ES2672513T3 - Ligandos de diacilhidrazina quirales para modular la expresión genética exógena a través del complejo del receptor de ecdisona - Google Patents

Ligandos de diacilhidrazina quirales para modular la expresión genética exógena a través del complejo del receptor de ecdisona Download PDF

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Abstract

Un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: N-(1-tert-butil-butil)-N'-(2-etil-3-metoxibenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N'-benzoil-N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N'-(2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-5 dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N'-(2-fluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N'-(2-bromo-benzoil)-N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N'-(3-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N'-(4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N'-(2-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N'-(6-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; y N-(1-tert-butil-butil)-N'- (3-metoxi-2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCIÓN
Ligandos de diacilhidrazina quirales para modular la expresión genética exógena a través del complejo del receptor de ecdisona
Antecedentes de la invención Campo de la invención
Esta invención se refiere a los campos de biotecnología, ingeniería genética y química medicinal. La invención se refiere al campo de la expresión genética. La invención también se refiere a ligandos de diacilhidrazina y ligandos de diacilhidrazina quirales para receptores nucleares naturales y mutados y su uso en un sistema de expresión genética inducible con base en el receptor nuclear y métodos para modular la expresión de un gen dentro de una célula anfitriona que utiliza estos ligandos y sistema de expresión genética inducible.
Antecedentes
Se citan en este documento diversas publicaciones.
En el campo de la ingeniería genética, el control preciso de la expresión genética es una valiosa herramienta para estudiar, manipular y controlar el desarrollo y otros procesos fisiológicos. La expresión genética es un proceso biológico complejo que implica una serie de interacciones proteína-proteína específicas. Con el fin de que se active la expresión genética, de tal manera que se produzca el ARN necesario como la primera etapa en la síntesis de proteínas, se debe llevar un activador transcripcional a la proximidad de un promotor que controla la transcripción de genes. Normalmente, el propio activador transcripcional se asocia con una proteína que tiene por lo menos un dominio de unión a ADN que se une a sitios de unión de ADN presentes en las regiones promotoras de los genes. De esta manera, para que ocurra la expresión genética, una proteína que comprende un dominio de unión de ADN y un dominio de transactivación ubicado a una distancia apropiada del dominio de unión de ADN se debe llevar a la posición correcta en la región promotora del gen.
El método transgénico tradicional utiliza un promotor específico al tipo de célula para conducir la expresión de un transgén diseñado. Una construcción de ADN que contiene el transgén se incorpora primero en un genoma anfitrión. Cuando se activa por un activador transcripcional, la expresión del transgén se produce en un tipo de célula dado.
Otro medio para regular la expresión de genes extraños en células es a través de promotores inducibles. Ejemplos de uso de dichos promotores inducibles incluyen el promotor PR1-a, sistemas de represor-operador procariótico, sistemas de inmunofilina inmunosupresores, y sistemas de activación de transcripción eucariotas superiores tales como sistemas receptores de hormonas esteroides y se describen a continuación.
El promotor PR1-a del tabaco se induce durante la respuesta adquirida por resistencia sistémica después de ataque del patógeno. El uso de PR1-a puede estar limitado porque a menudo responde a materiales endógenos y factores externos tales como patógenos, radiación UV-B, y contaminantes. Se han descrito sistemas de regulación de genes con base en promotores inducidos por choque térmico, el interferón y los metales pesados (Wurn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5414-5418 (1986); Arnheiter et al., Cell 62:51 -61 (1990); Filmus et al., Nucleic Acids Research 20:27550-27560 (1992)). Sin embargo, estos sistemas tienen limitaciones debido a su efecto sobre la expresión genética no objetivo. Estos sistemas también tienen fugas.
Los sistemas de represor-operador procariótico utilizan proteínas represoras bacterianas y las secuencias de ADN de operador únicas a las que se unen. Los sistemas de represor-operador de tanto tetraciclina (“Tet”) como de lactosa (“Lac”) de la bacteria Escherichia coli se han utilizado en plantas y animales para controlar la expresión genética. En el sistema Tet, la tetraciclina se une a la proteína represora de TetR, dando como resultado un cambio conformacional que libera la proteína represora del operador que como resultado permite que ocurra la transcripción, en el sistema Lac, un operón lac se activa en respuesta a la presencia de lactosa, o análogos sintéticos tales como isopropil-b-D-tiogalactósido. Desafortunadamente, el uso de dichos sistemas se restringe por la química inestable de los ligandos, es decir tetraciclina y lactosa, su toxicidad, su presencia natural, o los niveles relativamente altos requeridos para inducción o represión. Por razones similares, se limita la utilidad de dichos sistemas en animales.
Las moléculas inmunosupresoras tales como FK506, rapamicina y ciclosporina A se pueden unir las inmunofilinas FKBP 12, ciclofilina, etc. Utilizando esta información, se ha ideado una estrategia general para llevar juntas dos proteínas al colocar FK506 sobre cada una de las dos proteínas o al colocar FK506 sobre una y ciclosporina A sobre la otra. Un homodímero sintético de FK506 (FKl012) o un compuesto resultante de la fusión de FK506-ciclosporina (FKCsA) luego se puede utilizar para inducir la dimerización de estas moléculas (Spencer et al., Science 262:1019-24 (1993); Belshaw et al., Proc Natl Acad Sci USA 93:4604-7 (1996)). El dominio de unión a ADN de Gal4 fusionado al dominio activador de FKBP12 y VP16 fusionado a ciclofilina, y el compuesto de FKCsA se utilizaron para mostrar la heterodimerización y activación de un gen indicador bajo el control de un promotor que contiene sitios de unión de Gal4. Desafortunadamente, este sistema incluye inmunosupresores que pueden tener efectos secundarios no deseados y por lo tanto limita su uso para diversas aplicaciones de interruptores para genes de mamíferos.
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También se han empleado sistemas de activación de transcripción eucariótica superiores tales como sistemas receptores de hormonas esteroides. Los receptores de hormonas esteroides son miembros de la superfamilia del receptor nuclear y se encuentran en células de vertebrados e invertebrados. Desafortunadamente, el uso de compuestos esteroides que activan los receptores para la regulación de la expresión genética, particularmente en plantas y mamíferos, se limita debido a su implicación en muchas otras rutas biológicas naturales en dichos organismos. Con el fin de superar dichas dificultades, se ha desarrollado un sistema alternativo utilizando receptores de ecdisona de insectos (EcR).
El crecimiento, muda y desarrollo en insectos se regulan por la hormona esteroide de ecdisona (hormona de muda) y las hormonas juveniles (Dhadialla et al., Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569 (1998)). El objetivo molecular para la ecdisona en insectos consiste en por lo menos un receptor de ecdisona (EcR) y una proteína ultraespiráculo (USP). El EcR es un miembro de la superfamilia del receptor esteroide nuclear que se caracteriza por el ADN de firma y los dominios de unión al ligando, y un dominio de activación (Koelle et al., Cell, 67: 59-77 (1991)). Los receptores EcR son sensibles a una serie de compuestos esteroides tales como ponasterona A y muristerona A. Recientemente, se han descrito compuestos no esteroides con actividad agonista ecdiesteroide, QUE incluyen los insecticidas comercialmente disponibles tebufenozida y metoxifenozida que se comercializan en el mundo por Rohm and Haas Company (véase documentos WO 96/27673 y US 5,530,028). Ambos análogos tienen perfiles de seguridad excepcionales en otros organismos.
El receptor de ecdisona de insectos (EcR) se heterodimeriza con Ultraespiráculo (USP), el homólogo de insectos del receptor X retinoide de mamífero (RXR), y une los ecdieroides y elementos de respuesta del receptor de ecdisona y activa la transcripción de genes sensibles a ecdisona. Los complejos de EcR/USP/ligando cumplen funciones importantes durante el desarrollo y reproducción de insectos. El EcR tiene cinco dominios modulares, A/B (transactivación), C (unión De ADN, heterodimerización), D (Bisagra, heterodimerización), E (unión del ligando, heterodimerización y transactivación) y F (transactivación). Algunos de estos dominios tales como A/B, C y E conservan su función cuando se fusionan a otras proteínas.
Los sistemas de expresión genética inducibles regulados estrechamente o “interruptores para genes” son útiles para diversas aplicaciones tales como terapia génica, producción a gran escala de proteínas en células, ensayos de cribado de alto rendimiento con base en células, genómicos funcionales y regulación de rasgos en plantas y animales transgénicos.
La primera versión de un interruptor para gen con base en EcR utiliza EcR de Drosophila melanogaster (DmEcR) y RXR de Mus musculus (MmRXR) y mostró que estos receptores en presencia del esteroide, ponasterona, transactivan genes indicadores en estirpes celulares de mamíferos y ratones transgénicos (Christopherson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6314-6318 (1992); No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3346-3351 (1996)). Posteriormente, Suhr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7999-8004 (1998) mostró que el agonista de ecdisona no esteroide, tebufenozida, indujo un alto nivel de transactivación de genes indicadores en células de mamífero a través de EcR de Bombyx mori (BmEcR) en ausencia de un compañero de heterodímeros exógenos.
Los documentos WO 97/38117 y WO99/58155 divulgan métodos para modular la expresión de un gen exógeno en el cual una construcción de ADN que comprende el gen exógeno y un elemento de respuesta ecdisona se activa por una segunda construcción de ADN que comprende un receptor de ecdisona que, en presencia de un ligando del mismo, y opcionalmente en presencia de un receptor capaz de actuar como compañero silencioso, se une al elemento de respuesta ecdisona para inducir la expresión genética. El receptor ecdisona de elección se aisló de Drosophila melanogaster. Normalmente, dichos sistemas requieren la presencia del compañero silencioso, preferiblemente el receptor de retinoide X (RXR), con el fin de proporcionar activación óptima. Las células de mamífero, receptor de ecdisona de insectos (EcR) se heterodimeriza con el receptor X retinoide (RXR) y regula la expresión de los genes objetivo de una manera dependiente del ligando. El Documento WO 99/02683 divulga que el receptor de ecdisona aislado a partir de la polilla de seda Bombyx mori es funcional en sistemas de mamíferos sin necesidad de un compañero dimérico exógeno.
El documento US 6,265,173 B1 divulga que diversos miembros de la superfamilia esteroide/tiroides de receptores se pueden combinar con el receptor ultraespiráculo (USP)de Drosophila melanogaster o fragmentos del mismo que comprenden por lo menos el dominio de dimerización de USP para uso en un sistema de expresión genética. El documento US 5,880,333 divulga un EcR de Drosophila melanogaster y un sistema heterodímero ultraespiráculo (USP) utilizado en plantas en las que el dominio de transactivación y el dominio de unión de ADN Se colocan sobre dos proteínas híbridas diferentes. Desafortunadamente, estos sistemas con base en USP son constitutivos en células animales y, por lo tanto, no son efectivos para regular la expresión del gen indicador.
En cada uno de estos casos, el dominio de transactivación y el dominio de unión de ADN (ya sea como EcR nativa como en el documento WO 99/02683 o como EcR modificado como en el documento WO 97/38117) se incorporaron en una sola molécula y los otros compañeros heterodiméricos, ya sea USP o RXR, se utilizaron en su estado nativo.
Los inconvenientes de los sistemas de regulación de genes con base en EcR descritos anteriormente incluyen una considerable actividad de fondo en ausencia de ligandos y sin aplicabilidad de estos sistemas para uso tanto en plantas como en animales (véase el documento US 5,880,333). Por lo tanto, subsiste la necesidad en la técnica de sistemas con base en EcR mejorados para modular con precisión la expresión genética exógena tanto en plantas como en animales. Dichos sistemas mejorados serían útiles para aplicaciones tales como terapia génica, producción a gran escala de proteínas y anticuerpos, ensayos de cribado de alto rendimiento con base en células, genómicos funcionales y regulación
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de rasgos en animales transgénicos. Para ciertas aplicaciones tales como terapia génica, puede ser deseable tener un sistema de expresión genética inducible que responda bien a ligandos no esteroides sintéticos y al mismo tiempo sea insensible a los esteroides naturales. De esta manera, los sistemas mejorados que son simples, compactos y dependientes de ligandos que son relativamente baratos, y de baja toxicidad para el anfitrión serían útiles para regular los sistemas biológicos.
Recientemente, se ha mostrado que un sistema de expresión genética inducible con base en el receptor de ecdisona en el cual los dominios de transactivación y de unión de ADN se separan unos de otros al colocarlos en dos diferentes proteínas resulta en una actividad de fondo muy reducida en la ausencia de un ligando y una actividad significativamente incrementada sobre el fondo en presencia de un ligando (véase WO 01/70816 A1). Este sistema de dos híbridos es un sistema de modulación de expresión genética inducible significativamente mejorado en comparación con los dos sistemas divulgados en las solicitudes WO 97/38117 y WO 99/02683. El sistema de dos híbridos aprovecha la capacidad de un par de proteínas de interacción para llevar el dominio de activación de transcripción a una posición más favorable con relación al dominio de unión de ADN de tal manera que cuando el dominio de unión de ADN se une al sitio de unión de ADN sobre el gen, el dominio de transactivación activa más efectivamente el promotor (véase, por ejemplo, el documento US 5,283,173). Brevemente, el sistema de expresión genética inducible de dos híbridos comprende dos casetes de expresión genética inducible; el primero que codifica un dominio de unión a ADN fusionado a un polipéptido del receptor nuclear, y el segundo codifica un dominio de transactivación fusionado a un polipéptido del receptor nuclear diferente. En la presencia de ligando, la interacción del primer polipéptido con el segundo polipéptido ata de manera efectiva el dominio de unión a ADN al dominio de transactivación. Ya que los dominios de unión y transactivación de ADN residen en dos moléculas diferentes, la actividad de fondo en ausencia de ligando se reduce en gran medida.
El sistema de dos híbridos también proporciona sensibilidad mejorada a ligandos no esteroides, por ejemplo, diacilhidrazinas, en comparación con los ligandos esteroides por ejemplo, ponasterona A (“PonA”) o muristerona a (“MurA”). Es decir, cuando se compara con esteroides, los ligandos no esteroides proporcionan mayor actividad a menor concentración. Adicionalmente, ya que la transactivación se basa en interruptores para genes EcR es a menudo dependiente de la estirpe celular, es más fácil adaptar los sistemas de interruptor para genes para obtener la máxima capacidad de transactivación para cada aplicación. Adicionalmente, el sistema de dos híbridos evita algunos efectos secundarios debido a la sobrexpresión de RXR que a menudo se produce cuando se utiliza RXR no modificado como un compañero del receptor de heterodímero. En un sistema de dos híbridos, se eliminan los dominios de unión de ADN y transactivación nativos de EcR o RXR Y como resultado, estas moléculas híbridas tienen menos oportunidad de interactuar con otros receptores de hormonas esteroides presentes en la célula lo que resulta en efectos secundarios reducidos. Los sistemas de interruptor para genes adicionales incluyen aquellos descritos en los siguientes documentos: US 7,091,038; WO2004078924; EP1266015; US20010044151; US20020110861; US20020119521; US20040033600; US20040197861; US20040235097; US20060020146; US20040049437; US20040096942; US20050228016;
US20050266457; US20060100416; WO2001/70816; WO2002/29075; WO2002/066612; WO2002/066613;
WO2002/066614; WO2002/066615; WO2005/108617; US 6,258,603; US20050209283; US20050228016;
US20060020146; EP0965644; US 7,304,162; US 7,304,161; MX234742; KR10-0563143; AU765306; AU2002-248500; y AU2002-306550.
Los documentos US2005/209283 y WO2004/ 078924 describen ligandos no esteroides para uso en sistema de expresión genética inducible con base en el receptor nuclear, y un método para modular la expresión genética exógena. El complejo de receptor de ecdisona comprende: un dominio de unión a ADN; un dominio de unión a ligando; un dominio de transactivación; y un ligando se pone en contacto con una construcción de ADN que comprende: el gen exógeno y un elemento de respuesta; en el que el gen exógeno está bajo el control del elemento de respuesta y la unión del dominio de unión a ADN con el elemento de respuesta en la presencia del ligando resulta en activación o supresión del gen.
El documento US4985461 divulga composiciones insecticidas que contienen N'-N-diacilhidrazinas N'-sustituidas, métodos para utilizar dichas composiciones y ciertas N,N'-diacilhidrazinas N’-sustituidas insecticidas novedosas.
El documento US6326403 divulga compuestos que se pueden utilizar como inhibidores de integrinas, en particular para la profilaxis y el tratamiento de trastornos circulatorios, para trombosis, infarto de miocardio, enfermedades coronarias, arteriosclerosis, para procesos patológicos que se mantienen o se propagan por angiogénesis y en terapia de tumores.
Wheelock et al (High-throughput screening de ecdysone agonists using a reporter gene assay followed by 3-D QSAR analysis de the molting hormonal activity Bioorganic and Medicianl Chemistry 2006 Feb 15;14(4):1143-59) examinaron 172 análogos de diacilhidrazina por su capacidad para activar un gen indicador dependiente de ecdisona (hormona de muda) en un ensayo de cribado de alto rendimiento con base en células de gusano de seda (Bombyx mori).
Con la mejora en los sistemas de regulación de genes con base en receptores de ecdisona existe un aumento en su uso en diversas aplicaciones que resulta en un aumento de la demanda de ligandos con una actividad mayor que aquellos existentes actualmente. Los documentos US 6,258,603 B1, US 2005/0209283 A1 y US 2006/0020146 A1 (y las patentes citadas en esos documentos) divulgan ligandos de dibenzoilhidrazina. Sin embargo, subsiste la necesidad de ligandos adicionales con propiedades farmacológicas mejoradas. Los solicitantes han descubierto ligandos de diacilhidrazina quirales que no se han descrito previamente que tienen actividades biológicas sorprendentes y la capacidad para modular la expresión de transgenes de formas inesperadas.
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Resumen de la invención
La presente divulgación describe ligandos de diacilhidrazina de la Fórmula I y ligandos quirales de diacilhidrazina de la Fórmula II o III para uso con sistemas de expresión genética inducibles con base en el receptor de ecdisona útiles para modular la expresión de un gen objetivo de interés en una célula anfitriona. Los ligandos quirales de diacilhidrazina descritos están enantioméricamente enriquecidos en ya sea el estereoisómero R o S. La invención se refiere a un compuesto seleccionado del grupo que consiste de:
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxibenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N’-benzoil-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-fluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N’-(2-bromo-benzoil)-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(6-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; y
N-(1-tert-butil-butil)-N’-(3-metoxi-2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Los solicitantes han descubierto que estos ligandos de diacilhidrazina quirales novedosos son sorprendentemente efectivos. Por lo tanto, la presente invención es útil para aplicaciones tales como terapia génica, producción de proteínas y anticuerpos a gran escala, ensayos de cribado con base en células, genómicos funcionales, proteómicos, metabolómicos y regulación de rasgos en organismos transgénicos, en los que es deseable el control de los niveles de expresión genética inducible. Una ventaja de la presente invención es que proporciona un medio para regular la expresión genética inducible y adaptar los niveles de expresión para satisfacer los requisitos del usuario.
La presente invención también proporciona un método in vitro para modular la expresión de un gen endógeno o heterólogo en una célula anfitriona, en el que la célula anfitriona comprende un primer casete de la expresión de gen recombinante que comprende un primer polipéptido que codifica un primer polipéptido que comprende:
i) un dominio de unión a ADN; y
ii) un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H;
y un segundo casete de la expresión de gen recombinante que comprende:
i) un elemento de respuesta capaz de unirse a dicho dominio de unión a ADN;
ii) un promotor; y
iii) dicho gen endógeno o heterólogo;
el método que comprende poner en contacto dicha célula anfitriona con un compuesto de la invención; en el que se modula la expresión del gen endógeno o heterólogo.
Preferiblemente la célula anfitriona comprende:
(i) un primer casete de la expresión de gen recombinante que comprende un polipéptido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:
(a) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con dicho gen cuya expresión se va a modular; y
(b) un dominio de unión al ligando del receptor de ecdisona;
(ii) un segundo casete de la expresión de gen recombinante que comprende un polipéptido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:
(a) un dominio de transactivación; y
(b) un dominio de unión al ligando del receptor X del retinoide quimérico; y
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(iii) un tercer casete de la expresión de gen recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende:
(a) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;
(b) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y
(c) dicho gen endógeno o heterólogo.
La presente invención también proporciona un compuesto de la invención para uso en la regulación de la expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico en el que dicho compuesto se pone en contacto con un complejo de receptor de ecdisona dentro de las células de dicho sujeto, en el que dichas células contienen adicionalmente una secuencia de unión a ADN para dicho complejo de receptor de ecdisona cuando en combinación con dicho ligando, y en el que la formación de un complejo de secuencia de unión a ADN-ligando-complejo del receptor de ecdisona induce la expresión del gen, en el que se regula la expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico. Preferiblemente el compuesto es para uso en la regulación de la expresión del gen heterólogo en un sujeto transgénico, en el que dicho sujeto transgénico comprende un complejo de receptor de ecdisona recombinante capaz de regular la expresión del gen heterólogo.
La invención también proporciona un método in vitro para producir un polipéptido que comprende las etapas de:
(a) seleccionar un vertebrado;
(b) introducir en la célula anfitriona:
(i) una construcción de ADN que comprende:
(a) un gen exógeno que codifica el polipéptido; y
(b) un elemento de respuesta;
en el que el gen exógeno está bajo el control del elemento de respuesta; y
(ii) un complejo de receptor de ecdisona que comprende:
a) un dominio de unión a ADN que se une al elemento de respuesta;
b) un dominio de unión para dicho compuesto; y
c) un dominio de transactivación; y
(c) exponer la célula a dicho compuesto; en el que se produce un polipéptido.
La invención también proporciona un compuesto de la invención para uso en la modulación de la expresión de un gen exógeno en un sujeto, en el que las células del sujeto comprenden un sistema de modulación de expresión genética. Preferiblemente el gen exógeno codifica IL-12 humano.
La presente divulgación describe compuestos de la Fórmula I
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en la que
A es alcoxi, arilalquiloxi o ariloxi;
B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
R1 y R2 son independientemente alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II
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en la que
A es alcoxi, arilalquiloxi, ariloxi, arilalquilo, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
5 B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
R1 y R2 son independientemente alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
con la condición de que R1 no sea igual a R2;
10 en la que la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente S; o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula III
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en la que
15 A es alcoxi, arilalquiloxi, ariloxi, arilalquilo, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
R1 y R2 son independientemente alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
20 con la condición de que R1 no sea igual a R2;
en la que la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente R;
o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente invención se refiere a N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil- benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% o una sal farmacéuticamente aceptable, hidrato, forma 25 cristalina o forma amorfa de la misma.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende N-(1 - tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi- benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% o una sal farmacéuticamente aceptable, hidrato, forma cristalina o forma amorfa de la misma.
La presente divulgación también describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula IV
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en la que
A es arilalquilo, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
R2 es alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
con la condición de que R2 no sea igual a -CR8R9CHR10CR11R12; y
R8, R9, R10, R11 y R12 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo o heteroarilo;
en la que el átomo de carbono asimétrico al cual R2 se adhiere está enantioméricamente enriquecido en ya sea el isómero R o S; que comprende:
a) hacer reaccionar un compuesto de la Fórmula V
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con un compuesto de la Fórmula VI
R2HC=N-NH-CO2R7 Fórmula VI
en la que
X y Y son independientemente O o NR en la que R es alquilo o arilo;
Ca y Cb son independientemente un átomo de carbono asimétrico de la configuración S o un átomo de carbono asimétrico de la configuración R;
R14 y R15 son independientemente alquilo o arilo;
R13 es halo, hidrógeno, alquilo, alcoxi o OSO2CF3;
R7 es alquilo, arilalquilo o arilo; y
R2, R8, R9, R10, R11 y R12 tienen los mismos significados anotados anteriormente;
Para formar un compuesto de la Fórmula VII;
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b) reducir el compuesto de la Fórmula VII para formar un compuesto de la Fórmula VIII;
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imagen7
c) hacer reaccionar el compuesto de la Formula VIII con un compuesto de la Formula B-CO-LG en la que LG es un grupo saliente para formar un compuesto de la Fórmula IX;
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d) eliminar el grupo R7CO2- del compuesto de la Fórmula IX para formar un compuesto de la Fórmula X; y
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e) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula X con un compuesto de la Fórmula A-CO-LG en la que LG es un grupo saliente para formar un compuesto de la Fórmula IV.
La presente divulgación describe métodos para modular la expresión genética, en una célula anfitriona utilizando un sistema de modulación de expresión genética, con un ligando de diacilhidrazina de la invención.
La presente divulgación se refiere al uso de un ligando de diacilhidrazina de la invención en un sistema de expresión genética inducible que tiene un nivel reducido de expresión genética, de fondo y responde a concentraciones submicromolares del ligando.
La divulgación describe un método para modular la expresión de un gen objetivo en una célula anfitriona, en el que la célula anfitriona comprende un primer casete de expresión genética, que comprende un primer polipéptido que codifica un primer polipéptido que comprende:
i) un dominio de transactivación;
ii) un dominio de unión a ADN; y
iii) un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H; y un segundo casete de expresión genética, que comprende:
i) un elemento de respuesta capaz de unirse a dicho dominio de unión a ADN;
ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación; y
iii) dicho gen objetivo;
el método que comprende poner en contacto dicha célula anfitriona con un ligando de diacilhidrazina de la invención; en el que se modula la expresión del gen objetivo.
La presente divulgación describe un método para regular la expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico que comprende poner en contacto un ligando con un complejo de receptor de ecdisona dentro de las células del sujeto, en el que las células contienen adicionalmente una secuencia de unión a ADN para el complejo de receptor de ecdisona cuando en combinación con el ligando y en el que la formación de un complejo de secuencia de unión a ADN- ligando-complejo del receptor de ecdisona induce la expresión del gen, y en el que el ligando es un ligando de diacilhidrazina de la invención; en el que se regula expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico.
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La presente divulgación describe un método in vitro para modular la expresión de un gen objetivo en una célula anfitriona que comprende las etapas de:
a) introducir en la célula anfitriona un sistema de modulación de expresión genética, que comprende:
i) un primer casete de expresión genética que es capaz de ser expresado en una célula anfitriona, dicho primer casete de expresión genética que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:
(a) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se va a modular; y
(b) un dominio de unión al ligando del receptor de ecdisona;
ii) un segundo casete de expresión genética que es capaz de ser expresado en la célula anfitriona, dicho segundo casete de expresión genética que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:
(a) un dominio de transactivación; y
(b) un dominio de unión al ligando del receptor X del retinoide quimérico; y
iii) un tercer casete de expresión genética que es capaz de ser expresado en una célula anfitriona, dicho tercer casete de expresión genética que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende:
(a) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;
(b) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y
(c) un gen cuya expresión se va a modular; y
b) introducir en la célula anfitriona un ligando de diacilhidrazina de la invención; en el que se modula la expresión de un gen en una célula anfitriona.
La presente divulgación describe un método para producir un polipéptido que comprende las etapas de:
a) seleccionar una célula que es sustancialmente insensible a la exposición a un ligando de diacilhidrazina de la invención;
b) introducir en la célula:
i) una construcción de ADN que comprende:
(a) un gen exógeno que codifica el polipéptido; y
(b) un elemento de respuesta;
en el que el gen está bajo el control del elemento de respuesta; y
ii) un complejo de receptor de ecdisona que comprende:
(a) un dominio de unión a ADN que se une al elemento de respuesta;
(b) un dominio de unión para dicho ligando; y
(c) un dominio de transactivación; y
c) exponer la célula a dicho ligando; en el que se produce un polipéptido.
Este método proporciona la ventaja de controlar temporalmente la producción de polipéptidos por la célula. Más aún, en aquellos casos en que la acumulación de dicho polipéptido puede dañar la célula, la expresión del polipéptido se puede limitar a períodos cortos al exponer dicha célula a los compuestos de la presente invención. Dicho control es particularmente importante cuando el gen exógeno es un gen terapéutico. Los genes terapéuticos se pueden llamar para producir polipéptidos que controlan las funciones necesarias, tales como la producción de insulina en pacientes diabéticos. También se pueden utilizar para producir proteínas dañinas o incluso letales, tales como aquellas letales para las células cancerosas. Dicho control también puede ser importante cuando los niveles de proteína producidos pueden constituir un drenaje metabólico sobre el crecimiento o la reproducción, tal como en plantas transgénicas.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Esquema de la construcción de interruptor CVBE, y la construcción del indicador 6XEcRE-Lac Z. El flanqueo de ambas construcciones son repeticiones terminales largas, el G418 y puromicina son marcadores seleccionables, CMV es
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el promotor de citomegalovirus, VBE es la secuencia de codificación para los aminoácidos 26-546 de EcR de Bombyx- Mori insertado corriente abajo del dominio de transactivación de la VP16, 6X-EcRE es seis copias del elemento de respuesta de ecdisona, lacZ codifica la enzima indicadora beta-galactosidasa.
Figuras 2A -2C: Comparación de HPLC Quiral de (A) rac-, (B) (R)- y (C) N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2,6-dicloro-benzoil)- hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico.
Figura 3: Gráfica que muestra la comparación in vivo de rac-, N’-(1-tert-butilbutil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)- y (S)-2-etil-3-metoxibenzoico sobre la inducción de la expresión genética del Sistema Terapéutico RheoSwitch® en ratones. Los círculos sólidos son el enantiómero S, los triángulos sólidos son el Racemato, y los círculos vacíos son el enantiómero R.
Figura 4: Tabla de lotes de muestra o el racemato y el enantiómero R de N’-(1-tert-butilbutil)- N’-(3,5-dimetil-benzoil)- hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxibenzoico. Las muestras del enantiómero R obtenidas por cristalización/precipitación rápida a partir de metanol/agua o tolueno/heptano produjeron el mismo patrón de difracción de rayos X de polvo (datos no mostrados), y tenía esencialmente el mismo punto de fusión ([tolueno/heptano] 166.2-167.1 °C, [CH3OH/H2O] 166.5167.4 °C) en comparación entre sí y en comparación con un estándar obtenido a partir de la cristalización de CH3OH (165.1-166.5 °C). Las muestras de dos preparaciones separadas del racemato obtenidas mediante evaporación de metanol dieron el mismo punto de fusión (170-171 0C, 169-170 0C) dentro del error experimental y ligeras variaciones de pureza.
Figura 5: Tabla que muestra la distribución de tamaño de partículas del enantiómero R micronizado de N’-(1 -tert-butil- butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico.
Figura 6: Tabla que muestra la distribución de tamaño de partículas del racemato micronizado de N’-(1 -tert-butil-butil)-N’- (3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico.
Figura 7: Tabla que muestra el análisis de densidad evidente y de compactación del racemato micronizado y el enantiómero R de N’-(1-tert-butil-butil)-N’-(3,5-dimetilbenzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3- metoxi-benzoico.
Figura 8: El análisis gravimétrico Térmico/análisis térmico diferencial (TGA/DTA) (gráfica térmica) del racemato micronizado y el enantiómero R de N’-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxibenzoico demuestra diferentes formas cristalinas. Lotes Nos: REH-28-9-1 y REH-28-4-2; peso de muestra 7.71994 mg. Salida de señal en unidades de uV por mg de muestra (uV/mg); gravimetría térmica-porcentaje de cambio de peso de la muestra (% de TG). Ambos materiales mostraron un evento endotérmico en el perfil DTA. La temperatura de inicio para el enantiómero R (163.6 0C) fue significativamente inferior que aquella del racemato (171.2 °C). El calor de fusión para el enantiómero R (59.8 uvs/mg) también fue significativamente menor que aquel del racemato (80.8 uv.s/mg).
Figura 9: Tabla que muestra prueba de solubilidad comparativa cualitativa del racemato y el enantiómero R de N’-(1 -tert- butil-butil)-N’-(3,5-dimetilbenzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxibenzoico en excipientes farmacéuticos.
Figura 10: Tabla que muestra los resultados de un ensayo de equilibrio termodinámico (90 0C durante 5 minutos o tiempo indicado; tratamiento 2) seguido de enfriamiento a temperatura ambiente y siembra del racemato y el enantiómero R de N’-(1-tert-butil-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3- metoxi-benzoico en excipientes farmacéuticos. El tratamiento 1 es el resultado de la agitación a temperatura ambiente durante < 2.5 h.
Figura 11: Tabla que muestra la solubilidad (pM) del racemato y el enantiómero R de N’-(1- tert-butil-butil)-N’-(3,5-dimetil- benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico en PEG 1000 al 20% en agua destilada, pH 7.0.
Figura 12: Tabla que muestra la solubilidad del racemato y el enantiómero R de N’-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3,5-dimetil- benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxibenzoico en polisorbato 80 acuoso.
Figura 13: Tabla que muestra la permeabilidad bidireccional del racemato y el enantiómero R de N’-(1-tert-butil-butil)-N’- (3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico A través de monocapas de célula Caco-2. “Clasificación de Permeabilidad: (Papp A^-B) < 1.0 X 10-6 cm/s = BAJO; (Papp A^-B) > 1.0 X 10-6 cm/s = ALTO; bEflujo Significativo: Eflujo > 3.0 y (Papp B^A) > 1.0 X 10-6 cm/s
Figura 14: Tabla que muestra la permeabilidad del racemato y el enantiómero R de N’-(1- tert-butil-butil)-N’-(3,5-dimetil- benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico en células MDR1 -MDCK. Clasificación: A-B Papp > 3.0 y Relación de Eflujo < 3.0: Alta. A-B Papp > 3.0 y 10 > Relación de Eflujo > 3.0: Moderada. A-B Papp > 3.0 y Relación de Eflujo > 10: Baja A-B Papp < 3.0: Baja.
Figura 15: Tabla que muestra la estabilidad del racemato y el enantiómero R de N’-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3,5-dimetil- benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxibenzoico en cromosomas de hígado humano.
Figura 16: Tabla que muestra el esquema de dosificación del racemato y el enantiómero R de N’-(1- tert-butil-butil)-N’- (3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico/ preparaciones de Labrasol en ratones C57BL/6N:Crl. aAdministración de dosis durante 9 días (primer 18 hembras/grupo) o 12 días (segundo 18 hembras/grupo); bincluidos posibles reemplazos.
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Figura 17: Micrografías de muestras no micronizadas y micronizadas de N’-(1- tert-butil-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)- hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico racemato. Obsérvese la escala de referencia de 50 micras.
Figura 18: Tabla que muestra los niveles de suero sanguíneo del racemato y el enantiómero R de N’-(1 -tert-butil-butil)-N’- (3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico administrado en Labrasol en niveles de 4 dosificaciones (3, 10, 30 y 50 mg/kg/día) después de 9 días de administración de fármaco y horas después de la dosificación diaria.
Figura 19: Tabla que muestra los niveles de suero sanguíneo del racemato y el enantiómero R de N’ -(1 -tert-butil-butil)- N’-(3 ,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido 2-etil-3-metoxi-benzoico administrado en Labrasol en niveles de 4 dosificaciones (3, 10, 30 y 50 mg/kg/día) después de 12 días de administración de fármaco y horas después de la dosificación diaria.
Figura 20: Representación esquemática del plásmido pCMV/GEVY (DEF). El plásmido pCMV/GEVY(DEF) consiste en los dominios D, E y F de EcR de Choristoneura fumiferana que lleva las mutaciones V390I/Y410E/E274V fusionadas corriente abajo de la levadura GAL4-DBD (aa 1-147) y colocadas bajo el control del promotor CMV y una señal de poliadenilación de SV40 corriente abajo en el vector pBIND (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.). Los dominios DEF de los EcR mostrados se amplificaron utilizando cebadores diseñados con base en secuencias de 20-25 nt en los extremos 5' y 3'. Se agregaron sitios de enzimas de restricción BamH I y Xba I a los cebadores 5' y 3'respectivamente. Los productos de PCR se digirieron con enzimas de restricción apropiadas y se clonaron en el vector pBEND
Figura 21: Representación Esquemática del vector pCMV/VP16-Hs-LmRXR. El vector pCMV/VP16-Hs-LmRXR contiene un RXR quimérico de RXRp de Homo Sapiens (hélice 1-8 del dominio E) y RXR de Locusta migratoria (hélice 9-12 del dominio E), fusionados corriente abajo del dominio de activación VP16 y colocados bajo el control del promotor CMV en el vector pBIND.
Figura 22: Representación esquemática del vector indicador p6xGAL4RE-TTR-SEAP. El vector indicador SEAP inducible p6xGAL4RE-TTR-SEAP Contiene el gen indicador de fosfatasa alcalina secretado humano colocado bajo la marca registrada control del promotor inducible que consiste de 6 copias del elemento de respuesta Gal4 corriente arriba del promotor de transtiretina (TTR).
Figura 23: Representación esquemática de Ad-RTS-hIL-12 en la que se han suprimido las regiones E1 y E3 y los componentes RTS-IL12 reemplazan la Región E1.
Figura 24: Gráficas que muestran la expresión de mIL12p70 en tumor y suero, después de la inyección de células B16 infectadas con el plásmido Ad.RheoSP1-mIL12, y la administración del enantiómero R o el racemato de diacilhidrazina a dosificaciones de 0, 3, 10, 30, 50 mg/kg/día. Controles: ratones portadores de B16 no traducido que reciben solo ligando a 50 mg/kg/día durante 3 días (Ligando 50) y ratones portadores de tumores no tratados (sin ligando) (TuControl). “L3d luego 3d discont.”: ratones tratados con ligando durante 3 días, seguido por 3 días adicionales durante los cuales no se proporciona el ligando.
Figura 25: Gráficas que muestran la expresión de mIFN-Y en tumor y suero, después de inyección de células B16 infectadas con el plásmido Ad.RheoSP1-mIL12, y la administración del enantiómero R el o racemato de diacilhidrazina a dosificaciones de 0, 3, 10, 30, 50 mg/kg/día. Controles: ratones portadores de B16 no traducido que reciben solo ligando a 50 mg/kg/día durante 3 días (Ligando 50) y ratones portadores de tumores no tratados (sin ligando) (TuControl). “L3d luego 3d discont.”: ratones tratados con ligando durante 3 días, seguido por 3 días adicionales durante los cuales no se proporciona el ligando.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto seleccionado del grupo que consiste de:
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxibenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N’-benzoil-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-fluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N’-(2-bromo-benzoil)-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(6-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; y N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3-metoxi-2-metilbenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico,
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos de la Fórmula I
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en la que
5 A es alcoxi, arilalquiloxi o ariloxi;
B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
R1 y R2 son independientemente alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
10 o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II
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en la que
A es alcoxi, arilalquiloxi, ariloxi, arilalquilo, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
15 B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
R1 y R2 son independientemente alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
con la condición de que R1 no sea igual a R2;
20 en la que la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente S; o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula III
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en la que
25 A es alcoxi, arilalquiloxi, ariloxi, arilalquilo, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
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B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y
R1 y R2 son independientemente alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
con la condición de que R1 no sea igual a R2;
en la que la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente R; o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II o III en la que A es -OC(CH3)3, -OCH2Ph, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
B es arilo opcionalmente sustituido;
R1 es alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido, hidroxialquilo (C1-C4) o alquenilo (C2-C6) opcionalmente sustituido; y
R2 es alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido, arilalquilo (C1-C4), cicloalquilo (C3-C7) opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido;
con la condición de que R1 no sea igual a R2;
en la que
la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente S en la Fórmula II; y la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente R en la Fórmula III;
o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II o III en la que A es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
B es arilo opcionalmente sustituido;
R1 es alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido, hidroxialquilo (C1-C4) o alquenilo (C2-C6) opcionalmente sustituido; y
R2 es alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido, arilalquilo (C1-C4), cicloalquilo (C3-C7) opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido;
con la condición de que R1 no sea igual a R2;
en la que
la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente S en la Fórmula II; y la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente R en la Fórmula III;
o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II o III en la que A es
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R3a, R3b, R3c, R3d y R3e se seleccionan independientemente de hidrógeno, halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, - SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg o -N(Re)C=N(Rh)-amino; o
R3a y R3b tomados juntos con los átomos de carbono a los cuales ellos se adhieren forman un anillo cicloalquilo o heterociclo fusionado de cinco, seis o siete miembros; o
R3b y R3c tomados juntos con los átomos de carbono a los cuales ellos se adhieren forman un anillo cicloalquilo o heterociclo fusionado de cinco, seis o siete miembros;
R4a, R4b, R4c, R5a, R5b, R6a, R6b y R6c se seleccionan independientemente de hidrógeno, halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, - SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg o -N(Re)C=N(Rh)-amino;
X es O o S;
B es
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y;
R3f, R3g, R3h, R3i y R3j se seleccionan independientemente de hidrógeno, halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, - SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg o -N(Re)C=N(Rh)-amino; o
R3f y R3g tomados juntos con los átomos de carbono a los cuales ellos se adhieren forman un anillo cicloalquilo o heterociclo fusionado de cinco, seis o siete miembros; o
R3g y R3h tomados juntos con los átomos de carbono a los cuales ellos se adhieren forman un anillo cicloalquilo o heterociclo fusionado de cinco, seis o siete miembros;
en la que
Rc es hidrógeno, hidroxi, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi o arilalquiloxi;
Rd es haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
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Re es hidrógeno, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
Rf es hidrógeno, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi o amino;
Rg es haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido o amino;
Rh es hidrógeno, alquilo, arilo, ciano o nitro;
R1 es alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido, hidroxialquilo (C1-C4) o alquenilo (C2-C6) opcionalmente sustituido; y
R2 es alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido, arilalquilo (C1-C4), cicloalquilo (C3-C7) opcionalmente sustituido o arilo opcionalmente sustituido;
con la condición de que R1 no sea igual a R2;
en la que
la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente S en la Fórmula II; y la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente R en la Fórmula III;
o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II en la que
A, B, R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f, R3g, R3h, R3i, R3j, R4a, R4b, R4c, R5a, R5b, R6a, R6b, R6c y X tienen los mismos significados como se anotó anteriormente;
R1 es alquilo (C1-C6), hidroxialquilo (C1-C4) o alquenilo (C2-C4); y R2 es cicloalquilo (C3-C7) opcionalmente sustituido;
en la que la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente S;
o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula III en la que
A, B, R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f, R3g, R3h, R3i, R3j, R4a, R4b, R4c, R5a, R5b, R6a, R6b, R6c y X tienen los mismos significados como se anotó anteriormente;
R1 es alquilo (C1-C6), hidroxialquilo (C1-C4) o alquenilo (C2-C4); y R2 es alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido; con la condición de que R1 no sea igual a R2;
en la que la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente R; o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II en la que A es
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B es
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R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f, R3g, R3h, R3' y R3j se seleccionan independientemente de hidrógeno, halo, alquilo (C1-C4) o
alcoxi (C1-C4);
R1 es alquilo (C1-C6), hidroxialquilo (C1-C4) o alquenilo (C2-C4); y R2 es cicloalquilo (C3-C7) opcionalmente sustituido
en la que la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente S; o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula III en la que A es
R3a
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R
R
3b
3c
B es
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R3a, R3b, R3c, R3d, R3e, R3f, R3g, R3h, R3i y R3j se seleccionan independientemente de hidrógeno, halo, alquilo (C1-C4) o
15 alcoxi (C1-C4);
R1 es alquilo (C1-C6), hidroxialquilo (C1-C4) o alquenilo (C2-C4); y R2 es alquilo (C1-C6) opcionalmente sustituido;
en la que la configuración absoluta en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2 es predominantemente R;
o sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, formas cristalinas o formas amorfas de los mismos.
20 La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II que tienen un exceso enantiomérico de por lo menos 50%, 75%, 85%, 95% o >99% del isómero S. El compuesto de la Fórmula II puede consistir esencialmente del isómero S.
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La presente divulgación describe compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula III que tienen un exceso enantiomérico de por lo menos 50%, 75%, 85%, 95% o >99% del isómero R. El compuesto de la Fórmula III puede consistir esencialmente del isómero R.
La presente divulgación describe una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la Fórmula I, II o III.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención como se establece en las reivindicaciones. La presente invención proporciona una N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-etil- 3-metoxi-benzoil)- hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% o de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable, hidrato, forma cristalina o forma amorfa de la misma. El compuesto puede ser enantioméricamente puro.
La presente invención proporciona la N’-benzoil-N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. La presente invención proporciona la N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-metil- benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La presente invención proporciona la N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-fluoro-benzoil)-hidrazida de ácido que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La presente invención proporciona la N’-(2-bromo-benzoil)-N-(1-tert-butilbutil)-hidrazida de ácido que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La presente invención proporciona la N-(1-tert-butil-butil)-N’-(3-metil-benzoil)-hidrazida de ácido que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La presente invención proporciona la N-(1-tert-butil-butil)-N’-(4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La presente invención proporciona la N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-cloro-piridina-3- carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5- dimetil-benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La presente invención proporciona la N-(1-tert-butil-butil)-N’-(6-cloro-piridina-3- carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5- dimetil-benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La presente invención proporciona la N-(1-tert-butil-butil)-N’-(3-metoxi-2-metilbenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil- benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende N-(1 - tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi- benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% o de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. El compuesto puede ser enantioméricamente puro.
Se ha descubierto inesperadamente que la N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5- dimetil-benzoico tiene una combinación de propiedades beneficiosas que la hacen de forma única adecuada para uso farmacéutico. Dichas propiedades incluyen un punto de fusión bajo y calor de fusión bajo en comparación con el racemato (Ejemplo 68); mejor solubilidad en muchos excipientes farmacéuticos líquidos en comparación con el racemato (Ejemplo 68); mejor permeabilidad en ciertas células en comparación con el racemato (Ejemplo 69); es más probable que sea capaz de cruzar la barrera hematoencefálica que el racemato (Ejemplo 69); mejor estabilidad al metabolismo del hepatocito en comparación con el racemato (Ejemplo 70); cuando se administra oralmente como una solución o suspensión de Labrasol, alcanza niveles de plasma significativamente más altos en comparación con el racemato (Ejemplo 71); y alcanza mucha mayor expresión genética in vivo por activación de un interruptor para gen con base en EcR en comparación con el racemato (Ejemplo 72).
La presente divulgación también describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula IV
(R)-3,5-dimetil-benzoico enantiomérico de por lo
(R)-3,5-dimetil-benzoico enantiomérico de por lo
(R)-3,5-dimetil-benzoico enantiomérico de por lo
(R)-3,5-dimetil-benzoico enantiomérico de por lo
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en la que
A es arilalquilo, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
B es arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
5 R2 es alquilo opcionalmente sustituido, arilalquilo, hidroxialquilo, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido;
con la condición de que R2 no sea igual a -CR8R9CHR10CR11R12; y
R8, R9, R10, R11 y R12 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo o heteroarilo;
10 en la que el átomo de carbono asimétrico al cual R2 se adhiere está enantioméricamente enriquecido en ya sea el isómero R o S; que comprende:
a) hacer reaccionar un compuesto de la Fórmula V
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con un compuesto de la Fórmula VI
15 R2HC=N-NH-CO2R7 Fórmula VI
en la que
X y Y son independientemente O o NR en la que R es alquilo o arilo;
Ca y Cb son independientemente un átomo de carbono asimétrico de la configuración S o un átomo de carbono asimétrico de la configuración R;
20 R14 y R15 son independientemente alquilo o arilo;
R13 es halo, hidrógeno, alquilo, alcoxi o OSO2CF3;
R7 es alquilo, arilalquilo o arilo; y
R2, R8, R9, R10, R11 y R12 tienen los mismos significados anotados anteriormente; para formar un compuesto de la Fórmula VII;
b) reducir el compuesto de la Fórmula VII para formar un compuesto de la Fórmula VIII;
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c) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula VIII con un compuesto de la Fórmula B-CO-LG en la que LG es un grupo saliente para formar un compuesto de la Fórmula IX;
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5 d) eliminar el grupo R7CO2 del compuesto de la Fórmula IX para formar un compuesto de la Fórmula X; y
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e) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula X con un compuesto de la Fórmula A-CO-LG en la que LG es un grupo saliente, para formar un compuesto de la Fórmula IV.
La presente divulgación describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula IV en la que R8, R9, R10, 10 R11 y R12 son hidrógeno.
La presente divulgación describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula IV en la que R8, R9, R10, R11 y R12 son hidrógeno;
X es NR y R es metilo;
Y es O;
15 R14 es metilo;
R15 es fenilo; y
cada uno de Ca y Cb tiene la configuración R.
La presente divulgación describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula IV en la que R8, R9, R10, R11 y R12 son hidrógeno;
20 X es NR y R es metilo;
Y es O;
R14 es metilo;
R15 es fenilo; y
cada uno de Ca y Cb tiene la configuración S.
25 La presente divulgación describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula IV en la que R8, R9, R10, R11 y R12 son hidrógeno;
X es NR y R es metilo;
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Y es O;
R14 es metilo;
R15 es fenilo;
cada uno de Ca y Cb tiene la configuración S; y B es 3,5-di-metilfenilo.
La presente divulgación describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula IV en la que R8, R9, R10, R11 y R12 son hidrógeno;
X es NR y R es metilo;
Y es O;
R14 es metilo;
R15 es fenilo;
cada uno de Ca y Cb tiene la configuración S; y A es 2-etil-3-metoxifenilo.
La presente divulgación describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula IV en la que R8, R9, R10, R11 y R12 son hidrógeno;
X es NR y R es metilo;
Y es O;
R14 es metilo;
R15 es fenilo;
cada uno de Ca y Cb tiene la configuración S; y R2 es tert-butilo.
La presente divulgación describe un proceso para la preparación de un compuesto de la Fórmula II o III que comprende:
a) hacer reaccionar una acil hidrazina de la fórmula XI
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con una cetona de la Fórmula XII
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para formar un compuesto de la Fórmula XIII;
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en la que R1 no es igual a R2;
b) reducir el compuesto de la Fórmula XIII en la presencia de un catalizador quiral para formar un compuesto de la Fórmula S-XIV o R-XIV; y
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c) hacer reaccionar el compuesto de la Fórmula S-XIV o R-XIV con un compuesto de la Fórmula B-CO-LG en la que LG es un grupo saliente para formar un compuesto de la Fórmula II o III.
Las diacilhidrazinas de la Fórmula I divulgadas en este documento incluyen, pero no se limitan a:
rac-N’-(1-tert-Butil-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxilico; o rac-N’-(1-tert- Butilbutil)- N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico.
Las diacilhidrazinas quirales de la Fórmula II o III divulgadas en este documento incluyen:
N-(1 -ciclohexil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxibenzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -ciclohexil-butil)-N’-(3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico;
ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico N-(1 -ciclohexil-butil)-N’-(4-metil-benzoil)-hidrazida.
(R)-N’-(1 -tert-Butil-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico;
(R)-N’-(1 -tert-Butil-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico;
(R)-N’-(1-tert-Butil-4-hidroxi-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico;
(R)-N’-(1-tert-Butil-4-hidroxi-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxibenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N’-benzoil-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-fluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-cloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N’-(2-bromo-benzoil)-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1-tert-butil-butil)-N’-(3-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1-tert-butil-butil)-N’-(3-cloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1-tert-butil-butil)-N’-(4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(4-etil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
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N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(4-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N’-(4-cloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2,6-difluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2,6-dicloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3,4-dimetoxibenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3,5-difluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3,5-dimetoxi-4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N’-(4-metil-benzo[1 ,3]dioxol-5-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxina-6-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(5-etil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxina-6-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(naftaleno-1 -carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(naftaleno-2-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(tiofeno-2-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2,5-dimetil-furano-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(6-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3-metoxi-2-metilbenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3-metoxi-2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetoxi-4-metil-benzoico; y N’-(4-etil-benzoil)-N-(1-fenetil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico.
Las diacilhidrazinas quirales de la Fórmula II y III puede contener centros de quiralidad en otras porciones de la molécula (es decir, no en el átomo de carbono asimétrico que lleva R1 y R2).
La presente invención también proporciona un método in vitro para modular la expresión genética en una célula anfitriona utilizando un sistema de modulación de expresión genética con uno o ligando de diacilhidrazina quiral de la invención.
La presente invención proporciona el uso de un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención en un sistema de expresión genética inducible que tiene un nivel reducido de expresión genética de fondo en ausencia de ligando y responde a concentraciones submicromolares del ligando.
La presente invención proporciona un método in vitro para modular la expresión de un gen objetivo en una célula anfitriona, en el que la célula anfitriona comprende un primer casete de expresión genética que comprende un primer polipéptido que codifica un primer polipéptido que comprende:
i) un dominio de transactivación;
ii) un dominio de unión a ADN; y
iii) un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H; y un segundo casete de expresión genética que comprende:
i) un elemento de respuesta capaz de unirse a dicho dominio de unión a ADN;
ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación; y
iii) dicho gen objetivo;
el método que comprende poner en contacto dicha célula anfitriona con un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención; en el que se modula la expresión del gen objetivo.
La presente invención proporciona un método in vitro para modular la expresión de un gen de interés en una célula anfitriona, en el que la célula anfitriona comprende un primer casete de la expresión de gen recombinante que comprende un primer polipéptido que codifica un primer polipéptido que comprende:
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i) un dominio de unión a ADN; y
ii) un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H;
y un segundo casete de la expresión de gen recombinante que comprende:
i) un elemento de respuesta capaz de unirse a dicho dominio de unión a ADN;
ii) un promotor; y
iii) dicho gen de interés;
el método que comprende poner en contacto dicha célula anfitriona con un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención; en el que se modula la expresión del gen de interés.
La presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención en un método in vitro para regular la expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico que comprende poner en contacto un ligando con un complejo de receptor de ecdisona dentro de las células del sujeto, en el que las células contienen adicionalmente una secuencia de unión a ADN para el complejo de receptor de ecdisona cuando en combinación con el ligando y en el que la formación de un complejo de secuencia de unión a ADN- ligando-complejo del receptor de ecdisona induce la expresión del gen, y en el que el ligando es un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención, en el que se regula expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico.
Las células son células autólogas, es decir, las células se obtienen del sujeto y se transfectan con el complejo receptor de ecdisona y la secuencia de unión de ADN. Las células autólogas transfectadas luego se implantan de nuevo en el sujeto que luego se trata con el ligando. Las células autólogas se pueden implantar en cualquiera de una serie de formas, que incluyen por infusión o inyección, por ejemplo, inyección directa. Las células autólogas se implantan por inyección intratumoral.
La presente divulgación describe un compuesto de la invención para uso en un método para regular la expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico dicho método que comprende poner en contacto un ligando con un complejo de receptor de ecdisona quimérico dentro de las células del sujeto, en el que las células contienen adicionalmente una secuencia de unión a ADN que comprenden adicionalmente un promotor para el complejo de receptor de ecdisona cuando en combinación con el ligando y en el que la formación de un complejo de secuencia de unión a ADN- ligando-complejo del receptor de ecdisona induce la expresión del gen, y en el que el ligando es un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención, en el que se regula la expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico.
El sujeto transgénico puede ser una planta, un insecto, un animal o un mamífero, por ejemplo un animal veterinario o humano tal como una vaca, cerdo, oveja, cabra, caballo, perro o gato.
Se puede utilizar un compuesto de la invención en un método para regular la expresión de transgén en un sujeto transgénico, en el que dicho sujeto transgénico comprende un complejo de receptor de ecdisona recombinante capaz de regular la expresión de transgén; el método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de un o ligando de diacilhidrazina quiral de la invención.
La presente divulgación describe un método in vitro para modular la expresión de un gen objetivo en una célula anfitriona que comprende las etapas de:
a) introducir en la célula anfitriona un sistema de modulación de expresión genética que comprende:
i) un primer casete de expresión genética que es capaz de ser expresado en una célula anfitriona, dicho primer casete de expresión genética que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:
(a) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión se va a modular; y
(b) un dominio de unión al ligando del receptor de ecdisona;
ii) un segundo casete de expresión genética que es capaz de ser expresado en la célula anfitriona, dicho segundo casete de expresión genética que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:
(a) un dominio de transactivación; y
(b) un dominio de unión al ligando del receptor X del retinoide quimérico; y
iii) un tercer casete de expresión genética que es capaz de ser expresado en una célula anfitriona, dicho tercer casete de expresión genética que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende:
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(a) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;
(b) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y
(c) un gen cuya expresión se va a modular; y
b) introducir en la célula anfitriona un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención; en el que se modula la expresión de un gen en una célula anfitriona.
La presente invención también se refiere a un método in vitro para producir un polipéptido que comprende las etapas de:
a) seleccionar una célula anfitriona que es sustancialmente insensible a la exposición a aligando de diacilhidrazina quiral de la invención;
b) introducir en la célula anfitriona:
i) una construcción de ADN que comprende:
(a) un gen exógeno que codifica el polipéptido; y
(b) un elemento de respuesta;
en el que el gen está bajo el control del elemento de respuesta; y
ii) un complejo de receptor de ecdisona que comprende:
a) un dominio de unión a ADN que se une al elemento de respuesta;
b) un dominio de unión para dicho compuesto; y
c) un dominio de transactivación; y
c) exponer la célula a dicho compuesto; en el que se produce un polipéptido.
El complejo de receptor de ecdisona o dominio de unión al ligando del receptor de ecdisona puede comprender una mutación.
Las abreviaturas utilizadas en este documento tienen su significado convencional dentro de las artes químicas y biológicas, a menos que se especifique lo contrario. Por ejemplo: “h” significa hora(s), “min” significa minuto(s), “sec” significa segundo(s), “d” significa día(s), “pL” significa microlitro(s), “mL” significa mililitro(s), “L” significa litro(s), “pM” significa micromolar, “mM” significa milimolar, “M” significa molar, “mol” significa moles, “mmol” significa milimoles, “pg” significa microgramo(s), “mg” significa miligramo(s), “A” significa adenina o adenosina, “T” significa timina o timidina, “G” significa guanina o guanosina, “C” significa citidina o citosina, “x g” significa tiempos de gravedad, “nt” significa nucléotido(s), “aa” significa aminoácido(s), “bp” significa par(es) base(s), “kb” significa kilobase(s), “k” significa kilo, “p” significa micro, “0C” significa grados Celsius, “THF” significa tetranhidrofurano, “DME” significa dimetoxietano, “DMF” significa dimetilformamida, “RMN” significa resonancia magnética nuclear, “psi” se refiere a libras por pulgada cuadrada, y “TLC” significa cromatografía de capa fina.
El término “alquilo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un hidrocarburo alifático saturado de cadena recta o ramificada que tiene desde uno hasta diez carbonos o el número de carbonos designados (C1-C10 significa 1 a 10 carbonos). Grupos alquilo de ejemplo incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n- butilo, sec-butilo, isobutilo, tert-butilo, npentilo, n-hexilo, isohexilo, n-heptilo, 4,4-dimetilpentilo, n-octilo, 2,2,4- trimetilpentilo, nonilo, decilo.
El término “alquilo opcionalmente sustituido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un alquilo como se definió anteriormente que se sustituye opcionalmente con uno a tres sustituyentes independientemente seleccionados de nitro, ciano, amino, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, -SO2Rd, - N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg o -N(Re)C=N(Rh)-amino. Grupos alquilo sustituidos de ejemplo incluyen -CH2OCH3, -CH2CH2NH2, -CH2CH2CN, -CH2SO2CH3.
El término “haloalquilo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un alquilo como se definió anteriormente que tiene uno a seis sustituyentes halo. Grupos haloalquilo de ejemplo incluyen, trifluorometilo, -CH2CH2F.
El término “hidroxialquilo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un alquilo como se definió anteriormente que tiene uno a tres sustituyentes hidroxi, normalmente un sustituyente hidroxi. Grupos hidroxialquilo de ejemplo incluyen hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo.
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El término “arilalquilo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un alquilo como se definió anteriormente que tiene uno a tres sustituyentes arilo (dichos sustituyentes arilo se pueden sustituir opcionalmente como se describe a continuación), normalmente uno o dos sustituyentes arilo. Grupos arilalquilo de ejemplo incluyen, por ejemplo, bencilo, feniletilo, 4-fluorofeniletilo, fenilpropilo, difenilmetilo.
El término “cicloalquilo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a grupos de hidrocarburo cíclicos saturados o parcialmente insaturados (que contienen uno o dos enlaces dobles) que contienen uno a tres anillos que tienen desde tres hasta doce átomos de carbono o el número de carbonos designados. Grupos cicloalquilo de ejemplo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, norbornilo, decalina, adamantilo.
El término “cicloalquilo opcionalmente sustituido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un cicloalquilo como se definió anteriormente que se sustituye opcionalmente con uno a tres sustituyentes independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, -SO2Rd, - N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg o - N(Re)C=N(Rh)-amino. Grupos cicloalquilo opcionalmente sustituidos de ejemplo incluyen
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y similares. Un cicloalquilo opcionalmente sustituido se puede fusionar a un grupo arilo para proporcionar un arilo opcionalmente sustituido como se describe a continuación.
El término “alquenilo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un grupo alquilo como se definió anteriormente que contiene uno a tres enlaces dobles carbono a carbono, normalmente uno o dos enlaces dobles. Grupos alquenilo de ejemplo incluyen -CH=CH2, -CH2CH=CH2, - CH2CH2CH=cH2, -CH2CH2CH=CHCH3.
El término “alquenilo opcionalmente sustituido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un alquenilo como se definió anteriormente que se sustituye opcionalmente con uno a tres sustituyentes independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo
opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, - N(Re)SO2Rg o - N(Re)C=N(Rh)-amino. Grupos alquenilo opcionalmente sustituidos de ejemplo incluyen -CH=CHPh, -CH2CH=CHPh.
El término “alquinilo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un grupo alquilo como se definió anteriormente que contiene uno a tres enlaces triple carbono a carbono, normalmente uno o dos enlaces triple. Grupos alquinilo de ejemplo incluyen -C=CH, -CECCH3, - CH2CECH, -CH2CH2CECH y -CH2CH2CECCH3.
El término “alquinilo opcionalmente sustituido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un alquinilo como se definió anteriormente que se sustituye opcionalmente con uno a tres sustituyentes independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo
opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, - N(Re)SO2Rg o - N(Re)C=N(Rh)-amino. Grupos alquenilo opcionalmente sustituidos de ejemplo incluyen -C=CPh, -CH2C=CPh.
El término “arilo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a sistemas de anillo aromático monocíclico y bicíclico que tienen desde seis hasta doce átomos de carbono tales como fenilo (abreviado como Ph), 1 -naftilo y 2-naftilo.
El término “arilo opcionalmente sustituido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un arilo como se definió anteriormente que se sustituye opcionalmente con uno a cinco sustituyentes, normalmente uno a tres sustituyentes, independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo
opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, - SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg o -N(Re)C=N(Rh)-amino. Grupos arilo opcionalmente sustituidos de ejemplo incluyen 2- metilfenilo, 2-metoxifenilo, 2-fluorofenilo, 2-clorofenilo, 2-bromofenilo, 3-metilfenilo, 3-metoxifenilo, 3-clorofenilo, 4- metilfenilo, 4-etilfenilo, 4-metoxifenilo, 4-clorofenilo, 2,6-di-fluorofenilo, 2,6-diclorofenilo, 2-metilo, 3-metoxifenilo, 2-etilo, 3- metoxifenilo, 3,4-di-metoxifenilo, 3,5-di-fluorofenilo, 3,5-dimetilfenilo y 3,5-dimetoxi, 4-metilfenilo y similares. El término
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arilo opcionalmente sustituido significa que incluye grupos que tienen anillos cicloalquilo opcionalmente sustituido fusionado y heterociclo opcionalmente sustituido fusionado. Ejemplos incluyen
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El término “heteroarilo” como se utiliza en este documento en si mismo o como parte de otro grupo se refiere a sistemas de anillo aromático monocíclico y bicíclico que tienen desde cinco hasta catorce átomos de carbono y uno, dos, tres o cuatro heteroátomos independientemente seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre. Grupos heteroarilo de ejemplo incluyen 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 2-imidazolilo, 4- imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3- isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3- piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 4-bencimidazolilo, 5- bencimidazolilo, 2-benztiazolilo, 4-benztiazolilo, 5-benztiazolilo, 5-indolilo, 3-indazolilo, 4-indazolilo, 5-indazolilo, 1- isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 2-quinolilo 3-quinolilo, 6-quinolilo. El término heteroarilo significa que incluye posibles N-óxidos. N-óxidos de ejemplo incluyen N-óxido de piridilo.
El término “heteroarilo opcionalmente sustituido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un heteroarilo como se definió anteriormente que se sustituye opcionalmente en cualquier átomo de carbono disponible con uno a cuatro sustituyentes, normalmente uno o dos sustituyentes, independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg o - N(Re)C=N(Rh)-amino. Grupos heteroarilo sustituidos de ejemplo incluyen
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La naturaleza química específica del arilo opcionalmente sustituido y grupos heteroarilo opcionalmente sustituidos para las fracciones terminales A y B en los ligandos quirales de diacilhidrazina identificados anteriormente no es estrictamente crítica, como se señaló, se contempla una amplia variedad de sustituyentes. Preferiblemente, los sustituyentes para el arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido se seleccionan de tal manera que el número total de carbono y heteroátomos no es mayor de aproximadamente veinte, más preferiblemente no más de aproximadamente quince.
El término “heterociclo” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a grupos cíclicos saturados o parcialmente insaturados (que contienen uno o dos enlaces dobles) que contienen uno a tres anillos que tienen desde dos hasta doce átomos de carbono y uno o dos átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno. El heterociclo se puede ligar opcionalmente al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o un átomo de nitrógeno. Grupos heterociclo de ejemplo incluyen
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El término “heterociclo opcionalmente sustituido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un heterociclo como se definió anteriormente que se sustituye opcionalmente con uno a cuatro sustituyentes, normalmente uno o dos sustituyentes independientemente seleccionados de halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, -SO2Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)SO2Rg o -N(Re)C=N(Rh)-amino. Grupos heterociclo opcionalmente sustituidos de ejemplo incluyen
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y similares. Un heterociclo opcionalmente sustituido se puede fusionar a un grupo arilo para proporcionar un arilo opcionalmente sustituido como se describió anteriormente.
El término “alcoxi” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un hidroxialquilo, haloalquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido o alquinilo opcionalmente sustituido adherido a un átomo de oxígeno terminal. Grupos alcoxi de ejemplo incluyen metoxi, tert-butoxi, - OCH2CH=CH2.
El término “ariloxi” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un arilo opcionalmente sustituido adherido a un átomo de oxígeno terminal. Grupos ariloxi de ejemplo incluyen fenoxi.
El término “arilalquiloxi” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un
arilalquilo adherido a un átomo de oxígeno terminal. Grupos arilalquiloxi de ejemplo incluyen benciloxi.
El término “alquiltio” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un hidroxialquilo, haloalquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido o alquinilo opcionalmente sustituido adherido a un átomo de azufre terminal. Grupos alquilo de ejemplo incluyen -SCH3.
El término “halo” o “halógeno” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a fluoro, cloro, bromo o yodo.
El término “amino” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un radical de
la fórmula -NRaRb en la que Ra y Rb son independientemente hidrógeno, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo
opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; o Ra y Rb tomados juntos con el átomo de nitrógeno a los cuales ellos se adhieren forman un heterociclo de cuatro a siete miembros. Grupos amino de ejemplo grupos incluyen -NH2, -N(H)CH3, - N(CH3)2, -N(H)CH2Ph.
El término “carboxamido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un radical de la fórmula -COamino. Grupos carboxamido de ejemplo incluyen -CONH2, - CON(H)CH3, -CON(H)Ph.
El término “sulfonamido” como se utiliza en este documento en sí mismo o como parte de otro grupo se refiere a un radical de la fórmula -SO2-amino. Grupos sulfonamido de ejemplo incluyen -SO2NH2, - SO2N(H)CH3, -SO2N(H)Ph.
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En referencia a los grupos opcionalmente sustituidos descritos anteriormente, Rc es hidrógeno, hidroxi, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi o arilalquiloxi; Rd es haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; Re es hidrógeno, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; Rf es hidrógeno, haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, arilalquiloxi o amino; Rg es haloalquilo, hidroxialquilo, arilalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido o amino; y Rh es hidrógeno, alquilo, arilo, ciano o nitro.
A lo largo de la memoria descriptiva, los grupos y los sustituyentes opcionales de los mismos se eligen para proporcionar restos y compuestos estables.
Los compuestos de la presente invención pueden contener proporciones no naturales de isótopos atómicos en uno o más de los átomos que constituyen tales compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden estar radiomarcados con isótopos radiactivos, tales como, por ejemplo, tritio (3H), yodo-125 (125I) o carbono-14 (14C). Todas las variaciones isotópicas de los compuestos de la presente invención, ya sean radioactivas o no, están destinadas a estar abarcadas dentro del alcance de la presente invención.
Los compuestos de la presente invención pueden formar sales que también están dentro del alcance de esta invención. La referencia a un compuesto de la presente invención en el presente documento se entiende que incluye una referencia a sus sales, a menos que se indique lo contrario. El término “sal (es)” como se usa en el presente documento indica sales ácidas y/o básicas formadas con ácidos y bases inorgánicos y/u orgánicos. Además, cuando un compuesto de la invención contiene tanto un resto básico como un resto ácido, pueden formarse zwitteriones (“sales internas”) y se incluyen dentro del término “sal (es)” como se usa en este documento. Se prefieren las sales farmacéuticamente aceptables (es decir, no tóxicas, fisiológicamente aceptables), aunque también son útiles otras sales, por ejemplo, en etapas de aislamiento o purificación que pueden emplearse durante la preparación. Las sales de los compuestos de la invención se pueden formar, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto con una cantidad de ácido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como uno en el que la sal precipita o en un medio acuoso seguido de liofilización.
Los compuestos de la presente invención que contienen un resto básico pueden formar sales con una variedad de ácidos orgánicos e inorgánicos. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen acetatos (tales como los formados con ácido acético o ácido trihaloacético, por ejemplo, ácido trifluoroacético), adipatos, alginatos, ascorbatos, aspartatos, benzoatos, bencenosulfonatos, bisulfatos, boratos, butiratos, citratos, alcanforados, canforsulfonatos, ciclopentano propionatos, digluconatos, dodecilsulfatos, etanosulfonatos, fumaratos, glucoheptanoatos, glicerofosfatos, hemisulfatos, heptanoatos, hexanoatos, clorhidratos (formados con ácido clorhídrico), bromohidratos (formados con bromuro de hidrógeno), yodohidratos, 2-hidroxietanosulfonatos, lactatos, maleatos (formados con ácido maleico), metanosulfonatos (formados con ácido metanosulfónico), 2-naftalenosulfonatos, nicotinatos, nitratos, oxalatos, pectinatos, persulfatos, 3- fenilpropionatos, fosfatos, picratos, pivalatos, propionatos, salicilatos, succinatos, sulfatos (como los formados con ácido sulfúrico), sulfonatos (como los mencionados en este documento), tartratos, tiocianatos, toluenosulfonatos tales como tosilatos, undecanoatos y similares.
Los compuestos de la presente invención que contienen un resto ácido pueden formar sales con una variedad de bases orgánicas e inorgánicas. Ejemplos de sales básicas incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, litio y potasio, sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas (por ejemplo, aminas orgánicas) tales como benzatinas, diciclohexilaminas, hidrabaminas (formado con N, N-bis (deshidroabietil) etilendiamina), N-metil-D-glucaminas, N-metil-D-glucamidas, t-butilaminas y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina y similares.
Los términos y las convenciones estereoquímicos usados en la memoria descriptiva son consistentes con los descritos en Pure & Appl. Chem 68: 2193 (1996), a menos que se indique lo contrario.
El término “exceso enantiomérico” o “ee” se refiere a una medida de la cantidad de un enantiómero presente en comparación con el otro. Para una mezcla de enantiómeros R y S, el porcentaje de exceso enantiomérico se define como | R - S | * 100, donde R y S son las respectivas fracciones en moles o en peso de enantiómeros en una mezcla tal que R + S = 1. Con conocimiento de la rotación óptica de una sustancia quiral, el porcentaje de exceso enantiomérico se define como ([a]obs/[a]max) * 100, donde [a]obs es la rotación óptica de la mezcla de enantiómeros y [a]max es la rotación óptica del enantiómero puro. La determinación del exceso enantiomérico es posible usando una variedad de técnicas analíticas, que incluyen espectroscopía de RMN, cromatografía de columna quiral o polarimetría óptica.
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Los términos “enantioméricamente puro” o “enantiopuro” se refieren a una muestra de una sustancia quiral, cuyas moléculas (dentro de los límites de detección) tienen el mismo sentido de quiralidad
Los términos “enantioméricamente enriquecido” o “enantioenriquecido” se refieren a una muestra de una sustancia quiral cuya relación enantiomérica es mayor que 50:50. Los compuestos enantioméricamente enriquecidos pueden ser enantioméricamente puros.
El término “átomo de carbono asimétrico” se refiere a un átomo de carbono en una molécula de un compuesto orgánico que está unido a cuatro átomos o grupos de átomos diferentes.
El término “predominantemente” significa en una relación mayor que 50:50.
El término “grupo saliente” o “LG” se refiere a un átomo o grupo que se separa de un átomo o grupo en lo que se considera la parte residual o principal del sustrato en una reacción especificada. En las reacciones de acoplamiento de amida, los grupos salientes a modo de ejemplo incluyen -F, -Cl, -Br, -OC6F5 y similares.
El término “aislado” para los fines de la presente invención designa un material (por ejemplo, un compuesto químico o material biológico tal como un ácido nucleico o proteína) que se ha eliminado de su entorno original (el entorno en el que está naturalmente presente). Por ejemplo, un polinucleótido presente en estado natural en una planta o un animal no está aislado, sin embargo, el mismo polinucleótido separado de los ácidos nucleicos adyacentes en los que está presente de manera natural, se considera “aislado”.
El término “purificado”, tal como se aplica a materiales biológicos, no requiere que el material esté presente en una forma que muestre pureza absoluta, excluyendo la presencia de otros compuestos. Es más bien una definición relativa.
“Ácido nucleico”, “molécula de ácido nucleico”, “oligonucleótido” y “polinucleótido” se usan indistintamente y se refieren a la forma polimérica de éster fosfato de ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina, “moléculas de ARN”) o desoxirribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina, “moléculas de ADN”), o cualquier análogo fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres, en forma de una cadena, o una hélice de dos cadenas. Son posibles las hélices de ADN-ADN de doble cadena, ADN-ARN y ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico, y en particular molécula de ADN o ARN, se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita a ninguna forma terciaria particular. Por lo tanto, este término incluye ADN de dos cadenas encontrado, entre otros, en moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos, ADN superenrollado y cromosomas. Al discutir la estructura de moléculas de ADN de dos cadenas particulares, las secuencias pueden describirse aquí de acuerdo con la convención normal de dar solo la secuencia en la dirección 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homóloga al ARNm). Una “molécula de ADN recombinante” es una molécula de ADN que se ha sometido a una manipulación biológica molecular. El ADN incluye, pero sin limitación, ADNc, ADN genómico, ADN plasmídico, ADN sintético y ADN semisintético.
El término “fragmento” se refiere a una secuencia de nucleótidos de longitud reducida en relación con el ácido nucleico de referencia y que comprende, en la porción común, una secuencia de nucleótidos idéntica al ácido nucleico de referencia. Tal fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede estar, cuando sea apropiado, incluido en un polinucleótido más grande del cual este es un constituyente. Tales fragmentos comprenden, o alternativamente consisten en, oligonucleótidos que varían en longitud desde al menos 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51,54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000 o 1500 nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico según la invención.
Como se usa en el presente documento, un “fragmento de ácido nucleico aislado” se refiere a un polímero de ARN o ADN que tiene una o dos cadenas, que contiene opcionalmente bases de nucleótidos sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar compuesto por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.
Un “gen” se refiere a un polinucleótido que comprende nucleótidos que codifican una molécula funcional (por ejemplo, un polipéptido o ARN) e incluye ADNc y ácidos nucleicos de ADN genómico. “Gen” también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa un ARN, proteína o polipéptido específico, que incluye secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificantes 5') y a continuación (secuencias no codificantes 3') la secuencia codificante. “Gen nativo” se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. “Gen quimérico” se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y/o codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Un gen quimérico puede comprender secuencias codificantes derivadas de diferentes fuentes y/o secuencias reguladoras derivadas de diferentes fuentes. “Gen endógeno” se refiere a un gen nativo en su ubicación natural en el genoma de un organismo. Un gen “extraño” o un gen “heterólogo” se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped mediante transferencia génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o genes quiméricos. Un “transgén” es un gen que se ha introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.
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ADN “heterólogo” se refiere a ADN que no se encuentra naturalmente en la célula, o en un sitio cromosómico de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye un gen extraño a la célula.
El término “genoma” incluye ADN o ARN tanto cromosómico como mitocondrial, cloroplástico y viral.
Una molécula de ácido nucleico es “hibridable” con otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma de una cadena de la molécula de ácido nucleico puede hibridarse con la otra molécula de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de la temperatura y la concentración iónica de la solución (véase Sambrook et al., 1989 infra). Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y ejemplificadas en Sambrook et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 en el mismo. Las condiciones de temperatura y concentración iónica determinan la “rigurosidad” de la hibridación.
Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para seleccionar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homólogas de organismos distantemente relacionados, a fragmentos muy similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Para el cribado preliminar de ácidos nucleicos homólogos, se pueden usar condiciones de hibridación de baja rigurosidad, correspondientes a una Tm de 55°, por ejemplo, 5x SSC, 0.1% de SDS, 0.25% de leche, y sin formamida; o 30% de formamida, 5x SSC, 0.5% de SDS). Las condiciones de hibridación de rigurosidad moderada corresponden a una Tm superior, por ejemplo, 40% de formamida, con 5x o 6x SCC. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad corresponden a la Tm más alta, por ejemplo, 50% de formamida, 5x o 6x SCC.
La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles los desajustes entre las bases. El término “complementario” se usa para describir la relación entre bases de nucleótidos que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. De acuerdo con esto, la presente descripción también describe fragmentos de ácido nucleico aislados que son complementarios a las secuencias completas tal como se divulgaron y usaron en la presente memoria así como aquellas secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares.
Los polinucleótidos se pueden detectar empleando condiciones de hibridación que comprenden una etapa de hibridación a Tm de 55 °C, y utilizando las condiciones que se han expuesto anteriormente. La Tm puede ser de 60 0C; la Tm puede ser de 63 0C; o la Tm puede ser de 65 0C.
Los lavados posteriores a la hibridación también determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones utiliza una serie de lavados que comienzan con 6X SSC, 0.5% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos (min), luego se repiten con 2X SSC, 0.5% SDS a 45 0C durante 30 minutos, y luego se repiten dos veces con 0.2X SSC, 0.5% SDS a 50 0C durante 30 minutos. Un conjunto de condiciones rigurosas usa temperaturas más altas en las que los lavados son idénticos a los anteriores, excepto la temperatura de los últimos dos lavados de 30 minutos en 0.2X SSC, 0.5% SDS aumenta a 60 0C. Otro conjunto de condiciones altamente rigurosas utiliza dos lavados finales en 0.1X SSC, 0.1% SDS a 65 0C.
La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a una Tm superior) de las hibridaciones de ácido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN: ARN, ADN: ARN, ADN: ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado las ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al., Supra, 9.50-0.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los desapareamientos se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., Supra, 11.7-11.8).
Los polinucleótidos se pueden detectar empleando condiciones de hibridación que comprenden una etapa de hibridación en menos de 500 mM de sal y al menos 37 grados Celsius, y una etapa de lavado en 2XSSPE al menos 63 grados Celsius. Las condiciones de hibridación pueden comprender menos de 200 mM de sal y al menos 37 grados Celsius para la etapa de hibridación. Las condiciones de hibridación pueden comprender 2XSSPE y 63 grados Celsius tanto para la hibridación como para las etapas de lavado.
La longitud de un ácido nucleico hibridable puede ser de al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 15 nucleótidos; más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos; y más preferiblemente la longitud es de al menos 30 nucleótidos. Además, el experto en la materia reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado se pueden ajustar según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda.
El término “sonda” se refiere a una molécula de ácido nucleico de una cadena que puede formar pares de bases con un ácido nucleico diana de una cadena o complementario para formar una molécula de dos cadenas.
Como se usa en la presente memoria, el término “oligonucleótido” se refiere a un ácido nucleico corto que se puede hibridar con una molécula de ADN genómico, una molécula de ADNc, un ADN plasmídico o una molécula de ARNm. Los
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oligonucleótidos se pueden marcar, por ejemplo, con 32P nucleótidos o nucleótidos a los que se ha conjugado covalentemente un marcador, tal como biotina. Un oligonucleótido marcado puede usarse como una sonda para detectar la presencia de un ácido nucleico. Los oligonucleótidos (uno o ambos pueden marcarse) se pueden usar como cebadores de PCR, ya sea para clonar una longitud completa o un fragmento de un ácido nucleico, o para detectar la presencia de un ácido nucleico. Un oligonucleótido también se puede usar para formar una triple hélice con una molécula de ADN. Generalmente, los oligonucleótidos se preparan sintéticamente, preferiblemente en un sintetizador de ácido nucleico. Por consiguiente, los oligonucleótidos pueden prepararse con enlaces análogos de fosfoéster de ocurrencia no natural, tales como enlaces tioéster, etc.
Un “cebador” se refiere a un oligonucleótido que hibrida a una secuencia de ácido nucleico diana para crear una región de ácido nucleico de doble cadena que puede servir como un punto de iniciación para la síntesis de ADN en condiciones adecuadas. Tales cebadores pueden usarse en una reacción en cadena de la polimerasa.
La “reacción en cadena de la polimerasa” se abrevia PCR y se refiere a un método in vitro para amplificar enzimáticamente secuencias de ácidos nucleicos específicas. La PCR implica una serie repetitiva de ciclos de temperatura, comprendiendo cada ciclo tres etapas: desnaturalización del ácido nucleico molde para separar las cadenas de la molécula diana, hibridación de un cebador de oligonucleótido PCR de una cadena con el ácido nucleico molde y extensión del cebador hibridado (s) por la ADN polimerasa. La PCR proporciona un medio para detectar la presencia de la molécula diana y, en condiciones cuantitativas o semicuantitativas, para determinar la cantidad relativa de esa molécula objetivo dentro del conjunto inicial de ácidos nucleicos.
La “reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa” se abrevia RT-PCR y se refiere a un método in vitro para producir enzimáticamente una molécula o moléculas de ADNc diana a partir de una molécula o moléculas de ARN, seguido de amplificación enzimática de una secuencia o secuencias de ácido nucleico específicas dentro de la molécula o moléculas de ADNc diana como se describió anteriormente. La RT-PCR también proporciona un medio para detectar la presencia de la molécula diana y, en condiciones cuantitativas o semicuantitativas, para determinar la cantidad relativa de esa molécula objetivo dentro del conjunto inicial de ácidos nucleicos.
Una “secuencia codificante” de ADN se refiere a una secuencia de ADN de doble cadena que codifica un polipéptido y puede transcribirse y traducirse en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. “Secuencias reguladoras adecuadas” se refiere a secuencias de nucleótidos situadas cadena arriba (secuencias 5' no codificantes), dentro, o cadena abajo (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias líderes de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento de ARN, sitio de unión efector y estructura de tallo-bucle. Los límites de la secuencia de codificación están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxilo). Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a, secuencias procariotas, ADNc de ARNm, secuencias de ADN genómico e incluso secuencias de ADN sintéticas. Si la secuencia de codificación está destinada a la expresión en una célula eucariótica, una secuencia de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción se localizarán normalmente 3' a la secuencia codificante.
“Marco de lectura abierto” se abrevia ORF y se refiere a una longitud de secuencia de ácido nucleico, ADN, ADNc o ARN, que comprende una señal de inicio de la traducción o un codón de iniciación, como un ATG o AUG, y un codón de terminación y puede traducirse potencialmente en una secuencia polipeptídica.
El término “cabeza a cabeza” se usa en la presente memoria para describir la orientación de dos secuencias de polinucleótidos en relación entre sí. Dos polinucleótidos se colocan en una orientación de cabeza a cabeza cuando el extremo 5' de la cadena de codificación de un polinucleótido es adyacente al extremo 5' de la cadena de codificación del otro polinucleótido, por lo que la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede desde el extremo 5' del otro polinucleótido. El término “cabeza a cabeza” se puede abreviar (5') - a - (5') y también se puede indicar con los símbolos (^ —) o (3 '^ 5' 5' — 3').
El término “cola a cola” se usa en el presente documento para describir la orientación de dos secuencias de polinucleótidos en relación entre sí. Dos polinucleótidos se posicionan en una orientación de cola a cola cuando el extremo 3' de la cadena codificante de un polinucleótido es adyacente al extremo 3' de la cadena codificante del otro polinucleótido, por lo que la dirección de transcripción de cada polinucleótido avanza hacia el otro polinucleótido. El término “cola a cola” puede abreviarse (3') - a - (3') y también puede indicarse mediante los símbolos (— ^) o (5'— 3' 3' ^ 5').
El término “cabeza a cola” se usa en la presente memoria para describir la orientación de dos secuencias de polinucleótidos en relación entre sí. Dos polinucleótidos se colocan en una orientación de cabeza a cola cuando el extremo 5' de la cadena codificante de un polinucleótido es adyacente al extremo 3' de la cadena codificante del otro polinucleótido, por lo que la dirección de transcripción de cada polinucleótido procede en la misma dirección que la del otro polinucleótido. El término “cabeza a cola” se puede abreviar (5') -a- (3') y también se puede indicar mediante los símbolos (— —) o (5'— 3' 5' — 3').
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El término “corriente abajo” se refiere a una secuencia de nucleótidos que está situada 3' en una secuencia de nucleótidos de referencia. En particular, las secuencias de nucleótidos aguas abajo generalmente se relacionan con secuencias que siguen el punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, el codón de iniciación de la traducción de un gen se localiza aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción.
El término “aguas arriba” se refiere a una secuencia de nucleótidos que está situada 5' en una secuencia de nucleótidos de referencia. En particular, las secuencias de nucleótidos aguas arriba generalmente se refieren a secuencias que están ubicadas en el lado 5' de una secuencia de codificación o punto de inicio de la transcripción. Por ejemplo, la mayoría de los promotores se encuentran aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción.
Los términos “endonucleasa de restricción” y “enzima de restricción” se usan indistintamente y se refieren a una enzima que se une y corta dentro de una secuencia de nucleótidos específica dentro del ADN de dos cadenas.
“Recombinación homóloga” se refiere a la inserción de una secuencia de ADN extraño en otra molécula de ADN, por ejemplo, la inserción de un vector en un cromosoma. Preferiblemente, el vector se dirige a un sitio cromosómico específico para la recombinación homóloga. Para recombinación homóloga específica, el vector contendrá regiones de homología suficientemente largas para las secuencias del cromosoma para permitir la unión complementaria y la incorporación del vector en el cromosoma. Las regiones de homología más largas y los mayores grados de similitud de secuencia pueden aumentar la eficacia de la recombinación homóloga.
Se pueden usar varios métodos conocidos en la técnica para propagar un polinucleótido de acuerdo con la divulgación. Una vez que se establece un sistema huésped adecuado y las condiciones de crecimiento, los vectores de expresión recombinantes se pueden propagar y preparar en cantidad. Como se describe en este documento, los vectores de expresión que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, los siguientes vectores o sus derivados: virus humanos o animales tales como virus vaccinia o adenovirus; virus de insectos tales como baculovirus; vectores de levadura; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, lambda) y vectores de ADN plásmido y cósmido, por nombrar algunos.
Un “vector” se refiere a cualquier vehículo para la clonación y/o transferencia de un ácido nucleico en una célula huésped. Un vector puede ser un replicón al que se puede unir otro segmento de ADN para provocar la replicación del segmento unido. Un “replicón” se refiere a cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, fago, cósmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. El término “vector” incluye vehículos tanto virales como no virales para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Se puede utilizar una gran cantidad de vectores conocidos para manipular ácidos nucleicos, incorporar elementos de respuesta y promotores en genes, etc. Los vectores posibles incluyen, por ejemplo, plásmidos o virus modificados que incluyen, por ejemplo, bacteriófagos tales como derivados de lambda o plásmidos tales como pBR322 o derivados de plásmido pUC, o el vector Bluescript. Por ejemplo, la inserción de los fragmentos de ADN correspondientes a los elementos de respuesta y promotores en un vector adecuado puede lograrse ligando los fragmentos de ADN apropiados en un vector elegido que tiene extremos cohesivos complementarios. Alternativamente, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse enzimáticamente o cualquier sitio puede producirse ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos del ADN. Dichos vectores pueden diseñarse para contener genes marcadores seleccionables que proporcionan la selección de células que han incorporado el marcador en el genoma celular. Tales marcadores permiten la identificación y/o selección de células huéspedes que incorporan y expresan las proteínas codificadas por el marcador.
Los vectores virales, y particularmente los vectores retrovirales, se han usado en una amplia variedad de aplicaciones de suministro de genes en células, así como sujetos animales vivos. Los vectores virales que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, virus adenoasociado, viruela, baculovirus, vaccinia, herpes simplex, Epstein-Barr, adenovirus, geminivirus y caulimovirus. Los vectores no virales incluyen plásmidos, liposomas, lípidos cargados eléctricamente (citofectinas), complejos de ADN-proteína y biopolímeros. Además de un ácido nucleico, un vector también puede comprender una o más regiones reguladoras, y/o marcadores seleccionables útiles para seleccionar, medir y controlar los resultados de la transferencia de ácido nucleico (transferencia a los tejidos, duración de la expresión, etc.).
El término “plásmido” se refiere a un elemento extracromosómico que a menudo porta un gen que no es parte del metabolismo central de la célula, y habitualmente en forma de moléculas de ADN de doble cadena circulares. Dichos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias integradoras de genoma, secuencias de fago o nucleótidos, lineales, circulares o superenrolladas, de un ADN o ARN de una cadena o de dos cadenas, derivados de cualquier fuente, en la que una cantidad de secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única que es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto con la secuencia 3' no traducida apropiada en una célula.
Un “vector de clonación” se refiere a un “replicón”, que es una unidad de longitud de un ácido nucleico, preferiblemente ADN, que se replica secuencialmente y que comprende un origen de replicación, tal como un plásmido, fago o cósmido, al cual otro segmento de ácido nucleico puede unirse para provocar la replicación del segmento unido. Los vectores de clonación pueden ser capaces de replicarse en un tipo de célula y expresión en otro (“vector lanzadera”).
El término “vector de expresión” se refiere a un vector, plásmido o vehículo diseñado para permitir la expresión de una secuencia de ácido nucleico insertada después de la transformación en el huésped. El gen clonado, es decir, la secuencia
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de ácido nucleico insertada se coloca habitualmente bajo el control de elementos de control tales como un promotor, un promotor mínimo, un potenciador o similar. Las regiones o promotores de control de la iniciación, que son útiles para dirigir la expresión de un ácido nucleico en la célula huésped deseada son numerosos y familiares para los expertos en la técnica. Prácticamente cualquier promotor capaz de conducir estos genes es adecuado para la presente invención que incluye, pero no se limita a: promotores virales, promotores bacterianos, promotores animales, promotores mamíferos, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotor específico de tejido, promotores específicos del desarrollo, promotores inducibles, promotores regulados por la luz; CYC1, HIS3, GAL1, GaL4, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, promotores de la fosfatasa alcalina (útiles para la expresión en Saccharomyces); Promotor AOX1 (útil para la expresión en Pichia); promotores de p-lactamasa, lac, ara, tet, trp, IPl, IPr, T7, tac y trc (útiles para la expresión en Escherichia coli); promotores regulados ligeros, específicos de semilla, específicos de polen, específicos de ovario, relacionados con patogénesis o enfermedad, de virus de mosaico de coliflor 35S, mínimo CMV 35S, de virus de mosaico de vena de yuca (CsVMV), de proteína de unión a clorofila a/b, de ribulosa 1,5 -bisfosfato carboxilasa, específico de brote, específico de raíz, de quitinasa, inducible por estrés, de virus baciliforme de tungro de arroz, superpromotor de planta, aminopeptidasa de leucina de patata, de nitrato reductasa, de mannopina sintasa, de nopalina sintasa, de ubiquitina, de proteína zeína y promotores de antocianina (útiles para expresión en células vegetales); promotores animales y mamíferos conocidos en la técnica incluyen, pero sin limitación, la región promotora temprana de SV40 (SV40e), el promotor contenido en la repetición terminal larga (LTR) 3' del virus del sarcoma de Rous (RSV), los promotores de la E1A o promotor tardío principal (MLP) genes de adenovirus (Ad), el promotor temprano de citomegalovirus (CMV), el promotor de timidina quinasa (TK) del virus herpes simplex (HSV), un promotor IE1 de baculovirus, un factor de elongación alfa 1 (EF1) promotor, un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK), un promotor de ubiquitina (Ubc), un promotor de albúmina, las secuencias reguladoras del promotor de metalotionein-L de ratón y las regiones de control transcripcional, los promotores ubicuos (HPRT, vimentina, a-actina, tubulina y similares), los promotores de los filamentos intermedios (desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP y similares), los promotores de genes terapéuticos (del tipo MDR, CFTR o factor VIII, y similares), promotores relacionados con patogénesis o la enfermedad, y promotores que exhiben la especificidad y se han utilizado en animales transgénicos, tales como la región de control del gen elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas; región de control del gen de insulina activa en células beta pancreáticas, región de control del gen de inmunoglobulina activa en células linfoides, región de control del virus de tumor mamario de ratón activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos; gen de albúmina, regiones de control Apo AI y Apo AII activas en el hígado, región de control del gen alfafetoproteína activa en el hígado, región de control del gen alfa 1 -antitripsina activa en el hígado, región de control del gen beta-globina activa en células mieloides, proteína básica de mielina región de control génico activa en células oligodendrocíticas en el cerebro, región de control del gen de la cadena ligera de miocina 2 activo en el músculo esquelético, y región de control del gen de la hormona de liberación gonadotrópico activa en el hipotálamo, promotor de piruvato quinasa, promotor villin, promotor de la proteína intestinal que se une al ácido graso, promotor de la a-actina de células de músculo liso y similares. Además, estas secuencias de expresión pueden modificarse mediante la adición de un potenciador o secuencias reguladoras y similares.
Los vectores se pueden introducir en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, dextrano DEAE, precipitación con fosfato de calcio, lipofección (fusión de lisosomas), uso de una pistola de genes, o un transportador de vector de ADN (véase, por ejemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963-967 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988) y Hartmut et al., solicitud de patente canadiense No. 2,012,311, presentada el 15 de marzo de 1990).
También se puede introducir un polinucleótido in vivo mediante lipofección. Durante la última década, ha habido un uso creciente de liposomas para la encapsulación y transfección de ácidos nucleicos in vitro. Los lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las dificultades y los peligros encontrados con la transfección mediada por liposomas pueden usarse para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UsA 84. 7413 (1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027 - 8031 (1988) y Ulmer et al., Science 259: 1745 - 1748 (1993)). El uso de lípidos catiónicos puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos cargados negativamente, y también promover la fusión con membranas celulares cargadas negativamente (Feigner et al., Science 337: 387-388 (1989)). Compuestos lipídicos y composiciones particularmente útiles para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en los documentos WO95/18863, WO96/17823 y U.S. 5,459,127. El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en los órganos específicos in vivo tiene ciertas ventajas prácticas. La orientación molecular de los liposomas a células específicas representa un área de beneficio. Está claro que dirigir la transfección a tipos de células particulares sería particularmente preferido en un tejido con heterogeneidad celular, tal como páncreas, hígado, riñón y cerebro. Los lípidos se pueden acoplar químicamente a otras moléculas con el objetivo de dirigir (Mackey et al., 1988, supra). Los péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no peptídicas podrían acoplarse químicamente a liposomas.
Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, WO95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión a ADN (por ejemplo, WO96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, WO95/21931).
También es posible introducir un vector in vivo como un plásmido de ADN desnudo (véanse las patentes de los Estados Unidos 5,693,622, 5,589,466 y 5,580,859). También pueden usarse enfoques de suministro de ADN mediado por receptor (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147 - 154 (1992) y Wu y et al., J. Biol. Chem. 262: 4429 - 4432 (1987))
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El término “transfección” se refiere a la absorción de ARN o ADN exógeno o heterólogo por una célula. Una célula ha sido “transfectada” por ARN o ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ARN o ADN se ha introducido dentro de la célula. Una célula ha sido “transformada” por ARN o ADN exógeno o heterólogo cuando el ARN o ADN transfectado produce un cambio fenotípico. El ARN o ADN transformador se puede integrar (unido covalentemente) en el ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula.
“T ransformación” se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, dando como resultado una herencia genéticamente estable. Los organismos hospedadores que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos “transgénicos” o “recombinantes” o “transformados”.
Además, el vector recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la divulgación puede incluir uno o más orígenes para la replicación en los huéspedes celulares en los que se busca su amplificación o su expresión, marcadores o marcadores seleccionables.
El término “marcador seleccionable” se refiere a un factor de identificación, generalmente un gen de resistencia química o antibiótico, que se puede seleccionar basándose en el efecto del gen marcador, es decir, resistencia a un antibiótico, resistencia a un herbicida, marcadores colorimétricos, enzimas, marcadores fluorescentes y similares, en donde el efecto se usa para seguir la herencia de un ácido nucleico de interés y/o para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables conocidos y usados en la técnica incluyen: genes que proporcionan resistencia a ampicilina, estreptomicina, gentamicina, kanamicina, higromicina, herbicida de bialafos, sulfonamida y similares; y genes que se usan como marcadores fenotípicos, es decir, genes reguladores de antocianina, gen de isopentanil transferasa y similares.
El término “gen indicador” se refiere a un ácido nucleico que codifica un factor de identificación que puede identificarse basándose en el efecto del gen indicador, en el que el efecto se usa para rastrear la herencia de un ácido nucleico de interés, para identificar un célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés, y/o para medir la inducción o la transcripción de la expresión génica. Los ejemplos de genes indicadores conocidos y usados en la técnica incluyen: luciferasa (Luc), proteína fluorescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), p-galactosidasa (LacZ), p- glucuronidasa (Gus) y similares. Los genes marcadores seleccionables también pueden considerarse genes indicadores.
“Promotor” y “secuencia promotora” se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante se ubica 3' en una secuencia promotora. Los promotores se pueden derivar en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiológicas. Los promotores que causan que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células en la mayoría de los casos se conocen comúnmente como “promotores constitutivos”. El hecho de que un gen se exprese en un tipo de célula específico se denomina comúnmente “promotores específicos de células” o “promotores específicos de tejidos”. Promotores que causan que un gen se exprese en una etapa específica de desarrollo o diferenciación celular se conocen comúnmente como “promotores específicos del desarrollo” o “promotores específicos de diferenciación celular”. Promotores que son inducidos y hacen que un gen se exprese después de la exposición o el tratamiento de la célula con un agente, molécula biológica, producto químico, ligando, luz o similar que induce al promotor se denominan comúnmente “promotores inducibles” o “promotores regulables”. Se reconoce además que, como en la mayoría de los casos, los límites exactos de las secuencias reguladoras tienen no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener actividad promotora idéntica.
La secuencia promotora está típicamente unida en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (convenientemente definido, por ejemplo, mapeando con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa.
Una secuencia codificante está “bajo el control” de las secuencias de control transcripcional y traduccional en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm, que luego se empalma con ARN trans (si la secuencia codificante contiene intrones) y se traduce a la proteína codificada por la secuencia de codificación.
Las “secuencias de control de la transcripción y la traducción” se refieren a secuencias reguladoras del ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula huésped. En células eucariotas, las señales de poliadenilación son secuencias de control.
El término “elemento de respuesta” se refiere a uno o más elementos de ADN que actúan en cis que confieren capacidad de respuesta a un promotor mediado por interacción con los dominios de unión a ADN de un factor de transcripción, por ejemplo, el dominio de unión a ADN de la primera proteína híbrida. Este elemento de ADN puede ser palindrómico (perfecto o imperfecto) en su secuencia o compuesta de motivos de secuencia o medios sitios separados por un número variable de nucleótidos. Los medios sitios pueden ser similares o idénticos y disponerse como repeticiones directas o invertidas o como un medio sitio único o como multímeros de medios sitios adyacentes en tándem. El elemento de
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respuesta puede comprender un promotor mínimo aislado de diferentes organismos dependiendo de la naturaleza de la célula u organismo en el que se incorporará el elemento de respuesta. El dominio de unión a ADN de la primera proteína híbrida se une, en presencia o ausencia de un ligando, a la secuencia de ADN de un elemento de respuesta para iniciar o suprimir la transcripción de gen (es) aguas abajo bajo la regulación de este elemento de respuesta. Los ejemplos de secuencias de ADN para los elementos de respuesta del receptor de ecdisona natural incluyen: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (SEQ ID NO: 16) (ver Cherbas et al., Genes Dev. 5: 120-131 (1991)); AGGTCAN(n) AGGTCA, donde N(n) puede ser uno o más nucleótidos espaciadores (SEQ ID NO: 17) (véase D'Avino et al., Mol. Cell. Endocrinol. 113: 1-9 (1995)); y GGGTTGAATGAATTT (SEQ ID NO: 18) (véase Antoniewski et al., Mol. Cell Biol. 14: 4465-4474 (1994)).
El término “operablemente ligado” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está operablemente ligado a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias de codificación pueden estar operablemente ligadas a secuencias reguladoras en orientación con sentido o antisentido.
El término “expresión”, como se usa en el presente documento, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN con sentido (ARNm) o antisentido derivado de un ácido nucleico o polinucleótido. La expresión también puede referirse a la traducción de ARNm a una proteína o polipéptido.
Los términos “casete”, “casete de expresión” y “casete de expresión génica” se refieren a un segmento de ADN que puede insertarse en un ácido nucleico o polinucleótido en sitios de restricción específicos o mediante recombinación homóloga. El segmento de ADN comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, y el casete y los sitios de restricción están diseñados para asegurar la inserción del casete en el marco de lectura apropiado para transcripción y traducción. “Casete de transformación” se refiere a un vector específico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés y que tiene elementos además del polinucleótido que facilitan la transformación de una célula huésped particular. Los casetes, casetes de expresión, casetes de expresión génica y casetes de transformación de la invención también pueden comprender elementos que permiten la expresión potenciada de un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés en una célula huésped. Estos elementos pueden incluir, pero no se limitan a: un promotor, un promotor mínimo, un potenciador, un elemento de respuesta, una secuencia de terminación, una secuencia de poliadenilación y similares.
Para los fines de esta invención, el término “interruptor para gen” se refiere a la combinación de un elemento de respuesta asociado con un promotor, y un sistema basado en EcR que, en presencia de uno o más ligandos, modula la expresión de un gen en el que se incorporan el elemento de respuesta y el promotor.
Los términos “modular” y “modula” significan inducir, reducir o inhibir la expresión de ácido nucleico o gen, dando como resultado la respectiva inducción, reducción o inhibición de la producción de proteína o polipéptido.
Los plásmidos o vectores usados en los métodos de acuerdo con la invención pueden comprender además al menos un promotor adecuado para dirigir la expresión de un gen en una célula huésped.
Los potenciadores que pueden usarse en la invención incluyen, pero no se limitan a: un potenciador de SV40, un potenciador de citomegalovirus (CMV), un potenciador de factor de alargamiento 1 (EF1), potenciadores de levadura, potenciadores de genes virales y similares.
Las regiones de control de terminación, es decir, secuencias de terminación o de poliadenilación, también pueden derivarse de diversos genes nativos de los huéspedes preferidos. Opcionalmente, un sitio de terminación puede ser innecesario, sin embargo, es más preferido si está incluido. La región de control de terminación puede estar comprendida o derivada de una secuencia sintética, señal de poliadenilación sintética, una señal de poliadenilación tardía de SV40, una señal de poliadenilación de SV40, una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGH), secuencias terminadoras virales o similares.
Los términos “secuencias no codificantes3'“ o “región no traducida 3' (UTR)” se refieren a secuencias de ADN situadas aguas abajo abajo (3') de una secuencia codificante y pueden comprender secuencias de reconocimiento de poliadenilación [poli (A)] y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación generalmente se caracteriza por afectar la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm.
“Región reguladora” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una segunda secuencia de ácido nucleico. Una región reguladora puede incluir secuencias que son naturalmente responsables de expresar un ácido nucleico particular (una región homóloga) o pueden incluir secuencias de un origen diferente que son responsables de expresar proteínas diferentes o incluso proteínas sintéticas (una región heteróloga). En particular, las secuencias pueden ser secuencias de genes procariotas, eucariotas o virales o secuencias derivadas que estimulan o reprimen la transcripción de un gen de una manera específica o inespecífica y de una manera inducible o no inducible. Las regiones reguladoras incluyen orígenes de replicación, sitios de corte y empalme de ARN, promotores, potenciadores, secuencias de terminación transcripcional y secuencias señal que dirigen el polipéptido a las rutas secretoras de la célula diana.
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Una región reguladora de una “fuente heteróloga” se refiere a una región reguladora que no está asociada de forma natural con el ácido nucleico expresado. Entre las regiones reguladoras heterólogas están incluidas regiones reguladoras de una especie diferente, regiones reguladoras de un gen diferente, secuencias reguladoras híbridas y secuencias reguladoras que no se producen en la naturaleza, pero que están diseñadas por un experto en la técnica.
“Transcrito de ARN” se refiere al producto resultante de la transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el transcrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se denomina transcrito primario o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento postranscripcional del transcrito primario y se denomina ARN maduro. “ARN mensajero (ARNm)” se refiere al ARN que no tiene intrones y que puede traducirse en proteína por la célula. “ADNc” se refiere a un ADN de dos cadenas que es complementario y se deriva de ARNm. El “sentido” de ARN se refiere a la transcripción de ARN que incluye el ARNm y, por lo tanto, puede traducirse en proteína por la célula. “ARN antisentido” se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a todo o parte de un transcrito primario o ARNm diana y que bloquea la expresión de un gen diana. La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito de gen específico, es decir, en la secuencia 5' no codificante, en la secuencia 3' no codificante, o en la secuencia codificante. “ARN funcional” se refiere a ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que aún no se ha traducido tiene un efecto sobre los procesos celulares.
“Polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de forma intercambiable y se refieren a un compuesto polimérico compuesto por residuos de aminoácidos unidos covalentemente. Los aminoácidos tienen la siguiente estructura general:
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Un “polipéptido aislado”, “péptido aislado” o “proteina aislada” se refiere a un polipéptido o proteina que está sustancialmente libre de aquellos compuestos que normalmente están asociados con el mismo en su estado natural (por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos). “Aislado” no pretende excluir mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos, o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad biológica, y que pueden estar presentes, por ejemplo, debido a la purificación incompleta, la adición de estabilizadores o la composición en una preparación farmacéuticamente aceptable.
Un “polipéptido mutante de sustitución” o un “mutante de sustitución” se entiende que significa un polipéptido mutante que comprende una sustitución de al menos un (1) de un aminoácido tipo silvestre o de origen natural con un aminoácido diferente en relación con el polipéptido tipo silvestre o de origen natural. Un polipéptido mutante de sustitución puede comprender solo una (1) sustitución de aminoácido natural o de origen natural y se puede denominar polipéptido “mutante puntual” o “mutante puntual único”. Alternativamente, un polipéptido mutante de sustitución puede comprender una sustitución de dos (2) o más aminoácidos tipo silvestre o de origen natural con 2 o más aminoácidos en relación con el polipéptido tipo silvestre o de origen natural. Según la divulgación, un polipéptido del dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación de sustitución comprende una sustitución de al menos un (1) aminoácido tipo silvestre o de origen natural con un aminoácido diferente en relación con el polipéptido del dominio de unión del ligando del receptor nuclear del Grupo H tipo silvestre o de origen natura.
Cuando el polipéptido mutante de sustitución comprende una sustitución de dos (2) o más aminoácidos tipo silvestre o de origen natura, esta sustitución puede comprender un número equivalente de aminoácidos tipo silvestre o de origen natural suprimidos para la sustitución, es decir, 2 aminoácidos tipo silvestre o de origen natural reemplazados con 2 aminoácidos no tipo silvestre o de no origen natural, o un número no equivalente de aminoácidos tipo silvestre suprimidos para la sustitución, es decir, 2 aminoácidos tipo silvestre reemplazados con 1 aminoácido de tipo no silvestre (una mutación de sustitución + supresión), o 2 aminoácidos de tipo silvestre reemplazados con 3 aminoácidos tipo no silvestre (una mutación de sustitución + inserción).
Los mutantes de sustitución pueden describirse usando un sistema de nomenclatura abreviado para indicar el residuo de aminoácido y el número reemplazado dentro de la secuencia de polipéptido de referencia y el nuevo residuo de aminoácido sustituido. Por ejemplo, un mutante de sustitución en el que los residuos de aminoácido vigésimo (20) de un polipéptido está sustituido puede ser abreviado como “x20z”, en donde “x” es el aminoácido a ser sustituido, “20” es la posición de residuo de aminoácido o número dentro del polipéptido, y “z” es el nuevo aminoácido sustituido. Por lo tanto, un mutante de sustitución abreviado intercambiablemente como “E20A” o “Glu20Ala” indica que el mutante comprende un residuo de alanina (comúnmente abreviado en la técnica como “A” o “Ala”) en lugar del ácido glutámico (comúnmente abreviado en la técnica como “E” o “Glu”) en la posición 20 del polipéptido.
Se puede realizar una mutación de sustitución mediante cualquier técnica de mutagénesis conocida en la técnica, que incluye, pero no se limita a, mutagénesis in vitro dirigida al sitio (Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253:6551 (1978); Zoller et al., DNA 3:479-488 (1984); Oliphant et al., Gene 44:177 (1986); Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710 (1986)), use of TAB® linkers (Pharmacia), restriction endonuclease digestion/fragment deletion and substitution, PCR- mediated/oligonucleotide-directed mutagenesis, and the like. PCR-based techniques are preferred for site-directed mutagenesis (see Higuchi, 1989, “Using PCR to Engineer DNA”, in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70).
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“Fragmento” de un polipéptido de acuerdo con la invención se refiere a un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es más corta que la del polipéptido de referencia y que comprende, a lo largo de la porción completa con estos polipéptidos de referencia, una secuencia de aminoácidos idéntica. Tales fragmentos pueden, cuando sea apropiado, ser incluidos en un polipéptido más grande de los cuales son parte. Dichos fragmentos de un polipéptido de acuerdo con la invención pueden tener una longitud de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240 o 300 aminoácidos.
Una “variante” de un polipéptido o proteína se refiere a cualquier análogo, fragmento, derivado o mutante que se deriva de un polipéptido o proteína y que retiene al menos una propiedad biológica del polipéptido o proteína. Diferentes variantes del polipéptido o proteína pueden existir en la naturaleza. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas caracterizadas por diferencias en las secuencias de nucleótidos del gen estructural que codifican para la proteína, o pueden implicar corte y empalme diferencial o modificación postraduccional. El experto en la materia puede producir variantes que tienen sustituciones, supresiones, adiciones o reemplazos de aminoácidos únicos o múltiples. Estas variantes pueden incluir, entre otros: (a) variantes en las que uno o más restos de aminoácidos están sustituidos con aminoácidos conservadores o no conservadores, (b) variantes en las que se añaden uno o más aminoácidos al polipéptido o proteína, (c) variantes en las que uno o más de los aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, y (d) variantes en las que el polipéptido o proteína se fusiona con otro polipéptido tal como albúmina sérica. Las técnicas para obtener estas variantes, que incluyen técnicas genéticas (deleciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas, son conocidas por las personas con experiencia normal en la técnica. Un polipéptido variante comprende preferiblemente al menos aproximadamente 14 aminoácidos.
El término “homología” se refiere al porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos o dos restos polipeptídicos. La correspondencia entre la secuencia de un resto a otro se puede determinar mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la homología puede determinarse mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas de polipéptido alineando la información de secuencia y usando programas informáticos fácilmente disponibles. Alternativamente, la homología puede determinarse mediante hibridación de polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido de digestión con nucleasas específicas de cadena simple y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos.
Como se usa en el presente documento, el término “homólogo” en todas sus formas gramaticales y variaciones de ortografía se refiere a la relación entre proteínas que poseen un “origen evolutivo común”, incluyendo proteínas de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de inmunoglobulinas) y proteínas homólogas de diferentes especies (por ejemplo, cadena ligera de miosina, etc.) (Reeck et al., Cell 50: 667 (1987)). Dichas proteínas (y sus genes codificantes) tienen homología de secuencia, como se refleja por su alto grado de similitud de secuencia. Sin embargo, en el uso común y en la presente divulgación, el término “homólogo”, cuando se modifica con un adverbio como “altamente”, puede referirse a la similitud de secuencia y no a un origen evolutivo común.
Por consiguiente, el término “similitud de secuencia” en todas sus formas gramaticales se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos de proteínas que pueden compartir o no un origen evolutivo común (véase Reeck et al., Cell 50: 667 (1987)). Dos secuencias de ADN pueden ser “sustancialmente homólogas” o “sustancialmente similares” cuando al menos aproximadamente 50% (preferiblemente al menos aproximadamente 75%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90 o 95%) de los nucleótidos coinciden sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden identificarse comparando las secuencias usando un software estándar disponible en bancos de datos de secuencia, o en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas como se define para ese sistema particular. La definición de condiciones de hibridación apropiadas corresponde a la persona experta. (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Como se usa en el presente documento, “sustancialmente similar” se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases de nucleótidos dan como resultado la sustitución de uno o más aminoácidos, pero no afectan las propiedades funcionales de la proteína codificada por la secuencia de ADN. “Sustancialmente similar” también se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la alteración de la expresión del gen mediante tecnología antisentido o de cosupresión. “Sustancialmente similar” también se refiere a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico tales como deleción o inserción de una o más bases de nucleótidos que no afectan sustancialmente a las propiedades funcionales del transcrito resultante. Por lo tanto, se entiende que la divulgación abarca más que las secuencias de ejemplo específicas. Cada una de las modificaciones propuestas está dentro de la experiencia habitual en la técnica, como lo es la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados.
Además, el experto en la técnica reconoce que las secuencias sustancialmente similares abarcadas por esta invención también se definen por su capacidad para hibridar, en condiciones rigurosas (0.1X SSC, 0.1% SDS, 65 °C y lavadas con 2X SSC, 0.1% SDS seguido de 0.1X SSC, 0.1% SDS), con las secuencias ejemplificadas aquí. Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares de la presente invención son aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de ADN son idénticas al menos en un 70% a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico informados en este documento. Los fragmentos de ácido nucleico de la presente divulgación incluyen aquellos fragmentos de ácido nucleico cuyas secuencias de ADN son al menos 80% idénticas a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico informados en este documento. Otros fragmentos de ácido nucleico son idénticos al menos en un 90% a la secuencia de ADN de los fragmentos de ácido nucleico informados en este documento. Otros fragmentos de ácido
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Dos secuencias de aminoácidos son “sustancialmente homologas” o “sustancialmente similares” cuando más de aproximadamente 40% de los aminoácidos son idénticos, o más de 60% son similares (funcionalmente idénticos). Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas se identifican por alineación usando, por ejemplo, el programa de compilación GCG (Genetics Computer Group, Manual de programa para el paquete GCG, Versión 7, Madison, Wisconsin).
El término “correspondiente a” se usa en este documento para referirse a secuencias similares u homólogas, ya sea que la posición exacta sea idéntica o diferente de la molécula a la que se mide la similitud u homología. Un alineamiento de secuencia de ácido nucleico o aminoácido puede incluir espacios. Por lo tanto, el término “correspondiente a” se refiere a la similitud de secuencia, y no a la numeración de los residuos de aminoácidos o las bases de nucleótidos.
Una “porción sustancial” de una secuencia de aminoácidos o nucleótidos comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, ya sea mediante evaluación manual de la secuencia por un experto en la técnica, o mediante comparación e identificación de secuencia automatizada por ordenador utilizando algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1993)); ver también
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). En general, es necesaria una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos con el fin de identificar putativamente un polipéptido o secuencia de ácido nucleico como homóloga a una proteína o gen conocido. Además, con respecto a secuencias de nucleótidos, se pueden usar sondas oligonucleotídicas específicas de gen que comprenden 2030 nucleótidos contiguos en métodos de identificación génica dependientes de secuencia (por Ejemplo, Hibridación Southern) y aislamiento (por Ejemplo., Hibridación in situ de colonias bacterianas o placas de bacteriófago). Además, pueden usarse oligonucleótidos cortos de 12-15 bases como cebadores de amplificación en PCR para obtener un fragmento particular de ácido nucleico que comprende los cebadores. Por consiguiente, una “porción sustancial” de una secuencia de nucleótidos comprende suficiente de la secuencia para identificar específicamente y/o aislar un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia.
El término “porcentaje de identidad”, como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias de polinucleótidos, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, como se determina mediante el emparejamiento entre cadenas de tales secuencias. La “identidad” y la “similitud” se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, que incluyen pero no se limitan a los descritos en: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991. Métodos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor combinación entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas de ordenador disponibles públicamente. Las alineaciones de secuencia y los cálculos de porcentaje de identidad se pueden realizar usando el programa Megalign del paquete de informático de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). La alineación múltiple de las secuencias se puede realizar usando el método de alineación Clustal (Higgins et al., CABIOS. 5: 151-153 (1989)) con los parámetros por defecto (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10). Parámetros predeterminados para alineaciones por pares usando el método Clustal se pueden seleccionar: KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 y DIAGONALS SAVED = 5.
El término “software de análisis de secuencia” se refiere a cualquier algoritmo informático o programa de software que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El “software de análisis de secuencia” puede estar disponible comercialmente o desarrollarse independientemente. El software de análisis de secuencia típico incluirá, pero no está limitado al paquete de programas de GCG 35 (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)), y DNASTAR (DNASTAR), Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 EE.UU.). Dentro del contexto de esta divulgación, se entenderá que cuando se usa un software de análisis de secuencia para el análisis, los resultados del análisis se basarán en los “valores por omisión” del programa al que se hace referencia, a menos que se especifique lo contrario. Como se usa en el presente documento, “valores por omisión” significará cualquier conjunto de valores o parámetros que originalmente se cargan con el software cuando se inicializan por primera vez.
“Sintetizado químicamente”, como se relaciona con una secuencia de ADN, significa que los nucleótidos componentes se ensamblaron in vitro. La síntesis química manual de ADN puede realizarse usando procedimientos bien establecidos, o la síntesis química automática puede realizarse usando una de una serie de máquinas disponibles comercialmente. En consecuencia, los genes se pueden adaptar para una expresión génica óptima basada en la optimización de la secuencia de nucleótidos para reflejar el codón sesgo de la célula huésped. El experto en la técnica aprecia la probabilidad de una expresión génica exitosa si el uso de codones está sesgado hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. La determinación de los codones preferidos se puede basar en una encuesta de genes derivados de la célula huésped donde la información de la secuencia está disponible.
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Como se usa en el presente documento, se dice que dos o más sistemas de regulación de genes operables individualmente son “ortogonales” cuando; a) la modulación de cada uno de los sistemas dados por su ligando respectivo, a una concentración elegida, da como resultado un valor mensurable cambio en la magnitud de la expresión del gen de ese sistema, y b) el cambio es estadísticamente significativamente diferente que el cambio en la expresión de todos los otros sistemas simultáneamente operables en la célula, tejido u organismo, independientemente de la simultaneidad o secuencialmente de la modulación Real. Preferiblemente, la modulación de cada sistema de regulación de genes operable individualmente produce un cambio en la expresión del gen al menos 2 veces mayor que todos los otros sistemas operables en la célula, tejido u organismo. Más preferiblemente, el cambio es al menos 5 veces mayor. Incluso más preferiblemente, el cambio es al menos 10 veces mayor. Todavía más preferiblemente, el cambio es al menos 100 veces mayor. Incluso aún más preferiblemente, el cambio es al menos 500 veces mayor. Idealmente, la modulación de cada uno de los sistemas dados por su ligando respectivo a una concentración elegida da como resultado un cambio mensurable en la magnitud de expresión del gen de ese sistema y ningún cambio medible en la expresión de todos los demás sistemas operables en la célula, tejido, u organismo. En tales casos, se dice que el sistema de regulación génica inducible múltiple es “completamente ortogonal”. La presente invención es útil para buscar ligandos ortogonales y sistemas de expresión génica basados en receptores ortogonales, tales como los descritos en el documento US 2002/0110861 A1.
El término “modular” significa la capacidad de un complejo de ligando/receptor dado para inducir o suprimir la transactivación de un gen exógeno.
El término “gen exógeno” significa un gen extraño para el sujeto, es decir, un gen que se introduce en el sujeto a través de un proceso de transformación, una versión no mutada de un gen mutado endógeno o una versión mutada de un gen endógeno no mutado. El método de transformación no es crítico para esta invención y puede ser cualquier método adecuado para el sujeto conocido por aquellos en la técnica. Por ejemplo, las plantas transgénicas se obtienen por regeneración a partir de las células transformadas. Se conocen numerosos procedimientos de transformación de la literatura, como la agroinfección mediante Agrobacterium tumefaciens o su plásmido T1, electroporación, microinyección de células de plantas y protoplastos, y transformación de microproyectiles. Se conocen técnicas complementarias para la transformación de células animales y la regeneración de tales células transformadas en animales transgénicos. Los genes exógenos pueden ser genes naturales o sintéticos y genes terapéuticos que se introducen en el sujeto en forma de ADN o ARN que pueden funcionar a través de un intermedio de ADN tal como mediante transcriptasa inversa. Dichos genes pueden introducirse en células diana, introducirse directamente en el sujeto, o introducido indirectamente por la transferencia de células transformadas, por ejemplo, células autólogas, en el sujeto. El término “gen terapéutico” significa un gen que imparte una función beneficiosa a la célula huésped en la que se expresa dicho gen.
El término “complejo receptor de ecdisona” generalmente se refiere a un complejo proteico heterodimérico que consiste en dos miembros de la familia del receptor de esteroides, las proteínas del receptor de ecdisona (“EcR”) y ultraespiráculo (“USP”) (véase Yao et al., Nature 366: 476 - 479 (1993)); Yao et al., Cell 71: 63 - 72 (1992)). El complejo receptor de ecdisteroide funcional también puede incluir proteínas adicionales tales como inmunofilinas. Los miembros adicionales de la familia de proteínas del receptor de esteroides, conocidos como factores transcripcionales (tales como DHR38, betaFTZ-1 u otros homólogos de insectos), también pueden ser dependientes del ligando o socios independientes para EcR y/o USP. El complejo receptor de ecdisona también puede ser un heterodímero de la proteína receptora de ecdisona y el homólogo de vertebrado de la proteína ultraspiratoria, proteína de ácido retinoico-X (“RXR”). Los complejos de homodímeros de la proteína receptora de ecdisona o USP también pueden ser funcionales en algunas circunstancias.
Un complejo de receptor de ecdisteroide puede ser activado por un ecdisteroide activo o un ligando no esteroideo unido a una de las proteínas del complejo, incluido EcR, pero sin excluir otras proteínas del complejo.
El complejo de receptor de ecdisona incluye proteínas que son miembros de la superfamilia de receptores de esteroides en donde todos los miembros se caracterizan por la presencia de un dominio de transactivación amino-terminal, un dominio de unión a ADN (“DBD”) y un dominio de unión a ligando (“LBD“) separados por una región de bisagra. Algunos miembros de la familia pueden también tener otro dominio de transactivación en el lado carboxi terminal del LBD. El DBD se caracteriza por la presencia de dos dedos de cinc de cisteína, entre los que se encuentran dos motivos de aminoácidos, el P-box y el D-box, que confieren especificidad a los elementos de respuesta de ecdisona. Estos dominios pueden ser nativos, modificados o quimeras de diferentes dominios de proteínas receptoras heterólogas.
Las secuencias de ADN que componen el gen exógeno, el elemento de respuesta y el complejo receptor de ecdisona pueden incorporarse en arqueobacterias, células procariotas tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis u otras enterobacterias, o células eucariotas tales como células vegetales o animales. Sin embargo, debido a que muchas de las proteínas expresadas por el gen se procesan incorrectamente en bacterias, se prefieren las células eucariotas. Las células pueden estar en forma de células individuales u organismos multicelulares. Las secuencias de nucleótidos para el gen exógeno, el elemento de respuesta y el complejo receptor también se pueden incorporar como moléculas de ARN, preferiblemente en forma de ARN virales funcionales tales como el virus del mosaico del tabaco. De las células eucariotas, se prefieren las células de vertebrado porque carecen naturalmente de las moléculas que confieren respuestas a los ligandos de esta invención para el receptor de ecdisona. Como resultado, son “sustancialmente insensibles” a los ligandos de esta invención. Por lo tanto, los ligandos de esta invención tendrán efectos fisiológicos insignificantes o de otro tipo sobre las células transformadas, o sobre el organismo completo. Por lo tanto, las células pueden crecer y expresar el producto deseado, sustancialmente no afectado por la presencia del propio ligando.
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El término “sujeto” significa un insecto, planta o animal intacto o una célula de un insecto, planta o animal. También se anticipa que los ligandos funcionarán igual de bien cuando el sujeto sea un hongo o levadura. Cuando el sujeto es un animal intacto, preferiblemente el animal es un vertebrado, más preferiblemente un mamífero.
Los ligandos de diacilhidrazina de Fórmula I y ligandos de diacilhidrazina quirales de Fórmula II o III de la presente divulgación, cuando se usan con el complejo de receptor de ecdisona, que a su vez está unido al elemento de respuesta unido a un gen exógeno, proporcionan los medios para la regulación temporal externa de la expresión del gen exógeno. El orden en el que los diversos componentes se unen entre sí, es decir, complejo de ligando a receptor y complejo de receptor a elemento de respuesta, no es crítico. Típicamente, la modulación de la expresión del gen exógeno es en respuesta a la unión del complejo receptor de ecdisona a un control específico, o elemento regulador del ADN. La proteína receptora de ecdisona, como otros miembros de la familia de receptores de esteroides, posee al menos tres dominios, un dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN y un dominio de unión a ligando. Este receptor, como un subconjunto de la familia de receptores de esteroides, también posee regiones menos bien definidas responsables de las propiedades de heterodimerización. La unión del ligando al dominio de unión a ligando de la proteína receptora de ecdisona, después de la heterodimerización con proteína USP o RXR, permite que los dominios de unión de ADN de las proteínas heterodiméricas se unan al elemento de respuesta en una forma activada, dando como resultado la expresión o supresión del gen exógeno. Este mecanismo no excluye el potencial de unión del ligando a EcR o a USP, y a la formación resultante de complejos de homodímeros activos (por ejemplo, EcR + EcR o USP + USP). Preferiblemente, uno o más de los dominios de receptor pueden variarse produciendo un interruptor para gen quimérico. Típicamente, uno o más de los tres dominios se pueden elegir de una fuente diferente a la fuente de los otros dominios para que el receptor quimérico se optimice en la célula u organismo huésped elegido para la actividad transactivadora, la unión complementaria del ligando y el reconocimiento de un elemento de respuesta específico. Además, el propio elemento de respuesta puede modificarse o sustituirse con elementos de respuesta para otros dominios de proteína de unión a ADN tales como la proteína GAL-4 de levadura (véase Sadowski etal., Nature 335: 563-564 (1988) o proteína LexA de E. coli (véase Brent et al., Cell 43: 729-736 (1985)) para acomodar complejos de receptores de ecdisona quiméricos. Otra ventaja de los sistemas quiméricos es que permiten la elección de un promotor utilizado para conducir el gen exógeno de acuerdo con un resultado final deseado. Tal doble control puede ser particularmente importante en áreas de terapia génica, especialmente cuando se producen proteínas citotóxicas, ya que tanto el tiempo de expresión como las células en las que se produce la expresión pueden controlarse. Cuando se introducen genes exógenos, unidos operativamente a un promotor adecuado, en las células del sujeto, la expresión de los genes exógenos se controla mediante la presencia del ligando de esta invención. Los promotores pueden estar regulados de forma constitutiva o inducible o pueden ser específicos de tejido (es decir, expresarse solo en un tipo de célula particular) o específicos de ciertas etapas del desarrollo del organismo.
Numerosas secuencias genómicas y de ácido nucleico de ADNc que codifican una diversidad de polipéptidos son bien conocidas en la técnica. El material genético exógeno útil con los ligandos de esta invención incluye genes que codifican proteínas biológicamente activas de interés, tales como, por ejemplo, proteínas secretoras que pueden liberarse de una célula; enzimas que pueden metabolizar un sustrato de una sustancia tóxica a una sustancia no tóxica, o de una sustancia inactiva a una sustancia activa; proteínas reguladoras; receptores de superficie celular; y similares. Los genes útiles también incluyen genes que codifican factores de coagulación sanguínea, hormonas tales como insulina, hormona paratiroidea, factor liberador de hormona luteinizante, inhibinas seminales alfa y beta y hormona de crecimiento humana; genes que codifican proteínas tales como enzimas, cuya ausencia conduce a la aparición de un estado anormal; genes que codifican citoquinas o linfoquinas tales como interferones, factor estimulante de colonias de macrófagos granulocíticos, factor 1 estimulante de colonias, factor de necrosis tumoral y eritropoyetina; genes que codifican el inhibidor sustancias como alfa1 -antitripsina, genes que codifican sustancias que funcionan como fármacos tales como toxinas de difteria y cólera; y similares. Los genes útiles también incluyen aquellos útiles para terapias contra el cáncer y para tratar trastornos genéticos. Los expertos en la técnica tienen acceso a la información de la secuencia de ácido nucleico para prácticamente todos los genes conocidos y pueden obtener la molécula de ácido nucleico directamente de un depósito público, la institución que publicó la secuencia, o emplear métodos rutinarios para preparar la molécula.
El gen exógeno puede ser el gen hIL-12 bajo el control del Sistema Terapéutico RheoSwitch™ (RTS), transfectado ex vivo con un adenovirus en células dendríticas autólogas.
Para el uso de terapia génica, los ligandos descritos en este documento pueden administrarse solos o como parte de una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede estar en forma de soluciones, suspensiones, tabletas, cápsulas, ungüentos, elixires o composiciones inyectables.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cargas tales como sacáridos, por ejemplo lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos cálcicos, por ejemplo fosfato tricálcico o hidrogenofosfato cálcico, así como aglutinantes tales como pasta de almidón, usando, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como los almidones mencionados anteriormente y también carboximetil-almidón, polivinilpirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Los auxiliares son agentes reguladores de flujo y lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o sales de los mismos, tales como estearato de magnesio o estearato de calcio, y/o polietilenglicol. Los núcleos de grageas pueden proporcionarse con revestimientos adecuados que, si se desea, son resistentes a los jugos gástricos.
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Para este propósito, se pueden usar soluciones concentradas de sacáridos, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, laca, etc.
luciones y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Con el fin de producir revestimientos resistentes a los jugos gástricos, se usan soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a las tabletas o recubrimientos de grageas, por ejemplo, para identificación o para caracterizar combinaciones de dosis de compuestos activos
Otras preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas de ajuste suave selladas hechas de gelatina y un plastificante como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos o nanopartículas que se pueden mezclar opcionalmente con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. El compuesto activo se puede disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, o parafina líquida, opcionalmente con estabilizantes.
Los aceites grasos pueden comprender mono, di o triglicéridos. Los mono-, di- y triglicéridos incluyen aquellos que se derivan de ácidos C6, C8, C10, C12, C+4, C16, C18, C20 y C22. Los ejemplos de diglicéridos incluyen, en particular, dioleína, dipalmitoleína y diglicéridos mixtos de capril-caprina. Los triglicéridos preferidos incluyen aceites vegetales, aceites de pescado, grasas animales, aceites vegetales hidrogenados, aceites vegetales parcialmente hidrogenados, triglicéridos sintéticos, triglicéridos modificados, triglicéridos fraccionados, triglicéridos de cadena media y larga, triglicéridos estructurados y mezclas de los mismos. De ejemplo de triglicéridos incluye: aceite de almendra; aceite de babassu; aceite de borraja; aceite de semilla de grosella negra; aceite de canola; aceite de risino; aceite de coco; aceite de maíz; aceite de algodón; aceite de onagra; aceite de semilla de uva; aceite de cacahuete; aceite de semilla de mostaza; aceite de oliva; aceite de palma; aceite de semilla de palma; aceite de cacahuete; aceite de colza; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de hígado de tiburón; aceite de soja; aceite de girasol; aceite de risino hidrogenado; aceite de coco hidrogenado; aceite de palma hidrogenado; aceite de soja hidrogenado; aceite vegetal hidrogenado; aceite de semilla de algodón hidrogenada y de ricino; aceite de soja parcialmente hidrogenado; aceite parcialmente de soja y de semilla de algodón; tricaproato de glicerilo; tricaprilato de glicerilo; tricaprato de glicerilo; triundecanoato de glicerilo; trilaurato de glicerilo; trioleato de glicerilo; trilinoleato de glicerilo; trilinolenato de glicerilo; tricaprilato de glicerilo/caprato; tricaprilato de glicerilo/caprato/laurato; tricaprilato de glicerilo/caprato/linoleato; y tricaprilato de glicerilo/caprato/estearato.
El triglicérido puede ser el triglicérido de cadena media disponible bajo el nombre comercial LABRAFAC CC. Otros triglicéridos incluyen aceites neutros, por ejemplo, aceites vegetales neutros, en particular aceites de coco fraccionados tales como los conocidos y disponibles comercialmente bajo el nombre comercial MIGLYOL, que incluyen los productos: MIGLYOL 810; MIGLYOL 812; MIGLYOL 818; y CAPTeX 355. Otros triglicéridos son triglicéridos de ácido caprílico- cáprico conocidos y disponibles comercialmente con el nombre comercial MYRITOL, incluido el producto MYRITOL 813. Otros triglicéridos de esta clase son CAPMUL MCT, CAPTEX 200, CAPTEX 300, cApTEX 800, NEOBEE M5 y MAZOL 1400.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden triglicéridos pueden comprender además tensioactivos lipófilos y/o hidrófilos que pueden formar soluciones claras después de la disolución con un disolvente acuoso. Uno de tales tensioactivos es el succinato de tocoferil polietilenglicol 1000 (vitamina E TPGS). Los ejemplos de tales composiciones se describen en la patente de EE.UU. 6,267,985.
El vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender LABRASOL (Gattefosse SA), que es glicéridos cáprílico/cáprico PEG-8. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender PL90G, vitamina E TPGS y Miglyol 812N. Los componentes de tal formulación se muestran en la Tabla 1.
TABLA1
Ingrediente
Concentración mg/ml
placebo 30 mg/ml
(R) -N- (1 -terc-butil-butil) -N'- (2-etil-3-metoxibenzoil) -hidrazida de ácido 3,5-dimetil-benzoico
0 mg 30 mg
PL90G [Phospholipon 90G]
100 mg 100 mg
Vitamina E TPGS
100 mg 100 mg
BHT [hidroxitolueno butilado]
0.1 mg 0.1 mg
Miglyol 812N [triglicéridos de cadena media]
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Las posibles preparaciones farmacéuticas que pueden usarse rectalmente incluyen, por ejemplo, supositorios, que consisten en una combinación de uno o más de los ligandos con una base de supositorio. Las bases de supositorios adecuadas son, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos parafínicos. Además, también es posible usar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación del ligando con una base. Los materiales base posibles incluyen, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles o hidrocarburos parafínicos.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas del ligando en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua y soluciones alcalinas. Además, suspensiones del ligando como suspensiones de inyección aceitosa apropiada pueden administrarse. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos o polietilenglicol-400. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes.
Las composiciones tópicas se pueden formular como aceites, cremas, lociones, ungüentos y similares por elección de vehículos apropiados. Los vehículos adecuados incluyen aceites vegetales o minerales, vaselina blanca (parafina blanda blanca), grasas o aceites de cadena ramificada, grasas animales y alcohol de alto peso molecular (mayor que C12). También se pueden incluir emulsionantes, estabilizadores, humectantes y antioxidantes, así como agentes que impartan color o fragancia, si se desea. Adicionalmente, se pueden emplear potenciadores de la penetración transdérmica en estas formulaciones tópicas. Se pueden encontrar ejemplos de tales potenciadores en la patente de los EE.UU. Nos. 3,989,816 y 4,444,762.
Las cremas pueden formularse a partir de una mezcla de aceite mineral, cera de abeja autoemulsionante y agua en la que se mezcla el ligando, disuelto en una pequeña cantidad de un aceite como el aceite de almendras. Un ejemplo típico de dicha crema es uno que incluye aproximadamente 40 partes de agua, aproximadamente 20 partes de cera de abejas, aproximadamente 40 partes de aceite mineral y aproximadamente 1 parte de aceite de almendras.
Los ungüentos se pueden formular mezclando una suspensión del ligando en un aceite vegetal tal como aceite de almendras con parafina blanda caliente y permitiendo que la mezcla se enfríe. Un ejemplo típico de tal pomada es uno que incluye aproximadamente 30% de aceite de almendras y aproximadamente 70% de parafina blanda en peso
Las lociones se pueden preparar convenientemente preparando una suspensión del ligando en un alcohol adecuado de alto peso molecular tal como propilenglicol o polietilenglicol.
Los ejemplos de antioxidantes que pueden añadirse a las composiciones farmacéuticas incluyen BHA y BHT.
La composición farmacéutica puede comprender 30 mg de ligando por ml de LABRASOL en una cápsula de gelatina sólida. La cápsula puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg de ligando.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener de 0.01% a 99% en peso del ligando. Las composiciones pueden ser ya sea en formas de dosis únicas o múltiples. La cantidad de ligando en cualquier composición farmacéutica particular dependerá de la dosis efectiva, es decir, la dosis requerida para provocar la expresión o supresión génica deseada. Se pueden administrar de 0.1 a 7.5 mg/kg al sujeto. Se pueden administrar de 0.1 a 3 mg/kg al sujeto. Se pueden administrar de 0.1 a 3 mg/kg.
Las vías adecuadas de administración de las composiciones farmacéuticas incluyen oral, rectal, tópica (que incluye dérmica, bucal y sublingual), vaginal, parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intratecal, intratumoral y epidural) y por sonda nasogástrica. Los expertos en la técnica entenderán que la vía de administración preferida dependerá de la afección a tratar y puede variar con factores tales como la afección del receptor. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar una o más veces al día. La composición farmacéutica puede administrarse diariamente comenzando 24 horas antes de la administración de las células que contienen el complejo receptor de ecdisona y la secuencia de unión al ADN.
Los ligandos de diacilhidrazina de Fórmula I y ligandos de diacilhidrazina quirales de Fórmula II o III descritos en la presente memoria también pueden administrarse junto con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los expertos en la técnica entenderán que los compuestos farmacéuticamente activos que van a usarse en combinación con los ligandos descritos en la presente memoria se seleccionarán con el fin de evitar efectos adversos sobre el receptor o interacciones indeseables entre los compuestos. Los ejemplos de otros compuestos farmacéuticamente activos que se pueden usar en combinación con los ligandos incluyen, por ejemplo, quimioterapéuticos contra el SIDA, agentes, derivados de aminoácidos, analgésicos, anestésicos, productos anorrectales, antiácidos y antiflatulentos, antibióticos, anticoagulantes, antídotos, agentes antifibrinolíticos, antihistamínicos, agentes antiinflamatorios, antineoplásicos, antiparasitarios, antiprotozoarios, antipiréticos, antisépticos, antiespasmódicos y anticolinérgicos, antivirales, supresores del apetito, medicamentos para la artritis, modificadores de la respuesta biológica, reguladores del metabolismo óseo, evacuaciones intestinales, agentes cardiovasculares, estimulantes del sistema nervioso central, potenciadores metabólicos cerebrales, cerumenolíticos, inhibidores de la colinesterasa, preparaciones para el resfriado y la tos, factores estimulantes de colonias, anticonceptivos, agentes citoprotectores, preparaciones dentales, desodorantes, dermatológicos, desintoxicantes, agentes para la diabetes, diagnósticos, medicamentos para la diarrea, agonistas del
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receptor de dopamina, electrolitos, enzimas y digestivos, preparaciones de ergot, agentes de la fertilidad, suplementos de fibra, agentes antifúngicos, inhibidores de la galactorrea, inhibidores de la secreción de ácido gástrico, agentes procinéticos gastrointestinales, inhibidores de la gonadotropina, estimulantes del crecimiento del cabello, hematínicos, agentes hemorreológicos, hemostáticos, antagonistas del receptor H2 de histamina, hormonas, agentes hiperglucemiantes, hipolipidémicos, inmunosupresores, laxantes, leprostáticos, adjuntos de leucoféresis, surfactantes pulmonares, preparaciones para la migraña, mucolíticos, antagonistas del relajante muscular, relajantes musculares, antagonistas de narcóticos, aerosoles nasales, análogos de nucleósido en medicamentos para nauseas, suplementos nutricionales, preparaciones para osteoporosis, oxitócicos, parasimpatolíticos, parasimpaticomiméticos, fármacos para el Parkinsonismo, adyuvantes de penicilina, fosfolípidos, inhibidores de plaquetas, agentes para la porfiria, análogos de prostaglandinas, prostaglandinas, inhibidores de la bomba de protones, medicamentos para el prurito, psicotrópicos, quinolonas, estimulantes respiratorios, estimulantes salivales, sustitutos de la sal, agentes esclerosantes, preparaciones para heridas cutáneas, ayudas para dejar de fumar, sulfonamidas, simpaticolíticos, trombolíticos, agentes del síndrome de Tourette, preparaciones de temblor, preparaciones para tuberculosis, agentes uricosúricos, agentes del tracto urinario, contrayentes del útero, relajantes uterinos, preparaciones vaginales, agentes de vértigo, análogos de vitamina D, vitaminas y medios de contraste de imágenes médicas. En algunos casos, los ligandos pueden ser útiles como un complemento de la terapia farmacológica, por ejemplo, para “apagar” un gen que produce una enzima que metaboliza un fármaco particular.
Para aplicaciones agrícolas, además de las aplicaciones descritas anteriormente, los ligandos de esta invención también pueden usarse para controlar la expresión de proteínas pesticidas tales como la toxina de Bacillus thuringiensis (Bt). Dicha expresión puede ser específica de tejido o planta. Además, particularmente cuando también se necesita el control de plagas de plantas, uno o más plaguicidas se pueden combinar con los ligandos descritos en la presente memoria, proporcionando así ventajas y eficacia adicionales, que incluyen menores aplicaciones totales, que si los pesticidas se aplican por separado. Cuando se emplean mezclas con plaguicidas, las proporciones relativas de cada componente en la composición dependerán de la eficacia relativa y la tasa de aplicación deseada de cada plaguicida con respecto a los cultivos, plagas y/o malezas a tratar. Los expertos en la técnica reconocerán que las mezclas de pesticidas pueden proporcionar ventajas tales como un espectro de actividad más amplio que un pesticida utilizado solo. Los ejemplos de pesticidas que pueden combinarse en composiciones con los ligandos descritos en la presente memoria incluyen fungicidas, herbicidas, insecticidas, acaricidas y microbicidas.
Los ligandos de diacilhidrazina de Fórmula I y ligandos de diacilhidrazina quirales de Fórmula II o III descritos en la presente pueden aplicarse al follaje de la planta como pulverizaciones acuosas por métodos comúnmente empleados, tales como aerosoles hidráulicos convencionales de alto-litro, aerosoles de bajo-litro, chorro de aire, aerosoles aéreos. La dilución y la velocidad de aplicación dependerán del tipo de equipo empleado, el método y la frecuencia de aplicación deseada, y la tasa de aplicación del ligando. Puede ser deseable incluir adyuvantes adicionales en el tanque de pulverización. Dichos adyuvantes incluyen tensioactivos, dispersantes, esparcidores, adhesivos, agentes antiespumantes, emulsionantes y otros materiales similares descritos en McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, McCutcheon's Emulsifiers and Detergents / Functional Materials y McCutcheon's Functional Materials, todos publicados anualmente por McCutcheon Division of MC Publishing Company. (New Jersey). Estos ligandos también se pueden mezclar con fertilizantes o materiales fertilizantes antes de su aplicación. Estos ligandos y material de fertilización sólido también se pueden mezclar en equipos de mezcla o combinación, o se pueden incorporar con fertilizantes en formulaciones granulares. Se puede usar cualquier proporción relativa de fertilizante que sea adecuada para los cultivos y malezas a tratar. Los ligandos descritos en la presente memoria comprenderán comúnmente de 5% a 50% de la composición fertilizante. Estas composiciones proporcionan materiales fertilizantes que promueven el rápido crecimiento de las plantas deseadas, y al mismo tiempo controlan la expresión génica.
Células huéspedes y organismos no humanos
Como se describió anteriormente, los ligandos de diacilhidrazina de Fórmula I y los ligandos de diacilhidrazina quiral de Fórmula II o III pueden usarse para modular la expresión génica en una célula huésped. La expresión en células huéspedes transgénicas puede ser útil para la expresión de diversos genes de interés. La presente descripción describe ligandos para la modulación de la expresión génica en células huésped procariotas y eucariotas.
La expresión en células huéspedes transgénicas es útil para la expresión de diversos polipéptidos de interés que incluyen, pero no se limitan a, antígenos producidos en plantas como vacunas; enzimas como alfa-amilasa, fitasa, glucanos y xilanasa; genes de resistencia contra insectos, nematodos, hongos, bacterias, virus y tensiones abióticas en plantas; antígenos; nutracéuticos; productos farmacéuticos; vitaminas; genes para modificar el contenido de aminoácidos, resistencia a herbicidas, frío, sequía y tolerancia al calor; productos industriales; aceites, proteínas, carbohidratos; antioxidantes; plantas masculinas estériles; flores; combustibles; otros rasgos de salida; polipéptidos o productos terapéuticos que se pueden usar para tratar una afección, una enfermedad, un trastorno, una disfunción o un defecto genético, como anticuerpos monoclonales, enzimas, proteasas, citoquinas, interferones, insulina, eritopoyetina, factores de coagulación, otros factores o componentes sanguíneos; vectores virales para terapia génica; virus para vacunas; objetivos para el descubrimiento de fármacos, genómica funcional y análisis y aplicaciones de proteómica: intermediarios de la vía para la modulación de vías ya existentes en el huésped; intermediarios de la vía para la síntesis de nuevos productos hasta ahora no posibles usando el servidor; ensayos basados en células; ensayos de genómica funcional; ensayos proteómicos, y similares. Adicionalmente, los productos génicos pueden ser útiles para conferir mayores rendimientos de crecimiento del huésped o para permitir que se utilice un modo de crecimiento alternativo.
Por lo tanto, la presente invención proporciona ligandos de diacilhidrazina quirales como se define en las reivindicaciones para modular la expresión de un gen endógeno o heterólogo en una célula huésped aislada. La célula huésped aislada puede ser una célula huésped procariota o una célula huésped eucariota. La célula huésped aislada puede ser una célula huésped de invertebrado o una célula huésped de vertebrado. Preferiblemente, la célula huésped se selecciona del grupo 5 que consiste en una célula bacteriana, una célula fungosa, una célula de levadura, una célula de nemátodo, una célula de insecto, una célula de pez, una célula de planta, una célula aviar, una célula animal y una célula de mamífero. Más preferiblemente, la célula huésped es una célula de levadura, una célula de nemátodo, una célula de insecto, una célula de planta, una célula de pez cebra, una célula de pollo, una célula de hámster, una célula de ratón, una célula de rata, una célula de conejo, una célula de gato, una célula de perro, una célula bovina, una célula de cabra, una célula de vaca, 10 una célula de cerdo, una célula de caballo, una célula de oveja, una célula de simio, una célula de mono, una célula de chimpancé o una célula humana. Los ejemplos de células huéspedes incluyen, pero no se limitan a, especies de hongos o levaduras tales como Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula o bacterias. Especies tales como las de los géneros Synechocystis, Synechococcus, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas, Methylomonas, Methylobacter, Alcaligenes, Anabaena, Thiobacillus, 15 Methanobacterium y Klebsiella; especies de plantas seleccionadas del grupo que consiste en manzana, Arabidopsis, bajra, banano, cebada, frijoles, remolacha, mungo negro, garbanzo, chile, pepino, berenjena, haba, maíz, melón, mijo, frijol mungo, avena, okra, Panicum, papaya, maní, guisante, pimiento, gandul, piña, Phaseolus, patata, calabaza, arroz, sorgo, soja, calabaza, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, batata, té, tomate, tabaco, sandía y trigo; animal; y células huéspedes de mamíferos.
20 La célula huésped puede ser una célula de levadura seleccionada del grupo que consiste en Saccharomyces, Pichia y una célula huésped de Candida.
La célula huésped puede ser una célula de nemátodo de Caenorhabditis elegans.
La célula huésped puede ser una célula de insecto.
La célula huésped puede ser una célula vegetal seleccionada del grupo que consiste de una célula de manzana, 25 Arabidopsis, bajra, banano, cebada, frijoles, remolacha, grosella negra, garbanzo, chile, pepino, berenjena, haba, maíz, melón, mijo, frijol mungo, avena, quimbombó, Panicum, papaya, maní, guisante, pimiento, dal, piña, Phaseolus, papa, calabaza, arroz, sorgo, soja, calabaza, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, boniato, té, tomate, tabaco, sandía, y trigo.
La célula huésped puede ser una célula de pez cebra.
30 La célula huésped puede ser una célula de pollo.
La célula huésped puede ser una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en una célula de hámster, una célula de ratón, una célula de rata, una célula de conejo, una célula de gato, una célula de perro, una célula bovina, una célula de cabra, una célula de vaca, una célula de cerdo, una célula de caballo, una célula de oveja, una célula de mono, una célula de chimpancé y una célula humana.
35 La transformación de la célula huésped bien conocida en la técnica y se puede lograr mediante una variedad de métodos que incluyen pero no se limitan a electroporación, infección viral, transfección de plásmido/vector, transfección mediada por vector no viral, transformación mediada por Agrobacterium, bombardeo de partículas, y similares. La expresión de los productos génicos deseados implica cultivar las células huésped transformadas en condiciones adecuadas e inducir la expresión del gen transformado. Las condiciones de cultivo y los protocolos de expresión génica en células procariotas y 40 eucariotas son bien conocidos en la técnica. Las células se pueden cosechar y los productos génicos se pueden aislar de acuerdo con protocolos específicos para el producto génico.
Además, se puede elegir una célula huésped que modula la expresión del polinucleótido insertado, o modifica y procesa el producto polipeptídico de la manera específica deseada. Diferentes células anfitrionas tienen características y mecanismos específicos para el procesamiento y la modificación traduccional y postraduccional (por ejemplo, 45 glicosilación, escisión (por ejemplo, de secuencia de señal)) de proteínas. Se pueden elegir líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento deseados de la proteína extraña expresada. Por ejemplo, la expresión en un sistema bacteriano se puede usar para producir un producto proteico central no glicosilado. Sin embargo, un polipéptido expresado en bacterias puede no plegarse adecuadamente. La expresión en levadura puede producir un producto glicosilado. La expresión en células eucarióticas puede aumentar la probabilidad de Glicosilación 50 “nativa” y plegamiento de una proteína heteróloga. Además, la expresión en células de mamífero puede proporcionar una herramienta para reconstituir, o constituir, la actividad del polipéptido. Además, diferentes sistemas de expresión vector/huésped pueden afectar a las reacciones de procesamiento, tales como escisión proteolítica, en diferente medida. Los ligandos de diacilhidrazina quirales de la presente invención pueden usarse en un organismo no humano que comprende una célula huésped aislada. Entonces el organismo no humano puede ser un organismo procariota o un 55 organismo eucariota. Entonces el organismo humano puede ser un organismo invertebrado o un organismo vertebrado.
Preferiblemente, el organismo no humano se selecciona del grupo que consiste en una bacteria, un hongo, una levadura, un nemátodo, un insecto, un pez, una planta, un ave, un animal y un mamífero. Más preferiblemente, el organismo no humano es una levadura, un nemátodo, un insecto, una planta, un pez cebra, un pollo, un hámster, un ratón, una rata, un
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Entonces el organismo humano puede ser una levadura seleccionada del grupo que consiste en Saccharomyces, Pichia y Candida.
Entonces el organismo no humano puede ser un nematodo de Caenorhabditis elegans.
Entonces el organismo no humano puede ser una planta seleccionada del grupo que consiste en manzana, Arabidopsis, bajra, banano, cebada, frijoles, remolacha, blackgum, garbanzo, chile, pepino, berenjena, haba, maíz, melón, mijo, frijol mungo, avena, okra, Panicum, papaya, maní, guisante, pimiento, dal, piña, Phaseolus, papa, calabaza, arroz, sorgo, soja, calabaza, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, camote, té, tomate, tabaco, sandía, y trigo
Entonces el organismo no humano puede ser un ratón Mus musculus.
Sistemas de modulación de expresión génica
La presente divulgación describe ligandos de diacilhidrazina de Fórmula I y ligandos de diacilhidrazina quirales de Fórmula II o III que son útiles en un sistema de expresión génica inducible basado en el receptor de ecdisona. Estos ligandos de diacilhidrazina proporcionan un sistema de expresión génica inducible mejorado tanto en células huéspedes procariotas como eucariotas. Por lo tanto, la presente invención se refiere a ligandos de diacilhidrazina quirales como se define en las reivindicaciones que son útiles para modular la expresión de genes. En particular, la presente divulgación describe ligandos de diacilhidrazina quirales que tienen la capacidad de transactivar un sistema de modulación de expresión génica que comprende al menos un casete de expresión génica que es capaz de expresarse en una célula huésped que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un dominio de unión ligando receptor nuclear del Grupo H. El dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H puede ser de un receptor de ecdisona, un receptor ubicuo, un receptor huérfano 1, un NER-1, un receptor nuclear de hormona esteroide 1, una proteína-15 que interactúa con el receptor retinoide X, un receptor hepático X p, una proteína similar a un receptor de hormona esteroidea, un receptor hepático X, un receptor hepático X a, un receptor X farnesoide, una proteína 14 que interactúa con el receptor o un receptor farnesol. El dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H puede ser de un receptor de ecdisona.
El sistema de modulación de la expresión génica puede comprender un casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión al ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión debe ser modulada; y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación de sustitución. El sistema de modulación de expresión génica puede comprender además un segundo casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del polipéptido codificado del primer casete de expresión génica; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del polipéptido codificado del primer casete de expresión génica; y iii) un gen cuya expresión debe ser modulada.
El sistema de modulación de expresión génica puede comprender un casete de expresión génica que comprende a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un dominio de transactivación, un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión debe modularse; y un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación de sustitución, y b) un segundo dominio de unión al ligando del receptor nuclear seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión al ligando del receptor X del retinoide vertebrado, un dominio de unión al ligando del receptor X del retinoide invertebrado un dominio de unión a ligando de la proteína ultraespiráculo, y un dominio de unión a ligando quimérico que comprende dos fragmentos de polipéptido, donde el primer fragmento polipeptídico es de un dominio de unión a ligando de receptor X de retinoide de vertebrado, un dominio de unión de ligando de receptor de retinoide X invertebrado o un dominio de unión a ligando de proteína ultraespiráculo, y el segundo fragmento polipeptídico es de un dominio de unión a ligando de receptor X de retinoide de vertebrado diferente, un dominio de unión de ligando de receptor de retinoide X de invertebrado o un dominio de unión de ligando de proteína ultraespiráculo. El sistema de modulación de expresión génica puede comprender además un segundo casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del polipéptido codificado del primer casete de expresión génica; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del polipéptido codificado del primer casete de expresión génica; y iii) un gen cuya expresión debe modularse.
El sistema de modulación de expresión génica puede comprender un primer casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un primer polipéptido que comprende un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión debe modularse y un dominio de unión de ligando al receptor nuclear, y un segundo casete de expresión génica que comprende un polinucleótido que codifica un segundo polipéptido que comprende un dominio de transactivación y un dominio de unión a ligando de receptor nuclear, en el que uno de los dominios de unión a ligando de receptor nuclear es un dominio de unión a ligando de receptor nuclear de Grupo H que comprende una mutación de sustitución. El primer polipéptido puede estar sustancialmente libre de un dominio de transactivación y el segundo polipéptido está sustancialmente libre de un dominio de unión a ADN. Para los fines de la invención, “sustancialmente libre” significa que la proteína en cuestión no contiene una secuencia suficiente del dominio
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en cuestión para proporcionar activación o actividad de unión. El sistema de modulación de la expresión génica puede comprender además un tercer casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido del primer casete de expresión génica; ii) un promotor que se activa mediante el dominio de transactivación del segundo polipéptido del segundo casete de expresión génica; y iii) un gen cuya expresión debe ser modulada.
En el que cuando solo un dominio de unión a ligando de receptor nuclear es un dominio de unión de ligando de Grupo H que comprende una mutación de sustitución, el otro dominio de unión de ligando de receptor nuclear puede ser de cualquier otro receptor nuclear que forma un dímero con el dominio de unión al ligando del Grupo H que comprende la mutación de sustitución. Por ejemplo, cuando el dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación de sustitución es un dominio de unión al ligando del receptor de ecdisona que comprende una mutación de sustitución, el otro dominio de unión al ligando del receptor nuclear (“pareja”) puede ser un receptor de ecdisona, un receptor de retinoide X de vertebrado (RXR), un RXR invertebrado, una proteína ultraespiráculo (USP), o un receptor nuclear quimérico que comprende al menos dos fragmentos diferentes del polipéptido del dominio de unión al ligando del receptor nuclear seleccionados del grupo que consiste en un RXR de vertebrado, un RXR de invertebrado y un USP (véanse los documentos WO 01/70816 A2, solicitud de patente internacional No. PCT/US02/05235 y uS 2004/0096942 A1). El dominio de unión del ligando de receptor nuclear “pareja” puede comprender además una mutación de truncamiento, una mutación de deleción, una mutación de sustitución u otra modificación.
El dominio de unión del ligando de RXR de vertebrado puede ser de un Homo sapiens humano, ratón Mus musculus, rata Rattus norvegicus, pollo Gallus gallus, cerdo Sus scrofa domestica, rana Xenopus laevis, pez cebra Danio rerio, tunicado Polyandrocarpa misakiensis, o medusa Tripedalia cysophora RXR.
El dominio de unión del ligando de RXR de invertebrados puede ser de un polipéptido ultraespiráculo de langosta Locusta migratoria (“LmUSP”), un homólogo 1 de la garrapata ixodid Amblyomma americanum RXR (“AmaRXRI”), un homologo 2 de garrapata ixodid Amblyomma americanum RXR (“AmaRXR2”), un homólogo de cangrejo violinista Celuca pugilator RXR (“CpRXR”), un homólogo de escarabajo Tenebrio molitor RXR (“TmRXR”), un homólogo de abeja Apis mellifera RXR (“AmRXR”), un homólogo de áfido Myzus persicae RXR (“MpRXR”), o un homólogo de no dípteros/no lepidópteros RXR.
El dominio de unión al ligando RXR quimérico puede comprender al menos dos fragmentos polipeptídicos seleccionados del grupo que consiste en un fragmento de polipéptido RXR de especie de vertebrado, un fragmento de polipéptido RXR de especie de invertebrado y un fragmento de polipéptido de homólogo RXR de especie de invertebrado no dípteros/no lepidópteros. Un dominio de unión de ligando quimérico RXR para usar en la presente invención puede comprender al menos dos fragmentos de polipéptidos RXR de diferentes especies, o cuando la especie es la misma, los dos o más fragmentos de polipéptido pueden ser de dos o más isoformas diferentes del fragmento de polipéptido RXR de especie.
El dominio de unión del ligando RXR quimérico puede comprender al menos un fragmento de polipéptido RXR de especie de vertebrado y un fragmento de polipéptido RXR de especie de invertebrado.
El dominio de unión del ligando RXR quimérico puede comprender al menos un fragmento de polipéptido RXR de especie de vertebrado y un fragmento de polipéptido homólogo de RXR de especie de invertebrado no díptero/no lepidóptero.
El gen cuya expresión debe modularse es un gen homólogo con respecto a la célula huésped. El gen cuya expresión debe modularse puede ser un gen heterólogo con respecto a la célula huésped.
Los ligandos de diacilhidrazina quirales reivindicados para su uso en la presente invención como se describe a continuación, cuando se combinan con el dominio de unión a ligando del (de los) receptor (es) nuclear (es), que a su vez están unidos al elemento de respuesta unido a un gen, proporcionan los medios para la regulación temporal externa de la expresión del gen. El mecanismo de unión o el orden en el que los diversos componentes de esta invención se unen entre sí, es decir, por ejemplo, dominio de unión de ligando a ligando, dominio de unión a ADN a elemento de respuesta, dominio de transactivación a promotor, etc., no es crítico.
El receptor de ecdisona es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares y se clasifica en la subfamilia 1, grupo H (denominado aquí receptores nucleares del Grupo H). Los miembros de cada grupo comparten 40-60% de identidad de aminoácidos en el dominio E (unión del ligando) (Laudet et al., Cell 97: 161-163 (1999)). Además del receptor de ecdisona, otros miembros de esta subfamilia 1 del receptor nuclear, grupo H incluyen: receptor ubicuo (UR), receptor huérfano 1 (OR-1), receptor 1 nuclear de la hormona esteroidea (NER-1), proteína 15 de interacción del receptor retinoide X (RIP- 15), receptor hepático X p (LXRp), proteína similar al receptor de la hormona esteroide (RLD-1), receptor hepático x (LXR), receptor hepático X a (LXRa), receptor farnesoide X (FXR), proteína 14 que interactúa con el receptor (RIP-14) y receptor de farnesol (HRR-1).
En un ejemplo específico, la unión del ligando al dominio de unión al ligando de un receptor nuclear del Grupo H y su pareja del dominio de unión del ligando receptor nuclear permite la expresión o supresión del gen. Este mecanismo no excluye el potencial de unión del ligando al receptor nuclear del Grupo H (GHNR) o a su compañero, y la formación resultante de complejos de homodímeros activos (por ejemplo, GHNR + GHNR o compañero + compañero). Preferiblemente, uno o más de los dominios del receptor se varía produciendo un Interruptor para gen híbrido. Típicamente, uno o más de los tres dominios, DBD, LBD y dominio de transactivación, se pueden elegir de una fuente diferente a la fuente de los otros dominios para que los genes híbridos y las proteínas híbridas resultantes se optimicen
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en la célula huésped elegida u organismo para la actividad de transactivación, unión complementaria del ligando, y reconocimiento de un elemento de respuesta específico. Además, el propio elemento de respuesta puede modificarse o sustituirse con elementos de respuesta para otros dominios de proteína de unión a ADN tales como la proteína GAL-4 de levadura (véase Sadowski et al., Nature 335: 563-564 (1988)) o proteína LexA de Escherichia coli (véase Brent et al., Cell 43: 729-736 (1985)), o elementos de respuesta sintéticos específicos para interacciones dirigidas con proteínas diseñadas, modificadas y seleccionadas para tales interacciones específicas (véase, por ejemplo, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 20 94: 3616 - 3620 (1997)) para acomodar receptores híbridos. Otra ventaja de los sistemas de dos híbridos es que permiten la elección de un promotor utilizado para dirigir la expresión génica de acuerdo con un resultado final deseado. Tal doble control puede ser particularmente importante en áreas de terapia génica, especialmente cuando se producen proteínas citotóxicas, ya que tanto el tiempo de expresión como las células en las que se produce la expresión pueden controlarse. Cuando los genes, unidos operativamente a un promotor adecuado, se introducen en las células del sujeto, la expresión de los genes exógenos se controla mediante la presencia del sistema de esta invención. Los promotores pueden estar regulados de forma constitutiva o inducible o pueden ser específicos del tejido (es decir, expresarse solo en un tipo particular de células) o específicos de ciertas etapas del desarrollo del organismo.
En particular, los descritos en este documento son ligandos de diacilhidrazina de Fórmula I y ligandos de diacilhidracina quirales de Fórmula II o III útiles en un sistema de modulación de la expresión génica que comprende un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H que comprende una mutación de sustitución. Este sistema de expresión génica puede ser un sistema de expresión génica basada en “un solo interruptor” en el que el dominio de transactivación, el dominio de unión a ADN y el dominio de unión a ligando están en un polipéptido codificado. Alternativamente, el sistema de modulación de expresión génica puede ser un sistema de modulación de expresión génica basado en “interruptor doble” o “bihíbrido” en el que el dominio de transactivación y el dominio de unión a ADN están ubicados en dos polipéptidos codificados diferentes
Un sistema de modulación de la expresión génica basada en el receptor de ecdisona para su uso en la presente invención puede ser cualquiera heterodimérico u homodimérico. Un complejo de EcR funcional generalmente se refiere a un complejo de proteína heterodimérica que consta de dos miembros de la familia de receptores de esteroides, una proteína de receptor de ecdisona obtenida de diversos insectos y una proteína ultraespiráculo (USP) o el homólogo de vertebrados de USP, proteína de receptor retinoide X (véase Yao et al., Nature 366: 476 - 479 (1993) y Yao et al., Cell 71: 63 - 72 (1992)). Sin embargo, el complejo también puede ser un homodímero como se detalla a continuación. El complejo receptor de ecdiesteroide funcional también puede incluir proteínas adicionales tales como inmunofilinas. Los miembros adicionales de la familia de proteínas del receptor de esteroides, conocidos como factores transcripcionales (tales como DHR38 o betaFTZ-1), también pueden ser dependientes del ligando o parejas independientes para EcR, USP y/o RXR. Además, se pueden requerir otros cofactores, como las proteínas generalmente conocidas como coactivadores (también denominados adaptadores o mediadores). Estas proteínas no se unen de forma específica al ADN y no están involucradas en la transcripción basal. Pueden ejercer su efecto sobre la activación de la transcripción a través de diversos mecanismos, incluida la estimulación de la unión a ADN de los activadores, al afectar la estructura de la cromatina, o mediando interacciones del complejo activador-iniciación. Los ejemplos de tales coactivadores incluyen RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/nCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP, así como la proteína de unión del elemento de respuesta C del coactivador promiscuo B, CBP/p300 (para revisión, véase Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9: 222 - 232 (1997)). Además, los cofactores proteicos generalmente conocidos como correpresores (también conocidos como represores, silenciadores o mediadores silenciadores) pueden ser necesarios para inhibir eficazmente la activación transcripcional en ausencia de ligando. Estos correpresores pueden interactuar con el receptor de ecdisona no ligados para silenciar la actividad en el elemento de respuesta. La evidencia actual sugiere que la unión del ligando cambia la conformación del receptor, lo que da como resultado la liberación del correpresor y el reclutamiento de los coactivadores descritos anteriormente, aboliendo así su actividad de silenciamiento. Los ejemplos de correpresores incluyen N-CoR y SMRT (para revisión, véase Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10: 1167-1177 (1996)). Estos cofactores pueden ser endógenos dentro de la célula u organismo, o pueden agregarse exógenamente como transgenes para expresarse de forma regulada o no regulada. Los complejos homodímeros de la proteína receptora de ecdisona, USP o RXR también pueden ser funcionales en algunas circunstancias.
El complejo receptor de ecdisona incluye típicamente proteínas que son miembros de la superfamilia de receptores nucleares en donde todos los miembros se caracterizan generalmente por la presencia de un dominio de transactivación amino-terminal, un dominio de unión a ADN (“DBD”) y un dominio de unión a ligando (“LBD”) separado del DBD por una región de bisagra. Como se usa aquí, el término “dominio de unión al ADN” comprende una secuencia polipeptídica mínima de una proteína de unión al ADN, hasta la longitud completa de una proteína de unión al ADN, siempre que el dominio de unión al ADN funcione para asociarse con un elemento de respuesta particular. Los miembros de la superfamilia de receptores nucleares también se caracterizan por la presencia de cuatro o cinco dominios: A/B, C, D, E, y en algunos miembros F (véanse los documentos US 4,981,784 y Evans, Science 240: 889-895 (1988)). . El dominio “A/B” corresponde al dominio de transactivación, “C” corresponde al dominio de unión al ADN, “D” corresponde a la región de bisagra, y “E” corresponde al dominio de unión del ligando. Algunos miembros de la familia también pueden tener otro dominio de transactivación en el lado carboxi-terminal del LBD correspondiente a “F”.
El DBD se caracteriza por la presencia de dos dedos de cinc de cisteína entre los que se encuentran aminoácidos de dos motivos, el P-box y el D-box, que confieren especificidad a los elementos de respuesta de ecdisona. Estos dominios pueden ser nativos, modificados o quimeras de diferentes dominios de proteínas receptoras heterólogas. El receptor EcR, como un subconjunto de la familia de receptores de esteroides, también posee regiones menos bien definidas
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responsables de las propiedades de heterodimerización. Debido a que los dominios de los receptores nucleares son de naturaleza modular, los dominios LBD, DBD y de transactivación pueden intercambiarse.
Se conocen sistemas de interruptor de gen que incorporan componentes del complejo receptor de ecdisona. Sin embargo, en estos sistemas conocidos, siempre que se usa EcR, se asocia con dominios de unión de ADN nativos o modificados y dominios de transactivación en la misma molécula. USP o RXR se usan generalmente como socios silenciosos. Se ha demostrado previamente que cuando los dominios de unión de ADN y los dominios de transactivación están en la misma molécula, la actividad de fondo en ausencia de ligando es alta y dicha actividad se reduce drásticamente cuando los dominios de unión al ADN y dominios de transactivación están en moléculas diferentes, es decir, en cada una de las dos parejas de un complejo heterodímero u homodímero (véase PCT/US01/09050).
Método de modulación de la expresión genética
Los ligandos de la presente invención se pueden usar en métodos de modulación de la expresión génica en una célula huésped usando un sistema de modulación de expresión génica. Específicamente, los ligandos de la presente invención se pueden usar en un método in vitro para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de la expresión génica; y b) introducir en la célula huésped un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención; en el que el gen que se va a modular es un componente de un casete de expresión génica que comprende: i) un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por el dominio de unión a ADN del sistema de expresión génica; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del sistema de expresión génica; y iii) un gen cuya expresión se va a modular, por lo que tras la introducción del ligando de diacilhidrazina quiral de la invención en la célula huésped, la expresión del gen se modula.
Los ligandos de la presente invención pueden usarse en un método in vitro para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de expresión génica; b) introducir en la célula huésped un casete de expresión génica, en el que el casete de expresión génica comprende i) un elemento de respuesta que comprende un dominio reconocido por el dominio de unión al ADN del sistema de expresión génica; ii) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del sistema de expresión génica; y iii) un gen cuya expresión debe ser modulada; y c) introducir en la célula huésped un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención; por lo que tras la introducción del ligando de diacilhidrazina quiral en la célula huésped, se modula la expresión del gen.
Los ligandos de la presente invención pueden usarse en un método in vitro para modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende un casete de expresión génica que comprende un elemento de respuesta que comprende un dominio al que pertenece el dominio de unión al ADN del primer polipéptido híbrido del sistema de modulación de expresión génica se une; un promotor que se activa mediante el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido del sistema de modulación de expresión génica; y un gen cuya expresión debe ser modulada; donde el método comprende las etapas de: a) introducir en la célula huésped un sistema de modulación de expresión génica; y b) introducir en la célula huésped un ligando de diacilhidrazina quiral de la invención; por lo que tras la introducción del ligando en el huésped, la expresión del gen se modula.
Los genes de interés para la expresión en una célula huésped usando métodos divulgados en este documento pueden ser genes endógenos o genes heterólogos. La información de la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos para un gen o proteína deseado puede localizarse en una de las muchas bases de datos de acceso público, por ejemplo, GENBANK, EMBL, Swiss-Prot y PIR, o en muchas publicaciones de revistas relacionadas con la biología. Por lo tanto, los expertos en la técnica tienen acceso a la información de la secuencia de ácido nucleico para prácticamente todos los genes conocidos. Dicha información se puede usar luego para construir los constructos deseados para la inserción del gen de interés dentro de los casetes de expresión génica usados en los métodos descritos en este documento.
Medición de la expresión/transcripción genética
Una medición útil de los métodos de la invención es la del estado transcripcional de la célula que incluye las identidades y las abundancias de ARN, preferiblemente especies de ARNm. Dichas mediciones se llevan a cabo convenientemente midiendo las abundancias de ADNc mediante cualquiera de varias tecnologías de expresión génica existentes.
La tecnología de matriz de ácido nucleico es una técnica útil para determinar la expresión diferencial de ARNm. Dicha tecnología incluye, por ejemplo, chips de oligonucleótidos y micromatrices de ADN. Estas técnicas se basan en fragmentos de ADN u oligonucleótidos que corresponden a diferentes genes o ADNc que se inmovilizan en un soporte sólido y se hibridan con sondas preparadas a partir de conjuntos de ARNm totales extraídos de células, tejidos u organismos completos y convertidos en ADNc. Los chips de oligonucleótidos son matrices de oligonucleótidos sintetizados en un sustrato usando técnicas fotolitográficas. Se han producido chips que se pueden utilizar para el análisis de hasta 1700 genes. Las micromatrices de ADN son matrices de muestras de ADN, típicamente productos de PCR, que se imprimen robóticamente en un portaobjetos de microscopio. Cada gen se analiza mediante una secuencia de ADN diana de longitud completa o parcial. Micromatrices con hasta 10,000 genes ahora se preparan rutinariamente comercialmente. La principal diferencia entre estas dos técnicas es que los chips oligonucleotídicos típicamente utilizan oligonucleótidos 25-mer que permiten el fraccionamiento de moléculas cortas de ADN mientras que los objetivos de ADN más grandes de
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micromatrices, aproximadamente 1,000 pares de bases, pueden proporcionar más sensibilidad en el fraccionamiento de mezclas complejas de ADN.
Otra medida útil de los métodos de la invención es la determinación del estado de traducción de la célula midiendo las abundancias de las especies de proteínas constituyentes presentes en la célula usando procesos bien conocidos en la técnica.
Cuando se desea la identificación de genes asociados con diversas funciones fisiológicas, puede emplearse un ensayo en el que cambian funciones tales como crecimiento celular, apoptosis, senescencia, diferenciación, adhesión, unión a moléculas específicas, unión a otra célula, organización celular, organogénesis, transporte intracelular, facilitación del transporte, conversión de energía, metabolismo, miogénesis, neurogénesis y/o hematopoyesis
Además, la expresión del gen indicador o marcador seleccionable puede usarse para medir la modulación de la expresión génica usando la presente invención.
Otros métodos para detectar los productos de la expresión génica son bien conocidos en la técnica e incluyen transferencias de Southern (detección de ADN), transferencias de punto o de ranura (ADN, ARN), transferencias de tipo Northern (ARN), RT-PCR (ARN), Western blots (detección de polipéptidos) y análisis ELISA (polipéptidos). Aunque son menos preferidas, las proteínas marcadas pueden usarse para detectar una secuencia particular de ácidos nucleicos a la que se hibrida.
En algunos casos, es necesario amplificar la cantidad de una secuencia de ácido nucleico. Esto se puede llevar a cabo usando uno o más de una serie de métodos adecuados que incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”), reacción en cadena de la ligasa (“LCR”), amplificación de desplazamiento de cadena (“SDA”), amplificación basada en la transcripción, y similares. La PCR se lleva a cabo de acuerdo con técnicas conocidas en las que, por ejemplo, se trata una muestra de ácido nucleico en presencia de un ADN polimerasa termoestable, bajo condiciones de hibridación, con un par de cebadores oligonucleotídicos, con un cebador que se hibrida con una cadena (molde) de la secuencia específica a detectar. Los cebadores son suficientemente complementarios para cada hebra molde de la secuencia específica para hibridar con los mismos. Se sintetiza un producto de extensión de cada cebador y es complementario a la cadena molde de ácido nucleico a la que se hibrida. El producto de extensión sintetizado a partir de cada cebador también puede servir como un molde para la síntesis adicional de productos de extensión usando los mismos cebadores. Siguiendo un número suficiente de rondas de síntesis de productos de extensión, la muestra puede analizarse como se describió anteriormente para evaluar si están presentes la secuencia o secuencias a detectar.
Métodos generales
Las técnicas estándar de ADN recombinante y clonación molecular usadas en la presente son bien conocidas en la técnica y están descritas por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, nY (1989) (Maniatis) y por TJ Silhavy, ML Bennan, y LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience (1987).
Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son bien conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para su uso en los siguientes ejemplos se pueden encontrar como se establece en el Manual de Métodos para Bacteriología General (Phillipp Gerhardt, rGe Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg y G. Briggs Phillips, eds), Sociedad Americana de Microbiología, Washington, DC. (1994)) o por Thomas D. Brock en Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989).
Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales utilizados para el crecimiento y mantenimiento de las células huésped se obtuvieron de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO / BRL (Gaithersburg, MD) o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que se especifique lo contrario.
Las manipulaciones de secuencias genéticas pueden realizarse usando el conjunto de programas disponibles de Genetics Computer Group Inc. (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI). Cuando se utiliza el programa GCG “Pileup”, se puede usar el valor predeterminado de creación de hueco de 12 y el valor predeterminado de 4 de la brecha de separación. Cuando se usa el programa “Gap” o “Bestfit” de CGC, se utiliza la penalización de creación de espacio por omisión de 50 y la penalización de extensión de espacio por omisión de 3. En cualquier caso, en que no se soliciten los parámetros del programa GCG, en estos o en cualquier otro programa GCG, se pueden usar los valores predeterminados.
Los puntos de fusión se midieron en tubos capilares de vidrio con un aparato Electrothermal® y no están corregidos. Las rotaciones ópticas ([a] 25589) se midieron a temperatura ambiente en una celda de cuarzo de 10 cm de longitud utilizando un Polarímetro Perkin Elmer Modelo 341. Las concentraciones se dan en g/100 mL. Los espectros de 1H RMN se registraron a 300 MHz o 400.13 MHz usando un Bruker RMN. A menos que se indique lo contrario, la referencia interna fue solvente. Los espectros de 13C RMN se registraron a 100.6 MHz con un Bruker RMN. A menos que se indique lo contrario, la referencia interna fue solvente. El análisis de LC-MS se realizó usando un apilamiento Agilent 1100 LC acoplado con un espectrómetro de masas de un solo cuádruple Agilent. Los solventes fueron (A) H2O/0.1% de ácido
fórmico y (B) ACN/0.1% de ácido fórmico en un gradiente de T = 0 15% B a T = 10 98% B y un tiempo de parada de 20 min en una Columna C18 de 75 mm x 2.1 mm con un caudal = 0.2 ml/min. El análisis de masa exacto se realizó por infusión directa en un espectrómetro de masas Agilent ESI/TOF. Las determinaciones de la estructura cristalina de rayos X se realizaron usando un Bruker SMART6000. Los análisis elementales se realizaron en un analizador Perkin Elmer 5 2400 CHN. La cromatografía en capa fina analítica o TLC se realizó usando placas Macherey-Nagel Polygram® Sil
G/UV254 de 0.2 mm. La mayoría de las placas se visualizaron con luz UV. Algunos fueron desarrollados usando yodo o ácido fosfomolíbdico. La cromatografía en gel de sílice se realizó usando gel de sílice Aldrich (malla 230-400, 60 Á) en columnas de vidrio bajo una cabeza de presión de N2 o argón de aprox. 30 psi. La HPLC analítica se realizó utilizando un sistema Gilson HPLC equipado con un mezclador dinámico 811C, detector 306 UV/VIS 155 y controlador líquido215. La 10 absorbancia UV se midió a 220 nm y 254 nm y las integraciones se realizaron a 254 nm. Los caudales se mantuvieron típicamente a 1 ml/min. La cromatografía en fase normal se realizó con una columna DuPont Zorbax ODS de 4.6 mm x 25 cm. La cromatografía de fase inversa se realizó usando una columna C18 Alltech Adsorbosphere 5 micras, 4.6 mm x 25 cm. El HPLC quiral se realizó usando una columna OD-H de 4.6 mm x 25 cm CHIRALCEL® de 5 micras, una columna AD-H de 4.6 mm x 25 cm CHIRAKPAK® 5 micras, o una columna ULMO Regis Rexchrom (S, S) de 4.6 mm x 25 cm, 5 15 micras, 100 Á. Los solventes fueron de grado reactivo a menos que se indique lo contrario. Se usaron solventes anhidros tal como se compraron.
Métodos sintéticos generales
Los compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II o III en la que A, B y R2 se definen como anteriormente y R1 es alquenilo se puede preparar a través de síntesis asimétrica como se describe en el Esquema General 1.
20 Esquema General 1
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La reacción de la hidrazina protegida 1 (por ejemplo; carbazato de bencilo o carbazato de t-butilo) con aldehído R2CHO proporciona 2. La alilación asimétrica de 2 proporciona 3 o 4 en forma enantioméricamente enriquecida, dependiendo entre otros de la elección del reactivo quiral y R2. Los métodos para realizar reacciones de alilación asimétricas son 25 conocidos en la técnica y se pueden utilizar para preparar compuestos de la divulgación. La síntesis de reactivos quirales particularmente útiles en reacciones de alilación asimétrica se describe en Leighton et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 9596 (2003) y WO 03/074534. La reacción de 3 con cloruro de ácido carboxílico B-COCl da 5. El ácido carboxílico B-CO2H también se puede acoplar con 3 para proporcionar 5. La eliminación del grupo protector de 5 da 6. Un experto en la técnica reconoce que existe una variedad de métodos para desproteger una hidrazina, dependiendo de la naturaleza del grupo 30 de protección. Las estrategias de protección/desprotección adecuadas se discuten en “Protective Groups in Organic Synthesis”, T. W. Green and P. G. M. Wuts (1999). La reacción de 7 con cloruro de ácido carboxílico ACOCl o ácido carboxílico A-CO2H da 8, un compuesto de Fórmula II. De forma similar, la reacción de 4 conduce a un compuesto de Fórmula III.
Los compuestos enriquecidos enantioméricamente de la Fórmula II o III en los que A, B, R1 y R2 se definen como anteriormente también se pueden preparar a través de reducción asimétrica como se describe en el Esquema General 2.
Esquema General 2
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5 La reacción de acil hidrazina 1 con cetona R1COR2 proporciona hidrazona 2. La reducción asimétrica de 2 proporciona 3 o 4 en forma enantioméricamente enriquecida, dependiendo entre otras en la elección del agente de reducción, R1 y R2. El documento US 5,250,731 describe la hidrogenación catalítica asimétrica de acil hidrazonas para dar acil hidrazinas ópticamente activas en presencia de un complejo de catalizador de fosfolano quiral. Un experto en la técnica reconocerá que también se pueden utilizar otros ligandos quirales. Más aún, un experto en la técnica reconocerá que se pueden 10 emplear métodos de reducción asimétrica adicionales. En este ejemplo, la reacción de 3 con BCOCl da 5, un compuesto de Fórmula II. De forma similar, la reacción de 4 conduce a un compuesto de Fórmula III.
Adicionalmente, los compuestos enantioméricamente enriquecidos de Fórmula II o III se pueden preparar por resolución quiral, o una combinación de síntesis asimétrica y resolución quiral o una combinación de hidrogenación asimétrica y resolución quiral. Como se describe en el Esquema General 3, someter las diacilhidrazinas racémicas a cromatografía de 15 HPLC quiral proporciona compuestos enantioméricamente enriquecidos de Fórmula II o III. Las columnas quirales adecuadas para uso en resoluciones quirales incluyen, por ejemplo, columnas quirales Daicel CHIRALCEL® OD-H, Daicel CHIRAKPAK® AD-H y Regis Technologies ULMo. Otros métodos de resolución quiral también son posibles. Las diacilhidrazinas racémicas para uso en procesos de resolución quirales se pueden preparar utilizando la metodología descrita en los documentos US 2005/0209283 A1 y US 2006/0020146 A1.
20 Esquema General 3
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Los compuestos enantioméricamente enriquecidos de Fórmula II o III en la que R1 es alquenilo se pueden elaborar utilizando adicionalmente transformaciones químicas estándar. Como se describe en el Esquema General 4 para un compuesto enantioméricamente enriquecido de Fórmula III, el alquenilo se puede convertir en un alquilo, un hidroxialquilo, 25 un alquilo opcionalmente sustituido con un cicloalquilo, un alquilo opcionalmente sustituido con un heterociclo, un alquilo sustituido con un alcoxi, un haloalquilo y otros grupos alquilo opcionalmente sustituidos. Un experto en la técnica reconocerá una variedad de transformaciones químicas de una o múltiples etapas que se pueden utilizar para convertir un alqueno en otros grupos de la invención.
Esquema General 4
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La presente invención se puede entender mejor por referencia a los siguientes métodos sintéticos generales 5 proporcionados anteriormente y a los ejemplos proporcionados a continuación.
Ejemplo 1
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N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico Síntesis
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El compuesto 1: carbazato de bencilo está disponible comercialmente.
El compuesto 2: carbazato de bencilo (300 g, 1.81 moles) se disolvió en 1.2 L de alcohol metílico en un matraz de 4 cuellos de 3 L equipado con condensador de reflujo, termómetro, agitación magnética, y un embudo de adición de 500 mL. Se agregó ácido acético glacial (5 mL) a la mezcla que luego se llevó a 45 0C. Se agregó pivaldehído (248.8 g de solución, 2.17 moles, aproximadamente 75% en t-butanol) en forma de porciones durante 30 minutos. La reacción se calentó a reflujo durante 30 minutos, mientras que se monitorizaba por TLC. La mezcla se dejó enfriar a casi temperatura ambiente y se concentró sobre un evaporador rotativo a un volumen total de alrededor de 700 mL. Se agregó aproximadamente 7 g de carbono activado a aproximadamente 30 0C. La mezcla se agitó durante la noche y se filtró a través de una almohadilla de Celita en un embudo de Büchner fritado con vidrio “C” de tamaño de poro. El solvente se eliminó en vacío para dejar un aceite amarillo claro que se vertió en un plato de cristalización y se indujo para critalizar mediante manipulación con espátula. El material se granuló y el solvente residual se dejó evaporar en aire a temperatura ambiente durante varios días, dejando 420.4 g de producto crudo. La recristalización a temperatura ambiente de una mezcla que inicialmente hierve de 300 mL de acetato de etilo y 1 L de hexanos produce 363.2 g de (E)-N’-(2,2-dimetil-propilideno)- hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico como un sólido blancuzco. Un segundo cultivo de 43.1 g y punto de fusión idéntico se obtuvo a partir de una mezcla de alrededor de 150 mL de hexanos y 45 mL de acetato de etilo. Rendimiento total: 96.1%. Rf = 0.32 (2:1 hexanos:acetato de etilo); mp = 74-74.5 0C; 1H RmN (400 MHz, CDCb) 5 8.0 (1H, br s), 7.4-7.3 (5H, m), 7.1 (1H, s), 5.20 (2H, s), 1.1 (9H, s).
El compuesto 3: (S,S)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina se preparó utilizando un procedimiento modificado de Leighton et al., J. Am. Chem. Soc. 125:9596 (2003) y WO 03/074534. El procedimiento completo se realizó bajo un sistema cerrado anhidro con momentos minimizados y breves de exposición a la atmósfera. Un matraz de 4 cuellos de 5 L secado al horno con entrada de gas, agitación superior, y embudo de adición se cargó primero con aliltriclorosilano (419.5 g, 2.39 moles) y luego con 2 L CH2Cl2 anhidro. La solución se enfrió bajo argón a 0 0C en un baño de hielo/sal. Se agregó trietilamina (485 g, 4.79 moles) a través de un embudo de adición, lo que mantiene la temperatura a 0 0C. En este punto la reacción era de un color ámbar transparente. Se agregó en forma de porciones S,S- pseudoefedrina (359 g, 2.17 moles) utilizando un embudo de adición de sólidos durante un periodo de 2 h, lo que mantiene una temperatura interna <15 °C. El embudo de adición se enjuagó con 200 mL de CH2Cl2 en la reacción. A través del tiempo, se forman sólidos semigranulares como pasta (Et3NCl). La lechada viscosa de color marrón claro se agitó durante aproximadamente 2 h sobre hielo, luego el baño de hielo se eliminó, permitiendo de esta manera que la reacción alcanzara temperatura ambiente durante un periodo de varias horas. Aproximadamente 12 h más tarde, se eliminó la mayoría del CH2Cl2 mediante destilación mientras que se mantiene el sistema bajo argón. Se agregó 1 L de hexano anhidro, y se
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destiló de nuevo el solvente. Luego se agregó 1 L de pentano anhidro y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 h bajo argón. El lodo similar a pasta previo que se formó originalmente en el CH2Cl2 se hace más granular, primero luego de adición de hexano, y luego especialmente después de la adición de pentano. La solución era de color ámbar marrón claro. En porciones, y mediante uso de presión de argón gentil, el pentano y el producto soluble se transfieren fuera del matraz de reacción a través de un filtro de lana de vidrio y tubo de PFA en el segundo matraz de 3 cuellos de 1 L, seco equipado con a cabezal de destilación y agitación magnética. En alternación con la transferencia de solución, se destiló pentano de este segundo matraz dejando atrás el producto oleoso concentrado. Este proceso se repitió, lavando el residuo de Et3NCl dos veces cada una con 500 mL de pentano, y transfiriendo los lavados al segundo matraz bajo una atmósfera de argón. El producto se recolectó mediante destilación en fracciones bajo un vacío de alrededor de 10 torr. Aproximadamente 56.3 g (9.7%) se recolectó en un primer licor que posiblemente contiene hasta aproximadamente aliltriclorosilano al 3%. La primera fracción, (S,S)-2-alil-2-cloro- 3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina purificada, se obtuvo en una cantidad de 413.3 g (71%), bp = 140-144 @ aproximadamente 10 torr, como un líquido ligeramente viscoso, de color amarillo claro al momento de la recolección, pero que se volvió naranja durante varios días bajo refrigeración y sellado con septo/ parapelícula hermético. El material se almacenó en refrigeración, no se caracterizó y se utilizó sin purificación adicional en la siguiente reacción de alilación.
El compuesto 4: Un matraz de 4 cuellos de 5 L equipado con termómetro y agitación magnética, se secó en un horno y se mantuvo bajo argón mientras que se agregó 2 L de CH2Cl2 anhidro, seguido por N’-(2,2-dimetil-propilideno)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico (220 g, 939 mmoles). La mezcla se enfrió y se agitó en un baño de hielo/solución salina grande de aproximadamente 10 gal a 2-3 °C. Se agregó (S,S)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina (363 g, 1.355 moles) al matraz durante aproximadamente 30 min utilizando una cánula y asistencia con presión de argón gentil. La solución originalmente de color amarillo pálido se vuelve de color naranja claro transparente, mientras la temperatura permaneció en 2-3 °C. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente por su propia cuenta y se monitorizo al detener una alícuota pequeña en CH3OH y analizar mediante TLC (2:1 hexanos:EtOAc). 36 horas después del inicio, el análisis de TLC indica aproximadamente 90% de terminación. La mezcla se enfrió a 5 0C, se agregaron 48 g adicionales (0.179 mmoles) de oxazasilolidina, y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. Aproximadamente 8 horas más tarde, la reacción se enfrió de nuevo a 5 0C y se neutralizó con una solución preenfriada de 100 g de K2CO3 en 100 mL de agua desionizada durante un periodo de alrededor de 1 h. Durante la neutralización, una exotermia elevó la temperatura tan alto como 17 0C. Se agregaron aproximadamente 100 mL de agua desionizada adicional. La solución se convirtió en una apariencia azul-verde transparente. En ningún momento durante la reacción o neutralización se produjo una aparente evolución del gas. Después de 4 días de agitación a temperatura ambiente, la solución era de color amarillo claro, y después de 5 días, la fase orgánica se había gelificado pero permanecía de color amarillo claro. La mezcla se enfrió a aproximadamente 15 0C (más tarde aparentemente esto no es necesario), se agregaron aproximadamente 1.25 L de hexanos y el gel se colapsó parcialmente y se rompió con agitación superior. El sobrenadante se extrajo por sifón y se filtró a través de lana de vidrio mientras que se agregaba alternativamente aproximadamente porciones de 1 L al gel blanco que queda en el matraz. También se agregaron hexanos adicionales al sobrenadante para precipitar la pseudoefedrina como un sólido blanco y para colapsar cualquier gel restante. Los extractos de hexano se combinaron y el solvente se eliminó a vacío. En general, mediante las extracciones de gel, la precipitación de pseudoefedrina inducida por hexanos y filtraciones a través de lana de vidrio y un embudo Büchner fritado de vidrio, se utilizaron aproximadamente 5-6 L de hexanos para obtener la hidrazida alílica bruta como un aceite amarillo. En lotes, este material crudo se trató con aproximadamente tres volúmenes de hexanos, se dejó reposar a temperatura ambiente, se decantó de la seudoefedrina precipitada y se transfirió a un embudo de separación. La solución del producto se aisló de la pseudoefedrina residual lavando tres veces con aproximadamente 25 mL de HCl 1.4 N cada una (también se eliminó mucho color), seguido de lavados con K2CO3 al 10% y solución salina. La solución de hexanos del producto bruto se secó sobre Na2SO4 anhidro sólido, y el disolvente se eliminó en vacío para dar un aceite viscoso de color amarillo claro. La TLC (hexanos:EtOAc 2:1) mostró el producto deseado Rf = 0.4; dos impurezas a 0.25 y 0.31 (5-10% de cada una, una de ellas probablemente material de partida), y unas pocas impurezas menos prominentes por encima de Rf = 0.4. La pseudoefedrina detectada previamente en el valor de referencia ahora estaba ausente. Se aisló un total de 196.8 g (75.8%) de (R)-N’-(1-tert-butil- but-3-enil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico como un aceite ámbar después de eliminar la traza de solvente en una bomba de vacío. El gel original, ahora algo condensado y granular, se extrajo con aproximadamente 2 L de hexanos en ebullición. Los sólidos se filtraron, se destilaron los hexanos y el aceite se decantó a partir de la pseudoefedrina precipitada, produciendo aproximadamente 18 g. Este material se combinó con residuos de tanda del producto primario anterior (aproximadamente 3-4 g), y se lavó con HCl 1.4 N, K2CO3 acuoso y solución salina como antes. Los hexanos se destilaron para producir 20.6 gramos de producto adicional, como un aceite de color ámbar que mediante TLC parece idéntico a la primera tanda. Una porción de 10.1 g de (R)-N’-( 1-tert-butil-but-3-enil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se sometió a cromatografía de forma cuantitativa sobre gel de sílice para proporcionar 8.88 g (88% de rendimiento para cromatografía) de producto puro como un aceite, blancuzco claro. Rf = 0.43 (2:1 hexanos:acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 7.4 (5H, br s), 6.2 (1H, br s), 6.0 (1H, br s), 5.15 (2H, s), 5.1 (2H, s), 4.1 (1H, br), 2.7 (1H, m), 2.4 (1H, br d), 2.0 (1H, m), 0.95 (9H, s); ee = 98.1%, columna AD-H; [a]25589 -42.5° (c 2.18, CH3OH).
El compuesto 5: (R)-N’-(1 -tert-butil-but-3-enil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico (110 g, 398 mmoles) y 500 mL de cloruro de metileno se agregaron a un matraz de fondo redondo de 2 L con un termómetro y agitador magnético. Posteriormente se agregó una solución de K2CO3 (82.51 g, 597 mmol en 200 mL de agua desionizada), y el matraz se enfrió a aproximadamente 10 0C. Luego se agregó cloruro de 3,5-dimetil benzoilo puro (73.82 g, 437.8 mmol) lentamente durante un periodo de 20 min. Se utilizó 1 L de cloruro de metileno para enjuagar el cloruro de ácido residual en el matraz
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y para diluir la mezcla de reacción. No se dejó que la temperatura excediera 15 0C durante la adición. La reacción se agitó durante la noche, primero en un baño de hielo y luego a temperatura ambiente. El análisis de TLC a aproximadamente 16 horas indicó que la reacción se completó con cloruro de ácido residual; la mezcla se agitó durante un total de alrededor de 40 horas. La mezcla de reacción se vertió en un embudo separador de 2 L. La capa orgánica se recolectó y se combinó con un pequeño retrolavado con CH2Cl2 de la capa acuosa. La fase orgánica se lavó una vez más con K2CO3 al 10%, se lavó con solución salina, y luego se secó sobre MgSO4Na2SO4 sólido. La mezcla se filtró a partir de las sales, y el solvente se eliminó en vacío para obtener un sólido beige claro granular. El producto crudo se suspendió y se agitó en 300 mL de 2:1 hexanos:éter y se filtró sobre un embudo de Büchner para eliminar sustancialmente el cloruro de 3,5-dimetilbenzoilo residual. Los sólidos recolectados se lavaron cuatro veces más con un total combinado de alrededor de 1200 mL 2:1 hexanos:éter, proporcionando de esta manera un sólido granular blanco. El producto se recolectó y se dejó secar al aire para proporcionar 144.55 g de (R)-N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)- hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico, rendimiento = 88.9%. Una muestra de 30 g se disolvió en 205 mL de metanol en ebullición y se dejó cristalizar a temperatura ambiente. El material floculante resultante se lavó en un Büchner con 50 mL de CH3OH para dar 22.2 g, mp = 146 0C, (ee >99.9%). Una muestra analítica de (R)-N’-(1-tert-butil-but-3- enil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se obtuvo al recristalizar dos veces este material a partir de CH3OH en ebullición seguido por destilación de ruta corta de Kugelrohr y reco9lección como un sólido para dar un material blanco puro: mp = 145.5-147 0C. Rf = 0.12 (10:1 hexanos:acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, CDCls): 5 7.5-7.2 (m, 9H, 9 + NH), 7.2-6.8 (m), 6.4 (S), 6.3 (S), 5.95 (br, 5H, bencílico + C=C), 5.4-4.6 (m, 9H, alílico N-CH, 9-CH3), 3.65 (br), 2.5 (m), 2.35 (S), 2.3 (S), 1.2-0.8 (m, 9H, -C(CH3)3); [a]25589 -12.8° (c 2.01, CHCh).
El compuesto 6 (R)-N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico (13.5 g, 33 mmoles) se suspendió en 100 mL de ácido acético glacial a temperatura ambiente. Se agregó paladio sobre carbono al 10% (0.24 g) como una lechada en 4.4 g de ácido acético. La suspensión gris se agitó durante 90 minutos a 10-30 psi sobre un hidrogenador Parr, se monitorizó la reacción mediante TLC. El catalizador se dejó sedimentar, y la solución de reacción se eliminó con una pipeta y se pasó a través de un papel de filtro estriado (Schleicher & Schuell 597 1/2, 125 mm día). El residuo catalizador se lavó con ácido acético y los lavados se pasaron a través de papel de filtro para dar una masa total combinada de 156 g de ácido acético y producto. La mezcla se enfrió sobre hielo y se agregó aproximadamente 600 mL de agua desionizada. Durante un periodo de 30 minutos, producto engrasado y luego se cristalizó. Este se filtró a través de papel, se secó en aire, y se recolectó sobre papel para proporcionar 7.9 g de un sólido amarillo claro. Durante varias horas, 0.52 g del producto adicional se precipitó fuera del filtrado para dar un rendimiento total de 8.42 g (92.2%) de N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; Rf = 0.5 (1:1 hexanos:acetato de etilo); [a]25589 +7.63 (c 1.98, CH3OH), 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 7.05 (1H, s), 7.02 (2H, s), 4.6+3.5 (1H, 2d), 4.1 (2H, s, NH2), 2.38+2.37 (6H, 2s), 1.1-2.1 (4H, m), 1.0+0.9 (9H, 2s), 1.0+0.98 (3H, 2t), 2 confórmeros distintos.
El compuesto 7 (compuesto del título): N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico (35 g, 126.6 mmoles,) se disolvió en 100 mL de cloruro de metileno en un matraz de fondo redondo de 500 mL con agitación magnética. Se agregó K2CO3 acuoso (26.25 g, 189.9 mmoles, solución en 75 mL de agua desionizada) y la mezcla se agitó sobre hielo. Se agregó cloruro de 2- etil-3-metoxibenzoilo sólido (27.67 g, 139.3 mmoles) y se enjuagó en el matraz utilizando 25 mL de CH2Cl2. La mezcla se agitó sobre hielo durante aproximadamente 40 h, dejando que el baño se caliente a temperatura ambiente. Se agregaron cloruro de metileno y agua adicional según sea necesario para ayudar a la manipulación. La capa orgánica se separó y se secó sobre MgSO4. Se agregó aproximadamente 5 g de carbono activado y se eliminaron la sal y el carbono mediante filtración a través de papel. El solvente se evaporó en vacío, primero sobre un evaporador rotativo y luego bajo alto vacío, proporcionando 57.8 g de producto crudo, que contiene trazas de CH2Cl2. El material crudo se trituró primero con 3 x 100 mL de porciones de éter (2% de etanol) y luego con 1 x 100 mL de porción de 1:1 hexanos:éter en un embudo de Büchner de vidrio fritado (tamaño de poro ASTM 40-60 C, Pirex). El producto luego se lavó con 2 x 200 mL de agua desionizada con mezcla completa y se dejó secar al aire. Se recolectó N-(1 -tert-butil- butil)-N’-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico (también mencionada como N’-(1 -tert-butil- butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-2-etil-3-metoxi-benzoico) como un sólido polvoriento blanco brillante (36.51 g, 65.7% de rendimiento, bastante puro y muy alto ee mediante HPLC y HPLC quiral, un punto mediante TLC, 1:1 hexanos:éter). La evaporación de los lavados orgánicos combinados produjo aproximadamente 20 g de material, que se trituró primero con 200 mL de 2:1 hexanos:éter y luego con 2 x 100 mL 2:1 hexanos:éter en un Büchner de vidrio fritado, tamaño de poro ASTM 40-60 C. El material se lavó con 3 x 100 mL de agua desionizada con mezcla completa y se dejó secar al aire. Un segundo cultivo se recolectó como un polvo blanco (12.98 g, 23.4% de rendimiento, bastante puro y alto ee mediante HPLC y HPLC quiral). Un tercer cultivo se obtuvo de una forma similar como un sólido blancuzco (1.52 g, 2.7%, 98% puro, >99% de ee). Se preparó una muestra final disolviéndola en metanol caliente y filtrar a través de un filtro de jeringa de 0.45 micras en un plato de cristalización grande. El material se recolectó, se pulverizó con una espátula y se calentó a 50-58 0C en un horno de vacío prácticamente hasta peso constante. El análisis de HPLC indicó 99.3% de pureza química y >99.9% de ee Rf = 0.28 (1:1 hexanos:acetato de etilo); mp = 162.2-162.8 0C; [a]25589 +12.9 (c 2.04, CH3OH); 1H RMN (400 MHz, CD3D) 5 7.0-7.1 (4H, m), 6.9 (1H, d), 6.1-6.4 (1H, 2d), 4.5-4.7 (1H, 2d), 3.78 (3H, s), 2.3 (6H, s), 2.3 (1H, m), 1.9 (2H, m), 1.55 (3H, m), 1.1-1.15 (9H, 2s), 0.9-1.0 (6H, m).
Los Ejemplos 2 a 29 se prepararon utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1. El porcentaje de exceso enantiomérico (ee) se determinó mediante HPLC quiral.
La Tabla 2 proporciona datos analíticos para los ejemplos 2 a 29.
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N’-benzoil-N-(1- tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-metil- benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
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N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-fluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
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Cl
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N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-cloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico
N’-(2-bromobenzoil)- N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3-cloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
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Cl
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N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(4-etil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(4-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(4-cloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2,6-difluoro-benzoil)-
hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
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N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2,6-dicloro-benzoil)-
hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
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N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3,4-dimetoxi-benzoil)- hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3,5-difluoro-benzoil)-
hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3,5-dimetoxi-4-
metilbenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5- Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(4-metil-benzo[1,3]dioxol-5- carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5- Dimetilbenzoico
Ejemplo 21*
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23*
24*
25*
imagen64
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(5-metil-2,3-dihidro-
benzo[1,4] dioxina-6-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
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>99
imagen66
>99
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>99
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>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(5-etil-2,3-dihidro-
benzo[1,4]dioxina- 6-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(naftaleno-1 -carbonil)- hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(naftaleno-2-carbonil)- hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(tiofeno- 2-carbonil)- hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
26
27
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>99
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>99
28
Cl
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>99
29
imagen72
>99
*Ejemplo Comparativo
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2,5-dimetil-furano-3-
carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5- Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-cloro-piridina-3- carbonil)- hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(6-cloro-piridina-3 - carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5- Dimetilbenzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3-metoxi-2- metilbenzoil)- hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
Tabla 2: Datos analíticos
Ejemplo
1H RMN (solvente) MS MP; 0C
2
(CDCls) 5 7.88-7.0 (m, 8H), 4.75+3.69 (2d, 1H), 2.4+2.28 (2s, 6H), 2.0-1.3 (mm, 4H), 1.15+1.02 (2s, 9H), 0.94 (m, 3H) ppm [M+H]-381.2533, [M+Na]- 403.2351 66-68
3
(CDCls) 5 7.62-6.77 (m, 7H), 4.75+3.72 (2d, 1H), 2.34+2.33 (2s, 6H), 2.02 (s, 3H), 1.85-1.42 (mm, 4H), 1.19+1.14 (2s, 9H), 1.01 (m, 3H) ppm [M+H]-395.2685, [M+Na]- 417.2507 137-138
4
(DMSO-d6) 5 10.07+9.98 (2s, NH), 7.73-6.63 (m, 7H), 4.54+4.39 (2d, 1H), 3.91+3.77 (2s, 3H), 2.36+2.28 (2s, 6H), 1.77-1.25 (mm, 4H), 1.1+0.98 (2s, 9H), 0.87 (m, 3H) ppm [M+H]-411.2637, [M+Na]- 433.2459
5
(DMSO-da) 5 10.48+10.35 (2s, NH), 7.61-6.68 (m, 7H), 4.52+4.37 (2d, 1H), 2.25 (s, 6H), 1.76-1.19 (mm, 4H), 1.02+0.83 (m, 12H) ppm [M+H]-399.2436, [M+Na]- 421.2253 114-116
6
(CDCI3) 5 7.84-6.6 (m, 7H), 4.74+3.72 (2d, 1H), 2.4+2.34 (2s, 6H), 1.97-1.44 (mm, 4H), 1.18+1.13 (2s, 9H), 0.99 (m, 3H) ppm [M+H]-415.2146, [M+Na]- 437.1962 138-140
7
(DMSO-da) 5 10.47+10.37 (2s, NH), 7.62-6.13 (m, 7H), 4.52+4.35 (2d, 1H), 2.28+2.26 (2s, 6H), 1.79-1.38 (mm, 4H), 1.07+0.85 (m, 12H) ppm [M+H]-459.1637, [M+Na]- 481.1453 145-147
8
(CDCla) 5 7.72-7.09 (m, 7H), 4.74+3.68 (2d, 1H), 2.4+2.38 (2s, 6H), 2.29 (s, 3H), 2.0-1.45 (mm, 4H), 1.31+1.15 (2s, 9H), 1.02 (m, 3H) ppm [M+H]-395.2685, [M+Na]- 417.2503 158-159
9
(DMSO-d6) 5 10.3+10.12 (2s, NH), 7.48-6.8 (m, 7H), 4.57+4.41 (2d, 1H), 3.86+3.77 (2s, 3H), 2.35+2.25 (2s, 6H), 1.78-1.29 (mm, 4H), 1.08+1.04 (2s, 9H), 0.98-0.88 (m, 3H) ppm [M+H]-411.2637, [M+Na]- 433.2456 110-111
10
(CDCla) 5 7.83-7.07 (m, 7H), 4.74+3.69 (2d, 1H), 2.4+2.31 (2s, 6H), 2.0-1.45 (mm, 4H), 1.15+1.09 (2s, 9H), 1.02-0.94 (m, 3H) ppm [M+H]-415.2148, [M+Na]- 437.1963 163-164
11
(CDCI3) 5 8.08-7.08 (m, 7H), 4.74+3.68 (2d, 1H), 2.46+2.40 (2s, 6H), 2.34+2.28 (2s, 3H), 1.74-1.31 (mm, 4H), 1.15+1.02 (2s, 9H), 0.95 (m, 3H) ppm [M+H]-395.2687, [M+Na]- 417.2511 60-62
12
(DMSO-d6) 5 10.21+10.04 (NH, 2s) d 7.78-6.93 (m, 7H), 4.54+4.39 (2d, 1H), 2.60 (m, 2H), 2.32+2.21 (2s, 6H), 1.84-1.21 (mm, 4H), 1.15 (t, 3H), 1.05-0.84 (m, 12H) ppm [M+H]-409.2844, [M+Na]- 431.2670 111-112
13
(DMSO-d6) 5 10.16+9.98 (2s, NH), 7.88-6.97 (m, 7H), 4.57+4.41 (2d, 1H), 3.87+3.8 (2s, 3H), 2.35+2.24 (2s, 6H), 2.02-1.21 (mm, 4H), 1.08+1.02 (2s, 9H), 0.93-0.86 (m, 3H) ppm [M+H]-411.2640, [M+Na]- 433.2458 65-67
14
(CDCI3) 5 8.38-7.06 (m, 7H), 4.74+3.7 (2d, 1H), 2.41+2.28 (2s, 6H), 1.65-1.31 (mm, 4H), 1.14+1.02 (2s, 9H), 0.93 (m, 3H) ppm [M+H]-415.2136, [M+Na]- 437.1961 87-89
15
(DMSO-d6) 5 10.62+10.54 (NH, 2s) d 7.45-6.96 (m, 6H), 4.50+4.35 (2d, 1H), 2.29+2.22 (2s, 6H), 1.70-1.15 (mm, 4H), 1.0-0.80 (m, 12H) ppm [M+H]-417.2335, [M+Na]- 439.2160 180-182
16
(DMSO-d6) 5 10.53 (s, 1H), 7.53-7.35 (m, 3H), 7.08 (s, 2H), 7.03 (s, 1H), 4.64 (d, 1H), 2.31+2.28 (2s, 6H), 1.89-1.42 (mm, 4H), 1.06 (s, 9H), 0.93-0.86 (m, 3H) ppm [M+H]-449.1730, [M+Na]- 471.1546 185-187
17
(DMSO-d6) 5 10.08+9.89 (NH, 2s) d 7.75-6.87 (m, 6H), 4.53+4.38 (2d, 1H), 3.88+3.72 (m, 6H), 2.32-2.21 (m, 6H), 1.81-1.21 (mm, 4H), 1.050.82 (m, 12H) ppm [M+H]-441.2732, [M+Na]- 463.2545 121-123
18
(DMSO-d6) 5 10.40+10.21 (NH, 2s) d 7.57-6.97 (m, 6H), 4.53+4.38 (2d, 1H), 2.31+2.22 (2s, 6H), 1.71-1.24 (mm, 4H), 1.03+0.99 (2s, 9H), 0.88-0.76 (m, 3H) ppm [M+H]-417.2337, [M+Na]- 439.2155 192-194
19
(DMSO-d6) 5 10.16+9.98 (2s, 1H), 7.37-6.51 (m, 5H), 4.58+4.41 (2d, 1H), 3.91+3.86 (2s, 3H), 3.78 (s, 3H), 2.36+2.26+2.13+2.10 (4s, 6H), 2.00 (s, 3H), 1.80+1.30 (m, 4H), 1.09+1.06 (2s, 9H), 0.99+0.89 (2t, 3H) ppm [M+H]-455.2913, [M+Na]- 477.2728
20
(CDCI3) 5 7.26-6.43 (m, 5H), 6.06+5.99 (2s, 2H), 4.72+4.60 (2d, 1H), 2.45-2.32 (m, 6H), 1.88 (s, 3H), 1.99-1.44 (m, 4H), 1.17-0.97 (m, 12H) ppm [M+H]-439.2609, [M+Na]- 461.2407
21
(DMSO-d6) 5 10.25+10.10 (s, 1H), 7.13 (s, 2H), 7.05 (s, 1H), 6.70 (d, 1H), 6.45+6.36 (2d, 1H), 4.56+4.36 (2d, 1H), 4.22-3.53 (mm, 4H), 2.28 (s, 6H), 1.80-1.37 (mm, 4H), 1.65+1.58 (2s, 3H), 1.06 (s, 9H), 0.96+0.88 (2t, 3H) ppm 70
22
(CDCl3) 5 7.08-6.22 (m, 5H), 4.74+3.69 (2d, 1H), 4.3-4.13 (m, 4H), 2.39+2.34 (2s, 6H), 2.14-1.95 (m, 2H), 1.44-1.29 (mm, 4H), 1.18+1.12 (2s, 9H), 1.0 (m, 6H) ppm [M+H]-467.2905, [M+Na]- 489.2721 128-129
23
(CDCls) 5 9.2-7.08 (m, 10H), 4.81+3.76 (2d, 1H), 2.42+2.32 (2s, 6H), 2.08-1.45 (mm, 4H), 1.25-1.02 (m, 12H) ppm [M+H]-431.2691, [M+Na]- 453.2512 173-174
24
(CDCls) 5 8.43-6.94 (m, 10H), 4.78+3.73 (2d, 1H), 2.41+2.29 (2s, 6H), 2.03-1.31 (mm, 4H), 1.18-0.94 (m, 12H) ppm [M+H]-431.2752, [M+Na]- 453.2512 91 (vitrea) - 134
25
(DMSO-da) 5 10.25+10.08 (2s, 1H), 7.95-6.91 (m, 6H), 4.58+4.39 (2dd, 1H), 2.31+2.24 (2s, 6H), 1.90-1.25 (m, 4H), 1.08+1.01 (2s, 9H), 0.96-0.84 (m, 3H) ppm [M+H]-387.2104, [M+Na]- 409.1923
26
(DMSO-da) 5 9.78+9.56, 7.14+7.08 (2s, 1H), 7.03+6.98 (2s, 1H), 6.29+2.24 (2s, 1H), 4.53+4.37 (2d, 1H), 2.25 (s, 6H), 2.21+2.17 (2s, 6H), 1.78-1.23 (m, 4H), 1.05+1.00 (2s, 9H), 0.98+0.86 (2t, 3H) ppm [M+H]- 399.2644
27
(DMSO-d6) 5 10.59+10.51 (2s, 1H), 8.48 (dd, 1H), 7.45 (dd, 1H), 7.13 (s, 2H), 7.04 (s, 1H), 6.73 (dd, 1H), 6.62 (dd, 1H), 4.56+4.41 (2d, 1H), 2.30 (s, 6H), 1.79-1.27 (m, 4H), 1.09+1.05 (2s, 9H), 0.97+0.91 (2t, 3H) ppm [M+H]-416.2103, [M+Na]- 438.1922
28
(DMSO-d6) 5 10.54+10.38 (2s, 1H), 8.39-7.00 (m, 6H), 4.58+4.42 (2d, 1H), 2.25 (s, 6H), 1.86-1.30 (m, 4H), 1.08+1.04 (2s, 9H), 1.00+0.89 (2t, 3H) ppm [M+H]-416.2102, [M+Na]- 438.1924
29
(DMSO-d6) 5 10.39+10.22 (2s, NH), 7.16-7.0 (m, 5H), 6.45+6.33 (2d, 1H), 4.57+4.39 (2d, 1H), 3.85+3.78 (2s, 3H), 2.36+2.29 (2s, 6H), 1.801.46 (mm, 4H), 1.09+1.06 (2s, 9H), 0.96-0.89 (m, 3H) ppm [M+H]-425.2804, [M+Na]- 447.2616 141-143
Ejemplo Comparativo 30
imagen73
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(S)-[2-(6-metoxi-naftalen-2-il)-propionil]-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico 5 Síntesis
5
10
15
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25
30
35
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El Compuesto 1: N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico se preparó como se describe en el Ejemplo 1.
Compuesto 2: el compuesto 2 se preparó a partir del ácido carboxílico correspondiente. Se agregó cloruro de tionilo (1.24 g, 10.42 mmoles) a una solución de ácido (S)-(+)-2-(6-metoxi-naftalen-2-il)-propiónico (Naproxeno, 2 g, 8.69 mmoles) en 8.2 mL de cloroformo en un matraz de fondo redondo equipado con agitación magnética. Se agregó una gota de DMF y la mezcla se sometió a reflujo durante 3 horas. El cloroformo y exceso de cloruro de tionilo se destilaron de la mezcla de reacción mientras que se agregó cloruro de metileno. La evaporación de solvente residual produjo cloruro de (S)-2-(6- metoxi-naftalen- 2-il)-propionilo (1.918 g, 88.8 % de rendimiento). Rf = 0.2 (1:1 hexanos:éter de etilo). 1H RMN (400 MHz, CDCta)^ 5 9.98 (br, 1H), 7.78 (t, 2H), 7.36 (d, 1H), 7.18 (d, 1H), 7.14 (m, 2H), 4.25 (q, 1H), 3.93 (s, 3H), 1.68 (d, 3H).
El compuesto 3 (compuesto del título): N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico (e.e estimado en >99% con base en el precursor, 1.1 g, 3.98 mmoles) se disolvió en 10 mL de cloruro de metileno. Se agregó solución de K2CO3 acuosa (0.907 g, 6.57 mmoles en 2.5 mL) a la mezcla de reacción. Se agregó cloruro de (S)-2-(6-metoxi-naftalen- 2-il)-propionilo (1.09 g, 4.38 mmoles) y la reacción se agitó durante 24 horas y se monitorizó mediante TLC. Se agregaron cloruro de metileno y agua adicionales según fue necesario para ayudar a la manipulación. La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4, se filtró, y el solvente se eliminó en vacío para proporcionar el producto crudo: mp = 98 0C (vítrea)- 123 0C. El material crudo se trituró tres veces con 2:1 hexanos:éter para proporcionar 1.554 g, 80.1% de rendimiento de N-(1-tert-butil-butil)-N’-(S)-[2-(6-metoxi-naftalen-2-il)-propionil]-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico, mp = 98 0C (vítrea)- 122 0C. El material triturado se cristalizó a partir de isopropanol a 35 0C para dar el producto cristalino. Los espectros de 1H RMN de todos los tres lotes fueron idénticos. Rf = 0.15 (1:1 hexanos:éter de etilo); mp = 158-160 0C (el calentamiento inicio a 150 0C); mp = 156-164 0C (el calentamiento inicio a 25 0C); [a]25589 +95.8° (c 2.02, CH3OH); 1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 9.96+9.82 (NH, 2s), 7.71+7.58 (2H, 2d), 7.63 (1H, s), 7.49+7.31 (1H, 2d), 7.26 (1H, s), 7.13+ 6.77 (1H, 2d), 7.06 (2H, s), 6.68+6.30 (1H, 2s), 4.31 (m, 1H), 3.88+3.85 (3H, 2s), 3.58 (1H, m), 2.30+1.83 (6H, 2s), 1.64-1.03 (4H, mm), 1.00 (3H, m), 0.87+0.84 (9H, 2s), 0.63 (3H, t); 13C RMN (100 MHz, CDCla) 5 173.9, 172.2, 157.8, 137.3, 133.7, 130.8, 129.1, 128.8, 127.4, 125.9, 125.8, 123.7, 123.3, 119.2, 119.1, 105.5, 62.7, 55.3, 45.1, 35.0, 28.5, 27.6, 26.9, 21.2, 17.5, 14.2; HRMS (ESI) m/z calculado para C31H39N2O3 [M-H]- 487.2966, encontrado 487.2949, calculado para C31H4üClN2O3 [M+Cl]- 523.2733, encontrado 523.2718, Anal. Calculado para C31H40N2O3: C, 76.19; H, 8.25; N, 5.73; O, 9.8; Encontrado: C, 76.01; H, 8.35; N, 5.70.
Con el fin de determinar el curso estereoquímico de la reacción de alilación asimétrica en el Ejemplo 1, se determinó la estructura de cristal de rayos x de N-(1-tert-butil-butil)-N’-(S)-[2-(6-metoxi-naftalen-2-il)-propionil] -hidrazida de ácido (R)- 3,5-dimetil-benzoico. Este experimento establece la configuración absoluta del carbono que lleva el grupo tert-butilo y el grupo n-propilo es R.
Ejemplo Comparativo 31
imagen75
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico Síntesis
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imagen76
Compuesto 1: (E)-N’-(2,2-dimetil-propilideno)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se preparó como se describe en el Ejemplo 1.
Compuesto 2: (R,R)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina se preparó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1 utilizando R,R-pseudoefedrina.
Compuesto 3: (S)-N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se preparó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1. Datos analíticos: Rf = 0.46 (2:1 hexanos:acetato de etilo); mp = 69-71 0C; 1H RMN (400 MHz, CDCh) 5 7.4 (br s, 5H), 6.2 (br s, 1H), 6.0 (br s, 1H), 5.15 (s, 2H), 5.1 (s, 2H), 4.1 (br, 1H), 2.7 (m, 1H), 2.4 (br d, 1H), 2.0 (m, 1H), 0.95 (s, 9H); ee = 98.2%, columna ADH; [a]25589 +39.3° (c=2.03, CHCla).
Compuesto 4: (S)-N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se preparó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1. Datos analíticos: Rf = 0.43 (2:1 hexano:acetato de etilo); mp = 150-151.5 0C; 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 7.45-6.88 (m, 7H), 6.44 + 6.28 (2s, 1H), 5.96 (br, 1H), 5.38-4.68 (m, 5H), 3.69 (br, 1H), 2.68-2.43 (m, 2H), 2.36 + 2.29 (2s, 6H), 1.13 + 1.02 + 0.94 (3s, 9H); [a]25589 +12.5° (c=2.01, CHCla).
Compuesto 5: N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico se preparó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1. Datos analíticos: Rf = 0.5 (1:1 hexanos:acetato de etilo); mp = 112-112.8 0C; 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 7.05 (s, 1H), 7.02 (s, 2H), 4.6+3.5 (2d, 1H), 2.38+2.37 (2s, 6H), 1.2-2.1 (m, 4H), 1.1+1.0 (2s, 9H), 1.05+0.98 (2t, 3H) 2 confórmeros distintos; [a]25589 -7.97 (c 2.14, CH3OH).
Compuesto 6 (compuesto del título): N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil- benzoico se preparó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1. Datos analíticos: Rf = 0.28 (1:1 hexanos: acetato de etilo); mp = 156.5-157.5 0C; [a]25589 -13.39° (c 2.05, CH3OH); 1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 10.4+ 10.26 (s, 1H), 7.18-7.14 (m, 3H), 7.08 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.03 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.34 + 6.21 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.57 + 4.38 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.29 (s, 6H), 2.27-2.23 (m, 1H), 1.89-1.79 (m, 2H), 1.59-1.38 (m, 3H), 1.09 + 1.06 (s, 9H), 0.95 + 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C RMN (100 MHz, DMSO-da) 5 173.40, 168.24, 157.64, 137.18, 136.98, 136.50, 130.89, 130.73, 130.20, 126.96, 125.28, 124.83, 119.37, 118.95, 112.41, 62.29, 56.11, 35.45, 28.71, 27.56, 21.24, 20.15, 15.15, 14.68; HRMS (ESI) m/z, calculado para C27H39N2O3 [M+H]+ 439.2955, encontrado 439.295, calculado para C27H38NaN2O3
[M+Na]+ 461.2774, encontrado 461.2765; Anal. Calculado para C27H38N2O3: C, 73.94; H, 8.73; N, 6.39; O, 10.94. Encontrado: C, 73.87; H, 8.94; N, 6.38; ee:>99.9%; Regis (S,S) ULMO, mezcla 98:2 de hexanos:metanol a una velocidad de flujo de 1 mL/min.
Los Ejemplos Comparativos 32 a 47 se prepararon utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 31. El porcentaje de 5 exceso enantiomérico (ee) se determinó mediante HPLC quiral.
Ejemplo
Estructura
% de ee
Nombre
32
imagen77
>99
N’-benzoil-N-(1 - tert-butil-butil)-
hidrazida de ácido (S)-(3,5-dimetil- benzoico
33
imagen78
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-metil-benzoil)- hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil- benzoico
34
imagen79
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-fluoro-
benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5- dimetil-benzoico
34
36
37
38
imagen80
imagen81
imagen82
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-cloro-benzoil)- hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil- benzoico
>99
N’-(2-bromobenzoil)- N-(1 -tert-butil- butil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil- benzoico
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3-metil-benzoil)- hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil- benzoico
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(4-metil-benzoil)- hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil- benzoico
39
40
41
42
imagen83
>99
imagen84
>99
>99
imagen85
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(4-etil-benzoil)- hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil- benzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2,6-difluoro- benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5- dimetil-benzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2,6-dicloro- benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5- dimetil-benzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(3,5-dimetoxi-4- metilbenzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5- dimetil-benzoico
43
44
45
46
Cl
imagen86
imagen87
>99
N-(1-tert-butilbutil)-
carbonil)-hidrazida
dimetil-benzoico
N’-(tiofeno- 2- de ácido (S)-3,5-
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2,5-dimetil- furano-3 -carbonil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico
imagen88
>99
imagen89
>99
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2-cloro-piridina- 3- carbonil)-hidrazida de ácido (S)-3,5- dimetil-benzoico
N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(6-cloro-piridina- 3- carbonil)-hidrazida de ácido (S)-3,5- dimetil-benzoico
imagen90
Ejemplo Comparativo 48
imagen91
(S)-N’-(1 -tert-Butil-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico
5 Síntesis
5
10
15
20
imagen92
Compuesto 2: Pivaldehído (52.1 g, 454 mmoles, aproximadamente 75% solución en t-butanol) se disolvió en 120 mL de metanol en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 1L con condensador de reflujo, termómetro, y embudo de adición. Se agregó ácido acético glacial (1 mL) seguido por adición controlada de carbazato de t-butilo (50 g, 378 mmoles), sin eliminación de calor de la reacción. La mezcla se agitó durante 4 horas, mientras que se monitorizaba por TLC. Luego de terminación de la reacción, el solvente se eliminó en vacío, el residuo se tomó en pentano, y el pentano se evaporó. El aceite resultante se cristalizó luego de reposo para proporcionar N’-(2,2-dimetil-propilideno)-hidrazina de éster de tert- butilo de ácido carboxílico (75.7 g, 93%). Rf = 0.42 (2:1 hexanos:acetato de etilo, 1% de ácido acético); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 7.6 (br s, 1H), 7.1 (s, 1H), 1.5 (s, 9H), 1.1 (s, 9H) ppm.
Compuesto 3: (R,R)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina se preparó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1 utilizando R,R-pseudoefedrina.
Compuesto 4: N’-(2,2-Dimetil-propilideno)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico (12 g, 59.9 mmoles) se cargó en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 1 L seco con termómetro, agitador magnético, y atmósfera de nitrógeno. Se cargó cloruro de metileno anhidro (200 mL) en el matraz utilizando un catéter. La mezcla se enfrió a 0 °C con un baño de hielo. (R,R)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina (24.07 g, 89.87 mmoles) Posteriormente se agregó al matraz bajo condiciones inertes. En minutos, la solución originalmente de color amarillo claro se volvió amarillo oscuro transparente. La reacción se agitó durante 6 hr a 0 0C, luego se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó durante la noche, mientras que se monitorizó mediante TLC. La reacción se neutralizó al agregar aproximadamente 25 mL de metanol, lo que resulta en un aligeramiento de color. La solución se concentró y el residuo se diluyó con 100 mL de acetato de etilo y 100 mL de agua. Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo dos veces. Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con solución salina, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El aceite resultante se purificó mediante cromatografía de columna utilizando acetato de etilo al 10% en hexanos. La (S)-N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico purificada se obtuvo como un aceite (2.87 g, 24.4% de rendimiento). Una fracción impura también se recolectó (3.17 g). Rf = 0.44 (5:1 hexanos:acetato de etilo, visualización I2); 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 6.07 (br, 1H, NH), 5.85 (m, 1H), 5.0 (dd, 2H), 2.6 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.3 (m, 1H), 1.4 (s, 9H), 0.9 (s, 9H).
5
10
15
20
25
30
35
Compuesto 5: (S)-N’-(1 -tert-Butil-but-3-enil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico (2.34 g, 9.65 mmoles) se disolvió en metanol (50 mL) en una botella Parr. Se agregó Pd/C al 10% (70 mg) como una lechada en agua (1.6 mL), y la mezcla se agitó sobre un hidrogenador Parr durante 4.5 h con una presión de partida de 55 psi. La reducción de la presión se monitorizo como una medición del progreso de la reacción, lo que indica que la reacción fue probablemente completa después 30 minutos. El catalizador sustancialmente se dejó sedimentar, y el sobrenadante se eliminó con una pipeta, se pasó a través de un filtro de jeringa de 0.45 micras, y se analizó mediante TLC. El solvente se eliminó en vacío para proporcionar 2.19 g (92.7%) de (S)-N’-(1- tert-butil-butil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico como un aceite amarillo ligeramente pálido. Rf = 0.48 (5:1 hexanos:acetato de etilo, visualización I2), 1H RMN (400 MHz, CDCb)
6.0 (br, 1H), 4.0 (br, 1H), 2.5 (d, 1H), 1.5 (s, 9H), 1.1 (m, 2H), 1.6 (br, 2H), 0.94 (s, 9H), 0.94 (t, 3H).
Compuesto 6 (compuesto del título): (S)-N’-(1-tert-Butil-butil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico (1 g, 4.09 mmoles) se disolvió en aproximadamente 3 mL de cloruro de metileno en un frasco con una barra de agitación. Se agregó una solución de 0.8 g de K2CO3 (5.79 mmoles) en aproximadamente 2 mL de agua, seguida por 0.81 g (4.80 mmoles) de cloruro de 3,5-dimetilbenzoilo. La reacción se agitó durante la noche, primero sobre hielo, y luego se dejó calentar a temperatura ambiente. Luego se agregaron varios mL de cada uno de agua y cloruro de metileno para disolver todos los sólidos. La capa acuosa se eliminó y la capa orgánica se secó sobre MgSO4 sólido. El TLC que indicó la reacción fue aproximadamente 95% completa. La mezcla se filtró a través de algo de lana de vidrio en un frasco. El solvente se evaporó con una corriente de N2, que persigue con 3:1 hexanos:éter y pentano. El residuo se manipuló con una espátula para iniciar cristalización, y después que se completó la solidificación, se trituró tres veces con 2-3 mL de pentano en un embudo de vidrio fritado pequeño. Después de secado en aire, se obtuvieron 300 mg (19.5%) de (S)-N’-(1 - tert-Butil-butil)- N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico, se indicó mediante TLC que es bastante pura, la HPLC quiral indicó el e.e = 93.3 %. El producto se secó en un horno de vacío a 50 0C durante la determinación del punto de fusión. Rf = 0.42 (4:1 hexanos:acetato de etilo, UV (fuerte), I2 (débil) visualización); mp = 115.5-117.5 0C; [a]25589 -30.18 (c 2.02, CH3OH), 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 7.15-7.03(m, 3H), 6.07+6.00 (s+d, 1H), 4.52+4.40 (2dd, 1H), 2.32+2.28+2.23 (3s, 6H), 1.85-0.89 (m, 25H).
Ejemplo Comparativo 49
imagen93
(R)-N’-(1 -tert-Butil-butil)-N’-(3,5 -dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico
imagen94
Compuesto 1: N-(1-tert-butil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-N’3,5-dimetil-benzoico se preparó como se describe en el Ejemplo 1.
Compuesto 2 (compuesto del título): A una solución de N-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico (400 mg, 1.44 mmol) en THF (10 mL) se agregó ahídrido de t-boc (629 mg, 2.88 mmol). La reacción se sometió a reflujo durante 40 h, se enfrió, se diluyó con éter (20 mL), se lavó con H2O, y se secó sobre Na2SO4 anhidro. El solvente se evaporó en vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash y cromatografía de capa fina para dar (R)-N’-(1- tert-butil-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de tert-butilo de ácido carboxílico (45.7 mg, rendimiento 4.1 %) como un sólido blanco. Rf = 0.39 (1:3 EtOAc: n-Hexano); [a]25589 +26.25 (c 2.09, CH3OH), 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5
7.15-7.03 (m, 3H), 6.07+6.00 (2d, 1H), 4.59+4.50 (2dd, 1H), 2.37+2.34 (2s, 6H), 1.85-0.89 (m, 25H) ppm; HRMS (ESI) m/z calculado para C22H37N2O3 [M+H]+ 377.2804, encontrado 377.2795, calculado para C22H36N2NaO3 [M+Na]+ 399.2624, encontrado 399.2618.
Ejemplo Comparativo 50
5
imagen95
N’-(1 -tert-butil-but-3-enil)-N’-((S)-3,3,3-trifluoro-2-metoxi-2-fenil-propionil)-hidrazida de ácido (R)-3-Metoxi-2-metil- benzoico
Síntesis
imagen96
10 Compuesto 1: hidrazida de ácido 3-Metoxi-2-metil-benzoico se preparó utilizando la metodología descrita en el documento US 2005/0209283 A1.
Compuesto 2: Pivaldehído (13.45 g, 156 mmoles) se disolvió en 300 mL de metanol en un matraz de fondo redondo. Se agregaron hidrazida de ácido 3- metoxi-2-metil-benzoico (26.6 g, 147.6 mmoles) y 150 gotas de ácido acético glacial, y la mezcla se calentó a reflujo durante aproximadamente 8 horas, mientras que se monitorizaba por TLC. Luego de 15 terminación de la reacción, el solvente se eliminó en vacío, y el producto se suspendió en hexanos fríos y se filtró sobre un embudo de Buchner para proporcionar 24.4 g (66%) de (2,2-dimetil-propilideno)-hidrazida de ácido 3-Metoxi-2-metil- benzoico. Rf = 0.19, (2:1 hexanos:acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 7.42+7.41 (3s, 1H), 7.1 (t, 1H), 6.9 (d, 1H), 6.82 (d, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.2+2.1 (2s, 3H), 1.07+1.0 (3s, 9H), múltiples conformaciones, posiblemente mezcla E/Z.
Compuesto 3: (S,S)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina se preparó como se describe en el Ejemplo 1.
20 Compuesto 4: (2,2-dimetil-propilideno)-hidrazida de ácido 3-Metoxi-2-metil-benzoico (10.84 g, 43.31 mmol) se cargó en un matraz de fondo redondo de 1 l seco conservado bajo una atmósfera de nitrógeno. Se agregó 350 mL de cloruro de metileno anhidro mediante catéter. El matraz se enfrió a aproximadamente 5 0C en un baño de hielo. Se agregó (S,S)-alil- 2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina (17.4 g, 65 mmol) mediante jeringa. En minutos, la mezcla originalmente clara se volvió amarilla oscura y transparente, y se dejó de revolver bajo nitrógeno a aproximadamente 5 0C. Después de 25 4 hr, la TLC indica una reacción completa. La reacción se neutralizó al agregar aproximadamente 25 mL de metanol con
mezcla gentil. El color oscuro se disipó. La solución se concentró y el residuo se diluyó con acetato de etilo (100 mL) y agua (100 mL). Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 100 mL). Las fases orgánicas
5
10
15
20
25
30
combinadas se lavaron una vez con solución salina, se secaron sobre MgSCU, se decantaron, y se concentraron para proporcionar un aceite amarillo profundo que se cristalizó luego de reposo (13.66 g, 72.4% de rendimiento). El material crudo se cristalizó a partir de 4:1 hexanos:acetato de etilo, mientras que se separa de un residuo en polvo insoluble, posiblemente pseudoefedrina. Después de una cristalización, el material purificado indica un e.e de alrededor de 80%, que favorece el isómero R, según se determina mediante análisis Mosher. Después de 3 cristalizaciones, 6.65 g de N’-(1 - tert-butil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-3-Metoxi-2-metil-benzoico (35.2%), se recuperó como un sólido cristalino, pero sin mejora adicional en ee Rf = 0.38 (2:1 hexanos:acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 7.22 (t, 1H), 7.11 (br s, 1H), 6.95 (d, 1H), 6.15 (m, 1H), 5.2 (d, 1H), 5.15 (d, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.80 (d, 1H), 2.50 (dm, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.2 (dt, 1H), 1.08 (s, 9H).
Compuesto 5 (compuesto del título): N’-(1 -tert-butil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-3-Metoxi-2-metil-benzoico (100 mg, 0.344 mmoles) y cloruro de (R)-(+)-alfa-metil-alfa-(trifluorometil)-fenilacetilo (104 mg, 0.413 mmoles) se disolvieron en 1.5 mL de cloruro de metileno en un frasco. Se agregó una solución de K2CO3 (95 mg, 0.69 mmoles) en aproximadamente 0.5 mL de agua, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y se monitorizó mediante TLC. Las fases se separaron, al agregar cloruro de metileno y/o agua adicional según fue necesario para ayudar a la manipulación. La capa de cloruro de metileno se secó sobre MgSO4 o Na2SO4, y el solvente se eliminó en vacío para proporcionar el producto crudo como un sólido oleoso. Este residuo se trituró con hexanos/éter, con lo cual comenzó la cristalización. Se dejó que la cristalización procedió sin más disturbios. El aislamiento del licor madre proporcionó 83 mg de (16.4%) N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-N’-((S)-3,3,3-trifluoro-2-metoxi-2-fenilpropionil)-hidrazida de ácido (R)-3-metoxi-2- metilbenzoico cristalina de la cual se obtuvo una estructura cristalina de rayos x. Mp = 128-129 0C; [a]25589 +66.4° (c 2.00, CH3OH); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 7.5 (d, 2H), 7.2-7.3 (m, 4H), 7.07 (m, 1H), 6.9 (d, 1H), 6.6+6.2 (br, 1H), 5.2 (d, 1H),
5.1 (d, 1H), 4.8 (1H, br), 3.85 (s, 3H), 3.8 (s, 3H), 2.55 (br, 1H), 2.35 (br, 2H), 1.5 (3H), 1.05 (br s, 9H); 13C RMN (100 MHz, CDCl3) 5 168.1, 158.3, 138.7, 134.0, 129.4, 128.0, 126.5, 126.4, 126.3, 124.9, 122.1, 118.0, 117.0, 112.2, 57.3, 55.7, 35.8, 32.0, 28.1, 12.3; HRMS (ESI) m/z calculado para C27H34F3N2O4 [M+H]+ 507.2471, encontrado 507.2463, m/z calculado para C27H33F3N2NaO4 [M+Na]+ 529.2290, encontrado 529.2284. Anal. Calculado para C27H33F3N2O4: C, 64.02; H, 6.57; F, 11.25; N, 5.53; C, 12.63. Encontrado: C, 63.87; H, 6.71; N, 5.52.
Con el fin de determinar el curso estereoquímico de la reacción de alilación asimétrica en el Ejemplo 50, se determinó la estructura de cristal de rayos x de N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-N’-((S)-3,3,3-trifluoro-2-metoxi-2- fenil-propionil)-hidrazida de ácido (R)-3-Metoxi-2-metil-benzoico. Este experimento establece la configuración absoluta del carbono que lleva el grupo tert-butilo y grupo n-propilo es R.
Ejemplo Comparativo 51
imagen97
N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3-metoxi-2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetoxi-4-metil-benzoico Síntesis
imagen98
Compuesto 1: N’-(1 -tert-butil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-3-Metoxi-2-metil-benzoico se preparó como se describe en el Ejemplo 50.
Compuesto 2: N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-3-Metoxi-2-metil-benzoico (3.05 g, 10.5 mmol) se disolvió 5 en 100 mL de metanol. Se agregó cuidadosamente paladio sobre carbono (1%, 240 mg), y la mezcla se agitó sobre un hidrogenador Parr durante 2.5 horas a una presión de partida de 55 psi. La reducción en la presión se monitorizo como una medida del progreso de reacción; después de 1.5 horas, cesó la absorción de hidrógeno. La mezcla se filtró a través de una almohadilla de Celita, y el solvente se eliminó en vacío. El análisis mediante TLC utilizando varios solventes fue en gran parte sin éxito para distinguir entre los dos puntos de hidrazida, aunque 3:1 hexanos:acetato de etilo (Rf = 0.28) 10 fue marginalmente exitoso. El producto crudo se cristalizó dos veces a partir de 2:1 pentano:hexanos para proporcionar >0.6 g de N’-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3-metoxi- 2-metil-benzoico . 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 7.05 (t, 1H), 6.79 (d, 1H), 6.76 (d, 1H), 3.7 (s, 3H), 2.37 (m, 1H), 2.12 (s, 3H), 1.7-1.1 (m, 4H), 0.90 (s, 9H), 0.82 (t, 3H).
Compuesto 3 (compuesto del título): N’-(1-tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3-Metoxi-2-metil-benzoico (100 mg, 0.34 mmol) y cloruro de 3,5-dimetoxi-4-metil-benzoilo (90 mg, 0.41 mmol) se disolvieron en 1 mL de cloruro de metileno. Se 15 agregó 1.5 eq. de alrededor de K2CO3 25%, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente y se monitorizó mediante TLC. Luego de terminación, las fases se separaron, al agregar CH2Cl2 y/o agua adicional según fue necesario para ayudar a la manipulación. La fase de CH2Cl2 se secó sobre MgSO4 o Na2SO4, y el solvente se eliminó en vacío para proporcionar un sólido oleoso. Este se trituró con 1:1 hexano:éter y se dejó secar al aire para proporcionar N-(1 -tert-butil- butil)-N’-(3-metoxi-2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetoxi-4-metilbenzoico. Rf = 0.29 (2:1 hexanos:acetato 20 de etilo); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 7.1 (t, 1H), 7.0 (s, NH 1H), 6.9 (d, 1H), 6.7 (s, 2H), 6.3 (d, 1H), 4.78 (m, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.85 (2s, 6H), 2.2 (s, 3H), 2.05 (m, 1H), 1.95 (s, 3H), 1.8 (m, 1H), 1.6 (m, 2H), 1.2+1.1+1.05 (3s, 9H), 1.05 (m, 3H); HRMS (ESI) m/z calculado para C27H39N2O5 [M+H]+ 471.2859, encontrado 471.2850, calculado para C27H38NaN2O5 [M+Na]+ 493.2670, encontrado 493.2678.
Ejemplo Comparativo 52
imagen99
N-(1 -ciclohexil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico Síntesis
imagen100
Compuesto 1: el carbazato de bencilo esta disponible comercialmente.
Compuesto 2: Se disolvió carbazato de bencilo (25 g, 150.44 mmoles) en 200 mL de etanol bajo una atmósfera de nitrógeno en un matraz de fondo redondo equipado con agitación magnética. Se agregaron ciclohexanocarbaldehído (17.7 5 g, 158 mmoles) y ácido acético (1 mL) a la solución y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 h. El precipitado sólido resultante se filtró, se lavó con hexanos, se cristalizó a partir de acetato de etilo, y se secó durante la noche en el banco abierto para proporcionar 28.87 g (73.7% de rendimiento) N’-ciclohexilmetileno-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico cristalina blanca. Rf = 0.67 (1:3 hexanos:acetato de etilo), 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 7.8 (1H, br s), 7.4 (5H, m), 7.1 (1H, br s), 5.3 (2H, s), 2.4 (1H, m), 1.7-1.9 (4H, m), 1.3 (6H, m); HRMS (ESI) m/z calculado para C15H21N2O2 10 [M+H]+ 261.1603, encontrado 261.1592, calculado para C15H2üNaN2O2 [M+Na]+ 283.1426, encontrado 283.1417.
Compuesto 3: (S,S)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina se preparó como se describe en el Ejemplo 1. El compuesto 4: Un matraz de fondo redondo con agitador magnético y atmósfera de N2 se cargó con 5 g (19.21 mmoles) N’-ciclohexilmetileno-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico en 75 mL de CHCh anhidro. La mezcla se enfrió a 0 0C, y se agregó (S,S)-oxazasilolidina (5.66 g, 21.1 mmoles) a la solución utilizando una jeringa. El baño de hielo se 15 eliminó después de aproximadamente 30 minutos y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La
reacción se neutralizó con Na2CO3 acuoso. La capa orgánica se eliminó, y la fase acuosa se extrajo con CHCl3. Las fases orgánicas combinadas se retrolavaron varias veces con agua, se secaron sobre Na2SO4 anhidro, y se liberaron de solvente utilizando un evaporador rotativo. El producto crudo resultante se purificó mediante cromatografía de columna para proporcionar (R)-N’-(1-ciclohexil-but-3-enil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico como un aceite viscoso de 20 color amarillo claro en 2.31 g, 39.8% de rendimiento. Rf = 0.41 (3:1 hexanos:acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, CDCb)
5 7.4 (5H, m), 6.3 (1H, br), 5.9 (1H, br s), 5.25 (2H, s), 5.2 (2H, br s), 2.95 (1H, br s), 2.35 (1H, br d), 2.17 (1H, br m), 1.8 (2H, br m), 1.75 (2h, br d), 1.55 (1H, br t), 1.0-1.4 (6H, m) ppm; HrMS (ESI) m/z calculado para C18H27N2O2 [M+H]+ 303.2072, encontrado 303.2079, calculado para C1sH26NaN2O2 [M+Na]+ 325.1892, encontrado 325.1899.
Compuesto 5: R-N’-(1-ciclohexil-but-3-enil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico (2.20 g, 7.27 mmoles) se 25 disolvió en 2 mL de cloruro de metileno en un frasco con un agitador magnético. Se agregó solución de K2CO3 acuosa (1.51 g, 10.91 mmoles en 4 mL) y la mezcla se enfrió sobre hielo. El cloruro de ácido puro se agregó lentamente y aproximadamente 1 mL de cloruro de metileno se utilizó para perseguir y enjuagar. La mezcla se agitó durante la noche, primero sobre hielo luego a temperatura ambiente, mientras que se monitorizaba por TLC. Se agregó agua y/o CH2Cl2 a la mezcla de reacción para ayudar a la manipulación, y la capa orgánica se recolectó. La capa acuosa se extrajo una vez
5
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15
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30
con CH2CI2, y las capas orgánicas se combinaron y secaron sobre Na2SÜ4 sólido. El solvente se eliminó en vacío, y el residuo se trituró con 2:1 hexanos:éter para proporcionar 2.93 g (92.7%) de (R)-N’-(1 -ciclohexil-but-3-enil)-N’-(3,5-dimetil- benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico como un sólido blanco. Rf = 0.33 (3:1 hexanos:acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 9.8+9.65 (0.5H, NH, 2s), 7.1-7.5 (3.5H, m), 6.9-7.1 (5H, m), 6.05 (0.5H, m), 5.9 (0.5H, m),
5.2 (1H, m), 5.0 (2H, m), 4.8 (1H, m), 4.35 (1H, m), 2.35 (2H, br m), 2.25 (6H, s), 0.8-2.0 (11H, m); HMS (ESI) m/z calculado para C27H35N2O3 [M+H]+ 435.2647, encontrado 435.2659, calculado para C27H34NaN2O3 [M+Na]+ 457.2467, encontrado 457.2470.
Compuesto 6: (R)-N’-(1-Ciclohexil-but-3-enil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico (2.91 g, 6.7 mmoles) se suspendió en aproximadamente 50 mL de ácido acético glacial. Se agregó 102 mg paladio sobre carbono al 10% como una lechada en varios mL de ácido acético. La mezcla se diluyó con ácido acético a 75 mL, y se agitó sobre un hidrogenador Parr durante 90 minutos a 20-30 psi. La suspensión se dejó reposar durante dos días para permitir la sedimentación del carbono. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de jeringa de 0.45 micras en un plato de recristalización y el solvente se evaporó para dejar 2.06 g (102% de equilibrio de masa) de ácido (R)-3,5-dimetil- benzoico N-(1-ciclohexil-butil)-hidrazida como un aceite viscoso marrón rojizo. Rf = 0.24 (2:1 hexanos: acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, CDCla) 5 7.05 (1H, s), 7.0 (2H, s), 4.55+3.35 (1H, 2t), 2.4 (6H, s), 0.8-1.9 (15H, m), 0.9 (3H, t); HRMS (ESI) m/z calculado para C19H31N2O [M+H]+ 303.2436, encontrado 303.2441, calculado para C^H30N2NaO [M+Na]+ 325.2256, encontrado 325.2262.
Compuesto 7 (compuesto del título): ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico N-(1-ciclohexil-butil)-hidrazida (0.14 g, 0.46 mmoles) se disolvió en 1 mL de cloruro de metileno en un frasco con un agitador magnético. Se agregó solución de K2CO3 acuosa (0.1 g, 0.69 mmoles, 2.77 mL). El matraz se enfrió sobre hielo, y se agregó cloruro de ácido puro. Aproximadamente 0.8 mL de cloruro de metileno adicional se utilizó para perseguir y enjuagar. La mezcla se agitó durante la noche, primero sobre hielo y luego a temperatura ambiente, mientras que se monitorizó la reacción mediante TLC. Se agregaron agua y CH2Cl2 a la mezcla de reacción para ayudar a la manipulación, y la capa acuosa se extrajo una vez con CH2Cl2. Las capas orgánicas se combinaron y secaron sobre Na2SO4 sólido. El solvente se eliminó en vacío, y el producto crudo se purificó mediante cromatografía para proporcionar 143 mg (67.9 % de rendimiento) N-(1-ciclohexil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi- benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico como un aceite viscoso marrón rojizo. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 10.4 (1H, 2s), 7.0-7.25 (5H, m), 6.2 (1H, m), 4.45 (1H, m), 3.8 (3H, s), 2.35 (6H, s), 2.0-2.2 (2H, m), 0.9-2.0 (15H, m), 0.9 (6H, m).
Los Ejemplos Comparativos 53 a 55 se prepararon utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 52. El porcentaje de exceso enantiomérico (ee) se determinó mediante HPLC quiral.
Ejemplo
Estructura
% de ee
Nombre
53
imagen101
62.4
N’-benzoil-N-(1- ciclohexil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico
54
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59.1
N-(1 -ciclohexilbutil)- N’-(3-metoxi-benzoil)- hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico
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Ejemplo Comparativo 56
imagen104
N-(1 -ciclohexil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico 5 Síntesis
5
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imagen105
Compuesto 1: N’-CicIohexilmetileno-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se preparó como se describe en el Ejemplo 52.
Compuesto 2: (R,R)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina se preparó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1 utilizando R,R-pseudoefedrina.
Compuesto 3: (S)-N’-(1-ciclohexil-but-3-enil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se preparó en 69% de rendimiento como un aceite viscoso de color amarillo claro utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 52. Datos analíticos: Rf = 0.41 (3:1 hexanos:acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 8.65 (1H, br s), 7.4 (5H, m), 5.85 (1H, br), 5.1 (4H, m), 4.2 (1H, s), 2.7 (1H, br s), 2.1 (1H, br m), 2.0 (1H, br m), 1.8 (2H, br m), 1.65 (2H, br m), 1.45 (1H, br m)
1.0- 1.2 (6H, br m); 1H RMN (400 MHz, CDCls) 5 7.4 (5H, m), 6.3 (1H, br), 5.9 (1H, br s), 5.25 (2H, s), 5.2 (2H, br s), 2.95 (1H, br s), 2.35 (1H, br d), 2.17 (1H, br m), 1.8 (2H, br m), 1.75 (2H, br d), 1.55 (1H, br t), 1.0-1.4 (6H, m); HRMS (ESI) m/z calculado para C18H27N2O2 [M+H]+ 303.2072, encontrado 303.2057, calculado para C^H26NaN2O2 [M+Na]+ 325.1892, encontrado 325.1873.
Compuesto 4: (S)-N’-(1-ciclohexil-but-3-enil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se preparó en 84.8% de rendimiento como un sólido blanco utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 52. Datos analíticos: ee >80%. Rf = 0.34 (3:1 hexanos: acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 9.8+9.65 (0.5H, NH, 2s),
7.1- 7.5 (3.5H, m), 6.9-7.1 (5H, m), 6.05 (0.5H, m), 5.9 (0.5H, m), 5.2 (1H, m), 5.0 (2H, m), 4.8 (1H, m), 4.35 (1H, m), 2.35 (2H, br m), 2.25 (6H, s), 0.8-2.0 (11H, m); HrMs (eSi) m/z calculado para C27H35N2O3 [M+H]+ 435.2647, encontrado 435.2655, calculado para C27H34NaN2O3 [M+Na]+ 457.2467, encontrado 457.2469.
Compuesto 5: N-(1-ciclohexil-butil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico se preparó utilizando la metodología descrita en el ejemplo 52. Datos analíticos: Rf = 0.24 (2:1 hexanos:acetato de etilo); 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 7.05+6.95 (1H, s), 7.0+6.85 (2H, 2s), 4.55+4.05 (2H, 2s), 4.3+3.15 (1H, 2t), 2.3 (6H, 2s), 0.6-1.9 (15H, m), 0.9+0.8 (3H, 2t); (400 MHz, CDCh) 5 7.05 (1H, s), 7.0 (2H, s), 4.55+3.35 (1H, 2t), 2.4 (6H, s), 0.8-1.9 (15H, m), 0.9 (3H, t); HRMS (ESI) m/z calculado para C19H31N2O [M+H]+ 303.2436, encontrado 303.2440, calculado para C^H30N2NaO [M+Na]+ 325.2256, encontrado 325.2260.
Compuesto 6 (compuesto del título): N-(1-c¡clohexil-but¡l)-N’-(2-et¡l-3-metox¡-benzo¡l)-h¡draz¡da de ácido (S)-3,5-dimetil- benzoico se preparó utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 52 en 37% de ee.
Los Ejemplos Comparativos 57 a 59 se prepararon utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 56. El porcentaje de exceso enantiomérico (ee) se determinó mediante HPLC quiral. La Tabla 3 proporciona datos analíticos para los ejemplos 5 57 a 59.
Ejemplo
Estructura
% de ee
nombre
57
imagen106
87.7
N’-benzoil-N-(1- ciclohexil-but¡l)-h¡draz¡da de ácido (S)-3,5-Dimetilbenzoico
58
imagen107
86.7
N-(1 -ciclohexilbutil)- N’-(3-metoxibenzoil)- hidrazida de ácido (S)-3,5-Dimetilbenzoico
59
imagen108
99
N-(1 -ciclohexilbutil)- N’-(4-etil-benzoil)- hidrazida de ácido (S)-3,5-Dimetilbenzoico
Tabla 3: Datos analíticos
Ejemplo
1H RMN (solvente) MS
57
(CDCls) 5 8.0 (1H, NH, br s), 7.0-7.8 (8H, m), 4.6+3.6 (1H, 2 br s), 2.3-2.4 (6H, 2 br s), 1.4-2.0 (10H, br m), 1.1-1.4 (4H, 2 br s), 0.9-1.1 (4H, 2 br s) ppm [M+H+] 407.2695 [M+Na+] 429.2513
58
(CDCls) 5 6.9-7.6 (7H+1 NH, m), 4.6+3.65 (1H, 2 br s), 3.85 (3H, 2 br s), 2.4 (6H, 2 br s), 1.4-2.0 (10H, br m), 1.1-1.4 (4H, br m), 0.9-1.3 (4H, 2 br s) ppm [M+H+] 437.2799 [M+Na+] 459.2616
59
(CDCls) 5 7.9 (1H, NH, br s), 6.9-7.6 (7H, m), 3.6+4.6 (1H, 2 br s), 2.75 (2H, br s), 2.4 (6H, 2 br s), 1.5-2.0 (9H, br m), 1.1-1.4 (8H, br m), 1.0 (4H, 2 br s) ppm [M+H+] 435.3016 [M+Na+] 457.2827
Ejemplo Comparativo 60
5
10
15
20
25
imagen109
N-(1 -ciclohexil-but-3-enil)-N’-(3-metoxi-2-metilbenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico
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Compuesto 1: la hidrazida de ácido 3-Metoxi-2-metil-benzoico se preparó como se describe en el Ejemplo 50.
Compuesto 2: 10.0 g (55.5 mmol) de hidrazida de ácido 3-Metoxi-2-metil-benzoico se disolvió en 200 mL de alcohol etílico absoluto. Se agregaron ciclohexanocarbaldehído (6.85 g, 61.0 mmol) y ácido acético glacial (3 mL), y la mezcla de reacción se agitó durante 18 h mientras que se monitorizaba por TLC. El precipitado se recolectó mediante filtración y se lavó con hexano. El producto de ciclohexilmetileno-hidrazida de ácido 3-Metoxi-2-metil-benzoico se obtuvo como un sólido blanco (9.36 g, rendimiento 61%): Rf = 0.20 (3:1 EtOAc:n-Hexano); 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 11.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.50 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 7.25 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 6.99 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.89 (s, 3H), 2.28 (s, 3H), 1.92-1.62 (m, 5H), 1.38-1.14 (m, 6H); HrMs (EsI) m/z calculado para C16H23N2O2 [M+H]+ 275.1760, encontrado 275.1752, calculado para C1sH22N2NaO2 [M+Na]+ 297.1579, encontrado 297.1568.
Compuesto 3: (S,S)-2-alil-2-cloro-3,4-dimetil-5-fenil-[1,3,2]oxazasilolidina se preparó como se describe en el Ejemplo 1.
Compuesto 4: A un matraz de fondo redondo con un agitador y una entrada de nitrógeno se agregó ciclohexilmetileno- hidrazida de ácido 3-Metoxi-2-metil-benzoico (2.8 g, 10.2 mmol) y CHCl3 seco (50 mL). Se agregó (S,S)-Oxazasilolidina (3.28 g, 12.20 mmol) en forma de gotas. La reacción se agitó a 50 0C durante 6 h, luego a temperatura ambiente durante 18 h. Se agregó solución de NaHCO3 saturada (30 mL) para neutralizar la reacción. La capa de CHCl3 se separó y la capa acuosa se extrajo con CHCl3 (2 x 30 mL). La solución de CHCl3 se combinó y se secó sobre Na2SO4 anhidro. El solvente se evaporó en vacío, y la mezcla cruda se purificó mediante cromatografía flash para obtener N’-(1 -ciclohexil-but-3-enil)- hidrazida de ácido (R)-3- metoxi-2-metil-benzoico como un sólido blanco (1.74 g, 54% de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 5 9.69 (s, 1H), 7.24 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.05 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.92 (m, 1H), 5.15 (dd, J = 1.6, 17.2 Hz, 1H), 5.08 (dd, J = 1.6, 10.4 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 3.6, 6.8 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.75 (m, 1H), 2.26-2.22 (m, 1H), 2.16 (s, 3H), 2.14-2.08 (m, 1H), 1.81 -1.08 (m, 11H); HRMS (ESI) m/z calculado para C19H29N2O2 [M+H]+ 317.2229, encontrado 317.2221, m/z calculado para C19H29N2O2 [M+Na]+ C19H2sN2NaO2 339.2048, encontrado 339.2037.
Compuesto 5 (compuesto del título): A una solución de N’-(1 -ciclohexil-but-3- enil)-hidrazida de ácido (R)-3-Metoxi-2-metil- benzoico (1.3 g, 4.11 mmol) en CH2Cl2 (5 mL), se agregó K2CO3 (2.27 g, 16.44 mmol), H2O (5 mL), y finalmente cloruro de 3,5-dimetilbenzoilo (727 mg, 4.31 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Se agregaron CH2Cl2 y H2O adicionales para ayudar en la manipulación, la capa de CH2Cl2 se separó, y la capa acuosa se extrajo con
CH2CI2. las soluciones de CH2CI2 se combinaron y secaron sobre Na2SÜ4 anhidro. El solvente se evaporó en vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash para proporcionar N-(1-ciclohexil-but-3-enil)-N’-(3-metoxi-2-metil- benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico como un sólido blanco (1.45 g, 78% de rendimiento). Rf = 0.21 (3:1 EtOAc:n-Hexano); 1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 10.47+10.39 (2s, 1H), 7.20-7.01 (m, 5H), 6.37 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5 6.22-5.89 (m, 1H), 5.18 (dd, 1H), 5.02 (dd, 1H), 4.46 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 2.44-2.34 (m, 2H), 2.29 (s, 3H), 2.02-1.53 (m,
8H), 1.26-1.02 (m, 3H); HRMS (ESI) m/z calculado para C28H37N2O3 [M+H]+ 449.2804, encontrado 449.2793, calculado para C28H36N2NaO3 [M+Na]+ 471.2624, encontrado 471.2615.
Ejemplo Comparativo 61
imagen111
10 N-(1 -ciclohexil-but-3-enil)-N’-(3-metoxi-2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-4-Metoxi-3,5-dimetil-benzoico
Síntesis
N-(1-ciclohexil-but-3-enil)-N’-(3-metoxi-2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-4-Metoxi-3,5-dimetil-benzoico se preparó en 71% de rendimiento utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 60. Datos analíticos: Rf = 0.14 (1:3 EtOAc:n- Hexano); 1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 10.46+10.38 (2s, 1H), 7.21-6.42 (m, 5H), 6.16-5.93 (m, 1H), 5.23 (dd, 1H), 5.01 15 (dd, 1H), 4.45 (m, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (s, 6H), 2.42-2.28 (m, 2H), 2.04 (s, 3H), 1.88-1.05 (m, 14H); HRMS (ESI) m/z calculado para C29H38N2O5 [M+H]+ 495.2859, encontrado 495.2848, calculado para C29H3sN2NaO5 [M+Na]+ 517.2678, encontrado 517.2667.
Ejemplo Comparativo 62
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20 N’-(4-etil-benzoil)-N-(1-fenetil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico Síntesis
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Compuesto 2: hidrazida de ácido 4-etil-benzoico (10 g, 60.9 mmoles) se disolvió en 32 mL de metanol. Se agregó ácido acético (1 mL), la mezcla se llevó a reflujo, y luego se agregó lentamente hidrocinnamaldehído (5.77g, 67 mmoles). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 10 h y se monitorizó mediante TLC. Los precipitados se recolectaron a través de filtración y se lavaron con hexanos. Se obtuvo (3-fenil-propilideno)-hidrazida de ácido 4-etil-benzoico como un sólido blanco (9.34 g, 54.7% de rendimiento). Rf = 0.36 (1:1 EtOAc:n-hexano); 1H RMN (400 MHz, CDCb) 5 8.87 (s, 1H), 7.72-7.24 (m, 10H), 2.87 (t, J = 15.2 Hz, 2H), 2.79-2.57 (m, 4H), 1.24 (t, J = 8 Hz, 3H).
Compuesto 3: sulfóxido de (R)-(+)-metil p-tolilo (0.5 g, 3.21 mmoles) y trifenil-difluorosilicato de tetrabutilamonio (TBAT) (0.12 g, 0.214 mmoles) se disolvieron en 0.038 mL de 2-metil-2-buteno y 2.4 mL de cloruro de metileno anhidro bajo nitrógeno y con agitación magnética. Se agregó aliltriclorosilano (0.23 mL, 1.61 mmoles) a -78 0C y la reacción se agitó durante 15 minutos. (1-metil-3-fenil-propilideno)hidrazida de ácido 4-etil-benzoico (0.3 g, 1.07 mmoles) se disolvió en 11.6 mL de cloruro de metileno anhidro y se agregaron a la reacción durante un periodo de 30 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante 5 horas bajo nitrógeno y se mantuvo a -78 0C a - 70 0C, con monitorización de TLC. La reacción se neutralizó con 1.5 mL de trietilamina y 3 mL de metanol anhidro a -78 0C. Luego se agregó solución salina y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. La capa orgánica se eliminó, se combinó con tres extracciones de cloruro de metileno, y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se evaporó, y la mezcla cruda se purificó mediante cromatografía flash utilizando un gradiente de etapa de 2:1 y 1:1 pentano:acetato de etilo. N’-(1 -fenetil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)- 4-etil-benzoico purificada se obtuvo como un aceite claro (0.145 g, 41.4% de rendimiento, 57.6% de ee mediante HPLC quiral sobre Chiralcel ADH). Rf = 0.50 (1:1 EtOAc:n-hexano); 1H RmN (400 MHz, CDCh) 5 7.64-7.13 (m, 9H), 5.91 (m, 1H), 5.15 (t, J = 28.0 Hz, 2H), 3.12 (m, 1H), 2.76-2.63 (m, 4H), 2.38-2.24 (m, 2H), 1.88-1.74 (m, 2H), 1.23 (t, J = 8.0 Hz, 3H).
Compuesto 4 (compuesto del título): N’-(1-fenetil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-4-etil-benzoico (0.1 g, 0.31 mmoles) se disolvió en 0.47 mL de cloruro de metileno con agitación magnética. Se agregaron bicarbonato de potasio (0.064 g, 0.37 mmoles) en 0.7 mL de agua desionizada y cloruro de 3,5-dimetilbenzoilo (0.063 g, 0.37 mmoles) a la mezcla. La mezcla de reacción primero se agitó sobre hielo y luego se dejó calentar a temperatura ambiente durante el fin de semana mientras que se monitorizaba por TLC. La capa orgánica se eliminó y la capa acuosa se extrajo con cloruro de metileno tres veces y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se evaporó, y la mezcla cruda se purificó mediante cromatografía
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flash, utilizando 2:1 hexanos:acetato de etilo como eluyente. N-(4-etil-benzoil)- N-(1-fenetil-but-3-enil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-Dimetilbenzoico purificada se obtuvo como un aceite amarillo (0.102 g, rendimiento 72.9%, 51.2% de ee mediante HPLC quiral sobre Chiralcel ADH). Rf = 0.34 (2:1 hexano:EtOAc); 1H RMN (400 MHz, CDCta) 5 7.8-7.02 (m, 12H), 5.99 (br, 1H), 5.22 (d, J = 24.0 Hz, 2H), 2.73 (d, J = 8 Hz, 2H), 2.31 (s, 6H), 2.12-2.03 (m, 2H), 1.87 (s, 1H), 1.61 (s, 2H), 1.29 (t, J = 8.0 Hz, 3H); HRMS (ESI) m/z calculado para C30H35N2O2 [m+H]+ 455.2699, encontrado 455.2685, calculado para C30H34N2NaO2 [M+Na]+ 477.2518, encontrado 477.2505.
Ejemplo Comparativo 63
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(S)-N’-(1 -tert-Butil-4-hidroxi-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico Síntesis
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Compuesto 1: el compuesto 1 se preparó como se describe en el Ejemplo 31.
Compuesto 2 (compuesto del título): A una solución de (S)-N’-(1-tert-butil-but-3-enil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico (200 mg, 0.49 mmol) en THF (3 mL), se agregó sulfuro de borano dimetilo (2 M en THF, 125 |jL, 0.25 mmol) a 0 °C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Se eliminó en vacío exceso de borano y THF, y se agregaron THF (3 mL) adicional, seguido por H2O2 (61 microlitros, 0.54 mmol) y NaOH 3N (90 microlitros, 0.27 mmol). Después de agitación a 50-55 0C durante 1 h, se agregó más agua, la mezcla se extrajo con éter, y la capa de éter se secó sobre Na2SO4 anhidro. El solvente se eliminó en vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash para dar (S)-N’-(1-tert-butil-4-hidroxi-butil)-N’-(3,5-dimetilbenzoil)- hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico como un sólido blanco (128 mg, rendimiento 61%). Rf = 0.30 (1:1 EtOAc:n-hexano). 1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 9.71+9.63 (2s, 1H), 7.44-6.88 (m, 8H), 5.06 (dd, J = 3.6, 12.8 Hz, 1H), 4.79 (dd, J = 12.4, 25.2 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.28 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 3.47 (m, 2H), 2.27 (s, 6H), 1.86-1.21 (m, 4H), 1.01 (s, 9H); HRMS (ESI) m/z calculado para C25H35N2O4 [M+H]+ 427.2597, encontrado 427.2587, calculado para C2sH34N2NaO4 [M+Na]+ 449.2416, encontrado 449.2407.
Ejemplo Comparativo 64
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(R)-N’-(1 -tert-Butil-4-hidroxi-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico Síntesis
(R)-N’-(1 -tert-Butil-4-hidroxi-butil)-N’-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazina de éster de bencilo de ácido carboxílico se preparó en 5 >99% de ee utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 63.
Ejemplo 65
Este ejemplo ilustra el método analítico utilizado para determinar el exceso enantiomérico (ee) de compuestos de la invención.
Como se muestra en la Figura 2A-C, los cromatogramas de HPCL quiral para N-(1 -tert-butilbutil)- N’-(2,6-dicloro-benzoil)- 10 hidrazida de ácido rac-3,5-dimetil-benzoico (Ejemplo 16), N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2,6- dicloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico y N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2,6-dicloro-benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico (Ejemplo 41) ilustran el método utilizado para determinar el exceso enantiomérico. La N-(1- tert-butil-butil)-N’-(2,6-dicloro- benzoil)-hidrazida de ácido rac-3,5-dimetil-benzoico contiene 50% del isómero R (pico 1 en aproximadamente 16 minutos) y 50% del isómero S (pico 2 en aproximadamente 19 minutos). La muestra enantioméricamente enriquecida de N-(1-tert- 15 butil-butil)-N’-(2,6-dicloro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico es sustancialmente libre del isómero S con un ee de >99%. La muestra enantioméricamente enriquecida de N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2,6-dicloro-benzoil)-hidrazida de ácido (S)-3,5-dimetil-benzoico es sustancialmente libre del isómero R con un ee de >99%. En este experimento, se generaron los datos utilizando una columna 4.6 mm x 25 cm Regis Rexchrom (S,S) ULMO a un índice de flujo de 2.0 mL/min utilizando 2% metanol en hexano como el solvente y un volumen de inyección de 20 |jL. Se determinó el exceso 20 enantiomérico de otros compuestos de la Fórmula II III en forma similar, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 66
Este ejemplo ilustra la prueba in vitro de los compuestos de la invención.
Casete de expresión genética
GAL4 DBD (1-147)-CfEcR(DEF)/VP16AD-pRXREF-LmUSPEF: Los dominios D, E, y F de tipo silvestre de EcR de gusano 25 de las yemas del abeto Choristoneura fumiferana (“CfEcR-DEF”; SEQ ID NO: 1) se fusionaron a un dominio de unión de ADN GAL4 (“Gal4DBD1-147”; SEQ ID NO: 2) y se colocaron bajo el control de un promotor de fosfoglicerato quinasa (“PGK”; SEQ ID NO: 3). Hélices 1 a 8 de los dominios EF de RXRp de Homo sapiens (“HsRXRp-EF”; nucleótidos 1-465 de la SEQ ID NO: 4) y hélices 9 a 12 de los dominios EF de proteínas ultraespiráculo de Locusta migratoria (“LmUSP- EF”; los nucleótidos 403-630 de la SEQ ID NO: 5) se fusionaron al dominio de transactivación de VP16 (“VP16AD”, SEC 30 ID NO: 6) y se colocaron bajo el control de un promotor de factor de elongación-1a (“EF-1a”; SEQ ID NO: 7). Cinco sitios de unión del elemento de respuesta a GAL4 de consenso (“5XGAL4RE”; que comprende 5 copias de un GAL4RE que comprende la SEQ ID NO: 8) se fusionaron a un promotor mínimo TATA sintético (SEq ID NO: 9) y se colocaron corriente arriba del gen indicador de luciferasa (SEC ID NO: 10).
Formación estable de células
35 Las células CHO se transfectaron transitoriamente con casetes de transcripción para GAL4 DBD (1-147) CfEcR(DEF) y para VP16AD pRXREF-LmUSPEF controlados por promotores celulares ubicuamente activos (PGK y EF-1a, respectivamente) sobre un solo plásmido. De manera estable células transfectadas se seleccionaron por la resistencia a Zeocin. Los clones de células CHO aislados individualmente se transfectaron transitoriamente con un gen indicador de GAL4 RE-luciferasa (Luc pFR). Se seleccionaron los clones 27-63 utilizando higromicina.
40 Tratamiento con ligando de diacilhidrazina quiral
Las células se tripsinizaron y se diluyó a una concentración de 2.5 x 104 células mL. 100 jL de suspensión de células se colocó en cada pozo de una placa de 96 pozos y se incubó a 37 0C bajo 5% de CO2 durante 24 h. Se prepararon soluciones
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madre de ligandos en DMSO y se diluyeron 300 veces para todos los tratamientos. Las pruebas de respuesta de dosis consistieron en 8 concentraciones que varían de 33 pM a 0.01 pM.
Ensayo del gen indicador
La expresión del gen indicador de luciferasa se midió 48 h después del tratamiento de células utilizando Bright-Sistema de Ensayo de Luciferasa Glo™ de Promega (E2650). La luminiscencia se detectó a temperatura ambiente utilizando un luminómetro de placa de microtitulación Dynex MLX.
Estirpe celular estable
Se obtuvo una población de células transformadas de manera estable que contienen CVBE y 6XEcRE como se describe en Suhr et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 95:7999-804 (1998) Las células 293 de riñón humano, también conocidas como células HEK-293, se infectaron secuencialmente con vectores retrovirales que codifican primero la construcción de interruptor CVBE, y, posteriormente, la construcción indicadora 6XEcRE Lac Z. La construcción de interruptor contenía la secuencia de codificación para los aminoácidos 26-546 de EcR de Bombyx mori (BE) (latrou) insertado en marco y corriente abajo del dominio de transactivación VP16 (VBE). Un codón de inicio ATG sintético se colocó bajo el control del promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CVBE) y se flanqueó por repeticiones terminales largas (LTR). La construcción indicadora contenía seis copias del sitio de unión del elemento de respuesta a ecdisona (EcRE) colocadas corriente arriba de LacZ y flanqueadas en ambos lados con secuencias LTR (6XEcRE).
La clonación por dilución se utilizó para aislar clones individuales. Los clones se seleccionan utilizando 450 ug/ml de G418 y 100 ng/ml de puromicina. Los clones individuales se evaluaron en base a su respuesta en presencia y ausencia de ligandos de prueba. El clon Z3 se seleccionó para propósitos de tamizado y SAR.
Las células de riñón 293 humanas transformadas de forma estable con CVBE y 6XEcRE LacZ se mantuvieron en Medio Esencial Mínimo (Mediates, 10-010-CV) que contenía 10% de FBS (Life Technologies, 26140-087), 450 goma de G418 (Mediates, 30- 234- CR), y 100 genomas prometedores (Sigma, P-7255), a 37 0C en una atmósfera que contiene 5% de CO2 y se subcultivaron cuando alcanzaron 75% de confluencia.
Tratamiento con ligando de diacilhidrazina quiral
Las células Z3 se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pozos a una concentración de 2.5 X 103 células por pozo y se incubaron a 37 0C en 5% de CO2 durante veinticuatro horas. Las soluciones madre de ligandos se prepararon en DMSO. Las soluciones de ligando se diluyeron 100 veces en medio y se agregaron 50 pL de esta solución de ligando diluido (33 pM) a las células. La concentración final de DMSO se mantuvo a 0.03% en ambos controles y tratamientos.
Ensayos de gen indicador
La expresión del gen indicador se evaluó 48 horas después del tratamiento de las células. La actividad de p-galactosidasa se midió utilizando el sistema de ensayo de gen indicador de bioluminiscencia la pantalla Gal Screen™ de Tropix (GSY1000). Las actividades de inducción de doblez se calcularon al dividir unidades relativas de luz (“RLU”) en células tratadas con ligando RLU en células tratadas con DMSO. La luminiscencia se detectó a temperatura ambiente utilizando un luminómetro de placa de microtitulación Dynex MLX.
Una construcción de interruptor de CVBE esquemática, y la construcción indicadora 6XEcRE Lac Z se muestra en la Figura 1. Flanqueando ambas construcciones se tienen repeticiones terminales largas, G418 y puromicina son marcadores seleccionables, CMV es el promotor de citomegalovirus, VBE es la secuencia de codificación para los aminoácidos 26 a 546 de EcR de Bombyx mori insertado corriente abajo del dominio de transactivación de VP16, el 6X EcRE es seis copias del elemento de respuesta a ecdisona, lacZ se codifica para la enzima indicadora p-galactosidasa.
Expresión genética de casete
GAL4 DBD-CfEcR (DEF)/VP16AD-MmRXRE: los dominios D, E, y F de tipo silvestre del gusano del abeto de EcR de Choristoneura fumiferana (“CfEcR-DEF”; SEQ ID NO: 1) se fusionaron a un dominio de unión a ADN de GAL4(“Gal4DBD1 - 147”; SEQ ID NO: 2) y se colocaron bajo el control del promotor SV40e del vector pM (PT3119-5, Clontech, Palo Alto, CA). Los dominios D y E de RXR de Mus Musculus (“MmRXR-DE”; SEQ ID nO: 11) se fusionaron al dominio de transactivación de VP16 (“VP16AD”; SEQ ID NO: 6) y se colocaron bajo el control del promotor SV40e del vector pVP16 (PT3127-5, Clontech, Palo Alto, CA).
Estirpe celular estable
Células CHO se transfectaron transitoriamente con casetes de transcripción para GAL4 DBD-CfEcR(DEF) y para VP16ADMmRXRE controlados por los promotores SV40e. Se seleccionaron las células transfectadas de manera estable utilizando higromicina. Los clones de células CHO aislados individualmente se transfectaron transitoriamente con una GAL4 RE-luciferasa indicadora (PFR-Luc, Stratagene, La Jolla, CA). El clon 13B3 se seleccionó utilizando Zeocin.
Tratamiento con ligando de diacilhidrazina quiral
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Las células se tripsinizaron y se diluyeron a una concentración de 2.5 x 104 células mL. 100 pL de suspensión de células se colocó en cada pozo de una placa de 96 pozos y se incubó a 37 0C bajo 5% de CO2 durante 24 h. Las soluciones madre de ligandos se prepararon en DMSO y se diluyeron 300 veces para todos los tratamientos. Las pruebas de respuesta de dosis consistieron en 8 concentraciones que varían desde 33 pM hasta 0.01 pM.
Ensayo de interruptor para gen - sistemas EcR:USP/PXR diseñados por ingeniería
Los ensayos de interruptor para gen celular se realizaron mediante transfección transitoria de las siguientes construcciones en las células de fibroblastos embrionarios de ratón (NIH3T3). Los dominios D, E y F de tipo silvestre de EcR de Choristoneura fumiferana o su mutante V390I/Y410E/E274V se fusionaron a GAL4-DBD y se colocaron bajo el control del promotor de CMV en el vector pBIND (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.). Los dominios DEF de ECRs mostrados se amplificaron utilizando cebadores diseñados sobre la base de secuencias de 20-25 nt en los extremos 5' y 3'. Los sitios de enzimas de restricción EcoR I/BamH I y Xba I se agregaron a los cebadores 5' y 3' respectivamente. Los productos de PCR se digirieron con enzimas de restricción apropiadas y se clonaron en el vector pBIND. Los LBD EcR clonados en el vector pBIND se verificaron por secuenciación. Un RXR quimérico de RXRp de Homo sapiens y RXR de Locusta migratoria, fusionado a un VP16-AD y colocado bajo el control de un promotor SV40e, se construyó como se describió previamente (Kumar P & Katakam A in Gene Transfer, Friedmann T and Rossi J, eds, pp. 643-651 (2007), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring inducible Harbor, NY). El plásmido indicador de luciferasa pFRLuc (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, EE.UU.), contiene cinco copias del elemento de respuesta a GAL4 y un promotor mínimo sintético.
Las células NIH3T3 se mantuvieron a 37 0C y 5% de CO2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de ternera bovino al 10%, ambos obtenidos de Mediatech Inc., Manassas, VA. Las células se sembraron en una placa de 96 pozos a una densidad de 2.500 células/pozo en 50 pL de medio de crecimiento. Los días siguientes las células se trataron primero con 35 pL de DMEM sin suero que contenía dimetilsulfóxido (DMSO, control) o una solución de DMSO que contenía ligando. Las células luego se transfectaron con 15 pl de DMEM libre de suero que contenía 0.04 pg de construcción de EcR, 0.04 ug de construcción de RXR, y 0.16 pg de construcción de indicador de luciferasa por pozo, utilizando el reactivo de transfección SuperFect™ (Qiagen Inc., Valencia, CA, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ligandos se probaron a 8 dosis de 0.01-33 pM y la concentración final de DMSO fue de 0.33% en ambos pozos de control y de tratamiento. Después de un post-tratamiento e incubación por transfección de 48 horas, las células se ensayaron para la actividad de luciferasa utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa Bright- Glo™ (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los valores de EC50 se midieron de forma mínima por duplicado.
Ensayo del gen indicador
La expresión del gen indicador de luciferasa se midió 48 h después del tratamiento de células utilizando Sistema de Ensayo de Luciferasa Bright-Glo™ de Promega (e2650). La luminiscencia se detectó a temperatura ambiente utilizando un luminómetro de placa de microtitulación Dynex MLX.
Cada ensayo se realizó en dos pozos separados, y los dos valores se promediaron. Las inducciones plegadas se calcularon al dividir unidades relativas de luz (“RLU”) en las células tratadas con ligando RLU en las células tratadas con DMSO. La EC50 se calculó a partir de datos de dosis-respuesta utilizando un modelo logístico de tres parámetros. se determinó la Max FI relativa como la inducción máxima de plegado del ligando probado (un compuesto de la invención) observada en cualquier concentración relativa a la inducción máxima plegada de ligando GS™-E (N-tert-butil-N’-(2-etil-3- metoxi-benzoil)-hidrazida de ácido 3,5-dimetilbenzoico) observada a cualquier concentración.
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Claims (19)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste de:
    N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-etil-3-metoxibenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
    N’-benzoil-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
    N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-fluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
    N’-(2-bromo-benzoil)-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N’-(3-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; N-(1-tert-butil-butil)-N’-(4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
    N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico;
    N-(1-tert-butil-butil)-N’-(6-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico; y N-(1-tert-butil-butil)-N’- (3-metoxi-2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
  2. 2. La N-(1 -tert-but¡l-but¡l)-N’-(2-et¡l-3-metox¡-benzo¡l)-h¡draz¡da de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  3. 3. La N’-benzoil-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  4. 4. La N-(1-tert-butil-butil)-N’-(2-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  5. 5. La N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-fluoro-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  6. 6. La N’-(2-bromo-benzoil)-N-(1 -tert-butil-butil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  7. 7. La N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(3-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  8. 8. La N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(4-metil-benzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%,
    0 una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  9. 9. La N-(1 -tert-butil-butil)-N’-(2-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  10. 10. La N-(1-tert-butil-butil)-N’-(6-cloro-piridina-3-carbonil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación
    1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  11. 11. La N-(1-tert-butil-butil)-N’-(3-metoxi-2-metilbenzoil)-hidrazida de ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico de la reivindicación 1 que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 95% preferiblemente que tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 99%, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
  12. 12. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  13. 13. Un método in vitro para modular la expresión de un gen endógeno o heterólogo en una célula anfitriona, en el que la célula anfitriona comprende un primer casete de la expresión de gen recombinante que comprende un primer polipéptido que codifica un primer polipéptido que comprende:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    i) un dominio de unión a ADN; y
    ii) un dominio de unión al ligando del receptor nuclear del Grupo H;
    y un segundo casete de la expresión de gen recombinante que comprende:
    i) un elemento de respuesta capaz de unirse a dicho dominio de unión a ADN;
    ii) un promotor; y
    iii) dicho gen endógeno o heterólogo;
    el método que comprende poner en contacto dicha célula anfitriona con un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11; en el que se modula la expresión del gen endógeno o heterólogo.
  14. 14. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 13 en el que la célula anfitriona comprende:
    (i) un primer casete de la expresión de gen recombinante que comprende un polipéptido que codifica un primer polipéptido híbrido que comprende:
    (a) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con dicho gen cuya expresión se va a modular; y
    (b) un dominio de unión al ligando del receptor de ecdisona;
    (ii) un segundo casete de la expresión de gen recombinante que comprende un polipéptido que codifica un segundo polipéptido híbrido que comprende:
    (a) un dominio de transactivación; y
    (b) un dominio de unión al ligando del receptor X del retinoide quimérico; y
    (iii) un tercer casete de la expresión de gen recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que comprende:
    (a) un elemento de respuesta reconocido por el dominio de unión a ADN del primer polipéptido híbrido;
    (b) un promotor que se activa por el dominio de transactivación del segundo polipéptido híbrido; y
    (c) dicho gen endógeno o heterólogo.
  15. 15. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para uso en la regulación de la expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico en el que dicho compuesto se pone en contacto con un complejo de receptor de ecdisona dentro de las células de dicho sujeto, en el que dichas células contienen adicionalmente una secuencia de unión a ADN para dicho complejo de receptor de ecdisona cuando en combinación con dicho ligando, y en el que la formación de un complejo de secuencia de unión a ADN-ligando-complejo del receptor de ecdisona induce la expresión del gen, en el que se regula la expresión del gen endógeno o heterólogo en un sujeto transgénico.
  16. 16. El compuesto de la reivindicación 15 para uso en la regulación de la expresión del gen heterólogo en un sujeto transgénico, en el que dicho sujeto transgénico comprende un complejo de receptor de ecdisona recombinante capaz de regular la expresión del gen heterólogo.
  17. 17. Un método in vitro para producir un polipéptido que comprende las etapas de:
    (a) seleccionar una célula anfitriona de vertebrado que es sustancialmente insensible a la exposición a un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;
    (b) introducir en la célula anfitriona:
    (i) una construcción de ADN que comprende:
    (a) un gen exógeno que codifica el polipéptido; y
    (b) un elemento de respuesta;
    en el que el gen exógeno está bajo el control del elemento de respuesta; y
    (ii) un complejo de receptor de ecdisona que comprende:
    a) un dominio de unión a ADN que se une al elemento de respuesta;
    b) un dominio de unión para dicho compuesto; y
    c) un dominio de transactivación; y
    (c) exponer la célula a dicho compuesto; en el que se produce un polipéptido.
  18. 18. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 para uso en la modulación de la expresión de un gen 5 exógeno en un sujeto, en el que las células del sujeto comprenden un sistema de modulación de expresión genética.
  19. 19. El compuesto para uso de la reivindicación 18, en el que dicho gen exógeno codifica el IL-12 humano.
    imagen1
    imagen2
    imagen3
    Compuesto
    Lote # Origen Micronizado Análisis
    Enantiómero R
    REH-28-4-2 precipitado de CH3OH/H2O, secado en horno de vacio, luego micronizado Sí Todos los análisis de formulación anterior
    Racemato
    REH-28-9-1 (PYAP-2-8-2-2M) micronizado de PYAP 28-2-2 Sí Todos los análisis de formulación anterior excepto ratón PK
    Racemato
    PYAP 2-8-2-2 Precipitación de CH30H y secado en horno de vacío a 50 °C NO Ratón PK
    Tamaño de partícula (Hm)
    Lectura #1 Lectura #2 Lectura #3 Promedio
    D(V, 0.1)
    11.55 11.32 11.34 11.4
    D (V, 0.5)
    25.26 24.3 25.4 25.0
    D (V, 0.9)
    50.58 47.99 51.62 50.1
    D (V, 0.1): D (V, 0.5) D (V, 0.9)
    distribución en volumen, 10% de las partículas tiene o está por debajo de este tamaño,
    distribución en volumen, 50% de las partículas tiene o está por debajo de este tamaño,
    distribución en volumen, 90% de las partículas tiene o está por debajo de este tamaño.
    Tamaño de partícula (gm)
    Lectura #1 Lectura #2 Lectura #3 Promedio
    D (V, 0.1)
    10.21 9.99 9.96 10.1
    D (V, 0.5)
    38.4 36.0 35.4 36.6
    D (V, 0.9)
    89.58 82.15 80.31 84.0
    D (V, 0.1): distribución en volumen, 10% de las partículas tiene o está por debajo de este tamaño. D (V, 0.5) distribución en volumen. 50% de las partículas tiene o está por debajo de este tamaño. D (V, 0.9) distribución en volumen, 90% de las partículas tiene o está por debajo de este tamaña.
    Material
    Densidad evidente (g/mL> Densidad de compactación (g/mL) Densidad real (g/mL)
    Enantiómero R
    0.149 0.175 1.1647
    Racemato
    0.193 0.210 1.1522
    imagen4
    i I I 1 ? 3 1 1 ! I I
    T' ’í T T
    ww
    Racemato Enantiómero R
    Excipiente
    Color/ viscosidad Proveedor Ligando Concentración
    25 mg/g
    5 mg/g 10 mg/g 15 mg/g 20 mg/g 30 mg/g 50 mg/g
    Labras dI
    □aro/fluido Gattefossó Enantiómcro R soluble soluble soluble
    Racemato
    soluble Mayormente soluble, opaco msoluble
    Lauragliccl 90
    □aro/fluido Gattefossó Enantiómero R soluble soluble soluble soluble soluble
    Racemato
    soluble soluble soluble Suspensión parcialmente soluble insoluble
    Phosal 53 MCT
    Amanllo/viscoso Phospholipid GmbH Enantiómcro R Mayormente soluble parcialmente soluble
    Racemato
    insabible insoluble
    Migliol
    □aro/fluido Sasol Enantiómcro R soluble soluble
    Racemato
    parcialmente soluble msoluble
    Cremofor EL
    □aro/viscoso BASF Enantiómero R Mayormente soluble Mayormente soluble Mayormente soluble
    Racemato
    insoluble insabible insoluble
    Palissrbatc 80
    □aro/fluido Cruda Enantiómcro R parcialmente soluble msoluble
    Racemato
    Suspensión parcialmente soluble msolublc
    Crillet IHP
    Amarillo/ viscoso Cruda Enantiómero R soluble soluble
    Racemato
    parcialmente soluble msoluble
    Minstato de isopropila
    □aro/fluido Cruda Enantiómero R soluble soluble
    Racemato
    Suspensión parcialmente soluble msoluble
    Ácido oieico
    □aro/fluido TO Enantiómero R soluble soluble
    Racemato
    Suspensión Suspensión parcialmente soluble
    PEG400NF
    □aro/fluido Cruda Enantiómero R soluble parcialmente soluble
    Racemato
    Suspensión parcialmente soluble insabible
    Excipiente
    Proveedor Ligando Conc. mg/g Apariencia
    Tratamiento 1
    Tratamiento 2 Comentarios
    Labrasol (triglicérido capricocaprilico PEG-8)
    Gattefossé Enantiómero R 15 transparente transparente
    Racemato
    15 Ligeramente precipitado Precipitado 48 (h)
    Lauroglicol 90 (Monolaurato de propilenglico!)
    Gattefossé Enantiómero R 50 transparente transparente
    Racemato
    50 Preci pitado Precipitado 48 (h)
    Phosal 53 MCT
    Phospholipid GmbH Enantiómero R 10 transparente transparente
    Racemato
    10 Precipitado Precipitado
    Migliol
    Sasol Enantiómero R 15 transparente transparente
    Racemato
    15 Precipitado Precipitado
    Cremofor EL
    BASF Enantiómero R 25 transparente transparente
    Racemato
    25 transparente Ligeramente precipitado (tratamiento 2) 90 °C durante 10 min
    Polisorbato 80
    Croda Enantiómero R 10 Ligeramente precipitado Ligeramente precipitado (tratamiento 2) 90 °C durante 25 min
    Racemato
    10 Precipitado Ligeramente precipitado (tratamiento 2) 90 °C durante 25 min
    Crillet 1HP (Polisorbato 80)
    Croda Enantiómero R 10 transparente transparente
    Racemato
    10 Precipitado transparente (tratamiento 2) 90 °C durante 15 min
    Miristato de ¡sopropilo
    Croda Enantiómero R 15 transparente transparente
    Racemato
    15 Precipitado Precipitado
    Acido oleico
    TCI Enantiómero R 15 Precipitado traslúcidoJmuy ligero Precipitado traslúcido/muy ligero
    Racemato
    15 Precipitado Precipitado
    PEG 400 NF
    Croda Enantiómero R 10 transparente transparente
    Racemato
    10 Precipitado Precipitado
    Solubilidad (uM)
    PEG 1000 al 20% en agua destilada. pH 7.0
    Filtración Centrifugación
    Racemato
    <0.1 1.35
    Enantiómero R
    0.32 7.53
    Enantiómero R Racemato
    Solvente
    Solubilidad (mg/g) PH Solubilidad (mg/g) PH
    Agua Di
    0.03 6.70 0.1 4.03
    Polisorbato 80 al 0.5%
    2.9 6.33 2.8 4.23
    Pollsorbato 80 al 1.0%
    12.3 5.84 4.7 4.39
    Polisorbato 80 al 1.5%
    9.3 5.41 4.5 4.41
    Permeabilidad Caco-2
    Material
    % Recuperación Papp (X10-6 cm/s) Eflujo Clasificación de permeabilidad* eflujo significativo
    A-B
    B-A A-B B-A
    Racemato
    24 47 1.31 3.42 2.6 Alto No
    Enantiómero R
    19 48 12.4 19.1 1.5 Alto No
    Permeabilidad MDR1-MDCK
    Material
    % Recuperación Papp (X10-6 cm/s) Eflujo Clasificación de penetración de cerebro
    A-B
    B-A A-B B-A
    Racemato
    26 46 0.77 6.90 9.0 Bajo
    Enantiómero R
    21 50 9.60 37.5 3.9 Moderado
    Estabilidad Metabólica humana
    Material
    % restante
    0 min
    15 min 60 min
    Racemato
    100 - 21
    Enantiómero R
    100 28
    testosterona
    100 21 "
    Grupo
    Ruta Artículo de prueba Dosis (mg/kg/día) Volumen de dosis (mL/kg/día) Concentración (mg/mL) Hembras3
    1
    Oral Enantlómero R 3 2.5 1.2 36 + 2b
    2
    Oral Enantiómero R 10 2.5 4 36 + 2b
    3
    Oral Enantlómero R 30 2.5 12 36 + 2b
    4
    Oral Enantlómero R 50 2.5 20 36 + 2b
    5
    Oral Racemato 3 2.5 1.2 36 + 2b
    6
    Oral Racemato 10 2.5 4 36 + 2b
    7
    Oral Racemato 30 2.5 12 36 + 2b
    8
    Oral Racemato 50 2.5 20 36 + 2b
    aLa administración de la dosis ocurrirá durante 9 días (primeras 18 hembras/grupo) o 12 días (segundas 18 hembras/grupo) incluido como posibles reemplazos
    imagen5
    imagen6
    Jww
    3 mg/kg/día j jl * de enantiómern R
    -J
    / / \ \ 10 mg/kg/día ! / \ * de enantiómero R ! / \ \ • * \ \ 30 ma/ka/día
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    / / V i de enantiómero R • \ \ --#-50 mg/kg/día / > \ \ de enantiómero R • f' ...............m ..................
    / / "y —o— 3 mg/kg/día i í #\ de racemato / # 'V **<3- 10 mg/kg/día
    T7 ^ ..........\ de racemato \í .........D ‘-30 mg/kg/día / ~ - -‘UR^niN. V de racemato * ñ ni-....... ............X _ ................................................................
    0 1 2 4 8 24 de racemato Día 9 - Horas
    imagen7
    3 mg/kg/d¡a de enantiómero R 10 mg/kg/dia de enantiómero R
    30 mg/kg/día de enantiómero R -#• 50 mg/kg/día
    de enantiómero R -o—3 mg/kg/dia de racemato
    -O- 10 mg/kg/día de racemato —&— 30 mg/kg/dia de racemato -O- 50 mg/kg/dia de racemato
    imagen8
    imagen9
    imagen10
    136
    RTS-IL-12
    imagen11
    Enantiómero R
    imagen12
    Control Tu -I
    imagen13
    137
    Enantiómero R
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    DI
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    imagen18
    138
ES08754763.4T 2007-05-29 2008-05-29 Ligandos de diacilhidrazina quirales para modular la expresión genética exógena a través del complejo del receptor de ecdisona Active ES2672513T3 (es)

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