KR20200095462A - Hbb 유전자 기능 회복을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Hbb 유전자 기능 회복을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20200095462A
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카메하메하 케이. 웡
마르와 벤하지살라
로라 제인 스미스
알버트 반스 시무어
제이슨 보케 라이트
제임스 안토니 맥위겐
세레나 니콜 돌라이브
마틴 티아 바보발 세인트
제이미 프라우트
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시티 오브 호프
호몰로지 메디슨, 인크.
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Abstract

베타 글로빈 유전자(HBB) 유전자에서 돌연변이를 교정하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 조성물 및 이를 사용하여 세포에서 HBB 유전자 돌연변이를 교정하는 방법이 본원에 제공된다. 또한 아데노-연관 바이러스 조성물 제조용 패키징 시스템이 제공된다.

Description

HBB 유전자 기능 회복을 위한 아데노-연관 바이러스 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원의 교차 참조
이 출원은 2017년 10월 18일자로 출원된 미국 임시 출원 제62/574,163호; 및 2018년 1월 24일자로 출원된 미국 임시 출원 제62/621, 102호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
서열 목록
본 출원은 606107_HMT-023PC_Sequence_Listing_ST25.txt라는 ASCII 형식으로 2018년 10월 12일자로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 크기는 200,630 바이트이다. 서열 목록은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
정부 이익의 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인 번호 제P30CA033572호 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
혈색소병증은 헤모글로빈 단백질의 생산, 구조 및/또는 기능이 비정상인 유전적 장애의 패밀리(family)를 포함한다. 헤모글로빈 단백질은 적혈구의 건조 중량의 대략 97 %를 구성하며 혈액의 산소 운반 능력을 약 70 배 증가시킨다. 주요 성인 헤모글로빈 단백질은 2개의 알파 글로빈(HBA) 서브유닛, 2개의 베타 글로빈(HBB) 서브유닛, 및 각 서브유닛과 연관된 헴(heme) 그룹으로 구성된다. 염색체 11에 대한 HBB의 유전적 결함은 겸상세포질환(SCD: sickle cell disease) 및 베타 지중해빈혈증과 같은 특정 혈색소병증을 유발할 수 있다.
겸상세포빈혈이라고도 하는 겸상세포질환은 대략 100,000 명의 미국인에게 영향을 미치는 상염색체 열성 질환이다. 이는 아프리카계 미국인들 사이에서 널리 퍼져 있지만 다른 인종 그룹에도 존재한다. 서부 및 중앙 아프리카에서는 모든 아기의 1 내지 2%가 SCD에 걸린 채 태어난다. SCD는 HBB의 코딩 서열에서 뉴클레오티드 20에서 동형 접합 돌연변이에 의해 야기된다. 이 돌연변이는 음으로 하전된 아미노산 글루타메이트(GAG에 의해 코딩됨)를 성숙한 베타 글로빈의 6 번째 아미노산에서 중성, 소수성 잔기 발린(GUG에 의해 인코딩됨)으로 대체한다. SCD 돌연변이를 갖는 베타 글로빈 사슬을 함유하는 헤모글로빈은 적혈구의 모양을 왜곡하는 다가닥 중합체로 응집되는 경향이 있어서, 이들 세포를 부서지기 쉽고 초승달 또는 겸상같은 형상이 되도록 한다. 이러한 비정상적 적혈구는 용혈을 위해 더 많이 배치되며 조직과 기관에 더 적은 산소를 전달한다. 더욱이, 헤모글로빈 응집은 적혈구를 강성이 되도록 하고 작은 혈관에 용이하게 유지시켜 혈류를 감소시키고 혈관 폐색을 야기한다. 그 결과, SCD 환자는 빈혈과 "위기"라고 불리는 통증 단계(episode)를 겪으며, 위기 동안의 기관 손상은 SCD와 연관된 사망률 및 이환율의 주요 원인이다. 특히, 뼈, 비장, 신장 및 폐의 경색(즉, 부족한 혈액 공급으로 인한 조직의 괴사)이 특히 일반적이다. 이에 반하여, 겸상세포 돌연변이에 대해 이형 접합 성인들은 대체로 무증상이다.
베타 지중해빈혈증은 전 세계 10 만 명 중 약 1 명과 유럽 연합의 1 만 명 중 약 1 명에 영향을 미친다. 베타 지중해빈혈증은 HBB에서 베타 글로빈의 발현을 감소시키는 다양한 돌연변이에 의해 유발된 장애 그룹이다. 지금까지, 치환, 삽입 및 결실을 포함한 884 개의 상이한 돌연변이가 베타 지중해빈혈증(HbVar 데이터베이스)에서 확인되었다. 이러한 돌연변이는 HBB의 게놈 유전자좌 전체에 위치된다. 치환, 삽입 및 작은 결실 중에서, 병원성 변이체는 5' UTR의 상류 및 3' UTR로 발견되었다. 이들 공지된 884 개 돌연변이 이외에, 추가의 변이체는 HBB 서열의 특정 변이와 연계할 때만 병원성일 수 있다. 베타 지중해빈혈증 돌연변이는 유전자 전사, RNA 가공, 전사 후 변형, mRNA의 번역 등에 영향을 줄 수 있다. 베타 지중해빈혈증은 중증도에서 매우 가변적이며, 일부 HBB 돌연변이는 베타 글로빈 생산의 완전한 손실을 초래하며 기타 HBB 돌연변이는 베타 글로빈 양의 감소만 초래한다. 두 대립 유전자 모두에서 종종 HBB 돌연변이를 갖는 중증의 베타 지중해빈혈증(즉, 중증성 지중해빈혈증)을 갖는 환자는 빈혈, 성장 지연 및 비정상적인 기관 발달을 겪는다. 경증 내지 중등도의 베타 지중해빈혈증(즉, 경증성 지중해빈혈증 또는 중간성 지중해빈혈증)이 있는 환자는 덜 심각한 증상을 나타낸다.
혈색소병증은 만성 수혈을 필요로 하는 SCD 및 베타 지중해빈혈증으로 수혈 및 지지 치료로 관리될 수 있다. 그러나, 수혈을 반복하면 철분 과부하가 발생하고 합병증의 발생률을 줄이기 위해 철 킬레이션 요법이 필요하다. SCD 및 베타 지중해빈혈증의 이환율 및 사망률은 SCD에 대해 현재까지 FDA 승인된 유일한 약물인 하이드록시우레아에 의해 약화될 수 있다. 그러나, 이 치료는 처방률이 낮고 규정 준수가 좋지 않기 때문에 널리 사용되지 않는다.
SCD 또는 베타 지중해빈혈증을 치료하기 위해, 환자는 적절하게 발현될 수 있는 기능적 베타 헤모글로빈의 적어도 하나의 카피를 보유하는 조혈 줄기 세포를 받을 필요가 있다. 하나의 접근법은 골수 이식을 통해 동종이계 공여체로부터 야생형 조혈 줄기 세포를 얻는 것이다. 그러나, 일치하는 공여체의 이용 가능성은 주요 제한 요소이며, 골수 이식은 종종 5 내지 10%의 사망률을 초래하는 심각한 합병증과 연관이 있다. 보다 최근에, 유전자 요법 접근법은 생체 외(ex vivo)에서 베타 글로빈 발현 폴리 뉴클레오티드를 환자로부터 단리된 돌연변이 조혈 줄기 세포 내로 도입하기 위해 사용되어 왔다.
현재까지, 모든 HBB 유전자 요법 임상 시험은 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터의 사용을 수반하였다. 그러나, 레트로바이러스-기반 유전자 요법은 많은 안전성 및 효능 우려를 제기한다. 예를 들어, 인간 게놈 내로의 레트로바이러스 벡터의 삽입은 표적화되지 않기 때문에, 벡터가 종양 억제 유전자를 파괴하거나 종양 유전자를 활성화시켜 악성 종양을 유발할 위험이 있다. 실제로, 감마레트로바이러스 벡터로 CD34+ 골수 전구체를 형질도입함으로써 X-연결된 중증 복합 면역 결핍(SCID)을 치료하기 위한 임상 시험에서, 10 명의 환자 중 4 명은 백혈병으로 발전했다(문헌[Hacein-Bey-Abina et al., J Clin Invest. (2008) 118(9):3132-42]). 더욱이, 이러한 안전성 우려로 인해, 렌티바이러스 유전자 요법은 생체 외에서만 수행될 수 있다. 생체 외 치료를 위해 대상체로부터 추출될 수 있는 조혈 줄기 세포의 수는 대상체에 존재하는 것의 작은 분율에 불과하고 생체 외에서 조혈 줄기 세포를 확장시키기 위해 현재 임상적으로 사용되는 신뢰할 수 있는 방법이 없기 때문에, 이러한 생체 외 사용은 요법의 효능을 감소시킨다.
또한 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc finger nuclease), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN: transcription activator-like effector nuclease), 및 클러스터된, 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복(CRISPR: short palindromic repeat) 기술과 같은 뉴클레아제 기반 유전자 편집 기술은 SCD 및 베타 지중해빈혈증 환자에서 HBB 유전자의 결함을 교정하는 데 사용된다고 추측되었다. 그러나, 이들 기술의 각각은 의도된 표적 부위와 순차적으로 유사한 인간 게놈에서 부위의 비표적 돌연변이(off-target mutation)에 대한 가능성으로 인해 안전성 우려를 제기한다.
따라서, 당업계에는 SCD 및 베타 지중해빈혈증 환자에서 HBB 유전자 기능을 효율적이고 안전하게 회복할 수 있는 개선된 유전자 요법 조성물 및 방법에 대한 요구가 존재한다.
HBB 유전자에서 돌연변이를 교정하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 조성물 및 이를 사용하여 세포에서 HBB 유전자 돌연변이를 교정하는 방법이 본원에 제공된다. 또한 아데노-연관 바이러스 조성물 제조용 패키징(packaging) 시스템이 제공된다.
본원에 개시된 AAV 조성물 및 방법은 외인성 뉴클레아제(예를 들어, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 뉴클레아제(TALEN: transcriptional activator-like nuclease), 또는 Cas9와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제(RNA-guided nuclease))를 사용하여 게놈 DNA를 절단할 필요없이 생체 내 HBB 유전자에서 돌연변이의 매우 효율적인 교정을 허용한다는 점에서 특히 유리하다.
따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은 (a) AAV Clade F 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드, 및 (b) (i) 표적 유전자에서 표적 좌위 편집용 편집 요소, (ii) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암(arm) 뉴클레오티드 서열 5', 및 (iii) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3'을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 복제-결함 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus)를 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 세포 내의 베타 글로빈(HBB) 유전자에서 돌연변이의 교정 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 (a) AAV Clade F 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드, 및 (b) (i) 표적 유전자에서 표적 좌위 편집용 편집 요소; (ii) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 5'; 및 (iii) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3'을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 복제-결함 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus)로 형질도입하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 공동-형질도입하거나 공동-투여하지 않고 형질도입되는, 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 세포는 다능성 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 조혈 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 포유류 대상체 내에 있으며, 상기 AAV는 상기 대상체에서 상기 세포를 형질도입하는 데 유효한 양으로 상기 대상체에게 투여된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법에서, 상기 방법은 (a) 생체 외에서 상기 대상체로부터 적혈구 전구 세포에 AAV Clade F 캡시드 단백질; 및 (i) 표적 유전자에서 표적 좌위 편집용 편집 요소; (ii) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 5'; 및 (iii) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3'을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 복제-결함 AAV로 형질도입하는 단계; 및 (b) 상기 형질도입된 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 공동-형질도입하거나 공동-투여하지 않고 형질도입되는, 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구 세포는 다능성 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구 세포는 조혈 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포이다.
다른 양태에서, 본 발명은 HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 (a) AAV Clade F 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드, 및 (b) (i) 표적 유전자에서 표적 좌위 편집용 편집 요소; (ii) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 5'; 및 (iii) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3'을 포함하는 교정 게놈을 포함하는 복제-결함 AAV의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 공동-형질도입하거나 공동-투여하지 않고 형질도입되는, 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 질환 또는 장애는 지중해빈혈증 또는 겸상세포질환이다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 인간 대상체이다.
하기 실시형태는 상기 양태들 각각에 적용된다.
특정 실시형태에서, 상기 표적 유전자는 상기 HBB 유전자이다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 상기 HBB 유전자에서 뉴클레오티드 점 돌연변이 또는 결실에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 HBB 유전자에서 상기 뉴클레오티드 점 돌연변이 또는 결실은 위치 -87에서 G, 위치 -31에서 G, 위치 -30에서 A, 위치 -29에서 G, 위치 -28에서 G, 위치 -10에서 T, 위치 1에서 C, 위치 1에서 A, 위치 2에서 G, 위치 17 및 18에서 C 및 T의 결실, 위치 19에서 A, 위치 20에서 A의 결실, 위치 20에서 T, 위치 25 및 26에서 A 및 A의 결실, 위치 26 이후 G의 추가, 위치 47에서 A, 위치 48에서 A, 위치 51에서 C의 결실, 위치 52에서 A, 위치 58에서 G, 위치 59에서 G, 위치 79에서 A, 위치 82에서 T, 위치 84 이후 C의 추가, 위치 93에서 T, 위치 93에서 A, 위치 97에서 C, 위치 98에서 C, 위치 202에서 G, 위치 208에서 G, 위치 222에서 C, 위치 241 또는 242에서 T의 결실, 위치 254 내지 257에서 T 및 T 및 C 및 T의 결실, 위치 260에서 T, 위치 264 또는 265에서 C의 결실, 위치 343 이후 A의 추가, 위치 399 및 400에서 G 및 T의 결실, 위치 401에서 T, 위치 417 이후 A의 추가, 위치 446에서 A, 위치 1099에서 T, 위치 1293에서 A, 1344에서 T로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 돌연변이에 상응하는 야생형 HBB 유전자의 일부를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자의 하나 이상의 엑손의 코딩 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자의 하나 이상의 엑손의 코딩 영역으로 구성된다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 엑손 1의 코딩 영역, 전체 인트론 1, 전체 엑손 2, 전체 인트론 2, 및 엑손 3의 코딩 영역을 포함하는 HBB 유전자의 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 코딩 영역은 상기 야생형 HBB 유전자의 상응하는 엑손에 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만으로 동일하게 침묵(silently) 변경된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 43 내지 46 및 105 내지 107로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 AAVS1이다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 상기 HBB 유전자 또는 이의 일부의 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 4 내지 444로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 4 내지 444에 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 미만으로 동일하게 침묵 변경된다. 특정 실시형태에서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 47 또는 100의 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 상기 HBB 유전자의 스터퍼(stuffer)-삽입된 코딩 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 뉴클레오티드 3 및 뉴클레오티드 4 사이의 뉴클레오티드간 결합이며, 이에 의하여 상기 표적 좌위에의 상기 편집 요소의 통합으로 인해 상기 표적 유전자의 시작 코돈으로 시작하는 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하는 상기 표적 좌위를 생성하게 된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 시작 코돈 및 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열, 또는 상기 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 인트론 내에 있으며, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 스플라이스 수용체 부위, 리보솜 스키핑 요소(ribosomal skipping element), 및 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 상기 HBB 유전자의 인트론 1 내에 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 코딩 뉴클레오티드에 인접하여 3'이고, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 리보솜 스키핑 요소 및 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 야생형 표적 유전자(예를 들어, HBB 유전자) 또는 돌연변이체 표적 유전자(예를 들어, HBB 유전자)의 상응하는 뉴클레오티드의 정지 코돈이다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 야생형 표적 유전자(예를 들어, HBB 유전자) 또는 돌연변이체 표적 유전자(예를 들어, HBB 유전자)의 상응하는 뉴클레오티드의 정지 코돈에 인접하여 5'이다.
특정 실시형태에서, 상기 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열은 상기 제1 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 실시형태에서, 상기 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열은 상기 제2 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 게놈 영역은 제1 편집창(editing window)에 위치되며, 상기 제2 게놈 영역은 제2 편집창에 위치된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 편집창들은 상이하다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 편집창들은 동일하다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 편집창은 서열 번호: 101, 102, 또는 103에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 편집창은 서열 번호: 101, 102, 또는 103에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 게놈 영역은 서열 번호: 101에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 게놈 영역은 서열 번호: 102에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 상동성 암은 서열 번호: 101에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 3' 상동성 암은 서열 번호: 102에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 외인성 폴리아데닐화 서열 3'을 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 상기 표적 유전자에 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 23 내지 28 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 5' 및 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 각각은 독립적으로 약 100 내지 약 2000 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 상기 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 5' 반전된(inverted) 말단 반복(5' ITR) 뉴클레오티드 서열 5', 및 상기 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 3' 반전된 말단 반복(3' ITR) 뉴클레오티드 서열 3'을 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 18과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 19와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 20과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 21과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 29 내지 42 및 104 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 선택적으로: 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다.
특정 실시형태에서, (a) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며; (b) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며; (c) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; (d) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는 (e) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이다.
특정 실시형태에서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203 내지 736의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 선택적으로: 서열 번호: 2의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 D이고; 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다.
특정 실시형태에서, (a) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며; (b) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며; (c) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; (d) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는 (e) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이다.
특정 실시형태에서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 선택적으로: 서열 번호: 2의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 T이고; 서열 번호: 2의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 68에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 V이고; 서열 번호: 2의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 L이고; 서열 번호: 2의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 D이고; 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다.
특정 실시형태에서, (a) 서열 번호: 2의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 T이고, 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이며; (b) 서열 번호: 2의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Y이며; (c) 서열 번호: 2의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이며; (d) 서열 번호: 2의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 L이고, 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이며; (e) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며; (f) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며; (g) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; (h) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는 (i) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이다.
특정 실시형태에서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합 효율은 적어도 1%이다. 특정 실시형태에서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합의 대립 유전자 빈도는 적어도 0.5%이다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같이 AAV를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 AAV의 재조합 제조용 패키징 시스템으로서, 상기 패키징 시스템은: (a) 하나 이상의 AAV Rep 단백질을 인코딩하는 Rep 뉴클레오티드 서열, (b) 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 AAV Clade F 캡시드 단백질을 인코딩하는 Cap 뉴클레오티드 서열, 및 (c) 본원에 개시된 바와 같이 교정 게놈을 포함하며, 상기 패키징 시스템은 상기 캡시드 내에 상기 교정 게놈을 봉입하기 위한 세포 내에서 작용하여 상기 AAV를 형성하는 것인, 패키징 시스템을 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 패키징 시스템은 상기 Rep 뉴클레오티드 서열 및 상기 Cap 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터, 및 상기 교정 게놈을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 Rep 뉴클레오티드 서열은 AAV2 Rep 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV2 Rep 단백질은 78/68 또는 Rep 68/52이다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV2 Rep 단백질은 서열 번호: 22의 AAV2 Rep 아미노산 서열과 최소 퍼센트 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 최소 퍼센트 서열 동일성은 상기 AAV2 Rep 단백질을 인코딩하는 아미노산 서열의 길이에 걸쳐 적어도 70%이다.
특정 실시형태에서, 상기 패키징 시스템은 제3 벡터를 더 포함하며, 상기 제3 벡터는 헬퍼(helper) 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 상기 헬퍼 바이러스 벡터는 독립적 제3 벡터이다. 특정 실시형태에서, 상기 헬퍼 바이러스 벡터는 상기 제1 벡터와 통합된다. 특정 실시형태에서, 상기 헬퍼 바이러스 벡터는 상기 제2 벡터와 통합된다. 특정 실시형태에서, 상기 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 및 거대세포바이러스(CMV: cytomegalovirus)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스이다. 특정 실시형태에서, 상기 아데노바이러스 게놈은 El, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아데노바이러스 RNA 유전자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 헬퍼 바이러스는 헤르페스 단순 바이러스(HSV: herpes simplex virus)이다. 특정 실시형태에서, 상기 HSV 게놈은 UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HSV 유전자를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 제1 벡터 및 상기 제3 벡터는 제1 형질감염 플라스미드 내에 함유된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터의 뉴클레오티드는 제2 형질감염 플라스미드 내에 함유된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 벡터 및 상기 제3 벡터의 뉴클레오티드는 재조합 헬퍼 바이러스로 클로닝된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터의 뉴클레오티드는 재조합 헬퍼 바이러스로 클로닝된다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 AAV의 재조합 제조방법으로서, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 패키징 시스템을 캡시드 내에 교정 게놈을 봉입하기 위해 작용하는 조건 하에서 세포 내로 도입하여 상기 AAV를 형성하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
도 1a 및 1b는 AAVS1-FP가 GM16265 세포의 게놈으로 통합된 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이며, AAVS1-FP 벡터는 AAVHSC7, AAVHSC15, 및 AAVHSC17에 패키지되어 있다.
도 1c는 AAVHSC17 캡시드에 패키지된 AAVS1-FP 벡터로 형질도입된 1차 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC: hematopoietic stem cell)에서 FP 코딩 서열의 통합을 갖는 대립 유전자의 백분율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 12 bp 링커를 함유하는 HBB 교정 벡터 hHBB-hL-014의 플라스미드 맵을 도시하고 있다. 이 도면에서, HBB의 흑색 영역은 인간 HBB 단백질을 인코딩하는 엑손에서의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 흑색 영역 사이의 점선은 엑손 사이의 인트론을 나타낸다.
도 3a는 AAVHSC15 및 AAVHSC17 캡시드에 패키지된 hHBB-hL-014 벡터로 형질도입된 GM16265 세포의 게놈 DNA로부터 증폭된 DNA의 편집-특이적 크기를 나타내는 DNA 전기영동의 이미지이다.
도 3b는 AAVHSC17 캡시드에 패키지된 hHBB-hL-014 벡터로 형질도입된 GM16265, GM16266 및 GM16267 LCL의 게놈 DNA로부터 증폭된 DNA의 편집-특이적 크기를 보여주는 DNA 전기영동의 이미지이다.
도 4a, 4b, 4c, 및 4d는 각각 HBB 교정 벡터 hHBB-hL-001, hHBB-h1W-013, hHBB-hL-011 및 hHBB-h1W-012의 2개의 AAV ITR 사이의 유전적 요소를 보여주는 벡터 맵이다. 이들 도면에서, HBB의 흑색 영역은 인간 HBB 단백질을 인코딩하는 엑손에서의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 흑색 영역 사이의 점선은 엑손 사이의 인트론을 나타낸다.
도 5a, 5b 및 5c는 AAVHSC17 캡시드에 패키지된 도면에 표시된 벡터로 형질도입된 1차 인간 CD34+ HSC의 게놈 DNA로부터 증폭된 DNA의 편집-특이적 크기를 나타내는 DNA 전기영동의 이미지이다.
도 6은 표시된 바와 같이 샘플에 걸쳐 편집된 CD34+ 세포의 분율을 나타내는 그래프이다.
도 7a, 7b, 7c, 7d, 및 7e는 각각 HBB 교정 벡터 hHBB-hA-009, hHBB-hAW-002, hHBB-h1-010, hHBB-h1W-008, 및 hHBB-hE3C-001의 2개의 AAV ITR 사이의 유전적 요소를 보여주는 벡터 맵이다. 도 7a 내지 7d에서, "HBB 코딩 영역" 또는 "HBB 코딩 영역(66%)"으로 표지된 흑색 영역은 시작 코돈에서 정지 코돈까지(도 7c 및 7d) 또는 제2 코돈에서 정지 코돈까지(도 7 및 7b) 인간 HBB 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 8은 AAVHSC7 캡시드에 패키지된 도면에 표시된 벡터로 형질도입된 RKO 및 GM16265 LCL 세포의 게놈 DNA로부터 증폭된 DNA의 편집-특이적 크기(1,874 bp) 및 비특이적 크기(1,180 bp)를 보여주는 DNA 전기영동의 이미지이다.
도 9는 AAVHSC7 및 AAVHSC17 캡시드에 패키지된 AAVS1-FP 벡터의 투여 후 인간 HSC로 이종 이식된 NSG 마우스로부터의 혈액, 골수("BM"), 및 비장 세포에서 FP 코딩 서열의 통합을 갖는 대립 유전자의 백분율을 나타내는 그래프이다.
본 개시내용은 HBB 유전자에서 돌연변이 교정용 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 조성물 및 이를 사용하여 세포에서 HBB 유전자 돌연변이를 교정하는 방법을 제공한다. 또한 아데노-연관 바이러스 조성물 제조용 패키징 시스템이 제공된다.
I. 정의
본원에 사용된 용어 "복제-결함 아데노-연관 바이러스"는 Rep 및 Cap 유전자가 없는 게놈을 포함하는 AAV를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "HBB 유전자"는 HBB 유전자의 코딩 영역, 엑손, 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 및 전사 조절 영역을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 야생형 또는 돌연변이 인간 베타 글로빈 유전자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "HBB 유전자에서 돌연변이를 교정하는 것"은 야생형 HBB 단백질 또는 이의 기능적 등가물을 발현할 수 있는 좌위를 생성하기 위하여 표적 유전자(예를 들어, 돌연변이체 HBB 유전자)의 표적 좌위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "HBB 유전자에서 돌연변이를 교정하는 것"은 HBB 유전자에서 돌연변이를 야생형 서열로 되돌리는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, "HBB 유전자에서 돌연변이를 교정하는 것"은 야생형 베타 글로빈 단백질 또는 이의 기능적 등가물이 선택적으로는 외인성 표적 유전자 프로모터(예를 들어, HBB 유전자 프로모터)의 제어 하에서 표적 유전자의 좌위(예를 들어, 돌연변이체 HBB 유전자 좌위)로부터 발현되도록, 야생형 베타 글로빈 단백질 또는 이의 기능적 등가물의 적어도 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 표적 유전자(예를 들어, 돌연변이체 HBB 유전자)에 삽입하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 "기능적 등가물"은 야생형 베타 글로빈으로서 기능할 수 있는 유전자 또는 이의 단편의 생성물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, HBB의 기능적 등가물은 엡실론 글로빈(HBE), 델타 글로빈(HBD), 감마 글로빈 1(HBG1), 감마 글로빈 2(HBG2) 및 HBB 유사 유전자(pseudogene) HBBP와 같은 다른 글로빈 유전자 또는 유사 유전자를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, HBB의 기능적 등가물은 변형된 베타 글로빈 단백질일 수 있으며, 변형은 야생형 베타 글로빈에서 발견되지 않은 적어도 하나의 특성, 예를 들어 SCD 돌연변이를 보유한 베타 글로빈의 응집을 억제하는 능력을 부여한다.
본원에 사용된 용어 "교정 게놈"은 상동 재조합을 통해 편집 요소(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 결합)를 표적 좌위에 통합하여 HBB 유전자에서 유전적 결함을 교정할 수 있는 재조합 AAV 게놈을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 인간 HBB 유전자에 있다. 당업자는 5' 상동성 암, 편집 요소, 및 3' 상동성 암을 포함하는 교정 게놈의 일부가 표적 좌위(예를 들어, 인간 HBB 유전자)에 대해 센스 또는 안티센스 배향일 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 용어 "편집 요소"는 표적 좌위에 통합될 때 표적 좌위를 변형시키는 교정 게놈의 일부를 지칭한다. 편집 요소는 표적 좌위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표적 좌위"는 편집 요소에 의해 변형된 염색체 또는 뉴클레오티드 간 결합의 영역을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 HBB 유전자에서 영역 또는 뉴클레오티드 간 결합이며, 선택적으로, 상기 표적 좌위는 베타 글로빈 단백질의 발현 또는 기능을 손상시키는 적어도 하나의 유전적 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 AAVS1이다. 상기 AAVS1 좌위는 문헌[Giraud et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1994) 91(21): 10039-43]; 문헌[Linden et al, Proc Natl Acad Sci U S A. (1996) 93(21): 11288-94]; 및 문헌[Linden et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (1996) 93(15):7966-72]에 기재된 바와 같이, NCBI 참조 서열 번호 NC_000019.10의 뉴클레오티드 55,090,913 내지 55,117,600인 염색체 19 qter13.3-13.4 상에 있으며, 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 안전한 항구(safe harbor) 좌위이다. 안전한 항구 좌위는 새로 삽입된 유전자 물질이: (1) 예측 가능하게 기능하고; 그리고 (2) 숙주 세포 또는 유기체에 위험을 초래할 수 있는 숙주 게놈의 변경을 유발하지 않아야 하도록 보장하는 방식으로 새로운 유전자 물질의 통합을 수용할 수 있는 게놈의 부위이다. 따라서, 특정 실시형태에서, 표적 좌위는 숙주 게놈과의 원하지 않는 상호 작용의 위험을 최소화하면서 예측 가능한 전이유전자(transgene) 발현을 지원할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 안전한 항구 좌위일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표적 유전자"는 표적 좌위 또는 이의 일부가 위치하는 유전자를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 표적 유전자에 완전히 존재한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 유전자는 HBB이다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 유전자는 인간 PPP1R12C이다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 유전자는 적혈구 전구세포에서 발현된다.
본원에 사용된 용어 "상동성 암"은 표적 좌위 측면에 있는 게놈과 실질적으로 동일한 편집 요소의 5' 또는 3'에 위치된 교정 게놈의 일부를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 인간 HBB 유전자에 있고, 상기 상동성 암은 표적 좌위 측면에 있는 게놈과 실질적으로 동일한 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Clade F 캡시드 단백질"은 본원에서 서열 번호: 1의 아미노산 1 내지 736, 138 내지 736, 및 203 내지 736에서 각각 기재된 VP1, VP2, 또는 VP3 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 AAV VP1, VP2, 또는 VP3 캡시드 단백질을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 정렬된 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수를 길이가 더 긴 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 전장으로 나눈 것에 의해 결정된다.
본원에 사용된 용어 "HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애"는 HBB 유전자의 변이에 의해 야기되거나, 악화되거나, 또는 유전적으로 연결된 임의의 질환 또는 장애를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상기 HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애는 겸상세포질환 또는 베타 지중해빈혈증과 같은 혈색소병증이다.
본원에서 사용되는 용어 "침묵 변경된"은 코딩 서열 또는 스태퍼(staffer)-삽입된 코딩 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않고 유전자의 코딩 서열 또는 스태퍼-삽입된 코딩 서열의 변형(예를 들어, 뉴클레오티드 치환에 의한)을 지칭한다. 이러한 침묵(silent) 변경은 표적 유전자와 파라성(paralogous)인 다른 유전자 또는 유사 유전자의 좌위(예를 들어, 다른 글로빈 유전자 좌위 또는 베타 글로빈 유사 유전자 좌위) 내로의 교정 게놈의 통합 가능성을 감소시킨다는 점에서 유리하다. 이러한 침묵 변경은 또한 편집 요소와 표적 유전자 사이의 상동성을 감소시켜, 상동성 암보다는 편집 요소에 의해 매개되는 바람직하지 않은 통합을 감소시킨다.
본원에 사용된 용어 "코딩 서열"은 시작 코돈에서 시작하여 정지 코돈에서 끝나는 폴리펩티드를 인코딩하는 상보적 DNA(cDNA)의 부분 또는 이의 침묵 변경된 서열을 지칭한다. 유전자는 대안적인 스플라이싱 및/또는 대안적인 번역 개시로 인해 하나 이상의 야생형 코딩 서열을 가질 수 있다. 예시적인 야생형 HBB 코딩 서열은 NCBI 참조 서열: NM_000518.4의 뉴클레오티드 51 내지 494에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "코딩 뉴클레오티드"는 정지 코돈의 3' 뉴클레오티드를 제외하고 유전자의 코딩 서열에서 뉴클레오티드에 상응하는 유전자의 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 상기 HBB 유전자의 코딩 뉴클레오티드는 상기 HBB 유전자의 뉴클레오티드 1 내지 443 중 어느 하나이다.
본원에 사용된 유전자의 "스터퍼-삽입된 코딩 서열"이라는 용어는 유전자의 코딩 서열에 삽입된 하나 이상의 인트론을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 인트론 중 적어도 하나는 비 천연 인트론, 즉, 유전자의 천연 인트론과 상이한 서열을 갖는 것이다. 특정 실시형태에서, 스터퍼-삽입된 코딩 서열에서 모든 인트론은 비 천연 인트론이다. 비 천연 인트론은 다른 종으로부터의 인트론의 서열 또는 동일한 종과 상이한 유전자에서 인트론의 서열을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 비 천연 인트론 서열의 적어도 일부는 합성일 수 있다. 당업자는 비 천연 인트론 서열이 당업계에 공지된 임의의 컨센서스 스플라이싱 모티프를 도입함으로써 RNA 스플라이싱을 매개하도록 설계될 수 있음을 이해할 것이다. 예시적인 컨센서스 스플라이싱 모티프는 문헌[Sibley et al., (2016) Nature Reviews Genetics, 17, 407-21]에 제공되며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다. 비 천연 인트론의 삽입은 스태퍼 서열이 벡터의 조정이 최적 크기(예를 들어, 4.5 내지 4.8 kb)에 도달할 수 있게 함에 따라 벡터 패키징의 효율성 및 견고성을 촉진시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 인트론 중 적어도 하나는 유전자의 천연 인트론이다. 특정 실시형태에서, 스터퍼-삽입된 코딩 서열에서 모든 인트론은 유전자의 천연 인트론이다. 비 천연 또는 천연 인트론은 코딩 서열에서 임의의 뉴클레오티드 간 결합에서 삽입될 수 있다. 특정 실시형태에서, 효율적인 스플라이싱을 촉진할 것으로 예측되는 뉴클레오티드 간 결합에서 하나 이상의 비 천연 또는 천연 인트론이 삽입된다(예를 들어, 문헌[Zhang (1998) Human Molecular Gentics, 7(5):919-32] 참조, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다). 특정 실시형태에서, 하나 이상의 비 천연 또는 천연 인트론이 2개의 내인성 엑손을 연결하는 뉴클레오티드 간 결합에서 삽입된다.
본원에 사용된 용어 "리보솜 스키핑 요소"는 하나의 mRNA 분자의 번역으로부터 2개의 펩티드 사슬을 생성시킬 수 있는 짧은 펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "리보솜 스키핑 펩티드"는 리보솜 스키핑 요소에 의해 인코딩된 펩티드를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상기 리보솜 스키핑 펩티드는 X1X2EX3NPGP의 컨센서스 모티프를 포함하고, 상기 식에서 X1은 D 또는 G이고, X2는 V 또는 I이며, X3는 임의의 아미노산(서열 번호: 49)이다. 특정 실시형태에서, 상기 리보솜 스키핑 펩티드는 토세아-아사인아(thosea-asigna) 바이러스 2A 펩티드(T2A), 돼지 테스코바이러스(porcine teschovirus)-1 2A 펩티드(P2A), 구제역 바이러스 2A 펩티드(F2A), 말 비염 A 바이러스 2A 펩티드(E2A), 세포질 다각체병 바이러스 2A 펩티드(BmCPV 2A), 및 flacherie virus of B. mori 2A 펩티드의 무름병 바이러스(BmlFV 2A)로 이루어진 군으로부터 선택된다. T2A 펩티드 및 P2A 펩티드의 예시적인 아미노산 서열은 각각 서열 번호: 71 및 73에 기재되어 있다. T2A 요소 및 P2A 요소의 예시적인 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 72 및 74에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 상기 리보솜 스키핑 요소는 N 말단에서 Gly-Ser-Gly의 서열을 더 포함하는 펩티드를 인코딩하며, 선택적으로 N 말단에서 Gly-Ser-Gly의 서열은 GGCAGCGGA(서열 번호: 75)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 이론에 구속되고 싶지는 않지만, 리보솜 스키핑 요소는 제1 펩티드 사슬의 번역을 종결시키고 제2 펩티드 사슬의 번역을 재개시하고; 또는 인코딩된 펩티드의 고유 프로테아제 활성에 의해 또는 환경(예를 들어, 사이토졸) 내의 다른 프로테아제에 의해 리보솜 스키핑 펩티드에서의 펩티드 결합의 절단에 의해 기능한다고 추측된다.
본원에 사용된 용어 "폴리아데닐화 서열"은 RNA로 전사될 때 폴리아데닐화 신호 서열을 구성하는 DNA 서열을 지칭한다.
본 개시내용에서, 유전자 내에서 뉴클레오티드 위치는 시작 코돈의 제1 뉴클레오티드에 대해 특정된다. 시작 코돈의 제1 뉴클레오티드는 위치 1이고, 시작 코돈의 제1 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 5'는 음수를 가지며, 시작 코돈의 제1 뉴클레오티드에 대한 뉴클레오티드 3'은 양수를 갖는다. 예를 들어, 본원에 사용된 HBB 유전자의 뉴클레오티드 1은 NCBI 참조 서열: NG_000007.3의 뉴클레오티드 70,595이다. 시작 코돈에 인접하여 5'인 뉴클레오티드는 뉴클레오티드-1이다.
본 개시내용에서, 유전자 내의 엑손 및 인트론은 시작 코돈의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 엑손에 대해 특정된다. 시작 코돈의 제1 뉴클레오티드를 포함하는 엑손은 엑손 1이다. 엑손 3' 내지 엑손 1은 5' 내지 3': 엑손 2, 엑손 3 등이다. 인트론 3' 내지 엑손 1은 5' 내지 3': 인트론 1, 인트론 2 등이다. 따라서, 유전자는 5' 내지 3': 엑손 1, 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3 등을 포함한다. 인간 HBB 유전자의 예시적인 엑손 1은 NCBI 참조 서열: NG_000007.3이의 뉴클레오티드 70,545 내지 70,686이다. 인간 HBB 유전자의 예시적인 인트론 1은 NCBI 참조 서열: Ng_000007.3의 뉴클레오티드 70,687 내지 70,816이다. 당업자는 유전자가 다수의 상이한 mRNA로 전사될 수 있음을 이해할 것이다. 이와 같이, 유전자(예를 들어, HBB)는 다수의 상이한 엑손 및 인트론 세트를 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "통합"은 교정 게놈과 표적 유전자 사이의 상동 재조합에 의해 편집 요소가 표적 좌위에 도입되는 것을 지칭한다. 편집 요소의 통합은 표적 유전자에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및/또는 결실을 초래할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "편집 요소의 표적 좌위로의 통합 효율"은 편집 요소의 표적 좌위로의 통합이 발생한 형질도입된 집단에서 세포의 백분율을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "편집 요소의 표적 좌위로의 통합의 대립 유전자 빈도"는 편집 요소의 표적 좌위로의 통합이 발생한 형질도입된 세포의 집단에서 대립 유전자의 백분율을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "표준 AAV 형질도입 조건"은 2 x 105 CD34+ 인간 줄기 세포에 1.5 x 105의 감염 다중도(MOI: multiplicity of infection)에서 AAV의 형질도입을 지칭하며, 상기 세포는 5% 이산화탄소(CO2)의 인큐베이션 환경에서 37℃에서 20% 우태혈청(FCS: Fetal Calf Serum), 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린, 2mmol/L L-글루타민, 10 ng/mL 인간 IL-3, 10 ng/mL 인간 IL-6, 및 1 ng/mL 인간 SCF로 보충된 이스코브 변형된 둘베코 배지(IMDM: Iscove's Modified Dulbecco's Medium)로 배양되고, 상기 AAV는 인산염 완충 식염수(PBS: phosphate buffered saline)에서 제형화되며, 상기 AAV는 배양 배지의 부피의 9분의 1 이하의 부피로 CD34+ 세포를 함유하는 세포 배양 배지에 첨가된다.
본원에 사용된 바와 같이, 대상체에게 AAV의 투여와 관련하여 용어 "유효량"은 원하는 예방 또는 치료 효과를 달성하는 AAV의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "적혈구 전구세포"는 적혈구로 분화될 수 있는 세포를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구세포는 다능성 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구세포는 유도된 다능성 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구세포는 조혈 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구세포는 골수성 전구세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구세포는 거핵구 적혈구 전구세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 적혈구 전구세포는 적혈구 전구체 세포이다.
II. 아데노-연관 바이러스 조성물
일 양태에서, 본 개시내용은 HBB 유전자에서 돌연변이를 교정하는 데 유용한 신규한 복제-결함 AAV 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 AAV는 일반적으로 AAV Clade F 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드; 및 HBB 유전자에서 표적 좌위 편집용 교정 게놈을 포함한다.
임의의 AAV Clade F 캡시드 단백질 또는 이의 유도체가 본원에 개시된 AAV 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이며; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이며, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호: 2의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 D이고; 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이며; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이며, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호: 2의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 T이고; 서열 번호: 2의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 68에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 V이고; 서열 번호: 2의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 L이고; 서열 번호: 2의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 D이고; 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이며; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 T이며, 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이며, 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Y이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 L이며, 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이며, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이다. 특정 실시형태에서, 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열 203 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열 138 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 8의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 8의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 8의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 8의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 8의 아미노산 203 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 138 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 8의 아미노산 1 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 13의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 13의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드: (a) 서열 번호: 13의 아미노산 203 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 138 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 13의 아미노산 1 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 16의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 16의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 138 내지 736을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 Clade F 캡시드 단백질 중 둘 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 AAV 캡시드는: (a) 서열 번호: 16의 아미노산 203 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 138 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질; 및 (c) 서열 번호: 16의 아미노산 1 내지 736으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 Clade F 캡시드 단백질을 포함한다.
본원에 개시된 AAV 조성물에서 유용한 교정 게놈은: (i) 표적 유전자에서 표적 좌위의 편집용 편집 요소, (ii) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 5', 및 (iii) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3'을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 상기 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 5' 반전된 말단 반복(5' ITR) 뉴클레오티드 서열 5', 및 상기 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 3' 반전된 말단 반복(3' ITR) 뉴클레오티드 서열 3'을 포함한다.
본원에 개시된 교정 게놈에서 유용한 교정 요소는 표적 좌위에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실, 또는 치환을 매개할 수 있다. 상기 표적 좌위는 적혈구 전구세포에서 발현된 HBB 유전자 또는 다른 유전자일 수 있는 표적 유전자 내에 완전히 또는 부분적으로 위치할 수 있다.
특정 실시형태에서, 표적 좌위에서 상동 재조합에 의해 정확하게 통합될 때, 편집 요소는 HBB 유전자에서 돌연변이를 야생형 HBB 서열 또는 야생형 HBB 단백질 또는 이의 기능적 등가물을 인코딩하는 침묵 변경된 서열로 되돌려 교정한다. HBB 유전자에서 대부분의 돌연변이는 본원에 개시된 편집 요소에 의해 교정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자에서 치환 또는 결실 돌연변이를 교정하는 하나 이상의 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자에서 삽입 돌연변이를 결실하는 뉴클레오티드 간 결합이다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자의 하나 이상의 코딩 엑손을 포함한다. 예를 들어, 상기 편집 요소는 엑손 1의 코딩 영역, 전체 인트론 1, 전체 엑손 2, 전체 인트론 2, 및 엑손 3의 코딩 영역을 포함하는 HBB 유전자의 일부를 포함할 수 있다. 상기 엑소는 본원에 개시된 바와 같이 야생형일 수 있거나 침묵 변경될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자의 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자의 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서 상기 편집 요소는 HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444, 또는 뉴클레오티드 4로부터 정지 코돈까지의 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부를 포함하고, HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부에 외인성 폴리아데닐화 서열 3'을 선택적으로 더 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 외인성 폴리아데닐화 서열 3'을 선택적으로 더 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 편집 요소는 상동 재조합에 의해 HBB 유전자의 내인성 시작 코돈 직후(예를 들어, HBB 유전자의 뉴클레오티드 3과 뉴클레오티드 4 사이) 엑손 1에 통합될 수 있으며, 이에 의하여 편집 요소의 통합은 내인성 HBB 유전자의 시작 코돈과 프레임 내(in-frame)에서 완전한 HBB 코딩 서열을 생성시킨다. 특정 실시형태에서, 이러한 편집 요소는 상동 재조합에 의해 비-HBB 표적 유전자의 내인성 시작 코돈 직후(예를 들어, 표적 유전자의 뉴클레오티드 3과 뉴클레오티드 4 사이) 엑손 1에 통합될 수 있으며, 이에 의하여 편집 요소의 통합은 내인성 표적 유전자의 시작 코돈과 프레임 내에서 완전한 HBB 코딩 서열을 생성시킨다. 편집 요소에서 HBB 코딩 서열의 일부는 본원에 개시된 바와 같이 야생형이거나 침묵 돌연변이될 수 있다. 편집 요소에 의해 인코딩된 HBB 아미노산 서열의 일부는 야생형 또는 이의 기능적 등가물일 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열(예를 들어, 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열)의 적어도 일부, 및 리보솜 스키핑 요소 또는 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 리보솜 스키핑 요소, 및 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열(예를 들어, 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열)의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 리보솜 스키핑 요소; 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 언급된 편집 요소는 상동 재조합에 의해 표적 유전자의 코딩 뉴클레오티드에 인접하게 3'(예를 들어, 천연 HBB 유전자의 정지 코돈에 대해 인접하게 5')에 통합되어 5' 내지 3': 코딩 뉴클레오티드에서 끝나는 표적 유전자의 5' 부분, 리보솜 스키핑 요소, 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열, 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함하는 재조합 표적 유전자를 생성할 수 있으며, 상기 리보솜 스키핑 요소는 표적 유전자의 코딩 영역 및 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열과 프레임 내가 되도록 위치된다. 이 재조합 표적 유전자의 발현은 인코딩된 리보솜 스키핑 펩티드의 제1 부분에 융합된 표적 유전자의 N-말단 부분에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 완전한 HBB 아미노산 서열에 융합된 인코딩된 리보솜 스키핑 펩티드의 제2 부분(예를 들어, 단일 프롤린 잔기)을 포함하는 제2 폴리펩티드를 생성한다. 편집 요소에서 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 HBB 코딩 서열 또는 코딩 영역은 본원에 개시된 바와 같이 야생형이거나 침묵 돌연변이될 수 있다. 편집 요소에 의해 인코딩된 HBB 아미노산 서열은 야생형 또는 이의 기능적 등가물(예를 들어, 제1 메티오닌이 없음)일 수 있다. 상기 표적 좌위는 뉴클레오티드 간 결합 또는 표적 유전자의 코딩 뉴클레오티드에 인접하게 3'인 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 HBB 유전자의 천연 정지 코돈으로 구성된다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열(예를 들어, 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열)의 적어도 일부, 및 스플라이스 수용체 부위; 스플라이스 공여체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 및 외인성 폴리아데닐화 서열 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 및 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열(예를 들어, 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열)의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 언급된 편집 요소는 상동 재조합에 의해 표적 유전자의 인트론(예를 들어, 내인성 HBB 유전자의 인트론 1)에 통합되어 5' 내지 3': 표적 유전자의 하나 이상의 엑손 5' 내지 인트론; 외인성 스플라이스 공여체 부위를 포함하는 인트론의 5' 부분; 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소, 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함하는 재조합 HBB 유전자를 생성할 수 있으며, 리보솜 스키핑 요소는 완전한 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열과 프레임 내에 있도록, 그리고 표적 유전자의 내인성 스플라이스 공여체 부위에 대한 스플라이스 수용체 부위의 스플라이싱은 리보솜 스키핑 요소를 표적 유전자의 코딩 영역과 프레임 내에 놓이도록 위치된다. 이 재조합 표적 유전자의 발현은 인코딩된 리보솜 스키핑 펩티드의 제1 부분에 융합된 삽입 부위에 내인성 엑손(들) 5'에 의해 인코딩된 표적 유전자 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 완전한 HBB 아미노산 서열에 융합된 인코딩된 리보솜 스키핑 펩티드(예를 들어, 단일 프롤린 잔기)의 제2 부분을 포함하는 제2 폴리펩티드를 생성한다. 편집 요소에서 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열은 본원에 개시된 바와 같이 야생형이거나 침묵 돌연변이될 수 있다. 편집 요소에 의해 인코딩된 HBB 아미노산 서열은 야생형 또는 이의 기능적 등가물(예를 들어, 제1 메티오닌이 없음)일 수 있다. 상기 표적 좌위는 뉴클레오티드 간 결합 또는 표적 유전자의 인트론에서 뉴클레오티드에 인접하게 3'인 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
특정 실시형태에서, 편집 요소 내의 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 하나 이상의 부분은 야생형 HBB 유전자의 상응하는 엑손과 동일하지 않도록 침묵 변경될 수 있다. 이러한 침묵 변경은 다른 글로빈 유전자 또는 유사 유전자의 좌위, 예를 들어, 베타 글로빈 유사 유전자 좌위로 교정 게놈의 통합 가능성을 감소시킨다는 점에서 유리하다. 이러한 침묵 변경은 또한 편집 요소와 표적 유전자 사이의 상동성을 감소시켜, 상동성 암보다는 편집 요소에 의해 매개되는 바람직하지 않은 통합을 감소시킨다.
따라서, 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 유전자의 엑손의 상응하는 코딩 영역에 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 유전자의 하나 이상의 엑손의 코딩 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 유전자의 엑손의 상응하는 코딩 영역에 70% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 유전자의 하나 이상의 엑손의 코딩 영역을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 유전자의 엑손의 상응하는 코딩 영역에 85% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 유전자의 하나 이상의 엑손의 코딩 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 엑손 1의 코딩 영역, 전체 인트론 1, 전체 엑손 2, 전체 인트론 2, 및 엑손 3의 코딩 영역을 포함하는 HBB 유전자의 일부를 포함하며, 엑손 1의 코딩 영역, 전체 엑손 2, 및 엑손 3의 코딩 영역 중 하나 이상은 야생형 HBB 유전자의 엑손의 상응하는 영역에 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 엑손 1의 코딩 영역, 전체 인트론 1, 전체 엑손 2, 전체 인트론 2, 및 엑손 3의 코딩 영역을 포함하는 HBB 유전자의 일부를 포함하며, 엑손 1의 코딩 영역, 전체 엑손 2, 및 엑손 3의 코딩 영역의 하나 이상은 야생형 HBB 유전자의 엑손의 상응하는 영역에 70% 미만으로 동일하게 침묵 변경된다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 엑손 1의 코딩 영역, 전체 인트론 1, 전체 엑손 2, 전체 인트론 2, 및 엑손 3의 코딩 영역을 포함하는 HBB 유전자의 일부를 포함하며, 엑손 1의 코딩 영역, 전체 엑손 2, 및 엑손 3의 코딩 영역의 각각의 하나는 야생형 HBB 유전자의 엑손의 상응하는 영역에 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 엑손 1의 코딩 영역, 전체 인트론 1, 전체 엑손 2, 전체 인트론 2, 및 엑손 3의 코딩 영역을 포함하는 HBB 유전자의 일부를 포함하며, 엑손 1의 코딩 영역, 전체 엑손 2, 및 엑손 3의 코딩 영역의 각각의 하나는 야생형 HBB 유전자의 엑손의 상응하는 영역에 70% 미만으로 동일하게 침묵 변경된다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 43 내지 46 및 105 내지 107로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 하나 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 43 내지 46 및 105 내지 107로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 둘 이상을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 46에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 43, 44, 및 45에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 105, 106, 및 107에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분에 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 코딩 서열의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분에 70% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 코딩 서열의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분에 85% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 코딩 서열의 적어도 일부를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 적어도 일부가 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분에 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일한 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 적어도 일부가 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분과 70%미만으로 동일한 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 적어도 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 적어도 일부가 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분과 85% 미만으로 동일한 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 적어도 일부를 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분과 70% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 47에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분과 85% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 100에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 편집 요소는 HBB 유전자 코딩 서열에 외인성 폴리아데닐화 서열 3'을 더 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함하며, HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444는 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부가 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일한 HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444에 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부가 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분과 70% 미만으로 동일한 HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444로 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부는 서열 번호: 47에 기재된 뉴클레오티드 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부가 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 부분과 85% 미만으로 동일한 HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444로 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부는 서열 번호: 100에 기재된 뉴클레오티드 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있다. 이러한 편집 요소는 HBB 유전자 코딩 서열에 외인성 폴리아데닐화 서열 3'을 더 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함하며, HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부는 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일한 HBB 코딩 서열의 뉴클레오티드 4 내지 444로 전사 및 스플라이싱될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된 완전한 HBB 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열과 70% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 완전한 HBB 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 시작 코돈 및 서열 번호: 47에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 28에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 야생형 HBB 코딩 서열과 85% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 유전자의 완전한 HBB 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 시작 코돈 및 서열 번호: 100에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 99에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 편집 요소는 HBB 유전자 코딩 서열에 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 및 외인성 폴리아데닐화 서열 3'의 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 리보솜 스키핑 요소; 및 선택적으로 시작 코돈이 없는 완전한 HBB 코딩 서열을 포함하며, 상기 완전한 HBB 코딩 서열은 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 리보솜 스키핑 요소; 선택적으로 시작 코돈이 없는 완전한 HBB 코딩 서열; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함하며, 상기 HBB 코딩 서열은 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 및 선택적으로 시작 코돈이 없는 완전한 HBB 코딩 서열을 포함하며, 상기 완전한 HBB 코딩 서열은 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 선택적으로 시작 코돈이 없는 완전한 HBB 코딩 서열; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함하며, 상기 완전한 HBB 코딩 서열은 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일하게 침묵 변경된다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열이 야생형 HBB 코딩 서열과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일한 완전한 HBB 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열이 야생형 HBB 코딩 서열과 70% 미만으로 동일한 완전한 HBB 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 완전한 HBB 코딩 서열은 5' 내지 3' 시작 코돈 및 서열 번호: 47에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 완전한 HBB 코딩 서열은 서열 번호: 28에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열은 서열 번호: 43 내지 45에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열이 야생형 HBB 코딩 서열과 85% 미만으로 동일한 완전한 HBB 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있도록, 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열은 서열 번호: 105, 106, 및 107에 기재된 5' 내지 3' 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 편집 요소는 HBB 유전자 코딩 서열에 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 및 외인성 폴리아데닐화 서열 3'의 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 리보솜 스키핑 요소; 및 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하며, 상기 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열은 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일한 완전한 HBB 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 리보솜 스키핑 요소; 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함하며, 상기 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열은 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일한 완전한 HBB 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 및 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하며, 상기 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열은 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일한 완전한 HBB 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3': 스플라이스 수용체 부위; 리보솜 스키핑 요소; 침묵 변경된 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열; 및 외인성 폴리아데닐화 서열을 포함하며, 상기 HBB 스터퍼-삽입된 코딩 서열은 야생형 HBB 코딩 서열의 상응하는 영역과 100% 미만(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만)으로 동일한 완전한 HBB 코딩 서열로 전사 및 스플라이싱될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 및 모든 편집 요소는 표적 유전자에 존재하지 않는 독특한 서열(예를 들어, 야생형 또는 돌연변이체 HBB 유전자, 또는 그의 기능적 등가물을 인코딩하는 유전자)을 더 포함할 수 있고, 따라서 표적 좌위에서 편집 요소의 통합을 갖는 세포의 동정을 허용하도록 한다. 이러한 독특한 서열은 표적 좌위 및 그의 측면 영역 또는 이로부터 증폭된 핵산의 핵산 시퀀싱 분석(예를 들어, PCR 또는 차세대 시퀀싱)에 적합한 서열일 수 있다. 이러한 독특한 서열은 또한 표적 좌위 및 그의 측면 영역 또는 이로부터 증폭된 핵산의 제한 단편 길이 다형성 분석에 기초하여 표적 좌위에서 편집 요소의 통합을 갖는 세포의 동정을 허용하는 제한 엔도뉴클레아제 부위일 수 있다.
본원에 개시된 임의의 및 모든 편집 요소는 표적 좌위에 통합될 때 베타 글로빈 단백질에서 하나 이상의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 삽입 또는 결실)을 야기하는 하나 이상의 뉴클레오티드 변경을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 변형된 베타 글로빈 단백질은 야생형 베타 글로빈의 기능적 등가물이며, 즉 야생형 베타 글로빈으로서 기능할 수 있다. 특정 실시형태에서, 기능적으로 등가인 베타 글로빈은 야생형 베타 글로빈에서 발견되지 않은 적어도 하나의 특성, 예를 들어 SCD 돌연변이를 보유한 베타 글로빈의 응집을 억제하는 능력을 더 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 편집 요소는 적어도 0, 1, 2, 10, 100, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 또는 5000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 1 내지 5000, 1 내지 4500, 1 내지 4000, 1 내지 3000, 1 내지 2000, 1 내지 1000, 1 내지 500, 1 내지 200, 1 내지 100, 1 내지 50, 또는 1 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다.
특정 실시 형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 편집 요소는 엑손, 인트론, 5' 비번역된 영역(UTR), 3' UTR, 프로모터, 스플라이스 공여체, 스플라이스 수용체, 리보솜 스키핑 요소, 비코딩 RNA를 인코딩하는 서열, 인슐레이터(insulator), 유전자, 또는 이들의 조합을 포함하거나 이로 구성된다.
특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 23 내지 28 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 23 내지 26 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
본원에 개시된 교정 게놈에 사용되는 상동성 암은 표적 유전자(예를 들어, HBB 유전자) 또는 게놈 상 부근의 유전자의 임의의 영역으로 향할 수 있다. 상동성 암의 정확한 동일성 및 위치는 편집 요소 및/또는 표적 좌위의 동일성에 의해 결정된다.
본원에 개시된 교정 게놈에 사용된 상동성 암은 표적 좌위(예를 들어, HBB 유전자에서 표적 좌위) 측면에 있는 게놈과 실질적으로 동일하다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 상동성 암은 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 적어도 약 90%(예를 들어, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%) 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 상동성 암은 상기 제1 게놈 영역과 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 3' 상동성 암은 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 적어도 약 90%(예를 들어, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%) 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 3' 상동성 암은 상기 제2 게놈 영역과 100% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 및 3' 상동성 암은 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5' 및 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3' 각각에 각각 적어도 약 90%(예를 들어, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5%) 동일하다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 및 3' 상동성 암은 상기 제1 및 제2 게놈 영역 각각에 각각 100% 동일하다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 상동성 암 및 상기 제1 게놈 영역의 뉴클레오티드 서열에서 차이 및/또는 상기 3' 상동성 암 및 상기 제2 게놈 영역의 뉴클레오티드 서열에서 차이는 뉴클레오티드 서열에서 비-코딩 영역 차이를 포함하고, 필수적으로 구성되거나 구성된다.
당업자는 상동성 암이 상동 재조합에 의해 편집 요소의 해당 표적 부위로의 통합을 매개할 수 있도록 표적 좌위 측면에 있는 게놈 서열에 100% 동일할 필요는 없음을 이해할 것이다. 당업자는 상동성 암이 표적 좌위 측면에 있는 게놈 서열과 100% 동일하지 않은 상황에서, 상동성 아암과 게놈 사이의 상동 재조합은 사용된 상동성 암의 서열과 동일하도록 표적 좌위의 측면에 있는 게놈 서열을 변경시킬 수 있다는 것을 더 이해할 것이다.
특정 실시형태에서, 표적 좌위에 대한 상기 제1 게놈 영역 5'는 제1 편집창에 위치하며, 상기 제1 편집창의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 101 내지 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 표적 좌위에 대한 상기 제2 게놈 영역 3'은 제2 편집창에 위치하며, 상기 제2 편집창의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 101 내지 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 표적 좌위에 대한 상기 제1 게놈 영역 5'는 제1 편집창에 위치하며, 상기 제1 편집창의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 101 내지 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 구성되며; 그리고 표적 좌위에 대한 상기 제2 게놈 영역 3'은 제2 편집창에 위치하며, 상기 제2 편집창의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 101, 102, 또는 103에 기재된 서열로 구성된다.
특정 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 편집창들은 상이하다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 편집창은 상기 제2 편집창에 대해 5'에 위치된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 편집창은 서열 번호: 101에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 편집창은 서열 번호: 102에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 편집창은 서열 번호: 101에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되며, 상기 제2 편집창은 서열 번호: 102에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 게놈 영역은 상기 제1 편집창의 서열보다 더 짧은 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 게놈 영역은 상기 제1 편집창의 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 게놈 영역은 상기 제2 편집창의 서열보다 더 짧은 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 게놈 영역은 상기 제2 편집창의 서열로 구성된다.
특정 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 편집창들은 동일하다. 특정 실시형태에서, 상기 좌위는 편집창에서의 뉴클레오티드 간 결합 또는 뉴클레오티드 서열이며, 상기 제1 게놈 좌위는 표적 좌위에 대한 편집창 5'의 제1 부분으로 구성되며, 상기 제2 게놈 좌위는 표적 좌위에 대한 편집창 3'의 제2 부분으로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집창의 제1 부분은 편집창의 5' 말단부터 표적 좌위에 5' 인접한 뉴클레오티드까지의 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집창의 제2 부분은 표적 좌위에 3' 인접한 뉴클레오티드로부터 편집창의 3' 말단까지의 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집창의 제1 부분은 편집창의 5' 말단부터 표적 좌위에 5' 인접한 뉴클레오티드까지의 서열로 구성되며, 그리고 상기 편집창의 제2 부분은 표적 좌위에 3' 인접한 뉴클레오티드로부터 편집창의 3' 말단까지의 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집창은 서열 번호: 103에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 편집차의 제1 및 제2 부분은 실질적으로 동일한 길이를 갖는다(예를 들어, 짧은 부분의 길이 대 긴 부분의 길이의 비가 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 0.96, 0.97, 0.98, 또는 0.99를 초과한다).
특정 실시형태에서, 상기 5' 상동성 암은 약 50 내지 약 4000 뉴클레오티드(예를 들어, 약 100 내지 약 3000, 약 200 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 상동성 암은 약 800 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 상동성 암은 약 100 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 3' 상동성 암은 약 50 내지 약 4000 뉴클레오티드(예를 들어, 약 100 내지 약 3000, 약 200 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 3' 상동성 암은 약 800 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 3' 상동성 암은 약 100 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 및 3' 상동성 암의 각각은 독립적으로 약 50 내지 약 4000 뉴클레오티드(예를 들어, 약 100 내지 약 3000, 약 200 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 및 3' 상동성 암은 약 800 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
특정 실시형태에서, 상기 5' 및 3' 상동성 암은 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' 및 3' 상동성 암은 비대칭 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오티드의 비대칭성은 길이가 최대 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10% 차이와 같이, 길이가 최대 90%의 5' 및 3' 상동성 암 사이의 차이에 의해 정의된다.
특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 29 내지 42 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 5' 내지 3': 서열 번호: 101에 기재된 서열; 리보솜 스키핑 요소; 야생형 HBB 코딩 영역에 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB 코딩 서열; 외인성 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열 번호: 76, 77, 78, 또는 79에 기재된 바와 같이); 및 서열 번호: 102에 기재된 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 5' 내지 3': 서열 번호: 101에 기재된 서열; 리보솜 스키핑 요소; 서열 번호: 99에 기재된 서열; 외인성 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열 번호: 76, 77, 78, 또는 79에 기재된 바와 같이); 및 서열 번호: 102에 기재된 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 5' 내지 3': 서열 번호: 101에 기재된 서열; 리보솜 스키핑 요소; HBB의 제1 엑손의 야생형 코딩 영역에 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB의 제1 엑손의 코딩 영역; 선택적 제1 비천연 인트론; HBB의 야생형 제2 엑손에 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB의 제2 엑손; HBB의 제3 엑손의 야생형 코딩 영역에 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만으로 동일하게 침묵 변경된 HBB의 제3 엑손의 코딩 영역; 외인성 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열 번호: 76, 77, 78, 또는 79에 기재된 바와 같이); 및 서열 번호: 102에 기재된 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 5' 내지 3': 서열 번호: 101에 기재된 서열; 리보솜 스키핑 요소; 서열 번호: 105에 기재된 서열; 선택적 제1 비천연 인트론; 서열 번호: 106에 기재된 서열; 선택적 제2 인트론; 서열 번호: 107에 기재된 서열; 외인성 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 서열 번호: 76, 77, 78, 또는 79에 기재된 바와 같이); 및 서열 번호: 102에 기재된 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 104에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 교정 게놈은 상기 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 5' 반전된 말단 반복(5' ITR) 뉴클레오티드 서열 5', 및 상기 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 3' 반전된 말단 반복(3' ITR) 뉴클레오티드 서열 3'을 더 포함한다. 임의의 AAV 혈청형 또는 이의 변이체로부터의 ITR 서열은 본원에 개시된 교정 게놈에 사용될 수 있다. 5' 및 3' ITR은 동일한 혈청형의 AAV 또는 상이한 혈청형의 AAV에서 유래할 수 있다. 본원에 개시된 교정 게놈에 사용하기 위한 예시적인 ITR은 본원의 서열 번호: 18 내지 21에 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열 및 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 실질적으로 서로 상보적이다(예를 들어, 상기 5' 또는 3' ITR에서 1, 2, 3, 4, 또는 5 뉴클레오티드 위치에서 미스매치(mismatch)를 제외하고 서로 상보적이다).
특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 또는 3' ITR는 AAV2로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 및 상기 3' ITR 양쪽 모두는 AAV2로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 18과 적어도 95%(예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 가지며, 또는 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 19와 적어도 95%(예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 18과 적어도 95%(예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열을 가지며, 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 19와 적어도 95%(예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 23 내지 28 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 18의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 19의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 요소를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 29 내지 42 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 18의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 19의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 5' 내지 3' 서열 번호: 18의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 29 내지 42 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 19의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 또는 3' ITR는 AAV5로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 및 3' ITR 양쪽 모두는 AAV5로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 20과 적어도 95%(예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 가지며, 또는 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 21과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 20과 적어도 95%(예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 가지며, 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 21과 적어도 95%(예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%) 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 23 내지 28 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 20의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 21의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 요소를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 29 내지 42 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 20의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 21의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열을 갖는 편집 요소를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 교정 게놈은 5' 내지 3' 서열 번호: 20의 서열을 갖는 5' ITR 뉴클레오티드 서열, 서열 번호: 29 내지 42 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열, 및 서열 번호: 21의 서열을 갖는 3' ITR 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 교정 게놈은 약 0.5 내지 약 8 kb, 및 이들 사이에 둘러싸인 임의의 범위(예를 들어, 약 1 내지 약 5, 약 2 내지 약 5, 약 3 내지 약 5, 약 4 내지 약 5, 약 4.5 내지 약 4.8 또는 약 4.7 kb)의 길이를 갖는다.
본원에 개시된 교정 게놈은 편집 요소를 HBB 유전자의 임의의 원하는 표적 좌위에 통합시키도록 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 상응하는 야생형 HBB 유전자 서열에 대한 HBB 유전자 서열에서의 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환)이다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 상기 HBB 유전자에서 뉴클레오티드 점 돌연변이 또는 결실에 있다. 예시적인 HBB 점 돌연변이 또는 결실은 제한없이, 위치 -87에서 G, 위치 -31에서 G, 위치 -30에서 A, 위치 -29에서 G, 위치 -28에서 G, 위치 -10에서 T, 위치 1에서 C, 위치 1에서 A, 위치 2에서 G, 위치 17 및 18에서 C 및 T의 결실, 위치 19에서 A, 위치 20에서 A의 결실, 위치 20에서 T, 위치 25 및 26에서 A 및 A의 결실, 위치 26 이후 G의 추가, 위치 47에서 A, 위치 48에서 A, 위치 51에서 C의 결실, 위치 52에서 A, 위치 58에서 G, 위치 59에서 G, 위치 79에서 A, 위치 82에서 T, 위치 84 이후 C의 추가, 위치 93에서 T, 위치 93에서 A, 위치 97에서 C, 위치 98에서 C, 위치 202에서 G, 위치 208에서 G, 위치 222에서 C, 위치 241 또는 242에서 T의 결실, 위치 254 내지 257에서 T 및 T 및 C 및 T의 결실, 위치 260에서 T, 위치 264 또는 265에서 C의 결실, 위치 343 이후 A의 추가, 위치 399 및 400에서 G 및 T의 결실, 위치 401에서 T, 위치 417 이후 A의 추가, 446에서 A, 위치 1099에서 T, 위치 1293에서 A, 위치 1344에서 T를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 겸상세포질환 돌연변이이다(즉, HBB 유전자의 위치 20에서 T). 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 HBB 유전자의 엑손 1에서 염색체 또는 뉴클레오티드 간 결합의 영역, 예를 들어 내인성 시작 코돈 직후(예를 들어, HBB 유전자의 뉴클레오티드 3과 뉴클레오티드 4 사이의 뉴클레오티드 간 결합)이다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 HBB 유전자의 인트론 1에서 염색체 또는 뉴클레오티드 간 결합의 영역이다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 야생형 HBB 유전자의 천연 정지 코돈 또는 돌연변이체 HBB 유전자의 상응하는 뉴클레오티드로 구성된다. 특정 실시형태에서, 상기 표적 좌위는 야생형 HBB 유전자의 정지 코돈에 인접한 5' 뉴클레오티드 간 결합 또는 돌연변이체 HBB 유전자의 상응하는 뉴클레오티드 간 결합으로 구성된다.
본원에 개시된 AAV 조성물은 생체 내 및 시험관 내 모두에서 고효율로 세포에서 HBB 유전자의 돌연변이를 교정할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 특정 실시형태에서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 조혈 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합 효율은 적어도 0.1%(예를 들어, 적어도 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)이다. 특정 실시형태에서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 조혈 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합의 대립 유전자 빈도는 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)이다.
유전자 편집의 효율을 결정하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 개별 세포는 형질도입된 세포의 집단으로부터 분리되고 표적 좌위에 올바르게 통합된 편집 요소의 존재를 동정할 수 있는 PCR 프라이머를 사용하여 단일 세포 PCR을 받는다. 이러한 방법은 변형되지 않은 표적 좌위를 선택적으로 증폭시키는 PCR 프라이머를 사용하여 동일한 세포의 단일 세포 PCR을 더 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포의 유전자형이 결정될 수 있다. 예를 들어, 단일 세포 PCR이 세포가 편집된 표적 좌위 및 변형되지 않은 표적 좌위 양쪽 모두를 가지고 있음을 보이면, 세포는 편집된 HBB 유전자에 대한 이형 접합체로 간주될 것이다.
추가적으로 또는 대안적으로, 특정 실시형태에서, 형질도입된 세포의 집단(예를 들어, 조직 또는 기관)으로부터 추출된 DNA에 대해 선형 증폭 매개 PCR(LAM-PCR), 정량적 PCR(qPCR) 또는 디지털 액적 PCR(ddPCR)을 수행하여 통합의 대립 유전자 빈도를 평가할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 추출된 DNA는 상이한 서열을 검출하는 적어도 2개의 프라이머 쌍을 사용하여 디지털 액적 PCR(ddPCR)에 의해 분석된다. 예를 들어, ddPCR은 비통합 및 통합된 벡터뿐만 아니라, 비편집 및 편집된 표적 좌위를 검출하는 제1 프라이머 쌍, 비통합 및 통합된 벡터에 존재하는 서열을 검출하는 제2 프라이머 쌍, 및 선택적으로 비편집 및 편집된 표적 좌위에 존재하는 상동성 암에서 서열을 검출하는 제3 프라이머 쌍을 이용할 수 있다. 비편집 게놈 DNA 및 비통합 벡터의 공동-파티셔닝(co-partitioning) 가능성의 교정 후, 제1 및 제2 프라이머 쌍 양쪽 모두에 양성인 액적의 백분율은 통합의 대립 유전자 빈도에 해당한다. 본 방법의 일예는 본원의 실시예 1에 기재되어 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 특정 실시형태에서, 상기 HBB 좌위는 형질도입된 세포의 집단(예를 들어, 조직 또는 기관)으로부터 추출된 DNA로부터 교정 게놈에 의해 포함된 게놈 영역의 측면에 HBB 유전자의 영역과 결합하는 프라이머를 사용하는 PCR 또는 교정 게놈 내의 영역(예를 들어, 좌위에 비천연인 외인성 서열을 포함하는 영역)과 결합하는 프라이머를 사용하는 선형 증폭 매개 PCR(LAM-PCR)에 의해 증폭될 수 있다. 생성된 PCR 앰플리콘은 형질도입된 세포의 집단에 존재하는 편집 및 비편집된 HBB 대립 유전자의 상대적인 수를 결정하기 위해 단일 분자 차세대 시퀀싱(NGS: next generation sequencing) 기법을 사용하여 개별적으로 시퀀싱될 수 있다. 이 숫자는 편집 요소의 표적 좌위로의 통합의 대립 유전자 빈도를 결정하는 데 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같은 AAV를 약학적으로 허용 가능한 부형제, 보조제, 희석제, 운반체 또는 담체, 또는 이들의 조합과 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"는 조성물의 활성 성분과 조합될 때 성분이 생물학적 활성을 유지하게 하고, 의도하지 않은 면역 반응과 같은 파괴적인 생리학적 반응을 유발하지 않으면서 임의의 물질을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 인산염 완충 식염수, 오일/물 현탁액과 같은 현탁액 및 습윤제를 포함한다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, current Ed., Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, USA; A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins]; 문헌[Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al, 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al, 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc]에 기재된 것과 같은 주지된 종래 방법에 의해 제형화 된다.
III. 사용법
다른 양태에서, 본 개시내용은 세포 내 HBB 유전자에서 돌연변이를 교정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 세포에 본원에 개시된 바와 같은 복제-결함 AAV를 형질도입하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 HBB 유전자에서 돌연변이를 교정하는 데 매우 효율적이며 그러한 교정을 용이하게 하기 위하여 외인성 뉴클레아제(예를 들어, 거대뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화제-유사 뉴클레아제(TALEN: transcriptional activator-like nuclease), 또는 Cas9와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제)의 작용에 의해 표적 좌위에서 게놈의 절단을 필요로 하지 않는다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 외인성 뉴 클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 공동-형질도입하거나 공동-투여하지 않고 세포에 본원에 개시된 바와 같은 복제-결함 AAV를 형질도입하는 단계를 포함한다.
본원에 개시된 방법은 HBB 유전자에서 돌연변이를 보유하는 임의의 세포에 적용될 수 있다. 당업자는 적혈구로 분화할 수 있는 세포가 특히 중요하다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 특정 실시형태에서, 상기 방법은 다능성 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC: induced pluripotent stem cell), 및 조혈 줄기 세포(HSC: hematopoietic stem cell)를 포함하나 이에 한정되지 않는 줄기 세포에 적용된다. 상기 방법이 적용될 수 있는 예시적인 HSC는 제한없이 CD34+ HSC를 포함한다.
본원에 개시된 방법은 연구 목적으로 시험 관내에서 수행될 수 있거나 치료 목적으로 생체 외 또는 생체 내에서 수행될 수 있다.
특정 실시형태에서, 형질도입될 세포는 대상체로부터 취해지고 본원에 개시된 방법에 따라 생체 외 HBB 유전자에서 돌연변이를 교정하도록 형질도입되며, 이후, 형질도입된 세포는 대상체에게 다시 투여된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법에서, 상기 방법은 생체 외 줄기 세포(예를 들어, CD34+ 조혈 줄기 세포)에 본원에 개시된 바와 같은 복제-결함 AAV를 형질도입하여 형질도입된 세포를 수득하는 단계; 및 상기 형질도입된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 상기 형질도입된 세포는 대상체에게 투여되기 전에 정확한 유전자 통합을 위해 선택되고/되거나 클론 확장을 위해 배양될 수 있다. 특정 실시형태에서, 형질도입될 줄기 세포는 골수, 제대혈, 또는 말초 혈액으로부터 수득되며, 상기 줄기 세포는 하나 이상의 세포 마커(예를 들어, 세포 크기, 세포 밀도, 및 CD34와 같은 표면 마커)에 기반한 방법에 의해 선택적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, 상기 줄기 세포는 자가성(autologous), 즉 AAV 형질도입 후 세포가 투여될 대상체로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 상기 줄기 세포는 이를 필요로 하는 대상체와 동종이계적이며, 즉 상기 줄기 세포는 수령자 대상체와 유전적으로 동일하지 않은 공여체로부터 수득된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법에서, 상기 방법은 생체 외 동종이계 줄기 세포(예를 들어, CD34+ 조혈 줄기 세포)에 본원에 개시된 바와 같은 복제-결함 AAV를 형질도입하여 형질도입된 세포를 수득하는 단계; 및 상기 형질도입된 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 상기 동종이계 줄기 세포는 매칭된(matched) 공여체로부터 유래된다. 당업자는 동종이계 적용을 위해, 형질도입된 세포가 투여 전에 추가적인 변형, 예를 들어 이식편 대 숙주 질환(GVHD: graft-versus-host disease)의 발생을 예방 및/또는 감소시키기 위한 유전적 변형을 요구할 수 있음을 인식할 것이다. 상기 대상체는 인간 대상체 또는 인간 적혈구 전구세포를 함유하는 설치류 대상체(예를 들어, 마우스)일 수 있다. 적합한 마우스 대상체는 제한적으로 인간 줄기 세포(예를 들어, 인간 CD34+ HSC)가 이식된 마우스를 포함한다. HBB 유전자 돌연변이와 연관된 임의의 질환 또는 장애는 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 적합한 질환 또는 장애는 제한없이 베타 지중해빈혈증 또는 겸상세포질환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 공동-형질도입하지 않고 형질도입된다.
특정 실시형태에서, 형질도입될 세포는 포유 동물 대상체에 있으며, AAV는 대상체에서 세포를 형질도입시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법에서, 상기 방법은 일반적으로 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 복제-결함 AAV를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 상기 대상체는 인간 대상체, 비인간 영장류 대상체(예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)), 또는 인간 적혈구 전구세포를 함유하는 설치류 대상체(예를 들어, 마우스)일 수 있다. 적합한 마우스 대상체는 제한없이 인간 줄기 세포(예를 들어, 인간 CD34+ HSC)가 이식된 마우스를 포함한다. HBB 유전자 돌연변이와 연관된 임의의 질환 또는 장애는 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 적합한 질환 또는 장애는 제한없이 베타 지중해빈혈증 또는 겸상세포질환을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 공동-형질도입하거나 공동-투여하지 않고 형질도입된다.
본원에 개시된 방법은 생체 내 및 시험 관내 양쪽 모두에서 고효율로 세포에서 HBB 유전자를 교정할 수 있다는 점에서 특히 유리하다. 특정 실시형태에서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합 효율은 적어도 0.1%(예를 들어, 적어도 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)이다. 특정 실시형태에서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합의 대립 유전자 빈도는 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)이다. 유전자 편집의 효율을 결정하는 임의의 방법이 본원에 기재된 것을 제한없이 포함하여 이용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포에 본원에 개시된 AAV 조성물의 형질도입은 본원에 제공된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 임의의 형질도입 방법에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 50,000; 100,000; 150,000; 200,000; 250,000; 300,000; 350,000; 400,000; 450,000; 또는 500,000의 감염 다중도(MOI: multiplicity of infection)에서 또는 세포의 최적 형질도입을 제공하는 임의의 MOI에서 AAV와 접촉될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 대상체는 체중 kg 당 약 1011, 1012, 1013, 1014, 또는 1015개의 벡터 게놈의 용량으로 AAV를 투여받을 수 있다.
본원에 개시된 AAV 조성물은 정맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내, 비내, 국소 또는 피내 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 정맥 내 주사 또는 피하 주사를 통한 투여를 위해 제형화된다.
IV. AAV 패키징 시스템
다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 복제-결함 AAV의 재조합 제조용 패키징 시스템을 제공한다. 이러한 패키징 시스템은 일반적으로: 하나 이상의 AAV Rep 단백질을 인코딩하는 Rep 뉴클레오티드 서열; 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 AAV Clade F 캡시드 단백질을 인코딩하는 Cap 뉴클레오티드 서열; 및 본원에 개시된 바와 같은 HBB 유전자에서 돌연변이의 교정을 위한 교정 게놈을 포함하며, 상기 패키징 시스템은 상기 캡시드 내에 상기 교정 게놈을 봉입하기 위한 세포 내에서 작용하여 상기 AAV를 형성한다.
특정 실시형태에서, 상기 패키징 시스템은 상기 Rep 뉴클레오티드 서열 및 상기 Cap 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터, 및 상기 교정 게놈을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 패키징 시스템과 관련하여 사용된 "벡터"는 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 운반체인 핵산 분자(예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 코스미드, 인공 염색체 등)를 지칭한다.
임의의 AAV Rep 단백질이 본원에 개시된 패키징 시스템에 사용될 수 있다. 패키징 시스템의 특정 실시형태에서, 상기 Rep 뉴클레오티드 서열은 AAV2 Rep 단백질을 인코딩한다. 적합한 AAV2 Rep 단백질은 제한없이 Rep 78/68 또는 Rep 68/52를 포함한다. 패키징 시스템의 특정 실시형태에서, AAV2 Rep 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 22의 AAV2 Rep 아미노산 서열과 최소 퍼센트 서열 동일성을 갖는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 최소 퍼센트 서열 동일성은 상기 AAV2 Rep 단백질의 아미노산 서열의 길이에 걸쳐 적어도 70%(예를 들어, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)이다. 패키징 시스템의 특정 실시형태에서, 상기 AAV2 Rep 단백질은 서열 번호: 22에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
패키징 시스템의 특정 실시형태에서, 상기 패키징 시스템은 제3 벡터, 예를 들어, 헬퍼 바이러스 벡터를 더 포함한다. 상기 제3 벡터는 상기 제1 벡터와 통합되거나, 상기 제2 벡터와 통합된 독립 제3 벡터일 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
패키징 시스템의 특정 실시형태에서, 상기 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(헤르페스 단순 바이러스(HSV: herpes simplex virus) 포함), 폭스바이러스(예를 들어, 백시니아 바이러스), 거대세포바이러스(CMV: cytomegalovirus), 및 배큘로바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 헬퍼 바이러스가 아데노바이러스인 패키징 시스템의 특정 실시형태에서, 아데노바이러스 게놈은 E1, E2, E4, 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아데노바이러스 RNA 유전자를 포함한다. 상기 헬퍼 바이러스가 HSV인 패키징 시스템의 특정 실시형태에서, HSV 게놈은 UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22, 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택된 HSV 유전자 중 하나 이상을 포함한다.
패키징 시스템의 특정 실시형태에서, 상기 제1, 제2, 및/또는 제3 벡터는 하나 이상의 형질감염 플라스미드 내에 함유된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 벡터 및 상기 제3 벡터는 제1 형질감염 플라스미드 내에 함유된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터는 제2 형질감염 플라스미드 내에 함유된다.
패키징 시스템의 특정 실시형태에서, 상기 제1, 제2, 및/또는 제3 벡터는 하나 이상의 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 벡터 및 상기 제3 벡터는 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다. 특정 실시형태에서, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터는 재조합 헬퍼 바이러스 내에 함유된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 AAV의 재조합 제조방법으로서, 상기 방법은 세포에 캡시드 내에 교정 게놈을 봉입하기 위해 작용하는 조건 하에서 기재된 바와 같은 패키징 시스템으로 형질감염 또는 형질도입하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 예시적인 AAV의 재조합 제조 방법은 일시적 형질 감염(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 제1, 및 제2, 및 선택적으로 제3 벡터를 함유하는 하나 이상의 형질감염 플라스미드를 사용함), 바이러스 감염(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 제1, 및 제2, 및 선택적으로 제3 벡터를 함유하는, 아데노바이러스, 폭스바이럿(예를 들어, 백시니아 바이러스), 헤르페스 바이러스(HSV 포함), 거대세포바이러스, 또는 배큘로바이러스와 같은 하나 이상의 재조합 헬퍼 바이러스를 사용함), 및 안정한 생산자 세포주 형질감염 또는 감염(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 AAV Rep 단백질을 인코딩하는 Rep 뉴클레오티드 서열 및/또는 하나 이상의 AAV Clade F 캡시드 단백질을 인코딩하는 Cap 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 포유 동물 또는 곤충 세포와 같은 안정한 생산자 세포를 사용하며, 형질감염 플라스미드 또는 재조합 헬퍼 바이러스의 형태로 전달되는 본원에 기재된 바와 같이 교정 게놈을 사용함)을 포함한다.
V. 실시예
본원에 개시된 재조합 AAV 벡터는 뉴클레아제가 없는 상동성 의존 복구 기반 메커니즘을 통해 시험 관내 및 생체 내에서 매우 효율적인 유전자 편집을 매개한다. 하기 실시예는 본원에 개시된 바와 같은 AAV-기반 벡터를 사용하여 겸상세포질환(SCD: sickle cell disease) 및 베타 지중해빈혈증과 같은 특정 인간 질환에서 돌연변이된 HBB 유전자의 효율적인 교정을 입증한다. 이들 실시예는 제한이 아니라 예시로서 제공된다.
실시예 1 : HBB-돌연변이체 세포의 유전자 편집을 위한 AAV 캡시드의 선택
본 실시예는 HBB 돌연변이체 세포에서 AAVHSC7, AAVHSC15, 및 AAVHSC17과 같은 clade F AAV 캡시드에 패키지된 유전자 편집 AAV 벡터, AAVS1-FP의 통합 효율을 특징으로 한다. 각각 AAVF7, AAVF15, 및 AAVF17로도 공지된 AAVHSC7, AAVHSC15, 및 AAVHSC17은 WO2016049230A1에 완전히 기재되어 있으며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
본원에 사용된 유전자 편집 벡터인 AAVS1-FP는 WO2016049230A1에 완전히 기재되어 있다. 이는 5' 내지 3': AAV2 5' 반전된 말단 반복(ITR: inverted terminal repeat), 표적 좌위로부터 상류 DNA의 서열을 갖는 800개의 뉴클레오티드로 구성된 5' 상동성 암, 업스트림, 스플라이스 수용체, 2A 요소, 형광 단백질(FP: fluorescent protein)의 코딩 서열, 표적 좌위로부터 하류 DNA의 서열을 갖는 800개의 뉴클레오티드로 구성된 3' 상동성 암, 및 AAV2 3' ITR을 포함하며, 상기 표적 좌위는 염색체 19 상의 AAVS1에서 인간 PPP1R12C의 인트론 1에 존재하며, AAVS1-FP 벡터와 인간 게놈 사이의 상동 재조합 후, PPP1R12C의 엑손 1, 2A 요소, 및 FP 코딩 서열이 프레임 내에 있다. 벡터에서 FP 코딩 서열은 프로모터가 없기 때문에, 이 벡터로 형질도입된 세포는 벡터가 게놈에 통합된 경우에만 FP를 발현할 것이다. AAV2 ITR 및 향상된 녹색 형광 단백질(EGFP: enhanced green fluorescent protein)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 자가-상보성 AAV 벡터인 AAVHSC-scEGFP는 형질도입 효율의 제어로서 역할하였다(예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된 미국 특허 제8,628,966호 참조).
겸상세포질환(SCD: sickle cell disease)의 특징인 HBB의 인트론 1에서 위치 20에서 A에서 T로 돌연변이를 갖는 림프 모세포 세포주(LCL: lymphoblastoid cell line)인 GM16265 세포를 코리엘 의료 연구소(Coriell Institute for Medical Research)(뉴저지 주 캠든 소재)로부터 얻었다. LCL을 15% FCS 및 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI에서 배양하였다. 세포를 ml 당 대략 200,000개의 세포에 시딩(seed)하고 ml 당 500,000 내지 1,000,000개으 세포에 도달할 때 분열시켰다. 세포를 도말하기 전에, 필요한 바이러스 양을 각각의 형질도입에 대해 계산하였다. 바이러스의 형질도입 부피는 웰의 총 부피의 10%를 초과하지 않았다. 형질도입 당일, 로그 상 세포를 계수하고 도말하였다. 1.5 x 105의 감염 다중도(MOI: multiplicity of infection)에서 바이러스로 세포에 형질도입하였다. 패키지된 AAV 입자를 형질도입 전에 얼음 상에서 해동시키고 필요한 경우 얼음 상에서 초음파 처리하고, 각 웰에 개별적으로 첨가하였다. 형질도입 48 시간 후 세포를 수확하였다.
GM16265 세포는 AAVHSC7, AAVHSC15 또는 AAVHSC17 캡시드에 패키지된 AAVS1-FP 벡터로 형질도입되었다. 통합 효율은 하기 방법을 사용하여 유세포 분석에 의해 평가되었다: 세포를 FACS 완충액(IX PBS, 2% FCS, 0.1% 나트륨 아지드)을 사용하여 수확하고, 1200 RPM에서 10 분 동안 원심분리하였다. 여분의 상청액을 따라내어 대략 200 μl가 남았다. 4',6-디아미디노-2-페닐리놀레(DAPI)를 유세포 분석 직전에 100 μM 워킹 스톡(working stock)으로부터 3 μM의 최종 농도로 첨가하였다.
도 1a에 도시된 바와 같이, AAVHSC7-AAVS1-FP 및 AAVHSC17-AAVS1-FP에 의해 형질도입된 모든 활물 세포 중 FP-양성 세포의 백분율은 각각 24.3%(34.0% - 배경 레벨 9.7%) 및 7.8%(17.5% - 배경 레벨 9.7%)였다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 다른 실험에서, AAVHSC15-AAVS1-FP 및 AAVHSC17-AAVS1-FP에 의해 형질도입된 모든 활물 세포 중 FP-양성 세포의 백분율은 각각 25.1%(29.8 % - 배경 레벨 4.7%) 및 37.6%(42.3% - 배경 레벨 4.7%)였다. 이 데이터는 GM16265 세포가 AAVHSC7, AAVHSC15 및 AAVHSC17 캡시드에 패키지된 AAVS1-FP에 의해 효율적으로 형질도입될 수 있음을 보여준다.
AAVHSC17 캡시드에 패키지된 이 AAVS1-FP 벡터의 통합 효율은 또한 1차 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC)에서 검사되었다. 1차 인간 CD34+ HSC를 Miltenyi CD34 MicroBeads를 2회 농축함으로써 SCD를 갖는 공여체로부터의 인간 말초 혈액 세포로부터 정제하거나, 유사한 이중 농축 절차에 따라 ReachBio Inc.로부터 수득하였다. 세포를 20% 우태혈청(FCS: Fetal Calf Serum), 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린, 2mmol/L L-글루타민, 10 ng/mL 인간 IL-3, 10 ng/mL 인간 IL-6, 및 1 ng/mL 인간 SCF으로 보충된 이스코브 변형된 둘베코 배지(IMDM: Iscove's Modified Dulbecco's Medium)에서 배양하였다. 약 200,000개의 세포를 500 μl 배지에 도말하였다. AAV 입자를 배지에 직접 첨가하였다. 형질도입 48 시간 후 세포를 수확하였다.
BioRad QX200™ Droplet Digital™ PCR 시스템을 사용하는 디지털 액적 PCR에 의해 편집 효율을 측정하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 두 세트의 프라이머 및 프로브를 ddPCR에 의한 통합을 정량화하도록 설계하였다. AAVS1_Genomic 세트는 게놈의 AAVS1 좌위에 FP 코딩 서열의 표적화된 통합 후 비편집된 게놈 및 편집된 게놈에서 상동성 암 외부에 존재하는 AAVS1 좌위에서 서열을 검출하였다. AAVS1_FP 세트는 게놈의 AAVS1 좌위에 FP 코딩 서열의 표적화된 통합 후 편집된 게놈에서만 존재하는 FP 코딩 영역에서 서열을 검출하였다. 2개의 프로브를 상이한 파장의 형광 모이어티에 접합시켰다.
Figure pct00001
100 pg/μl의 DNA를 갖는 샘플을 오일 액적으로 분할하였다. 대부분의 오일 액적은 DNA 분자를 함유하지 않거나 단일 DNA 분자-AAVS1_Genomic 세트에만 양성인 비편집된 게놈; AAVS1_FP 세트에만 양성인 비통합된 벡터; 또는 프라이머/프로브 세트 양쪽 모두에 양성인 편집된 게놈을 함유하였다. 공동-파티션의 가능성을 여러 표준 샘플에 의해 결정하였다(그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되어 있는, 문헌[Regan et al, A rapid molecular approach for chromosomal phasing, PLoS One. (2015) 10(3):e0118270] 참조). 표준 샘플은 μl 당 100개의 비편집된 게놈, μl 당 1000개의 에피솜 벡터, 및 각각 μl 당 1, 5, 10, 15, 20, 및 25개의 편집된 대립 유전자에서 클로닝된 양성 대립 유전자의 범위를 함유하였다. 비편집 대 편집된 대립 유전자의 비율에 대한 공동-분할의 표준 곡선을 플롯팅하였다(R2 = 0.972, 피어슨(Pearson) 상관 p <0.001).
각각의 샘플을 적어도 3회의 실험에서 ddPCR로 분석하였고, 각각의 샘플에서 AAVS1_Genomic 양성, AAVS1_FP 양성, 및 이중 양성 액적의 양을 측정하였으며 각각의 샘플에서 비편집 대 편집된 대립 유전자의 알려진 비율에 대해 플롯팅하였다. 도 1c에 도시된 바와 같이, 게놈으로의 FP 코딩 서열의 통합을 1차 인간 CD34+ HSC로부터의 모든 대립 유전자의 약 30%에서 검출하였다. 따라서, AAVHSC17 캡시드에 패키지된 AAVS1-FP는 1차 인간 Cd34+를 효율적으로 형질도입하였다.
실시예 2: HBB 돌연변이의 시험관 내 교정
도 2에 도시된 바와 같이, hHBB-hL-014라는 명칭의 AAV-기반 HBB 교정 벡터를 생성하였다. 이 교정 벡터는 겸상세포질환에서 HBB 유전자의 엑손 1의 코딩 영역(시작 코돈으로부터 시작)에서 뉴클레오티드 20에서 HBB 돌연변이, 예를 들어 A에서 T로의 돌연변이를 교정하도록 설계되었다. hHBB-hL-014 벡터는 HBB의 일부 및 그 주변 게놈 서열 측면의 5' 및 3' AAV2 ITR을 포함하였으며, 엑손 1에서 뉴클레오티드 20에서 A에서 T로의 돌연변이는 역전되었다. HBB 게놈 서열의 일부를 NCBB Primer Blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 사용하여 설계된 표 2에 나타낸 바와 같이 증폭 프라이머를 사용하여 야생형 HBB 및 그의 주변 좌위로부터 수득 하였다. PCR 산물은 HBB의 모든 엑손 및 인트론을 커버하였고, HBB 전사 개시 부위로부터 상류에 1678개의 뉴클레오티드 및 HBB 폴리아데닐화 서열로부터 하류에 234개의 뉴클레오티드를 더 포함하였다. 겸상세포질환에서 HBB 돌연변이와 관련하여, 이 벡터는 각각 약 1.7 kb 길이의 상동성 암(돌연변이 역전 부위에 대한 게놈 서열 5' 및 3')을 함유하였다. ITR의 무결성(integrity)을 Bglll, Mscl, 및 Smal을 사용한 제한 다이제스트 스크리닝 및 ITR 특이적 시퀀싱 프로토콜을 사용한 시퀀싱에 의해 확인하였다(문헌[Mroske et al., Hum Gene Ther Methods (2012) 23 (2) : 128-36]). 인서트(insert)는 본원의 표 3에 나타낸 프라이머를 사용한 제한 다이제스트 및 생거(Sanger) 시퀀싱에 의해 확인되었다. 이 벡터는 HBB 엑손 및 인트론에서의 돌연변이뿐만 아니라 베타 지중해빈혈증에서 관찰된 바와 같이 HBB 발현에 영향을 미치는 5' 및 3' 비번역된 영역에서의 돌연변이를 교정할 수 있었다.
Figure pct00002
Figure pct00003
교정된 유전자의 검출을 용이하게 하기 위해, ClaI 제한 부위 및 SpeI 제한 부위를 함유하는 ACTAGTATCGAT(서열 번호: 80)의 서열을 갖는 12-bp 링커를 HBB 유전자에 삽입하였다. 이 링커 서열은 시작 코돈으로부터 117 bp 및 돌연변이 역전 부위로부터 97 bp인 인트론 1에 위치하여, 링커(Linker)와 원하는 유전자 교정 사이에 강력한 유전적 연결을 확립하였다. 인트론 1에서 주요 공여체 및 수용체 부위의 파괴를 교정된 HBB의 mRNA 스플라이싱을 유지하기 위해 회피하였다.
hHBB-hL-014 벡터를 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되어 있는 문헌[Chatterjee et al., (1993) Methods 5:51-59]에 기재된 패키징 방법을 사용하여 AAVHSC15 또는 AAVHSC17 캡시드 단백질로 패키징하였다. 패키지된 바이러스의 역가를 표 4에 나타낸 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR에 의해 결정하였다.
Figure pct00004
AAVHSC15-hHBB-hL-014 및 AAVHSC17-hHBB-hL-014 바이러스를 표적된 통합(TI) 분석법을 사용하여 GM16265 세포에서 HBB 유전자를 편집하는 능력에 대해 테스트하였다. 이 분석에서, 세포를 4000 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, IX PBS로 세척하였고, 펠릿을 후속 사용을 위해 80℃에서 동결시켰다. 냉동된 세포 펠릿을 100,000개 세포에 대해 200 μl에서 재현탁시켰다. 무 DNase(DNase-free) RNase 1 μl를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 10% SDS 10 μl 및 프로테나제 K 1.2 μl를 첨가하고 56℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 고 분자량 DNA를 표준 페놀 및 클로로포름 추출에 의해 추출하였다. 높은 DNA 수율을 위해, 0.5X 부피의 Tris-EDTA 완충액(TE: Tris-EDTA buffer) (pH 8.0)으로 역 추출을 수행하고 최종 튜브에 첨가하였다. DNA를 2.5 M의 최종 농도에서 10 M 암모늄 아세테이트로 침전시켰다. 대략 4X 부피의 빙냉 100% 에탄올을 첨가하였다. DNA를 -80℃에서 적어도 1 시간 동안 침전시켰다. DNA를 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 대략 30 내지 50 μ의 TE에 재현탁시키고, 나노드롭(Nanodrop)에 의해 정량화하였다. 정량화 후, hHBB-hL-014 벡터와 HBB 유전자 사이의 정확한 재조합을 확인하기 위해 DNA를 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 기반의 "표적된 통합"(TI) 분석을 거쳤다.
표 5에 기재된 서열을 갖는 프라이머를 본 실시예에서 TI 검정에 사용하였다. HBB2MTI100 프라이머는 링커 및 그 주변 영역을 표적하였고, HBB350 프라이머는 상동성 암 외부의 게놈 서열을 표적하였다. PCR 반응은 편집된 게놈으로부터 단리된 DNA로부터 2,219 bp 앰플리콘을 생성하지만 형질도입되지 않은 세포 또는 hHBB-hL-014 벡터 단독으로부터 단리된 DNA를 실질적으로 증폭하지 않을 것이다.
PCR 반응을 다음과 같이 설정하였다: 최대 50 μl의 PCR 물; 10 μl의 5X Q5 완충액; 5 μl의 베타인; 1 μl의 10 mM dNTP; 1 μl의 HBB2MTI100 정방향 프라이머(25 μΜ 농도); 1 μl의 HBB 350 역방향 프라이머(25 μM 농도); 100 ng 내지 1 μg의 게놈 DNA; 1 μl의 NEB Q5 고충실도 폴리머라제. PCR 기계를 다음과 같이 설정하였다: 95℃에서 5 분 동안 초기 변성; 95℃에서 10 초 동안 변성 15 사이클, 70℃에서 30 초 동안 어닐링, 사이클마다 0.5 도 감소, 및 72℃에서 2 분 동안의 연장; 95℃에서 10 초 동안 변성 20 사이클; 65℃에서 30 초 동안 어닐링, 및 72℃에서 2 분 동안 연장; 및 72℃에서 5 분 동안의 최종 연장. PCR 산물을 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
2.2 kb의 겉보기 크기를 갖는 앰플리콘을 단리하고 무딘 말단(blunt-end)을 pUC18 백본(backbone)에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 ClaI 또는 SpeI 엔도뉴클레아제를 사용하여 제한 소화에 의해 분석하여 링커의 정확한 삽입으로 클론을 동정하였다. 제한 소화에 의해 동정된 양성 클론을 M13F 및 M13R 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 DNA 시퀀싱에 의해 추가로 분석하였다.
Figure pct00005
도 3a에 도시된 바와 같이, AAVHSC15-hHBB-hL-014 및 AAVHSC17-hHBB-hL-014 바이러스로 형질도입된 GM16265 세포에서 2.2 kb PCR 밴드(hHBB-hL-014 벡터에 의한 정확한 편집을 나타냄)가 TI 검정에서 검출된 반면에, 이 PCR 산물은 형질도입되지 않은 GM16265 세포에서 검출되지 않았다.
GM16265 세포에서 HBB 유전자의 위치 20에서 A에서 T 돌연변이의 교정은 TI 검정에서 동정된 양성 클론의 시퀀싱에 의해 검증되었다. 서열 분석은 AAVHSC15-hHBB-hL-014 또는 AAVHSC17-hHBB-hL-014 바이러스로 형질도입한 후, T 돌연변이가 A로 교정되었고, 근처 무증상 돌연변이도 야생형으로 교정되었다. 반대쪽 PCR 가닥의 시퀀싱은 돌연변이의 교정을 확인하였다. HBB 좌위에 링커의 삽입은 모든 클론에서 검출되었다. 또한, 시험된 클론 중 어느 것도 상동성 암의 말단에 상응하는 게놈 영역에서 바람직하지 않은 돌연변이(예를 들어, 추가 삽입, 결실 또는 역전)를 나타내지 않았다.
HBB 유전자를 편집하는 hHBB-hL-014 벡터의 능력을 더 확인하기 위해, 2개의 추가 LCL인 GM16266 및 GM16267을 사용하였다. 이들 LCL은 또한 코리엘 의료 연구소(Coriell Institute for Medical Research) (뉴저지 주 캠든 소재)로부터 입수하였고, GM16265와 다른 증여체로부터 수집되었다. 두 LCL 양쪽 모두 HBB의 인트론 1에서 위치 20에서 A에서 T로의 돌연변이를 가졌다. GM16265의 배양 및 형질도입을 위한 동일한 방법에 따라, 세포는 AAVHSC17 캡시드에 패키지된 hHBB-hL-014로 형질도입되었다.
도 3b에 도시된 바와 같이, 약 2.2 kb의 PCR 앰플리콘이 AAVHSC17-hHBB-hL-014로 형질도입된 세포로부터는 검출되었지만. 형질도입되지 않은 세포로부터는 검출되지 않았다. 시퀀싱 결과는 SCD 돌연변이가 3 개의 모든 LCL(GM16265 세포 포함)로부터 형질도입된 세포에서 교정되었고, 바람직하지 않은 돌연변이(예를 들어, 추가 삽입, 결실, 또는 역전)는 상동성 암의 말단에 상응하는 게놈 영역에서 검출되지 않았음을 보여주었다. 시퀀싱 결과는 또한 상동성 암으로부터 게놈으로의 적절한 링커 삽입 및 끊김없는(seamless) 전이를 확인하였다.
상기 결과는 hHBB-hL-014 벡터가 돌연변이체 HBB 유전자를 다수의 SCD 세포주에서 야생형 서열로 되돌릴 수 있음을 보여준다. 따라서, 베타 지중해빈혈증과 같은 다른 유전 질환에서 HBB 유전자의 엑손, 인트론 또는 조절 서열에서의 돌연변이는 또한 hHBB-hL-014 벡터를 사용하여 교정할 수 있어야 한다.
실시예 3: HBB의 게놈 서열을 포함하는 HBB 교정 벡터
본 실시예는 HBB 유전자에서 돌연변이를 교정할 수 있는 HBB의 게놈 서열을 포함하는 AAV-기반 HBB 교정 벡터를 제공한다.
a) HBB 교정 벡터 hHBB-hL-001
도 4a에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-hL-001은 모든 엑손, 모든 인트론 및 폴리아데닐화 서열을 포함하는 HBB 게놈 서열을 함유한다. 이 벡터는 HBB 전사 개시 부위(도 4a에서 "HBB HAL"로 지칭됨)로부터 상류에서 800 bp를 포함하는 5' 영역, 및 HBB 폴리아데닐화 서열(도 4a에서 "HBB HAR")로부터 하류에서 800 bp를 포함하는 3' 영역을 추가로 함유한다. hHBB-hL-001 벡터는 서열 번호: 31(TI RE 링커 포함) 또는 서열 번호: 32 (TI RE 링커 제외)에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18의 서열을 가짐) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19의 서열을 가짐)을 더 포함한다. 이 벡터는 HBB 엑손 및 인트론에서의 돌연변이뿐만 아니라 베타 지중해빈혈증에서 관찰된 바와 같이 HBB 발현에 영향을 미치는 5' 및 3' 비번역된 영역에서의 돌연변이를 교정한다.
b) HBB 교정 벡터 hHBB-h1W-013
도 4b에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-h1W-013은 엑손 1, 2 및 3의 코딩 영역의 DNA 서열이 상응하는 야생형 서열에 완전히 동일하기 보다는 약 67% 동일하게 침묵 변경되는 것을 제외하고는 HBB 교정 벡터 hHBB-hL-001에서와 동일한 유전적 요소를 함유한다. 감소된 서열 동일성은 코돈 변경에 기인하며, 여기서 변성 코돈은 인코딩된 아미노산을 변화시키지 않고 오리지널(original) 코돈으로 치환된다. 이 침묵 코돈 변경은 HBB의 발현 수준을 크게 변화시킬 것으로 예상되지 않는다. 대신, 엡실론 글로빈(HBE), 델타 글로빈(HBD), 감마 글로빈 1(HBG1), 감마 글로빈 2(HBG2), 및 HBB 유사 유전자 HBBP와 같은 다른 글로빈 유전자 또는 유사 유전자와의 HBB 엑손의 상동성을 감소시켜 다른 게놈 좌위에서 이 벡터의 바람직하지 않은 재조합 가능성을 감소시킨다. 특정 실시예에서, 엑손 1, 엑손 2, 및 엑손 3의 코딩 영역의 침묵 변경된 서열은 각각 서열 번호: 43, 44, 및 45에 기재되어 있다. hHBB-h1W-013 벡터는 서열 번호: 33(TI RE 링커 포함) 또는 서열 번호: 34(TI RE 링커 제외)에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18의 서열을 가짐) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19의 서열을 가짐)을 더 포함한다.
c) HBB 교정 벡터 hHBB-hL-011
도 4c에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-hL-011은 HBB 폴리아데닐화 서열(도 4c에서 "HBB HAR"로 지칭됨)로부터 하류의 3' 영역이 길이가 약 100 bp인 것을 제외하고는 HBB 교정 벡터 hHBB-hL-001에서와 동일한 유전적 요소를 함유한다. 이러한 변형은 프로모터 서열이 전사 인자 및 보조 인자를 모집할 수 있기 때문에 HBB 폴리아데닐화 서열로부터 약 100 bp 하류에 위치한 다른 유전자(예를 들어, GATA 1, MYC 등)의 전사 프로모터 서열의 포함을 최소화하도록 하여, 이에 의해 상동 재조합의 효율을 감소시킨다. 추가적으로, 전사 프로모터 서열의 포함은 벡터로부터 HBB의 비정상적인 발현을 증가시킬 수 있다. hHBB-hL-011 벡터는 서열 번호: 35(TI RE 링커 포함) 또는 서열 번호: 36(TI RE 링커 제외)에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18의 서열을 가짐) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19의 서열을 가짐)을 더 포함한다.
d) HBB 교정 벡터 hHBB-h1W-012
도 4d에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-h1W-012는 엑손 1, 2 및 3의 코딩 영역의 DNA 서열이 상응하는 야생형 서열에 67% 동일하게 침묵 변경되는 것을 제외하고는 HBB 교정 벡터 hHBB-hL-011에서와 동일한 유전적 요소를 함유한다. 특정 실시예에서, 엑손 1, 엑손 2, 및 엑손 3의 코딩 영역의 침묵 변경된 서열은 각각 서열 번호: 43, 44, 및 45에 기재되어 있다. hHBB-h1W-012 벡터는 서열 번호: 37(TI RE 링커 포함) 또는 38(TI RE 링커 제외)에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18의 서열을 가짐) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19의 서열을 가짐)을 더 포함한다.
본 실시예에서 4개의 HBB 교정 벡터 각각은 교정 유전자의 검출을 용이하게 하기 위해 독특한 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 및 절단 부위를 포함하는 링커 서열을 함유한다. 이 링커 서열은 시작 코돈으로부터 117 bp인 인트론 1에 위치한다. 인트론 1에서 주요 공여체 및 수용체 부위의 파괴를 교정된 HBB의 mRNA 스플라이싱을 유지하기 위해 회피하였다.
상기 기재된 4개의 HBB 교정 벡터 각각은 AAVHSC17에서 생성되고 패키지되었다. 1차 인간 CD34+ HSC를 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 바이러스로 형질도입되고, 실시예 2에 기재된 TI 검정에 의해 통합을 평가하였다. 도 5a 및 5b에 도시된 바와 같이, hHBB-hL-001, hHBB-hL-011, 및 hHBB-h1W-012는 모두 HBB 유전자를 편집할 수 있었다.
게놈 편집의 효율은 차세대 시퀀싱(NGS: next generation sequencing)에 의해 정량적으로 측정되었다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 상동성 암 외부의 게놈의 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이들 프라이머는 비편집 및 편집된 대립 유전자로부터 2,342 bp의 산물을 증폭시킬 것이지만, AAV 벡터를 증폭시키지 않을 것이다.
Figure pct00006
PCR 반응을 다음과 같이 설정하였다: 최대 50 μl의 PCR 물; 10 μl의 5X Q5 완충액; 5 μl의 베타인; 1 μl의 10 mM dNTP; 1 μl의 HBB350 역방향 프라이머(25 μΜ 농도); 1 μl의 HBB L NGS S1 프라이머(25 μM 농도); 200 ng의 게놈 DNA; 및 1 μl의 Q5 고충실도 폴리머라제. PCR 기계를 다음과 같이 설정하였다: 98℃에서 30 분 동안 초기 변성; 95℃에서 10 초 동안 변성 30 사이클, 65℃에서 30 초 동안 어닐링, 및 72℃에서 2 분 동안의 연장; 및 72℃에서 5 분 동안의 최종 연장.
정확한 크기의 PCR 산물을 겔 전기영동에 의해 단리하고, 표준 프로토콜에 따라 Qiagen Qiaquick Gel 추출 키트를 사용하여 추출하였다. 겔 추출된 앰플리콘에서 벡터 게놈의 부재를 벡터 특이적 프라이머 및 공지된 수의 벡터 특이적 게놈 주형을 양성 대조군으로 사용하여 PCR에 의해 확인하였다. 벡터 게놈의 부재를 확인하기 위해, 하기 PCR 조건을 이용하였다: 98℃에서 30 분 동안 초기 변성; 98℃에서 10 초 동안 변성 30 사이클, 66℃에서 30 초 동안 어닐링, 및 72℃에서 1 분 동안의 연장; 및 72℃에서 2 분 동안의 최종 연장. 사용된 정방향 프라이머는 AAAGTCAGGGCAGAGCCATC(서열 번호: 108)이고, 사용된 역방향 프라이머는 AATGATTAACCCGCCATGCT(서열 번호: 109)였으며, 1,797개의 염기쌍의 앰플리콘을 증폭시킬 것이다.
추출된 PCR 산물을 NGS 시퀀싱 및/또는 하기에 기재된 바와 같은 디지털 PCR 정량화에 사용하였다. NGS 시퀀싱의 경우, 추출된 PCR 산물을 표 7에 나타낸 프라이머를 사용하여 중첩된 PCR 라운드에 적용하였다. 각각의 샘플은 순방향 및 역방향 프라이머의 독특한 조합을 가졌으며, 각각의 정확한 PCR 산물의 크기는 약 388 bp였다. PCR 기계를 다음과 같이 설정하였다: 98℃에서 30 분 동안 초기 변성; 98℃에서 10 초 동안 변성 30 사이클, 72℃에서 30 초 동안 어닐링, 및 72℃에서 30 초 동안의 연장; 및 72℃에서 2 분 동안의 최종 연장.
Figure pct00007
앰플리콘 크기를 겔 전기영동에 의해 확인하고, PCR 산물을 표준 프로토콜에 따라 Qiagen Qiaquick PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 모든 시험된 샘플로부터의 앰플리콘을 동일한 몰 농도로 혼합하고, 농도를 Advanced Analytical 생물분석기(bioanalyzer)로 확인하였다. 샘플을 MiSeq V2 300 사이클 키트를 사용하여 시퀀싱하였다.
표 8은 NGS 분석으로부터 결정된 바와 같이, 링커 서열의 존재 또는 부재 하에 수용 가능한 판독 수 뿐만 아니라 HBB 서열을 갖는 판독의 수를 나타낸다. 링커 서열의 존재는 AAV 벡터 통합을 나타내기 때문에, 링커를 갖는 대립 유전자의 백분율은 이들 벡터의 통합의 대립 유전자 빈도를 나타내며, 이는 일반적으로 0.1% 내지 1%이다.
Figure pct00008
디지털 PCR의 경우, 추출된 PCR 산물에 BioRad QX200™ Droplet Digital™ PCR 시스템을 사용하여 디지털 PCR 분석을 수행하였다. 게놈 표적과 삽입된 벡터 페이로드(링커) 사이의 연결을 계산하여 편집을 결정하고, 변이체 간의 유전적 연결에 사용되는 방법을 이용하는 우연의 일치(coincidence by chance)의 가능성과 관련하여 벡터 및 게놈 양쪽 모두를 함유하는 분할된 액적의 양을 검출함으로써 측정하였다(예를 들어, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되어 있는 문헌[Regan et al., A rapid molecular approach for chromosomal phasing, PLoS One. (2015) 10(3):e0118270] 참조). 0.1 ng/ul의 게놈 DNA의 농도를 연결용 샘플 당 최소 3회의 실험에 걸쳐 분석하고, 벡터 특이적 프로브 세트 및 게놈 특이적 프로브 세트를 갖는 다중화된 ddPCR을 사용하여 측정하였다. 프라이머 및 프로브 세트는 다음과 같다:
Figure pct00009
알려진 양의 편집된 물질에 대해 상기 방법에 따라 게놈 편집/연결을 측정하기 위해, 표준 DNA 시리즈가 생성되었다. 표준은 ul 당 100개의 비편집된 게놈, ul 당 1000개의 에피솜 벡터, 및 각각 ul 당 1, ul 당 5, ul 당 10, ul 당 15, ul 당 20, 및 ul 당 25개의 편집된 대립 유전자에서 클로닝된 양성 대립 유전자의 범위로 구성된다. 각각의 샘플에서 유전적 연결의 양을 측정하고 각각의 샘플에서 비편집 대 편집된 대립 유전자의 알려진 비율에 대해 플롯팅하였다(R2 = 0.972, 피어슨 상관 p<0.001).
1.5 x 105의 MOI에서 다양한 AAVHSC7 HBB 편집 벡터로 형질도입된 1차 CD34+ 혼합 제대혈 세포에서 HBB 좌위의 편집을 디지털 PCR에 의해 측정하였다. 형질도입 후 48 시간에 세포를 수확하고, PCR 산물의 아웃/아웃 PCR 및 디지털 PCR 분석에 의해 편집된 대립 유전자의 백분율에 대해 분석하였다. 도 6은 표시된대로 샘플에서 편집된 좌위의 분율을 도시한다.
실시예 4: HBB 코딩 서열 또는 이의 일부를 포함하는 HBB 교정 벡터
본 실시예는 HBB 코딩 서열 또는 이의 일부를 HBB 유전자 내로 예를 들어, 시작 코돈 이후 또는 인트론 1 내로 삽입할 수 있는 HBB 교정 벡터를 제공한다. 삽입된 서열은 천연 전사 조절 요소의 제어 하에 천연 좌위로부터 전사 및 번역될 수 있고, 이에 의해 기능적 HBB 단백질의 발현을 회복시킨다.
HBB 교정 벡터의 각각은 제2 코돈에서 정지 코돈까지 HBB 코딩 서열 또는 이의 일부를 함유하였다. HBB 코딩 서열 또는 이의 일부는 SV40 폴리아데닐화 서열이 뒤따르는데, 이는 적절한 발현을 지지하고 나머지 내인성 HBB 유전자의 추가 전사를 상당히 감소시키기에 충분히 강하다. 독특한 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 및 절단 부위를 포함하는 표적화된 통합 제한 카세트("TI RE 카세트")는 폴리아데닐화 서열의 하류에 선택적으로 삽입되어 원하는 상동 재조합의 검출을 용이하게 한다.
a) HBB 교적 벡터 hHBB-hA-009
도 7a에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-hA-009는 제2 코돈에서 정지 코돈까지의 야생형 HBB 코딩 서열의 일부(서열 번호: 27의 뉴클레오티드 4 내지 444), 이후 상기 기재된 바와 같이 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 벡터는 HBB 시작 코돈으로부터 상류이고 이를 포함하는 야생형 게놈 서열을 포함하는 5' 상동성 암(도 7a에서 "HBB HAL"로 지칭됨), 및 HBB 시작 코돈으로부터 하류이고 이를 포함하지 않는 3' 상동성 암(도 7a에서 "HBB HAR"로 지칭됨)을 더 포함한다. 상기 5' 상동성 암 및 상기 3' 상동성 암은 길이가 약 800 bp이다. hHBB-hA-009 벡터는 서열 번호: 39에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18의 서열을 가짐) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19의 서열을 가짐)을 더 포함한다. 5' 상동성 암은 일부 베타 지중해성빈혈 환자에서 관찰된 바와 같이 HBB 발현에 영향을 주는 시작 코돈 및/또는 5' 비번역된 영역(UTR)에서 돌연변이를 교정하는 능력을 갖는다. 그 결과, HBB 교정 벡터 hHBB-hA-009의 통합은 5' UTR, 코딩 서열 또는 3' UTR에서 돌연변이에 의해 손상된 야생형 HBB의 발현을 회복시킬 수 있다.
b) HBB 교정 벡터 hHBB-hAW-002
도 7b에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-hAW-002는 HBB 코딩 서열의 부분이 야생형 cDNA 서열의 상응하는 영역에 서열 번호: 47, 67% 동일하게 침묵 변경되는 것을 제외하고는 HBB 교정 벡터 hHBB-hA-009에서와 동일한 유전적 요소를 함유한다. 실시예 3에서 설명된 바와 같이, 이 코돈 변경은 HBB의 발현 수준을 상당히 변경시킬 것으로 예상되지는 않는다. 대신, 다른 글로빈 유전자 및 유사 유전자와 HBB 엑손의 상동성을 감소시켜 다른 게놈 좌위에서 이 벡터의 바람직하지 않은 재조합을 감소시킨다. hHBB-hAW-002 벡터는 서열 번호: 40에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18의 서열을 가짐) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19의 서열)을 더 포함한다.
c) HBB 교정 벡터 hHBB-h1-010
도 7c에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-h1-010은 상동 재조합에 의해 인트론 1에 야생형 HBB 코딩 서열을 삽입하도록 설계된다. 구체적으로, 삽입 부위는 HBB 유전자의 뉴클레오티드 160 및 161 사이에 있으며, 삽입은 인트론 1에서 주요 스플라이스 공여체 부위의 파괴를 회피한다. 이 벡터의 편집 요소(삽입된 영역)는 5' 내지 3' 스플라이스 수용체 부위(도 7c에서 "SA", 예를 들어, 서열 번호: 14), 통합시 HBB 시작 코돈과 프레임 내에 있는 리보솜 스키핑 요소(도 7c에서 "T2A", 예를 들어, 서열 번호: 72), 야생형 HBB 코딩 서열(서열 번호: 27), 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 함유한다. 통합시, HBB 좌위로부터 전사된 전-mRNA는 5' 내지 3': 내인성 HBB의 엑손 1; 인트론 1의 5' 말단에 내인성 스플라이스 공여체를 포함하여 인트론 1의 제1 68개 뉴클레오티드; hHBB-h1-010 벡터에 의해 도입된 스플라이스 수용체; 리보솜 스키핑 요소; HBB 코딩 서열; 및 poly(A) 테일을 함유한다. 스플라이싱 후, mRNA는 5' 내지 3': 내인성 HBB의 엑손 1; 인-프레임 리보솜 스키핑 요소; HBB 코딩 서열; 및 poly(A) 테일을 함유한다. 리보솜 스키핑 요소는 2개의 폴리펩티드: 부분 리보솜 스키핑 펩티드와 융합된 엑손 1의 말단에서 종결된 절두된 HBB 펩티드 및 전장 HBB의 N- 말단에 융합된 리보솜 건너 뛰기 펩티드의 프롤린 폴리펩티드를 생성하게 된다.
hHBB-h1-010 벡터는 삽입 부위로부터 상류에 야생형 게놈 서열을 포함하는 5' 상동성 암(도 7c에서 "HBB HAL"로 지칭됨) 및 삽입 부위로부터 하류에 야생형 게놈 서열을 포함하는 3' 상동성 암(도 7c에서 "HBB HAR"로 지칭됨)을 더 포함한다. 상기 5' 상동성 암 및 상기 3' 상동성 암은 길이가 약 800 bp이다. hHBB-h1-010 벡터는 서열 번호: 41에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18를 가짐) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19를 가짐)을 더 포함한다. 5' 상동성 암은 일부 베타 지중해성빈혈 환자에서 관찰된 바와 같이 HBB 발현에 영향을 주는 5' UTR에서 돌연변이를 교정하며, 5' UTR, 코딩 서열, 또는 3' UTR에서 돌연변이에 의해 손상된 야생형 HBB의 발현을 회복하는 능력을 갖는다.
d) HBB 교정 벡터 hHBB-h1W-008
도 7d에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-h1W-008은 HBB 코딩 서열이 야생형 cDNA 서열의 상응하는 영역과 67% 동일하게 침묵 변경되는 것을 제외하고, HBB 교정 벡터 hHBB-h1-010에서와 동일한 유전적 요소를 함유한다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 이 서열 변형은 HBB의 발현 수준을 상당히 변화시킬 것으로 예상되지는 않는다. 대신에, 다른 글로빈 유전자 및 유사 유전자와 HBB 엑손의 상 동성을 감소시켜, 다른 게놈 좌위에서 이 벡터의 바람직하지 않은 재조합을 감소시킨다. 특정 실시예에서, 침묵 변경된 HBB 코딩 서열은 서열 번호: 47에 기재되어 있다. hHBB-h1W-008 벡터는 서열 번호: 42에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18을 가짐) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19를 가짐)을 더 포함한다.
e) HBB 교정 벡터 hHBB-hE3C-001
도 7e에 도시된 바와 같이, HBB 교정 벡터 hHBB-hE3C-001은 상동 재조합에 의해 정지 코돈 직후에 HBB 유전자의 엑손 3에 HBB 코딩 서열을 삽입하도록 설계된다. 이 벡터의 편집 요소(삽입된 영역)는 침묵 변경된 HBB 코딩 서열(서열 번호: 99, 야생형 HBB 코딩 서열에 85% 동일)과 프레임 내에 있는 5' 내지 3' 리보솜 스키핑 요소(도 7e에서 "P2A", 예를 들어 서열 번호 74), 및 SV40 폴리아데닐화 서열(서열 번호: 77)을 함유한다. HBB 코딩 서열의 침묵 변경은 코딩 서열로부터 발현된 단백질의 수준을 증가시키고, 바람직하지 않은 게놈 좌위로의 벡터의 오프-타겟팅으로 초래할 수 있는 저-복잡성(low-complexity) 서열을 제거하고/하거나 편집 요소 및 게놈 사이의 상동성을 감소시켜, 상동성 암보다는 편집 요소에 의해 매개되는 바람직하지 않은 통합을 감소시키도록 설계된다.
통합시, HBB 좌위로부터 전사된 mRNA는 5' 내지 3': 정지 코돈에 인접하여 5'의 천연 HBB mRNA의 일부, 리보솜 스키핑 요소, 침묵 변경된 HBB 코딩 서열, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 함유한다. 리보솜 스키핑 요소는 2개의 폴리펩티드: 리보솜 스키핑 펩티드의 N-말단 부분과 융합된 천연 전장 HBB 펩티드, 및 전장 야생형 HBB 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 리보솜 스키핑 펩티드로부터의 프롤린 잔기를 생성시킨다.
hHBB-hE3C-001 벡터는 서열 번호: 101을 포함하는 5' 상동성 암(도 7e에서"HAL"로 지칭됨), 서열 부위로부터 상류의 야생형 게놈 서열, 및 삽입 부위로부터 하류의 야생형 게놈서열인 서열 번호: 102의 서열을 포함하는 3' 상동성 암(도 7e에서 "HAR"로 지칭됨)을 더 포함한다.
hHBB-hE3C-001의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 104에 기재되어 있다. 상기 벡터는 5' ITR(예를 들어, 서열 번호: 18) 및 3' ITR(예를 들어, 서열 번호: 19의 서열을 가짐)을 더 포함한다.
hHBB-h1-010 및 hHBB-h1W-008의 통합 효율을 RKO 및 LCL 세포에서 평가하였다. GM16265 LCL 세포를 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 AAVHSC7에 패키지된 HBB 교정 벡터로 형질도입하였다.
RKO 세포를 ATCC로부터 수득하였다. 세포를 10% FCS 및 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 6 웰 플레이트에서 웰당 750,000개의 세포 밀도로 도말하였다. 세포를 하기 방법을 사용하여 형질감염시켰다: 도말 24 시간 후, (a) 250 μl OptiMEM에 희석된 2 μg의 HBB 편집 플라스미드 및 (b) 250 μl OptiMEM에 희석된 5 μl Lipofectamine 2000을 15 분 동안 혼합 및 배양함으로써 세포를 OptiMEM 배지에서 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후 세포를 수확하였다.
표 9에 기재된 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 TI 검정에 의해 통합을 평가하였다. SA-2A-FM1 및 SA-2A-FM2 프라이머는 hHBB-h1-010 또는 hHBB-h1W-008 벡터에 의해 게놈에 삽입된 스플라이스 수용체 및 T2A 요소에 특이적이었으며, HBB-Out-RM2 프라이머는 3' 상동성 암으로부터 하류 게놈의 영역에 특이 적이었다. SA-2A-FM1 또는 SA-2A-FM2과 HBB-Out-RM2의 프라이머 쌍은 형질도입되지 않은 세포에서의 생성물 또는 교정 벡터 단독으로부터의 생성물을 증폭시키지 않는다. SA-2A-FM1 및 HBB-Out-RM2를 사용한 PCR 반응은 hHBB-h1-010 또는 hHBB-h1W-008 벡터가 5' 및 3' 상동성 암을 통한 상동 재조합에 의해 통합되면 1,881 bp 앰플리콘을 생성할 것이며, 상기 벡터가 편집 요소에서 5' 상동성 암 및 엑손 2 서열을 통한 상동 재조합에 의해 통합되면 1,188 bp 앰플리콘을 생성할 것이다. SA-2A-FM2 및 HBB-Out-RM2를 사용한 PCR 반응은 또한 이러한 두 가지 통합 방식에서 다른 크기의 앰플리콘을 생성할 것이다.
PCR 반응을 다음과 같이 설정하였다: 최대 50 μl의 PCR 물; 5 μl의 10X PCR 완충액; 5 μl의 베타인; 1 μl의 10 mM dNTP; 1 μl의 50 mM MgCl2; 10 μl의 5X Q 시약; 2.5 μl의 TI 정방향 프라이머(5 μΜ 농도); 2.5 μl의 TI 역방향 프라이머(5 μΜ 농도); 100 ng 게놈 DNA; 및 0.5 μl의 HotStarTaq 폴리머라제. PCR 기계를 다음과 같이 설정하였다: 95℃에서 15 분 동안 초기 변성; 94℃에서 10 초 동안 변성 40 사이클, 58℃에서 30 초 동안 어닐링, 및 72℃에서 3 분 동안의 연장; 및 68℃에서 10 분 동안의 최종 연장. PCR 산물을 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
Figure pct00010
도 8에 도시된 바와 같이, SA-2A-FM1 및 HBB-Out-RM2 프라이머를 사용하여, 1,874 뉴클레오티드 길이를 갖는 표적화된 통합 PCR 산물이 hHBB-h1W-002로 형질도입된 RKO 세포에서 검출되어 벡터의 성공적인 통합을 원하는 방식으로 나타내었다. 이와 대조적으로, HBB 좌위와 편집 요소(3' 상동성 암에서가 아닌)에서 엑손 2의 재조합에 의해 생성된 단축된 PCR 산물을 hHBB-h1-010으로 형질도입된 RKO 및 LCL 세포에서 검출하였다. SA-2A-FM2 및 HBB-Out-RM2 프라이머를 사용하여 PCR로부터 유사한 결과를 얻었다. 이 결과는 편집 요소에서의 침묵 코돈 변경이 바람직하지 않은 재조합을 감소시키거나 제거함으로써 HBB 유전자의 정확한 편집을 보장한다는 것을 나타낸다.
실시예 5: HBB 돌연변이의 생체 내 교정
본 실시예는 이전 실시예에서 기재된 것과 같은 HBB 교정 벡터를 검사하기 위한 동물 모델을 제공한다. NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wj1/SzJ의 유전자형을 갖는 NSG 마우스에 치사량에 가깝게 조사하고 1차 인간 야생형 CD34+ HSC를 이식하여 조혈 재구성을 실시하였다. NSG 마우스에서 인간 CD34+ HSC의 생착(engraftment) 수준을 유세포 분석에 의해 인간 및 뮤린 CD45+ 세포의 존재에 대해 말초 혈액을 분석함으로써 이식 12 주 후에 결정하였다. 말초 혈액에서 25% 초과 순환 인간 세포를 갖는 마우스를 사용하여 생체 내에서 1차 인간 CD34+ HSC를 형질도입시키기 위한 특정 AAV 벡터의 통합 효율을 평가하였다.
AAVS1-FP 벡터를 AAVHSC7 및 AAVHSC17에 패키지하고, 바이러스 입자를 kg 당 1.22 x 1013 내지 1.54 x 1013 벡터 게놈의 용량으로 재구성된 NSG 마우스에 정맥 내 투여하였다. 혈액, 골수 및 비장 샘플을 투여 4 주 후 수집하였다. 당업계에 공지된 페놀/클로로포름 추출법에 의해 샘플로부터 DNA를 정제하고, 추출된 DNA를 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 ddPCR에 의해 분석하였다.
AAVHSC7 및 AAVHSC17 그룹으로부터의 데이터를 모았다. 도 9에 도시된 바와 같이, AAVS1-FP 벡터가 투여된 이식된 NSG 마우스에서, 통합의 대립 유전자 빈도는 혈액에서 약 3%, 골수에서 약 1%였다. 이 결과는 AAVHSC7 및 AAVHSC17 캡시드가 AAVS1 좌위에 통합하기 위한 벡터를 효율적으로 전달하고, HBB 편집 치료 벡터를 전달하는데 잠재적으로 사용될 수 있음을 시사하였다.
HBB 결함 1차 인간 CD34+ HSC로 재구성된 변형된 동물 모델은 교정 벡터 또는 상기 실시예에 기재된 바와 같은 교정 벡터를 사용하여 HBB 돌연변이의 교정을 테스트하는 데 유용하다. 예를 들어, AAVHSC7, AAVHSC15 또는 AAVHSC17 캡시드와 같은 AAV clade F 캡시드에 패키지된 교정 벡터는 재구성된 동물에게 투여될 수 있다. 통합 효율은 혈액 또는 골수 샘플을 수집하고, 원하는 상동 재조합이 광범위한 집단 또는 적혈구의 전구세포와 같은 특정 유형의 세포에서 발생한 세포의 백분율을 정량함으로써 측정될 수 있다.
HBB 결함 1차 인간 CD34+ HSC로 재구성된 동물은 HBB 유전자의 부족으로 인해 혈색소병증이 나타날 것으로 예상되며, 다양한 AAV 캡시드에 패키지된 HBB 교정 벡터의 효능 및 안전성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 효능은 망상 적혈구 수, 완전 혈구 수(CBC), 혈액 도말 및 벡터 서열의 표적된 통합을 측정하여 평가된다. 안전성은 아스파테이트 트랜스아미나제(AST) 및 알라닌 트랜스아미나제(ALT)와 같은 간 트랜스아미나제 수준을 측정함으로써 평가된다.
이 모델은 또한 각각의 투여 후 HBB 교정의 수명을 평가하여 투여 요법을 최적화하는 데 사용될 수 있다.
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본 발명은 본원에 기재된 특정 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 설명된 것들에 추가하여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구 범위의 범주 내에 속한다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌(예를 들어, 공개 또는 특허 또는 특허 출원)은 각각의 개별 참조(예를 들어, 공개 또는 특허 또는 특허 출원)가 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함되도록 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 그 전체 내용이 본원에 인용되어 그리고 모든 목적을 위해 포함된다. 다른 실시형태는 하기 청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CITY OF HOPE HOMOLOGY MEDICINES, INC. <120> ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RESTORING HBB GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF <130> IPA200361-US <150> US 62/574,163 <151> 2017-10-18 <150> US 62/621,102 <151> 2018-01-24 <160> 115 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> adeno-associated AAV9 <400> 1 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val 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<220> <223> AAV5 3' ITR <400> 21 tacaaaacct ccttgcttga gagtgtggca ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc 60 tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg 120 cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa cgcgacaggg gggagag 167 <210> 22 <211> 621 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV2 Rep <400> 22 Met Pro Gly Phe Tyr Glu Ile Val Ile Lys Val Pro Ser Asp Leu Asp 1 5 10 15 Glu His Leu Pro Gly Ile Ser Asp Ser Phe Val Asn Trp Val Ala Glu 20 25 30 Lys Glu Trp Glu Leu Pro Pro Asp Ser Asp Met Asp Leu Asn Leu Ile 35 40 45 Glu Gln Ala Pro Leu Thr Val Ala Glu Lys Leu Gln Arg Asp Phe Leu 50 55 60 Thr Glu Trp Arg Arg Val Ser Lys Ala Pro Glu Ala Leu Phe Phe Val 65 70 75 80 Gln Phe Glu Lys Gly Glu Ser Tyr Phe His Met His Val Leu Val Glu 85 90 95 Thr Thr Gly Val Lys Ser Met Val Leu Gly Arg Phe Leu Ser Gln Ile 100 105 110 Arg Glu Lys Leu Ile Gln Arg Ile Tyr Arg Gly Ile Glu Pro Thr Leu 115 120 125 Pro Asn Trp Phe Ala Val Thr Lys Thr Arg Asn Gly Ala Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Lys Val Val 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ctgagtgagc tgcactgtga caagctgcac 600 gtggatcctg agaacttcag ggtgagtcta tgggacgctt gatgttttct ttccccttct 660 tttctatggt taagttcatg tcataggaag gggataagta acagggtaca gtttagaatg 720 ggaaacagac gaatgattgc atcagtgtgg aagtctcagg atcgttttag tttcttttat 780 ttgctgttca taacaattgt tttcttttgt ttaattcttg ctttcttttt ttttcttctc 840 cgcaattttt actattatac ttaatgcctt aacattgtgt ataacaaaag gaaatatctc 900 tgagatacat taagtaactt aaaaaaaaac tttacacagt ctgcctagta cattactatt 960 tggaatatat gtgtgcttat ttgcatattc ataatctccc tactttattt tcttttattt 1020 ttaattgata cataatcatt atacatattt atgggttaaa gtgtaatgtt ttaatatgtg 1080 tacacatatt gaccaaatca gggtaatttt gcatttgtaa ttttaaaaaa tgctttcttc 1140 ttttaatata cttttttgtt tatcttattt ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag 1200 ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa 1260 tttctgggtt aaggcaatag caatatctct gcatataaat atttctgcat ataaattgta 1320 actgatgtaa gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt 1380 tattttatgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat 1440 catgttcata cctcttatct tcctcccaca gctcctgggc aacgtgctgg tctgtgtgct 1500 ggcccatcac tttggcaaag aattcacccc accagtgcag gctgcctatc agaaagtggt 1560 ggctggtgtg gctaatgccc tggcccacaa gtatcactaa gctcgctttc ttgctgtcca 1620 atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac taaactgggg gatattatga 1680 agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt gcaatgatgt 1740 atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt gggaggtcag tgcatttaaa 1800 acataaagaa atgaagagct agttcaaacc ttg 1833 <210> 24 <211> 1833 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB sequence from 5' mutation to 3' mutation with silent codon alterations <400> 24 cggctgtcat cacttagacc tcaccctgtg gagccacacc ctagggttgg ccaatctact 60 cccaggagca gggagggcag gagccagggc tgggcataaa agtcagggca gagccatcta 120 ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg 180 tccacctcac accagaagaa aaaagtgctg taacagctct ctggggaaaa gtcaatgtcg 240 acgaggtagg gggggaagct ctcggaaggt tggtatcaag gttacaagac aggtttaagg 300 agaccaatag aaactgggca tgtggagaca gagaagactc ttgggtttct gataggcact 360 gactctctct gcctattggt ctattttccc acccttagac tcctcgtcgt gtatccatgg 420 acacaaagat ttttcgaaag cttcggagac ctcagcacac cagacgcagt aatgggaaat 480 ccaaaagtca aagcacacgg aaaaaaggtc ctgggggctt tctctgacgg actcgcacat 540 ctcgataatc tgaaaggaac attcgctacc ctctctgaac tccattgcga taaactccat 600 gtcgacccag aaaattttag agtgagtcta tgggacgctt gatgttttct ttccccttct 660 tttctatggt taagttcatg tcataggaag gggataagta acagggtaca gtttagaatg 720 ggaaacagac gaatgattgc atcagtgtgg aagtctcagg atcgttttag tttcttttat 780 ttgctgttca taacaattgt tttcttttgt ttaattcttg ctttcttttt ttttcttctc 840 cgcaattttt actattatac ttaatgcctt aacattgtgt ataacaaaag gaaatatctc 900 tgagatacat taagtaactt aaaaaaaaac tttacacagt ctgcctagta cattactatt 960 tggaatatat gtgtgcttat ttgcatattc ataatctccc tactttattt tcttttattt 1020 ttaattgata cataatcatt atacatattt atgggttaaa gtgtaatgtt ttaatatgtg 1080 tacacatatt gaccaaatca gggtaatttt gcatttgtaa ttttaaaaaa tgctttcttc 1140 ttttaatata cttttttgtt tatcttattt ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag 1200 ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa 1260 tttctgggtt aaggcaatag caatatctct gcatataaat atttctgcat ataaattgta 1320 actgatgtaa gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt 1380 tattttatgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat 1440 catgttcata cctcttatct tcctcccaca gctgctcgga aatgtcctcg tgtgcgtcct 1500 cgctcaccat ttcggaaagg agtttacacc tcctgtccaa gcagcttacc aaaaggtcgt 1560 cgcaggggtc gcaaacgctc tcgctcataa ataccattag gctcgctttc ttgctgtcca 1620 atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac taaactgggg gatattatga 1680 agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt tattttcatt gcaatgatgt 1740 atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt gggaggtcag tgcatttaaa 1800 acataaagaa atgaagagct agttcaaacc ttg 1833 <210> 25 <211> 1845 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB sequence from 5' mutation to 3' mutation with Linker <400> 25 cggctgtcat cacttagacc tcaccctgtg gagccacacc ctagggttgg ccaatctact 60 cccaggagca gggagggcag gagccagggc tgggcataaa agtcagggca gagccatcta 120 ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg 180 tgcatctgac tcctgaggag aagtctgccg ttactgccct gtggggcaag gtgaacgtgg 240 atgaagttgg tggtgaggcc ctgggcaggt tggtatcaag gttacaagac aggactagta 300 tcgattttaa ggagaccaat agaaactggg catgtggaga cagagaagac tcttgggttt 360 ctgataggca ctgactctct ctgcctattg gtctattttc ccacccttag gctgctggtg 420 gtctaccctt ggacccagag gttctttgag tcctttgggg atctgtccac tcctgatgct 480 gttatgggca accctaaggt gaaggctcat ggcaagaaag tgctcggtgc ctttagtgat 540 ggcctggctc acctggacaa cctcaagggc acctttgcca cactgagtga gctgcactgt 600 gacaagctgc acgtggatcc tgagaacttc agggtgagtc tatgggacgc ttgatgtttt 660 ctttcccctt cttttctatg gttaagttca tgtcatagga aggggataag taacagggta 720 cagtttagaa tgggaaacag acgaatgatt gcatcagtgt ggaagtctca ggatcgtttt 780 agtttctttt atttgctgtt cataacaatt gttttctttt gtttaattct tgctttcttt 840 ttttttcttc tccgcaattt ttactattat acttaatgcc ttaacattgt gtataacaaa 900 aggaaatatc tctgagatac attaagtaac ttaaaaaaaa actttacaca gtctgcctag 960 tacattacta tttggaatat atgtgtgctt atttgcatat tcataatctc cctactttat 1020 tttcttttat ttttaattga tacataatca ttatacatat ttatgggtta aagtgtaatg 1080 ttttaatatg tgtacacata ttgaccaaat cagggtaatt ttgcatttgt aattttaaaa 1140 aatgctttct tcttttaata tacttttttg tttatcttat ttctaatact ttccctaatc 1200 tctttctttc agggcaataa tgatacaatg tatcatgcct ctttgcacca ttctaaagaa 1260 taacagtgat aatttctggg ttaaggcaat agcaatatct ctgcatataa atatttctgc 1320 atataaattg taactgatgt aagaggtttc atattgctaa tagcagctac aatccagcta 1380 ccattctgct tttattttat ggttgggata aggctggatt attctgagtc caagctaggc 1440 ccttttgcta atcatgttca tacctcttat cttcctccca cagctcctgg gcaacgtgct 1500 ggtctgtgtg ctggcccatc actttggcaa agaattcacc ccaccagtgc aggctgccta 1560 tcagaaagtg gtggctggtg tggctaatgc cctggcccac aagtatcact aagctcgctt 1620 tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct aagtccaact actaaactgg 1680 gggatattat gaagggcctt gagcatctgg attctgccta ataaaaaaca tttattttca 1740 ttgcaatgat gtatttaaat tatttctgaa tattttacta aaaagggaat gtgggaggtc 1800 agtgcattta aaacataaag aaatgaagag ctagttcaaa ccttg 1845 <210> 26 <211> 1845 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB sequence from 5' mutation to 3' mutation with silent codon alterations, with Linker <400> 26 cggctgtcat cacttagacc tcaccctgtg gagccacacc ctagggttgg ccaatctact 60 cccaggagca gggagggcag gagccagggc tgggcataaa agtcagggca gagccatcta 120 ttgcttacat ttgcttctga cacaactgtg ttcactagca acctcaaaca gacaccatgg 180 tccacctcac accagaagaa aaaagtgctg taacagctct ctggggaaaa gtcaatgtcg 240 acgaggtagg gggggaagct ctcggaaggt tggtatcaag gttacaagac aggactagta 300 tcgattttaa ggagaccaat agaaactggg catgtggaga cagagaagac tcttgggttt 360 ctgataggca ctgactctct ctgcctattg gtctattttc ccacccttag actcctcgtc 420 gtgtatccat ggacacaaag atttttcgaa agcttcggag acctcagcac accagacgca 480 gtaatgggaa atccaaaagt caaagcacac ggaaaaaagg tcctgggggc tttctctgac 540 ggactcgcac atctcgataa tctgaaagga acattcgcta ccctctctga actccattgc 600 gataaactcc atgtcgaccc agaaaatttt agagtgagtc tatgggacgc ttgatgtttt 660 ctttcccctt cttttctatg gttaagttca tgtcatagga aggggataag taacagggta 720 cagtttagaa tgggaaacag acgaatgatt gcatcagtgt ggaagtctca ggatcgtttt 780 agtttctttt atttgctgtt cataacaatt gttttctttt gtttaattct tgctttcttt 840 ttttttcttc tccgcaattt ttactattat acttaatgcc ttaacattgt gtataacaaa 900 aggaaatatc tctgagatac attaagtaac ttaaaaaaaa actttacaca gtctgcctag 960 tacattacta tttggaatat atgtgtgctt atttgcatat tcataatctc cctactttat 1020 tttcttttat ttttaattga tacataatca ttatacatat ttatgggtta aagtgtaatg 1080 ttttaatatg tgtacacata ttgaccaaat cagggtaatt ttgcatttgt aattttaaaa 1140 aatgctttct tcttttaata tacttttttg tttatcttat ttctaatact ttccctaatc 1200 tctttctttc agggcaataa tgatacaatg tatcatgcct ctttgcacca ttctaaagaa 1260 taacagtgat aatttctggg ttaaggcaat agcaatatct ctgcatataa atatttctgc 1320 atataaattg taactgatgt aagaggtttc atattgctaa tagcagctac aatccagcta 1380 ccattctgct tttattttat ggttgggata aggctggatt attctgagtc caagctaggc 1440 ccttttgcta atcatgttca tacctcttat cttcctccca cagctgctcg gaaatgtcct 1500 cgtgtgcgtc ctcgctcacc atttcggaaa ggagtttaca cctcctgtcc aagcagctta 1560 ccaaaaggtc gtcgcagggg tcgcaaacgc tctcgctcat aaataccatt aggctcgctt 1620 tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct aagtccaact actaaactgg 1680 gggatattat gaagggcctt gagcatctgg attctgccta ataaaaaaca tttattttca 1740 ttgcaatgat gtatttaaat tatttctgaa tattttacta aaaagggaat gtgggaggtc 1800 agtgcattta aaacataaag aaatgaagag ctagttcaaa ccttg 1845 <210> 27 <211> 444 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 atggtgcatc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60 gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag 120 aggttctttg agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag 180 gtgaaggctc atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac 240 aacctcaagg gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat 300 cctgagaact tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc 360 aaagaattca ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat 420 gccctggccc acaagtatca ctaa 444 <210> 28 <211> 444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA sequences with silent codon alterations <400> 28 atggtccacc tcacaccaga agaaaaaagt gctgtaacag ctctctgggg aaaagtcaat 60 gtcgacgagg taggggggga agctctcgga agactcctcg tcgtgtatcc atggacacaa 120 agatttttcg aaagcttcgg agacctcagc acaccagacg cagtaatggg aaatccaaaa 180 gtcaaagcac acggaaaaaa ggtcctgggg gctttctctg acggactcgc acatctcgat 240 aatctgaaag gaacattcgc taccctctct gaactccatt gcgataaact ccatgtcgac 300 ccagaaaatt ttagactgct cggaaatgtc ctcgtgtgcg tcctcgctca ccatttcgga 360 aaggagttta cacctcctgt ccaagcagct taccaaaagg tcgtcgcagg ggtcgcaaac 420 gctctcgctc ataaatacca ttag 444 <210> 29 <211> 3533 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHBB-hL-014 vector, ITRs not included <400> 29 atcaacctag gctccagata gccatagaag aaccaaacac tttctgcgtg tgtgagaata 60 atcagagtga gattttttca caagtacctg atgagggttg agacaggtag aaaaagtgag 120 agatctctat ttatttagca ataatagaga aagcatttaa gagaataaag caatggaaat 180 aagaaatttg taaatttcct tctgataact agaaatagag gatccagttt cttttggtta 240 acctaaattt tatttcattt tattgtttta ttttatttta ttttatttta ttttgtgtaa 300 tcgtagtttc agagtgttag agctgaaagg aagaagtagg agaaacatgc aaagtaaaag 360 tataacactt tccttactaa accgacatgg gtttccaggt aggggcagga ttcaggatga 420 ctgacagggc ccttagggaa cactgagacc ctacgctgac ctcataaatg cttgctacct 480 ttgctgtttt aattacatct tttaatagca ggaagcagaa ctctgcactt caaaagtttt 540 tcctcacctg aggagttaat ttagtacaag gggaaaaagt acagggggat gggagaaagg 600 cgatcacgtt gggaagctat agagaaagaa gagtaaattt tagtaaagga ggtttaaaca 660 aacaaaatat aaagagaaat aggaacttga atcaaggaaa tgattttaaa acgcagtatt 720 cttagtggac tagaggaaaa aaataatctg agccaagtag aagacctttt cccctcctac 780 ccctactttc taagtcacag aggctttttg ttcccccaga cactcttgca gattagtcca 840 ggcagaaaca gttagatgtc cccagttaac ctcctatttg acaccactga ttaccccatt 900 gatagtcaca ctttgggttg taagtgactt tttatttatt tgtatttttg actgcattaa 960 gaggtctcta gttttttatc tcttgtttcc caaaacctaa taagtaacta atgcacagag 1020 cacattgatt tgtatttatt ctatttttag acataattta ttagcatgca tgagcaaatt 1080 aagaaaaaca acaacaaatg aatgcatata tatgtatatg tatgtgtgta tatatacaca 1140 catatatata tatatttttt cttttcttac cagaaggttt taatccaaat aaggagaaga 1200 tatgcttaga accgaggtag agttttcatc cattctgtcc tgtaagtatt ttgcatattc 1260 tggagacgca ggaagagatc catctacata tcccaaagct gaattatggt agacaaaact 1320 cttccacttt tagtgcatca acttcttatt tgtgtaataa gaaaattggg aaaacgatct 1380 tcaatatgct taccaagctg tgattccaaa tattacgtaa atacacttgc aaaggaggat 1440 gtttttagta gcaatttgta ctgatggtat ggggccaaga gatatatctt agagggaggg 1500 ctgagggttt gaagtccaac tcctaagcca gtgccagaag agccaaggac aggtacggct 1560 gtcatcactt agacctcacc ctgtggagcc acaccctagg gttggccaat ctactcccag 1620 gagcagggag ggcaggagcc agggctgggc ataaaagtca gggcagagcc atctattgct 1680 tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac tagcaacctc aaacagacac catggtgcat 1740 ctgactcctg aggagaagtc tgccgttact gccctgtggg gcaaggtgaa cgtggatgaa 1800 gttggtggtg aggccctggg caggttggta tcaaggttac aagacaggac tagtatcgat 1860 tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcatgt ggagacagag aagactcttg ggtttctgat 1920 aggcactgac tctctctgcc tattggtcta ttttcccacc cttaggctgc tggtggtcta 1980 cccttggacc cagaggttct ttgagtcctt tggggatctg tccactcctg atgctgttat 2040 gggcaaccct aaggtgaagg ctcatggcaa gaaagtgctc ggtgccttta gtgatggcct 2100 ggctcacctg gacaacctca agggcacctt tgccacactg agtgagctgc actgtgacaa 2160 gctgcacgtg gatcctgaga acttcagggt gagtctatgg gacgcttgat gttttctttc 2220 cccttctttt ctatggttaa gttcatgtca taggaagggg ataagtaaca gggtacagtt 2280 tagaatggga aacagacgaa tgattgcatc agtgtggaag tctcaggatc gttttagttt 2340 cttttatttg ctgttcataa caattgtttt cttttgttta attcttgctt tctttttttt 2400 tcttctccgc aatttttact attatactta atgccttaac attgtgtata acaaaaggaa 2460 atatctctga gatacattaa gtaacttaaa aaaaaacttt acacagtctg cctagtacat 2520 tactatttgg aatatatgtg tgcttatttg catattcata atctccctac tttattttct 2580 tttattttta attgatacat aatcattata catatttatg ggttaaagtg taatgtttta 2640 atatgtgtac acatattgac caaatcaggg taattttgca tttgtaattt taaaaaatgc 2700 tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta atactttccc taatctcttt 2760 ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg caccattcta aagaataaca 2820 gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatctctgca tataaatatt tctgcatata 2880 aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca gctacaatcc agctaccatt 2940 ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct gagtccaagc taggcccttt 3000 tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct cctgggcaac gtgctggtct 3060 gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat tcaccccacc agtgcaggct gcctatcaga 3120 aagtggtggc tggtgtggct aatgccctgg cccacaagta tcactaagct cgctttcttg 3180 ctgtccaatt tctattaaag gttcctttgt tccctaagtc caactactaa actgggggat 3240 attatgaagg gccttgagca tctggattct gcctaataaa aaacatttat tttcattgca 3300 atgatgtatt taaattattt ctgaatattt tactaaaaag ggaatgtggg aggtcagtgc 3360 atttaaaaca taaagaaatg aagagctagt tcaaaccttg ggaaaataca ctatatctta 3420 aactccatga aagaaggtga ggctgcaaac agctaatgca cattggcaac agcccctgat 3480 gcatatgcct tattcatccc tcagaaaagg attcaagtag aggcttgatt tgg 3533 <210> 30 <211> 3521 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aagacctttt cccctcctac 780 ccctactttc taagtcacag aggctttttg ttcccccaga cactcttgca gattagtcca 840 ggcagaaaca gttagatgtc cccagttaac ctcctatttg acaccactga ttaccccatt 900 gatagtcaca ctttgggttg taagtgactt tttatttatt tgtatttttg actgcattaa 960 gaggtctcta gttttttatc tcttgtttcc caaaacctaa taagtaacta atgcacagag 1020 cacattgatt tgtatttatt ctatttttag acataattta ttagcatgca tgagcaaatt 1080 aagaaaaaca acaacaaatg aatgcatata tatgtatatg tatgtgtgta tatatacaca 1140 catatatata tatatttttt cttttcttac cagaaggttt taatccaaat aaggagaaga 1200 tatgcttaga accgaggtag agttttcatc cattctgtcc tgtaagtatt ttgcatattc 1260 tggagacgca ggaagagatc catctacata tcccaaagct gaattatggt agacaaaact 1320 cttccacttt tagtgcatca acttcttatt tgtgtaataa gaaaattggg aaaacgatct 1380 tcaatatgct taccaagctg tgattccaaa tattacgtaa atacacttgc aaaggaggat 1440 gtttttagta gcaatttgta ctgatggtat ggggccaaga gatatatctt agagggaggg 1500 ctgagggttt gaagtccaac tcctaagcca gtgccagaag agccaaggac aggtacggct 1560 gtcatcactt agacctcacc ctgtggagcc acaccctagg gttggccaat ctactcccag 1620 gagcagggag ggcaggagcc agggctgggc ataaaagtca gggcagagcc atctattgct 1680 tacatttgct tctgacacaa ctgtgttcac tagcaacctc aaacagacac catggtgcat 1740 ctgactcctg aggagaagtc tgccgttact gccctgtggg gcaaggtgaa cgtggatgaa 1800 gttggtggtg aggccctggg caggttggta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc 1860 aatagaaact gggcatgtgg agacagagaa gactcttggg tttctgatag gcactgactc 1920 tctctgccta ttggtctatt ttcccaccct taggctgctg gtggtctacc cttggaccca 1980 gaggttcttt gagtcctttg gggatctgtc cactcctgat gctgttatgg gcaaccctaa 2040 ggtgaaggct catggcaaga aagtgctcgg tgcctttagt gatggcctgg ctcacctgga 2100 caacctcaag ggcacctttg ccacactgag tgagctgcac tgtgacaagc tgcacgtgga 2160 tcctgagaac ttcagggtga gtctatggga cgcttgatgt tttctttccc cttcttttct 2220 atggttaagt tcatgtcata ggaaggggat aagtaacagg gtacagttta gaatgggaaa 2280 cagacgaatg attgcatcag tgtggaagtc tcaggatcgt tttagtttct tttatttgct 2340 gttcataaca attgttttct tttgtttaat tcttgctttc tttttttttc ttctccgcaa 2400 tttttactat tatacttaat gccttaacat tgtgtataac aaaaggaaat atctctgaga 2460 tacattaagt aacttaaaaa aaaactttac acagtctgcc tagtacatta ctatttggaa 2520 tatatgtgtg cttatttgca tattcataat ctccctactt tattttcttt tatttttaat 2580 tgatacataa tcattataca tatttatggg ttaaagtgta atgttttaat atgtgtacac 2640 atattgacca aatcagggta attttgcatt tgtaatttta aaaaatgctt tcttctttta 2700 atatactttt ttgtttatct tatttctaat actttcccta atctctttct ttcagggcaa 2760 taatgataca atgtatcatg cctctttgca ccattctaaa gaataacagt gataatttct 2820 gggttaaggc aatagcaata tctctgcata taaatatttc tgcatataaa ttgtaactga 2880 tgtaagaggt ttcatattgc taatagcagc tacaatccag ctaccattct gcttttattt 2940 tatggttggg ataaggctgg attattctga gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt 3000 tcatacctct tatcttcctc ccacagctcc tgggcaacgt gctggtctgt gtgctggccc 3060 atcactttgg caaagaattc accccaccag tgcaggctgc ctatcagaaa gtggtggctg 3120 gtgtggctaa tgccctggcc cacaagtatc actaagctcg ctttcttgct gtccaatttc 3180 tattaaaggt tcctttgttc cctaagtcca actactaaac tgggggatat tatgaagggc 3240 cttgagcatc tggattctgc ctaataaaaa acatttattt tcattgcaat gatgtattta 3300 aattatttct gaatatttta ctaaaaaggg aatgtgggag gtcagtgcat ttaaaacata 3360 aagaaatgaa gagctagttc aaaccttggg aaaatacact atatcttaaa ctccatgaaa 3420 gaaggtgagg ctgcaaacag ctaatgcaca ttggcaacag cccctgatgc atatgcctta 3480 ttcatccctc agaaaaggat tcaagtagag gcttgatttg g 3521 <210> 31 <211> 3168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHBB-hL-001 vector, ITRs not included <400> 31 ttatttattt gtatttttga ctgcattaag aggtctctag ttttttatct cttgtttccc 60 aaaacctaat aagtaactaa tgcacagagc acattgattt gtatttattc tatttttaga 120 cataatttat tagcatgcat gagcaaatta agaaaaacaa caacaaatga atgcatatat 180 atgtatatgt atgtgtgtat atatacacac atatatatat atattttttc ttttcttacc 240 agaaggtttt aatccaaata aggagaagat atgcttagaa ccgaggtaga gttttcatcc 300 attctgtcct gtaagtattt tgcatattct ggagacgcag gaagagatcc atctacatat 360 cccaaagctg aattatggta gacaaaactc ttccactttt agtgcatcaa cttcttattt 420 gtgtaataag aaaattggga aaacgatctt caatatgctt accaagctgt gattccaaat 480 attacgtaaa tacacttgca aaggaggatg tttttagtag 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gattgcatca 1380 gtgtggaagt ctcaggatcg ttttagtttc ttttatttgc tgttcataac aattgttttc 1440 ttttgtttaa ttcttgcttt cttttttttt cttctccgca atttttacta ttatacttaa 1500 tgccttaaca ttgtgtataa caaaaggaaa tatctctgag atacattaag taacttaaaa 1560 aaaaacttta cacagtctgc ctagtacatt actatttgga atatatgtgt gcttatttgc 1620 atattcataa tctccctact ttattttctt ttatttttaa ttgatacata atcattatac 1680 atatttatgg gttaaagtgt aatgttttaa tatgtgtaca catattgacc aaatcagggt 1740 aattttgcat ttgtaatttt aaaaaatgct ttcttctttt aatatacttt tttgtttatc 1800 ttatttctaa tactttccct aatctctttc tttcagggca ataatgatac aatgtatcat 1860 gcctctttgc accattctaa agaataacag tgataatttc tgggttaagg caatagcaat 1920 atctctgcat ataaatattt ctgcatataa attgtaactg atgtaagagg tttcatattg 1980 ctaatagcag ctacaatcca gctaccattc tgcttttatt ttatggttgg gataaggctg 2040 gattattctg agtccaagct aggccctttt gctaatcatg ttcatacctc ttatcttcct 2100 cccacagctc ctgggcaacg tgctggtctg tgtgctggcc catcactttg gcaaagaatt 2160 caccccacca gtgcaggctg cctatcagaa agtggtggct ggtgtggcta 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tttagtgcat caacttctta tttgtgtaat aagaaaattg ggaaaacgat cttcaatatg 300 cttaccaagc tgtgattcca aatattacgt aaatacactt gcaaaggagg atgtttttag 360 tagcaatttg tactgatggt atggggccaa gagatatatc ttagagggag ggctgagggt 420 ttgaagtcca actcctaagc cagtgccaga agagccaagg acaggtacgg ctgtcatcac 480 ttagacctca ccctgtggag ccacacccta gggttggcca atctactccc aggagcaggg 540 agggcaggag ccagggctgg gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg 600 cttctgacac aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac accatggtgc atctgactcc 660 tgaggagaag tctgccgtta ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg 720 tgaggccctg ggcaggttgg tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 780 ctgggcatgt ggagacagag aagcttctga cctcttctct tcctcccaca gggcggtacc 840 agatctggca gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 900 cccggcccta ggggtaccat ggtccacctc acaccagaag aaaaaagtgc tgtaacagct 960 ctctggggaa aagtcaatgt cgacgaggta gggggggaag ctctcggaag actcctcgtc 1020 gtgtatccat ggacacaaag atttttcgaa agcttcggag acctcagcac accagacgca 1080 gtaatgggaa atccaaaagt caaagcacac ggaaaaaagg tcctgggggc tttctctgac 1140 ggactcgcac atctcgataa tctgaaagga acattcgcta ccctctctga actccattgc 1200 gataaactcc atgtcgaccc agaaaatttt agactgctcg gaaatgtcct cgtgtgcgtc 1260 ctcgctcacc atttcggaaa ggagtttaca cctcctgtcc aagcagctta ccaaaaggtc 1320 gtcgcagggg tcgcaaacgc tctcgctcat aaataccatt aggaattcaa ggcctctcga 1380 gcctctagaa ctatagtgag tcgtattacg tagatccaga catgataaga tacattgatg 1440 agtttggaca aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg 1500 atgctattgc tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt 1560 gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa gcttcagctg 1620 tgatcataac gttgagctca agactcttgg gtttctgata ggcactgact ctctctgcct 1680 attggtctat tttcccaccc ttaggctgct ggtggtctac ccttggaccc agaggttctt 1740 tgagtccttt ggggatctgt ccactcctga tgctgttatg ggcaacccta aggtgaaggc 1800 tcatggcaag aaagtgctcg gtgcctttag tgatggcctg gctcacctgg acaacctcaa 1860 gggcaccttt gccacactga gtgagctgca ctgtgacaag ctgcacgtgg atcctgagaa 1920 cttcagggtg agtctatggg acgcttgatg ttttctttcc ccttcttttc tatggttaag 1980 ttcatgtcat aggaagggga taagtaacag ggtacagttt agaatgggaa acagacgaat 2040 gattgcatca gtgtggaagt ctcaggatcg ttttagtttc ttttatttgc tgttcataac 2100 aattgttttc ttttgtttaa ttcttgcttt cttttttttt cttctccgca atttttacta 2160 ttatacttaa tgccttaaca ttgtgtataa caaaaggaaa tatctctgag atacattaag 2220 taacttaaaa aaaaacttta cacagtctgc ctagtacatt actatttgga atatatgtgt 2280 gcttatttgc atattcataa tctccctact ttattttctt ttatttttaa ttgatacata 2340 atcattatac atatttatgg gttaaagtgt aatgttttaa tatgtgtaca catattgacc 2400 aaatcagggt aattttgcat ttgtaatttt aaaaaatgc 2439 <210> 43 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHBB coding sequence in exon 1 with silent codon alterations <400> 43 atggtccacc tcacaccaga agaaaaaagt gctgtaacag ctctctgggg aaaagtcaat 60 gtcgacgagg taggggggga agctctcgga ag 92 <210> 44 <211> 223 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHBB coding sequence in exon 2 with silent codon alterations <400> 44 actcctcgtc gtgtatccat ggacacaaag atttttcgaa agcttcggag acctcagcac 60 accagacgca gtaatgggaa atccaaaagt caaagcacac ggaaaaaagg tcctgggggc 120 tttctctgac ggactcgcac atctcgataa tctgaaagga acattcgcta ccctctctga 180 actccattgc gataaactcc atgtcgaccc agaaaatttt aga 223 <210> 45 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHBB coding sequence in exon 3 with silent codon alterations <400> 45 ctgctcggaa atgtcctcgt gtgcgtcctc gctcaccatt tcggaaagga gtttacacct 60 cctgtccaag cagcttacca aaaggtcgtc gcaggggtcg caaacgctct cgctcataaa 120 taccattag 129 <210> 46 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHBB coding sequence from second codon to stop codon, with silent codon alterations <400> 46 actcctcgtc gtgtatccat ggacacaaag atttttcgaa agcttcggag acctcagcac 60 accagacgca gtaatgggaa atccaaaagt caaagcacac ggaaaaaagg tcctgggggc 120 tttctctgac ggactcgcac atctcgataa tctgaaagga acattcgcta ccctctctga 180 actccattgc gataaactcc atgtcgaccc agaaaatttt agactgctcg gaaatgtcct 240 cgtgtgcgtc ctcgctcacc atttcggaaa ggagtttaca cctcctgtcc aagcagctta 300 ccaaaaggtc gtcgcagggg tcgcaaacgc tctcgctcat aaataccatt ag 352 <210> 47 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHBB coding sequence from start codon to stop codon, with silent codon alterations <400> 47 gtccacctca caccagaaga aaaaagtgct gtaacagctc tctggggaaa agtcaatgtc 60 gacgaggtag ggggggaagc tctcggaaga ctcctcgtcg tgtatccatg gacacaaaga 120 tttttcgaaa gcttcggaga cctcagcaca ccagacgcag taatgggaaa tccaaaagtc 180 aaagcacacg gaaaaaaggt cctgggggct ttctctgacg gactcgcaca tctcgataat 240 ctgaaaggaa cattcgctac cctctctgaa ctccattgcg ataaactcca tgtcgaccca 300 gaaaatttta gactgctcgg aaatgtcctc gtgtgcgtcc tcgctcacca tttcggaaag 360 gagtttacac ctcctgtcca agcagcttac caaaaggtcg tcgcaggggt cgcaaacgct 420 ctcgctcata aataccatta g 441 <210> 48 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp Gly 1 5 10 15 Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu 20 25 30 Val Val 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aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 120 tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag 180 gtgtgggagg ttttttaa 198 <210> 78 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 polyA signal <400> 78 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120 ta 122 <210> 79 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 polyA signal <400> 79 taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60 tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120 tt 122 <210> 80 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TI RE Linker <400> 80 actagtatcg at 12 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB L NGS S1 <400> 81 cctctgggtc caagggtaga 20 <210> 82 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB NGS Nest 5 Forward Adapter 1 <400> 82 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca agtagagtct ttccctacac gacgctcttc 60 cgatctgggc ataaaagtca gggcaga 87 <210> 83 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB NGS Nest 5 Forward Adapter 2 <400> 83 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc atgcttatct ttccctacac gacgctcttc 60 cgatcttggg cataaaagtc agggcaga 88 <210> 84 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB NGS Nest 5 Forward Adapter 3 <400> 84 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg cacatcttct ttccctacac gacgctcttc 60 cgatctatgg gcataaaagt cagggcaga 89 <210> 85 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB NGS Nest 5 Forward Adapter 4 <400> 85 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact gctcgactct ttccctacac gacgctcttc 60 cgatctgatg ggcataaaag tcagggcaga 90 <210> 86 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB NGS Nest 5 Reverse Adapter 1 <400> 86 caagcagaag acggcatacg agatcatgat cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatctgtct ccacatgccc agtttcta 88 <210> 87 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBB NGS Nest 5 Reverse 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atgggaagaa ggttttggga gccttctcag atggcctggc tcacctggac 240 aacctgaagg gcacctttgc caccctgtct gagctgcact gtgacaagct gcatgtggac 300 cctgagaact tcaggctcct gggcaatgtt ctggtatgtg tgttagcaca ccattttggc 360 aaggaattca cccctccagt gcaggctgcc taccagaaag tggtggcagg tgtggccaat 420 gccctggccc acaaatatca ctga 444 <210> 100 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> silently altered HBB coding sequence without start codon <400> 100 gtgcacctca ccccagaaga gaagtctgct gtgacagctc tctggggaaa agtaaatgtg 60 gatgaggtgg gaggggaggc cctaggaagg cttcttgttg tctacccctg gacacagaga 120 ttctttgaat cctttgggga cctgagcact cctgatgcag tgatgggcaa ccccaaagtc 180 aaagctcatg ggaagaaggt tttgggagcc ttctcagatg gcctggctca cctggacaac 240 ctgaagggca cctttgccac cctgtctgag ctgcactgtg acaagctgca tgtggaccct 300 gagaacttca ggctcctggg caatgttctg gtatgtgtgt tagcacacca ttttggcaag 360 gaattcaccc ctccagtgca ggctgcctac cagaaagtgg tggcaggtgt ggccaatgcc 420 ctggcccaca aatatcactg a 441 <210> 101 <211> 489 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 ttgcatttgt aattttaaaa aatgctttct tcttttaata tacttttttg tttatcttat 60 ttctaatact ttccctaatc tctttctttc agggcaataa tgatacaatg tatcatgcct 120 ctttgcacca ttctaaagaa taacagtgat aatttctggg ttaaggcaat agcaatatct 180 ctgcatataa atatttctgc atataaattg taactgatgt aagaggtttc atattgctaa 240 tagcagctac aatccagcta ccattctgct tttattttat ggttgggata aggctggatt 300 attctgagtc caagctaggc ccttttgcta atcatgttca tacctcttat cttcctccca 360 cagctcctgg gcaacgtgct ggtctgtgtg ctggcccatc actttggcaa agaattcacc 420 ccaccagtgc aggctgccta tcagaaagtg gtggctggtg tggctaatgc cctggcccac 480 aagtatcac 489 <210> 102 <211> 1134 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60 taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120 tattttcatt gcaatgatgt atttaaatta tttctgaata ttttactaaa aagggaatgt 180 gggaggtcag tgcatttaaa acataaagaa atgaagagct agttcaaacc ttgggaaaat 240 acactatatc ttaaactcca tgaaagaagg tgaggctgca aacagctaat gcacattggc 300 aacagcccct gatgcatatg ccttattcat ccctcagaaa aggattcaag tagaggcttg 360 atttggaggt taaagttttg ctatgctgta ttttacatta cttattgttt tagctgtcct 420 catgaatgtc ttttcactac ccatttgctt atcctgcatc tctcagcctt gactccactc 480 agttctcttg cttagagata ccacctttcc cctgaagtgt tccttccatg ttttacggcg 540 agatggtttc tcctcgcctg gccactcagc cttagttgtc tctgttgtct tatagaggtc 600 tacttgaaga aggaaaaaca ggggtcatgg tttgactgtc ctgtgagccc ttcttccctg 660 cctcccccac tcacagtgac ccggaatctg cagtgctagt ctcccggaac tatcactctt 720 tcacagtctg ctttggaagg actgggctta gtatgaaaag ttaggactga gaagaatttg 780 aaaggcggct ttttgtagct tgatattcac tactgtctta ttaccctgtc ataggcccac 840 cccaaatgga agtcccattc ttcctcagga tgtttaagat tagcattcag gaagagatca 900 gaggtctgct ggctccctta tcatgtccct tatggtgctt ctggctctgc agttattagc 960 atagtgttac catcaaccac cttaacttca tttttcttat tcaataccta ggtaggtaga 1020 tgctagattc tggaaataaa atatgagtct caagtggtcc ttgtcctctc tcccagtcaa 1080 attctgaatc tagttggcaa gattctgaaa tcaaggcata taatcagtaa taag 1134 <210> 103 <211> 1626 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 ttgcatttgt aattttaaaa aatgctttct tcttttaata tacttttttg tttatcttat 60 ttctaatact ttccctaatc tctttctttc agggcaataa tgatacaatg tatcatgcct 120 ctttgcacca ttctaaagaa taacagtgat aatttctggg ttaaggcaat agcaatatct 180 ctgcatataa atatttctgc atataaattg taactgatgt aagaggtttc atattgctaa 240 tagcagctac aatccagcta ccattctgct tttattttat ggttgggata aggctggatt 300 attctgagtc caagctaggc ccttttgcta atcatgttca tacctcttat cttcctccca 360 cagctcctgg gcaacgtgct ggtctgtgtg ctggcccatc actttggcaa agaattcacc 420 ccaccagtgc aggctgccta tcagaaagtg gtggctggtg tggctaatgc cctggcccac 480 aagtatcact aagctcgctt tcttgctgtc caatttctat taaaggttcc tttgttccct 540 aagtccaact actaaactgg gggatattat gaagggcctt gagcatctgg attctgccta 600 ataaaaaaca tttattttca ttgcaatgat gtatttaaat tatttctgaa tattttacta 660 aaaagggaat gtgggaggtc agtgcattta aaacataaag aaatgaagag ctagttcaaa 720 ccttgggaaa atacactata tcttaaactc catgaaagaa ggtgaggctg caaacagcta 780 atgcacattg gcaacagccc ctgatgcata tgccttattc atccctcaga aaaggattca 840 agtagaggct tgatttggag gttaaagttt tgctatgctg tattttacat tacttattgt 900 tttagctgtc ctcatgaatg tcttttcact acccatttgc ttatcctgca tctctcagcc 960 ttgactccac tcagttctct tgcttagaga taccaccttt cccctgaagt gttccttcca 1020 tgttttacgg cgagatggtt tctcctcgcc tggccactca gccttagttg tctctgttgt 1080 cttatagagg tctacttgaa gaaggaaaaa caggggtcat ggtttgactg tcctgtgagc 1140 ccttcttccc tgcctccccc actcacagtg acccggaatc tgcagtgcta gtctcccgga 1200 actatcactc tttcacagtc tgctttggaa ggactgggct tagtatgaaa agttaggact 1260 gagaagaatt tgaaaggcgg ctttttgtag cttgatattc actactgtct tattaccctg 1320 tcataggccc accccaaatg gaagtcccat tcttcctcag gatgtttaag attagcattc 1380 aggaagagat cagaggtctg ctggctccct tatcatgtcc cttatggtgc ttctggctct 1440 gcagttatta gcatagtgtt accatcaacc accttaactt catttttctt attcaatacc 1500 taggtaggta gatgctagat tctggaaata aaatatgagt ctcaagtggt ccttgtcctc 1560 tctcccagtc aaattctgaa tctagttggc aagattctga aatcaaggca tataatcagt 1620 aataag 1626 <210> 104 <211> 2332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHBB vector <400> 104 ttgcatttgt aattttaaaa aatgctttct tcttttaata tacttttttg tttatcttat 60 ttctaatact ttccctaatc tctttctttc agggcaataa tgatacaatg tatcatgcct 120 ctttgcacca ttctaaagaa taacagtgat aatttctggg ttaaggcaat agcaatatct 180 ctgcatataa atatttctgc atataaattg taactgatgt aagaggtttc atattgctaa 240 tagcagctac aatccagcta ccattctgct tttattttat ggttgggata aggctggatt 300 attctgagtc caagctaggc ccttttgcta atcatgttca tacctcttat cttcctccca 360 cagctcctgg gcaacgtgct ggtctgtgtg ctggcccatc actttggcaa agaattcacc 420 ccaccagtgc aggctgccta tcagaaagtg gtggctggtg tggctaatgc cctggcccac 480 aagtatcacg gcagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag 540 gagaaccctg gacctatggt gcacctcacc ccagaagaga agtctgctgt gacagctctc 600 tggggaaaag taaatgtgga tgaggtggga ggggaggccc taggaaggct tcttgttgtc 660 tacccctgga cacagagatt ctttgaatcc tttggggacc tgagcactcc tgatgcagtg 720 atgggcaacc ccaaagtcaa agctcatggg aagaaggttt tgggagcctt ctcagatggc 780 ctggctcacc tggacaacct gaagggcacc tttgccaccc tgtctgagct gcactgtgac 840 aagctgcatg tggaccctga gaacttcagg ctcctgggca atgttctggt atgtgtgtta 900 gcacaccatt ttggcaagga attcacccct ccagtgcagg ctgcctacca gaaagtggtg 960 gcaggtgtgg ccaatgccct ggcccacaaa tatcactgag atccagacat gataagatac 1020 attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa 1080 atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac 1140 aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc 1200 tcgctttctt gctgtccaat ttctattaaa ggttcctttg ttccctaagt ccaactacta 1260 aactggggga tattatgaag ggccttgagc atctggattc tgcctaataa aaaacattta 1320 ttttcattgc aatgatgtat ttaaattatt tctgaatatt ttactaaaaa gggaatgtgg 1380 gaggtcagtg catttaaaac ataaagaaat gaagagctag ttcaaacctt gggaaaatac 1440 actatatctt aaactccatg aaagaaggtg aggctgcaaa cagctaatgc acattggcaa 1500 cagcccctga tgcatatgcc ttattcatcc ctcagaaaag gattcaagta gaggcttgat 1560 ttggaggtta aagttttgct atgctgtatt ttacattact tattgtttta gctgtcctca 1620 tgaatgtctt ttcactaccc atttgcttat cctgcatctc tcagccttga ctccactcag 1680 ttctcttgct tagagatacc acctttcccc tgaagtgttc cttccatgtt ttacggcgag 1740 atggtttctc ctcgcctggc cactcagcct tagttgtctc tgttgtctta tagaggtcta 1800 cttgaagaag gaaaaacagg ggtcatggtt tgactgtcct gtgagccctt cttccctgcc 1860 tcccccactc acagtgaccc ggaatctgca gtgctagtct cccggaacta tcactctttc 1920 acagtctgct ttggaaggac tgggcttagt atgaaaagtt aggactgaga agaatttgaa 1980 aggcggcttt ttgtagcttg atattcacta ctgtcttatt accctgtcat aggcccaccc 2040 caaatggaag tcccattctt cctcaggatg tttaagatta gcattcagga agagatcaga 2100 ggtctgctgg ctcccttatc atgtccctta tggtgcttct ggctctgcag ttattagcat 2160 agtgttacca tcaaccacct taacttcatt tttcttattc aatacctagg taggtagatg 2220 ctagattctg gaaataaaat atgagtctca agtggtcctt gtcctctctc ccagtcaaat 2280 tctgaatcta gttggcaaga ttctgaaatc aaggcatata atcagtaata ag 2332 <210> 105 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silently altered HBB coding sequence corresponding to HBB exon 1 <400> 105 atggtgcacc tcaccccaga agagaagtct gctgtgacag ctctctgggg aaaagtaaat 60 gtggatgagg tgggagggga ggccctagga ag 92 <210> 106 <211> 223 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silently altered HBB coding sequence corresponding to HBB exon 2 <400> 106 gcttcttgtt gtctacccct ggacacagag attctttgaa tcctttgggg acctgagcac 60 tcctgatgca gtgatgggca accccaaagt caaagctcat gggaagaagg ttttgggagc 120 cttctcagat ggcctggctc acctggacaa cctgaagggc acctttgcca ccctgtctga 180 gctgcactgt gacaagctgc atgtggaccc tgagaacttc agg 223 <210> 107 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Silently altered HBB coding sequence corresponding to HBB exon 3 <400> 107 ctcctgggca atgttctggt atgtgtgtta gcacaccatt ttggcaagga attcacccct 60 ccagtgcagg ctgcctacca gaaagtggtg gcaggtgtgg ccaatgccct ggcccacaaa 120 tatcactga 129 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 108 aaagtcaggg cagagccatc 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 109 aatgattaac ccgccatgct 20 <210> 110 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 110 aactgggcat gtggagacag agaa 24 <210> 111 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 111 gttacaagac aggactagta tcgat 25 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 112 tagaccaata ggcagagaga gt 22 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 113 ctgagccaag tagaagacct tt 22 <210> 114 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 114 ctgtttctgc ctggactaat ct 22 <210> 115 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 115 ccctactttc taagtcacag aggct 25

Claims (134)

  1. 세포 내의 베타 글로빈(HBB) 유전자에서 돌연변이의 교정 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포에 하기를 포함하는 복제-결함 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus)로 형질도입하는 단계를 포함하며:
    a) AAV Clade F 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드; 및
    b) (i) 표적 유전자에서 표적 좌위 편집용 편집 요소; (ii) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 5'; 및 (iii) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3'을 포함하는 교정 게놈,
    상기 세포는 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 공동-형질도입하거나 공동-투여하지 않고 형질도입되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 다능성 줄기 세포인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포는 조혈 줄기 세포인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 대상체 내에 있으며, 상기 AAV는 상기 대상체에서 상기 세포를 형질도입하는 데 유효한 양으로 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  6. HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법은:
    a) 생체 외에서 상기 대상체로부터 적혈구 전구 세포에 하기를 포함하는 복제-결합 AAV로 형질도입하여, 정확한 HBB 유전자를 갖는 형질도입된 세포를 수득하는 단계
    (i) AAV Clade F 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드; 및
    (ii) 하기를 포함하는 교정 게놈: (A) 표적 유전자에서 표적 좌위 편집용 편집 요소; (B) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 5'; 및 (C) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3', 및;
    b) 상기 형질도입된 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 세포는 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 공동-형질도입하지 않고 형질도입되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 적혈구 전구세포는 다능성 줄기 세포인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 적혈구 전구 세포는 다능성 줄기 세포인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 적혈구 전구 세포는 CD34+ 조혈 줄기 세포인 방법.
  10. HBB 유전자 돌연변이와 연관된 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 방법은 외인성 뉴클레아제 또는 외인성 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 공동-투여하지 않고, 하기를 포함하는 복제-결함 AAV의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법
    a) AAV Clade F 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드; 및
    b) (i) 표적 유전자에서 표적 좌위 편집용 편집 요소; (ii) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 5'; 및 (iii) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3'을 포함하는 교정 게놈.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 지중해빈혈증 또는 겸상세포질환인 방법.
  12. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인 방법.
  13. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자는 상기 HBB 유전자인 방법.
  14. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 HBB 유전자에서 뉴클레오티드 점 돌연변이, 삽입, 또는 결실에 있는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 HBB 유전자에서 상기 뉴클레오티드 점 돌연변이 또는 결실은 위치 -87에서 G, 위치 -31에서 G, 위치 -30에서 A, 위치 -29에서 G, 위치 -28에서 G, 위치 -10에서 T, 위치 1에서 C, 위치 1에서 A, 위치 2에서 G, 위치 17 및 18에서 C 및 T의 결실, 위치 19에서 A, 위치 20에서 A의 결실, 위치 20에서 T, 위치 25 및 26에서 A 및 A의 결실, 위치 26 이후 G의 추가, 위치 47에서 A, 위치 48에서 A, 위치 51에서 C의 결실, 위치 52에서 A, 위치 58에서 G, 위치 59에서 G, 위치 79에서 A, 위치 82에서 T, 위치 84 이후 C의 추가, 위치 93에서 T, 위치 93에서 A, 위치 97에서 C, 위치 98에서 C, 위치 202에서 G, 위치 208에서 G, 위치 222에서 C, 위치 241 또는 242에서 T의 결실, 위치 254 내지 257에서 T 및 T 및 C 및 T의 결실, 위치 260에서 T, 위치 264 또는 265에서 C의 결실, 위치 343 이후 A의 추가, 위치 399 및 400에서 G 및 T의 결실, 위치 401에서 T, 위치 417 이후 A의 추가, 위치 446에서 A, 위치 1099에서 T, 위치 1293에서 A, 1344에서 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 편집 요소는 돌연변이에 상응하는 야생형 HBB 유전자의 일부를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자의 하나 이상의 엑손의 코딩 영역을 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 엑손 1의 코딩 영역, 전체 인트론 1, 전체 엑손 2, 전체 인트론 2, 및 엑손 3의 코딩 영역을 포함하는 HBB 유전자의 일부를 포함하는 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 코딩 영역은 상기 코딩 영역은 상기 야생형 HBB 유전자의 상응하는 엑손에 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만으로 동일하게 침묵(silently) 변경되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 43 내지 46 및 105 내지 107로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 좌위는 AAVS1인 방법.
  22. 제1항 내지 제16항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 48 또는 이의 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 4 내지 444로 구성되는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 4 내지 444에 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 미만으로 동일하게 침묵 변경되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 47 또는 100의 서열로 구성되는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 서열은 상기 HBB 유전자의 스터퍼(stuffer)-삽입된 코딩 서열로 구성되는 방법.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 뉴클레오티드 3 및 뉴클레오티드 4 사이의 뉴클레오티드간 결합이며, 이에 의하여 상기 표적 좌위에의 상기 편집 요소의 통합으로 인해 상기 표적 유전자의 시작 코돈으로 시작하는 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하는 상기 표적 좌위를 생성하게 하는 방법.
  28. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 시작 코돈 및 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열, 또는 상기 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부를 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 인트론 내에 있으며, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 스플라이스 수용체 부위, 리보솜 스키핑 요소(ribosomal skipping element), 및 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 HBB 유전자의 인트론 1 내에 있는 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 코딩 뉴클레오티드에 인접하여 3'이고, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 리보솜 스키핑 요소 및 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 표적 좌위는 야생형 표적 유전자 또는 돌연변이체 표적 유전자의 상응하는 뉴클레오티드의 정지 코돈인 방법.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 외인성 폴리아데닐화 서열 3'을 더 포함하는 방법.
  34. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 상기 표적 유전자에 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 더 포함하는 방법.
  35. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 23 내지 28 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  36. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 상동성 암(arm) 뉴클레오티드 서열은 상기 제1 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 방법.
  37. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열은 상기 제2 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 방법.
  38. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 게놈 영역은 제1 편집창(editing window)에 위치되며, 상기 제2 게놈 영역은 제2 편집창에 위치되는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 제1 및 제2 편집창들은 상이한 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 제1 및 제2 편집창들은 동일한 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 편집창은 서열 번호: 101, 102, 또는 103에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 편집창은 서열 번호: 101, 102, 또는 103에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 게놈 영역은 서열 번호: 101에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 방법.
  44. 제38항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 게놈 영역은 서열 번호: 102에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 방법.
  45. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 상동성 암은 서열 번호: 101에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 방법.
  46. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 상동성 암은 서열 번호: 102에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 방법.
  47. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 및 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 각각은 독립적으로 약 100 내지 약 2000 뉴클레오티드의 길이를 갖는 방법.
  48. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교정 게놈은 상기 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 5' 반전된(inverted) 말단 반복(5' ITR) 뉴클레오티드 서열 5', 및 상기 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 3' 반전된 말단 반복(3' ITR) 뉴클레오티드 서열 3'을 더 포함하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 18과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 19와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 20과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 21과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 방법.
  51. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 29 내지 42 및 104 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  52. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며: 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G인 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    (a) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며;
    (b) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며;
    (c) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며;
    (d) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는
    (e) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  55. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며: 서열 번호: 2의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 D이고; 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G인 방법.
  56. 제55항에 있어서,
    (a) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며;
    (b) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며;
    (c) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며;
    (d) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는
    (e) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C인 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  58. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호: 2의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 T이고; 서열 번호: 2의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 68에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 V이고; 서열 번호: 2의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 L이고; 서열 번호: 2의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 D이고; 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G인 방법.
  59. 제58항에 있어서,
    (a) 서열 번호: 2의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 T이고, 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이며;
    (b) 서열 번호: 2의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Y이며;
    (c) 서열 번호: 2의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이며;
    (d) 서열 번호: 2의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 L이고, 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이며;
    (e) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며;
    (f) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며;
    (g) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며;
    (h) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는
    (i) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  61. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합 효율은 적어도 1%인 방법.
  62. 선행하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합의 대립 유전자 빈도는 적어도 0.5%인 방법.
  63. 하기를 포함하는 복제-결함 아데노-연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus):
    a) AAV Clade F 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드; 및
    b) (i) 표적 유전자에서 표적 좌위 편집용 편집 요소, (ii) 상기 표적 좌위에 대한 제1 게놈 영역 5'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 5', 및 (iii) 상기 표적 좌위에 대한 제2 게놈 영역 3'과 상동성을 갖는 상기 편집 요소의 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열 3'을 포함하는 교정 게놈.
  64. 제63항에 있어서, 상기 표적 유전자는 상기 HBB 유전자인 AAV.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 HBB 유전자에서 뉴클레오티드 점 돌연변이 또는 결실에 있는 AAV.
  66. 제65항에 있어서, 상기 HBB 유전자에서 상기 뉴클레오티드 점 돌연변이 또는 결실은 위치 -87에서 G, 위치 -31에서 G, 위치 -30에서 A, 위치 -29에서 G, 위치 -28에서 G, 위치 -10에서 T, 위치 1에서 C, 위치 1에서 A, 위치 2에서 G, 위치 17 및 18에서 C 및 T의 결실, 위치 19에서 A, 위치 20에서 A의 결실, 위치 20에서 T, 위치 25 및 26에서 A 및 A의 결실, 위치 26 이후 G의 추가, 위치 47에서 A, 위치 48에서 A, 위치 51에서 C의 결실, 위치 52에서 A, 위치 58에서 G, 위치 59에서 G, 위치 79에서 A, 위치 82에서 T, 위치 84 이후 C의 추가, 위치 93에서 T, 위치 93에서 A, 위치 97에서 C, 위치 98에서 C, 위치 202에서 G, 위치 208에서 G, 위치 222에서 C, 위치 241 또는 242에서 T의 결실, 위치 254 내지 257에서 T 및 T 및 C 및 T의 결실, 위치 260에서 T, 위치 264 또는 265에서 C의 결실, 위치 343 이후 A의 추가, 위치 399 및 400에서 G 및 T의 결실, 위치 401에서 T, 위치 417 이후 A의 추가, 위치 446에서 A, 위치 1099에서 T, 위치 1293에서 A, 1344에서 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 편집 요소는 돌연변이에 상응하는 야생형 HBB 유전자의 일부를 포함하는 AAV.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 HBB 유전자의 하나 이상의 엑손의 코딩 영역을 포함하는 AAV.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 엑손 1의 코딩 영역, 전체 인트론 1, 전체 엑손 2, 전체 인트론 2, 및 엑손 3의 코딩 영역을 포함하는 HBB 유전자의 일부를 포함하는 AAV.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 코딩 영역은 상기 야생형 HBB 유전자의 상응하는 엑손에 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50% 미만으로 동일하게 침묵 변경되는 AAV.
  71. 제70항에 있어서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 43 내지 46 및 105 내지 107로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하는 AAV.
  72. 제63항에 있어서, 상기 표적 좌위는 AAVS1인 AAV.
  73. 제63항 내지 제66 및 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 48 또는 이의 일부를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV.
  74. 제73항에 있어서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 4 내지 444로 구성되는 AAV.
  75. 제73항에 있어서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 27의 뉴클레오티드 4 내지 444에 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 미만으로 동일하게 침묵 변경되는 AAV.
  76. 제75항에 있어서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 47 또는 100의 서열로 구성되는 AAV.
  77. 제73항에 있어서, 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 HBB 유전자의 스터퍼-삽입된 코딩 서열로 구성되는 AAV.
  78. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 뉴클레오티드 3 및 뉴클레오티드 4 사이의 뉴클레오티드간 결합이며, 이에 의하여 상기 표적 좌위에의 상기 편집 요소의 통합으로 인해 상기 표적 유전자의 시작 코돈으로 시작하는 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하는 상기 표적 좌위를 생성하게 하는 AAV.
  79. 제73항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 시작 코돈 및 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열, 또는 상기 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열의 일부를 포함하는 AAV.
  80. 제79항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 인트론 내에 있으며, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 스플라이스 수용체 부위, 리보솜 스키핑 요소, 및 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하는 AAV.
  81. 제80항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 HBB 유전자의 인트론 1 내에 있는 AAV.
  82. 제79항에 있어서, 상기 표적 좌위는 상기 표적 유전자의 코딩 뉴클레오티드에 인접하여 3'이고, 상기 편집 요소는 5' 내지 3' 리보솜 스키핑 요소 및 HBB 코딩 서열 또는 스터퍼-삽입된 코딩 서열을 포함하는 AAV.
  83. 제82항에 있어서, 상기 표적 좌위는 야생형 표적 유전자 또는 돌연변이체 표적 유전자의 상응하는 뉴클레오티드의 정지 코돈인 AAV.
  84. 제73항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 상기 서열 번호: 48을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 외인성 폴리아데닐화 서열 3'을 더 포함하는 AAV.
  85. 제63항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 상기 표적 유전자에 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 더 포함하는 AAV.
  86. 제63항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 편집 요소는 서열 번호: 23 내지 28 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
  87. 제63항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열은 상기 제1 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 AAV.
  88. 제63항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열은 상기 제2 게놈 영역과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 AAV.
  89. 제62항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 게놈 영역은 제1 편집창에 위치되며, 상기 제2 게놈 영역은 제2 편집창에 위치되는 AAV.
  90. 제89항에 있어서, 상기 제1 및 제2 편집창들은 상이한 AAV.
  91. 제89항에 있어서, 상기 제1 및 제2 편집창들은 동일한 AAV.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 편집창은 서열 번호: 101, 102, 또는 103에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 AAV.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 편집창은 서열 번호: 101, 102, 또는 103에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 AAV.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 게놈 영역은 서열 번호: 101에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 AAV.
  95. 제89항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 게놈 영역은 서열 번호: 102에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 AAV.
  96. 제63항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 상동성 암은 서열 번호: 101에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 AAV.
  97. 제63항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' 상동성 암은 서열 번호: 102에 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 AAV.
  98. 제63항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 및 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 각각은 독립적으로 약 100 내지 약 2000 뉴클레오티드의 길이를 갖는 AAV.
  99. 제63항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교정 게놈은 상기 5' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 5' 반전된 말단 반복(5' ITR) 뉴클레오티드 서열 5', 및 상기 3' 상동성 암 뉴클레오티드 서열의 3' 반전된 말단 반복(3' ITR) 뉴클레오티드 서열 3'을 더 포함하는 AAV.
  100. 제99항에 있어서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 18과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 19와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 AAV.
  101. 제99항에 있어서, 상기 5' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 20과 적어도 95% 서열 동일성을 가지며, 상기 3' ITR 뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 21과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 AAV.
  102. 제63항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 교정 게놈은 서열 번호: 29 내지 42 및 104 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV.
  103. 제63항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며: 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G인 AAV.
  104. 제103항에 있어서,
    (a) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며;
    (b) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며;
    (c) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며;
    (d) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는
    (e) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C인 AAV.
  105. 제103항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 203 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 AAV.
  106. 제63항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며: 서열 번호: 2의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 D이고; 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G인 AAV.
  107. 제106항에 있어서,
    (a) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며;
    (b) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며;
    (c) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며;
    (d) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는
    (e) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C인 AAV.
  108. 제106항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 138 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 AAV.
  109. 제63항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서T, 상기 AAV Clade F 캡시드 단백질은 서열 번호: 2의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호: 2의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 T이고; 서열 번호: 2의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 68에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 V이고; 서열 번호: 2의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 L이고; 서열 번호: 2의 아미노산 151에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 160에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 D이고; 서열 번호: 2의 아미노산 206에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고; 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이고; 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고; 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고; 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이고; 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고; 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 590에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G 또는 Y이고; 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이고; 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고; 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이고; 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C이고; 또는 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G인 AAV.
  110. 제109항에 있어서,
    (a) 서열 번호: 2의 아미노산 2에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 T이고, 서열 번호: 2의 아미노산 312에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Q이며;
    (b) 서열 번호: 2의 아미노산 65에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 Y이며;
    (c) 서열 번호: 2의 아미노산 77에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 690에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 K이며;
    (d) 서열 번호: 2의 아미노산 119에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 L이고, 서열 번호: 2의 아미노산 468에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 S이며;
    (e) 서열 번호: 2의 아미노산 626에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이고, 서열 번호: 2의 아미노산 718에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 G이며;
    (f) 서열 번호: 2의 아미노산 296에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 H이고, 서열 번호: 2의 아미노산 464에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 N이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 681에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 M이며;
    (g) 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 687에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며;
    (h) 서열 번호: 2의 아미노산 346에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 A이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이며; 또는
    (i) 서열 번호: 2의 아미노산 501에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 I이고, 서열 번호: 2의 아미노산 505에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 R이고, 서열 번호: 2의 아미노산 706에 상응하는 캡시드 단백질에서 아미노산은 C인 AAV.
  111. 제109항에 있어서, 상기 캡시드 단백질은 서열 번호: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 또는 17의 아미노산 1 내지 736의 아미노산 서열을 포함하는 AAV.
  112. 제63항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합 효율은 적어도 1%인 AAV.
  113. 제63항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, AAV가 표준 AAV 형질도입 조건 하에서 CD34+ 인간 줄기 세포의 집단과 외인성 뉴클레아제의 부재 하에 시험관 내에서 접촉될 때, 편집 요소의 표적 좌위로의 통합의 대립 유전자 빈도는 적어도 0.5%인 AAV.
  114. 제62항 내지 제111항 중 어느 한 항의 AAV를 포함하는 약학적 조성물.
  115. AAV의 재조합 제조용 패키징 시스템으로서, 상기 패키징 시스템은
    a) 하나 이상의 AAV Rep 단백질을 인코딩하는 Rep 뉴클레오티드 서열;
    b) 제103항 내지 제111항 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 하나 이상의 AAV Clade F 캡시드 단백질을 인코딩하는 Cap 뉴클레오티드 서열; 및
    c) 제63항 내지 제102항 중 어느 하나에 기재된 바와 같이 교정 게놈을 포함하며, 상기 패키징 시스템은 상기 캡시드 내에 상기 교정 게놈을 봉입하기 위한 세포 내에서 작용하여 상기 AAV를 형성하는 것인, 패키징 시스템.
  116. 제115항에 있어서, 상기 패키징 시스템은 상기 Rep 뉴클레오티드 서열 및 상기 Cap 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 벡터, 및 상기 교정 게놈을 포함하는 제2 벡터를 포함하는 패키징 시스템.
  117. 제115항 또는 제116항에 있어서, 상기 Rep 뉴클레오티드 서열은AAV2 Rep 단백질을 인코딩하는 패키징 시스템.
  118. 제117항에 있어서, 상기 AAV2 Rep 단백질은 78/68 또는 Rep 68/52인 패키징 시스템.
  119. 제117항 또는 제118항에 있어서, 상기 AAV2 Rep 단백질은 서열 번호: 22의 AAV2 Rep 아미노산 서열과 최소 퍼센트 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 최소 퍼센트 서열 동일성은 상기 AAV2 Rep 단백질을 인코딩하는 아미노산 서열의 길이에 걸쳐 적어도 70%인 패키징 시스템.
  120. 제115항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 벡터를 더 포함하며, 상기 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 벡터인 패키징 시스템.
  121. 제120항에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스 벡터는 독립적 제3 벡터인 패키징 시스템.
  122. 제120항에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스 벡터는 상기 제1 벡터와 통합되는 패키징 시스템.
  123. 제120항에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스 벡터는 상기 제2 벡터와 통합되는 패키징 시스템.
  124. 제120항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 벡터는 헬퍼 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 패키징 시스템.
  125. 제120항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 및 거대세포바이러스(CMV: cytomegalovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 패키징 시스템.
  126. 제125항에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스인 패키징 시스템.
  127. 제126항에 있어서, 상기 아데노바이러스 게놈은 El, E2, E4 및 VA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아데노바이러스 RNA 유전자를 포함하는 패키징 시스템.
  128. 제125항에 있어서, 상기 헬퍼 바이러스는 헤르페스 단순 바이러스(HSV: herpes simplex virus)인 패키징 시스템.
  129. 제128항에 있어서, 상기 HSV 게놈은 UL5/8/52, ICPO, ICP4, ICP22 및 UL30/UL42로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 HSV 유전자를 포함하는 패키징 시스템.
  130. 제120항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터 및 상기 제3 벡터는 제1 형질감염 플라스미드 내에 함유되는 패키징 시스템.
  131. 제120항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터의 뉴클레오티드는 제2 형질감염 플라스미드 내에 함유되는 패키징 시스템.
  132. 제120항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 벡터 및 상기 제3 벡터의 뉴클레오티드는 재조합 헬퍼 바이러스로 클로닝되는 패키징 시스템.
  133. 제120항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 벡터 및 상기 제3 벡터의 뉴클레오티드는 재조합 헬퍼 바이러스로 클로닝되는 패키징 시스템.
  134. AAV의 재조합 제조방법으로서, 상기 방법은 본원에 제115항 내지 제133항 중 어느 한 항의 패키징 시스템을 캡시드 내에 교정 게놈을 봉입하기 위해 작용하는 조건 하에서 세포 내로 도입하여 상기 AAV를 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
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