티닙 (Tarceva) (HER1의 소분자 억제제, AstraZeneca and Genentech/OSI 각각, CCI-779 (mTOR에 작용하는 소분자, Novartis, Bay 43-9006 (Raf 및 VEGFR을 포함하는 키나제의 소분자 억제제, 및 이마티닙 메실레이트 (Gleevec, STI-571) (cKit, PDGFR, Bcr-Abl의 소분자 억제제, Novartis).
상기에 기재된 TLR3 효능제 조성물은 또한 다른 요법제 예컨대 면역조절제 예컨대 종양 괴사 인자, 인터페론 알파, 베타 및 감마, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, CpG-함유 단일-가닥 DNA, 예를 들어 BCG를 포함하는 다른 TLR의 효능제, 다른 사이토카인 및 면역자극제; F42K 및 다른 사이토카인 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1 베타, MCP-1, RANTES 및 다른 케모카인; 세포 표면 수용체 및 GAP 접합의 상향 조절에 영향을 미치는 제제; 세포증식 억제제 및 분화제; 또는 세포 부착 억제제를 포함할 수 있다.
또한, 별도의 제형으로 암 치료에 유용하지만 서로 관련되는, TLR3 효능제 및 다른 요법제를 포함하는 물질의 조성물이 기재되어 있다. 본원에서 사용되는 용어 "서로 관련된"은 별도의 제형들이 동일한 요법의 일부로서 판매 및 투여하려는 의도가 명백하도록, 별도의 제형들을 함께 포장하거나 또는 서로 부착시키는 것을 의미한다. 상기 제제 및 TLR3 효능제는 바람직하게는 블리스터 팩 (blister pack)또는 다른 다중-챔버 패키지 (multi-chamber package)로 함께 포장되거나, 또는 사용자에 의해 분리될 수 있는 (예: 두 용기들 사이의 점선을 찢음으로써) 용기들 (예컨대 포일 파우치 또는 유사물)을 연결하여 개별적으로 밀봉될 수 있다.
상기에 기재된 TLR3 효능제 조성물은 또한 이온화 방사선의 사용, CAR-T 세포의 주사 및/또는 항암 바이러스의 사용을 포함하는 다른 치료 양식을 포함할 수 있다.
암 및 치료 방법
본 명세서는 암 또는 이의 하나 이상의 증상들의 예방, 관리, 치료 또는 개선에 사용하기 위한 TLR3 효능제를 포함한다. 본 발명은 또한 암 또는 이의 하나 이상의 증상들의 예방, 관리, 치료 또는 개선용 약물의 제조를 위한 TLR3 효능제의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 암 또는 이의 하나 이상의 증상들을 예방, 관리, 치료 또는 개선하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 예방, 관리, 치료 또는 개선될 수 있는 암의 예로는 고형 종양, 특히 두부, 경부, 눈, 입, 인후, 식도, 가슴, 뼈, 폐, 결장, 직장, 위, 전립선, 유방, 난소, 신장, 간, 췌장 및 뇌의 암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
장기 또는 조직 (예: 뼈)로 전이될 가능성이 있거나 또는 전이된 암 또는 이의 하나 이상의 증상들을 예방, 관리, 치료 또는 개선하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 장기 또는 조직 (예: 뼈)로 전이될 가능성이 있거나 또는 전이된 암 또는 이의 하나 이상의 증상들을 예방, 관리, 치료 또는 개선하는데 사용하기 위한 TLR3 효능제가 기재되어 있다.
상기 방법 및 용도는 본 발명에 따른 TLR3 효능제의 예방적 또는 치료적 양의 하나 이상의 용량을 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직하게, 상기 TLR3 효능제는 1회 초과로 투여된다. 선택적으로, 상기 TLR3 효능제는 1개월 미만, 3주 미만, 2주 미만 또는 1주 미만의 간격으로 투여된다. 선택적으로, 이러한 치료는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복될 수 있다.
본 명세서는 암 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 관리, 치료 또는 개선하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 암 치료에 유용한 하나 이상의 다른 제제의 예방적 또는 치료적으로 유효한 양의 투여량의 투여와 조합하여, TLR3 효능제의 예방적 또는 치료적으로 유효한 양의 투여량을 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서는 또한 암을 예방, 관리, 치료 또는 개선하는데 사용하기 위한 TLR3 효능제에 관한 것이고, 상기 TLR3 효능제는 암 치료에 유용한 하나 이상의 효능제와 함께 사용된다. 바람직하게, 상기 TLR3 효능제는 1회 초과로 투여된다. 선택적으로, 상기 TLR3 효능제는 1개월 미만, 3주 미만, 2주 미만 또는 1주 미만의 간격으로 투여된다. 선택적으로, 이러한 치료는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 마다 반복될 수 있다.
본 발명에 따른 조합물 또는 약학적 조성물의 각 화합물은 개별적으로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 TLR3 효능제는 다른 화학요법제에 앞서 또는 이후에 투여된다.
일 구체예에서, dsRNA는 효능제의 혈장 농도를 바람직한 수준으로 유지하는 용량 요법을 사용하여 대상에게 투여된다. 특정 일 구체예에서, 상기 dsRNA의 혈장 농도는 약 10 μg/ml, 15 μg/ml, 20 μg/ml, 25 μg/ml, 30 μg/ml, 35 μg/ml, 40 μg/ml, 45 μg/ml 또는 50 μg/ml로 유지된다. 대상에게 바람직한 혈장 농도는 암의 특성, 암의 중증도, 순환 반감기 (안정성) 및 TLR3 효능제의 결합 친화도를 포함하나, 이에 한정되지 않는 여러 요인들에 따라 달라질 것이다.
본원에서 제공된 투여량 및 투여 빈도는 치료적으로 유효한 및 예방적으로 유효한이라는 용어에 포함된다. 상기 투여량 및 빈도는 전형적으로 연령, 체중뿐만 아니라 투여되는 특정 치료제 또는 예방제, 암의 중증도 및 타입, 투여 경로에 따라 각 환자에 대해 특이적 요소에 따라 추가로 달라질 것이다.
특히, 투여될 수 있는 본 발명에 따른 TLR3 효능제의 용량은 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg 체중, 예를 들어, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg 체중이다.
바람직하게, 치료적으로 유효한 양의 TLR3 효능제 (선택적으로 다른 요법제 또는 치료 프로토콜과 조합)는 대상에서 종양의 크기 또는 종양의 확산을, PBS와 같은 대조군에 비해, 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 만큼 감소시킨다.
본 발명의 범위에서, "사용을 위한 TLR3 효능제"는 "TLR3 효능제의 용도"와 동등하고, 특히 "치료에 사용하기 위한 TLR3 효능제"는 "치료를 위한 TLR3 효능제의 용도"와 동등하다는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 또한 본 개시내용에 따른 "치료용 약물의 제조를 위한 TLR3 효능제의 용도"를 포함한다.
암의 타입
다양한 구체예에서, 본 명세서는 암 대상자에 대한 치료 요법을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 임의의 암 또는 종양의 치료 요법을 결정하는데 사용될 수 있고, 예를 들어 이에 한정되는 것은 아니지만, 악성 종양 및 관련 장애는 하기에 한정되지 않고, TLR3을 발현하는 것을 포함한다.
따라서, 상기 방법은 하기를 포함하는 (그러나, 이에 한정되지 않음) 다양한 암 또는 다른 비정상 증식성 질환의 치료에 유용하다: 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선 및 피부의 암종; 편평세포 암종을 포함; 급성 및 만성 골수성 백혈병 및 전골수성 백혈병을 포함하는 골수계통의 조혈 종양; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 흑색종, 고환종, 기형암종, 신경모세포종 및 신경아교종을 포함하는 다른 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경아교종 및 슈반세포종 (schwannomas)을 포함하는 중추 및 말초 신경계의 종양; 섬유육종, 횡문근육종 및 골육종을 포함하는 중간엽 기원의 종양; 및 흑색종, 색소성 건피증 (xenoderma pigmentosum), 각질가시세포종 (keratoacanthoma), 고환종, 갑상선 여포 종양 (thyroid follicular cancer) 및 기형암종을 포함한 다른 종양. 특정 구체예에서, 난소, 방광, 유방, 결장, 폐, 피부, 췌장 또는 자궁에서 악성 또는 증식이상 변화 (예컨대, 화생 및 이형성) 또는 과증식 장애가 치료된다. 다른 특정 구체예에서, 육종, 흑색종 또는 백혈병이 치료된다.
상기 방법은 TLR3 양성 고형 종양에 사용된다. 종양의 예로는 유방암, 결장암, 난소암, 폐암, 뇌암 및 전립선암 및 흑색종을 포함한다. 바람직하게 상기 방법은 유방암 치료에 관한 것이다.
dsRNA의 합성
본 발명의 명세서에 따른 dsRNA 조성물을 생성하는데 표준 합성 방법이 사용될 수 있다. 예로서, 표준 포스포르아미다이트 고상 합성 기술 (standard phosphoramidite solid-phase synthesis technology)이 사용될 수 있다. M. D. Matteucci et al., Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981)를 참조한다. 2'-ACE RNA 합성 화학은 S.A. Scaringe, Ph.D Thesis, University of Colorado, 1996. DharmaconTM technology for RNAi, Gene Expression & Gene Editing에 개시된 바와 같은 보호기 도식도에 기반하여 사용될 수 있다. GE Healthcare의 2'-ACE RNA 합성 화학이 사용될 수 있다. 예컨대 겔, 예컨대 실시예에서 사용된 아크릴아미드 겔 상의 전기영동 방법이 순도를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
도면
도 1: 50bp dsRNA 및 상용 폴리(A:U)의 8% 아크릴아미드 겔 (TBE 1X)에서 dsRNA 프로파일. 5μg의 dsRNA (345, 397, 398, 415, 418, 405, 411, 412, 413) 및 상용 폴리(A:U)를 8% 아크릴아미드 겔에 로딩하고, BET로 염색하였다. 데이터는 시험된 17개의 50bp dsRNA 중 9개를 나타낸다.
도 2: 50bp dsRNA 단독에 대한 반응으로 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에 의한 TNF 알파의 분비. RAW264.7 세포를 10 μg/mL의 각 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, mTNF 알파 분비를 ELISA로 측정하였다. 데이터는 50bp dsRNA 412의 2개의 상이한 배치를 사용하는 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 3: 9개의 50bp dsRNA 단독으로 처리한 후 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292에 의한 IL6의 분비. NCI-H292 세포를 10 μg/mL의 각 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, hIL6 분비를 ELISA로 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 4: 50bp dsRNA 412는 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 사멸을 유발하지 않았다. NCI-H292 세포를 50 μg/mL의 각 dsRNA로 24시간 동안 처리하였다. 아넥신V (AnnexinV) 양성 세포를 화학발광 (키트 Annexin V-Glo, Promega)에 의해 측정하였다. 데이터는 50bp dsRNA 412의 2개의 상이한 배치를 사용하는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 5: dsRNA 412, 432, 452 및 상용 폴리(A:U)의 천연 6% 아크릴아미드 겔 (TBE 1X)에서 dsRNA 프로파일. 1μg의 dsRNA 412 (폴리(A:U) 50pb), 432 (폴리(A:U) 70pb), 452 (폴리(A:U) 90pb) 및 상용 폴리(A:U)를 6% 아크릴아미드 겔에 로딩하고, BET로 염색하였다. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 6: 크기가 증가하는 폴리(A:U)에 대한 반응으로 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에 의한 TNF 알파의 분비. RAW264.7 세포를 10 μg/mL의 각 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, mTNF 알파 분비를 ELISA로 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 7: 크기가 증가하는 폴리(A:U)로 마우스 마크로파지 RAW264.7에서 ISRE-리포터 유전자를 활성화시켰다. RAW264.7 세포를 표시된 dsRNA 50 μg/mL로 24시간 동안 처리하였다. ISRE-구동 생체발광을 측정하였다 (QUANTI-luc, Invivogen). 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 8: 크기가 증가하는 폴리(A:U)로 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292에 의한 IL6의 TLR3-의존성 분비를 유발하였다. WT 또는 TLR3 KO NCI-H292 세포를 10 μg/mL의 각 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, hIL6 분비를 ELISA로 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 9: 크기가 증가하는 폴리(A:U)로 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 TLR3-의존성 사멸을 유발하였다. NCI-H292 세포를 50 μg/mL의 표시된 dsRNA로 24시간 동안 처리하였다. 아넥신V 양성 세포를 화학발광 (키트 Annexin V-Glo, Promega)에 의해 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 10: dsRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 및 상용 폴리(A:U)의 천연 6% 아크릴아미드 겔 (TBE 1X)에서 dsRNA 프로파일. 이들 dsRNA 및 상용 폴리(A:U) 중 각 하나의 1 μg을 6% 아크릴아미드 겔에 로딩하고, BET로 염색하였다. 데이터는 2개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 11: 상용 폴리(A:U) 및 dsRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535에 대한 반응으로 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에 의한 TNF 알파의 분비. RAW264.7 세포를 10 μg/mL의 각 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, mTNF 알파 분비를 ELISA로 측정하였다. 데이터는 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 12: 상용 폴리(A:U) 및 dsRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535에 대한 반응으로, 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292에 의한 IL6의 TLR3-의존성 분비. WT 또는 TLR3 KO NCI-H292 세포를 10 μg/mL의 각 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, hIL6 분비를 ELISA로 측정하였다. 데이터는 적어도 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 13: 상용 폴리(A:U) 및 dsRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535에 대한 반응으로, 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 TLR3-의존성 사멸. NCI-H292 세포를 50 μg/mL의 표시된 dsRNA로 24시간 동안 처리하였다. 아넥신V 양성 세포를 화학발광 (키트 Annexin V-Glo, Promega)에 의해 측정하였다. 데이터는 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 14: 2가지 상이한 화학적 제조 기술로 제조된 dsRNA 532에 대한 반응으로 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에 의한 TNF 알파 분비. RAW264.7 세포를 표시된 dsRNA 532의 1 내지 100 μg/mL의 용량-반응으로 24시간 동안 처리하고, mTNF 알파 분비를 ELISA로 측정하였다. 데이터는 적어도 3개의 독립적인 분석의 평균이고, 적어도 6개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 15: 2개의 상이한 제조사로부터 제조된 dsRNA 532에 대한 반응으로 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에 의한 TNF 알파의 분비. RAW264.7 세포를 표시된 dsRNA 532의 1 내지 100 μg/mL의 용량-반응으로 24시간 동안 처리하고, mTNF 알파 분비를 ELISA로 측정하였다. 데이터는 적어도 5개의 독립적인 분석의 평균이다.
도 16: 2개의 상이한 화학적 합성 기술 또는 2개의 상이한 제조사로부터 제조된 dsRNA 532는 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 동일한 수준의 사멸을 유발한다. NCI-H292 세포를 표시된 dsRNA의 1 내지 100 μg/mL의 용량-반응으로 24시간 동안 처리하였다. 아넥신V 양성 세포를 화학발광 (키트 Annexin V-Glo, Promega)에 의해 측정하였다. 데이터는 적어도 4개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 17: 2가지 상이한 화학적 합성 기술로 제조된 dsRNA 532는 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 동일한 수준의 세포 생존율 감소를 유발하였다. NCI-H292 세포를 표시된 dsRNA의 1 내지 100 μg/mL의 용량-반응으로 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존률 분석은 MTS (키트 Cell Titer Aqueous solution, Promega)에 의해 측정하였다. 데이터는 적어도 4개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 18: 2개의 상이한 제조사로부터 제조된 dsRNA 532는 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 동일한 수준의 세포 생존율 감소를 유발한다. NCI-H292 세포를 표시된 dsRNA의 1 내지 100 μg/mL의 용량-반응으로 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존률 분석은 MTS (키트 Cell Titer Aqueous solution, Promega)에 의해 측정하였다. 데이터는 적어도 5개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 19: RNAse I 또는 RNAse III로 소화한 후 폴리(A:U) 및 dsRNA 532의 천연 6% 아크릴아미드 겔 (TBE 1X)에서 dsRNA 프로파일. 1μg의 dsRNA 및 상용 폴리(A:U)를 6% 아크릴아미드 겔에 로딩하고, BET로 염색하였다. 데이터는 적어도 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
도 20: 폴리(A:U) 및 dsRNA 532의 dsRNA Tm 계산 프로파일. 1 μg의 dsRNA를 SyBr 그린 Q-PCR 믹스와 혼합하고, 용융 곡선 분석을 수행하였다. 데이터는 적어도 3개의 독립적인 분석을 나타낸다. 도면에서, 온도는 섭씨 온도이다. 세로축에서, -d(RFU)/dT. 용융 피크가 표시된다.
실시예
약어:
TLR3: Toll-유사 수용체 3 (CD283)
WT: 야생형
KO: 녹아웃 (Knock Out)
TBE: 트리스 보레이트 EDTA
APS: 암모늄 퍼설페이트
TEMED: 테트라메틸에틸렌디아민
BET: 브로민화 에티듐 (Bromure Ethidium)
DNA: 데옥시리보핵산
RNA: 리보핵산
dsRNA: 이중-가닥 RNA
ssRNA: 단일-가닥 RNA
폴리(A:U): 폴리아데닐릭 폴리우리딜산
PAU: 고분자량의 상용 폴리(A:U)
폴리(I:C): 폴리이노시닉 폴리시티딜산
PIC: 폴리(I:C)
bp: 염기쌍
mTNFa: 마우스 종양 괴사 인자 알파
hIL6: 인간 인터루킨-6
Å: 옹스트롬
5'ppp: 5'트리-포스페이트
ISRE: 인터페론 자극된 반응 요소
표 1: 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에서 염증 반응을 활성화시키는 능력에 대해 테스트된 47개의 50 pb dsRNA의 서열.
표 2: 60 내지 90 pb 범위의 폴리(A:U) dsRNA의 서열 (서열 422, 432, 442, 452) 및 dsRNA 432 서열에 대해 증가하는 양의 폴리(이노신산:시티딜산)을 가진 dsRNA 70 pb 패밀리의 서열 (dsRNA 532, 533, 534, 535) 및 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에서 염증 반응을 활성화하는 능력 및 인간 폐암 NCI-H292 세포에서 염증 반응에 의한 아폽토시스 능력에 대해 시험함.
하기의 다른 가닥 및 이의 상보적 가닥이 동일한 방식으로 합성되고, 그 다음에 혼성화될 수 있다:
5' (I)10 - (U)50 - (I)10 3'
5' (A)60 - (I)10 3'
5' (A)50 - (I)20 3'
5' (A)20 - (I)50 3'
5' (A)10 - (I)60 3'
5' (I)5 - (A)60 - (I)5 3'
5' (I)15 - (A)40 - (I)15 3'
5' (I)20 - (A)30 - (I)20 3'
5' (I)25 - (A)20 - (I)25 3'
5' (I)30 - (A)10 - (I)30 3'
5' (I)5 - (A)50 - (I)15 3'
5' (I)13 - (A)64 - (I)13 3'
5' (I)10 - (A)70 - (I)10 3'
실시예
1 및 도 1: 천연 8% 아크릴아미드 겔 (
TBE
1X)에서
50bp
dsRNA
및 상용
폴리(A:U)의
분석.
DHARMACONTM (Colorado, USA)으로부터 입수한 동결건조된 dsRNA를 제조사 프로토콜에 따라 무균 무-RNAse 생리수 (physiological water) (INVIVOGEN, France) 중에 재현탁하였다. 핵산 로딩 버퍼 (Invitrogen, Cat#AM8556)를 부가한 후, 하기와 같이 준비된 8% 아크릴아미드 겔에 5 μg의 dsRNA를 로딩하였다: 9.3 mL의 무균 무-RNAse 물 (Sigma-Aldrich where, catalogue #W4502), 1.5 mL의 TBE 10x (Sigma-Aldrich), 4 mL의 아크릴아미드-비스 30% (Merck Chemicals, Germany, Cat#1.00639.1000), 0.2 mL의 APS (Sigma-Aldrich), 20 μL의 TEMED (Sigma-Aldrich). RNA 래더 (ladder)는 Invitrogen (cat #SM1833)으로부터 입수하였다. 샘플 이동 (migration)은 100V로 1시간 동안 설정하고, 1 μg/mL의 BET (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 그 다음에 겔을 GelDoc XR + 분석기 (BIORAD, California, USA)를 사용하여 시각화하였다. 데이터는 17개의 50bp dsRNA 중 9개를 나타낸다.
실시예
2 및 도
2: 50bp
dsRNA
단독에 대한 반응으로 마우스
마크로파지
RAW264.7 세포에 의한 TNF-알파의 분비.
동결건조된 dsRNA를 IDT 또는 DHARMACON으로부터 입수하였다. 5.104 RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트 (CORNING, USA, Cat#353072)에서 최종 부피 200 μL로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 10 μg/mL의 최종 농도로 24시간 동안 처리하고, 상등액을 수확하여 ELISA (BioLegend, USA Cat#430903)로 마우스 TNF-알파 분비를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 50bp dsRNA 412의 2가지 상이한 배치를 사용하는 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
3 및 도 3:
PAU
또는
50bp
dsRNA
단독으로 처리한 후 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292에 의한 IL6의 분비.
3.103 NCI-H292 WT 또는 TLR3 KO 세포를 p48-웰 플레이트(CORNING, USA, Cat#353078)의 300 μL/웰의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 배양 배지를 새로운 배지로 교체하고, 세포를 10 μg/mL의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 처리하였다. 24시간 후에, 상등액을 수확하여 ELISA (BioLegend, USA Cat#430501)에 의해 인간 IL-6 분비를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
4 및 도
4: 50bp
dsRNA
412는 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 사멸을 유발하지 않음.
1.104 NCI-H292 WT 또는 TLR3 KO 세포를 p96-웰 플레이트(GREINER, USA, Cat#655098)의 100 μL/웰의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 최종 농도 50 μg/mL로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리한 후에, Promega의 실시간 Glo AnnexinV 키트 (France, Cat#JA1000)를 사용하여 아넥신V+ 발광 판독으로 아폽토시스를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 50bp dsRNA 412의 2개의 상이한 배치를 사용하는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
5 및 도 5: 천연 6% 아크릴아미드 겔 (
TBE
1X)에서
dsRNA
412, 432, 452 및 폴리(A:U)의 분석.
DHARMACON으로부터 입수한 동결건조된 dsRNA를 제조사 프로토콜에 따라 무균 무-RNAse 생리수 (INVIVOGEN) 중에 재현탁하였다. RNA 로딩 버퍼 (Invitrogen)를 부가한 후, 하기와 같이 준비된 6% 아크릴아미드 겔 중에 1 μg의 dsRNA를 로딩하였다: 10.3 mL의 무균 무-RNAse 물 (Sigma-Aldrich), 1.5 mL의 TBE 10x (Sigma-Aldrich), 3 mL의 아크릴아미드-비스 30% (Merck Chemicals), 0.2 mL의 APS (Sigma-Aldrich), 20 μL의 TEMED (Sigma-Aldrich). RNA 래더는 Invitrogen으로부터 구입하였다. 샘플 이동은 100V로 1시간 동안 설정한 후에 1 μg/mL의 BET (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 그 다음에 Gel Doc 분석기 (BIORAD)를 사용하여 겔을 시각화하였다.
실시예
6 및 도 6: 크기가 증가하는
폴리(A:U)에
대한 반응으로 마우스
마크로파지
RAW264
.7 세포에 의한
TNF알파의
분비.
5.104 RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트 (CORNING, USA, Cat#353072)에서 200 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 10 μg/mL의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, 상등액을 수확하여 ELISA (BioLegend)로 마우스 TNF-알파 분비를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
7 및 도 7: 크기가 증가하는
폴리(A:U)로
마우스
마크로파지
RAW264.7에서
ISRE
-리포터 유전자를
활성화시킴
.
5.104 RAW264.7 세포 (Invivogen, France, Cat#rawl-isg)를 96-웰 플레이트 (CORNING, USA, 353072)에서 웰당 100 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 50 μg/mL의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리한 후에, 제조사의 프로토콜에 따라 QUANTI-Luc 키트 (Invivogen, Cat#rep-qlc1)를 사용하여 ISRE-구동 생체발광 분석을 수행하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
8 및 도 8: 크기가 증가하는
폴리(A:U)로
인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292에 의한 IL6의
TLR3
-의존성 분비를 유발시킴.
3.104 NCI-H292 WT 또는 TLR3 KO 세포를 48-웰 플레이트 (CORNING, USA, Cat#353078)에서 웰당 300 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 배양 배지를 새로운 배지로 교체하고, 세포를 10 μg/mL의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 처리하였다. 24시간 후에, 상등액을 수확하여, ELISA (BioLegend)에 의해 인간 IL-6 분비를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
9 및 도 9: 크기가 증가하는
폴리(A:U)로
인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의
TLR3
-의존성 사멸을 유발시킴.
1.104 NCI-H292 WT 또는 TLR3 KO 세포를 p96-웰 플레이트 (CORNING, USA, Cat#655098)의 100 μL/웰의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 50 μg/mL의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리한 후에, Promega의 실시간 Glo AnnexinV 키트 (France, Cat#JA1000)를 사용하여 아넥신V+ 발광 판독으로 아폽토시스를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
10 및 도 10: 천연 6% 아크릴아미드 겔 (
TBE
1X)에서
dsRNA
422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 및 폴리(A:U)의 분석.
DHARMACON으로부터 입수한 동결건조된 dsRNA를 제조사 프로토콜에 따라 무균 무-RNAse 생리수 (INVIVOGEN) 중에 재현탁하였다. RNA 로딩 버퍼 (Invitrogen)를 부가한 후에, 하기와 같이 준비된 6% 아크릴아미드 겔 중에 1 μg의 dsRNA를 로딩하였다: 10.3 mL의 무균 무-RNAse 물 (Sigma-Aldrich), 1.5 mL의 TBE 10x (Sigma-Aldrich), 3 mL의 아크릴아미드-비스 30% (Merck Chemicals), 0.2 mL의 APS (Sigma-Aldrich), 20 μL의 TEMED (Sigma-Aldrich). RNA 래더는 Invitrogen으로부터 구입하였다. 샘플 이동은 100V로 1시간 동안 설정한 후에 1 μg/mL의 BET (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 그 다음에 Gel Doc 분석기 (BIORAD)를 사용하여 겔을 시각화하였다. 겔은 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
11 및 도 11:
폴리
(
A:U
) 및
dsRNA
422, 432, 442, 532, 533, 534, 535에 대한 반응으로 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에 의한 TNF알파의 분비.
5.104 RAW264.7 세포를 p96-웰 플레이트 (CORNING, USA, Cat#353072)를 사용하여 웰당 200 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 10 μg/mL의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, 상등액을 수확하여 ELISA (BioLegend)로 마우스 TNF-알파 분비를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
12 및 도 12: 증가하는 크기의
폴리
(
A:U
) 및
dsRNA
422, 432, 442, 532, 533, 534, 535는 단독으로 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292에 의한 IL6의 TLR3-의존성 분비를 유발시킴.
3.104 NCI-H292 WT 또는 TLR3 KO 세포를 p48-웰 플레이트 (CORNING, USA, Cat#353078)를 사용하여 웰당 300 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 10 μg/mL의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, 상등액을 수확하여 ELISA (BioLegend)로 인간 IL-6 분비를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 적어도 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
13 및 도 13: 증가하는 크기의
폴리
(
A:U
) 및
dsRNA
422, 432, 442, 532, 533, 534, 535는 단독으로 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의
TLR3
-의존성 아폽토시스를 유발시킴.
1.104 NCI-H292 WT 또는 TLR3 KO 세포를 p96-웰 플레이트 (GREINER, USA, Cat#655098)를 사용하여 웰당 100 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 50 μg/mL의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리한 후에, Promega의 실시간 Glo AnnexinV 키트 (France, Cat#JA1000)를 사용하여 아넥신V+ 발광 판독으로 아폽토시스를 측정하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 적어도 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
14 및 도
14: 2가지
상이한 화학적 제조 기술로 제조된
532에 대한 반응으로 마우스
마크로파지
RAW264
.7 세포에 의한
TNF
-알파의 분비.
동결건조된 dsRNA를 TBDMS 또는 2'ACE의 2가지 상이한 화학적 제조 기술을 사용하여 DHARMACON으로부터 입수하였다. 5.104 RAW264.7 세포를 p96-웰 플레이트 (CORNING, USA, Cat#353072)의 웰당 200 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 1 내지 100 μg/mL 범위의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, 상등액을 수확하여 ELISA (BioLegend, USA Cat#430903)로 mTNF-알파 분비를 측정하였다. 데이터는 적어도 3개의 상이한 분석의 평균이고, 적어도 6개의 독립적인 분석을 나타낸다. 통계 분석은 two-tailed unpaired t-student 테스트를 사용하여 수행하였다; NS = p> 0.05로 유의하지 않음.
실시예
15 및 도
15: 2개의
상이한 제조사로부터 제조된
532에 대한 반응으
로 마우스 마크로파지 RAW264.7 세포에 의한 TNF-알파의 분비.
동결건조된 dsRNA를 DHARMACON 또는 BIOSPRING으로부터 입수하였다. 5.104 RAW264.7 세포를 p96-웰 플레이트 (CORNING, USA, Cat#353072)의 웰당 200 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 1 내지 100 μg/mL 범위의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, 상등액을 수확하여 ELISA (BioLegend, USA Cat#430903)로 mTNF-알파 분비를 측정하였다. 데이터는 적어도 5개의 상이한 실험의 평균이다. 통계 분석은 two-tailed unpaired t-student 테스트를 사용하여 수행하였다; NS = p> 0.05로 유의하지 않음.
실시예
16 및 도 16: 상이한 화학적 제조 합성 및 상이한 제조사로부터의 532는 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 동일한 아폽토시스 수준을 유발함.
동결건조된 dsRNA를 TBDMS 또는 2'ACE의 2개의 상이한 화학적 제조 기술을 사용하여 DHARMACON으로부터 입수하고; 또한, 동결건조된 dsRNA는 BIOSPRING으로부터 입수하였다. 1.104 NCI-H292 WT 세포를 p96-웰 플레이트 (GREINER, USA, Cat#655098)를 사용하여 웰당 100 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 1 내지 100 μg/mL 범위의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리하고, Promega의 실시간 Glo AnnexinV 키트 (France, Cat#JA1000)를 사용하여 아넥신V+ 발광 판독으로 아폽토시스를 측정하였다. 데이터는 적어도 4개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
17 및 도 17: 상이한 화학적 제조 합성으로부터의 532는 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 동일한 세포 생존율 감소 수준을 유발함.
동결건조된 dsRNA를 TBDMS 또는 2'ACE의 2가지 상이한 화학적 제조 기술을 사용하여 DHARMACON으로부터 입수하였다. 1.104 NCI-H292 WT 세포를 p96-웰 플레이트 (GREINER, USA, Cat#655098)를 사용하여 웰당 100 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 1 내지 100 μg/mL 범위의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리한 후에, Promega의 세포 역가 수용액 (Cell Titer Aqueous solution) (France, Cat#G3580)으로 세포 생존률을 측정하였다. 데이터는 적어도 4개의 독립적인 분석을 나타낸다. 통계 분석은 two-tailed unpaired t-student 테스트를 사용하여 수행하였다; NS = p> 0.05로 유의하지 않음.
실시예
18 및 도 18: 상이한 제조사로부터의 532는 인간 비-소세포 폐암 세포 NCI-H292의 동일한 세포 생존율 감소 수준을 유발함.
동결건조된 dsRNA를 DHARMACON 또는 BIOSPRING으로부터 입수하였다. 1.104 NCI-H292 WT 세포를 p96-웰 플레이트 (GREINER, USA, Cat#655098)를 사용하여 웰당 100 μL의 최종 부피로 시딩하였다. 24시간 후에, 세포를 1 내지 100 μg/mL 범위의 최종 농도로 형질감염 시약이 없이 dsRNA로 24시간 동안 처리한 후에, Promega의 세포 역가 수용액 (France, Cat#G3580)으로 세포 생존률을 측정하였다. 데이터는 적어도 5개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
19 및 도 19:
RNAse
I 및
RNAse
III에 대한
폴리
(
A:U
) 및
dsRNA
532 민감도의 분석 및 천연 6% 아크릴아미드 겔 (TBE 1X)에서 분석.
RNAse I은 서열에 관계없이 이중-가닥 RNA보다 단일-가닥 RNA에 대한 선호도가 높은 RNAse인 반면, RNAse III는 이중-가닥 RNA를 짧은 12-30개 염기의 dsRNA로 절단하는 RNAse이다. DHARMACON으로부터 입수한 동결건조된 dsRNA를 제조사 프로토콜에 따라 무균 무-RNAse 생리수 (INVIVOGEN) 중에 재현탁하였다. 1 μg의 dsRNA를 먼저 1 유닛의 RNAse I (ThermoFischer AMBION, Cat#AM2294) 또는 1 유닛의 RNAse III (ThermoFischer AMBION, Cat#AM2290)과 37 ℃에서 10분 또는 30분 동안 인큐베이션한 후에 RNA 로딩 버퍼 (Invitrogen)를 부가하고, 하기와 같이 준비된 6% 아크릴아미드 겔 중에 로딩하였다: 10.3 mL의 무균 무-RNAse 물 (Sigma-Aldrich), 1.5 mL의 TBE 10x (Sigma-Aldrich), 3 mL의 아크릴아미드-비스 30% (Merck Chemicals), 0.2 mL의 APS (Sigma-Aldrich), 20 μL의 TEMED (Sigma-Aldrich). RNA 래더는 Invitrogen으로부터 구입하였다. 샘플 이동은 100V로 45분 동안 설정한 후에 1 μg/mL의 BET (Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 그 다음에 Gel Doc 분석기 (BIORAD)를 사용하여 겔을 시각화하였다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 적어도 2개의 독립적인 분석을 나타낸다.
실시예
20 및 도 20: Q-
PCR
기기 분석을 사용한 RNA 용융 곡선 프로파일의 분석.
DHARMACON으로부터 입수한 동결건조된 dsRNA를 제조사 프로토콜에 따라 무균 무-RNAse 생리수 (INVIVOGEN) 중에 재현탁하였다. 1 μg의 dsRNA를 SyBr 그린 PCR 믹스 (Biorad, Cat#1725270)와 혼합한 후에, Biorad의 Q-PCR 기기 (Biorad, CFX Connect)를 사용하여 용융 곡선 분석을 수행하였다. 진한 선은 각 그래프 위에 명명된 dsRNA에 해당한다. PAU = 고분자량의 상용 폴리(A:U). 데이터는 적어도 3개의 독립적인 분석을 나타낸다.
| 분자 | 뮤린 (murine) 골수성 마크로파지 RAW264.7 세포의 염증 | 인간 상피 비-소세포 폐암 NCI-H292 | |
| 염증 | 아폽토시스 | ||
| 상용 폴리(A:U) PAU | ++ | ++ | ++ |
| 폴리 (I:C) 50pb #411 | - | - | - |
| 폴리 (I:C) 70pb #535 | - | ++ | ++ |
| 폴리 (A:U) 50pb #412 | ++ | - | - |
| 폴리 (A:U) 70pb #432 | ++ | + | + |
| 폴리 (I10A50I10:C10U50C10) 70pb #532 | ++ | ++ | ++ |
| 폴리 (A35I35:C35U35) 70pb #533 | ++ | ++ | ++ |
| 폴리 (A10I50A10:U10C50U10) 70pb #534 | - | ++ | ++ |
| 염기 조성 | 분자 | 뮤린 골수성 마크로파지 RAW264.7 세포의 염증 | 인간 상피 비-소세포 폐암 NCI-H292 | |
| 염증 | 아폽토시스 | |||
| (A:U)>50% | 상용 폴리(A:U) PAU | +++ | +++ | +++ |
| 폴리(AU:AU) 50pb #413 | - | - | - | |
| 폴리(A:U) 50pb #412 | +++ | - | - | |
| 폴리(A:U) 60pb #422 | +++ | + | + | |
| 폴리(A:U) 70pb #432 | +++ | ++ | ++ | |
| 폴리(A:U) 80pb #442 | +++ | ++ | +++ | |
| 폴리(A:U) 90pb #452 | +++ | ++ | ++ | |
| 폴리(I10A50I10:C10U50C10) 70pb #532 | +++ | +++ | +++ | |
| (A:U)=(I:C)=50% | 폴리(A35I35:C35U35) 70pb #533 | +++ | +++ | +++ |
| (I:C)>50% | 폴리(I:C) 50pb #411 | - | - | - |
| 폴리(I:C) 70pb #535 | - | +++ | +++ | |
| 폴리(A10I50A10:U10C50U10) 70pb #534 | - | +++ | +++ | |
[표 2]
RAW264.7 및 NCI-H292 세포 활성화에 대한 dsRNA의 길이 및 염기 조성의 효과. 범례 : - = 부정적 효과, + /- = 경계선, + 내지 +++ = 긍정적 활성화 증가.
SEQUENCE LISTING
<110> TOLLYS
<120> TLR3 ligands that activate both epithelial and myeloid cells
<130> BET18L0177
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210>
<211>
<212>
<213>
1
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 1
uacnucauau annnaccuau nuuaucuncn unuccaaccu uannauucac 50
<210>
<211>
<212>
<213>
2
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 2
nunaauccua annuunnaca cncanauaac auannucccu auaunacnua 50
<210>
<211>
<212>
<213>
3
50
RNA
Artificial Sequence
Page 1
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 3
ucnnucnacn caancnauua cacuccunuc acaucauaau cnuuuncuau 50
<210>
<211>
<212>
<213>
4
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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auancaaacn auuaunaunu nacannanun uaaucncuun cnucnaccna 50
<210>
<211>
<212>
<213>
5
50
RNA
Artificial Sequence
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<223> sense RNA
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<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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aaunaanuau unncanacau unanunccna acaanaccun accuaacnnu 50
<210>
<211>
6
50
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_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
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accnuuannu cannucuunu ucnncacuca aunucuncca auacuucauu 50
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 7
cncunuuuuc naaauuaccc uuuauncncn nnuauunaac cacncuuaun 50
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> in=i
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Page 3
<210>
<211>
<212>
<213>
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
9
50
RNA
Artificial Sequence
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<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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nnaanununn cuanaucuua ncuuacnuca cuanannnuc cacnuuuanu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
10
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 10
acuaaacnun nacccucuan unacnuaanc uaanaucuan ccacacuucc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
11
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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aanananucu cauaauacnu ccnnccncau ncncannnua uauuunnaca 50
Page 4
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<210>
<211>
<212>
<213>
12
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 12
unuccaaaua uacccuncnc auncnnccnn acnuauuaun anacucucuu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
13
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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auanaaacua cannacuaac cuuccunnca accnnnannu nnnaauccnu 50
<210>
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<213>
14
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
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<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<400> 14
acnnauuccc accucccnnu unccannaan nuuanuccun uanuuucuau
<210>
<211>
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<213>
15
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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nannannanu cnucanacca nauancuuun aunuccunau cnnaannauc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
16
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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nauccuuccn aucannacau caaancuauc unnucunacn acuccuccuc 50
<210>
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17
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
misc_feature
(1)..(50)
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_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<223> n=i
<400> 17
nnauacnana uccnuanauu nauaannnac acnnaauauc cccnnacnca
<210>
<211>
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<213>
18
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 18
uncnuccnnn nauauuccnu nucccuuauc aaucuacnna ucucnuaucc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
19
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
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<221>
<222>
<223>
misc_feature
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n=i
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acnuucuaan anuunnacna aaunuuucnc naccuannau nannucnccc 50
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<211>
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<213>
20
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
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<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<400> 20
nnncnaccuc auccuannuc ncnaaacauu ucnuccaacu cuuanaacnu 50
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<212>
<213>
21
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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uacnuancaa nnunacacaa ncacanuana uccuncccnc nuuuccuaun 50
<210>
<211>
<212>
<213>
22
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 22
cauannaaac ncnnncanna ucuacununc uununucacc uuncuacnua 50
<210>
<211>
<212>
<213>
23
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
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<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 23
cuanuununn auunnauunc cauucuccna nunuauuacc nunacnnccn 50
<210>
<211>
<212>
<213>
24
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 24
cnnccnucac nnuaauacac ucnnanaaun ncaauccaau ccacaacuan 50
<210>
<211>
<212>
<213>
25
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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cacnnnuccc aunuaaunca nucnuanccu accunacunu acuunnaanu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
26
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
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<223> antisense RNA
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
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n=i
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acuuccaanu acanucannu anncuacnac uncauuacau nnnacccnun 50
<210>
<211>
<212>
<213>
27
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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naccnnacna accacananc ncunnaanaa ucucuancun cuuuacaaan 50
<210>
<211>
<212>
<213>
28
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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cuuunuaaan cancuanana uucuuccanc ncucununnu ucnuccnnuc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
29
50
RNA
Artificial Sequence
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_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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uuucccacun ccuuaanccn ncuuncccuu ucunccunua nauccauunn 50
<210>
<211>
<212>
<213>
30
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 30
ccaaunnauc uacanncana aannncaanc cnncuuaann canunnnaaa 50
<210>
<211>
<212>
<213>
31
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
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ncaacuucna nnaccuaaun unaccnaccu anauucnnca uununnncan 50
<210>
<211>
32
50
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 32
cuncccacaa unccnaaucu annucnnuca cauuannucc ucnaanuunc 50
<210> 33
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 33
naucuaunnc nunanacccn uuauncucca uuacnnucan unnnucacan 50
<210> 34
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 34
cununaccca cunaccnuaa unnancauaa cnnnucucac nccauanauc 50
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<210>
<211>
<212>
<213>
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
35
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 35
acuncnacnu ucuaaacnuu nnuccnucan aancnccauc cannaucacn 50
<210>
<211>
<212>
<213>
36
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 36
cnunauccun naunncncuu cunacnnacc aacnuuuana acnucncanu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
37
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 37
acunnuncca acncncannc auanuucnan nanaauuauc cnnnnncaau 50
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_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<210>
<211>
<212>
<213>
38
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 38
auuncccccn nauaauucuc cucnaacuau nccuncncnu unncaccanu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
39
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 39
nacaaccanc aucucnnnuc uuncccaacc cnucuacacn cunuuauanc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
40
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> anrisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=1
Page 14
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<400> 40
ncuauaacan cnunuanacn nnuunnncaa nacccnanau ncunnuunuc
<210>
<211>
<212>
<213>
41
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 41
cauncuancn uncnnnnuac acuuncuaac cauuunnnac acnnnacacu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
42
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 42
anunucccnu nucccaaaun nuuancaanu nuaccccnca cncuancaun 50
<210>
<211>
<212>
<213>
43
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
misc_feature
(1)..(50)
Page 15
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<223> n=i
<400> 43
auanacnnac ancuunnuau ccunancaca nucncncnuc cnaaucuanc
<210>
<211>
<212>
<213>
44
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 44
ncuanauucn nacncncnac ununcucann auaccaancu nuccnucuau 50
<210>
<211>
<212>
<213>
45
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 45
uacccauacu ccaccnuunn cannnnnauc ncaunuccca cnunaaacau 50
<210>
<211>
<212>
<213>
46
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
Page 16
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<400> 46
aunuuucacn unnnacaunc naucccccun ccaacnnunn anuaunnnua 50
<210>
<211>
<212>
<213>
47
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 47
anuacaanac uanccuuncu ancaaccncn nncunnnanc cuaannuauc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
48
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 48
nauaccuuan ncucccancc cncnnuuncu ancaanncua nucuunuacu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
49
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
Page 17
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 49
uucancncnc anncuunnnu cnanauaaaa ucuccanunc ccaanaccac 50
<210>
<211>
<212>
<213>
50
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 50
nunnucuunn ncacunnana uuuuaucucn acccaanccu ncncncunaa 50
<210>
<211>
<212>
<213>
51
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 51
ncaacnnaac nuccuuancu ccnncannca auuaannnna acncaancau 50
<210>
<211>
<212>
<213>
52
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
Page 18
<223> antisense RNA
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 52
auncuuncnu uccccuuaau unccunccnn ancuaannac nuuccnuunc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
53
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 53
nuaucauunu ncaccunccn nunaccacuc aacnaununn nnacnccnuu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
54
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 54
aacnncnucc ccacaucnuu nanunnucac cnncannunc acaaunauac 50
<210>
<211>
<212>
<213>
55
50
RNA
Artificial Sequence
Page 19
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 55
nuuacccaua unnuccacan nacacucnuc ncuuccnnnc uuncccucua 50
<210>
<211>
<212>
<213>
56
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 56
uanannncaa ncccnnaanc nacnanunuc cununnacca uaunnnuaac 50
<210>
<211>
<212>
<213>
57
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 57
acncunucuc unncacnunn nunnccuana nnaaucacau ccaanccunn 50
<210>
<211>
58
50
Page 20
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 58
ccanncuunn aununauucc ucuannccac ccacnuncca nanacancnu 50
<210> 59
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 59
nucnunncaa unuucnucun nnununnucu acacaauncn nncnnuncnu 50
<210> 60
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 60
acncaccncc cncauununu anaccacacc canacnaaca uunccacnac 50
Page 21
<210>
<211>
<212>
<213>
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
61
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 61
unncanacac accnunaccc cnccucucca uunaunccac nncnaaunuc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
62
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 62
nacauucncc nunncaucaa unnananncn nnnucacnnu nunucuncca 50
<210>
<211>
<212>
<213>
63
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 63
ancccuucuc cccuncnncc acncccnuan anaucacncc uuunacccuc 50
Page 22
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<210>
<211>
<212>
<213>
64
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 64
nannnucaaa nncnunaucu cuacnnncnu nnccncannn nanaannncu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
65
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 65
acncuncann acuuncaacc nnncanacuc nncnncannu ccuanuncan 50
<210>
<211>
<212>
<213>
66
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
Page 23
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<400> 66
cuncacuann accunccncc nanucunccc nnuuncaanu ccuncancnu
<210>
<211>
<212>
<213>
67
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 67
nncnaanncc cuaacnnnan auacncnccc acaacucnnc ncnaauacnn 50
<210>
<211>
<212>
<213>
68
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 68
ccnuauucnc nccnanuunu nnncncnuau cucccnuuan nnccuucncc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
69
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
misc_feature
(1)..(50)
Page 24
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<223> n=i
<400> 69
ncaccanauc unuaannucc nccacncana cnannccnnn cnnanaccac
<210>
<211>
<212>
<213>
70
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 70
nunnucuccn cccnnccucn ucuncnunnc nnaccuuaca naucunnunc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
71
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 71
uccunnanna nnnncnnaua nccucuuacc cnunccccac cnuunncnnu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
72
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
Page 25
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<400> 72
accnccaacn nunnnncacn nnuaanannc uauccncccc uccuccanna 50
<210>
<211>
<212>
<213>
73
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 73
uncnccnnuc cccanccncn cucauncucn ncaccnccau aaccanaccn 50
<210>
<211>
<212>
<213>
74
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 74
cnnucunnuu aunncnnunc cnancaunan cncnncunnn naccnncnca 50
<210>
<211>
<212>
<213>
75
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
Page 26
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 75
uanccncccc unnnccncnn uccncuaccu uncannaauc nannccnucc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
76
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 76
nnacnnccuc nauuccunca annuancnna ccncnnccca nnnncnncua 50
<210>
<211>
<212>
<213>
77
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 77
ncuncuucnn cnccccnnnc ncaccccunc cncnnnnncn nnaucncccn 50
<210>
<211>
<212>
<213>
78
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
Page 27
<223> antisense RNA
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 78
cnnncnaucc cncccccncn ncannnnunc ncccnnnncn ccnaancanc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
79
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 79
nucnncnccc nnccccccnn ccccncancn nncuccccnc ccnnnccncc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
80
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 80
nncnncccnn ncnnnnancc cncuncnnnn ccnnnnnncc nnncnccnac 50
<210>
<211>
<212>
<213>
81
50
RNA
Artificial Sequence
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_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 81
nnnnnnccca cncnncnncn ccnccnncnc ccccnnnncn ccccncnucn 50
<210>
<211>
<212>
<213>
82
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 82
cnacncnnnn cnccccnnnn ncnccnncnn cnccnccncn unnncccccc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
83
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 83
cnnnccnncn nnnnncnnnc nnnnnccccu nncccncccn ncnccccncn 50
<210>
<211>
84
50
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_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 84
cncnnnncnc cnnncnnncc annnnccccc ncccnccccc cnccnncccn 50
<210> 85
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 85
nnnccnnnnc nnccccnnnc nncnnccncc nnccccnncn ncnnnncncc 50
<210> 86
<211> 50
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> n=i
<400> 86
nncnccccnc cnccnnnncc nncnnccncc ncccnnnncc nccccnnccc 50
Page 30
<210>
<211>
<212>
<213>
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
87
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 87
nnauannnnc nnccccnnnc nncnnccncc nnccccnncn ncnnnncnuu 50
<210>
<211>
<212>
<213>
88
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 88
aacnccccnc cnccnnnncc nncnnccncc ncccnnnncc nccccuaucc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
89
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<400> 89
auuuaaaaaa uaaauauaau aaaauauaau uuaauuaauu auuuauuaau 50
<210>
<211>
<212>
<213>
90
50
RNA
Artificial Sequence
Page 31
_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<220>
<223> antisense RNA
<400> 90
auuaauaaau aauuaauuaa auuauauuuu auuauauuua uuuuuuaaau
<210>
<211>
<212>
<213>
91
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<220>
<221>
<222>
<223>
misc_feature
(1)..(50)
n=i
<400> 91
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 50
<210>
<211>
<212>
<213>
92
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<400> 92
cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc cccccccccc 50
<210>
<211>
<212>
<213>
93
50
RNA
Artificial Sequence
<220>
<223> sense RNA
<400> 93
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 50
<210>
<211>
94
50
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_BEX19L0115_Filed Sequences txt.txt
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense RNA
<400> 94
uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu
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Claims (14)
- 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 2개의 상보적 가닥을 갖는 dsRNA로 필수적으로 구성되고, 폴리 A의 적어도 하나의 블록 또는 호모폴리머 및 폴리 U의 상보적 블록 또는 호모폴리머를 포함하며, 각 블록은 적어도 15, 20, 25 또는 30개의 A, 또는 U를 포함하고, 각 가닥은 50 내지 200개의 염기, 바람직하게는 55 내지 200개의 염기의 결정된 길이를 갖는 것인 이중-가닥 RNA (dsRNA), 및
약학적으로 허용 가능한 비히클, 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물. - 청구항 1에 있어서, 상기 dsRNA는 하기 식 (I)에 따른 A의 적어도 하나의 블록을 갖고, 상기 dsRNA는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%의, A 및 U를 포함하는 것인 조성물:
(I) [P]a [Q]b [R]c
- Q는 A 또는 U의 호모폴리머를 나타내고, b는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 초과의 정수이며;
- a 및 c는 독립적으로 0, 또는 a + b + c = 50 내지 200, 바람직하게는 60 내지 120, 더욱 바람직하게는 70 내지 100이 되는 정수일 수 있고; a, b 및 c는 동일하거나 또는 상이할 수 있으며;
- a = 1이면, Q = A인 경우, P는 U, G, I 및 C 중 하나의 염기로 이루어지고; Q = U인 경우, P는 A, G, I 및 C 중 하나의 염기로 이루어지며;
- a > 1이면, P는 A, U, G, I 및 C 중 적어도 1개 또는 2개의 염기로 이루어지는 것으로서, A, U, G, I 및 C 중 적어도 2개의 무작위 조합, A, U, G, I 및 C 중 염기의 1개의 블록, A, U, G, I 및 C 중 상이한 염기들의 적어도 2개의 블록, 또는 A, U, G, I 및 C 중 염기의 적어도 1개의 블록과 A, U, G, I 및 C 중 적어도 하나의 다른 염기의 혼합물의 구성 중 하나이고;
- c = 1이면, R = A인 경우, R은 U, G, I 및 C 중 하나의 염기로 이루어지고; R = U인 경우, P는 A, G, I 및 C 중 하나의 염기로 이루어지며;
- c > 1이면, R은 A, U, G, I 및 C 중 적어도 1개 또는 2개의 염기로 이루어지는 것으로서, A, U, G, I 및 C 중 적어도 2개의 무작위 조합, A, U, G, I 및 C 중 염기의 1개의 블록, A, U, G, I 및 C 중 상이한 염기들의 적어도 2개의 블록, 또는 A, U, G, I 및 C 중 염기의 적어도 1개의 블록과 A, U, G, I 및 C 중 적어도 하나의 다른 염기의 혼합물의 구성 중 하나이고;
- P 및 R은 염기 및/또는 서열 길이의 측면에서 동일하거나 또는 상이할 수 있다. - 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 dsRNA는 식 (II)을 갖는 것인 조성물:
[A]b
[U]b
b = 50 내지 200, 최선으로는 약 55 내지 약 100, 150 또는 200, 바람직하게는 약 60 내지 약 120, 바람직하게는 약 70 내지 약 100, 예컨대 약 60, 약 70, 약 80, 약 90이다. - 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 dsRNA는 식 (III)을 갖는 것인 조성물:
[P]a [A]b [R]c
[Y]a [U]b [Z]c
P 및 R은 G, I 및/또는 C 중에서 선택되고, Y 및 Z는 상보적 염기이다.
특히,
b = 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
a 및 c는 독립적으로 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40이다. - 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 dsRNA는 식 (IV)을 갖는 것인 조성물:
[A]b [R]c
[U]b [Z]c
R은 G, I 및/또는 C 중에서 선택되고, Z는 상보적 염기이다.
특히,
b = 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
c = 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40, 바람직하게는 약 30 내지 약 40, 예컨대 약 35, 약 40, 약 45이다. - 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 dsRNA는 식 (V)을 갖는 것인 조성물:
[P]a [A]b
[Y]a [U]b
P는 G, I 및/또는 C 중에서 선택되고, Y는 상보적 염기이다.
특히,
b = 20, 25 또는 30 내지 100, 특히 약 35 내지 약 100, 특히 약 40 내지 약 100, 최선으로는 약 50 내지 약 100, 예컨대 약 50 내지 약 90, 바람직하게는 약 50 내지 약 80, 예컨대 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80의 정수이고,
a = 약 10 내지 약 50, 바람직하게는 약 15 내지 약 40, 바람직하게는 약 30 내지 약 40, 예컨대 약 35, 약 40, 약 45이다. - 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 dsRNA는 식 (VI)을 갖는 것인 조성물:
[P]a [A]b [R]c
[Y]a [U]b [Z]c
P 및 R은 독립적으로 I 및 C 중에서 선택되고, Y 및 Z는 상보적 염기이며,
b = 약 20, 25 또는 30 내지 약 100 사이의 정수이고,
a 또는 c 중 하나는 0일 수 있고, a 및 c는 동시에 0은 아니며, 약 10 내지 약 50이다. - 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 A의 블록(들)은 U, G, I 및 C 중 다른 하나의 염기를 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% 미만으로 함유하는 것인 조성물.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 1 ml 당 상기 dsRNA를 0.01 내지 100 mg으로 포함하는 것인 조성물.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 약물로서의 조성물.
- 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, TLR3 수용체를 발현하는 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것인 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 조성물은 골수 세포 (myeloid cells)를 활성화시키고, 상피암 (epithelial cancer) 세포의 사멸을 유발하는 것인 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 조성물은 골수 세포에 의해 발현되는 TLR3을 활성화시키고, 염증성 사이토카인 및 케모카인의 분비를 유도하며, 염증의 TLR3-의존성 활성화 및 인간 또는 포유동물의 암세포의 사멸을 유발하는 것인 조성물.
- 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 및 화학요법제를 포유동물 또는 인간에게 동시, 개별 또는 순차적으로 투여하기 위한 것인 조성물.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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