KR20000076157A - 세포의 디엔에이로 핵산을 도입하는 디엔에이-기초 전이인자 시스템 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포의 DNA에 핵산을 도입하는 시스템과 관련된다. 상기 시스템은 SB 계열의 전이효소(SB)를 포함하며, 또는 상기 전이효소를 암호화하는 핵산 및 인접하는 역위 반복부를 지닌 핵산 서열을 함유하는 핵산 단편을 포함한다. 상기 전이효소는 역위 반복부의 적어도 한 부분을 인식하고 핵산 서열을 DNA에 결합시킨다. 상기 시스템을 사용하는 방법이 검토된다.

Description

세포의 디엔에이로 핵산을 도입하는 디엔에이-기초 전이인자 시스템{DNA-BASED TRANSPOSON SYSTEM FOR THE INTRODUCTION OF NUCLEIC ACID INTO DNA OF A CELL}
전이인자 또는 전이성 인자는 반복 서열에 결합된 짧은 핵산 단편을 포함한다. 활성 전이인자는 DNA 서열에 핵산을 삽입하는 것을 가능하게하는 효소를 암호화한다.
척추동물에서, DNA-전이인자, DNA 매개체를 경유하여 움직이는 이동인자(mobile elements)의 발견은 비교적 최근의 일이다(Radice, A.D., et al., 1994. Mol. Gen. Genet. 244, 606-612). 이후 비활성이고, 고도로 변이된 진핵세포 전이인자의 hAT(hobo/Ac/Tam) 수퍼패밀리(superfamily)는 물론 Tc1/mariner의 일원이 다른어종(fish species), 손톱개구리속(Xenopus) 및 인간의 게놈(Oosumi et al., 1995. Nature 383, 30; Lam et al., 1996. J. Mol. Biol. 257, 359-366 및 Lam, W. L., et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10870-10875)으로부터 분리되었다.
상기 전이성 인자는 잘라-붙이는 기작(cut-and-paste mechanism)을 통하여 전이하며; 인자-암호화된 전이효소는 전이인자를 그 최초의 위치로부터 절제(excision)하는 것을 촉매하며, 이를 게놈내에 재삽입(reintegration)시키는 것을 증진시킨다(Plasterk, 1996 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204, 125-143). 자율적인 전이인자 계열의 일원은 활성 전이효소, 전위(transposition)에 대한 트란스-활성인자를 발현시킬 수 있으며, 따라서 자력으로 전이시킬 수 있다. 비자율적인 인자는 전이효소 유전자를 변이시키기는 하지만, 시스-활성 DNA 서열은 유지한다. 상기 시스-활성의 DNA 서열은 또한 역위 말단반복부(inverted terminal repeats)로 언급된다. 어떤 역위 반복 서열은 하나 이상의 정반복 서열(direct repeat sequences)을 포함한다. 상기 서열은 상보적인 전이효소의 존재하에서 이동에 필수적인 말단의 역방향 반복부(IRs)에 다른 인자로부터 삽입된다.
단 하나의 자율적인 인자도 척추동물로부터 분리된바 없었고; 모든 전이인자-같은 서열이 결함이 있었으며, 이는 명백하게 " 종적 비활성(vertical inactivation) "이라고 일컫는 과정의 결과였다(Lohe et al., 1995 Mol. bio,. Evol.Evol. 12, 62-72). 하나의 계통발생적(phylogenetic) 모델(hart et al., 1997 Trends Genet. 13, 197-201)에 따르면, 진핵 게놈에서, 비자율적 대 자율적 인자의 비율은 전위의 트란스-상보적 특성의 결과로서 증가한다. 상기 과정은 게놈내에서 활성, 전이효소를 생산하는 복사(copy)의 궁극적인 소멸을 불가피하게 한다. 결과적으로, DNA-전이인자은 게놈의 일시적인 성분으로 고찰되며, 사멸하지 않기 위해 새로운 숙주내에서 안정적으로되는 방법을 찾아야만 한다. 실제로, 종간에서의 수평적인 유전자 전달은 전이인자의 진화(evolution)에 있어서, 가장 중요한 과정의 하나로 판단된다(위의 Lohe et al., 1995 and Kidwell, 1992. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 868-873).
수평적 유전자 전달의 자연적인 과정은 실험실 조건에서 모방될 수 있다. 식물에서는, Ac/Ds 및 Spm 계열(family)의 전이성 인자가 이종(heterologous species)으로 도입되었다(Osborne and Baker, 1995 Curr. Opin. Cell Biol. 7, 406-413). 그러나, 동물에서, 하나의 종에서 다른종으로의 활성 전이인자 시스템의 전달에 대한 커다란 장해는 종-특이성(species-specificity)이었으며, 이는 본래 숙주에 의해 제조된 성분에 대한 요구성에서 기인한다. 상기한 이유로, 초파리(드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster))의 P 성분 전이인자를 초파리과가 아닌 곤충(non-drosophilid insects), 제브라물고기(zebrafish) 및 포유동물 세포의 유전적 형질전환에 대해 사용하고자 하는 시도가 실패하였다(Gibbs et al., 1994 Mol. Mar. Biol. Biotech. 3, 317-326; Handler et al., 1993. Arch. Insect Biochem. Physiol. 22, 373-384; and Rio et al., 1988 J. Mol. Biol. 200, 411-415). P 인자와 대비하면, Tc1/mariner 수퍼패밀리의 전이성 인자는 그 전위에 대해 종-특이성 요인을 요구하지 않을 수 있다. 상기 인자는 자연계에서 단세포 기관으로부터 인간에 이르기까지 널리 존재한다(위의 Plasterk, 1996). 또한, 대장균(E. coli)에서 발현된 재조합 Tc1과 마리너(mariner) 전이효소는 생체외에서 전위를 촉매하기에 충분하다(Vos et al, 1996 Genes. Dev. 10, 755-761 및 Lampe et al., 1996. EMBO J. 15, 5470-5479 및 Plasterk 등의 PCT 국제공개 제 WO 97/29202 호 참조). 또한, 미노스(Minos)에 기초한 유전자 벡터가, 드로소필라 히테이(Drosophila hydei) 내생의 Tc1-유사인자(TcE), 파리 세라티티스 카피타타(Ceratitis capitata)(Loukeris et al., 1995 Science 270, 2002-2005)의 생식세포계열(germline) 형질전환에 성공적으로 사용되었다.
분자 계통발생적 분석은 물고기 TcEs의 대부분이 세개의 주요 형태로 분류될 수 있음을 보여주었다: 제브라물고기(zebrafish)-, 연어(salmonid)-, 제노푸스(Xenopus) TXr 형 인자, 상기에서 연어 서브패밀리(subfamily)는 그 시작이 가장짧고, 따라서 가장 최근에 활동하는 것이다(Ivics et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93, 5008-5013). 또한, 연어 및 다른 숙주종의 TcEs에 대한 계통발생적인 조사는, 상대적으로 큰 진화적인 간격에 있어서까지도 수평적인 전달을 통해 반응에 관여하지 않은 게놈에 삽입되어 영구적으로 자리잡는 상기 특정 서브패밀리(subfamily) 인자(element)의 능력에 관한 중요한 단서를 제공한다.
제브라물고기의 Tdr1(Izsvak et al., 1995) 및 9 개 어종(Ivics et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5008-5013)으로부터의 다른 밀접하게 관련된 TcEs와 경골어류(teleost fish)로부터의 TcEs(Goodier and Davidson, 1994 J. Mol. Biol. 241, 26-34 and Izsvak et al., 1995. Mol. Gen. Genet. 247, 312-322)는 척추동물에서 알려진 모든 DNA-전이인자중에서 그 성상이 가장 잘 확인되었다. 물고기 인자 및 다른 일반적인 TcEs는 역위 반복부 서열에 인접하는 전이효소를 암호화하는 단일 유전자에 의해 전형화된다. 불행하게도, 지금까지 분리된 물고기 인자는 모두 비활성인데, 이는 전이효소 유전자에 하나 이상의 변이가 있기 때문이다.
DNA를 세포내로 도입하는 방법은 공지이다. 이는 인산칼슘(calcium phosphate), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등의 DNA 축합시약, 다수-라멜라 소낭(multi-lamella vesicles), 리포좀(liposomes)과 같은 지질-함유 시약 및 바이러스-중재법(virus-medeated strateges) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 방법은 모두 한계가 있다. 예를들어, DNA 축합시약(condensing reagents) 및 바이러스-중재법과 관련해서는 크기(size)의 제약이 있다. 또한, 세포로 도입될 수 있는 핵산의 양은 바이러스 법에서 제한된다. 모든 방법이 세포의 핵산으로 전달된 핵산의 삽입을 가능하게하는 것은 아니며, DNA 축합방법 및 지질 함유 시약이 상대적으로 제조하기 쉬운 반면에, 핵산의 바이러스 벡터로의 삽입은 많은 수고가 필요하다. 또한, 바이러스-중재법은 생체내에서 사용시에 면역문제를 유발할 수 있다.
DNA를 세포내로 도입하는 새로운 방법, 특히 다양한 크기의 핵산 단편을 세포내 핵산으로 효과적으로 삽입하는 것을 증진시키는 방법, 특히 DNA의 세포의 게놈으로 삽입하는 방법이 있다.
본 발명은 유전자 발현, 유전자 지도작성, 변이유발, 숙주 염색체로의 DNA 도입방법 및 전이인자(trnasposon)과 전이효소(transposases)에 관련된다.
도 1은 연어의 Tc1-유사 전이효소 유전자의 분자 재구성을 나타내는 도면이다. 도 1a는 전이효소내의 보존 부위(conserved domain)와 IR/DR(invered repeat/direct repeat) 플랭킹서열(flanking sequence)을 지닌 연어의 TcE 의 개략도이다. 도 1b는 연어의 전이효소(SB1-SB3)에 대한 오픈 리딩 프레임을 구성하고, 다음으로 아미노산 치환체(replacements)를 유전자(SB4-SB10)에 체계적으로 도입하기 위한 예시적인 방법을 나타내는 도면이다. 아미노산 잔기는 단일문자 코드를 사용하여 나타내었고, 콘센서스와 구별하여 검은 활자로 하였다. 번역 종료 코돈은 별표시로 나타내었고, 틀이동변이(framshift mutation)는 #으로 나타내었다. 콘센서스에 대해 달라진 잔기는 체크-표시하였고, 흰색의 이탤릭체로 하였다. 우측 경계에 다양한 재구성 단계에서 수행된 다양한 기능시험을 표시하였다.
도 2a는 SB 단백질을 암호화 하는 핵산 서열(서열번호:3)을 나타내는 도면이다. 도 2b는 SB 전이효소의 아미노산 서열(서열번호:1)을 나타내는 도면이다.
도 3은 SB 전이효소의 N-말단 유도체의 DNA-결합 활성을 나타내는 도면이다. 도 3a는 N123의 발현 및 정제에서 단계를 나타내는 SDS-페이지(PAGE) 분석을 제공한다. 레인: 1) 발현벡터 pET21a를 함유하는 세포의 추출; 2) IPTG로 유도하기 전에 발현벡터 pET21a/N123 을 함유하는 세포의 추출; 3) IPTG로 유도한 후 2.5 시간 후에 발현벡터 pET21a/N123을 함유하는 세포의 추출; 4) Ni2+-NTA 수지를 사용하여 부분적으로 정제한 N123. 분자량은 우측에 kDa로 표시하였다. 도 3b는 어류 전이인자의 역위 반복부에 N123이 결합했는지를 결정하기 위한 모빌리티-시프트(mobility-shift) 분석 연구의 결과를 나타내는 도면이다. 레인: 1) 프로우브(probe)만 있는 경우; 2) 발현벡터 pET21a를 함유하는 세포의 추출물; 3) 판넬 A의 레인 4에 제시된 N123 제조물의 10,000-배 희석; 4) 레인 3에 1000 배 몰과량의 표식되지 않은 프로우브가 경합 DNA로서 더해진 것과 같다; 5) 레인 3에 경합 DNA로서 제브라물고기 Tdr1 인자의 역위 반복부 단편의 1000 배 몰과량이 더해진 것과 같다; 6)-13) 판넬 A의 레인 4에 제시된 N123 제조물의 200,000-, 100,000-, 50,000-, 20,000-, 10,000-, 5,000-, 2,500- 및 1,000-배 희석이다.
도 4는 N123에 의해 형성된 데옥시리보뉴클레오 프로테인의 DNase Ⅰ의 풋트프린팅(foot printing)을 나타내는 도면이다. 도 4a는 도 3B에서와 동일한 전이인자 역위 반복부 DNA 프로우브를 사용하며, 도 3a의 레인 4에 나타낸 N123 제조물의 500배 희석을 함유하는 겔의 DNase Ⅰ의 풋트프린팅을 나타내는 사진이다. 반응은 N123의 부재(하부레인) 또는 존재(중간레인)하에 수행되었다. 동일한 DNA 에서 퓨린 염기의 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 서열이 표식(marker)(레인 1)으로서 사용되었다. 반응은 N123의 존재(레인 2) 또는 부재(레인 3)하에 실시되었다. 도 4b는 제브라물고기의 Tdr1 인자에서 대응하는 서열과 함께, 판넬 A에 예시된 연어의 전이효소-결합부위의 서열비교(서열번호:37-40)를 나타내는 도면이다. 도 4c는 SB 전이인자내에 있는 외부 및 내부의 전이효소-결합 부위간 서열비교(서열번호: 41-42)를 나타내는 도면이다.
도 5는 인간 헬라 세포(Hela cells)에서 SB 의 삽입 활성을 나타내는 도면이다. 도 5a는 배양 세포에서 SB-중재 전이유전자 삽입에 대한 유전자 분석법을 개략적으로 나타내는 도면이다. 도 5b는 공여및 헬퍼 플라스미드의 다른 조합으로 트랜스펙트(transfect)된 항 G-418 헬라세포의 염색된 콜로니와 함께 헬라세포의 페트리디시(petri dish)를 사용하는 헬라세포의 삽입을 입증하는 도면이다. 플레이트: 1) pT/neo 에 pSB10-AS 를 더한 것; 2) pT/neo 에 SB10를 더한 것; 3) pT/neo 에 pSB10-△DDE 를 더한 것; 4) pT/neo 에 pSB6 를 더한 것; 5) pT/neo -△IR 에 pSB10 을 더한 것이다.
도 6은 인간의 헬라세포에서 전이유전자 삽입의 결과를 요약한다. 삽입은 활성 SB 전이효소의 존재에 의존하고, 이식된 유전자는 전이인자의 역위 반복부에 인접한다. 지시된 공여체 및 헬퍼 플라스미드의 다른 조합이 배양된 헬라 세포로 함께 코트랜스펙트(cotransfected) 되었으며, 도 5에 제시된 시험에 비교하면, 세포의 10분의 1이 대응 형질전환체(count transformants)에 대한 선택하에 플레이트 되었다. 이식된 유전자의 삽입효율은 항생물학적(antibiotic) 선택에서 생존하는 형질전환체의 숫자로 기록되었다. 우측의 형질전환체의 수는 접시당 항 G-418 세포 군락의 수를 나타낸다. 각각의 수는 3 번의 트랜스펙션 시험의 평균값이다.
도 7은 항 네오마이신-표식된 전이인자의 헬라세포 염색체로의 삽입을 나타내는 도면이다. 도 7a는 헬라세포의 게놈 DNA와 pT/neo 및 pSB10 으로 코트랜스펙트되고 G-418 선택에서 생존한 8 개의 헬라세포 콜로니(colony)로부터의 네오마이신-특이적 방사표식된(radiolabled) 프로우브(probe)와 서던교잡(Southern hybridization)시킨 결과를 나타내는 도면이다. 게놈 DNA는 한천 겔 전기영동(eletrophoresis) 및 블로팅(blotting)에 앞서, 네오-표식된 전이인자의 내부를 절단하지 않는 효소, 제한효소 NheⅠ, XHOⅠ, BgⅠⅡ, SpeⅠ, XbaⅠ로 소화된다. 도 7b는 인간의 게놈 DNA에 삽입되는 T/neo 전이인자의 결합서열(서열번호:43-63 및 서열번호:2)의 다이어그램이다. 상기 공여부위(doner site)는 최초에 Pt/neo(검은 화살표)에서 전이인자에 인접하였던, 플라스미드 벡터의 서열과 함께 상단에 나타내었다.
도 8은 전이인자의 절제(excision)과 삽입에 대한 플라스미드간(interplasmid) 분석을 설명하는 개략도이다. 상기 분석은 제브라물고기 배아에서 전이효소의 활성을 평가하는데 사용되었다. 두개의 플라스미드와 SB 전이효소 단백질을 암호화하는 RNA가 하나의-세포의 제브라 배아에 함께 삽입되었다. 상기 플라스미드중 하나는 SB 전이효소에 의해 인식되는 IR/DR 서열에 인접하는 항 암피실린 유전자(Ap)를 함유한다. 수정 및 삽입 5시간 후, 저분자량의 DNA가 배아로부터 분리되었고, E. coli를 형질전환하는데 사용되었다. 상기 박테리아는 암피실린 및 카나마이신(Km) 을 함유하는 배지에서 배양되었으며, 이는 Km 및 Ap 항생물학적-저항 표식을 모두 함유하는 단일의 플라스미드를 포함하는 박테리아를 선택하기 위함이다. 이중 항성의 세포로부터 얻은 상기 플라스미드는 Ap-전이인자가 절단되었는지, Km의 표적 플라스미드에 재삽입되었는지 여부를 확인하기 위해 검토된다. 또 다른 표식 Ap-플라스미드 또는 제브라물고기의 게놈으로 이동한 Ap-전이인자은 기록되지 않았다. 왜냐하면 삽입된 플라스미드 내의 DNA의 양은 게놈에서와 거의 동일하였으며, 표적 플라스미드에 삽입된 Ap-전이인자의 수는 게놈에서 삽입체의 수와 비슷하였기 때문이다.
도 9는 본 발명에 따른 유전자 전달 시스템을 사용하는 2개의 바람직한 방법을 나타낸다. 본 발명에 의한 핵산 단편의 삽입 위치에 의거할 때, 상기 효과는 기능손실이거나 기능획득 변이일 수 있다. 활성의 두 가지 형태는, 예를들어, 유전자 발견 및/또는 기능적 게놈에 사용될 수 있다.
도 10은 IRS-PCR(산재된 반복서열 폴리머라제 연쇄 반응)을 이용하는 바람직한 스크리닝법을 제시한다. 도 10a는 리트로포존(retroposon) DANA(D) 5'-GGCGACRCAGTGGCGCAGTRGG(서열번호:13)및 5'-GAAYRTGCAAACTCCACACAGA(서열번호:14) Tdr1 전이인자(T) 5'-TCCATCAGACCACAGGACAT(서열번호:15) 및 5'-TGTCAGGAGGAATGGGCCAAAATTC(서열번호:16);및 Angel(A)(고도로 반복된 축사(miniature)의 역위-반복부 전이성 인자) 5'-TTTCAGTTTTGGGTGAACTATCC(서열번호:12) 서열을 함유하는 제브라물고기의 게놈내에서 염색체 영역을 나타낸다.
중앙의 DANA 인자에 겹쳐 놓여진 상기 X 는 또 다른 제브라물고기의 게놈에 서 변이된 프라이머 결합부 또는 결실된 성분을 나타내는 것으로 여겨진다. 다양하고 증폭된 서열 태그 부위(tagged site)(STSs)는 가장 긴 탐지성 PCR 산물로 시작하는 소문자로 확인된다. X로 표시된 상기 산물은 결원 " X-DNA "를 지닌 게놈이 증폭되면, PCR 반응에서 제조되지 않는다. 3000개 이상의 염기쌍에 의해 분리된 성분 및 각각에 대해 잘못된 방향성을 갖는 성분은 효과적으로 증폭되지 않는다. 도 10b는 2 세트의 DNA 증폭 제조물에 대한 개략도로서, X 표식된 DANA 인자가 존재하는(레인 1) 것과 부재하는(레인 2) 게놈으로부터 얻는다. 표식된 DANA 서열이 없으면, 밴드 " a " 및 " d "가 없어지는 것을 주목하라.
바람직한 실시예의 상세한 설명
본 발명은 세포의 DNA에 핵산 서열을 도입하는데 사용되는 신규한 전이효소 및 전이인자에 관련된다. 전이효소는 DNA 말단의 역위 반복부에서 DNA에 결합할 수 있는 효소이다. 전이인자은 전형적으로는 적어도 하나, 바람직하게는 2개의, 역위 반복부를 함유하며, 이는 삽입되는 핵산에 인접한다. 상기 전이효소는 역위 반복부의 인식부위에 결합하며, 전이인자의 DNA 에 대한 결합을 촉매한다. SB 전이인자의 역위 반복부는 두개의 정반복부를 포함할 수 있으며 적어도 하나의 정반복부를 포함한다.
전이인자는 전이효소의 존재하에 DNA의 한 위치에서 제 2위치로 이동할 수 있다는 점에서 이동성이다. 어떤 이동성의 잘라-붙이는 형태의 전이인자 시스템에는 두개의 기본적인 요소, 활성 전이효소원 및 상기 전이효소에 의해 인식되고 이동되는 DNA 서열이 존재한다. 상기 DNA 서열의 이동은 인식되고 또한 이동되는 DNA 서열 사이에 핵산의 삽입을 허용한다.
Tc1/mariner 수퍼패밀리(superfamily)의 일원을 포함하는 DNA-전이인자는, 척추동물 게놈의 오랜 소재지이다(Radice et al., 1994; Smit and Riggs, 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1443-1448). 그러나, 이러한 류(class)의 전이인자의 복사 또는 TcE 삽입에 의해 야기되는 자발적인 변이의 사례중 그 어느 것도 척추동물에서 입증된 바 없다. 이것은 변이 유전자의 계통발생적인 역사가 기록된 리트로포존에 비교된다(Izsvak et al., 1996). 척추동물로부터 활성 DNA-전이인자을 분리하는 것의 실패는 이들 인자를 생식계열의 형질전환 및 삽입변이를 위한 벡터로서 개발하고자하는 의욕을 방해하여왔다. 그러나, 두개의 경골어 목(Ivics et al., 1996)사이의 수평적 전이에 대한 연어 TcEs의 뚜렷한 능력은 물고기의 전이인자중에서 상기 특정 서브패밀리(subfamily)이 훨신 먼 진화상의 간격을 넘어서 전이될 수 있다는 것을 제시하였다..
파르시모니 분석(parsimony analysis)을 사용하는 조상의 원형 유전자의 재구성이 보고된 바 있다(Jermann et al., 1995. Nature 374, 57-59; Unnikrishnan etal., 1996, Stewart, 1995 Nature 374, 12-13). 그러나, 그러한 방법은 조상 유전자를 계통발생적으로 역추적하기 위해 진화를 통한 유전자의 수직적인 전달을 요구한다. 파르시모니 분석은 연어 TcEs 사이의 계통 발생적인 관련을 해결할 수 없기 때문에, 우리는 전이인자중에서 동일한 서브패밀리에 속하는 비활성 인자로부터 콘센서스 서열을 재구성하는 접근을 취하였다. 마우스에서 L1 역전이인자(retrotransposon)의 기능적 프로모터의 인공소생(resurrection)(Adey et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 1569-1573)이 이미 보고되었다.
활성 유전자를 얻기위한 방법에 위험이 없는 것이 아니다. 하나의 유기체로부터 얻은 전이효소 유사유전자(pseudogens)의 콘센서스 서열이 단순하게 변이를 반영할 수 있는데, 이때 상기 변이는 수직적인 비활성중에 발생하여, 상기 변이된 인자의 증폭결과 게놈내에 고정된 것이다. 예를들어, 제브라물고기로부터 분리된 대부분의 Tdr1 성분은 전이인자 유전자내에 보존된, 350-bp 결실을 함유한다(Izsvak et al., 1995). 따라서, 그들의 콘센서스는 비활성 인자를 암호화할 것으로 기대된다. 그와 달리, 다른 종에 있어서 동일한 변이의 독립적인 고정은 가능성이 없어 보였기 때문에, 우리는 활성 전이인자에 대한 서열을 제공하기 위해 수개의 유기체로부터 얻은 전이인자중에서 동일한 서브패밀리의 비활성 인자로부터 콘센서스를 유도하였다.
연어-형 TcEs의 역위 반복부(IRs)와 전이효소 암호화 영역은 점변이(point mutation), 결실(deletion) 및 삽입을 포함하는 몇몇 변이를 축적하였으며, 평균 약 5%의 짝별 분기(pair wise divergence)(위의 Ivics et al., 1996)를 보였다. 실시예 1은 물고기 인자중에서 연어 서브패밀리의 전이효소 유전자를 재구성하는데 사용되는 방법을 기술하며, 축적된 계통발생적인 자료를 사용한다. 상기 분석은 directory/pub/database/embl/align 에서 FTP.EBI.AC.AK 로부터 DS30090 으로서 EMBL 데이타베이스에서 제공되며, 상기 분석의 결과는 비활성 SB 단백질에 대한 콘센서스 서열이었다. 조사된 모든 성분이 결실 또는 다른 변이로 인하여 비활성이었다. SB 전이효소 계열중 연어의 전이효소 유전자가 PCR 유전자 변이를 이용하여 제조되었으며, 이는 도 1에 제시되고 실시예 1에서 기술된 바와 같은 10개 구조의 제조를 통한 것이었다.
상기 서열은 또한, 본원에 기술한 바와 같이, SB 단백질 계열의 활성인자를 제공하도록 변형될 수 있다.
상기 SB 단백질은 핵산 단편에서 역위 반복부를 인식하며, 각각의 역위 반복부는 적어도 하나의 정반복부를 포함한다. 상기 유전자 전달 시스템은, 따라서, 두개의 요소를 포함한다: 전이효소와 복제되고, 비자발적인(즉, 비-자기 삽입) 연어형 인자 또는 전이인자 기질(substrate) DNA의 역위 반복부를 운반하는 전이인자(여기서 최소한 두개의 역위 반복부가 있는 핵산 단편으로 언급됨). 상기 두개의 요소을 함께 사용하므로써, 활성의 전이인자의 활성을 제공한다. 용도에 있어서, 상기 전이효소는 역위 반복부의 정반복부에 결합하고 포유동물은 물론 물고기의 염색체외 DNA 및 염색체를 포함하는 세포의 DNA로 삽입되는 핵산 서열의 결합을 증진시킨다. 상기 전이인자 시스템은 자연적으로는 나타나지 않는다.
실시예 1의 방법을 사용하여 재구성된 전이효소는 DNA, 바람직하게는 세포 DNA 에 삽입되는 핵산 서열의 효과적인 결합을 위해 전이인자의 역위 반복부에 결합할 수 있는 단백질 계열의 어느 하나를 나타낸다. 본 발명에 의한 단백질 계열의 하나의 예는 서열번호:1(도 2 참조)로 제공된다. 상기 단백질 계열은 본원에서 SB 단백질으로 언급된다. 본 발명에 의한 도 1에서 개략적으로 제공된다. 상기 단백질은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로의 이동, 류신 지퍼(leucine zipper)의 짝-유사 부위, 하나 이상의 뉴클레어 로컬라이징 영역 서열(nuclear localizing domain sequence)(NLS) 및 도 2의 한 실시예에서 상술한 바와 같은 DD(34)E 박스 및 글리신-부화 박스(glycine-rich box)를 포함하는 촉매부위를 포함한다. 상기 SB 계열의 단백질은 서열번호:1의 아미노산을 갖는 단백질을 포함하며 또한 서열번호:1에 대해 적어도 80%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열의 단백질을 포함한다. 즉, SB 계열의 단백질이 연결되었을 때, 적어도 80%의 아미노산 서열이 동일하다는 것이다. SB 계열의 단백질은 전이효소이며, 즉, 핵산의 세포 DNA로의 결합을 촉매할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 단백질은 콘센서스 정반복부(서열번호:10)은 물론 전이인자으로부터의 정 반복부(서열번호:6-9) 및 서열번호:4-5의 역위 반복부 서열에 결합할 수 있다. 상기 SB 단백질은 바람직하게는 약 10 %의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 약 35kD 에서 약 40kD 범위의 분자량을 갖는다.
이후의 변형에 적합한 활성 SB 단백질을 생산하기 위해, 11개의 어종로부터 수개의 염색체 단편이 배열되고, 제브라물고기 전이인자-유사 서열 Tdr1 에 대한 상동성에 따라 동정되었다(Ivics et al., 1996). 다음 상기 및 그밖의 상동의 서열이 수집되고 결합되었다. 상기 서열은 GenBank 또는 EMBL 데이타베이스에서 동정되었다. 그 밖에 콘센서스 서열에 이르기 위해 파르시모니 분석을 사용할 것을 제안하였으나, 상기 경우 파르시모니 분석은 수집된 연어-형 TcEs 사이에서 계통발생적인 관계를 해결할 수 없다. 다음, 콘센서스 전이인자는 코돈(codons)내에서 선택된 뉴클레오티드를 변경함에 의해 조작되었으며, 이는 그러한 위치에 있음직한 아미노산을 회복시키기 위함이다. 상기 방법은 주어진 위치에서 가장 일반적인 아미노산은 상기 위치에 최초 존재하던 (활성)아미노산임을 가정한다. 상기 콘센서스 서열은, C → T 변이가 고정되고,5mC 잔기의 탈아미노화(deamination)가 발생했음직한 위치에서 조사되었다(이는 C 가 T로 전환되도록 하며, 잘못 일치된 G 잔기를 A 로 " 수선 " 할 수 있도록 한다). 상기 예에서, " 다수-규칙(majority-rule) " 콘센서스 서열이 항상 사용된 것은 아니다. 다음 상기 조작의 정확성을 확인하기 위해 소생된 전이효소의 다양한 예기되는 활성이 시험되었다.
본원에 상술된 아미노산 잔기는 단일문자 아미노산 명명 또는 3 문자 약칭을 사용한다. 여기서 사용되는 약칭은 표준 폴리펩티드 명명법에 따른다, J. Biol. Chem., (1969), 243, 3552-3559. 여기서 모든 아미노산 서열은 아미노-말단에서 카르복시-말단의 방향에서 좌선 및 우선의 형식으로 나타낸다.
비록 본 발명의 전이효소를 암호화하는 특정 아미노산 서열이 기술되었으나, SB 활성을 변경함이 없이 SB 단백질의 서열로 만들어질 수 있는 다양한 보존적인 변화가 있다. 이러한 변화를 보존적인 변이라고 하며, 즉 특정 크기 또는 특성을 갖는 아미노산 군에 속하는 아미노산은, 예를들어 특히 촉매활성 또는 DNA 결합활성과 관련되지 않는 단백질 영역에서 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. SB 단백질의 다른 아미노산 서열은 활성 또는 결합특성을 현저하게 변경하지 않는 보존적인 변화를 함유하는 아미노산 서열을 포함한다. 아미노산 서열에 대한 치환체는 상기 아미노산이 속하는 류(class)의 다른 일원으로부터 선택될 수 있다. 예를들어, 비극성(hydrophobic) 아미노산은 알라닌(alanine), 루이신(leucine), 이소루이신(isoleucine), 발린(valine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalane), 트립토판(tryptophan) 및 티로신(tyrosine) 등을 포함한다. 극성의 중성 아미노산은 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cystein), 티로신(tyrosine), 아스파라긴(asparagine) 및 글루타민(glutamine) 을 포함한다. 양 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌(arginine), 리신(lysine) 및 히스티딘(histidine)을 포함한다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산(aspartic acid) 및 글루탐산(glutamic acid)을 포함한다. 상기와 같은 변경은 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔 전기영동 또는 등전점에 의해 결정되는 명확한 분자량에 본질적인 영향을 줄 것으로는 기대되지 않는다. 특히 바람직한 보존적인 치환은, 양전하를 유지하는 Arg의 Lys로의 치환 및 그 역; 음전하를 유지하는 Asp의 Glu로의 치환 및 그 역; 자유 -OH 기를 유지하는 Thr의 Ser으로의 치환; 및 자유 NH2를 유지하는 Asn 의 Gln 로의 치환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 SB 단백질은 세포내에서 촉매활성을 가지나, 상기 단백질은 세포내로 단백질 또는 핵산으로 도입될 수 있다. 상기 SB 단백질은 mRNA를 포함하는 리보핵산으로서; 에피소멀(episomal) DNA를 포함하는, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, 염색체외 DNA로서, 플라스미드 DNA로서, 또는 바이러스 핵산으로서 세포내에 도입될 수 있다. 또한, SB 단백질을 암호화하는 DNA는 세포의 게놈에 구조적인 또는 유도적인 발현을 위해 안정적으로 결합될 수 있다. SB 단백질이 핵산으로 세포내에 도입되면, 서열을 암호화하는 상기 SB 는 프로모터에 작동적으로 결합된다. 다양한 종류의 프로모터가 있으며, 이는 구조 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 유도 프로모터 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 프로모터는 세포내에서 RNA 폴리머라제에 결합하여 서열을 다운스트림(downstream)(3' 방향)으로 암호화하는 전사(transcription)를 개시하도록 하는 조절신호(regulatory signals)이다. DNA 서열은 프로모터와 같은 발현 조절서열에 작동적으로 결합할 수 있으며, 이때 상기 발현 조절서열은 DNA 서열의 전사 및 번역(translation)을 조절(control) 및 조정(regulate)한다. 상기 " 작동적으로 결합된 " 이라는 용어는 발현될 DNA 서열앞에 적절한 출발신호(예컨데, ATG)를 가지는 것과 원하는 단백질 제품의 제조를 위해 발현 조절서열의 조절하에서 DNA 서열의 발현을 허용하는 올바른 해독틀을 유지하는 것을 포함한다.
SB 단백질을 암호화하는 하나의 핵산 서열은 서열번호:3으로 제공된다. 또한 SB-암호화 핵산 서열을 필수적으로 변경하는 상기한 보존적인 변경외에, SB 단백질을 암호화하고 SB 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는 다른 DNA 또는 RNA 서열이 있으나, 이는 특정 아미노산을 지정하는데 사용되는 3 문자 코돈의 변성을 이용한다. 예를들어, 다음의 RNA 코돈(및 따라서, 대응하는 DNA 코돈, U가 T로 치환된)이 각각의 특정 아미노산을 암호화하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다는 사실이 당업계에 잘 알려져있다:
페닐알라닌(Phenylalanine(Phe 또는 F)) UUU 또는 UUC
루이신(Leucine(Leu 또는 L)) UUA, UUG, CUU, CUC, CUA또는 CUG
이소루이신(Isoleucine(Ile 또는 I)) AUU, AUC 또는 AUA
메티오닌(Methionine(Met 또는 M)) AUG
발린(Valine(Val 또는 V)) GUU, GUC, GUA, GUG
세린(Serine(Ser 또는 S)) UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
프로린(Proline(Pro 또는 P)) CCU, CCC, CCA, CCG
트레오닌(Threonine(Thr 또는 T)) ACU, ACC, ACA, ACG
알라닌(Alanine(Ala 또는 A)) GCU, GCG, GCA, GCC
티로신(Tyrosine(Tyr 또는 Y)) UAU 또는 UAC
히스티딘(Histidine(His 또는 H)) CAU 또는 CAC
글루타민(Glutamine(Gln 또는 Q)) CAA 또는 CAG
아스파라긴(Asparagine(Asn 또는 N)) AAU 또는 AAC
리신(Lysine(Lys 또는 K)) AAA 또는 AAG
아스파르트산(Aspartic Acid(Asp또는 D)) GAU 또는 GAC
글루탐산(Glutamic Acid(Glu 또는 E)) GAA 또는 GAG
시스테인(Cysteine(Cys 또는 C)) UGU 또는 UGC
아르기닌(Arginine(Arg 또는 R)) CGU, CGC, CGA,CGG, AGA, AGC
글리신(Glycine(Gly 또는 G)) GGU 또는 GGC 또는 GGA 또는 GGG
종료코돈(Termination codon) UAA, UAG 또는 UGA
또한, 특정 DNA 서열은 특정 세포형태에 바람직한 코돈을 사용하기 위해 변경될 수 있다. 예를들어, 동물 및 사람에서와 같이 E.coli 에 대해서도 바람직한 코돈 사용법이 알려졌다. 상기 변경은 당업자에게는 공지이며, 따라서 본 발명의 일부로서 고려된다.
또한, 본 발명에서 기대되는 것은 본 발명의 SB 단백질에 대한 항체이다. 본 발명의 목적을 위한 " 항체 "는 어떤 면역글로불린(immunogobulin)이며, 이는 SB 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 그 단편을 포함한다. 당해 기술분야에서 알려진 다양한 방법이 SB 단백질에 대한 폴리클로널(polyclonal) 또는 모노클로널(monoclonal) 항체의 제조에 사용될 수 있다. 예를들어, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, (1988).
상기 SB 단백질을 암호화하는 핵산이 플라스미드, 또는 유전자 발현 벡터와 같은 핵산 벡터, 또는 바이러스 벡터로서 세포내로 도입될 수 있다. 상기 핵산은 환형 또는 선형일 수 있다. DNA 및 단백질을 조작하는 방법은 당해 기술분야에서 공지이며, Sambrook et al.,(1989) Molecular cloning: A laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel, R.M., ed.(1994). Current Protocols in Molecular Biology 에 상세하게 기술되어 있다. 본원에서 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 코스미드(cosmid)를 의미하며, 이는 본 발명에 의한 SB 단백질을 유전자 이식하는 핵산 또는 핵산 단편에 결합할 수 있다. 상기 " 암호화 서열(coding sequense) " 또는 " 오픈 리딩 프레임 "은 핵산 영역을 의미하며, 이는 적절한 조절서열의 조절하에 놓이면 생체내에서 폴리펩타이드로 전사 및/또는 번역될 수 있다.
본 발명의 또 다른 면은 핵산 단편에 관련되고, 이는 때때로 전이인자(transposon) 또는 전이인자 성분(transposon element)으로 언급되며, 적어도 두개의 역위 반복부 사이에 위치한다. 바람직하게는 각각의 역위 반복부(inverted repeat)는 적어도 하나의 정반복부(direct repeat)를 포함한다(이하, IR/DR). 상기 전이인자 성분은 선형의 핵산단편(알려진 바와 같이, 5' 말단에서 3' 말단으로 확장된)이며, 선형 단편 또는 환형으로, 예를들어 플라스미드에서 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 각각의 역위 반복부 서열에는 두개의 정반복부가 있다. SB 에 결합하는 바람직한 정반복부는 다음을 포함한다:
5' 외부 반복부:(서열번호:6)
5'-GTTCAAGTCGGAAGTTTACATACACTTAG-3'
5' 내부 반복부:(서열번호:7)
5'-CAGTGGGTCAGAAGTTTACATACACTAAGG-3'
3' 내부 반복부(서열번호:8)
5'-CAGTGGGTCAGAAGTTAACATACACTCAATT-3'
3' 외부 반복부(서열번호:9)
5'-AGTTGAATCGGAAGTTTACATACACCTTAG-3'
바람직한 콘센서스 정반복부 서열은 다음과 같다(서열번호:10)
5'-CA(GT)TG(AG)GTC(AG)GAAGTTTACATACACTTAAG-3'
한 실시예에서, 정반복부 서열은 적어도 다음의 서열을 포함한다:
ACATACAC(서열번호: 11)
본 발명에 의한 바람직한 역위 반복부 서열은 서열번호:4 이다.
5'-AGTTGAAGTC GGAAGTTTAC ATACACTTAA GTTGGAGTCA
TTAAAACTCG TTTTTCAACT ACACCACAAA TTTCTTGTTA
ACAAACAATA GTTTTGGCAA GTCAGTTAGG ACATCTACTT
TATGCATGAC ACAAGTCATT TTTCCAACAA TTGTTTACAG
ACAGATTATT TCACTTATAA TTCACTGTAT CACAATTCCA
GTGGGTCAGA AGTTTACATA CACTAA-3'
본 발명의 두번째 역위 반복부 서열은 서열번호:5 이다.
5'-TTGAGTGTAT GTTAACTTCT GACCCACTGG GAATGTGATG
AAAGAAATAA AGCTGAAAT GAATCATTCT CTCTACTATT
ATTCTGATAT TTCACATTCT TAAAATAAAG TGGTGATCCT
AACTGACCTT AAGACAGGGA ATCTTTACTC GGATTAAATG
TCAGGAATTG TGAAAAAGTG AGTTTAAATG TATTTGGCTA
AGGTGTATGT AAACTTCCGA CTTCAACTG-3'
바람직하게는 상기 정반복부는 세포내로 핵산 단편의 삽입 및 결합을 허용하도록 SB 단백질에 결합하는 역위 반복부의 부분이다. SB 단백질에 대한 DNA 삽입의 위치는 TA 염기쌍(도 7b 참조)에서 발생한다..
상기 역위 반복부는 세포 DNA로 삽입되는 핵산 서열에 인접한다. 상기 핵산 서열은 유전자의 오픈 리딩 프레임의 전부 또는 일부(즉, 단백질을 암호화하는 유전자의 전부 또는 일부), 하나 이상의 발현 조절서열(즉, 핵산의 조절부위)을 단독으로 또는 오픈 리딩 프레임의 전부 또는 일부와 함께 포함할 수 있다. 바람직한 발현조절 서열은 인핸서(enhancer), 경계 조절인자(border control elements), 유전자좌-조절영역(locus-control regions) 또는 사일렌서(silencer)를 포함하며, 이에 제한도는 것은 아니다. 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 서열은 오픈 리딩 프레임의 적어도 한 부분에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함한다.
실시예에서 제시되는 것과 같이, SB 단백질에 결합할 수 있는 적어도 두개의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하고, 세포내의 DNA에 삽입될 수 있는 본 발명에 의한 핵산 단편의 조합은, SB 단백질(또는 세포에 SB 단백질을 전달하도록 SB 단백질을 암호화하는 핵산)과 조합하여 상기 핵산 서열이 세포내로 삽입되게 한다. 또한, 본 발명의 핵산 단편은 아직 밝혀지지는 않았으나 재생산이 가능한 다양한 기작을 통해 세포내의 DNA 에 결합될 수 있다. 양자의 모두에 있어서, 상기 핵산 단편은 유전자 전달에 사용될 수 있다.
상기 예에서 상술한 바와 같이, 단백질중 SB 계열은, 다양한 세포 형태 및 다양한 종에서 결합을 중재한다. 상기 SB 단백질은 역위 반복부를 지닌 본 발명에 의한 핵산 단편이 분화다능세포(즉, 그 자손이 조혈 간세포 및 기타 간세포와 같은 수개의 제한된 세포 형태로만 분화할 수 있는 세포) 및 분화전능세포(즉, 그 자손이 유기체에서 어떠한 세포형태로도 가능한 세포, 예를들어 배아 간세포(embryonic stem cells)로 결합할 수 있도록 한다. 본 발명에 의한 유전자 전달 시스템은 동물세포, 박테리아, 곰팡이(예를들어, 효모) 또는 식물 등을 포함하는 다양한 종류의 세포에 사용될 수 있다. 동물 세포는 척추동물 또는 무척추 동물일 수 있다. 난모세포(oocytes), 난세포(eggs) 및 하나 이상의 배아세포(embryo)가 또한 본 발명에서 고려된다. 다양한 기관 또는 조직으로부터의 성숙한 세포는 본 발명에 의한 핵산 단편을 분리하여, 단독으로 또는 SB 단백질 또는 SB 단백질을 암호화하는 핵산과 함께 수용할 수 있다. 핵산 단편 또는 SB 단백질을 수용하고, 상기 핵산 단편을 세포내의 DNA로 수용할 수 있는 세포는 임파세포(lymphocytes), 간세포(hepatocytes), 신경세포(neural cells), 근육세포(muscle cells), 다양한 혈액세포, 및 다양한 유기체의 세포를 포함한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 실시예 4는 특정 세포가 본 발명의 유전자 전달에 따를 수 있는지 여부를 결정하는 시험이다. 세포는 척추동물 또는 무척추동물로부터 얻을 수 있다. 바람직한 무척추동물은 새우(shrimp), 가리비(scllop), 바닷가재(lobster), 조개(clams) 또는 굴(oyster) 갑각류 또는 연체류 동물을 포함한다.
또한, 척추동물의 세포는 SB 단백질의 존재하에서 본 발명의 핵산 단편을 결합한다. 쥐 또는 마우스와 같은 설치류, 소 또는 염소와 같은 유제류 동물, 양, 돼지를 포함하는 포유류의 세포 또는 인간의 세포와 마찬가지로, 어류, 조류 및 기타 동물로부터 얻은 세포가 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 핵산 단편의 수용체로서 작용하는 상기 세포의 DNA는 SB 단백질의 존재하에서 본 발명의 핵산 단편과 접촉하는 어떠한 DNA 든지 포함한다. 예를들어, 상기 DNA 는 세포 게놈의 일부일 수 있고, 에피솜(episome), 플라스미드, 선형 또는 환형의 DNA 단편과 같은 염색체외(extrachromosomal)일 수도 있다. 결합의 표적은 이중-가닥 DNA 이다.
적어도 두개의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명에 의한 핵산 단편의 조합은 DNA 를 세포의 DNA로 도입하기 위한 유전자 전달 시스템으로서 유용하다. 여기서 상기 역위 반복부는 SB 단백질에 결합할 수 있으며, 상기 핵산 단편은 전이효소 또는 전이효소를 암호화하는 핵산과 조합하여 세포의 DNA에 결합할 수 있으며, 여기에서 상기 전이효소는 서열번호:1과 80% 상동인 아미노산 서열을 함유하는 SB 단백질을 포함하는 SB 단백질이다. 바람직한 실시예에서, 상기 SB 단백질은 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하며, 다른 바람직한 실시예에서 전이효소를 암호화하는 상기 DNA는 하기의 교잡(hybridization) 조건에서 서열번호:3의 DNA에 교잡할 수 있다: 42℃에서 7시간 동안의 0.1%(w/v) SDS, 0.5xSSC에서 30%(v/v)의 포름아미드(formamide).
유전자 치료에 있어서, 유전자 전달 벡터는 바이러스 벡터와 비-바이러스 벡터로 분류될 수 있다. SB 단백질과 조합하여 전이인자로서 본 발명인 핵산 단편의 사용은 비-바이러스 DNA-중재 유전자 전달을 정밀화한 것이다. 현재까지, 바이러스벡터가 유전자의 도입 및 발현에 있어서 보다 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 새로운 유전자 치료의 개발에 있어서, 비-바이러스 유전자 전달이 바이러스 중재 유전자 전달보다 우월한데에는 몇가지 이유가 있다. 예를들어, 유전자 치료제로서 바이러스를 선택하는 것은 바이러스 게놈에 따른 유전적 고안을 크기, 구조 및 발현의 조절에 있어서 제한한다. 비-바이러스 벡터는 대체로 합성 출발물질로부터 생성되며 따라서 바이러스 벡터보다 쉽게 제조된다. 비-바이러스 시약은 바이러스 시약보다 보다 덜 면역원성이며, 이는 반복투여를 가능하게한다. 비-바이러스 벡터가 바이러스 벡터에 비해 보다 안정적이며, 따라서 약제학적인 제형 및 적용에 바이러스 벡터보다 적합하다.
현재의 비-바이러스 유전자 전달 시스템은 숙주의 염색체를 포함하는 세포 DNA로 핵산의 삽입을 증진시킬 수 있을 정도로 갖추어지지는 않았다. 따라서, 비-바이러스 시스템을 사용하는 안정적인 유전자 전달 빈도는 매우 낮았다; 조직 배양 세포에서 최대 0.1% 이며, 일차 세포 및 조직에서는 훨씬 적다. 본 시스템은 삽입을 가능하게하고, 안정적인 유전자 전달의 빈도를 현저하게 개선하였다.
본 발명의 유전자 전달 시스템에 있어서, SB 단백질은 단백질을 암호화하는 핵산 또는 단백질으로서 세포내로 도입될 수 있다. 한 실시예에서, 단백질을 암호화하는 핵산은 RNA 이며 또 다른 실시예에서는 DNA이다. 또한, SB 단백질을 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터, 양이온성 지질 또는 진핵세포에 사용되는 입자충격(particle bombardment) 또는 일렉트로포레이숀(eletrporation)을 포함하는 표준 트랜스팩션 (transfaction) 기작을 통하여 세포내로 결합될 수 있다. SB 를 암호화하는 핵산의 도입에 이어서, 본 발명의 상기 핵산 단편이 동일한 세포에 도입될 수 있다.
유사하게, 상기 핵산 단편은 선형 단편 또는 환형 단편으로 세포에 도입될 수 있으며, 바람직하기로는 플라스미드 또는 재조합 바이러스 DNA 로서 도입된다. 바람직하게는 상기 핵산 서열은 적어도 한 부분의 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 아미노산 함유물을 제조한다. 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 서열은 적어도 하나의 단백질을 암호화하며, 오픈 리딩 프레임 또는 상기 핵산 서열의 암호화 부위의 직접적인 발현을 위해 선택된 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. 상기 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질은 당해 기술분야에서 신규하거나 공지의 다양한 재조합 DNA의 어느 하나이다. 한 실시예에서 상기 핵산 서열에 의해 임호화된 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase)(CAT), 성장호르몬(growth horomons), 예를들어 유전자 이식 동물에서 성장을 증진시키기 위한 β-갈락토시다제(β-galactosidase)(lacZ), 루시퍼라제(luciferase)(LUC) 및 인슐린-유사(insulin-like) 성장인자(IGFs)와 같은 표식단백질(marker protein) 이다.
유전자 이식 동물의 한 실시예에서, 상기 단백질은 세포로부터 동정을 위한 제조물이다. 생물반응기(bioreactor)로서 유전자 이식 동물이 알려졌다. 단백질은 밀크(milk), 뇨(urine), 혈액 및 난세포(eggs)에서 제조되었다. 밀크(milk), 뇨(urine), 혈액 및 난세포(eggs)에서 발현을 증진시키는 프로모터가 알려졌으며, 이는각각 카제인(casein) 프로모터, 마우스 뇨중 단백질(urinary protein) 프로모터, β-글로빈 프로모터 및 오브알부민(ovalbumin)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 재조합 성장호르몬, 재조합 인슐린 및 다른 다양한 재조합 단백질이 제조되었으며, 세포내의 단백질을 제조하기 위한 다른 방법을 사용하였다. 이들 또는 다른 단백질을 유전자 이식하는 핵산이 본 발명의 핵산 단편에 결합되고, 세포내로 도입될 수 있다. 세포의 DNA로 상기 핵산 단편의 효율적인 결합은 SB 단백질이 존재할 때 발생하였다. 상기 세포가 조직의 일부 또는 유전자 이식 동물의 일부이면, 다량의 재조합 단백질이 얻어질 수 있다. 연구 또는 단백질의 제조를 위하여 유전자 이식 동물을 제조하는 방법이 많이 있으며, 이는 (Hackett et al. (1993)). The molecular biology of transgenic fish. In Biocemistry and Molecular Biology of fishs(Hochachka ＆ Mommsen, eds) Vol.2, pp. 207-240 을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유전자 이식 동물을 제조하는 다른 방법으로는 M.Markkula et al., Rev. Reprod., 1, 97-106(1996); R.T.Wall et al., J. Dairy Sci., 80, 2213-2224(1997); J.C.Dalton. et. al., Adv. Exp. Med. Biol., 411, 419-428(1997); 및 H. Lubon et al., Transfus. Med. Rev., 10, 131-143(1996)을 포함한다. 실시예 6에 따라 유전자 이식된 제브라물고기가 제조되었다. 상기 시스템은 마우스 배아 간 세포(ES)에 표식(marker) 단백질과 함께 핵산을 도입하여 시험하였고, 상기 세포는 유전자 이식된 마우스의 제조에 사용될 수 있다(A. bradley et al., Nature, 309, 255-256(1984).
일반적으로, 상업적으로 중요한 동물의 계통(stock)을 증가시키기 위한 두가지 방법이 있다. 첫번째로 육상동물에 잘 적용되는 고전적인 양육이 있으나, 이는 주요한 변화를 만드는데 수십년이 걸린다. Hackett et al.(1997)에 의한 고찰은 조절된 양식으로 코호 연어(coho salmon)(Oncorhynchus kisutch)의 성장률이 4세대 동안 60% 증가하였으며, 2 무리의 채널 메기(chennel catfish)(Ictalurus punctatus)의 체중이 3 세대 동안 21% 내지 29% 증가하였음을 보고하였다. 두번째 방법은 유전공학, 선택된 경로서, 이에 따라 유전자가 동물 또는 식물의 염색체에 도입되며 상기 유기체에 향상된 성장 또는 휠씬 강화된 질병에 대한 저항성 같은 새로운 형질 또는 특성을 부여한다. 상기 유전공학의 결과는 몇몇 경우에 양육의 성과를 능가한다. 1 세대내에, 과량의 무지개 송어 성장호르몬 Ⅰ 유전자를 사용하여 일반 잉어(common carp)(Cyprinus carpino)의 체중을 58% 증가시키고, 과량의 연어 성장호르몬 유전자로 연어의 중량을 1000% 이상 증가시켰다. 어류에서 유전공학을 이용하는 장점은, 예를들어, 적절한 유전자만 동정된다면 유기체는 매우 짧은 시간동안에 직접 변경될 수 있다는 것이다(Hackrtt,1997 참조). 어류에서 유전공학의 단점은 성장과 개발에 관련된 많은 유전자들 중에 동정된 것이 거의 없다는 것이며, 그들의 단백질 제조물의 상호작용이 거의 밝혀지지 않았다는 것이다. 유전자 조작의 방법은 경제적으로 중요한 많은 동물을 결핍하고 있다. 본 발명은 삽입 변이(유전자 태깅)(gene tagging)를 수행하기 위한 효과적인 시스템 및 유전자 이식 동물의 제조를 위한 효과적인 방법을 제공한다. 본 발명 이전에, 유전자 이식 DNA는 염색체에 효과적으로 결합되지 못했다. 외래 DNA 분자의 백만개중 하나만이 세포의 게놈에 삽입하였으며, 수개의 분할 주기가 발육에 결합되었다. 따라서, 대부분의 유전자 이식 동물은 모자이크(mosaic)(Hackett, 1993) 이다. 그 결과, 유전자 이식 DNA가 전달된 배아로부터 양육된 동물은 결합된 외래 DNA 의 존재에 대해 생식체(gemetes)가 분석될 수 있을 때가지 배양되어야 한다. 많은 유전자 이식 동물이 위치효과(position effects) 때문에 전이유전자를 발현하지 못한다. 외래 DNA가 일찌기 단세포 단계의 동물 염색체에 결합하도록하는 단순하고, 신뢰할 만한 방법이 필요하다. 본 시스템은 이러한 필요를 충족한다.
본 발명의 전이인자 시스템은 생물공학의 많은 부분에 적용할 수 있다. 동물에서 벡터에 대한 전이성 인자(transposable elements)의 개발은 다음과 같다: 1) 본 명세서에 제시된 방법을 사용하여 동물 염색체로 효과적인 유전물질의 삽입. 2) 전이인자를 삽입 변이 유발제(mutagens)로서 사용하므로써 동정, 분리 및 성장과 발육에 관련된 유전자의 특성화(Kaiser et al., 1995, " Eukaryotic transposable elements as tools to study gene structure and function " In Mobile Genetic Elements, IRL Press, pp.69-199). 3) 동정, 분리 및 성장과 발육을 조절하는 전사 조절서열의 특성화. 4) 양적 형질 유전자좌(QTL) 분석을 위한 표식구조의 사용. 5) 성장 및 발육외에 경제적으로 중요한 특질의 유전자 좌위의 동정, 즉 질병에 대한 저항성(예를들어, Anderson et al., 1996, Mol. Mar.biol. Biotech., 5, 105-113). 한 실시예에서, 본 발명의 상기 시스템은 무균의 유전자 이식 물고기의 제조에 사용될 수 있다. 비활성 유전자를 지닌 한 배(broodstock)의 원종은 수중 양식된 물고기에서 생물학적인 억제 또는 성장률의 최대화를 위한 무균의 자손을 생성하도록 짝지워질 수 있다.
본 발명의 유전자 전달 시스템의 또 다른 용도에 있있어서, 상기 핵산 단편은 변형되어 유전자에 결합하고, 세포에 대한 유전자 치료를 제공한다. 상기 유전자는 조직 특이적 프로모터 또는 보편적인 프로모터 또는 상기 유전자를 필요로 하는 세포에서 유전자의 발현을 위한 하나 이상의 발현 조절부위의 조절하에 놓여진다. 다양한 유전자가 낭성섬유증(cystic fibrosis)에 대한 CFTR 유전자, 면역체계 혼란에 대한 아데노신 디아미나제(sdenosine deaminase)(ADA), 혈액세포질환에 대한 인자 Ⅳ 및 인터류킨-2(interleukin)(IL-2), 폐질환에 대한 알파-1-안티트립신(alpha-1-antitrypsin) 및 암 치료를 위한 종양괴사인자(TNFs) 및 복합 약제 내성(MDR) 단백질 포함하는 다양한 유전자 치료를 위해 시험된다.
이들 표식 단백질 및 다양한 재조합 단백질을 암호화하기 위한 유전자 서열을 포함하는 인간 또는 동물의 다양한 특이적 유전자 서열은 GenBank 등과 같은 알려진 유전자 데이타베이스에서 유용하다.
또한, 본 발명에 의한 유전자 전달 시스템은 재조합 서열의 라이브러리를 대상으로 작업하거나 스크린하는 방법의 일부로서 사용될 수 있다. 예를들어, 서열의 기능을 평가하거나 또는 단백질발현을 위한 스크리닝을 하거나, 또는 특정 단백질 또는 특정 세포형의 특정 발현조절영역의 효과를 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 실시예에서, 재조합 서열의 라이브러리는, 예컨데 그 기술이 이미 공지이고 본 발명의 목적도 아닌 조합 라이브러리 또는 유전자 셔플링(shuffling)의 생성물이며, 본 발명의 핵산 단편에 결합하여 일정한(constant) 역위 반복서열 사이에 위치하는 다양한 핵산 서열을 지닌 핵산 단편의 라이브러리를 생산할 수 있다. 다음 상기 라이브러리는 상기 논한 바와 같이 SB 단백질과 함께 세포내로 도입된다.
본 시스템의 장점은 역위 반복부 사이에 위치하고 삽입되는 핵산 서열의 크기에 의해 크게 제한되지 않는다는 것이다. SB 단백질은 1.3 킬로베이스(kb) 내지 약 5.0 kb 범위의 전이인자을 결합하는데 사용되었고, 마리너(mariner) 전이효소는 전이인자을 약 13kb까지 이동시켰다. SB 단백질을 이용하여 세포의 DNA로 결합될 수 있는 핵산 서열의 크기에 대해 알려진 한계는 없다.
오히려, 제한이되는 것은 본 발명의 유전자 전달 시스템이 세포내로 도입될 수 있게 하는 방법이다. 예를들어, 미세주입이 사용되면, 본 발명의 핵산 단편의 삽입서열의 크기에 대한 제약은 거의 없다. 유사하게, 지질중재 방법은 본질적으로 크기 제한이 없다. 그러나, 본 발명에 따르는 유전자 전달 시스템을 세포에 도입하기 위한 다른 방법, 예컨데 바이러스 중재 방법은 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열의 길이를 제한할 수 있다.
상기 두 요소의 SB 전이인자 시스템은 바이러스를 경유하여 세포에 전달될 수 있으며, 리트로바이러스(렌티바이러스(lentivirus)를 포함), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus), 헤르페스 바이러스(herpesvirus) 등을 포함한다. 역위 말단 반복부(IRs)와 전이효소를 암호화하는 유전자에 인접하는 관심있는 전이유전자를 함유하는 전이인자 부위에 대한 전달기작 및 전이효소를 유전자 이식하는 유전자의 몇몇의 잠재적인 조합이 있다. 예를들어, 전이인자 및 전이효소 유전자는 동일한 재조합 바이러스 게놈에 함유될 수 있으며; 단 한차례의 감염이 전이효소를 발현과 같은 SB 시스템의 양 요소를 전달하며, 다음 세포 염색체로의 삽입을 위해 재조합된 바이러스 게놈으로부터 전이인자를 절단한다. 또 다른 실시예에서, 상기 전이효소 및 전이인자은 지질-함유 시약과 같은 바이러스 및/또는 비-바이러스 시스템의 조합에 의해 각각 전달될 수 있다. 상기와 같은 경우에, 전이인자 및/또는 전이효소 유전자는 재조합 바이러스에 의해 전달될 수 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 발현된 전이효소 유전자는 염색체 DNA로의 결합을 위해 전이인자가 그 운반 DNA(바이러스 게놈)로부터 이탈하도록 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 사용하는 방법에 관련된다. 한 방법에서, 본 발명은 적어도 두 개의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 단편의 도입에 관련된다. 바람직한 실시예에서, 세포의 DNA 로의 핵산 단편의 효과적인 결합은 세포가 SB 단백질을 함유할 때 발생한다. 상기한 바와 같이, SB 단백질은 SB 단백질으로서 또는 SB 단백질을 암호화하는 핵산으로서 도입될 수 있다. SB 단백질을 암호화하는 핵산은 RNA 또는 DNA 일 수 있다. 상기 단백질은 세포에 단독으로 또는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터로 도입될 수 있다. 또한, 상기 SB 단백질을 암호화하는 핵산은 안정적으로 또는 일시적으로 세포의 게놈에 결합되어 세포에서 SB 단백질의 일시적 또는 연장된 발현이 가능하도록 할 수 있다. 또한, 프로모터 또는 다른 발현 조절영역은 SB 단백질을 암호화하는 핵산과 작동적으로 결합될 수 있으며, 이는 단백질의 발현을 양적으로 또는 조직-특이적 방법으로 조절한다. 상기한 바와 같이, 상기 SB 단백질은 SB 단백질 계열중 하나이며, 바람직하게는 서열번호:1에 적어도 80%의 아미노산 서열 상동 및 보다 바람직하게는 서열번호:1에 대해 90%의 아미노산 서열 상동을 갖는다. 또한, 상기 SB 단백질은 DNA-결합부위, 촉매부위(전이효소 활성을 갖는) 및 NLS 신호를 함유한다.
본 발명에 의한 상기 핵산 단편은, 예를들어, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, 미세주입, 핵산 단편의 양이온성 지질 운반체와 같은 지질 운반체와의 결합, 입자 포격, 일렉트로포레이숀, DNA 접합시약(condensing reagents)(예를들어, 칼슘인산염(calcium phosphate), 폴리리신(polylysine) 또는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine))과 같은 공지의 다양한 기술을 사용하여 도입되거나, 또는 핵산 단편을 바이러스 벡터로 결합하며, 상기 바이러스 벡터를 세포와 접촉시킨다. 바이러스 벡터가 사용되는 경우에는, 상기 바이러스 벡터는 리트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 바이러스 벡터를 포함하는 공지의 다양한 바이러스 벡터중 어떠한 것도 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 유전자 전달 시스템은 특정 표식인자(marker)를 수반하거나 또는 하나 이상의 동물세포에서 특정 유전자를 발현하는 유전자 이식 동물의 제조에 사용될 수 있다. 유전자 이식 동물의 제조방법은 공지이며, 본 발명에 의한 유전자 전달 시스템의 기술에 대한 결합은 과도한 시험을 요구하지 않는다. 하기 제시되는 실시예는 어류의 배아세포에 유전자 전달 시스템을 미세주입하여 유전자 이식 어류를 제조하는 방법을 제시한다. 나아가, 상기 실시예는 또한 마우스 배아 간 세포(stem cell)로 유전자 전달 시스템을 도입하는 방법을 기술한다. 배아 간 세포(stem cell)로부터 유전자 이식 마우스를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 또한, 낙농 동물의 밀크(milk)에서 생물약제학적 단백질의 제조(Young et al., BIO PHARM(1997), 10, 34-38)에 대한 고찰 및 제공된 참고자료는 밀크에서 재조합 단백질을 제조하는 방법 및 전략을 상술한다. 상기 방법 및 본 발명의 유전자 전달 시스템은 상기 유전자 이식 기술에 대해 공지기술과 특히 본원의 내용에 비추어 과도한 시험없이 용이하게 결합될 수 있다.
SB 단백질 또는 SB 단백질을 암호화하는 핵산과 조합하는 본 발명의 상기 핵산 단편은, 세포내의 DNA로 핵산을 도입하는 방법으로서, 유전자 이식 동물의 제조, 생식계(germline) 형질전환(transformation), 삽입변이 및 다양한 종에서 유전자 태깅(tagging)에 대한 강력한 도구이다. 도 9는 두가지 방법의 개략도이다.
게놈내에서 또는 게놈사이에서 하나의 염색체 좌위로부터 다른 좌위로 이동하는 고유한 능력 때문에, 전이성 인자는 몇몇 유기체에서 유전자 조작을 위한 벡터로 사용되었다. 전이인자 태깅은 전이인자가 유전자로 " 도약(hop) "하여 이동되는 것이며, 그에따른 삽입변이로 유전자를 비활성화시키는 것이다. 상기 방법은 Evans et al., TIG 1997 13,370-374 에서 논의 되었다. 상기 방법에 있어서, 상기 비활성된 유전자는 변이된 대립유전자(allele)를 회수하는데 사용될 수 있는 전이성 인자에 의해 " 태그 " 된다. 유전자의 서열정보를 얻기 위한 인간 및 다른 게놈 사업이 과학자가 새로운 유전자에 대해 생물학적인 기능을 부여하는 능력을 능가하였다. 따라서, 본 발명은 태그를 세포의 게놈으로 도입하는 효과적인 방법을 제공한다. 태그가 특정 표현형과 관련된 단백질의 발현을 중단시키는 세포내 좌위로 삽입되면, 본 발명의 핵산을 함유하는 세포에서 변경된 표현형의 발현은 본 발명의 핵산 단편에 의해 중단된 특정 유전자와 특정 표현형의 관련을 허용한다. 여기서 상기 핵산 단편은 태그로서 기능한다. 본 발명의 핵산 단편에 인접하는 게놈 DNA를 배열하도록 고안된 프라이머(primers)는 중단된 유전자에 관한 서열정보를 얻기 위하여 사용될 수 있다.
상기 핵산 단편은 또한 유전자 발견에 사용될 수 있다. 한 실시예에서, SB 단백질 또는 SB 단백질을 암호화하는 핵산과 조합하는 핵산 단편이 세포에 도입된다. 상기 핵산 단편은 바람직하게는 적어도 두개의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 상기 역위 반복부는 SB 단백질에 결합하고, 여기서 상기 핵산 단편은 SB 단백질의 존재하에 세포의 DNA에 결합한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 핵산 서열은, 예컨데 GEP 같은 표식 단백질 및 제한 엔도뉴클레아제 인식부위, 바람직하게는 6-염기 인식서열을 포함한다. 결합 후에, 상기 세포 DNA는 분리되고 제한 엔도뉴클레아제로 소화된다. 6-염기 인식서열을 사용하는 제한 엔도뉴클레아제가 사용되면, 상기 세포 DNA는 평균 약 4000-bp 단편으로 절단된다. 상기 단편은 복제되거나(cloned), 또는 연결자(linker)가 소화된 단편에 결합하여 PCR 프라이머에 대한 상보적인 서열을 제공할 수 있다. 연결자가 더해지면, PCR 반응이 단편을 증폭하기 위해 사용되고, 이때 연결자 및 핵산 단편의 역위 반복부의 정반복부에 결합하는 프라이머로부터 프라이머를 이용한다. 다음 증폭된 단편은 배열되고, 상기 정반복부에 인접하는 DNA는 GenBank 와 같은 컴퓨터 데이타베이스를 검색하는데 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명은 세포에서 핵산 서열을 이동시키는 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 본 발명의 핵산 단편은 상기한 바와 같이 세포내 DNA에 결합된다. 추가적인 SB 단백질 또는 SB 단백질을 암호화하는 핵산이 세포에 도입되며 상기 단백질은 핵산 단편을 세포 DNA의 최초 좌위에서 세포 DNA 내의 두번째 좌위로 이동시킬 수 있다. 상기 세포 DNA는 게놈 DNA 또는 염색체외 DNA 일 수 있다. 상기 방법은 핵산 단편이 게놈의 한 좌위에서 게놈의 다른 좌위로 이동하는 것, 또는 예를들어, 세포 플라스미드에서 상기 세포의 게놈으로 이동하는 것을 허용한다.
본원에서 인용하는 모든 참고자료, 특허 및 간행물은 본원에 참고로 반영된다. 본 발명의 실시예는 상세하게 논의될 것이며, 참고는 본 발명이 포함하는 범위내에서 가능한 변형으로 만들어졌다. 당업자가 이용할 수 있는 다양한 선택적인
기술 및 절차가 제시되어 있으며 이는 본 발명의 성공적인 수행을 허용한다.
발명의 요약
본 발명자들은 척추동물에서 게놈의 조작을 위한 DNA-기초 전이인자 시스템을 개발하였다. Tc1/mariner 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 전이인자는 다른 척추동물은 물론, 경골어의 게놈의 잘 알려진 성분이다. 그러나, 자연에서 분리한 모든 성분은 전위적으로 비활성이다. 분자 계통발생적인 자료가 전위(transposition)를 가능하게 하는 인식 위치를 가진 합성, 연어-형의 Tc1-유사 전이효소(SB) 계열을 동정하는데 사용되었다. 추정적인 전이효소 유전자의 콘센서스 서열(consensus sequence)은 8종의 어종(fish)으로부터 얻은 인자(element)중에서 연어 서브패밀리(subfamily)의 비활성 인자로부터 유도되고, 다음 상기 인자를 비활성으로 하는 변이를 제거하므로써 조작되었다. 하나의 전이효소가 제조되었으며, 완전한-길이(full-length)의 전이효소는 물론, 각각의 기능성 부위(domain)가 동정(identified)되고, 생화학적인 기능에 대해 시험되었다. 전이효소는 연어 인자의 역위 반복부(inverted repeats)내에 있는 2개의 결합부에 결합하고, 기질 특이적이며, 이는 물고기 인자중에서 밀접하게 관련된 서브패밀리(subfamily) 사이에 교차-이동(cross-mobilation)을 방지할 수 있다. SB 전이효소는 조작된 전이인자의 물고기 뿐만아니라 마우스 및 인간세포로의 염색체 삽입(chromosomal integration)을 현저히 증진시킨다. 전이효소에서의 특이적인 모티프(motif)에 더하여 표적 전이인자에서 특이적인 서열에 대한 요구는, 어류 및 포유동물의 세포 모두에서의 활성과 함께, SB 전이효소를 척추동물에서 생식계열 형질전환(germline transformation) 및 삽입변이에 대한 첫번째의 활성 DNA-전이인자 시스템으로 확립한다. 본 발명의 일면에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 핵산 단편에 관련한다: 적어도 2개의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열, 여기서 상기 역위 반복부는 SB 단백질에 결합할 수 있으며, 상기 핵산 단편은 세포내의 DNA로 삽입될 수 있다. 한 실시예에서, 핵산 단편은 플라스미드(plasmid)의 일부분이고, 바람직하게는 상기 핵산 서열은 적어도 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 일부를 포함하며, 또한 바람직하게는 적어도 하나의 유전자 발현조절 영역을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 발현 조절영역은 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer) 또는 사일렌서(silencer)로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 핵산 서열은 적어도 하나의 열린 번역 틀에 작동적으로(operably) 결합된 프로모터를 포함한다.
한 실시예에서, 세포는 무척추 또는 척추동물로부터 얻는다. 바람직한 무척추동물은 새우(shrimp), 가리비(scallop), 바닷가재(lobster), 조개(clam) 또는 굴(oyster)을 포함하는 갑각류 또는 연체류 동물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 척추동물의 시험예는 마우스(mice), 유제류 동물(ungulate), 양(sheep), 돼지(swine) 및 인간을 포함한다. 세포의 DNA는 세포의 게놈 또는 염색체외(extrachromosomal) DNA일 수 있으며, 에피솜(episome) 또는 플라스미드(plasmid)를 포함한다.
본 발명의 이러한 면에 대한 하나의 실시예에서, 적어도 하나의 역위 반복부는 서열번호:4 또는 서열번호:5 를 포함하며, 바람직하게는 SB 단백질의 아미노산 서열이 서열번호:1에 대해 적어도 80%의 아미노산 동일성(identity)을 갖는다. 또한 바람직하게는, 적어도 하나의 역위 반복부는 적어도 하나의 정반복부를 포함하며, 적어도 하나의 정반복부 서열은 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8 또는 서열번호:9 를 포함한다. 바람직한 정반복부는 서열번호:10 을 포함한다. 또한 바람직하게는 상기 핵산 단편은 서열번호:10 에 대해 적어도 80% 핵산 서열 동일성을 갖는 정 반복부를 포함한다.
본 발명의 또 다른 면에 있어서, 본 발명은 하기를 포함하는 세포의 DNA로 DNA를 도입하기 위한 유전자 전달 시스템과 관련된다: 적어도 2개의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 상기 역위 반복부는 SB 단백질에 결합할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 단편은 세포의 DNA에 삽입될 수 있는 핵산 단편; 및 전이효소 또는 전이효소를 암호화하는 핵산, 여기서 상기 전이효소는 서열번호:1에 대해 적어도 80 %의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 SB 단백질이다. 한 실시예에서, 상기 SB 단백질은 서열번호:1 을 포함한다. 또한, 상기 SB 단백질은 긴축 교잡조건(stringent hybridization conditions)에서 서열번호:1 에 교잡할 수 있는 DNA 에 의해 암호화된다. 한 실시예에서, 상기 전이효소는 단백질로서 세포내로 도입되고, 다른 실시예에서는 핵산으로서 세포내로 도입된다. 한 실시예에서 상기 핵산은 RNA이며, 또 다른 실시예에서 상기 핵산은 DNA이다. 또 다른 실시예에서 전이효소를 암호화하는 핵산은 세포의 게놈으로 삽입된다. 상기 핵산 단편은 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 일부일 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산 서열은 열린 해독 틀의 적어도 한 부분을 포함하며, 또한 바람직하게는 상기 핵산 서열은 적어도 하나의 유전자 조절영역을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 조절영역은 전사 조절영역이며, 상기 조절영역은 프로모터, 인핸서, 사일랜서, 유전자좌-조절(locus-control) 영역 및 보더인자(border elemet)로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 핵산 서열은 적어도 한 부분의 오픈 리딩 프레임에 작동적으로 결합된 프로모터를 포함한다.
본 발명의 이러한 면에서 사용되는 세포는 박테리아, 곰팡이(fungi), 식물, 동물을 포함하는 다양한 기원으로부터 얻을 수 있다. 한 실시예에서, 상기 세포는 동물로부터 얻는다; 척추동물 또는 무척추동물. 바람직한 무척추 동물은 갑각류(crustaceans) 또는 연체류 동물(mollusks)을 포함한다. 바람직한 척추동물은 어류, 조류 및 설치류(rodents), 유제류 동물(ungulats), 양, 돼지 및 인간을 포함한 동물을 포함한다.
핵산 단편을 수용하는 세포의 DNA는 세포의 게놈 또는 염색체외(extrachromosomal) DNA의 일부일 수 있다. 바람직하게는, 유전자 전달 시스템의 역위 반복부는 서열번호:4 또는 서열번호:5 를 포함한다. 또한, 바람직하게는 SB 단백질의 아미노산 서열은 서열번호:1 에 대해 적어도 80 %의 동일성을 갖고, 바람직하게는 적어도 하나의 역위 반복부는 적어도 하나의 정 반복부를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 정 반복부 서열은 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8 또는 서열번호:9 를 포함한다. 한 실시예에서, 상기 정 반복부는 서열번호:10의 콘센서스 서열을 갖는다. 특히 바람직한 실시예에 있어서, 상기 핵산 서열은 재조합 서열 라이브러리(library)의 일부이며, 핵산 서열은 다음으로 구성되는 방법중 선택되는 방법을 이용하여 세포내로 도입된다: 입자충격(particle bombardment), 일렉트로포레이숀(electroporation), 미세주입(microinjection), 핵산 단편과 지질함유 소포(vesicles) 또는 DNA 축합시약과 결합, 및 핵산 단편을 바이러스 벡터내로 삽입하고 바이러스 벡터를 세포와 접촉시킴.
본 발명의 또 다른 면에 있어서, 본 발명은 SB 단백질을 암호화하는 핵산과 관련되며, 여기서 핵산은 서열번호:1 을 포함하는 단백질 또는 서열번호:1에 대해 적어도 80 %의 동일성이 있는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화한다. 상기 SB 단백질을 암호화하는 핵산은 바이러스 벡터 또는 플라스미드와 같은 유전자 발현벡터와 같은 핵산 벡터에 결합될 수 있다. 상기 핵산은 환형 또는 선형일 수 있다. 본 발명은 또한 SB 단백질을 발현하는 세포와 관련된다.
한 실시예에 있어서, SB 단백질을 함유하는 세포가 무척추 또는 척추동물로부터 얻어진다. 바람직한 척추동물로는 어류, 조류, 포유류 등을 포함한다. 상기 세포는 난모세포(oocyte), 하나 이상의 배아세포 또는 난세포(egg)과 같은 분화다능(pluripotent) 및 분화전능(totipotent) 세포를 포함하는 다양한 조직으로부터 얻을 수 있다. 한 실시예에서, 상기 세포는 조직 또는 기관(organ)의 일부이다. 한 실시예에 있어서, SB 단백질을 암호화하는 핵산은 세포의 게놈내로 삽입된다.
본 발명은 또한 서열번호:1 의 아미노산을 포함하는 SB 단백질과 관련된다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 유전자 이식(transgenic) 동물의 제조방법과 관련된다: 핵산단편 및 전이효소를 분화다능 또는 분화전능 세포에 도입하고, 여기서 상기 핵산 단편은 적어도 2개의 역위 반복부에 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 상기 역위 반복부는 SB 단백질에 결합할 수 있으며, 상기 핵산 단편은 세포내 DNA로 삽일될 수 있고, 상기 전이효소는 서열번호:1 에 적어도 80 %의 아미노산 서열 동일성을 갖는 SB 단백질이며; 상기 세포를 동물로 배양한다. 바람직한 분화다능 또는 분화전능 세포는 난모세포, 배아세포, 난세포 및 간세포(stem cell)를 포함한다. 한 실시예에서, 상기 도입단계는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법을 포함한다: 미세주입(microinjection); 핵산 단편을 양이온성 지질 소포 또는 DNA 축합시약과 결합; 및 입자충격 및 일렉트로포레이숀은 물론 핵산 단편을 바이러스 벡터에 결합하고 상기 바이러스 벡터를 세포와 접촉시킴. 또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 리트로바이러스(retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 헤르페스바이러스(herpesvirus) 또는 아데노 관련(adeno-associated) 바이러스 벡터로 구성되는 군으로부터 선택된다. 본 방법에 사용되는 바람직한 방법은 마우스, 물고기, 유제류 동물, 새, 양을 포함한다.
본 발명의 또 다른 면에 있어서, 본 발명은 핵산을 세포내의 DNA로 도입하는 방법과 관련되며 하기의 단계를 포함한다: 적어도 2개의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 단편을 세포내로 도입, 여기서 상기 역위 반복부는 SB 단백질에 결합할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 단편은 SB 단백질의 존재하에 세포내의 DNA로 결합할 수 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 방법은 또한 SB 단백질을 세포내로 도입하는 것을 포함한다. 한 실시예에 있어서, SB 단백질은 서열번호:1에 대해 적어도 80 % 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 상기 SB 단백질은 단백질 또는 핵산으로서 세포내로 도입될 수 있으며, RNA 또는 DNA를 포함한다. 상기 핵산 단편을 수용하는 세포는 SB 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있으며, 단백질을 빠르게 발현할 수 있다. 한 실시예에 있어서, SB 단백질은 세포의 게놈으로 삽입된다. 상기 SB 단백질은 세포내에서 안정적으로 또는 일시적으로 발현될 수 있으며, SB 단백질을 암호화하는 핵산은 유도 프로모터(inducible promoter) 또는 구조 프로모터(constitutive promotor)의 조절을 받을 수 있다. 상기 방법의 일면에 있어서, 상기 도입단계는 핵산을 세포로 도입하는 방법을 포함하며, 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다: 미세주입(microinjection); 핵산 단편을 양이온성 지질 소포 또는 DNA 축합시약과 결합; 및 핵산 단편을 바이러스 벡터에 결합하고 상기 바이러스 벡터를 세포와 접촉. 바람직한 바이러스 벡터는 리트로바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터로 구성되는 군으로부터 선택된다. 상기 방법의 또 다른 면에 있어서, 상기 방법은 SB 단백질 또는 SB 단백질을 암호화하는 RNA를 세포내로 도입하는 단계를 포함한다. 본 방법에 사용된 세포는 분화다능 또는 분화전능 세포일 수 있으며, 본 발명은 또한 본 방법에 의해 제조된 유전자 이식 동물에 관련된다. 유전자 이식 동물이 제조되면, 상기 핵산 서열은 단백질, 바람직하게는 유전자 이식 동물로부터 채취하고자 하는 단백질 또는 표식(marker) 단백질을 암호화한다. 본 발명은 또한 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 유전자 이식 동물의 세포에 관련된다.
본 발명은 또한 SB 단백질에 관련된다. 한 실시예에 있어서, 상기 단백질은 다음의 특성을 갖는다: 세포의 DNA 내로 핵산 삽입을 촉매하는 활성; 서열번호:4 또는 5의 역위 반복부에 결합할 수 있는 능력; 및 서열번호:1 에 대한 80 %의 아미노산 서열의 동일성. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 단백질은 다음의 특성을 갖는다: 전이효소 활성; 약 10 % SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamid)에서 약 35 kD 에서 약 40 kD 범위의 분자량; 및 NLS 서열, DNA 결합부위 및 촉매적 부위 그리고 여기서 단백질은 핵산 단편을 세포의 핵산에 도입함에 있어서, 비-상동 재조합(non-homologous recombination)에 의해 얻어진 수준과 비교하면, 적어도 약 5배 향상되었다. 핵산 단편의 결합률을 시험하기 위한 바람직한 방법이 실시예로 제공된다.
또 다른 면에 있어서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포내 핵산 서열의 이동 방법에 관련한다: 본 발명의 단백질을 본 발명의 핵산 단편을 함유하는 DNA를 하우징(housing)하는 세포에 도입, 여기서 상기 단백질은 핵산 단편을 세포 DNA 내의 제 1위치에서 세포 DNA 내의 제 2위치로 이동시킨다. 한 실시예에 있어서, 세포의 DNA는 게놈 DNA 이다. 또 다른 실시예에 있어서, 세포 DNA 내의 제 1위치는 염색체외 DNA 이며, 또 다른 실시예에 있어서, 세포 DNA 내의 제 2위치는 염색체외 DNA 이다. 바람직한 실시예에 있어서, 단백질은 RNA로서 세포내로 도입된다.
본 발명은 또한 세포의 게놈내 유전자를 동정하는 방법을 포함하며, 하기의 단계를 포함한다: 핵산 단편 및 SB 단백질을 세포내로 도입, 여기서 핵산 단편은 적어도 2개의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 상기 역위반복부는 SB 단백질에 결합할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 단편은 SB 단백질의 존재하에 세포내 DNA에 삽입될 수 있다; 핵산 서열을 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 사용한 DNA 소화; 오픈 리딩 프레임으로부터 DNA 서열을 얻기 위해 역위 반복부에 가까운 핵산의 서열화; 및 상기 DNA 서열을 컴퓨터 데이타 베이스의 서열정보와 비교. 한 실시예에서, 상기 제한 엔도뉴클레아제는 6-염기 인식서열을 인식한다. 또 다른 실시예에서, 상기 소화단계는 또한 소화된 단편을 복제(clone)하거나 소화된 단편을 PCR 증폭하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 작동적으로 프로모터에 결합된 유전자를 포함하는 안정적인 유전자 이식의 척추동물에 관련되며, 여기서 유전자 및 프로모터는 역위 반복부에 인접하고, 여기서 상기 역위 반복부는 SB 단백질에 결합할 수 있다. 한 실시예에서, 상기 SB 단백질은 서열번호:1 또는 서열번호:1 에 최소한 80% 상동인 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시예에 있어서, 상기 척추동물은 제브라물고기를 포함하는 어류이며, 또 다른 실시예에서는 마우스이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 하기 서열에 결합할 수 있는 전이효소 활성을 지닌 단백질에 관련한다: 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9 또는 서열번호:10.
실시예 1
SB 전이효소의 재구성
재조합 DNA
유전자 재구성 - 단계 1: 전이효소 열린 해독 틀의 재구성.
아틀란타 연어(Atlantic salmon)로부터 얻은 Tss1.1 인자(GenBank 번호 L12206)를 결원 전이효소 유전자(defective transposase gene), SB1을 제조하기 위한 FTC-출발 및 FTC-종료에 인접하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR-중폭시켰다. 다음, Tss1.2 인자(L12207)중 결원 전이효소 유전자의 단편을 PCR 프라이머 FTC-3 및 FTC-4를 사용하여 PCR-증폭시켰으며, 다음 FTC-3 및 FTC-5로 보다 더 증폭시켰다. 상기 PCR 제조물은 제한효소 NcoⅠ 및 BlpⅠ로 소화시키고, 프라이머 서열에서 밑줄 표시된, SB1에서 대응하는 단편을 대체하여 SB2를 생성하도록 복제하였다. 다음, 무지개 송어(rainbow trout)(L12209)로부터 Tsg1 인자중 결원 전이효소 유전자의 Hind Ⅲ 단편 약 250 bp를 분리하였고, SB2 의 각각의 유전좌위로 복제하여 SB3이 되도록 하였다. 상기 Tss1 및 Tsg1 인자는 (Radice et ai.1994)에 기술되어 있으며, S.W. Emmons의 친절한 선물이었다.
FTC-출발: 5'CCTCTAGGATCCGACATCATG(서열번호:17)
FTC-종료: 5'-TCTAGAATTCTAGTATTTGGTAGCATTG(서열번호:18)
FTC-3: 5'-AACACCATGGGACCACGCAGCCGTCA(서열번호:19)
FTC-4: 5'-CAGGTTATGTCGATATAGGACTCGTTTTAC(서열번호:20)
FTC-5: 5'-CCTTGCTGAGCGGCCTTTCAGGTTATGTCG(서열번호:21)
유전자 재구성 - 단계 2 : 콘센서스 아미노산의 도입을 위한 SB3 열린해독틀의 자리-특이적(site-specific)의 PCR 변이.
PCR 변이에는 두가지 방법이 사용되었다: SB4 에서 SB6 까지의 메가프라이머(megaprimer) PCR(Sarkar and Sommer, 1990 BioTechniques 8, 404-407) 와 SB7 에서 SB10에 대한 라이게이즈 연쇄반응(Michael, 1994 BioTechniques 16, 410-412).
제조물 SB4에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같다:
FTC-7: Gln→Arg(74)및 Asn→Lys(75)에 대한 5'-TTGCACTTTTCGCACCAA(서열번호:22);
FTC-13: Ala→Glu(93)에 대한 5'-GTACCTGTTTCCTCCAGCATC(서열번호:23);
FTC-8: Leu→Pro(121)에 대한 5'-GAGCAGTGGCTTCTTCCT(서열번호:24);
FTC-9: Leu→Met(193)에 대한 5'-CCACAACATGATGCTGCC(서열번호:25);
FTC-10: Ala→Val(265) 및 Cys→Trp(268)에 대한 5'-TGGCCACTCCAATACCTTGAC(서열번호:26);
FTC-11: Ser→Ala(337) 및 Asn→Lys(339)에 대한 5'-ACACTCTAGACTAGTATTTGGTAGCATTGCC(서열번호:27).
제조물 SB5에 대한 올리고큐클레오타이드 프라이머:
B5-PTV: Leu→Pro(183), Asn→Thr(184) 및 Met→Val(185)에 대한 5'-GTGCTTCACGGTTGGGATGGTG(서열번호:28).
제조물 SB6에 대한 올리고큐클레오타이드 프라이머:
FTC-DDE: Asp→Glu(279)에 대한 5'-ATTTTCTATAGGATTAGGTCAGGGC(서열번호:29).
제조물 SB7 및 SB8 에 대한 올리고큐클레오타이드 프라이머, 두단계:
PR-GAIS: Asn→Ile(28), His→Arg(31), Phe→Ser(21)에 대한 5'-GTCTGGTTCATCCTTGGGAGCAATTTCCAAACGCC(서열번호: 30).
제조물 SB9 에 대한 올리고뉴클레오타이드 프라이머:
KARL: Pro→Arg(126)에 대한 5'-CAAAACCGACATAAGAAAGCCAGACTACGG(서열번호:31);
RA: Cys→Arg(166), Thr→Ala(175)에 대한 5'-ACCATCGTTATGTTTGGAGGAAGAAGGGGGAGGCTTGCAAGCCG(서열번호: 32);
EY: Lys→Glu(216), Asp→Tyr(218)에 대한 5'-GGCATCATGAGGAAGGAAAATTATGTGGATATATTG(서열번호: 33);
KRV: Cys→Arg(288)에 대한 5'-CTGAAAAAGCGTGTGCGAGCAAGGAGGCC(서열번호: 34);
VEGYP: Leu→Pro(324)에 대한 5'-GTGGAAGGCTACCCGAAACGTTTGACC(서열번호: 35).
제조물 SB10 에 대한 올리고뉴클레오타이드:
FATAH: Cys→Arg(143)에 대한 5'-GACAAAGATCGTACTTTTTGGAGAAATGATC(서열번호:36).
플라스미드(Plasmid).
pSB10에 대해, 상기 SB10 전이효소를 EcoR1 및 BamH1으로 절단하고, 클레노우(Klenow)로 메우며, CMV-βgal(Clonetch)의 클레노우(Klenow)-충전 NotⅠ 위치로 복제하여 상기 플라스미드에 본래 존재하는 LacZ 유전자를 대체하였다. 이때 그 인식서열은 상기와 같이 프라이머 FTC-출발 및 FTC-종료에서 결합시키고, 밑줄로 표시하였다. 비점착성-말단(blunt-end) 복제때문에, 상기 양 방향(both orientations) 유전자 삽입을 얻는 것이 가능하였으며, 안티센스 방향이 전이효소의 조절로서 사용되었다. pSB10-△DDE에 대해, 플라스미드 pSB 10은 전이효소 암호화 영역의 322bp 를 제거하는 MscⅠ으로 절단하였으며, 재환형화 하였다. 전이효소 유전자로부터 MscⅠ의 제거는 촉매인 DDE 부위의 대부분을 삭제시켰으며, 조발(早發) 번역 종료 코돈을 도입하므로서 해독틀을 중단하였다.
8개의 어종에서 발견한 12개의 부분적인 연어형 TcE 서열의 서열배열(EMBL 데이타베이스로부터의 디렉토리/pub/database/embl/align 에서 FTP.EBI.AC.AK 로부터의 DS30090 하에서 유용하다)은 우리가 다수의-규칙(majority-rule), 연어형 콘센서스 서열을 유도하고, 보존된 단백질 및 기능적 중요성을 갖는 것으로 보이는 DNA 서열 모티프(motif)를 동정할 수 있도록 하였다(도 1a).
변이된 전이효소 오픈 리딩 프레임의 개념적인 번역 및 다른 단백질에서의 기능적인 모티프와의 비교하므로써 우리는 SB 전이효소 계열에서 고도로 보존된 5개의 영역을 동정할 수 있었다(도 1a): ⅰ) N-말단에서 짝지워진 박스/루이신(box/leucine) 지퍼 모티프(zipper motif); ⅱ) DNA 결합부위; ⅲ) 양이분지(bipartite) 핵 좌위 신호(NLS); ⅳ) 전이효소 중심에 가까우며, 현재 알려진 기능이 없는 글리신-부화(glycine rich) 모티프; ⅴ) 전위(transposition)를 촉매하는 DDE 부위을 포함하는 C-말단 하프(half)내에 있는 3개의 분절(segment)을 구성하는 촉매부위. Doak 등에 의해 Tc1 마리너 서열에서 DDE 부위가 동정되었다(Doak et.al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 942-946). 복합적인 서열배열은 전이효소 암호화 서열에서 매우 무작위한 변이분포를 보여주었다; 코돈의 비-동의(non-synonymous) 위치에서 72% 가 발생하였다. 가장 높은 변이 빈도는 고도의 변이성인 CpG 디뉴클레오티드 좌위에서 관찰되었다(위의 Adey et al., 1994). 비록 아미노산 치환이 전이효소에서 분포되었으나, 보존부위 사이에 위치하는 단백질 영역에서와 비교할 때(코돈당 0.1 비-동의 변이), 보존 모티프에서는 보다 더 적은 변이가 관찰되었다(코돈당 0.07 비-동의 변이). 이러한 관찰은 숙주의 게놈에서 전이인자의 비활성에 앞서 어떠한 선택 기작을 유지하였을 것임을 우리에게 제시하였다. 상기 추정적인 기능성 부위의 동정은 재활성 과정에 있어서 매우 중요하였다.
전이효소 유전자의 재활성의 첫번째 단계는 아틀란타 연어(Salmo salar)로 부터 얻은 두개의 비활성 TcEs의 조각 및 단편과 무지개 송어(Onccorhynchus mykiss)(Radice et al., 1994, supra)로부터 얻은 단일 인자로부터 오픈 리딩 프레임을 복구하는 것이다. 종료코돈 및 틀이동(frameshifts)의 제거후에 완전한 오픈 리딩 프레임을 갖는 SB3을 Handler 등(1993)이 기술한 것과 동일한 절제분석(excision assay)으로 시험하였으나, 어떠한 탐지할 만한 활성이 관찰되지 않았다. 비-동의성 핵산 치환으로 인하여, SB3 폴리펩티드는 콘센서스 전이효소 서열과 24 위치에서 달랐으며(도 1b 참조), 상기 24 위치는 2 군으로 저장될 수 있다; 추정되는 기능성 부위에 존재하거나 및/또는 전체 Tc1 계열에서 보존되기 때문에 전이효소의 활성에 본질적이라고 할 수 있는 9개의 잔기와 그 상대적인 중요성을 예측할 수 없는 다른 15개의 잔기. 결과적으로, 우리는 이중(dual) 유전자 재구성 방법을 사용하였다. 첫째로, 전이효소중 상기 추정적인 기능성 단백질 부위을 변이의 이전 그룹을 정정함에 의해 동시에 체계적으로 재구성하였다. 각 부위는 가능하다면 개별적으로 생물화학적인 활성을 시험하였다. 둘째로, 상기 첫번째 접근과 병행하여, 하나의 완전한 길이(full-length)의, 추정적인 전이효소 유전자를 합성하였으며, 이는 상기 추정적인 전이효소에서 24개의 변이 아미노산 모두에 대한 재구성 과정을 확장하여 합성하였다.
따라서, 일련의 구조가 콘센서스에 가까운 코딩 서열을 가져오도록, 단계적으로, 제조되었으며, PCR 변이를 사용하였다(도 1b에서 SB4 내지 SB 10). 일반적인 접근에 따라, 다수-규칙 콘센서스에 의해 예측되는 상기 서열정보가 이어졌다. 그러나, 몇몇 코돈에 있어서는 CpG 위치에서5mC 잔기의 탈아미노작용(deamination)이 발생하였으며, C→T 변이가 많은 인자에서 고정되었다. R(288)에서, TpG's 및 CpG's가 배열중 동일한 수로 나타나면, CpG 서열이 선택되었는데, 이는 척추동물에서 CpG → TpG 전이가 TpG → CpG 보다 더 일반적이기 때문이다. 340 아미노산(도 1b 및 2의 SB10)를 암호화하는 합성 전이효소는 광범위한 유전자 공학의 결과이다.
상기 재구성한 기능성 전이효소 유전자 부위의 활성을 시험하였다. 첫째로, NLS-유사 단백질 모티프를 암호화하는 SB4 전이효소 유전자(도 1b)의 짧은 절편을 lacZ 유전자에 융합시켰다. 상기 전이효소 NLS는 세포질 표식-단백질, β-칼락토시다제(β-galactosidase)를 배양된 마우스 세포의 핵에 전달하는 것을 조절할 수 있었으며(위 Ivics et al., 1996), 이는 2분지 NLS가 SB에서 기능적인 모티프였고, 완전한 길이의 다기능성 효소를 소생하기 위한 우리의 접근이 가능하였음을 지지하였다.
실시예 2
역위 반복서열을 지닌 핵산 단편의 제조
전이효소 유전자에 인접하며, 54-bp의 짧은, 간접(indirect) 반복부(IRs)를 갖는 케노르아브다이티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)의 원형(prototype) Tc1과 대비할 때, 물고기에서 대부분의 TcEs는 각 말단부에 210-250 bp의 긴 IRs과 각 IR의 말단에서 정반복된 DNA 서열 모티프(DRs)를 갖는 TcEs의 IR/DR 아군(subgroup)(위의 Ivics et al., 1996; Izsvak et al., 1995)에 속했다(도 1a). 그러나, 상기 콘센서스 IR 서열은 완전한 반복부가 아니며(즉, 유사하나 동일하지는 않다), 이는 대부분의 TcEs와 대비하면, 상기 물고기 인자가 자연적으로 불완전한 역위 반복부를 포함한다는 것을 지시햇다. IRs의 중심에서 일치되는 부분은 80% 미만이나, DRs에서는 완전히 일치되며, 이는 이러한 무작위적이지 않은 비유사성의 분포가 IRs에서 기능적으로 중요한 서열 모티프를 유지하는 양성 선택의 결과일 수 있다는 것을 제시했다(도 3). 따라서, 우리는 DRs 및 그 주위의 DNA 서열이 IRs에서의 전위 및 변이에 대한 cis-활성(acting) 정보를 운반할 것이나, DRs 외부에서는, 전이인자에 대한 상기 인자의 능력을 손상시키지 않을 것이라고 예상하였다. 모델 기질로서, 우리는 타니크티스 알보누베스(Tanichthys albonubes)(이하 T라고 함)로부터 단일의 연어형 TcE 기질 서열을 선택하였으며, 이는 연어 콘센서스와 단지 3.8% 만 차이가 있는 원상의(intact) DR 모티프를 갖는다. 4개의 DR 서열의 DNase-보호 영역에서의 변화량은 83% 에서 95% 까지 변화하였다, 서열번호:6-9 참조.
타니크티스 알보누베스(Tanichthys albonubes)(L48685)로부터의 TcE를 pUC19의 SmaⅠ영역으로 복제하여 pT가 되도록 하였다. 상기 삽입분석을 위한 공여구조, pT/neo는 클레노우(Klenow)로 채운후, SV40 프로모터/인핸서(promoter/enhancer), 항 네오마이신 유전자(neomycin resistance gene) 및 SV40 폴리(A)신호를 함유하는 플라스미드 pRc-CMV(Invitrogen, San Diego, CA)를 pT의 StuⅠ/MscⅠ위치에 복제하여 제조하였다. T 의 StuⅠ/MscⅠ에 의한 이중 소화는 전이인자의 좌측에 352bp, 우측에 372bp를 남기며, 따라서 말단 역위 반복부를 함유하였다. pT/neo의 EcoR1 소화는 전이인자 좌측의 역위 반복부를 포함하여 350bp의 단편을 제거하였고, 상기 플라스미드가, 지정된 pT/neo-△IR, 전이효소-중재 전이유전자 삽입의 기질-의존성에 대한 조절로서 사용되었다(실시예 4 참조).
실시예 3
SB 전이인자의 DNA 특이성
아틀란타 연어 및 제브라물고기의 게놈에는 각각 Tss/Tdr1 및 Tss2/Tdr2인 적어도 두개의 뚜렷한 서브패밀리(subfamilies)가 있다. 동일한 서브패밀리로부터의 성분은 두개의 다른 종(예컨데, Tss1 및 Tdr1)으로부터 존재한다면, 약 70%의 핵산 상동성을 가지며, 동일한 종에서의 두개의 다른 서브패밀리의 일원보다 오히려 유사하다. 예를들어, Tdr1 및 Tdr2는 그들의 암호화된 전이효소 및 역위 반복부 서열에서 뚜렷이 다르고, 단지 30%의 핵산 상동성만을 갖는다. 전이인자의 특정 서브패밀리는 교차-이동(cross-mobilization)을 방지하기 위해 현저히 다르다. 하나의 커다란 의문은 전이효소의 기질인식이 밀접하게 관련된 전이인자의 활성을 방지할 정도로 충분히 특이적인가 하는 것이다.
우리는 제브라물고기형 TcEs의 DRs에 동일한, 연어형 인자의 12-bp DRs가 SB의 결합부위중 일부라는 것을 알게되었다. 그러나, 상기 결합부위는 30bp 길이였다.. 따라서, 특이적인 DNA-결합은 또한 물고기의 TcEs 서브패밀리 사이에 변성(variable)인 DRs 주변의 DNA 서열을 포함하였다. 그러한 전이효소 결합부위 서열에서의 차이는 N123이 제브라 Tdr1 IRs에 효과적으로 결합할 능력이 없는 것을 설명할 수 있었으며, 상기 전이효소가 밀접하게 관련된 TcE 서브패밀리까지도 구별할 수 있도록 한다. 실제로, 20-bp Tc1 결합부위에서 4개 염기쌍의 변이는 전이효소가 결합할 수 없도록 할 수 있다(Vos and Plasterk, 1994 EMBO J. 13, 6125-6132). 상기 DR 중심(core) 모티프는 일차적으로 전이인자-결합에 포함되는 반면에 DR 모티프 주변의 서열은 상기 결합에 특이성을 제공한다.
SB는 그 전이인자 기질 DNA 에 4개의 결합부위를 가지며, 이는 IRs의 말단에 위치한다. 상기 부위는 약 83% 내지 약 95%의 상동성을 갖는다(서열번호: 6-9와 비교). 그러나, 내부의 전이효소-결합부위가 결핍된 제브라물고기 Tdr1 인자는 명백하게 전이가 용이하다. 상기 고찰은 유전자 조작된 Tc3 성분의 내부 전이효소-결합부위의 제거가 전이의 능력을 낮추지 않았다는 발견과 일치하며(Colloms et al., 1994 Nucl. Acid Res. 22 5548-5554), 이는 내부의 전이효소-결합 부위가 전위에 본질적인 것은 아니라는 것을 제시한다. 전이효소를 포함하여 다수의 단백질에 대한 결합-부위는 종종 조절기능과 관련된다(Gierl et al., 1988 EMBO J. 7, 4045-4053). 결과적으로, TcEs의 IR/DR 군에서 전이효소에 대한 내부의 결합-부위는 전위 및/또는 유전자 발현에 영향을 주는 하나 이상의 조절목적을 만족시킨다.
일단 세포핵에서는, 전이효소는 전이인자내의 인식서열에 특이적으로 결합하여야 한다. Tc1 및 Tc3 전이효소의 상기 특이적인 DNA-결합부위는 그 N-말단 영역으로 지도화 되었다(위의 Colloms et al., 1994; Vos alc Plasterk, 1994). 그러나, TcE 전이효소의 N-말단부 사이에 매우 적은 서열 보존이 있으며, 이는 상기 서열이 단백질에 있어서 특이적인 DNA-결합부위를 암호화할 것임을 제시한다. 한편, 상기 N-말단부는 짝 DNA-결합부위에 대해 현저한 구조 및 서열의 유사성을 가지며, 전사인자중 팍스 계열(Pax family) 및 류신 지퍼-유사 모티프와의 신규 조합에서 발견되었다(Ivics et al., 1996). 특이적인 DNA-결합에 대한 모든 필수 정보를 함유하고 NLS를 포함하는 것으로 추정되며, SB(N123)의 최초 123개의 아미노산을 암호화하는 유전자 단편을 재구성하였고(도 1b의 SB8), E. coli. 에서 발현시켰다. N123은 C-말단 히스티딘 태그를 경유하여 16KDa 폴리펩티드로 정제하였다(도 3a).
N123을 600㎚, 0.5 O.D.에서 0.4mM IPTG를 첨가하여 E.coli 균주 BL21(DE3)(Novagen)에 도입하였고, 30℃에서 2.5시간 지속시켰다. 25mM HEPES, pH 7.5, 1M NaCl, 15% 글리세롤, 0.25% Tween 20, 2mM β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1mM PMSF 조건에서 세포를 초음파처리하였으며, 10mM 이미다졸(imidazol)(pH 8.0)을 제조자의 추천에 따라 Ni2+-NTA 수지(Qiagen)와 혼합하기 전에 상기 용액분획에 첨가하였다. 상기 수지는 25mM HEPES(pH7.5), 1M NaCl, 30% 글리세롤, 0.25% Tween 20, 2mM β-메르캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1mM PMSF 및 50 mM 이미다졸(pH 8.0)로 세척하였고, 결합 단백질을 300mM 이미다졸을 함유하는 초음파 완충액으로 용출하였으며, 이미다졸이 없는 초음파 완충액에 대해 4℃에서 하룻밤 투석하였다.
NLS 기능에 더하여, N123은 또한 SB의 특이적인 DNA-결합부위을 함유하며, 이는 모빌리티-시프트 분석(도 3b)에서 시험된 바와 같다. 인자중에서 좌선 역위 반복부(left inverted repeat)를 함유하는 pT중 300bp EorI/HindⅢ 절편은 [α32P]dCTP 및 클레노우(Klenow)를 사용하여 말단-표시하였다. 핵단백질 화합물을 전체 부피가 10 ㎕인 20mM HEPES(pH 7..5), 0.1 mM EDTA, 0.1 ㎎/㎖ BSA, 150 mM NaCl 에서 제조하였다. 반응은 100pg, 2㎍ 폴리[dI][dC] 및 1.5㎕ N123을 함유하였다. 빙상에서 15분 항온처리후, 50%의 글리세롤 및 브롬페놀(bromophenol)을 함유하는 5㎕의 로딩(loading) 염색제를 첨가하고, 상기 샘플을 5%의 폴리아크릴아미드 겔(Ausubel)에 적하 하였다. BRL의 kit를 제조자의 권고에 따라 사용하여 DNaseⅠ 풋트프린팅(footprinting)를 수행하였다. T중 좌선 IR을 함유하는 방사선 표식된 300-bp DNA 절편을 항온처리하자마자, 데옥시리보핵단백질 화합물이 관찰되었고(도 3b, 좌 판넬-레인 3), 이를 발현벡터만(레인 2)으로 또는 어떠한 단백질도 없이 프로우브만(레인 1)으로 형질전환시킨 박테리아 추출물을 함유하는 샘플과 비교하였다. 경쟁하는 DNA로서 반응에 과량 첨가한 T의 비표식(unlabelled) IR서열은 프로우브의 결합을 저해하였으며(레인 4), 반면에 제브라물고기로부터 복제된 Tdr 인자의 유사영역은 감지할 수 있을 정도로 결합에 경쟁하지 않았다(레인 5). 따라서, N123은 연어형과 제브라물고기형 TcE 기질을 구별할 수 있다.
점증의 N123 농도에서 모빌리티-시프트 분석에 의한 데옥시리보핵단백질 화합물의 수는 IR에 결합된 2개의 단백질 분자를 지시하였고(도 3b, 오른쪽 판넬), IR에서 전이효소에 대한 두개의 결합부 또는 하나의 위치에 대한 전이효소 이량체(dimer)의 결합과 일치한다. 전이효소-결합부는 DNaseⅠ 풋트프린팅 시험으로 보다 더 분석하였고, 지도화했다. 상기와 같이 동일한 T 단편을 사용하여, IR 프로우브의 말단에 인접하는 두개의 보호부를 관찰하였다(도 4). 상기 두개의 30-bp 풋트프린팅은 IRs 내의 끝 가까운(subterminal) DR 모티프를 포함한다. 따라서, 상기 DRs는 N123에 의한 DNA-결합에서 중심 서열이다. 상기 DR 모티프는 연어- 및 제브라물고기-형 TcEs에서 거의 동일하다(Ivics et al., 1997). 그러나, 상기 30-bp 전이효소 결합-부는 DR 모티프보다 길고, 외부 및 내부의 결합부에 각각 8 개 및 7 개의 염기쌍을 함유하며, 이는 제브라물고기- 및 연어-타입 IRs에서 다르다(도 4b).
비록 각각의 IR의 말단 부근의 전이효소에 대한 두개의 결합부가 있으나, 단지 외부만이 DNA 절단 및 그에 따른 전이인자의 절제에 사용되는 것이 명백하다. 서열대비는 외부 및 내부의 전이효소-결합부(도 4c) 사이에 길이에서 2-bp, 조성에서 3-bp 차이가 있음을 보여주었다. 요약하면, 우리의 합성 전이효소 단백질은 DNA-결합활성을 가지며, 상기 결합은 연어-형 IR/DR에 특이적인 것으로 보인다.
SB 전이효소의 N-말단 유도체의 발현을 위해, SB8의 유전자 절편을 프라이머 FTC-출발, FTC-8을 사용하여 PCR-증폭하였고, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)로 5'-인산하였으며, BamHⅠ으로 소화시키고, 클레노우(Klenow)로 채운 후, NdeⅠ/EcoRⅠ소화된 발현벡터 pET21a(Novagen)에 복제하였다. 상기 플라스미드, pET21a/N123은 전이효소의 최초 123개 아미노산(N123)을 C-말단 히스티딘 태그를 사용하여 발현시켰다.
실시예 4
SB 단백질에 의한 DNA 전위
하기 실시예는 합성, 연어-형 SB 전이효소가 전위의 복잡한 모든 단계, 즉 DNA 분자의 인식, 기질 DNA의 절제와 세포 염색체와 같은 세포내 DNA에 삽입 등을 수행하였음을 입증한다. 이는 SB 전이효소를 포함하지 않으며, 따라서 비-상동 재조합을 통해 삽입을 측정한 대조 샘플과 대비된다.
배양된 척추동물 세포로 두개의-요소 SB 전이인자 시스템을 코트란스펙션(cotransfaction)함에 있어서, 전이효소 활성은 전이효소에 대한 DNA 기질로서 작용하는 전이유전자의 삽입의 증가로 입증하였다. 공여체 대한 전이효소의 결합 및 상기 핵단백질 화합물의 트란스팩트된 세포핵으로 일련의 활성적인 전달은, SV40 NLS 단백질(Collas et al., 1996 Transgenic Res 5, 451-458)을 사용하는 형질전환 제브라물고기의 배아에서 관찰되는 것과 같이 증가된 삽입율을 가져올 수 있었다. 그러나, DNA-결합 및 핵 표적 활성 단독으로는 형질전환의 빈도를 증가시키지 않았으며, 이는 완전한-길이의 전이효소의 존재하에서만 발생하였다. 비록 충분하지는 않으나, 이들 기능은 전이효소 활성에 대해 어느정도 필수적이었다. 실제로, 마리너(mariner) 의 NLS 에서 단 하나의 아미노산의 치환이 전체적인 전이효소 기능에 대해 장해가 된다(Lohe et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1293-1297). 유전자의 변이형인 SB6의 전위 촉매에 대한 불활성은 보존된 모티프의 중요성을 입증하였다. 특히, SB6를 함유하는 11개의 아미노산 치환체중 3개인 F(21), N(28), H(31)가 특이적인 DNA-결합 부위내에 존재하였다(도 1 및 2). 물고기 TcE 전이효소의 짝-유사 DNA-결합부위 서열분석은 28 위치의 이소루이신(isoleucine)이 전이효소와 팍스 단백질(Pax protain)에서 그에 대응하는 위치 사이에서 보존되었음을 지시하였다(위의 Ivics et al., 1996). 따라서, 우리는상기 모티프가 DNA-활성에서 중요하다는 것을 예측하였다. SB는 특이적인 인식 및 삽입에 대해 기질-의존성이었다; 말단 역위 반복부 양자를 지닌 유전자 조작된 전이인자만이 SB에 의해 전이될 수 있었다. 유사하게, Drosphila 의 P 인자 형질전환에서, 상기 전이효소-제조 헬퍼(helper) 구조는 종종 " 윙-클립(wings-clipped) " 전이효소 유전자이며, 이는 인자의 도약(jumping)을 저해하는 P 인자의 역위 반복부중 하나를 결핍한다(Cooley et al., 1988 Science 239, 1121-1128). 우리의 일시적인 분석에 의하면, 전위는 SB 시스템의 양 요소가 동일한 세포에 존재할 경우에만 발생할 수 있었다. 상기 전위가 발생하면, 다수의 삽입이 발생할 수 있으며, 이는 항-네오마이신의 세포 복제물내에 11개에 이르는 삽입된 전이유전자에 대한 우리의 발견에의해 입증되었다(도 7a). 배양된 포유동물에서 종종 연쇄 다합체(concatemeric multimers)의 형태로 발생하는, 플라스미드 DNA의 하나의 게놈 위치로의 자발적인 삽입(Perucho et. al., 1980, Cell 22, 309-317)에 대비하면, 상기 다수 삽입은 별개의 염색체 좌위에서 발생하였다.
우리의 합성, 연어 전이인자의 결합은 마우스 및 인간은 물론 물고기에서도 관찰되었다. 또한, 플라스미드 대 플라스미드의 전위분석(위의 Lamp et a., 1996)에서 유전자 표식인자의 재조합은 전이효소의 존재하에 미세주입된 제브라물고기에서 현저하게 증가하였다. 따라서, SB는 본래의 숙주에 대한 그 활성을 제한하는 어떠한 명백하고, 특이적인 요인을 필요로하지 않는다. 특히, 전이유전자 삽입에서, 약 20 배의 가장 현저한 증가는 물고기 배아세포는 물론 인간세포에서도 관찰되었다.
SB의 삽입활성
핵에 들어가고 역위 반복부에 있는 활성부위에 특이적으로 결합하는 능력에 더하여, 충분히 활성인 전이효소는 전이인자을 절제하고 결합하는 것으로 기대되었다. SB 전이효소의 C-말단 절반에는 3개의 단백질 모티프가 DD(34)E 촉매부위를 구성하고; 두개의 불변의 아스파르트산 잔기, D(153) 및 D(244), 및 글루탐산 잔기, E(279), 상기 후자의 두개는 34 아미노산 (도 2)에 의해 분리되었다. 원상의(intact) DD(34)E 박스(box)는 Tc1 및 Tc3 전이효소의 촉매적 기능에 필수적이다(위의 van Luenen et al., 1994 Cell 79, 293-301; Vos and Plasterk, 1994).
두개의 다른 삽입분석을 사용하였다. 첫번째 분석은 배양된 세포의 염색체로의 염색체 결합을 탐지하도록 고안하였다. 상기 분석은 두개의 비자발적인 전이성 인자의 트란스-대응배열에 기초하였으며, 여기서 하나는 선택적인 표식 유전자(공여체)를 함유하고 다른 하나는 전이효소(헬퍼)를 발현한다(도 5a). 공여체, pT/neo 는 유전자 조작된, T-기초 인자이며, 전이효소의 결합부를 함유하는 전이인자의 말단 IRs 에 인접한 SV40 프로모터-유도 네오(promotor-driven neo) 유전자를 함유하였다. 상기 헬퍼 구조는 인간의 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 인핸서(enhancer)/프로모터에 의해 유도된 완전한 길이의 SB 10 전이효소 유전자를 발현하였다. 상기 분석에서, 상기 공여 플라스미드는 헬퍼 또는 조절구조와 함께 배양된 척추동물 세포로 코트란스팩트 되었고, 염색체 삽입과 네오 전이유전자의 발현에서 기인하며, 네오마이신 유사 약제인 G-418에 저항성인 세포 복제의 수는 유전자 전이의 효율에 대한 표시로서 작용하였다. 만약 SB가 엄격하게 숙주-특이적이지 않다면, 전위는 또한 계통분류상 원거리의 척추동물종에서도 발생해야 할 것이다. 도 5a에 도시한 분석 시스템을 이용하여, 증가된 수준의 전이유전자 결합이 헬퍼 플라스미드의 존재하에서 관찰되었고; 마우스 LMTK 세포에서는 5-배 이상이었고, 인간 HeLa 세포에서는 20-배 이상이었다(도 5b 및 6). 결과적으로, SB는 전이유전자의 결합효과를 증가시키며, 이러한 활성은 물고기에만 제한되지 않는다.
전이유전자의 삽입을 증가시키기 위한 필요요건을 분석하기 위하여, 추가적인 실험을 수행하였다. 도 5b는 G-418로 선택하고, 트란스팩트 후 2주간 메틸렌 블루로 염색시킨 트란스팩트된 HeLa 세포의 5개의 플레이트를 나타낸다. 상기 염색형태는 네오-표식한 전이인자의 헬라세포 염색체로의 삽입은, 안티센스 방향(orientation)에서 복제된 SB 전이효소 유전자와 공여체 플라스미드의 대조 코트란스팩트와 비교하면(pSB10-AS; 플레이트 1), 상기 SB 전이효소-발현 헬퍼 구조가 코트란스팩트될 때(플레이트 2) 증가되었음을 입증하였다. 상기 결과는 전이효소 단백질의 제조가 증가된 전이유전자의 염색체 삽입에 본질적이었음을 지시하고, 상기 전이효소는 인간세포에서 훨씬 더 정확함을 입증한다.
두번째 분석에서, 전이효소 인식서열과 표식 유전자(항 암피실린)를 함유하는 지시 플라스미드(indicater plasmid)를 카나마이신 유전자와 SB 전이효소를 함유하는 표적 플라스미드와 함께 주입하였다. 그 결과인 플라스미드는 분리하여 E. coli의 형질전환에 사용하였다. 콜로니는 항 암피실린 및 항 카나마이신에 대해 선택하였다(도 8 참조). SB 전이효소를 상기 방법으로 미세주입하는 동안, SB 전이효소를 암호화하는 mRNA를 SB 전이효소 단백질에 대신하여 또는 부가하여 협력-미세주입(comicroinjection)할 수 있다.
세포 트랜스펙션
10%의 태아 송아지 혈청이 첨가된 DMEM 에서 배양한 세포를, 트랜스펙션에 앞서 하룻동안 6㎝의 플레이트에 종배양하고, BRL의 리포펙틴(Lipofectin)을 사용하여 5㎍의 엘루티프(Elutip)(Schleicher and Schuell)-정제 플라스미드로 트란스팩트하였다. DNA-지질화합물로 5시간 배양후, 상기 세포는 인산염 완충 염수(PBS)에서 15% 글리세롤로 30초간 " 글리세롤-충격 " 시키고, PBS로 세척한 다음 혈청 함유 배지로 이동시켰다. 트랜스펙션 2 일후, 상기 트랜스펙트한 세포를 트립신처리하였고, DMEM을 함유하는 2㎖이 혈청에 재현탁하고, 상기 세포 현탁액의 1㎖ 또는 0.1㎖ 분취량을 600 ㎍/㎖ G-418(BRL)을 함유하는 배지에서 수개의 10 ㎝ 플래이트에 파종(seed) 하였다. 2주간의 선택 후, 세포 콜로니를 채취하고 개개의 배양물로 발전시키거나 또는 PBS 하에서 10% 포름알데하이드로 15분간 고정하고, PBS에서 30분간 메틸렌블루로 염색하였으며, 탈이온수로 광범위하게 세척하고, 공기건조 및 촬영하였다.
상기 분석은 염색체 결합에 필수적인 전이효소 부위를 지도화하는데 사용될 수 있다. 상기 분석에서, 틀 이동 변이를 SB 전이효소 유전자에 도입하였고, 이는 번역 종료 코돈을 G(161) 다음에 두었다. 상기 구조, pSB10-△DDE 는 특이적인 DNA-결합 및 NLS 부위를 함유하나 촉매부위를 결핍하는 전이효소 폴리펩티드 절형(truncated)의 전이효소를 발현하였다. 상기 구조를 사용한 형질전환율(도 5의 플레이트 3)은 안티센스 조절(도 6)로 얻은 것과 유사하였다. 상기 결과는 완전한 길이의 전이효소 단백질의 존재는 필수적이며, DNA-결합 및 핵 전달 활성 그 자체는 관찰된 전이유전자 결합의 증가에 충분한 요건이 아니라는 것을 제시하였다.
전이효소 요구의 추가적인 조절로서, 기존의 SB 전이효소, SB10과 11 잔기가 상이한 SB6 유전자(도 1b)의 결합활성을 상기와 동일한 분석을 사용하여 시험하였다. SB6를 사용하여 관찰되는 형질전환체의 숫자(도 5b의 플레이트 4)는 안티센스 조절 시험에서와 거의 동일하였고, 이는 우리가 전이효소 유전자에 도입한 아미노산 치환체가 전이효소의 기능에 중대한 것이었음을 지시하였다. 요약하면, 상기 도 5b의 플레이트 1, 3 및 4에 제시된 3가지의 조절은 증가된, SB-중재 전이유전자의 삽입의 트란스-요구를 확립하였다.
진정한 전위는 원상의(intact) IR 서열을 필요로한다. 네오-표식된 전이인자 기질의 IRs중 하나를 제거하고, 상기 구조 pT/neo-△IR의 수행을 시험하였다. 상기 플라스미드로 관찰된 형질전환율(도 5b의 플레이트 5)은 완전한-길이의 공여체(도 6)로 관찰한 것 보다 7-배 이상 낮았다. 상기 결과는 전이인자에 인접하는 양자의 IRs이 효과적인 전위에 필요함을 지시하였으며, 따라서 2 요소 SB 전이인자 시스템의 수개의 cis-요구를 확립하였다.
삽입된 전이유전자의 구조를 조사하기 위하여, 도 5b의 플레이트 2에 제시된 것과 유사한 시험의 G-418 선택에서 성장하는 11개의 세포 콜로니를 채취하였고, 그 DNA를 서던 교잡(Sourthern hybridization)을 사용하여 분석하였다. 세포 콜로니의 게놈 DNA 샘플을 2233bp T/neo 표식 전이인자의 내부를 절단하지 않는 5개의 제한효소로 소화시켰으며, 네오-특이적 프로우브로 교잡시켰다(도 7). 상기 교잡 형태는 모든 분석된 콜로니가 형질전환체당 1(레인 4) 내지 11(레인 2) 범위의 결합된 전이유전자를 함유하고 있음을 지시하였다. 또한, 많은 다중삽입이 인간 게놈의 다른 자리에서 발생하였다.
삽입된 전이인자에 인접한 중복 TA 서열의 존재는 TcE 전위의 특징이다. 그러한 서열을 밝히기 위해, 삽입된 전이인자와 인간게놈 DNA의 연결 절편을 결찰-조절(ligation-mediated) PCR 분석을 사용하여 분리하였다(Devon et al., Nucl. Acids. Res., 23, 164-1645(1995)). 우리는 5개의 삽입된 전이인자의 연결 절편을 복제하고 서열화하였으며, 이때 상기 모두가 예상한 IRs 서열을 나타내었고, 이는 모든 접합(junctions)에서 상이하였고, pT/neo에서 최초로 전이인자에 인접하는 플라스미드 벡터 서열과 상이한(도 7b) TA 이뉴클레오타이드(dinucleotide) 및 서열과 계속하였다. 전이인자의 좌선 또는 우선의 IR을 함유하는 9개의 추가적인 접합으로부터 얻은 결과는 동일하였다(데이타는 제시하지 않음). 상기 결과는 표식 전이인자가 정확하게 공여 플라스미드로부터 절제되었고, 그 결과 인간 염색체의 다양한 위치로 삽입되었음을 지시하였다. 다음, 상기 접합서열은 야생-형 HeLa DNA로부터 복제된 대응하는 " 빈(empty) " 염색체 서열의 영역과 대비하였다. 도 7b에 제시된 바와 같이, 상기의 삽입은 모두 TA의 표적자리에서 발생하였으며, 이는 중복되었고, 그 결과 삽입된 전이인자를 TA 에 인접하게 하였다. 상기 데이타는 SB가 Tc1/마리너 수퍼패밀리(superfamily)와 동일하게, 잘라-붙이는 형태의 전위기작을 사용하고, 반응의 신뢰성이 이종구조(heterologous) 세포에서 유지되는 것을 입증하였다. 상기 데이터는 또한 SB-중재 전이의 빈도가 무작위 재조합 보다 적어도 15-배 높다는 것을 제시하였다. 일련의 재조합중 어느 것도 SB-전이효소에 의해 중재되지 않으므로, 무작위 재조합에 대한 실제 전위율은 훨씬 더 높을 수 있다. 만약 상기 삽입이 SB 단백질에 의해 조절되지 않는 무작위 삽입의 결과라면, 삽입된 네오 구조의 말단은 플라스미드의 말단에 대응하지 않을 것이며; 전이인자에 인접하는 결실 IR 서열 및/또는 첨가 플라스미드 서열이 있었을 것이다. 또한, 삽입부에 중복 TA 염기쌍은 없었을 것이다.
염색체외 플라스미드로부터 척추동물의 염색체에 이르기까지, 완전한 길이의 전이효소에 의해 양 말단에 역위 반복부를 지닌 완전한 전이인자의 절제 및 삽입의 의존성은 유전자 전달 시스템이 완전히 기능적임을 입증한다.
실시예 5
다른 종으로부터 세포 DNA의 전이
전이효소 활성의 숙주-요구(Host-requirements)를 3가지의 다른 척추동물세포, 마우스로부터의 LMTK, 인간의 HeLa 및 제브라물고기의 배아세포를 사용하여 평가하였다.
분석은 전이효소가 기능적인 세포 세트(functional set of cells)에서 작용한다는 것을 입증하기 위해 고안되었다(즉, 자연적인 환경에서 분화하고 성장하는 배아세포). 상기 분석은 하나의 플라스미드에서 전이인자를 제거하고, 표적 플라스미드로 삽입시키는 플라스미드간(inter-plamid) 전달과 단세포 단계의 제브라물고기 배아로 삽입되는 전이효소 구조를 포함하였다. 상기 실시예에서, 전이인자 절제 및/또는 결합을 기록하기 위한 표시(공여)플라스미드는 다음을 포함한다: 1) E. coli 또는 물고기 세포에서 회수되었을 때, 기능의 손실 또는 획득을 확인하기 위해 스크린될 수 있는 표식 유전자, 및 2) 상기 표식 유전자에 인접하는 IRs 내의 전이효소-인식 서열. 표식된 전이인자의 전체 크기는 경골어류의 게놈에서 발견되는 TcEs의 자연적인 크기인 약 1.6kb 로 유지하였다. 그러나, 약 5kb의 전이인자를 사용하는 유전자 전이율은 1.6kb 전이인자에 대한 것과 크게 다르지 않았으며, 이는 전위가 커다란 크기의 전이인자로도 발생할 수 있음을 제시하였다. 상기 Ts1 전이효소의 전이활성은 블루스크립트(Bluescript) 발현벡터로부터의 T7 RNA 중합효소로 생체외에서 합성한 200 ng/㎕ 의 Ts1 mRNA에 더하여 약 250 ng/㎕ 의 표적 및 공여 플라스미드 각각을 단세포 단계의 제브라물고기 배아에 협력-미세주입(co-microinjection)하여 증진하였다. 주입한지 약 5시간 후부터, 저분자량의 DNA가 제조되었고, E.coli 세포로 형질전환되었으며, 50㎍/㎖ 카나마이신 및/또는 암피실린을 함유하는 한천 배지상에 리플리카법으로 이식하여 콜로니를 선택하였다. 상기 연구에서, 표적 플라스미드로의 전이 빈도는 대조 세포의 0.002 %와 비교하면, 시험 세포에서는 약 0.041% 였다. 상기 수준은 제브라물고기 게놈에서 발생하였던 전위를 포함하지 않았다. 상기 시험으로부터 우리는 배아의 약 40 내지 50%가 4 일이상 생존하지 못하였음을 알았다. 마우스에서의 삽입변이 연구는 열성 치사율이 약 0.05 임을 제시하였다(즉, 평균 약 20개 삽입이 치명적임). 상기 치사율을 제브라물고기에 적용할 수 있다고 가정하면, 대략적인 사망율 수준은 상기 시험에서 사용된 미세주입으로, 게놈당 약 20개 삽입, 상기 사망율이 설명될 수 있다.
실시예 6
SB 전이인자으로부터 안정적인 유전자 발현
전이인자 시스템은, 만약 전달된 유전자가 신뢰할 수 있을 정도로 발현된다면, 유전자 치료 및 바이오리엑터 시스템을 위한 동물 염색체로의 유전자 이동과 같은 목적을 위한 유전자 전달에 있어서 기능적이다. 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 전이효소-중재전달에 이어지는 유전자 발현의 신뢰도를 결정하기 위해, 우리는 SV40 프로모터에 더하여 슬리핑 뷰티 전이효소를 암호화하는 생체외 합성한 mRNA의 지도하에 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자를 함유하는 전이인자를 단세포 단계의 제브라물고기에 협력-미세주입하였다. 배아발생중에 약간의 GFP 발현이 관찰된 34개의 주입된 배아를 성숙할 때까지 배양하여 야생형의 제브라물고기와 짝짓기 하였다. 상기 짝짓기에서 우리는 34마리의 물고기중 4마리가 GFP 유전자를 그 자손에 전달시켰음을 발견하였다(표 1). 상기 4마리의 F0 물고기의 자손에서 GFP 유전자의 발현은 A, B, C, 및 D로 표시하였고, 평가하였으며, 물고기를 양육하였다. 상기 4마리의 조상으로부터, GFP 유전자의 전달율은 약 2 내지 12%(표 1)였고, 평균 7% 였다. 상기 물고기에서 GFP 발현은 동일 조직형에서는 모든 개체에서 거의 동일하였으며, 이는 GFP의 유전자의 발현은 난세포(eggs)과 정자(sperm)를 통한 전달 이후에도 회복할 수 있음을 제시하였다. 상기 데이타는 생식계열이 GFP 유전자 발현에 대한 모자이크이며, 상기 유전자의 발현이 안정적이었음을 제시하였다. 물고기 D의 F1 자손을 상호 짝짓기 하였다. 이 경우 우리는 약 75%의 전이를 예상하였으며, 우리는 실제로 동일한 조직에서 동등한 수준으로 GFP 단백질을 발현하는 F2 물고기 69/90(77%)를 발견하였고; 이는 또한 적어도 2세대의 동물을 통해 신뢰성 있게 발현될 수 있는 유전자 전달을 위한 SB 전이인자 시스템의 능력을 입증하였다.
표 1
GFP 유전자를 함유하는 SB 전이인자의 주입후에 제브라물고기에서의 유전자발현에 대한 안정성.
GFP 발현
유전자전이 라인 F0 F1 F2
34 조상 34(여기서 4개의 자손, A-D 이 전이유전자를 전달하였다) A 25/200(12%) B 76/863(9%) C 12/701(2%) D 86/946(10%) 69/90(77%)
상기 물고기 A-D 에 대한 칸에서의 숫자는 조사된 전체 자손수에 대한 GFP 발현 물고기의 숫자이다. GFP를 발현하는 자손의 백분율은 괄호안에 표시하였다.
실시예 7
삽입변이 및 유전자 발견에 있어서 SB 전이인자
게놈내 또는 사이에서 하나의 염색체 자리에서 다른 자리로 이동할 수 있는 타고난 능력으로 인하여, 전이성 인자는 박테리아(Gonzales et al., 1996 Vet. Microbiol. 48, 283-291; Lee and Henk, 1996. Vet. Microbiol. 50, 143-148), 드로소필라(Drosophila)(Ballinger and Benzer, 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9402-9406; Bellen et al., 1989 Genes Dev. 3, 1288-1300; Spradling et al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10824-10830), 시. 엘레간스(C. elegans)(Plasterk, 1995. Meth. Cell. Biol., Academic Press, Inc. pp. 59-80) 및 다양한 식물종(Plant species)(Osborne and Baker, Curr. Opin. Cell Biol, 7, 406-413(1995))을 포함하는 특정 유기체의 유전자 조작을 혁명화하였다. 전이인자는 전이인자-태깅(tagging), 인핸서 트랩핑(enhancer trapping) 및 형일전환에 대해 유용한 벡터로 이용되었다. 그러나, 전부는 아니라도, 경제적으로 중요한 다수의 동물이 그러한 도구를 가지고 있지 않다. 다양한 유기체에서 그 기능에 대한 단순하고도 뚜렷한 능력으로 인하여, SB 는 현재 DNA 전이인자 기술이 유용하지 않은 종에 대해 효과적인 벡터로서 유용하다.
SB-형 전이성 인자는 삽입변이로 인한 삭제효과를 갖을 수 있는 기능적 DNA 서열 또는 많은 콘시컨스(consrquence)를 갖지 않는 비-기능적 염색질(chromatin)의 두가지 형태의 염색질에 결합할 수 있다(도 9). " 전이인자 태깅 "은 거의 20 년간 단순한 모델시스템에서 개발되었다(위의 Bingham et al., Cell, 25, 693-704(1981); Bellen et al., 1989). 전이인자 태깅은 오래된 기술로서 여기서 형질전환 DNA는 세포에 삽입되어 유전자에 결합하며, 이에 따른 삽입변이에 의해 유전자를 불활성화시킨다. 상기 과정에서, 불활성화된 유전자는 변이된 대립유전자를 회복하는데 사용될 수 있는 전이성 인자에 의해 태그된다. 전이성 인자의 삽입은 특징적인 표현형을 유도하는 유전자의 기능을 중단시킬 수 있다. 도 10에 제시된 바와 같이, 삽입은 대체로 무작위적이기 때문에, 삽입되어 기능-손실 변이를 가져올 수 있는 동일한 절차가 세포에 새로운 표현형을 제공하는 유전자를 전달하는데 종종 사용될 수 있다. 기능-획득 변이는 조절에서의 중요성은 물론 성장 및 발육에서도 작용하는 유전자의 역할을 이해하는데 사용될 수 있다.
태그된 유전자를 분리하는 몇가지 방법이 있다. 모든 경우에 있어서, 게놈 DNA는 공지기술(조직 및 동물에 따라 다르다)로 변이시킨 동물의 하나 이상의 조직세포에서 분리한다. 상기 DNA는 전이인자 태그를 자르거나 또는 자를 수 없는 제한 엔도뉴클레아제로 절단시키고(종종 알려진 자리를 절단한다). 상기 결과인 절편은 플라스미드 또는 파아지(phage) 벡터에 직접 복제되며, 동정을 위해 전이인자 DNA에 대한 프로우브를 사용한다(Kim et al., 1995 Mobile Genetic Elements, IRL Press, D. L. Sheratt eds). 또한, 상기 DNA는 많은 방법중 어느 하나로 PCR 증폭시킬 수 있으며; 우리는 Izsvak 및 Ivics(위 1993)의 LM-PCR 방법및 Devon 등에 의한 그 수정된 방법을 사용하였고, 전이인자 프로우브로의 교잡(hybridization)으로 동정하였다. 또하나의 방법은 역-PCR(inverse-PCR)이다(예를들어, Allende 등, Genes Dev., 10, 3141-3155(1996)). 복제방법에 관계없이, 동정된 클론은 서열배열하였다. 상기 서열은 전이인자(또는 삽입된 DNA)에 인접하며, 삽입 인자에 대한 비-동일성에 의해 동정하였다. 상기 서열은 결합되고, 이미 특성화된 다른 유전자와의 상동성 또는 어떤 기능을 암호화하는 유전자 또는 서열 모티프와 부분적 상동성에 대한 핵산정보를 찾는데 사용될 수 있다. 어떤 경우에는 상기 유전자는 공지의 어떠한 단백질과도 상동성이 없을 수 있다. 이는 다른 것들이 비교하게될 새로운 서열이 된다. 상기 암호화된 단백질은 회수를 유도했던 표현형을 야기하는데 있어서의 그 역할을 조사하는데에 중심이 된다.
실시예 8
유전자 지도 작성을 위한 SB 전이인자
전이유전자 및 다른 유전자위에 대한 반복성 인자를 동정하였다. DANA 는 뚜렷한 카세트(cassette)의 특이한 구조이며, 자손 SINE 인자에 삽입된 짧은 서열에 의해 수집된 것으로 여겨진다. DANA를 Diano 계통(linage)에서 약 4 × 105copies/게놈 까지 증폭시켰다. Angel 인자는, DANA 만큼 풍부하였으며, 이는 물고기 유전자 부근에서 발견되는 역위-반복서열이다. DANA 및 Angel 인자는 게놈내에서 무작위로 분포하는 것으로 여겨지며, 메덜리안 패션(Medelian fashion)에서 이탈하였다. DANA 및 Angel 인자에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 물고기 계통과 형질전환 서열의 국부화(localization)에서 다형성(polymorphism)을 스크린하기 위한 유전적 표식으로서 사용되었다. 산재된 반복서열-PCR(IRS-PCR)은 다형성 DNA를 탐지하는데 사용되었다. IRS-PCR 은 반복인자에 인접한 게놈 DNA를 증폭하며, 이때 반복-특이적 프라이머를 메덜린 패션에서 유전된 다형성 절편의 제조에 사용하였다(도 10a). 다형성 DNA 절편은 IRS-PCR에서 Angel 특이적 프라이머 또는 DANA 에 의해 산출될 수 있으며, 탐지할 수 있는 다형성 밴드의 수는 제브라물고기의 게놈내에서 SB-유사 전이인자을 포함하는 다양한 프라이머의 반복서열에의 조합에 의해 현저하게 증가하였다.
다형성 절편은 겔로부터 회수 가능하였으며, 변이 지도작성을 위해 서열 태그된 자리를 제공하도록 복제되었다. 도 10b는 STSs를 산출하기 위해 IRS-PCR 을 사용하는데 대한 일반적인 원칙 및 제한조건을 제시한다. 우리는 제브라물고기의 약 0.1%가 단지 4 개의 프라이머를 사용하는 IRS-PCR에 의해 직접 분석될 수 있다고 평가하였다. DANA의 상기 4개의 보존된 (C1-4) 영역은 제브라물고기 게놈에서 다른 정도의 보존 및 표현을 갖는 것으로 보이며, 이는 PCR 프라이머를 고안할 때 고려되었다.
상기와 동일한 방법은 물고기 계통 또는 다른 동물의 핑거프린팅(fingerprinting)에 잠재적인 적용성을 갖는다. 상기 방법은 효모, 박테리아 및 박테리오파아지 P1-유도된 합성 염색체(각각 YACs, BACs 및 PAC)에서 복제된 커다란 DNAs의 서브클론(subclone)을 얻는데 사용될 수 있고, 삽입된 형질전환 서열의 탐지에 사용될 수 있다.
상기 특정 실시예 및 시험예에서 기술한 본 발명은 당업자에게 용이하게 이해될 것이고, 본 발명이 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 범위를 넘지 않는 범위에서 상기 실시예, 시험예 및 용도의 수정 또는 변형이 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING
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INTRODUCTION OF NUCLEIC ACID INTO THE DNA OF A CELL
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GAAGGCTACC CGAAACGTTT GACCCAAGTT AAACAATTTA AAGGCAATGC TACCAAATAC 1020
TAG 1023
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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:
AGTTGAATCG GAAGTTTACA TACACCTTAG 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:10:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:10:
CAKTGRGTCR GAAGTTTACA TACACTTAAG 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:11:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 8 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:11:
ACATACAC 8
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:12:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 23 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:12:
TTTCAGTTTT GGGTGAACTA TCC 23
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:13:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:13:
GGCGACRCAG TGGCGCAGTR GG 22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:14:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:14:
GAAYRTGCAA ACTCCACACA GA 22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:15:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:15:
TCCATCAGAC CACAGGACAT 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:16:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 25 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:16:
TGTCAGGAGG AATGGGCCAA AATTC 25
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:17:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:17:
CCTCTAGGAT CCGACATCAT G 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:18:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:18:
TCTAGAATTC TAGTATTTGG TAGCATTG 28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:19:
AACACCATGG GACCACGCAG CCGTCA 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:20:
CAGGTTATGT CGATATAGGA CTCGTTTTAC 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21:
CCTTGCTGAG CGGCCTTTCA GGTTATGTCG 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:
TTGCACTTTT CGCACCAA 18
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:23:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23:
GTACCTGTTT CCTCCAGCAT C 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:24:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:24:
GAGCAGTGGC TTCTTCCT 18
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:25:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 18 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:25:
CCACAACATG ATGCTGCC 18
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 21 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:
TGGCCACTCC AATACCTTGA C 21
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 31 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27:
ACACTCTAGA CTAGTATTTG GTAGCATTGC C 31
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:28:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:28:
GTGCTTCACG GTTGGGATGG TG 22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:29:
ATTTTCTATA GGATTGAGGT CAGGGC 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 35 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30:
GTCTGGTTCA TCCTTGGGAG CAATTTCCAA ACGCC 35
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31:
CAAAACCGAC ATAAGAAAGC CAGACTACGG 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 44 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32:
ACCATCGTTA TGTTTGGAGG AAGAAGGGGG AGGCTTGCAA GCCG 44
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 36 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:
GGCATCATGA GGAAGGAAAA TTATGTGGAT ATATTG 36
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 29 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34:
CTGAAAAAGC GTGTGCGAGC AAGGAGGCC 29
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 27 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35:
GTGGAAGGCT ACCCGAAACG TTTGACC 27
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36:
GACAAAGATC GTACTTTTTG GAGAAATGTC 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:
GTTGAAGTCG GAAGTTTACA TACACTTAGG 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38:
GTTTAAACCA GAAGTTTACA CACACTGTAT 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 30 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39:
CCAGTGGGTC AGAAGTTTAC ATACACTAAG 30
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 28 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40:
CTTGAAAGTC AAGTTTACAT ACAATAAG 28
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 32 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:
TCCAGTGGGT CAGAAGTTTA CATACACTAA GT 32
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 32 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:
TCCAGTGGGT CAGAAGTTTA CATACACTAA GT 32
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43:
TGAATTCGAG CTCGGTACCC TACAGT 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44:
ACTGTAGGGG ATCCTCTAGA GTCGAC 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:
AAATTTATTT AATGTGTACA TACAGT 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46:
ACTGTATAAG AACCTTTAGA ACGAAG 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:
AAATTTATTT AATGTGTACA TA 22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48:
TAAGAACCTT TAGAACGAAG 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:49:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:49:
GAATAAACAG TAGTTCAACT TACAGT 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:50:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:50:
ACTGTATATG TTTTCATGGA AAATAG 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:51:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:51:
GAATAAACAG TAGTTCAACT TA 22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:52:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:52:
TATGTTTTCA TGGAAAATAG 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:53:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:53:
TCACTGACTC ATTCAACATC TACAGT 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:54:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:54:
ACTGTATTTA TTGAATGCCT GCTGAA 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:55:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:55:
TCACTGACTC ATTCAACATC TA 22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:56:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:56:
TTTATTGAAT GCCTGCTGAA 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:57:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:57:
ACTTACATAA TTATAAGTTT TACAGT 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:58:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:58:
ACTGTATATA ATGATGACAT CTATTA 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:59:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:59:
ACTTACATAA TTATAAGTTT TA 22
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:60:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 20 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:60:
TATAATGATG ACATCTATTA 20
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:61:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:61:
TATAAAGACA CATTCACATG TACAGT 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:62:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 26 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:62:
ACTGTATGTT TACTGCGGCA CTATTC 26
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:63:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A) LENGTH: 22 base pairs
(B) TYPE: nucleic acid
(C) STRANDEDNESS: single
(D) TOPOLOGY: linear
(ii) MOLECULE TYPE: DNA (genomic)
(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:63:
TATAAAGACA CATGCACACG TA 22

Claims (101)

  1. SB 단백질에 결합할 수 있는 두개 이상의 역위 반복부(inverted repeats) 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하고, 세포내의 DNA에 삽입될 수 있는 핵산 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 핵산 서열이 플라스미드(plasmid)의 일부분인 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  3. 제 1항에 있어서, 핵산 서열이 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 일부 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  4. 제 1항에 있어서, 핵산 서열이 하나 이상의 발현 조절영역(expression control region)을 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 핵산 단편.
  5. 제 4항에 있어서, 발현 조절영역이 프로모터(promotor), 인핸서(enhancer) 및 사일렌서(silencer)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  6. 제 1항에 있어서, 핵산 서열이 오픈 리딩 프레임의 일부이상에 작동적으로(operably) 연결된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  7. 제 1항에 있어서, 세포가 동물의 세포인 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  8. 제 7항에 있어서, 세포가 무척추동물의 세포인 것을 특징으로하는 핵산 단편.
  9. 제 8항에 있어서, 무척추동물이 갑각류(crustacean) 또는 연체류 동물(mollusk)인 것을 특징으로하는 핵산 단편.
  10. 제 9항에 있어서, 갑각류 또는 연체류 동물이 새우(shrimp), 가리비(scallop), 바닷가재(lobster) 또는 굴(oyster)인 것을 특징으로하는 핵산 단편.
  11. 제 7항에 있어서, 세포가 척추동물의 세포인 것을 특징으로하는 핵산 단편.
  12. 제 10항에 있어서, 세포가 어류의 세포인 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  13. 제 11항에 있어서, 세포가 조류(bird)의 세포인 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  14. 제 11항에 있어서, 척추동물이 포유동물인 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  15. 제 14항에 있어서, 세포가 마우스(mice), 유제류 동물(ungulates), 양(sheep), 돼지(swine) 및 인간으로 구성된 군으로부터 선택된 포유동물의 세포인 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  16. 제 1항에 있어서, 세포의 DNA가 에피솜(episome) 또는 플라스미드(plasmid)로 구성된 군으로부터 추가로 선택된 염색체외(extrachromosomal) DNA 또는 세포 게놈(genome)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  17. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 역위반복부가 서열번호:4 또는 서열번호:5를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  18. 제 1항에 있어서, SB 단백질의 아미노산 서열이 서열번호:1과 80% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  19. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 역위 반복부가 하나 이상의 정반복부(direct repeat)를 포함하고, 하나 이상의 정반복부는 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8 또는 서열번호:9 를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  20. 제 1항에 있어서, 정반복부가 서열번호:10의 콘센서스(consensus) 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  21. 제 1항에 있어서, 정반복부가 서열번호:10과 80% 이상의 핵산 서열 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 단편.
  22. SB 단백질에 결합할 수 있는 두개 이상의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하고, 세포내의 DNA에 삽입될 수 있는 핵산 단편; 및
    서열번호:1과 80% 이상의 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 지닌 SB 단백질인 전이효소 또는 상기 전이효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포의 DNA로 DNA를 도입하는 유전자 전달 시스템.
  23. 제 22항에 있어서, SB 단백질이 서열번호:1을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  24. 제 22항에 있어서, 전이효소를 암호화하는 DNA가 42℃에서 7시간 동안의 0.1%(w/v) SDS, 0.5×SSC 에서 30%(v/v) 포름아미드(formamide)의 교잡(hybridization) 및 세척조건에서 서열번호:1과 교잡할 수 있는 것을 특징으로하는 유전자 전달 시스템; .
  25. 제 22항에 있어서, 전이효소가 단백질로서 세포에 제공되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  26. 제 22항에 있어서, 전이효소가 전이효소를 암호화는 핵산으로서 세포에 제공되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  27. 제 26항에 있어서, 전이효소를 암호화하는 핵산이 RNA인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  28. 제 22항에 있어서, 전이효소를 암호화하는 핵산이 세포의 게놈으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  29. 제 22항에 있어서, 핵산 단편은 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터의 일부분인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  30. 제 22항에 있어서, 핵산 서열이 오픈 리딩 프레임의 일부 이상을 포함하는 것을 특징으로하는 유전자 전달 시스템.
  31. 제 22항에 있어서, 핵산 서열이 하나 이상의 유전자 조절영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  32. 제 31항에 있어서, 조절영역이 전사(transcriptional) 조절영역인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  33. 제 31항에 있어서, 조절영역이 프로모터(promotor), 인핸서(enhancer), 사일렌서(silencer), 위치-조절영역 및 보더인자(border element)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  34. 제 22항에 있어서, 세포는 동물의 세포인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  35. 제 22항에 있어서, 핵산 서열이 오픈 리딩 프레임의 일부 이상에 작동적으로작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  36. 제 34항에 있어서, 세포가 척추동물 또는 무척추동물의 세포인 것을 특징으로하는 유전자 전달 시스템.
  37. 제 36항에 있어서, 무척추동물이 갑각류 또는 연체류 동물인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  38. 제 36항에 있어서, 세포가 어류 또는 조류의 세포인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  39. 제 36항에 있어서, 척추동물이 포유동물인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  40. 제 39항에 있어서, 세포가 설치류 동물(rodents), 유제류 동물(ungulates), 양, 돼지 및 인간으로 구성되는 군으로부터 선택된 포유동물의 세포인 것을 특징으로하는 유전자 전달 시스템.
  41. 제 22항에 있어서, 세포의 DNA가 세포 게놈 및 염색체외(extrachromosal) DNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로하는 유전자 전달 시스템.
  42. 제 22항에 있어서, 하나 이상의 역위 반복부가 서열번호:4 또는 서열번호:5를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  43. 제 22항에 있어서, SB 단백질의 아미노산 서열이 서열번호:1과 80% 이상의 상동성을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  44. 제 22항에 있어서, 하나 이상의 역위 반복부가 적어도 하나 이상의 정반복부를 포함하고, 하나 이상의 정반복부는 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8 또는 서열번호:9 를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  45. 제 22항에 있어서, 정반복부가 서열번호:10의 콘센서스(consensus) 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  46. 제 22항에 있어서, 핵산 서열이 재조합 서열의 라이브러리(library)중 일부인 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템.
  47. 제 22항에 있어서, 핵산 서열이 입자충격(particle bombordment); 일렉트로포레이숀(electrporation); 미세주입(microinjection); 핵산 서열과 지질-함유 운반체 또는 DNA 축합시약의 혼합; 및 핵산 단편의 바이러스 벡터로의 삽입과 상기 바이러스 벡터의 세포와의 접촉으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법을 사용하여 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 유전자 전달 시스템;
  48. 서열번호:1을 포함하는 단백질 또는 서열번호:1과 80% 이상의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 SB 단백질을 암호화하는 핵산.
  49. 제 48항에 있어서, 핵산 벡터내에 존재하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  50. 제 49항에 있어서, 벡터가 유전자 발현 벡터(gene expression vector)인 것을 특징으로 하는 핵산.
  51. 제 50항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 것을 특징으로 하는 핵산.
  52. 제 49항에 있어서, 핵산이 선형 핵산 단편인 것을 특징으로 하는 핵산.
  53. 제 48항의 핵산을 포함하는 세포.
  54. 제 53항에 있어서, 세포가 동물의 세포인 것을 특징으로 하는 핵산.
  55. 제 54항에 있어서, 세포가 척추동물 또는 무척추동물의 세포인 것을 특징으로 하는 핵산.
  56. 제 55항에 있어서, 척추동물이 어류인 것을 특징으로 하는 핵산.
  57. 제 55항에 있어서, 척추동물이 포유동물인 것을 특징으로 하는 핵산.
  58. 제 53항에 있어서, 세포가 난모세포(oocyte) 또는 난세포(egg)인 것을 특징으로 하는 핵산.
  59. 제 53항에 있어서, 세포가 조직(tissue) 또는 기관(organ)의 일부분인 것을 특징으로 하는 핵산.
  60. 제 53항에 있어서, 세포가 하나 이상의 배아세포(embryo)를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  61. 제 48항에 있어서, 세포의 게놈에 삽입되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  62. 서열번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 SB 단백질.
  63. SB 단백질에 결합할 수 있는 두개 이상의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하고, 세포내의 DNA에 삽입될 수 있는 핵산 단편과 서열번호:1과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 SB 단백질인 전이효소를 분화다능(pluripotent) 또는 분화전능(totipotent) 세포에 도입하는 단계; 및
    상기 세포를 동물로 성장시키는 단계를 포함하는 유전자 이식 동물의 제조방법.
  64. 제 63항에 있어서, 분화다능(pluripotent) 또는 분화전능(totipotent) 세포는 난모세포, 배아세포, 난세포(egg) 및 간세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 63항에 있어서, 도입단계가 미세주입; 일렉트로포레이숀; 핵산 단편과 양이온성 지질 운반체 또는 DNA 축합시약과의 혼합; 및 핵산 단편의 바이러스 벡터로 의 삽입과 상기 바이러스 벡터의 세포와의 접촉으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법을 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 바이러스 벡터가 리트로바이러스 벡터(retroviral vactor), 아데노바이러스 벡터(adenovirus vactor) 또는 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated viral vactor) 또는 헤르페스 바이러스(herpes virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 63항에 있어서, 동물이 마우스, 어류, 유제류 동물, 조류 또는 양인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. SB 단백질에 결합할 수 있는 두개 이상의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하고, SB 단백질의 존재하에서 세포내의 DNA에 삽입될 수 있는 핵산 단편을 도입하는 단계를 포함하는 세포내의 DNA로 핵산을 도입하는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, SB 단백질을 세포로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
  70. 제 68항에 있어서, SB 단백질이 서열번호:1과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 69항에 있어서, SB 단백질이 RNA로서 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 68항에 있어서, 세포가 SB 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 72항에 있어서, SB 단백질을 암호화하는 핵산이 세포의 게놈으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 72항에 있어서, SB 단백질이 세포내에서 안정적으로 발현되는 것을 특징으로하는 방법.
  75. 제 72항에 있어서, SB 단백질이 유도 프로모터(inducible promotor)의 조절을 받는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 68항에 있어서, 도입 단계가 미세주입; 일렉트로포레이숀; 핵산 단편과 양이온성 지질 운반체 또는 DNA 축합시약과의 혼합; 및 핵산 단편의 바이러스 벡터로의 삽입과 상기 바이러스 벡터의 세포와의 접촉으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포에 핵산을 도입하는 방법을 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
  77. 제 76항에 있어서, 바이러스 벡터가 리트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 68항에 있어서, SB 단백질 또는 SB 단백질을 암호화하는 RNA를 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로하는 방법.
  79. 제 68항에 있어서, 세포가 분화전능 또는 분화다능 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 79항의 방법으로 제조된 유전자 이식 동물.
  81. 제 68항에 있어서, 핵산 서열이 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 68항에 있어서, 단백질이 표식(marker) 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 81항의 단백질을 제조하는 세포.
  84. 제 81항의 방법으로 제조된 재조합 단백질을 생산하는 유전자 이식 동물.
  85. 핵산의 세포의 DNA로의 삽입을 촉매할 수 있고; 서열번호:4 또는 5의 역위 반복부 서열과 결합할 수 있으며, 서열번호:1과 80% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 단백질.
  86. 전이효소 활성; 약 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에서 약 35 kD 내지 약 40 kD의 분자량 범위; 및 NLS 서열, DNA 결합 영역 및 촉매 영역을 포함하고, 비-상동성 재조합에 의해 얻어지는 수준과 비교하면, 약 5배 이상 증진된 핵산 단편의 세포의 핵산으로의 도입율을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질.
  87. 제 84항 또는 제 85항의 단백질을 제 1항에 따른 핵산 단편을 함유하는 DNA를 포함하는 세포에 도입하여 핵산 단편을 세포 DNA내의 제 1위치에서 세포 DNA내의 제 2위치로 이동시키는 단계를 포함하는 세포내의 핵산 서열을 이동시키는 방법.
  88. 제 87항에 있어서, 세포 DNA가 게놈 DNA인 것을 특징으로하는 방법.
  89. 제 87항에 있어서, 세포 DNA내의 제 1위치가 염색체외 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 87항에 있어서, 세포 DNA내의 제 2위치가 염색체외 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제 87항에 있어서, 단백질이 핵산으로서 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. SB 단백질에 결합할 수 있는 두개 이상의 역위 반복부 사이에 위치하는 핵산 서열을 포함하고, SB 단백질의 존재하에서 세포내의 DNA에 삽입될 수 있는 핵산 단편 및 SB 단백질을 세포내로 도입하는 단계;
    세포의 DNA를 핵산 서열을 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키는 단계;
    역위 반복부 서열을 동정하는 단계;
    오픈 리딩 프레임으로부터 DNA 서열를 얻기 위해 역위 반복부 서열에 가까운 핵산을 서열화하는 단계;및
    DNA 서열을 컴퓨터 데이타베이스의 서열 정보와 비교하는 단계를 포함하는 세포 게놈내의 유전자를 동정하는 방법.
  93. 제 92항에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)가 6-염기 인식서열을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제 93항에 있어서, 소화단계가 소화된 단편을 복제(cloning) 또는 상기 소화된 단편을 PCR 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 프로모터에 작동적으로(operably) 연결된 유전자를 포함하며, 상기 유전자 및 프로모터가 SB 단백질에 결합할 수 있는 역위 반복부에 의해 플랭킹된 것을 특징으로하는 안정적인 유전자 이식 척추동물 라인(line),
  96. 제 95항에 있어서, SB 단백질이 서열번호:1 또는 서열번호:1과 80% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 안정적인 유전자 이식 척추동물 라인.
  97. 제 96항에 있어서, 척추동물이 어류인 것을 특징으로 하는 안정적인 유전자 이식 척추동물 라인.
  98. 제 97항에 있어서, 척추동물이 제브라물고기인 것을 특징으로 하는 안정적인 유전자 이식 척추동물 라인.
  99. 제 96항에 있어서, 척추동물이 마우스인 것을 특징으로 하는 안정적인 유전자 이식 척추동물 라인.
  100. 서열번호:4, 서열번호:5, 서열번호:6, 서열번호:7, 서열번호:8, 서열번호:9, 또는 서열번호:10 중 하나 이상에 결합할 수 있는 전이효소 활성을 갖는 단백질.
  101. SB 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체.
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