KR20200121834A - 변이체 cd3-결합 도메인 및 질환 치료를 위한 병용 요법에서의 그것의 용도 - Google Patents

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KR20200121834A
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에지오 본비니
링 후앙
치아-잉 카오 람
구루나드흐 레디 치칠리
랄프 프로만 알더슨
폴 에이. 무어
레슬리 에스. 존슨
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마크로제닉스, 인크.
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Abstract

본 발명은 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인, CDRH3 도메인, CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함하고, 이것들 중 적어도 하나는 rCD3-결합 도메인의 상응하는 CDR의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이며, 여기서 이러한 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 이러한 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해, CD3에 대한 변경된 친화성을 나타낸다. 발명은 특히 CD3에 대한 감소된 친화성을 나타내며 DA를 발현하는 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있고 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 나타내는 vCD3-결합 도메인을 포함하는 그러한 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 암 및 병원체-관련 질환의 치료에서의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 분자(들)를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

변이체 CD3-결합 도메인 및 질환 치료를 위한 병용 요법에서의 그것의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 특허 출원 일련 번호 62/631,043 (2018년 2월 15일에 출원됨; 계류중), 및 62/738,632 (2018년 9월 28일에 출원됨; 계류중)에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 컴퓨터-판독 가능한 매체 (파일명: 1301_0150PCT_ST25.txt, 2019년 1월 30일에 생성되고, 295,037 바이트의 크기임)에 개시된, 37 C.F.R. 1.821에 따른 하나 이상의 서열 목록 (이하 참조)을 포함하며, 상기 파일은 그 전체가 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 CD3-결합 도메인 및 또한 질환 항원 ("DA")의 에피토프에 결합할 수 있는 질환 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자 (예컨대, 이중특이적 항체, 디아바디, 이중특이적 scFv, 3가 분자, TandAb®, BiTE® 등) (예컨대, "DA x CD3 결합 분자")에 관한 것이다. 발명은 특히 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인, CDRH3 도메인, CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 참조 CD3-결합 도메인 ("rCD3-결합 도메인")의 상응하는 CDR의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 그러한 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이며, 이러한 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 이러한 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 CD3에 대한 변경된 친화성을 나타낸다. 발명은 특히 CD3에 대한 감소된 친화성을 나타내며 DA를 발현하는 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있고 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 나타내는, vCD3-결합 도메인을 포함하는 그러한 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 암 및 병원체-관련 질환의 치료에서의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 분자(들)를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.
I. 포유류 면역 체계
포유류 면역 체계는 예컨대, 손상, 감염 및 신생물을 포함한 다양한 상태에 대한 방어로서 작용한다. 인간 및 다른 포유류가 병원체, 외래 물질 및 암 항원에 대해 면역학적 반응을 발생시키는 효율은 두 가지 특성에 달려 있다: 항원 인식에 대한 면역 반응의 정교한 특이성, 및 동일한 항원으로 재활성화될 때 더 빠르고 더 활발한 반응을 허용하는 면역학적 기억 (Portoles, P. et al. (2009) "The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination", Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex", Immunol Rev. 232(1):7-21; Topalian, S.L. et al. (2015) "Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy", Cancer Cell 27:450-461).
건강한 개체에서, 면역 체계는 정지 상태로 있고, 다양한 억제 수용체의 레퍼토리 및 수용체 리간드에 의해 억제된다. 암 항원, 미생물 병원체, 또는 알레르기 유발원이 인식될 때, 활성화 수용체 어레이 및 수용체 리간드는 면역 체계의 활성화를 유도하도록 촉발된다. 이러한 활성화는 대식세포, 천연 살해 (NK) 세포 및 항원-특이적, 세포독성 T-세포의 활성화로 이어지고, 다양한 사이토카인의 방출을 촉진하며, 다양한 사이토카인은 전부 대상체의 건강에 대한 인지된 위협에 대해 대항하는 작용을 한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1):39-48; Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation", Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy", Adv. Immunol. 90:297-339). 면역 체계는 상쇄하는 억제 신호가 활성화 면역 신호보다 더 클 때 그것의 정지 상태로 복귀될 수 있다.
그러므로, 암의 질환 상태 (및 실제로 감염성 질환의 질환 상태)는 대상체의 면역 체계를 적절하게 활성화하지 못한 것을 반영하는 것으로 여겨질 수 있다. 이러한 실패는 활성화 면역 신호의 부적절한 제시를 반영하는 것이거나, 또는 대상체에서 억제 면역 신호를 경감시키는 부적절한 능력을 반영하는 것일 수 있다. 일부 경우에, 연구자들은 암 세포가 면역 체계에 의해 탐지되는 것을 피하기 위하여 면역 체계를 끌어들일 수 있는 것을 밝혀냈다 (Topalian, S.L. et al. (2015) "Immune Checkpoint Blockade: A Common Denominator Approach to Cancer Therapy", Cancer Cell 27:450-461).
포유류 면역 체계는 2개의 별도의, 그러나 상호관련된 체계: 체액성 면역 체계 및 세포 면역 체계에 의해 매개된다. 일반적으로 말하자면, 체액성 체계는 B 세포에 의해 생성된 가용성 분자 (항체 또는 면역글로불린)에 의해 매개된다. 이러한 분자는 신체에 대해 외래인 것으로서 인식된 항원과 조합하여 중화시키는 능력을 가진다. 세포 면역 체계는 다양한 치료 역할을 수행하는, "T-세포"로 명명된 특정 세포의 이동(mobilization)을 포함한다. T-세포는 흉선에서 성숙하고 조직, 림프계 및 순환계 사이에서 순환하는 림프구이다. 외래 구조물 (항원)의 존재 및 인식에 대한 반응으로, T-세포는 면역 반응을 개시하기 위하여 "활성화"된다. 많은 경우에, 이들 외래 항원은 숙주 세포에서 신생물 또는 감염의 결과로서 발현된다. 비록 T-세포가 자체로는 항체를 분비하지 않지만, 그것은 일반적으로 림프구의 제2 부류, "B 세포" (골수로부터 유래됨)에 의한 항체 분비에 필요하다. 결정적으로, T-세포는 한 항원을 다른 것으로부터 식별할 수 있게 되도록 특별한 면역학적 특이성을 나타낸다.
T-세포 활성화에는 2가지 상호작용이 필요하다 (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation", Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy", Adv. Immunol. 90:297-339). 제1 상호작용으로, 세포는 그것이 나이브 T 림프구의 T 세포 수용체 ("TCR")에 결합할 수 있도록 세포의 부류 I 또는 부류 II 주요 조직적합성 복합체 ("MHC")에 결합된 관련 표적 항원을 나타내야 한다. 비록 거의 모든 세포 유형이 항원-제공 세포로서 작용할 수 있지만, 일부 세포, 예컨대 대식세포, B 세포, 및 수지상 세포는 외래 항원을 제공하는 데 있어서 전문화되고, "전문적인" "항원-제공 세포"이다. 항원-제공 세포의 MHC I 분자에 결합된 항원의 면역학적 검출은 세포독성 T-세포의 생성으로 이어진다. 항원-제공 세포의 MHC II 분자에 결합된 항원의 면역학적 검출은 세포독성 T-세포의 생성으로 이어진다. 제2 상호작용으로, 항원-제공 세포의 리간드는 T-세포의 공-수용체에 결합해야 한다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation", Immunol. Rev. 229:307-321). 두 자극 신호를 모두 경험하는 T-세포는 그런 후에 사이토카인 (예컨대 인터류킨-2 및 인터류킨-12)에 반응할 수 있다.
TCR 참여 중에 두 공-자극 신호의 부재시에, T-세포는, 클론성 무반응으로 언급되는, 기능적으로 반응할 수 없는 상태에 들어간다 (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors", Exp. Pharmacol. 181:291-328). 병리학적 상태에서, T-세포는 다양한 장기-특이적 자가면역 질환, 예컨대 제1형 당뇨병, 류머티스양 관절염, 및 다발성 경화증의 핵심 플레이어이다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1):39-48).
이러한 면역 "체크포인트" 경로는 자기 관용을 유지하는 데 (즉, 대상체가 그/그녀 자신의 세포에 대한 면역 체계 공격 ("자가면역" 반응)이 발생시키는 것을 방지하는 데) 및 항-미생물 또는 항-알레르기 면역 반응 중에 부수적인 조직 손상을 제한하는 데 중요하다. T-세포의 접촉이 2가지 필요한 신호 중 오직 하나만의 생성을 초래하는 경우, T-세포는 활성화되지 못하고 적응성 면역 반응이 일어나지 않는다. 그러므로 T-세포 활성화의 "2가지 신호" 메커니즘은 면역 체계가 원치 않는 반응, 예컨대 그렇지 않으면 대상체 자체 세포에 대한 면역 체계 공격 ("자가면역" 반응)을 초래하게 될 자기 항원에 대한 반응을 피하는 방법을 제공한다.
II. 세포 면역 체계의 세포 표면 분자
A. CD3, CD4 및 CD8
면역 체계의 세포는 그것의 특수화된 당단백질 세포 표면 분자의 발현을 특징으로 한다. 이러한 분자와 다른 세포 촉발자의 분자 사이의 상호작용은 면역 반응을 유지시키거나 약화시킨다. 특히, 모든 T-세포는 그것의 CD3의 발현을 특징으로 한다. CD3은 4개의 구별되는 사슬로 구성된 T-세포 공-수용체이다 (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation of Signaling", Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function, And Role Of Immunostaining In Clinical Practice", J. Pathol. 173(4):303-307; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex", Immunol. Rev. 232(1):7-21).
포유류에서, 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 및 2개의 CD3ε 사슬을 함유한다. 이들 사슬은 T 림프구에서 활성화 신호를 생성하기 위하여 TCR과 연관된다 (Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) "T Cell Activation", Annu. Rev. Immunol. 27:591-619). CD3의 부재시에는, TCR은 적절하게 조립되지 못하고 분해된다 (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer", Immunology 129(2):170-177). CD3은 모든 성숙 T-세포의 구성원에 결합되는 것으로 나타나고, 실제로 다른 세포 유형은 없다 (Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease", 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer", Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex", Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139 참조).
T-세포 상의 TCR 복합체의 변이체 CD3ε 신호전달 구성요소는 T-세포와 암 세포 사이의 면역학적 시냅스의 형성을 강제하기 위한 표적으로서 사용되어 왔다. CD3 및 종양 항원의 공동 참여는 T-세포를 활성화시켜서, 종양 항원을 발현하는 암 세포의 용해를 촉발시킨다 (Baeuerle et al. (2011) "Bispecific T-cell Engager For Cancer Therapy", In: BISPECIFIC ANTIBODIES, Kontermann, R.E. (Ed.) Springer-Verlag; 2011:273-287). 이 접근법은 이중특이적 항체가 암세포에 대한 높은 특이성을 가진 T-세포 구획과 전체적으로 상호작용하는 것을 허용하고 세포 표면 종양 항원의 광범위한 어레이에 폭넓게 적용될 수 있으며 또한 표적 병원체-감염 세포에 실시되어 왔다 (예컨대, Sloan et al. (2015) "Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells", PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233; WO 2014/159940; 및 WO 2016/054101 참조).
"헬퍼 T-세포"로서 알려져 있는, T-세포의 제1 하위세트는 CD4의 발현을 특징으로 한다 (즉, 그것은 CD3+일뿐만 아니라 "CD4+"이다). CD4+ T-세포는 대부분의 포유류 면역 및 자가면역 반응의 필수 조직자이다 (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1):39-48). CD4+ T-세포의 활성화는 항원-제공 세포 (예컨대 B-세포, 대식세포 또는 수지상 세포)의 표면에서 배열되는 항원:주요 조직적합성 부류 II (MHC II) 분자 복합체와, 나이브 CD4+ T-세포의 표면에서 배열되는 2개의 분자, TCR 및 CD3 세포 표면 수용체 리간드의 복합체 사이의 공-자극 상호작용을 통해 매개되는 것으로 나타났다. 활성화된 T 헬퍼 세포는 표적 세포에 대한 염증 반응을 매개할 수 있는 Th1 세포로 증식할 수 있다.
"세포독성 T-세포"로서 알려져 있는, T-세포의 제2 하위세트는 CD8의 발현을 특징으로 한다 (즉, 그것은 CD3+일뿐만 아니라 "CD8+"이다). CD8은 세포독성 T-세포에서 발현되는, 2개의 구별되는 사슬로 구성된 T-세포 공-수용체이다 (Leahy, D.J. (1995) "A Structural View of CD4 and CD8", FASEB J. 9:17-25). CD8+ T-세포의 활성화는 표적 세포의 표면에서 배열되는 항원:주요 조직적합성 부류 I (MHC I) 분자 복합체와 CD8+ T-세포의 표면에서 배열되는 CD8과 T-세포 수용체의 복합체 사이의 공-자극 상호작용을 통해 매개되는 것으로 나타났다 (Gao, G. et al. (2000) "Molecular Interactions Of Coreceptor CD8 And MHC Class I: The Molecular Basis For Functional Coordination With The T-Cell Receptor", Immunol. Today 21:630-636). 특정 면역 체계 세포에 의해서만 발현되는 주요 조직적합성 부류 II (MHC II) 분자와 달리, MHC I 분자는 매우 광범위하게 발현된다. 그러므로, 세포독성 T-세포는 광범위한 세포 유형에 결합할 수 있다. 활성화된 세포독성 T-세포는 그것의 세포독소 퍼포린, 그랜자임, 및 그래뉼리신의 방출을 통해 세포 살해를 매개한다. 퍼포린의 작용을 통해, 그랜자임은 표적 세포의 세포질로 들어가고 그것의 세린 프로테아제 기능은, 궁극적으로 표적화된 세포의 세포자멸사 (프로그래밍된 세포 사멸)로 이어지는 일련의 시스테인 프로테아제인 카스파제 캐스케이드를 촉발시킨다.
B. T-세포 수용체 ("TCR")
T-세포 수용체 ("TCR")는 CD4+ 또는 CD8+ T-세포에 의해 천연적으로 발현되며, 이러한 세포가 항원-제공 세포의 부류 I 또는 부류 II MHC 단백질에 의해 결합되고 제공되는 항원 펩타이드를 인식하는 것을 허용한다. TCR에 의한 pMHC (펩타이드-MHC) 복합체의 인식은 사이토카인의 생성 및 항원-제공 세포의 용해로 이어지는 세포 면역 반응의 전파를 개시한다 (예컨대, Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes", Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy", Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation", Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes", Am. J. Ther. 12(6):534-550 참조). CD3은 TCR에 결합하는 수용체이다 (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer", Immunology 129(2):170-177; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex", Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) "Novel Targeted Therapies For Autoimmunity", Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy", Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) "T Cell Activation", Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) "Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression", Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309).
TCR 및 CD3 복합체는, CD3 ζ 사슬 제타 사슬 (also 또한 T-세포 수용체 T3 제타 사슬 또는 CD247로도 알려짐)과 함께 "TCR 복합체"를 포함한다 (van der Merwe, P.A. etc. (epub Dec. 3, 2010) "Mechanisms For T Cell Receptor Triggering", Nat. Rev. Immunol. 11:47-55; Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology of the T Cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling", Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140). 이 복합체는 이것이 큰 수 (10)의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유하기 때문에 특히 중요하다.
CD3 결합 도메인 및 표적 세포에서 발현된 질환 항원 ("DA")에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자는 그러한 표적 세포의 재지시된 T-세포 살해를 매개할 수 있다. 그러나, 이러한 분자의 CD3에 대한 친화성으로 인해, 이러한 분자는 자극된 T-세포로부터 바람직하지 못한 사이토카인 방출을 나타내기에는 너무 강력할 수 있다.
그러므로, 포유류 면역 반응에 관여하는 분자를 확인하는 데 있어 이전의 진전에도 불구하고, 암 및 감염성 질환을 치료하기 위한 개선된 치료법에 대한 필요성이 남아 있다. 본 바령은 치료 창을 증강시키기 위해 이러한 다중특이적 분자의 세포 살해 및/또는 사이토카인 방출을 조절하기 위해 사용될 수 있는 광범위한 결합 동역학을 가지는 변이체 CD3-결합 도메인의 패널을 제공한다. 본 발명은 이런 목적 및 다른 목적에 관한 것이다.
본 발명은 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 CD3-결합 도메인 및 또한 질환 항원 ("DA")의 에피토프에 결합할 수 있는 질환 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자 (예컨대, 이중특이적 항체, 디아바디, 이중특이적 scFv, 3가 분자, TandAb®, BiTE® 등) (예컨대, "DA x CD3 결합 분자")에 관한 것이다. 발명은 특히 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인, CDRH3 도메인, CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 참조 CD3-결합 도메인 ("rCD3-결합 도메인")의 상응하는 CDR의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 그러한 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이며, 이러한 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 이러한 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 CD3에 대한 변경된 친화성을 나타낸다. 발명은 특히 CD3에 대한 감소된 친화성을 나타내며 DA를 발현하는 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있고 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 나타내는, vCD3-결합 도메인을 포함하는 그러한 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 암 및 병원체-관련 질환의 치료에서의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 분자(들)를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.
상세하게 설명하면, 발명은 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 CD3-결합 도메인 및 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 질환 항원-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자를 제공하며, 여기서 CD3-결합 도메인은:
(I) (A) SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95 및 SEQ ID NO:97로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
(II) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(C) SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105 및 SEQ ID NO:107로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
(III) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(F) SEQ ID NO:109 또는 SEQ ID NO:111로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
(IV) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(E) SEQ ID NO:113 및 SEQ ID NO:115로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인
을 포함한다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예를 포함하며, 여기서 CD3-결합 도메인은:
(I) (A) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(B) SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104 및 SEQ ID NO:106으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 또는
(II) (A) SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112; 및 SEQ ID NO:114로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(B) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인
을 포함한다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 DA x CD3 결합 분자는 이중특이적 항체, 이중특이적 디아바디, 이중특이적 scFv, 이중특이적 TandAb, 또는 3가 결합 분자이다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 DA x CD3 결합 분자는 하나 이상의 질환 항원 및/또는 이펙터 세포의 상이한 세포 표면 분자에 결합할 수 있다. 특히, 이펙터 세포의 상이한 세포 표면 분자는 CD2, CD8, CD16, TCR, NKp46, 또는 NKG2D이다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 질환 항원은 암 항원, 또는 병원체-관련 항원이다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 암 항원은 암 항원: 19.9, 4.2, ADAM-9, AH6, ALCAM, B1, B7-H3, BAGE, 베타-카테닌, 혈액형 ALeb/Ley, 버킷 림프종 항원-38.13, C14, CA125, 카르복시펩티다제 M, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD36, CD40/CD154, CD45, CD56, CD46, CD52, CD56, CD79a/CD79b, CD103, CD123, CD317, CDK4, CEA, CEACAM5/CEACAM6, CO17-1A, CO-43, CO-514, CTA-1, CTLA-4, 사이토케라틴 8, D1.1, D156-22, DR5, E1 시리즈, EGFR, 에프린 수용체, EphA2, Erb, GAGE, GD2/GD3/GM2 강글리오시드, GICA 19-9, gp100, Gp37, gp75, gpA33, HER2/neu, HMFG, 인간 유두종 바이러스-E6/인간 유두종 바이러스-E7, HMW-MAA, I 항원, IL13Rα2, 인테그린 β6, JAM-3, KID3, KID31, KS 1/4 pan-암종 항원, L6,L20, LEA, LUCA-2, M1:22:25:8, M18, M39, MAGE, MART, 메소텔린, MUC-1, MUM-1, Myl, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, 네오당단백질, NS-10, OFA-1, OFA-2, 온코스타틴 M, p15, p97, PEM, PEMA, PIPA, PSA, PSMA, 전립선 산 포스페이트, R24, ROR1, 스핑고지질, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, sTn, T-세포 수용체 유래 펩타이드, T5A7, TAG-72, TL5, TNF-수용체, TNF-γ 수용체, TRA-1-85, 트랜스페린 수용체, 5T4, TSTA, VEGF, VEGF 수용체, VEP8, VEP9, VIM-D5, 및 Y 합텐, Ley로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
발명은 특히 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 암 항원은 B7-H3, CEACAM5/CEACAM6, EGRF, EphA2, gpA33, HER2/neu, VEGF, 5T4, IL13Rα2, CD123, CD19, 또는 ROR1이다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 병원체-관련 항원은 병원체-관련 항원: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 DA x CD3 결합 분자는 서로에게 공유적으로 결합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하며, 여기서:
(A) 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
(i) (1) 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLDA)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및
(2) CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하고,
하위도메인 1A 및 1B는 펩타이드 링커에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1; 및
(ii) 헤테로다이머-촉진 도메인인 도메인 2를 포함하고;
(B) 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
(i) (1) CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및
(2) 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHDA)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하고;
하위도메인 1A 및 1B는 펩타이드 링커에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1; 및
(ii) 헤테로다이머-촉진 도메인인 도메인 2를 포함하며,
여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 상이하고;
(a) 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인은 회합하여 질환 항원-결합 도메인을 형성하며, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 회합하여 CD3-결합 도메인을 형성하거나; 또는
(b) 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인 및 제2폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인은 회합하여 CD3-결합 도메인을 형성하며, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인 및 제2폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 회합하여 질환 항원-결합 도메인을 형성한다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서:
(a) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 E-코일 도메인이고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 K-코일 도메인이거나; 또는
(b) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 K-코일 도메인이고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 E-코일 도메인이다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 제1 또는 제2 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 도메인 3을 추가적으로 포함한다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 DA x CD3 결합 분자는 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드 사슬을 추가로 포함한다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 DA x CD3 결합 분자는 CD8-결합 도메인을 추가로 포함한다.
발명은 추가적으로 이러한 DA x CD3 결합 분자의 구체예와 관련되며, 여기서 DA x CD3 결합 분자는:
(I) (A) SEQ ID NO:179를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:175를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(II) (A) SEQ ID NO:184를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:181을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(III) (A) SEQ ID NO:196을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:186을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(IV) (A) SEQ ID NO:197을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:192를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(V) (A) SEQ ID NO:193을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:194를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(VI) (A) SEQ ID NO:179를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:175를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
(C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
(D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
(VII) (A) SEQ ID NO:184를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:181을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
(C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
(D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
(VIII) (A) SEQ ID NO:196을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:186을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
(C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
(D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
(IX) (A) SEQ ID NO:193을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:194를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
(C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
(D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드
를 포함한다.
발명은 추가적으로 상기 기술된 DA x CD3 결합 분자 중 어느 것 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물에 관련된다.
발명은 추가적으로 상기 기술된 DA x CD3 결합 분자 중 어느 것 또는 상기 기술된 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 방법에 관련된다.
발명은 추가적으로 이러한 방법의 구체예에 관련되며, 여기서 질환은 암이다. 구체예를 포함하여, 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비-소세포 폐암, 혈액암, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 망막 세포 암종, 고환암, 및 자궁암으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
발명은 추가적으로 이러한 방법의 구체예에 관련되며, 여기서 질환은 병원체-관련 항원이 병원체-관련 항원: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 구체예를 포함한, 병원체-관련 질환이다.
발명은 추가적으로 상기 기술된 DA x CD3 결합 분자 중 어느 것 또는 상기 기술된 제약학적 조성물의 질환 치료에서의 용도에 관련된다.
발명은 추가적으로 이러한 용도의 구체예에 관련되며, 여기서 질환은 암이다. 암이 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비-소세포 폐암, 혈액암, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 망막 세포 암종, 고환암, 및 자궁암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 구체예가 포함된다.
발명은 추가적으로 이러한 용도의 구체예에 관련되며, 여기서 질환은 병원체-관련 질환이다. 병원체-관련 항원이 병원체-관련 항원: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 구체예가 포함된다.
도 1A-1B는 각각이 E-코일 또는 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인 (대체 헤테로다이머-촉진 도메인은 하기에 제공됨)을 가지는 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 2개의 에피토프-결합 도메인을 가지는 대표적인 공유 결합된 디아바디의 개략도를 도시한다. 시스테인 잔기가 링커에 (도 1A) 및/또는 헤테로다이머-촉진 도메인에 (도 1B) 존재할 수 있다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 충전 패턴을 사용하여 도시된다.
도 2는 각각이 CH2 및 CH3 도메인을 가져서 회합된 사슬이 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 형성하게 되는 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 2개의 에피토프-결합 도메인을 가지는 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 도시한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 충전 패턴을 사용하여 도시된다.
도 3A-3C는 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬 (즉, 전부 4개의 폴리펩타이드 사슬)로 구성된 4개의 에피토프-결합 도메인을 가지는 대표적인 공유 결합된 4가 디아바디를 보여주는 개략도를 도시한다. 각 쌍의 한 폴리펩타이드는 CH2 및 CH3 도메인을 가져서, 회합된 사슬은 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 형성하게 된다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 충전 패턴을 사용하여 도시된다. 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬은 동일할 수 있다. 이러한 구체예에서, 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬이 동일하고 VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하면 (도 3A-3B에서 도시됨), 결과적으로 생성되는 분자는 4개의 에피토프-결합 도메인을 가지며 이중특이적이고 각각의 결합된 에피토프와 관련하여 2가이다. 이러한 구체예에서, VL 및 VH 도메인이 동일한 에피토프를 인식하면 (예컨대, 동일한 VL 도메인 CDR 및 동일한 VH 도메인 CDR이 두 사슬에서 사용됨) 결과적으로 생성되는 분자는 4개의 에피토프-결합 도메인을 가지며 단일특이적이고 단일 에피토프와 관련하여 4가이다. 대안으로, 두 쌍의 폴리펩타이드는 상이할 수 있다. 이러한 구체예에서, 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬이 상이하고 각 쌍의 폴리펩타이드의 VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하면 (도 3C에서 상이한 음영 및 패턴으로 도시됨), 결과적으로 생성되는 분자는 4개의 에피토프-결합 도메인을 가지며 사중특이적이고 각각의 결합된 에피토프에 관련하여 1가이다. 도 3A는 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 Fc 도메인-함유 디아바디를 나타낸다. 도 3B는 시스테인 잔기 및 링커 (선택적 시스테인 잔기를 포함함)를 ㅍ포함하는 E-코일 및 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 Fc 도메인-함유 디아바디를 나타낸다. 도 3C는 헤테로다이머화를 촉진하기 위하여 항체 CH1 및 CL 도메인을 함유하는 Fc 도메인-함유 디아바디를 나타낸다.
도 4A-4B는 3개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 2개의 에피토프-결합 도메인을 가지는 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 도시한다. 폴리펩타이드 사슬 중 2개는 CH2 및 CH3 도메인을 가져서, 회합된 사슬은 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 형성한다. VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 추가로 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 충전 패턴을 사용하여 도시된다.
도 5는 5개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 4개의 에피토프-결합 도메인을 가지는 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 도시한다. 폴리펩타이드 사슬 중 2개는 CH2 및 CH3 도메인을 가져서, 회합된 사슬은 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 형성한다. 연결된 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 추가로 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 충전 패턴을 사용하여 도시된다.
도 6A-6F는 3개의 에피토프-결합 도메인을 가지는 대표적인 Fc 도메인-함유 3가 결합 분자의 개략도를 도시한다. 도 6A 및 6B는 각각, 디아바디-형 결합 도메인이 Fc 도메인에 대해 N-말단 또는 C-말단인 상이한 도메인 방향을 가지는 2개의 디아바디-형 결합 도메인 및 하나의 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6A 및 6B의 분자는 4개의 사슬을 포함한다. 도 6C 및 6D는 각각, Fc 도메인에 대해 N-말단의 2개의 디아바디-형 결합 도메인, 및 경쇄 및 중쇄가 폴리펩타이드 스페이서를 통해 연결되어 있는 Fab-형 결합 도메인, 또는 scFv-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6E 및 6F의 3가 결합 분자는, 각각 Fc 도메인에 대해 C-말단의 2개의 디아바디-형 결합 도메인, 및 경쇄 및 중쇄가 폴리펩타이드 스페이서를 통해 연결되어 있는 Fab-형 결합 도메인, 또는 scFv-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6C-6F의 3가 결합 분자는 3개의 사슬을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 충전 패턴을 사용하여 도시된다.
도 7A-7D는 CTL 및 결합 검정의 결과를 도시한다. 도 7A는 CD3 mAb 1; CD3 mAb 1 M1; CD3 mAb 1 M2; CD3 mAb 1 M15; CD3 mAb 1 M17; CD3 mAb 1 M18; CD3 mAb 1 M19; 및 CD3 mAb 1 M20의 VL 및 VH 도메인을 함유하는 DART-A-형 디아바디 구성물에 의해 매개된 대표적인 재지시된 세포 사멸의 결과 (CTL 검정에서 % 세포독성)를 나타낸다. 도 7B-7C는 표 11-12에서 보고된 친화성 상수 (도 7B: KD; 도 7C: ka; 및 도 7D: kd)와 CTL 활성 (18시간째에 세포용해의 EC50) 사이의 상관관계를 도표로 나타낸다.
도 8A-8E는 Pan-T 이펙터 세포 및 MV-4-11 백혈병 표적 세포를 사용하여, CD3 mAb 1; CD3 mAb 1 M2; CD3 mAb 1 M7; CD3 mAb 1 M13; 및 CD3 mAb 1 M15의 VL 및 VH 도메인을 함유하는 DART A-형 디아바디 구성물에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구 (CTL 검정)의 결과를 도시한다. 퍼센트 세포독성은 도 8A에 도표화된다. 사이토카인 반응은 도 8B-8E에 도표화된다 (도 8B: IFN-감마; 도 8C: TNF-알파; 도 8D: IL-6; 도 8D: IL-2); NegCtrl: 음성 대조군.
도 9A-9B는 질환 항원에 결합하는 DART-B-형 디아바디의 능력을 도시한다. 도 9A는 CD123-발현 MOLM-13 세포에 결합하는 CD123-WT, CD123-M1, CD123-M2 및 CD123-M18 DART-B-형 디아바디의 능력을 나타낸다. 도 9B는 5T4-발현 A498 세포에 결합하는 5T4-WT, 5T4-M1, 5T4-M2, 및 5T4-M18 DART-B-형 디아바디의 능력을 나타낸다. 결합은 디아바디' E/K 코일에 특이적인 비오티닐화된 항체 및 스트렙트아비딘-피코에리트린 (PE)을 사용하여 검출되었다.
도 10A-10B는 CD8+ T-세포 (도 10A) 및 CD4+ T-세포 (도 10B)에 결합하는 CD123-WT, CD123-M1, CD123-M2 및 CD123-M18 DART-B-형 디아바디의 능력을 도시한다.
도 11A-11Q는 Pan-T 이펙터 세포 및 MOLM-13 급성 단핵세포성 백혈병 (AML) 표적 세포를 사용하는, CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐): CD123-WT (도 11B, 11F, 11J 및 11N), CD123-M2 (도 11C, 11G, 11K 및 11O), CD123-M18 (도 11D, 11H, 11L 및 11P), HIV-WT (도 11E, 11I, 11M 및 11Q)에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구 (CTL 검정) 결과를 도시한다. 퍼센트 세포독성은 도 11A에 도표화된다. 사이토카인 반응 및 퍼센트 세포독성은 도 11B-11Q에 도표화된다 (도 11B-11E: IFN-감마; 도 11F-11I: TNF-알파; 도 11J-11M: IL-6; 도 11N-11Q: IL-2)
도 12A-12E는 PBMC 이펙터 세포 및 MOLM-13 AML 표적 세포를 사용하는, CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐)에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구 (CTL 검정) 결과를 도시한다. 퍼센트 세포독성은 도 12A에 도표화된다 (E:T= 15:1, 24 h). 사이토카인 반응은 도 12B-12E에 도표화된다 (도 12B: IFN-감마; 도 12C: TNF-알파; 도 12D: IL-6; 도 12E: IL-2).
도 13A-13Q는 Pan-T 이펙터 세포 및 A498 망막 세포 암종 표적 세포 (E:T= 5:1, 24 h)를 사용하는, 5T4 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐) 5T4-WT (도 13B, 13F, 13J 및 13N), 5T4-M2 (도 13C, 13G, 13K 및 13O), 5T4-M18 (도 13D, 13H, 13L 및 13P), HIV-WT (도 13E, 13I, 13M 및 13Q)에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구 (CTL 검정) 결과를 도시한다. 세포독성은 도 13A에 도표화된다. 사이토카인 반응 및 퍼센트 세포독성은 도 13B-13Q에 도표화된다 (도 13B-13E: IFN-감마; 도 13F-13I: TNF-알파; 도 13J-13M: IL-6; 도 13N-13Q: IL-2).
도 14A-14J는 PBMC (도 14A-14E) 또는 Pan-T 이펙터 세포 (도 14F-14J) (PBMC의 경우 E:T= 30:1 및 Pan-T-세포의 경우 10:1, 24-48 h)를 사용하는, CD19 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐)에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구 (CTL 검정) 결과를 도시한다. 퍼센트 세포독성 (48 hrs)은 도 14A (PBMCs) 및 도 14F (Pan-T-세포)에 도표화된다. PBMC를 사용하여 48시간 째의 사이토카인 반응은 도 14B-14E (PBMCs) 및 도 14G-14J (Pan T-세포)에 도표화된다 (도 14B 및 14G: IFN-감마; 도 14C 및 14H: TNF-알파; 도 14D 및 14I: IL-6; 도 14E 및 14J: IL-2).
도 15A-15E는 T-세포 활성화를 매개하는 대표적인 CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디의 능력을 도시한다. T-세포 활성화는 CD25 및 CD69의 발현에 영향을 미치는 디아바디의 능력을 평가함으로써 측정되었다. 퍼센트 세포독성은 도 15A에 도표화된다. CD25를 측정함으로써 결정되는 CD4+ T-세포의 활성화는 도 15B에 도표화된다. CD69를 측정함으로써 결정되는 CD4+ T-세포의 활성화는 도 15C에 도표화된다. CD25를 측정함으로써 결정되는 CD8+ T-세포의 활성화는 도 15D에 도표화된다. CD69를 측정함으로써 결정되는 CD8+ T-세포의 활성화는 도 15E에 도표화된다.
도 16A-16E는 T-세포 활성화를 매개하는 대표적인 5T4 x CD3 DART-B-형 디아바디의 능력을 도시한다. T-세포 활성화는 CD25 및 CD69의 발현에 영향을 미치는 디아바디의 능력을 평가함으로써 측정되었다. 퍼센트 세포독성은 도 16A에 도표화된다. CD25를 측정함으로써 결정되는 CD4+ T-세포의 활성화는 도 16B에 도표화된다. CD69를 측정함으로써 결정되는 CD4+ T-세포의 활성화는 도 16C에 도표화된다. CD25를 측정함으로써 결정되는 CD8+ T-세포의 활성화는 도 16D에 도표화된다. CD69를 측정함으로써 결정되는 CD8+ T-세포의 활성화는 도 16E에 도표화된다.
도 17A-17B는 생체내에서 종양의 감소를 매개하는 예시의 CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물의 능력에 대한 생체내 연구 결과를 도시한다. CD123-WT (50 μg/kg) 또는 CD123-M18 (5 μg/kg 또는 50 μg/kg)이 KG1A 세포를 받은 마우스에게 제공되었고, 종양 부피가 35일 동안 평가되었다. 도 17A: CD4; 도 17B: CD8.
도 18A-18D는 생체내에서 종양의 감소를 매개하는 CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물의 능력에 대한 생체내 연구 결과를 도시한다. CD123-WT, CD123-M2 또는 CD123-M18 (0.5, 5 50, 또는 500 μg/kg)이 KG1A 세포를 받은 마우스에게 제공되었고, 종양 부피가 35일 동안 평가되었다. 도 18A: CD123-WT; 도 18B: CD123-M2; 도 18C: CD123-M18; 도 18D: CD123-WT 및 CD123-M18 50 μg/kg 및 500 μg/kg 치료 그룹.
도 19A-19D는 생체내에서 종양의 감소를 매개하는 CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물의 능력에 대한 생체내 연구 결과를 도시한다. CD123-WT, CD123-M2 또는 CD123-M18 (0.5, 5 50, 또는 500 μg/kg)이 MV4-11 세포를 받은 마우스에게 제공되었고, 종양 부피가 35일 동안 평가되었다. 도 19A: CD123-WT; 도 19B: CD123-M18; 도 19C: CD123-M2; 도 19D: CD123-WT, CD123-M2 및 CD123-M18 500 μg/kg 치료 그룹.
도 20A-20B는 생체내에서 종양의 감소를 매개하는 5T4 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물의 능력에 대한 생체내 연구 결과를 도시한다. 5T4-WT (10, 50, 100, 또는 500 μg/kg), 5T4-M18 (10, 50, 100, 또는 500 μg/kg) 또는 5T4-M2 (500 μg/kg)가 SKOV3 세포를 받은 마우스에게 제공되었고, 종양 부피가 45일 동안 평가되었다. 도 20A: 5T4-WT; 도 20B: 5T4-M18 및 5T4-M2.
도 21A-21D는 CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디에 의해 유도된 사이토카인 방출 프로파일에 대한 생체내 연구 결과를 도시한다. 혈청 사이토카인 수준 (pg/ml)이 KG1A 세포를 받았던 마우스에게 CD123-WT, CD123-M2 또는 CD123-M18 (50, 또는 500 μg/kg)의 투여 후 6시간 후에 평가되었다. 도 21A: IFN-γ; 도 21B: TNF-α; 도 21C: IL-6; 및 도 21D: IL-2.
도 22A-22C는 세포 표면 항원에 결합하는 CD123 x CD3 x CD8 3가-형 분자, T-CD123-WT, T-CD123-M1, T-CD123-M2 및 T-CD123-M18의 능력을 도시한다. 도 22A: CD123-발현 MOLM-13 세포에 대한 결합; 도 22B: CD4+ T-세포에 대한 결합; 도 22C: CD8+ T-세포에 대한 결합.
도 23A-23G는 상이한 T-세포 집단을 사용하는, T-CD123-WT, T-CD123-M1, T-CD123-M2 및 T-CD123-M18 CD123 x CD3 x CD8 3가-형 분자에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구 (CTL 검정) 결과를 도시한다. CD3+ Pan-T-세포 (도 23A); CD4+ T-세포 (도 23B) 및 CD8+ T-세포 (도 23C)를 사용하는 퍼센트 세포독성. CD3+ Pan-T-세포를 사용하는 사이토카인 반응은 도 23D-23G에 도표화된다. 도 23D: IFN-γ; 도 23E: TNF-α; 도 23F: IL-6; 및 도 23G: IL-2.
도 24A-24J는 CD123-M18 (10 mg/kg 및 20 mg/kg) 또는 CD123-WT (0.003 mg/kg)로 처리된 시노몰구스 원숭이에서 관찰된 혈청 사이토카인 수준, Ki67 발현, 및 임상 병리 마커 수준을 도시한다. 도 24A: IFN-γ; 도 24B: TNF-α; 도 24C: IL-6; 도 24D: IL-2; 도 24E: IL-15; 도 24F: Ki67 양성 CD4+ T-세포; 도 24G: Ki67 양성 CD8+ T-세포; 도 24H: 혈소판; 도 24I: C-반응성 단백질; 도 24J: 혈액 우레아 질소.
도 25A-25G는 AML 환자로부터의 말초혈 샘플에서 DART-A-WT, CD123-WT, CD123-M1 및 CD123-M18에 의해 매개된 AML 블라스트 고갈(blast depletion)의 대표적인 연구 결과를 도시한다. 도 25A: 대조군의 퍼센트로서 AML 34+ 모세포(blast cell) 수; 도 25B: CD4+ 세포 팽창; 도 25C: CD8+ 세포 팽창; 도 25D-G: 사이토카인 방출 (도 25D: IFN-γ; 도 25E: TNF-α; 도 25F: IL-6; 및 도 25G: IL-2).
도 26A-26E는 Pan-T 이펙터 세포 및 MOLM-13 AML 표적 세포 (E:T= 15:1, 48-96 hr)를 사용하는, CD123 x CD3 디아바디 구성물 CD123-WT, CD123-M1, CD123-M13, CD123-M17, CD123-M18, 및 CD123-M19에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구 (CTL 검정) 결과를 도시한다. 방출된 %LDH의 함수로서의 세포독성이 도 26A에 도표화된다. 사이토카인 반응은 도 26B-26E에 도표화된다 (도 26B: IFN-감마; 도 26C: TNF-알파; 도 26D: IL-6; 도 26E: IL-2).
도 27A-27D는 Pan-T 이펙터 세포 및 MOLM-13 AML 표적 세포 (E:T= 15:1, 48-96 hr)를 사용하는, CD123 x CD3 디아바디 구성물 CD123-WT, CD123-M1, CD123-M13, CD123-M17, CD123-M18, CD123-M19, 및 DART-A-WT에 의해 매개된 4-7 재지시된 세포 사멸 검정 (CTL 검정) 및 사이토카인 방출 연구의 누적 결과를 도시한다. pM의 CTL 활성 EC50 값이 도 27A에 도표화된다. CD123-WT의 EC50 값의 배수로서의 CTL 활성이 도 27B에 도표화된다. CD123-WT의 퍼센트로서의 CTL 활성 Emax가 도 27C에 도표화된다. CD123-WT에 대해 표준화된 계산된 치료 지수 (TI = Emax (CTL) : Emax (사이토카인))가 도 27D에 도표화된다.
도 28A-28B는 생체내에서 종양의 감소를 매개하는 CD123 x CD3 디아바디 구성물의 능력에 대한 생체내 연구 결과를 도시한다. CD123-WT (0.5 mg/kg), CD123-M18 또는 CD123-M13 (0.005, 0.05, 0.5 및 1 mg/kg)이 KG1A 세포를 받았던 마우스에게 제공되었고, 종양 부피가 42일 동안 평가되었다. 도 28A: CD123-WT 및 CD123-M18. 도 28B: CD123-WT 및 CD123-M13.
도 29A-29B는 생체내에서 종양의 감소를 매개하는 CD123 x CD3 디아바디 구성물의 능력에 대한 생체내 연구 결과를 도시한다. CD123-WT (0.05 mg/kg), CD123-M18 또는 CD123-M17 (0.005, 0.05, 0.5 및 1 mg/kg)이 KG1A 세포를 받았던 마우스에게 제공되었고, 종양 부피가 42일 동안 평가되었다. 도 29A: CD123-WT 및 CD123-M18. 도 29B: CD123-WT 및 CD123-M17.
도 30A-30B는 CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디에 의해 유도된 인터류킨-2 사이토카인 방출에 대한 생체내 연구 결과를 도시한다. 혈청 사이토카인 수준 (pg/ml)이 KG1A 세포를 받았던 마우스에게 CD123-WT (0.5 mg/kg), CD123-M13, CD123-M17 또는 CD123-M18 (0.05, 0.5 및 1 mg/kg)이 투여된 후 6시간 후에 평가되었다. 도 30A: CD123-WT, CD123-M13, 및 CD123-M18; 및 도 30B: CD123-WT, CD123-M17 및 CD123-M18.
도 31A-31F는 인간 및 시노몰구스 원숭이 PBMC로부터의 CD19-WT, CD19.1-M18, 및 HIV-M18에 의한 자가 B-세포 고갈의 대표적인 연구 결과를 도시한다. CD20+ B-세포의 고갈이 도 31A (인간 PBMC) 및 도 31B (cyno PBMC)에 도표화된다. 처리된 인간 PBMC로부터의 사이토카인 방출은 도 31C-F에 도표화된다 (도 31C: IFN-γ; 도 31D: TNF-α; 도 31E: IL-6; 및 도 31F: IL-2).
도 32A-32D는 CD19.1-M18 (1 mg/kg 및 10 mg/kg) 또는 CD123-WT (0.1 mg/kg)로 처리된 시노몰구스 원숭이의 말초혈에서 관찰된 B-세포 수준의 감소를 도시한다. 사전용량 B-세포 수준이 도 32A에 도시된다 (B-세포 집단은 타원형으로 표시됨). 1일, 8일 및 15일 째의 수준이 각각 도 32B-32C에 도시된다.
도 33A-33C는 처리 전 및 양성 대조군 CD19-WT (도 33A: 0.1 mg/kg) 또는 CD3 변이체 CD19.1-M18 (도 33B: 10 mg/kg; 및 도 33C: 30 mg/kg)로 처리된 후 7일 째의 시노몰구스 원숭이로부터의 림프절에서의 B-세포의 면역조직화학 염색을 도시한다.
도 34는 CD19.1-M13 (1 mg/kg), CD19.1-M17 (1 mg/kg) 또는 CD19-WT (0.1 mg/kg)로 처리된 시노몰구스 원숭이의 말초혈에서 관찰된 B-세포 수준의 감소를 도시한다.
도 35A-35E는 CD19.1-M13 (1 mg/kg), CD19.1-M17 (1 mg/kg), 또는 CD19-WT (0.1 mg/kg)로 처리된 시노몰구스 원숭이에서 관찰된 혈청 사이토카인 수준을 도시한다. 도 35A: TNF-α, 도 35B: IFN-γ, 도 35C: IL-2, 도 35D: IL-6; 및 도 35E: IL-15.
도 36A-36B는 CD19.1-M13 (1 mg/kg), CD19.1-M17 (1 mg/kg), 또는 CD19-WT (0.1 mg/kg)로 처리된 시노몰구스 원숭이에서 관찰된 T-세포의 증식을 도시한다. 도 36A: Ki67 양성 T-세포 CD4+ T-세포; 도 36B: Ki67 양성 CD8+ T-세포.
본 발명은 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 CD3-결합 도메인 및 또한 질환 항원 ("DA")의 에피토프에 결합할 수 있는 질환 항원-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자 (예컨대, 이중특이적 항체, 디아바디, 이중특이적 scFv, 3가 분자, TandAb®, BiTE® 등)(예컨대, "DA x CD3 결합 분자")에 관한 것이다. 발명은 특히 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인, CDRH3 도메인, CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 참조 CD3-결합 도메인 ("rCD3-결합 도메인")의 상응하는 CDR의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 변이체 CD3-결합 도메인 ("vCD3-결합 도메인")을 포함하는 그러한 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이며, 이러한 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 이러한 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 CD3에 대한 변경된 친화성을 나타낸다. 발명은 특히 CD3에 대한 감소된 친화성을 나타내며 DA를 발현하는 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있고 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 나타내는, vCD3-결합 도메인을 포함하는 그러한 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 암 및 병원체-관련 질환의 치료에서의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 분자(들)를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.
상기에서 나타낸 것과 같이, 본 발명의 치료 분자는 특히, 이펙터 세포의 세포 표면 분자 상의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인 및 질환 항원을 발현하는 표적 세포의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "질환 항원" ("DA"로 약칭함)은 비정상적인 또는 감염된 세포의 표면에서 발현되고 감염의 이러한 비정상을 특징으로 하는, 또는 외래 세포 표면에서 발현되고 이러한 외래 세포 기원을 특징으로 하는 항원을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, 그것의 세포 표면에서 질환 항원을 발현하고, 따라서 본 발명의 치료 분자에 의해 결합될 수 있으며 그로써 이러한 치료 분자에 의한 사멸에 대해 표적화될 수 있는 세포는 "표적 세포"이다. 특히 본 발명과 관련되는 것은 "암 항원" 또는 "병원체-관련 항원"인 질환 항원이다.
I. 항체 및 그것의 결합 도메인
본 발명의 DA x CD3 결합 분자는 항체이거나 항체로부터 유래될 수 있다 (예컨대, 항체 폴리펩타이드의 단편화, 절단 등에 의해, 또는 항체 분자의 아미노산 서열 또는 그러한 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (또는 그것의 서열)의 사용으로부터).
항체는 분자, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드, 등의 특정 도메인 또는 모이어티 또는 형태 ("에피토프")에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 에피토프-함유 분자는 면역원 활성을 가질 수 있어서, 그것은 동물에서 항체 생성 반응을 이끌어내게 되고; 이러한 분자는 "항원"으로 명명된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "항체" 및 "항체들"은 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 다클론성 항체, 카멜화된 항체, 단일-사슬 Fvs (scFv), 단일-사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-연결 이중특이적 Fv (sdFv), 인트라바디, 및 상기 중 어느 것의 에피토프-결합 도메인을 나타낸다. 특히, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉, 에피토프-결합 도메인을 함유하는 분자이다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형 (예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다. 항체는 그러한 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 비단백질 분자에, 이러한 분자 상의 특정 도메인 또는 모이어티 또는 형태 ("에피토프")의 존재로 인해 "면역특이적으로 결합"할 수 있다.
용어 "단클론성 항체"는 단클론성 항체가 항원의 선택적 결합에 관여하는 아미노산들 (자연적으로 발생하는 또는 자연적으로 발생하지 않는)로 구성되는 동종성 항체 집단을 나타낸다. 단클론성 항체는 단일 에피토프 (또는 항원 부위)에 대해 지시되는, 고도로 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체 및 전장 단클론성 항체뿐만 아니라, 이것들의 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단일-사슬 (scFv), 이것들의 돌연변이), 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필요한 특이성 및 항원에 결합하는 능력이 있는 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구조를 포함한다. 항체의 공급원 또는 (예컨대, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 형질전환 동물, 등에 의한) 그것이 만들어지는 방식에 관해서는 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 용어는 상기 "항체"의 정의 하에 기술된 전체 면역글로불린 뿐만 아니라 단편을 포함한다. 단클론성 항체의 제조 방법은 기술분야에 알려져 있다. 사용될 수 있는 한 가지 방법은 Kohler 등의 방법 (Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity", Nature 256:495-497) 또는 그것의 변용이다. 전형적으로, 단클론성 항체는 마우스, 래트 또는 토끼에서 발생된다. 항체는 동물을 원하는 에피토프를 함유한 세포, 세포 추출물, 또는 단백질 제제의 면역원 유발 양으로 면역화함으로써 생성된다. 면역원은, 한정하는 것은 아니지만, 일차 세포, 배양된 세포주, 암성 세포, 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 조직일 수 있다. 면역화에 사용된 세포는 면역원으로서 사용되기 전에 일정 시간 (예컨대, 적어도 24시간) 동안 배양될 수 있다. 세포는 그 자체로 또는 비변성 보조제, 예컨대 Ribi와 함께 면역원으로서 사용될 수 있다 (예컨대, Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production", ILAR J. 37(3):119-125 참조). 일반적으로, 세포는 면역원으로서 사용될 때 온전하게 유지되어야 하고 바람직하게는 생존 가능해야 한다. 온전한 세포는 항원이 면역화된 동물에 의해 파열된 세포보다 더 잘 검출되게 할 수 있다. 변성제 또는 가혹한 보조제, 예컨대, 프로인크 보조제의 사용은 세포를 파열시킬 수 있고 따라서 권장되지 않는다. 면역원은 격주로, 또는 주마다와 같은 주기적 간격으로 다중 투여될 수 있고, 또는 동물에서 생존성을 유지하기 위한 방식으로 (예컨대, 조직 재조합으로) 투여될 수 있다. 대안으로, 기존의 단클론성 항체 및 원하는 병원성 에피토프에 면역특이적인 임의의 다른 동등한 항체는 서열분석될 수 있고 기술분야에 알려져 있는 임의의 수단에 의해 재조합에 의해 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 항체가 서열분석되고, 그런 후 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터에 클로닝된다. 관심 있는 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포의 벡터에서 유지될 수 있고 숙주 세포는 미래의 사용을 위해 팽창되고 냉동될 수 있다. 이러한 항체의 폴리뉴클레오타이드 서열은 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 (예컨대, 이중특이적, 삼중특이적 및 사중특이적) 분자뿐만 아니라 하기에서 상세하게 설명되는 것과 같이, 항체의 친화성, 또는 다른 특성을 개선하기 위하여 친화성 최적화된, 키메라 항체, 인간화된 항체, 및/또는 개과화된 항체를 생성하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 그것의 결합 도메인을 통해 "면역특이적" 방식으로 에피토프에 결합한다. 본원에서 사용되는 바, 항체, 디아바디 또는 다른 에피토프-결합 분자는, 그것이 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화성으로 대체 에피토프에 비해 그 에피토프와 더 빈번하게, 더 신속하게 반응하거나 회합한다면, 다른 분자의 영역 (즉, 에피토프)에 "면역특이적으로" 결합한다고 말할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체는 그것이 다른 바이러스 에피토프 또는 비바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 더 쉽게, 및/또는 더 긴 기간으로 이 바이러스 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한 이런 정의의 판독에 의해, 예를 들어, 제1 표적에 면역특이적으로 결합하는 항체 (또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있다는 것이 인지된다. 그로써, "면역특이적 결합"은 배타적 결합을 (비록 포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지 않는다. 일반적으로, 반드시 그런 것은 아니지만, 본원에서 결합에 대한 언급은 "면역특이적" 결합을 의미한다.
지난 수십년은 항체의 치료적 잠재력에 관한 관심이 성행하였고, 항체는 생명공학-유래 약물의 선두 부류 중 하나가 되었다 (Chan, C.E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases", Singapore Med. J. 50(7):663-666). 200개를 넘는 항체-기반 약물이 사용이 승인되었거나 현재 개발 중이다.
천연 항체 (예컨대 IgG 항체)는 2개의 "중쇄"와 복합체를 형성한 2개의 "경쇄"로 구성된다. 각각의 경쇄는 가변 도메인 ("VL") 및 불변 도메인 ("CL")을 함유한다. 각각의 중쇄는 가변 도메인 ("VH"), 3개의 불변 도메인 ("CH1", "CH2" 및 "CH3"), 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치한 "힌지" 영역 ("H")을 함유한다. 대조적으로, scFv는 경쇄와 중쇄 가변 도메인을 짧은 연결 펩타이드를 통해 함께 연결함으로써 만들어진 단일 사슬 분자이다.
그러므로 자연적으로 발생하는 면역글로불린 (예컨대, IgG)의 기본적인 구조 단위는 2개의 경쇄 및 중쇄를 가지는, 보통 약 150,000 Da의 당단백질로서 발현되는 테트라머이다. 각 사슬의 아미노 말단 ("N-말단") 부분은 주로 항원 인식에 기여하는, 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 도메인을 포함한다. 각 사슬의 카르복시 말단 ("C-말단") 부분은 불변 영역을 규정하며, 경쇄는 단일 불변 도메인을 가지고 중쇄는 보통 3개의 불변 도메인 및 힌지 도메인을 가진다. 그러므로, IgG 분자의 경쇄의 구조는 n-VL-CL-c이고 IgG 중쇄의 구조는 n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c이다 (n 및 c는 각각, 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단을 나타냄). 온전한, 비변형 항체 (예컨대, IgG 항체)의 항원의 에피토프에 결합하는 능력은 가변 도메인의 존재 및 서열에 좌우된다. 구체적으로 주지되지 않는 한, 본원에 기술된 단백질 분자의 도메인의 순서는 "N-말단에서 C-말단쪽" 방향이다.
A. 항체 가변 도메인의 특징
IgG 분자의 가변 도메인은 에피토프와 접촉하게 될 항체의 아미노산 잔기를 함유하는 3개의 상보성 결정 영역 ("CDR"), 및 프레임워크 영역 ("FR")으로 언급되며, CDR 분절을 분리시키고 일반적으로 구조를 유지하며 CDR 잔기가 에피토프와 접촉하는 것을 허용하도록 (특정 프레임워크 잔기가 또한 이러한 접촉에서 역할을 하기도 함) CDR 잔기의 배치를 결정하는 4개의 개재 비-CDR 분절로 이루어진다. 그러므로, VL 및 VH 도메인은 구조 n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c를 가지며, 여기서 n과 c는 각각 도메인의 N-말단부와 C-말단부를 나타낸다. CDR의 아미노산 서열은 항체가 특정 에피토프에 결합할 수 있을 것인지의 여부를 결정한다.
면역글로불린의 성숙한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인으로부터의 아미노산은 사슬에서 아미노산의 위치에 의해 표시된다. Kabat 등 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) ("Kabat"), 분명하게 본원에 참조로 포함됨)은 항체에 대한 수많은 아미노산 서열을 기술하였고, 각 하위그룹에 대한 아미노산 공통 서열을 확인하였으며, 각 아미노산에 잔기 번호를 배정하였다. CDR은 Kabat에 의해 정의된 것과 같이 확인된다 (Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", J. Mol. Biol. 196:901-917)에 의해 정의된 CDRH1은 5개 잔기 앞에 있는 것이 인지될 것이다). Kabat 넘버링 체계는 보존된 아미노산을 참조하여 문제의 항체를 공통 서열의 항체와 정렬함으로써 그의 개요서에 포함되지 않은 항체에 확장할 수 있다. 잔기 번호를 배정하기 위한 이 방법은 해당 분야에서 표준이 되었고 키메라 또는 인간화된 변이체를 포함한, 상이한 항체의 동등한 위치에 있는 아미노산을 쉽게 확인시켜준다. 예를 들어, 인간 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산은 마우스 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산과 동등한 위치를 차지한다.
항체의 경쇄의 제1, 제2 및 제3 CDR인 (또는 그것으로서 작용할 수 있는) 폴리펩타이드는 본원에서 각각 CDR L 1 도메인, CDR L 2 도메인, 및 CDR L 3 도메인으로서 표시된다. 유사하게, 항체의 중쇄의 제1, 제2 및 제3 CDR인 (또는 그것으로서 작용할 수 있는) 폴리펩타이드는 본원에서 각각 CDR H 1 도메인, CDR H 2 도메인, 및 CDR H 3 도메인으로서 표시된다. 그러므로, 용어 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, CDRL3 도메인, CDRH1 도메인, CDRH2 도메인, 및 CDRH3 도메인은 단백질에 통합되었을 때, 이러한 단백질이 경쇄 및 중쇄를 가지는 항체이거나 또는 디아바디 또는 단일-사슬 결합 분자 (예컨대, scFv, BiTe, 등)이거나, 또는 또 다른 유형의 단백질이거나에 관계 없이, 그 단백질이 특정 에피토프에 결합할 수 있게 되는 것을 유발하는 폴리펩타이드에 대해 지정된다. 따라서, 본원에서 사요오디는 바, 용어 "에피토프-결합 도메인"은 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 결합 분자의 능력에 기여하는 결합 분자의 단편 또는 부분 (또는 그러한 단편 또는 부분의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드)을 포함하는 도메인을 나타낸다. 에피토프-결합 도메인은 항체의 임의의 1, 2, 3, 4, 또는 5개 CDR 도메인을 함유하거나, 또는 항체의 CDR 도메인의 6개 전부를 함유할 수 있고, 이러한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있지만, 이러한 항체의 것과는 상이한, 이러한 에피토프를 향한 면역특이성, 친화성 또는 선택성을 나타낼 수 있다. 에피토프-결합 도메인은 CDR의 일부, 즉 결합에 필요한 CDR 잔기의 하위세트만을 함유할 수 있다 ("특이성-결정 잔기" 또는 "SDR"로 명명됨; Kim, J.H. et al. (2012) "Humanization By CDR Grafting And Specificity-Determining Residue Grafting", Methods Mol. Biol. 907:237-245; Kim, K.S. et al. (2010) "Construction Of A Humanized Antibody To Hepatitis B Surface Antigen By Specificity-Determining Residues (SDR)-Grafting And De-Immunization", Biochem. Biophys. Res. Commun. 396(2):231-237; Kashmiri, S.V. et al. (2005) "SDR Grafting - A New Approach To Antibody Humanization", Methods 36(1):25-34; Gonzales, N.R. et al. (2004) "SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity", Mol. Immunol. 41:863-872). 그러나, 바람직하게, 에피토프-결합 도메인은 이러한 항체의 CDR 도메인 중 6개 전부를 함유할 것이다. 항체의 에피토프-결합 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬 (예컨대, scFv)일 수 있거나, 또는 각각의 사슬이 아미노 말단 및 카르복시 말단을 가지는 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다 (예컨대, 디아바디, Fab 단편, Fab2 단편, 등)
발명은 또한 특히 인간화된 항체의 VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는 결합 분자를 포함한다. 용어 "인간화된 항체"는 비인간 종으로부터의 면역글로불린의 에피토프-결합 도메인 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 토대로 한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가지는, 일반적으로 재조합 기법을 사용하여 제조된 키메라 분자를 나타낸다. 이러한 항체의 가변 도메인의 폴리뉴클레오타이드 서열은 이러한 유도체를 생성하기 위한, 그리고 이러한 항체의 친화성, 또는 다른 특성을 개선하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체를 인간화하는 것의 일반적인 원리는 항체의 에피토프-결합 도메인의 기본적인 서열을 보유하는 한편, 항체의 비인간 나머지를 인간 항체 서열과 교환하는 것을 포함한다. 단클론성 항체를 인간화하기 위해서는 일반적으로 4개 단계가 있다. 이것들은 다음과 같다: (1) 출발 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 예측된 아미노산 서열을 결절하는 단계, (2) 인간화된 항체 또는 개과화된 항체를 설계하는 단계, 즉, 인간화 또는 개과화 과정 중에 사용하기 위한 항체 프레임워크 영역을 결정하는 단계, (3) 방법론/기법의 실제 인간화 또는 개과화 단계, 및 (4) 인간화된 항체의 트랜스펙션 및 발현 단계. 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567호; 5,807,715호; 5,866,692호; 및 6,331,415호를 참조한다.
에피토프-결합 도메인은 불변 도메인에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 적절한 프레임워크 영역에 접목된(grafted) 이러한 가변 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)만을 포함할 수 있다. 에피토프-결합 도메인은 야생형이거나 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이것은 인간 개체에서 불변 영역을 면역원으로서 제거하지만, 외래 가변 도메인에 대한 면역 반응의 가능성은 남아 있다 (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). 또 다른 접근법은 인간-유래 불변 영역을 제공하는 것뿐만 아니라, 가변 도메인을 가능한 한 인간 형태와 밀접하게 개조하기 위하여 그것을 변형시키는 것에 초점을 맞춘다. 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 문제의 항원에 대한 반응으로 달라지고 결합 능력을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하며, 이것들은 주어진 종에서 상대적으로 보존되고 잠정적으로 CDR에 대한 스캐폴딩을 제공하는 4개의 프레임워크 영역 (FR)이 옆에 있는 것으로 알려져 있다. 비인간 항체가 특정 항원과 관련하여 제조될 때, 가변 도메인은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상의 비인간 항체로부터 유래된 CDR을 접목시킴으로써 "개조" 또는 "인간화"될 수 있다. 이런 접근법의 다양한 항체에의 적용이 문헌에 보고되어 있다: Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy", Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity", Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation", Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity", Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo", Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 및 Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen", J. Immunol. 148:1149-1154. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다 (예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개 전부의 CDR을 함유하는 인간화된 마우스 항체). 다른 구체예에서, 인간화된 항체는 원래의 항체에 비해 서열이 상이한 하나 이상 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 CDR을 가진다.
설치류 또는 변형된 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인에 융합된 그것들의 관련된 상보성 결정 영역 (CDR)을 가지는 키메라 항체를 포함하여, 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 에피토프-결합 도메인을 포함하는 많은 인간화된 항체 분자가 기술되어 있다 (예를 들어, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies", Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen", J. Immunol. 138:4534-4538, 및 Brown et al. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody", Cancer Res. 47:3577-3583 참조). 다른 참고문헌은 적절한 인간 항체 불변 도메인과의 융합 전에 인간 지지용 프레임워크 영역 (FR)에 접목된 설치류 CDR을 기술한다 (예를 들어, Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy", Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity", Science 239:1534-1536; 및 Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse", Nature 321:522-525 참조). 또 다른 참고문헌은 재조합으로 제조된 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지된 설치류 CDR을 기술한다. 예를 들어, 유럽 특허 공개 번호 519,596호를 참조한다. 이들 "인간화된" 분자는 인간 수령체에서 그런 모이어티의 치료적 적용의 기간 및 유효성을 제한하는 설치류 항-인간 항체 분자를 향한 원치 않는 면역학적 반응을 최소화하기 위해 설계된다. 또한 이용될 수 있는 항체를 인간화하는 다른 방법은 Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins", Nucl. Acids Res. 19:2471-2476에 의해, 그리고 미국 특허 제 6,180,377호; 6,054,297호; 5,997,867호; 및 5,866,692호에서 개시된다.
B. 항체 불변 영역의 특성
본 명세서 전체에서, IgG의 불변 영역의 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) ("Kabat") (본원에 참조로 분명하게 포함됨)에서 EU 인덱스의 넘버링이다. 용어 "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 불변 도메인의 넘버링을 나타낸다.
다형성은 항체 불변 영역 내의 많은 상이한 위치 (예컨대, Fc 위치, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, Kabat에서 제시된 것과 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링되는 위치 270, 272, 312, 315, 356, 및 358)에서 관찰되었고, 그러므로 제시된 서열과 선행 기술의 서열 사이에 약간의 차이가 있을 수 있다. 인간 면역글로불린의 다형성 형태는 잘 특성화되어 있다. 현재, 18개의 중쇄 알로타입 ("Gm 알로타입")이 알려져 있다: G1m (1, 2, 3, 17) 또는 G1m (a, x, f, z), G2m (23) 또는 G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m (b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., "The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation". Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). 구체적으로 본 발명의 항체는 임의의 면역글로불린 유전자의 임의의 알로타입, 아이소알로타입, 또는 할로타입을 포함할 수 있으며, 본원에서 제공된 서열의 알로타입, 아이소알로타입, 또는 할로타입에 한정되지 않는 것으로 고려된다. 나아가, 일부 발현 시스템에서 CH3 도메인의 C-말단 아미노산 잔기 (상기 진하게 표시된 부분)는 번역 후에 제거될 수 있다. 따라서, CH3 도메인의 C-말단 잔기는 발명의 결합 분자에서 선택적인 아미노산 잔기이다. 구체적으로 본 발명에 포함되는 것은 CH3 도메인의 C-말단 잔기가 결핍된 결합 분자이다. 또한 본 발명에 구체적으로 포함되는 것은 CH3 도메인의 C-말단 리신 잔기를 포함하는 그러한 구성물이다.
1. 중쇄의 불변 영역
항체의 두 중쇄의 CH1 도메인은 항체의 경쇄의 "CL" 불변 영역과 복합체를 형성하고, 개재 힌지 도메인을 통해 중쇄 CH2 도메인에 부착된다.
예시의 CH1 도메인은 인간 IgG1 CH1 도메인이다. 예시의 인간 IgG1 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:1)이다:
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV.
예시의 CH1 도메인은 인간 IgG2 CH1 도메인이다. 예시의 인간 IgG2 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:2)이다:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV.
예시의 CH1 도메인은 인간 IgG3 CH1 도메인이다. 예시의 인간 IgG3 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:3)이다:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV.
예시의 CH1 도메인은 인간 IgG4 CH1 도메인이다. 예시의 인간 IgG4 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:4)이다:
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV.
한 예시의 힌지 도메인은 인간 IgG1 힌지 도메인이다. 예시의 인간 IgG1 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:5): EPKSCDKTHTCPPCP이다.
다른 예시의 힌지 도메인은 인간 IgG2 힌지 도메인이다. 예시의 인간 IgG2 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:6): ERKCCVECPPCP이다.
또 다른 예시의 힌지 도메인은 인간 IgG3 힌지 도메인이다. 예시의 인간 IgG3 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:7)이다:
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP.
또 다른 예시의 힌지 도메인은 인간 IgG4 힌지 도메인이다. 예시의 인간 IgG4 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:8): ESKYGPPCPSCP이다. 본원에서 기술된 것과 같이, IgG4 힌지 도메인은 S228P 치환과 같은 안정화 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시의 S228P-안정화된 인간 IgG4 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:9): ESKYGPPCPPCP이다.
IgG 항체의 두 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인은 상호작용하여, 한정하는 것은 아니지만 Fc 감마 수용체 (FcγR)를 포함한 세포의 Fc 수용체에 의해 인식되는 IgG 항체의 "Fc 도메인"을 형성한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "Fc 도메인"은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용된다. Fc 도메인은 그것의 아미노산 서열이 다른 IgG 아이소타입과 관련하여 그 아이소타입과 가장 상동한다면 특정 IgG 아이소타입, 부류 또는 하위부류의 것이라고 말할 수 있다. 진단학에서의 알려져 있는 용도에 더불어, 항체는 치료제로서도 유용한 것으로 밝혀졌다.
예시의 인간 IgG1의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:10):
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPG X ,
이고 (Kabat에서 나타낸 것과 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링됨), 여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
예시의 인간 IgG2의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:11):
231 240 250 260 270 280
APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSPG X
이고 (Kabat에서 나타낸 것과 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링됨), 여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
예시의 인간 IgG3의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:12):
231 240 250 260 270 280
APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
340 350 360 370 380
PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE
440 447
ALHNRFTQKS LSLSPG X
이고 (Kabat에서 나타낸 것과 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링됨), 여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
예시의 인간 IgG4의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:13):
231 240 250 260 270 280
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD
290 300 310 320 330
GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS
340 350 360 370 380
SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE
390 400 410 420 430
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE
440 447
ALHNHYTQKS LSLSLG X
이고 (Kabat에서 나타낸 것과 같은 EU 인덱스에 의해 넘버링됨), 여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
2. 경쇄의 불변 영역
상기에서 표시된 것과 같이, 항체의 각각의 경쇄는 가변 도메인 ("VL") 및 불변 도메인 ("CL")을 함유한다.
바람직한 CL 도메인은 인간 IgG CL 카파 도메인이다. 예시의 인간 CL 카파 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:14)이다:
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD
SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC.
대안으로, 예시의 CL 도메인은 인간 IgG CL 람다 도메인이다. 예시의 인간 CL 람다 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:15)이다:
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS
NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS.
II. 다중특이적 결합 분자
항체의 항원의 에피토프에 결합하는 능력은 항체의 VL 및 VH 도메인의 존재 및 아미노산 서열에 좌우된다. 항체의 경쇄와 중쇄의 상호작용, 특히, 그것의 VL 및 VH 도메인의 상호작용은 천연 항체, 예컨대 IgG의 2개의 에피토프-결합 도메인 중 하나를 형성한다. 천연 항체는 단지 하나의 에피토프 종에 결합할 수 있지만 (즉, 이것은 단일특이적임), 그 종의 다수의 복사물에도 결합할 수 있다 (즉, 2가 또는 다가를 나타냄).
항체의 기능성은 동시에 2개의 별도의 및 구별되는 항원 (또는 동일한 항원의 상이한 에피토프)에 결합할 수 있는 다중특이적 항체-기반 분자를 생성함으로써 및/또는 동일한 에피토프 및/또는 항원에 대한 더 높은 결합가를 가지는 항체-기반 분자 (즉, 둘 이상의 에피토프-결합 도메인)를 생성함으로써 증강될 수 있다.
천연 항체보다 더 큰 능력을 가지는 분자를 제공하기 위하여, 광범위한 재조합 이중특이적 항체 포맷이 개발되었고 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565 참조), 이중 대부분은 추가의 에피토프-결합 도메인 (예컨대, scFv, VL, VH, 등)을 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)에 또는 그 안에 융합시키기 위하여, 또는 다중 에피토프-결합 도메인 (예컨대, 2개의 Fab 단편 또는 scFv)을 융합시키기 위하여 링커 펩타이드를 사용한다. 대체 포맷은 CH2-CH3 도메인과 같은 도메인 또는 대체 폴리펩타이드를 다이머화하기 위하여 에피토프-결합 도메인 (예컨대, scFv, VL, VH, 등)을 융합시키기 위하여 링커 펩타이드를 사용한다 (WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2006/107617, WO 2007/046893). PCT 공개 번호 WO 2013/174873, WO 2011/133886 및 WO 2010/136172는 CL 및 CH1 도메인이 그것들의 각각의 천연 위치로부터 교환되고 VL 및 VH 도메인이 하나 이상의 항원에 결합하는 것을 허용하기 위해 다양화되어 있는 (WO 2008/027236; WO 2010/108127) 삼중특이적 항체를 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2013/163427 및 WO 2013/119903은 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 부가물을 함유하기 위해 CH2 도메인을 변형시키는 것을 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2010/028797, WO2010028796 및 WO 2010/028795는 3가 결합 분자를 형성하기 위하여, 그것의 Fc 도메인이 추가적인 VL 및 VH 도메인으로 대체되어 있는 재조합 항체를 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2003/025018 및 WO2003012069는 그것의 개별 사슬이 scFv 도메인을 함유하는 재조합 디아바디를 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2013/006544는 단일 폴리펩타이드 사슬로서 합성된 후 단백질 가수분해되어 헤테로다이머 구조를 생성하는 다가 Fab 분자를 개시한다. PCT 공개 번호 WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 및 WO 1991/003493은 항체 또는 항체 부분에 추가적인 결합 도메인 또는 기능성 기를 첨가하는 것 (예컨대, 디아바디를 항체의 경쇄에 첨가하는 것, 또는 추가적인 VL 및 VH 도메인을 항체의 경쇄 및 중쇄에 첨가하는 것, 또는 이종성 융합 단백질을 첨가하거나 다중 Fab 도메인을 서로 연결시키는 것)을 개시한다.
기술분야에서는 추가적으로 둘 이상의 상이한 에피토프 종에 결합할 수 있다는 점에서 이러한 천연 항체와 상이한 디아바디를 생성하는 (즉, 2가 또는 다가에 더불어, 또는 그것을 대신하여, 이중특이성 또는 다중특이성을 나타내는) 능력에 대해 주목하였다 (예컨대, Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 / WO 02/02781 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity", J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications", Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange", Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain", Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System", Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy", Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).
특히, DART® 디아바디로 명명된, 안정적이고, 공유 결합된 헤테로다이머 비-단일특이적 디아바디가 개발되었다; 예컨대, Sloan, D.D. et al. (2015) "Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells", PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) "Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform", Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates", Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma", Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B-Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold", Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion", J. Mol. Biol. 399(3):436-449); 미국 특허 제 8,044,180호; 8,133,982호; 8,187,593호; 8,193,318호; 8,530,627호; 8,669,349호; 8,778,339호; 8,784,808호; 8,795,667호; 8,802,091호; 8,802,093호; 8,946,387호; 8,968,730호; 및 8,993,730호; 미국 특허 공개 번호 2009/0060910; 2010/0174053; 2011/0081347; 2011/0097323; 2011/0117089; 2012/0009186; 2012/0034221; 2012/0141476; 2012/0294796; 2013/0149236; 2013/0295121; 2014/0017237; 및 2014/0099318; 유럽 특허 번호 EP 1868650; EP 2158221; EP 2247304; EP 2252631; EP 2282770; EP 2328934; EP 2376109; EP 2542256; EP 2601216; EP 2714079; EP 2714733; EP 2786762; EP 2839842; EP 2840091; 및 PCT 공개 번호 WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/027797; WO 2010/033279; WO 2010/080538; WO 2011/109400; WO 2012/018687; WO 2012/162067; WO 2012/162068; WO 2014/159940; WO 2015/021089; WO 2015/026892; 및 WO 2015/026894 참조). 이러한 디아바디는 둘 이상의 공유적으로 복합체를 형성한 폴리펩타이드를 포함하고, 이황화 결합이 형성되는 것을 허용하는 사용한 폴리펩타이드 종의 각각에 하나 이상의 시스테인 잔기를 조작함으로써 이러한 폴리펩타이드 사슬의 하나 이상의 쌍을 서로 공유 결합시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 구성물의 C-말단에 시스테인 잔기의 첨가는 포함된 폴리펩타이드 사슬들 사이의 이황화 결합을 허용하여 결과적으로 생성된느 디아바디를 디아바디의 결합 특성을 간섭하지 않으면서 안정화시키는 것으로 밝혀졌다.
가장 간단한 DART® 디아바디는 각각이 3개의 도메인을 포함하는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다 (도 1A-1B). 제1 폴리펩타이드 사슬은: (i) 제1 면역글로불린의 경쇄 가변 도메인의 에피토프-결합 도메인을 포함하는 도메인 (VL1), (ii) 제2 면역글로불린의 중쇄 가변 도메인의 에피토프-결합 도메인을 포함하는 제2 도메인 (VH2), 및 (iii) 제2 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화를 촉진하는 작용을 하고 ("헤테로다이머-촉진 도메인") 디아바디의 제1 폴리펩타이드를 제2 폴리펩타이드 사슬에 공유 결합시키는 작용을 하는 제3 도메인을 포함한다. 제2 폴리펩타이드 사슬은 상보하는 제1 도메인 (VL2 도메인), 상보하는 제2 도메인 (VH1 도메인) 및 제1 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 ("헤테로다이머-촉진 도메인") 및 공유 결합을 촉진하기 위하여 제1 폴리펩타이드 사슬의 제3 도메인과 복합체를 형성하는 제3 도메인을 함유한다. 이러한 분자는 안정적이고, 강력하며 둘 이상의 항원에 동시에 결합하는 능력을 가진다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 제3 도메인은 각각, 공유 이황화 결합을 통해 함께 폴리펩타이드에 결합하기 위해 작용하는 시스테인 잔기 (도면에서 " ⓒ "로 표시됨)를 함유한다. 폴리펩타이드 사슬의 하나 또는 둘 다의 제3 도메인은 추가적으로 CH2-CH3 도메인의 서열을 가질 수 있어서, 한 디아바디 폴리펩타이드의 또 다른 디아바디 폴리펩타이드에 대한 복합체 형성은 Fc 도메인을 형성한다. 이러한 Fc 도메인은 디아바디의 생물학적 반감기를 변경시키고, 그것의 면역원성을 감소시키기 위해 작용할 수 있으며, 및/또는 이펙터 기능을 향상시키거나 억제하기 위하여 세포 (예컨대 B 림프구, 수지상 세포, 천연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산성 세포, 호염기성 세포 및 비만 세포)의 Fc 수용체에 결합할 수 있다. 이러한 분자의 많은 변이체가 기술되어 있고 (예컨대, 미국 특허 공개 번호 2015/0175697; 2014/0255407; 2014/0099318; 2013/0295121; 2010/0174053; 2009/0060910; 2007/0004909; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221; EP 1868650; 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665 참조), 본원에서 제공된다.
최근에, 2개의 디아바디-형 결합 도메인 및 1개의 비-디아바디-형 도메인, 및 Fc 도메인을 포함하는 3가 구조가 기술된 바 있다 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 2015/184207 및 WO 2015/184203 참조). 이러한 3가 결합 분자는 하기에서 보다 상세하게 제공되는 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적 분자를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 3개의 상이한 에피토프에 결합하는 능력은 향상된 능력을 제공한다.
이중특이적 또는 4가 분자가 바람직하지만 Fc가 필요하지 않는 용도를 위해 대체 구성물이 기술분야에 알려져 있는데, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, "BiTE"로도 언급되는 이중특이적 T-세포 관여 분자 (예컨대, PCT 공개 번호: WO 1993/11161; 및 WO 2004/106381 참조) 및 "TandAb"로도 언급되는 4가 탠덤 항체 (예컨대 미국 특허 공개 번호: 2011-0206672; 유럽 특허 공개 번호 EP 2371866, 및; PCT 공개 번호 WO 1999/057150, WO 2003/025018, 및 WO 2013/013700 참조)를 예로 들 수 있다. BiTE는 나란히 연결된 scFv를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬로부터 형성되는 한편, TandAb는 각각이 VH1, VL2, VH2, 및 VL2 도메인을 포함하는 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬의 호모-다이머화에 의해 형성된다.
다중특이적 결합 분자 (예컨대, 이중특이적 항체, 이중특이적 디아바디, 3가 분자, 등)를 생성하는 능력은, 예를 들어, 상이한 세포의 표면에 존재하는 수용체들을 공동 결찰에 의해 두 세포를 함께 공동 결찰시키기 위한 ("트랜스"로) 이들의 사용으로 이어졌다 (예컨대, 세포독성 T-세포를 표적 세포, 예컨대 질환 항원을 발현하는 암세포 또는 병원체-감염 세포에 교차 결합시키는 것) (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells", Nature 314:628-631, 및 Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody", Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies", Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658; Sloan et al. (2015) "Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells", PLoS Pathog 11(11): e1005233. doi:10.1371/journal.ppat.1005233)). 대안으로 (또는 추가적으로), 다중특이적 분자는 동일한 세포의 표면에 존재하는 분자, 예컨대 수용체, 등을 공동 결찰시키기 위해 ("시스"로) 사용될 수 있다. 상이한 세포 및/또는 수용체의 공동 결찰은 이펙터 기능 및/또는 면역 세포 신호전달을 조절하기 위해 유용하다. 에피토프-결합 도메인을 포함하는 다중특이적 분자 (예컨대, 이중특이적 디아바디)는 T 림프구, 천연 살해 (NK) 세포, 항원-제공 세포 또는 다른 단핵 세포 상에서 발현되는 CD2, CD3, CD8, CD16, TCR, 천연 살해 그룹 2, 멤버 D 수용체 (NKG2D), 등과 같은 임의의 면역 세포의 표면 결정기에 대해 지시될 수 있다. 특히, 면역 이펙터 세포 상에 존재하는 세포 표면 수용체에 대해 지시된 에피토프-결합 도메인은 재지시된 세포 사멸을 매개할 수 있는 다중특이적 결합 분자의 생성에 유용하다.
본 발명은 질환 항원 ("DA")을 발현하는 표적 세포 (예컨대, 암세포 또는 병원체-감염 세포, 등)의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 결합 분자를 제공한다. 이러한 결합 분자는 "제1 에피토프" 및 "제2 에피토프"에 결합할 수 있고, 이러한 에피토프 중 하나는 CD3의 에피토프이며 이러한 에피토프 중의 다른 하나는 질환 항원의 에피토프이다. 특정 에피토프가 제1 대비 제2 에피토프로서 표시되는지의 여부는 관련이 없다; 이러한 표시는 본 발명의 결합 분자의 폴리펩타이드 사슬의 도메인의 존재 및 방향과만 관련이 있다. 그러므로, 본 발명의 이중특이적 분자는 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 "VL CD3 " / "VH CD3 " 도메인, 및 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 "VL DA " / "VH DA " 도메인을 포함한다. 본 발명은 특히 본원에 제공된 임의의 방법을 사용하여 생성된 이중특이적 디아바디, 이중특이적 scFv, BiTE, 항체, TandAb, 및 3가 결합 분자를 포함한다.
A. Fc 도메인이 없는 이중특이적 디아바디
한 구체예에서, 발명의 DA x CD3 결합 분자는 이중특이적 디아바디이고 제1 및 제2 에피토프 둘 다와 결합할 수 있는 도메인을 포함하지만, Fc 도메인이 결핍되어서, Fc-FcγR 상호작용을 통해 FcγR 분자에 결합할 수 없을 것이다. 이중특이적 디아바디의 이러한 구체예의 제1 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 쪽 방향으로: N-말단, 제1 또는 제2 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (즉, VLCD3 또는 VLDA), 제1 개재 스페이서 펩타이드 (링커 1), 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (이러한 제1 폴리펩타이드 사슬이 VLCD3을 함유하는 경우) 또는 CD3에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (이러한 제1 폴리펩타이드 사슬이 VLDA를 함유하는 경우), 선택적으로 시스테인 잔기를 함유하는 제2 개재 스페이서 펩타이드 (링커 2), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다 (도 1A-1B).
이중특이적 디아바디의 이런 구체예의 제2 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 쪽 방향으로: N-말단, 제1 또는 제2 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (즉, VLCD3 또는 VLDA, 그리고 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬에 포함되기 위해 선택되지 않은 VL 도메인), 개재 스페이서 펩타이드 (링커 1), 에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (즉, VHCD3 또는 VHDA, 그리고 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬에 포함되기 위해 선택되지 않은 VH 도메인), 선택적으로 시스테인 잔기를 함유하는 제2 개재 스페이서 펩타이드 (링커 2), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다 (도 1A-1B). 특정 에피토프에 특이적인 사용된 VL 및 VH 도메인은 바람직하게 동일한 항체로부터 얻어지거나 유래된다. 그러나, 이러한 도메인은 도메인들이 회합하여 이러한 에피토프에 면역학적으로 결합할 수 있는 기능성 결합 부위를 형성한다면 상이한 단클론성 항체로부터 유래될 수 있다. 이러한 상이한 항체는 본원에서 "상응하는" 항체로서 언급된다.
제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 제2 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인과 상호작용하여 에피토프 중 하나 (예컨대, 제1 에피토프)에 특이적인 제1 기능성 에피토프-결합 도메인을 형성한다. 마찬가지로, 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인과 상호작용하여 다른 에피토프 (즉, 제2 에피토프)에 특이적인 제2 기능성 에피토프-결합 도메인을 형성한다. 그러므로, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인의 선택은 "조정"되어서, 디아바디의 두 폴리펩타이드 사슬이 제1 에피토프 및 제2 에피토프 둘 다에 결합할 수 있는 VL 및 VH 도메인을 포괄적으로 포함하게 된다 (즉, 그것은 VLCD3/VHCD3 및 VLDA/VHDA를 포괄적으로 포함한다).
가장 바람직하게, 개재 스페이서 펩타이드 (즉, "링커 1", 이러한 VL 및 VH 도메인을 분리시킴)의 길이는 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인이 서로 결합하는 것을 실질적으로 또는 완전하게 방지하도록 선택된다 (예를 들어 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 개재하는 링커 아미노산 잔기로 이루어짐). 그러므로, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 실질적으로 또는 완전하게 서로 결합할 수 없다. 마찬가지로, 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 실질적으로 또는 완전하게 서로 결합할 수 없다. 바람직한 개재 스페이서 펩타이드 (링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:16): GGGSGGGG를 가진다.
제2 개재 스페이서 펩타이드 ("링커 2")이 길이 및 조성은 이러한 다이머화를 촉진하는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인 (즉, "헤테로다이머-촉진 도메인")의 선택을 토대로 선택된다. 전형적으로, 제2 개재 스페이서 펩타이드 (링커 2)는 3-20개의 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 특히, 사용된 헤테로다이머-촉진 도메인(들)이 시스테인 잔기를 포함하거나/포함하지 않는 경우에, 시스테인-함유 제2 개재 스페이서 펩타이드 (링커 2)가 이용된다. 시스테인-함유 제2 개재 스페이서 펩타이드 (링커 2)는 1, 2, 3개 또는 그 이상의 시스테인을 함유할 것이다. 바람직한 시스테인-함유 스페이서 펩타이드 (링커 2)는 서열 GGCGGG (SEQ ID NO:17)를 가진다. 대안으로, 링커 2는 시스테인을 포함하지 않으며 (예컨대, GGG, GGGS (SEQ ID NO:18), LGGGSG (SEQ ID NO:19), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:20), ASTKG (SEQ ID NO:21), LEPKSS (SEQ ID NO:22), APSSS (SEQ ID NO:23), 등), 하기에서 기술되는 것과 같이 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인이 사용된다. 선택적으로, 시스테인-함유 링커 2 및 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인이 둘 다 사용된다.
헤테로다이머-촉진 도메인은 한 폴리펩타이드 사슬에 GVEPKSC (SEQ ID NO:24) 또는 VEPKSC (SEQ ID NO:25) 또는 AEPKSC (SEQ ID NO:26)를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있고 다른 폴리펩타이드 사슬에 GFNRGEC (SEQ ID NO:27) 또는 FNRGEC (SEQ ID NO:28)를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다 (US2007/0004909).
바람직한 구체예에서, 헤테로다이머-촉진 도메인은 반대 전하의 나란히 반복된 코일 도메인, 예를 들어, 그것의 글루타메이트 잔기가 pH 7에서 음전하를 형성할 "E-코일" 헤테로다이머-촉진 도메인 (SEQ ID NO:29: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K), 또는 그것의 리신 잔기가 pH 7에서 양전하를 형성할 "K-코일" 헤테로다이머-촉진 도메인 (SEQ ID NO:30: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)을 포함할 것이다. 이러한 대전된 도메인의 존재는 제1 및 제2 폴리펩타이드 사이의 회합을 촉진하고, 그로써 헤테로다이머 형성을 강화시킨다. 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하기 위하여 상기 기술된 E-코일 및 K-코일 서열의 변형을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인이 이용될 수 있다. 그러한 시스테인 잔기의 존재는 한 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 코일이 다른 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 상보하는 코일에 공유 결합되고, 그로써 폴리펩타이드 사슬이 서로 공유 결합되는 것을 허용하여 디아바디의 안정성을 증가시킨다. 이러한 특히 바람직한 헤테로다이머-촉진 도메인의 예는 아미노산 서열 E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:31)을 가지는 변형된 E-코일, 및 아미노산 서열 K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:32)를 가지는 변형된 K-코일을 들 수 있다.
WO 2012/018687에서 개시된 것과 같이, 디아바디의 생체내 약물동역학적 특성을 개선시키기 위하여, 디아바디는 디아바디의 하나 이상의 말단에서 혈청-결합 단백질의 폴리펩타이드 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. 가장 바람직하게, 혈청-결합 단백질의 이러한 폴리펩타이드 부분은 디아바디의 폴리펩타이드 사슬의 C-말단에서 배치될 것이다. 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고 인간에서 19일의 반감기를 가진다. 알부민은 다른 단백질에 비공유적으로 결합하는 것을 허용함으로써 혈청 반감기를 연장시키는 소분자 결합 부위를 여러 개 가지고 있다.
스트렙토코쿠스 (Streptococcus) 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)은 안정적인 3-나선 번들을 형성하는 46개의 아미노산 잔기로 이루어지며 넓은 알부민-결합 특이성을 가지고 있다 (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules", J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). 그러므로, 디아바디의 생체내 약물동역학적 특성을 개선하기 위하여 혈청-결합 단백질의 특히 바람직한 폴리펩타이드 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G로부터의 알부민-결합 도메인 (ABD)M 보다 바람직하게는 스트렙토코쿠스 스트레인 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3 (ABD3)으로부터 유래된다 (SEQ ID NO:33): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLINNAKT VEGVKALIDE ILAALP.
WO 2012/162068 (본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 것과 같이, SEQ ID NO:33의 "탈면역화된" 변이체는 MHC 부류 II 결합을 약화 또는 제거하는 능력을 가진다. 조합된 돌연변이 결과를 토대로, 다음의 치환 조합이 이러한 탈면역화된 ABD를 형성하기 위한 바람직한 치환인 것으로 여겨진다: 66D/70S +71A; 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. 변이체 ABD는 변형 L64A, I65A 및 D79A 또는 변형 N66S, T70S 및 D79A를 가진다. 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66NAK S 70 A 71EGVKALIDE ILAALP (SEQ ID NO:34),
또는 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65NNAKT VEGVKALI A 79E ILAALP (SEQ ID NO:35),
또는 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66NAK S 70 VEGVKALI A 79E ILAALP (SEQ ID NO:36)
를 가지는 변이체 탈면역화된 ABD가, 실질적으로 야생형 결합을 나타내는 한편 약화된 MHC 부류 II 결합을 제공하는 그러한 탈면역화된 ABD로서 특히 바람직하다. 그러므로, ABD를 가지는 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은 E-코일 (또는 K-코일) 도메인과 ABD (바람직하게 탈면역화된 ABD임) 사이에 개재하기 위하여 이러한 폴리펩타이드 사슬의 E-코일 (또는 K-코일) 도메인에 C-말단쪽에 바람직하게 배치되는 제3 링커 (링커 3)를 함유한다. 이러한 링커 3의 바람직한 서열은 SEQ ID NO:18: GGGS이다.
B. Fc 도메인을 포함하는 디아바디
본 발명의 한 구체예는 Fc 도메인을 포함하고 CD3의 에피토프 및 질환 항원의 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 디아바디 (예컨대, 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적, 등)에 관한 것이다. 이러한 분자의 Fc 도메인은 임의의 아이소타입의 것일 수 있다 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4). 분자는 추가로 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 존재하는 경우, CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인은 임의의 아이소타입의 것일 수 있고 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), 바람직하게는 원하는 Fc 도메인과 동일한 아이소타입의 것이다.
디아바디 폴리펩타이드 사슬 중 하나 또는 둘 다에 IgG CH2-CH3 도메인의 첨가, 그로 인해 디아바디 사슬의 복합체 형성은 Fc 도메인의 형성을 초래하고, 생물학적 반감기를 증가시키며 및/또는 디아바디의 결합가를 변경시킨다. 이러한 디아바디는, 그것의 서열이 폴리펩타이드 사슬이 서로에게 공유적으로 결합되어 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 공유적으로 회합된 디아바디를 형성하는 것을 허용하는 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 두 디아바디 폴리펩타이드 전부에 IgG CH2-CH3 도메인을 포함시키는 것은 2-사슬 이중특이적 Fc 도메인-함유 디아바디가 형성되는 것을 허용할 것이다 (도 2).
대안으로, 디아바디 폴리펩타이드의 유직 하나에만 IgG CH2-CH3 도메인을 포함시키는 것은 보다 복잡한 4-사슬 이중특이적 Fc 도메인-함유 디아바디가 형성디는 것을 허용할 것이다 (도 3A-3C). 도 3C는 불변 경쇄 (CL) 도메인 및 불변 중쇄 CH1 도메인을 가지는 대표적인 4-사슬 디아바디를 나타내지만, 다른 폴리펩타이드뿐만 아니라 이러한 도메인의 단편이 대체로 사용될 수 있다 (예컨대, 도 3A 및 3B, 미국 특허 공개 번호 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허 공개 번호 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공개 번호 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 그러므로, 예를 들어, CH1 도메인 대신, 당업자는 인간 IgG의 힌지 도메인으로부터 유래된 아미노산 서열 GVEPKSC (SEQ ID NO:24), VEPKSC (SEQ ID NO:25), 또는 AEPKSC (SEQ ID NO:26)를 가지는 펩타이드를 사용할 수 있고, CL 도메인 대신, 당업자는 인간 카파 경쇄의 C-말단의 6개 아미노산, GFNRGEC (SEQ ID NO:27) 또는 FNRGEC (SEQ ID NO:28)를 사용할 수 있다. 대표적인 펩타이드 함유 4-사슬 디아바디가 도 3A에 도시된다. 대안으로, 또는 더불어, 당업자는 "E-코일" 나선형 도메인 (SEQ ID NO:29: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K 또는 SEQ ID NO:31: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K); 및 "K-코일" 도메인 (SEQ ID NO:30: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E 또는 SEQ ID NO:32: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)과 같은 반대 전하의 나란한 코일 도메인을 포함하는 펩타이드를 사용할 수 있다. 대표적인 코일 도메인 함유 4-사슬 디아바디가 도 3B에 도시된다.
본 발명의 Fc 도메인-함유 디아바디 분자는 추가적인 개재 스페이서 펩타이드 (링커)를 포함할 수 있고, 일반적으로 이러한 링커는 헤테로다이머-촉진 도메인 (예컨대, E-코일 또는 K-코일)과 CH2-CH3 도메인 사이 및/또는 CH2-CH3 도메인과 가변 도메인 (즉, VH 또는 VL) 사이에 포함될 것이다. 전형적으로, 추가적인 링커는 3-20개의 아미노산 잔기를 포함할 것이고 선택적으로 IgG 힌지 도메인의 전부 또는 일부 (바람직하게 1, 2, 3개 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 가지는 IgG 힌지 도메인의 시스테인-함유 부분)를 함유할 것이다. 본 발명의 이중특이적 Fc 도메인-함유 디아바디 분자에 사용될 수 있는 링커로는 다음을 들 수 있다: GGGS (SEQ ID NO:18), LGGGSG (SEQ ID NO:19), GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:20), ASTKG (SEQ ID NO:21), LEPKSS (SEQ ID NO:22), APSSS (SEQ ID NO:23), APSSSPME (SEQ ID NO:37), VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:38), LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:39), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40), scFv 링커: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:41); "긴" 링커: GGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:42), GGC, 및 GGG. LEPKSS (SEQ ID NO:22)는 클로닝의 용이함을 위해 GGG 또는 GGC 대신 사용될 수 있다. 추가적으로, 아미노산 GGG, 또는 LEPKSS (SEQ ID NO:22) 뒤에 바로 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)가 이어져서 대체 링커: GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:43); 및 LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:44)가 형성될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 Fc 도메인-함유 분자는 링커에 더불어 또는 링커 대신 IgG 힌지 도메인을 포함시킬 수 있다. 예시의 힌지 도메인으로는 다음을 들 수 있다: IgG1으로부터의 EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:5), IgG2로부터의 ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO:6), IgG3으로부터의 ELKTPLGDTT HTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP (SEQ ID NO:7), IgG4로부터의 ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO:8), 및 가닥 교환을 감소시키기 위하여 안정화 S228P 치환 (넘버링은 Kabat에서 제시된 것과 같은 EU 인덱스에 의한 것임)을 포함하는 IgG4 힌지 변이체 ESKYGPPCP P CP (SEQ ID NO:9).
도 3A-3C에서 제공된 것과 같이, 발명의 Fc 도메인-함유 디아바디는 4개의 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 디아바디의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 3개의 도메인: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인, (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인, 및 (iv) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은: (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인, 및 (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하고, 여기서 헤테로다이머-촉진 도메인은 제1/제3 폴리펩타이드 사슬과 제2/제4 폴리펩타이드 사슬과의 다이머화를 촉진한다. 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인, 및 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인은 단일특이적, 이중특이적 또는 사중특이적인 4가 결합을 허용하기 위하여 동일하거나 상이할 수 있다. 표시 "VL3" 및 "VH3"은 각각, 이러한 디아바디의 "제3" 에피토프에 결합하는 경쇄 가변 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 나타낸다. 유사하게, 표시 "VL4" 및 "VH4"는 각각, 이러한 디아바디의 "제4" 에피토프에 결합하는 경쇄 가변 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 나타낸다. 발명의 대표적인 4-사슬 이중특이적 Fc 도메인-함유 디아바디의 폴리펩타이드 사슬의 일반 구조가 표 1에서 제공된다:
이중특이적 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
사중특이적 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VL3-VH4-HPD-CH2-CH3-COOH
제4 사슬 NH2-VL4-VH3-HPD-COOH
HPD = 헤테로다이머-촉진 도메인
특정 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 총 4개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 이중특이적, 4가 (즉, 4개의 에피토프-결합 도메인을 가짐), Fc-함유 디아바디이다 (도 3A-3C). 발명의 이중특이적, 4가, Fc-함유 디아바디는 2개의 제1 에피토프-결합 도메인 및 2개의 제2 에피토프-결합 도메인을 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 디아바디는 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드는 3개의 도메인: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 이러한 디아바이의 제2 폴리펩타이드는: (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다. 이러한 디아바디의 제3 폴리펩타이드는 CH2-CH3 서열을 포함한다. 그러므로, 이러한 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 또는 제2 에피토프 중 어느 하나와 결합할 수 있는 VL1/VH1 에피토프-결합 도메인뿐만 아니라, 이러한 에피토프의 다른 하나와 결합할 수 있는 VL2/VH2 에피토프-결합 도메인을 형성한다. 제1 및 제2 폴리펩타이드는 그것들의 각각의 제3 도메인에서 시스테인 잔기를 포함하는 이황화 결합을 통해 서로에게 결합된다. 특히, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 다이설파이드 결합을 통해 안정화되는 Fc 도메인을 형성하기 위해 서로와 복합체를 형성한다. 이러한 이중특이적 디아바디는 향상된 효능을 가진다. 도 4A 및 4B는 이러한 디아바디의 구조를 예시한다. 이러한 Fc 도메인-함유 디아바디는 두 방향 중 어느 한 방향을 가질 수 있다 (표 2):
제1 방향 제3 사슬 NH2-CH2-CH3-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제2 방향 제3 사슬 NH2-CH2-CH3-COOH
제1 사슬 NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
HPD = 헤테로다이머-촉진 도메인
특정 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 총 3개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 이중특이적, 2가 (즉, 2개의 에피토프-결합 도메인을 가짐), Fc-함유 디아바디이다 (도 4A-4B). 발명의 이중특이적, 2가 Fc-함유 디아바디는 제1 또는 제2 에피토프 중 어느 한 에피토프에 대해 면역특이적인 한 에피토프-결합 도메인뿐만 아니라, 이러한 에피토프의 다른 하나에 결합할 수 있는 VL2/VH2 에피토프-결합 도메인을 포함한다.
추가의 구체예에서, Fc 도메인-함유 디아바디는 총 5개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 5개의 폴리펩타이드 사슬 중 2개는 동일한 아미노산 서열을 가진다. 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은: (i) VH1-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인, 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제1 폴리펩타이드 사슬은 VH1 및 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체의 중쇄일 수 있다. 이러한 디아바디의 제2 및 제5 폴리펩타이드 사슬은: (i) VL1-함유 도메인, 및 (ii) CL-함유 도메인을 함유한다. 이러한 디아바디의 제2 및/또는 제5 폴리펩타이드 사슬은 제1/제3 폴리펩타이드 사슬의 VH1에 상보하는 VL1을 함유하는 항체의 경쇄일 수 있다. 제1, 제2 및/또는 제5 폴리펩타이드 사슬은 자연적으로 발생하는 항체로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 그것들은 재조합에 의해 구성될 수 있다. 이러한 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬은: (i) VH1-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인, (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인, (iv) VL2-함유 도메인, (v) VH3-함유 도메인 및 (vi) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하고, 헤테로다이머-촉진 도메인은 제3 사슬과 제4 사슬의 다이머화를 촉진한다. 이러한 디아바디의 제4 폴리펩타이드는: (i) VL3-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다.
그러므로, 이러한 디아바디의 제1 및 제2, 및 제3 및 제5 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 에피토프에 결합할 수 있는 2개의 VL1/VH1 에피토프-결합 도메인을 형성한다. 이러한 디아바디의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 에피토프-결합 도메인뿐만 아니라, 제3 에피토프에 결합할 수 있는 VL3/VH3 결합 부위를 형성한다. 제1 및 제3 폴리펩타이드는 그것들의 각각의 불변 영역에서 시스테인 잔기를 포함하는 이황화 결합을 통해 서로에게 결합된다. 특히, 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 서로와 복합체를 형성하여 Fc 도메인을 형성한다. 이러한 다중특이적 디아바디는 향상된 효능을 가진다. 도 5는 이러한 디아바디의 구조를 예시한다. VL1/VH1, VL2/VH2, 및 VL3/VH3 도메인은 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적인 결합을 허용하기 위하여 동일하거나 상이할 수 있는 것이 이해될 것이다.
폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 원하는 에피토프에 특이적인 VL/VH 결합 부위를 형성하기 위하여 선택된다. 폴리펩타이드 사슬의 회합에 의해 형성된 VL/VH 결합 부위는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적인 4가 결합을 허용하기 위하여 동일하거나 상이할 수 있다. 특히, VL 및 VH 도메인은 다가 디아바디가 제1 에피토프에 대한 2개의 결합 도메인 및 제2 에피토프에 대한 2개의 결합 도메인, 또는 제1 에피토프에 대한 3개의 결합 도메인 및 제2 에피토프에 대한 1개의 결합 도메인, 또는 제1 에피토프에 대한 2개의 결합 도메인, 제2 에피토프에 대한 1개의 결합 도메인 및 제3 에피토프에 대한 1개의 결합 도메인을 포함할 수 있도록 (도 5에 도시됨) 선택될 수 있다. 발명의 대표적인 5-사슬 Fc 도메인-함유 디아바디의 폴리펩타이드 사슬의 일반 구조가 표 3에서 제공된다:
이중특이적 (2x2) 제2 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제1 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH2-HPD-COOH
제5 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제4 사슬 NH2-VL2-VH2-HPD-COOH
이중특이적 (3x1) 제2 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제1 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
제5 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제4 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
삼중특이적 (2x1x1) 제2 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제1 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VH1-CH1-CH2-CH3-VL2-VH3-HPD-COOH
제5 사슬 NH2-VL1-CL-COOH
제4 사슬 NH2-VL3-VH2-HPD-COOH
HPD = 헤테로다이머-촉진 도메인
특정 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 제1 에피토프에 대해 면역특이적인 2개의 에피토프-결합 도메인, 및 제2 에피토프에 대해 특이적인 2개의 에피토프-결합 도메인을 가지는 총 5개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 이중특이적, 4가 (즉, 4개의 에피토프-결합 도메인을 가짐), Fc-함유 디아바디이다. 다른 구체예에서, 발명의 이중특이적, 4가, Fc-함유 디아바디는 제1 에피토프에 대해 면역특이적인 3개의 에피토프-결합 도메인 및 제2 에피토프에 대해 특이적인 1개의 에피토프-결합 도메인을 포함한다. 상기에서 제공된 것과 같이, VL 및 VH 도메인은 삼중특이적 결합을 허용하기 위해 선택될 수 있다. 따라서, 발명은 또한 삼중특이적, 4가, Fc-함유 디아바디를 포함한다. 발명의 삼중특이적, 4가, Fc-함유 디아바디는 제1 에피토프에 대해 면역특이적인 2개의 에피토프-결합 도메인, 제2 에피토프에 대해 면역특이적인 1개의 에피토프-결합 도메인, 및 제3 에피토프에 대해 면역특이적인 1개의 에피토프-결합 도메인을 포함한다.
전통적인 면역 기능에서, 항체-항원 복합체의 면역 체계의 세포와의 상호작용은 항체-의존성 세포독성, 비만 세포 탈과립화, 및 식세포작용과 같은 이펙터 기능으로부터 림프구 증식 및 항체 분비의 조절과 같은 면역조절 신호에 이르기까지 다양한 반응을 초래한다. 이들 상호작용은 전부 항체 또는 면역 복합체의 Fc 도메인의 조혈 세포 상의 특수화된 세포 표면 수용체에의 결합을 통해 개시된다. 항체 및 면역 복합체에 의해 촉발된 세포 반응의 다양성은 3개의 Fc 수용체: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), 및 FcγRIII (CD16)의 구조적 이질성으로부터 유발된다. FcγRI (CD64), FcγRIIA (CD32A) 및 FcγRIII (CD16)은 활성화 (즉, 면역 체계 증강) 수용체이고; FcγRIIB (CD32B)는 억제 (즉, 면역 체계 약화) 수용체이다. 이에 더불어, 신생아 수용체 (FcRn)와의 상호작용은 엔도솜으로부터 세포 표면으로의 IgG 분자의 재순환 및 혈액으로의 방출을 매개한다. 예시의 야생형 IgG1 (SEQ ID NO:10), IgG2 (SEQ ID NO:11), IgG3 (SEQ ID NO:12), 및 IgG4 (SEQ ID NO:13)의 아미노산 서열은 상기 제시된다.
Fc 도메인의 변형은 변경된 표현형, 예를 들어 변경된 혈청 반감기, 변경된 안정성, 세포 효소에 대한 변경된 민감성 또는 변경된 이펙터 기능으로 이어질 수 있다. 그러므로 본 발명의 Fc 도메인-함유 결합 분자를, 예를 들어, 암 치료에서 이러한 분자의 유효성을 증강시키기 위하여, 이펙터 기능과 관련하여 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. Fc 도메인-매개된 이펙터 기능의 감소 또는 제거는 특정 경우에, 예를 들어, 그것의 작용 메커니즘이 차단 또는 길항작용을 포함하지만 표적 항원을 포함한 세포는 살해하지 않는 항체의 경우에 바람직하다. 증가된 이펙터 기능은 일반적으로 FcγR이 저수준으로 발현되는, 예를 들어, 저 수준의 FcγRIIB를 가진 종양-특이적 B 세포인 바람직하지 못한 세포, 예컨대 종양 및 외래 세포에 대해 지시될 때 바람직하다 (예컨대, 비호지킨 림프종, CLL, 및 버킷 림프종). 이러한 부여된 또는 변경된 이펙터 기능 활성을 가지는 발명의 분자는 이펙터 기능 활성의 증강된 효능이 바람직한 질환, 장애 또는 감염의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
따라서, 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 Fc 도메인은 조작된 변이체 Fc 도메인일 수 있다. 비록 본 발명의 이중특이적 Fc 도메인-함유 분자의 Fc 도메인이 하나 이상의 Fc 수용체 (예컨대, FcγR(들))에 결합하는 능력을 가질 수 있어도, 보다 바람직하게 이러한 변이체 Fc 도메인은 변경된 결합 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b) (야생형 Fc 도메인에 의해 나타난 결합에 비해)를 가지며, 예컨대, 활성화 수용체에 대한 증강된 결합을 가지거나 및/또는 억제 수용체(들)에 대한 실질적으로 감소된 결합 능력을 갖거나 결합 능력을 갖지 않을 것이다. 그러므로, 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 Fc 도메인은 완전한 Fc 도메인의 CH2 도메인의 일부 또는 전부 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있거나, 또는 변이체 CH2 및/또는 변이체 CH3 서열 (예를 들어, 완전한 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 도메인과 관련하여 하나 이상의 삽입 및/또는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있음)을 포함할 수 있다. 이러한 Fc 도메인은 비-Fc 폴리펩타이드 부분을 포함할 수 있거나, 또는 자연적으로 완전하지 않은 Fc 도메인의 부분을 포함할 수 있거나, 또는 자연적으로 발생하지 않는 방향의 CH2 및/또는 CH3 도메인 (예컨대, 예를 들어, 2개의 CH2 도메인 또는 2개의 CH3 도메인, 또는 N-말단에서 C-말단 방향으로, CH2 도메인에 연결된 CH3 도메인, 등)을 포함할 수 있다.
이펙터 기능을 변경시키는 것으로 확인된 Fc 도메인 변형은 기술분야에 알려져 있고, 활성화 수용체 (예컨대, FcγRIIA (CD16A))에 대한 결합을 증가시키고 억제 수용체 (예컨대, FcγRIIB (CD32B))에 대한 결합을 감소시키는 변형을 포함한다 (예컨대, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro and Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors", Cancer Res. 57(18):8882-8890). 표 4는 활성화 수용체에 대한 결합을 증가시키거나 및/또는 억제 수용체에 대한 결합을 감소시키는 예시의 변형의 예시의 단일, 이중, 삼중, 사중 및 오중 치환 (넘버링 (EU 인덱스에 따름) 및 치환은 상기에서 제시된 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열과 관련됨)을 열거한다.
바람직한 활성화 Fc 도메인의 변이†
단일-부위 변이
F243L R292G D270E R292P
Y300L P396L
이중-부위 변이
F243L 및 R292P F243L 및 Y300L F243L 및 P396L R292P 및 Y300L
D270E 및 P396L R292P 및 V305I P396L 및 Q419H P247L 및 N421K
R292P 및 P396L Y300L 및 P396L R255L 및 P396L R292P 및 P305I
K392T 및 P396L
삼중-부위 변이
F243L, P247L 및 N421K P247L, D270E 및 N421K
F243L, R292P 및 Y300L R255L, D270E 및 P396L
F243L, R292P 및 V305I D270E, G316D 및 R416G
F243L, R292P 및 P396L D270E, K392T 및 P396L
F243L, Y300L 및 P396L D270E, P396L 및 Q419H
V284M, R292L 및 K370N R292P, Y300L 및 P396L
사중-부위 변이
L234F, F243L, R292P 및 Y300L F243L, P247L, D270E 및 N421K
L234F, F243L, R292P 및 Y300L F243L, R255L, D270E 및 P396L
L235I, F243L, R292P 및 Y300L F243L, D270E, G316D 및 R416G
L235Q, F243L, R292P 및 Y300L F243L, D270E, K392T 및 P396L
P247L, D270E, Y300L 및 N421K F243L, R292P, Y300L, 및 P396L
R255L, D270E, R292G 및 P396L F243L, R292P, V305I 및 P396L
R255L, D270E, Y300L 및 P396L F243L, D270E, P396L 및 Q419H
D270E, G316D, P396L 및 R416G
오중-부위 변이
L235V, F243L, R292P, Y300L 및 P396L F243L, R292P, V305I, Y300L 및 P396L
L235P, F243L, R292P, Y300L 및 P396L
† 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스를 따름
감소된 결합 CD32B 및/또는 증가된 결합 CD16A를 가지는 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시의 변이체는 F243L, R292P, Y300L, V305I 또는 P396L 치환을 함유하고, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. 이들 아미노산 치환은 인간 IgG1 Fc 도메인에 임의의 조합으로 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인은 F243L, R292P 및 Y300L 치환을 함유한다. 다른 구체예에서,변이체 인간 IgG1 Fc 도메인은 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P396L 치환을 함유한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 결합 분자의 Fc 도메인은 (야생형 IgG1 Fc 도메인 (SEQ ID NO:10)에 의해 나타난 결합에 비해) 감소된 (또는 실질적으로는 없는) 결합 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)를 나타내는 것이 바람직하다. 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 결합 분자는 감소된 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 나타내는 IgG Fc 도메인을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 결합 분자의 CH2-CH3 도메인은 다음 치환: L234A, L235A, D265A, N297Q, 및 N297G 중 임의의 1, 2, 3, 또는 4개를 포함하고, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. 다른 구체예에서, CH2-CH3 도메인은 N297Q 치환, N297G 치환, L234A 및 L235A 치환 또는 D265A 치환을 함유하는데, 이들 돌연변이가 FcR 결합을 없애기 때문이다. 대안으로, (야생형 IgG1 Fc 도메인 (SEQ ID NO:10)에 의해 나타난 결합 및 이펙터 기능에 비해) 감소된 (또는 실질적으로는 없는) 결합 FcγRIIIA (CD16a) 및/또는 감소된 이펙터 기능을 독특하게 나타내는 자연적으로 발생하는 Fc 도메인의 CH2-CH3 도메인이 이용된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 결합 분자는 IgG2 Fc 도메인 (SEQ ID NO:11), IgG3 Fc 도메인 (SEQ ID NO:12) 또는 IgG4 Fc 도메인 (SEQ ID NO:13)을 포함한다. IgG4 Fc 도메인이 이용될 때, 본 발명은 또한 안정화 돌연변이, 예컨대 상기에서 기술된 힌지 영역 S228P 치환의 도입을 포함한다 (예컨대, SEQ ID NO:9 참조). N297G, N297Q, L234A, L235A 및 D265A 치환이 이펙터 기능을 없애기 때문에, 이펙터 기능이 바람직한 상황에서, 이들 치환은 바람직하게는 사용되지 않을 것이다.
감소된 또는 없어진 이펙터 기능을 가지는 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 IgG1 서열은 치환 L234A/L235A를 포함할 것이다 (SEQ ID NO:45):
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
Fc 도메인을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 도메인의 결합 친화도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "반감기"는 그것의 투여 후에 분자의 평균 생존 시간의 척도인 분자의 약물동역학적 특성을 의미한다. 반감기는 대상체 신체 (예컨대, 인간 환자 또는 다른 포유류) 또는 그것의 특정 구획으로부터, 예를 들어, 혈청에서 측정되는 바, 즉, 순환 반감기, 또는 다른 조직에서 공지된 양의 분자의 50 퍼센트 (50%)를 제거하기 위해 필요한 시간으로서 표시될 수 있다. 일반적으로, 반감기의 증가는 투여된 분자에 대한 순환에서의 평균 체류 시간 (MRT)의 증가를 초래한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 결합 분자는 야생형 Fc 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 Fc 도메인을 포함하여서, 분자는 증가된 반감기 (야생형 Fc 도메인을 포함하는 경우 그러한 분자에 비해)를 가지게 된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 결합 분자는 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435, 및 436으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 반감기 연장 아미노산 치환을 포함하는 변이체 IgG Fc 도메인을 포함하고, 여기서 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스의 넘버링이다. Fc 도메인-함유 분자의 반감기를 증가시킬 수 있는 수많은 돌연변이가 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 M252Y, S254T, T256E, 및 이것들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,277,375호, 7,083,784호; 7,217,797호, 8,088,376호; 미국 특허 공개 번호 2002/0147311호; 2007/0148164호; 및 PCT 공개 번호 WO 98/23289; WO 2009/058492; 및 WO 2010/033279 (이것들은 본원에 그 전문이 참조로 포함됨)에서 기술된 돌연변이를 참조한다.
일부 구체예에서, 향상된 반감기를 나타내는 본 발명의 Fc 도메인-함유 결합 분자는 Fc 도메인 잔기 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 및 436 중 둘 이상에서 치환을 포함하는 변이체 Fc 도메인을 가진다. 특히, 둘 이상의 치환은: T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K, 및 Y436I로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 이러한 분자는 다음 치환을 포함하는 변이체 IgG Fc 도메인을 가질 수 있다:
(A) M252Y, S254T 및 T256E;
(B) M252Y 및 S254T;
(C) M252Y 및 T256E;
(D) T250Q 및 M428L;
(E) T307Q 및 N434A;
(F) A378V 및 N434A;
(G) N434A 및 Y436I;
(H) V308P 및 N434A; 또는
(I) K288D 및 H435K.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 결합 분자는 치환: M252Y, S254T 및 T256E 중 임의의 1, 2, 또는 3개를 포함하는 변이체 IgG Fc 도메인을 가진다. 발명은 추가로:
(A) 이펙터 기능 및/또는 FcγR 결합을 변경시키는 하나 이상의 돌연변이; 및
(B) 혈청 반감기를 연장시키는 하나 이상의 돌연변이
를 포함하는 변이체 Fc 도메인을 가지는 그러한 결합 분자를 포함한다.
증가된 반감기를 제공하는 (및 시노몰구스 원숭이 및 인간 FcRn 둘 다에 대한 결합에서 10배 증가를 가지는) (Dall'Acqua, W.F. et al. (2006) "Properties of Human IgG1s Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn)", J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524) 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 IgG1 서열은 치환 M252Y/S254T/T256E를 포함할 것이다 (SEQ ID NO:46):
APELLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
치환 L234A/L235A에 의해 제공된 감소된 또는 없어진 이펙터 기능 및 치환 M252Y/S254T/T256E에 의해 제공된 증가된 혈청 반감기를 조합하는, 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 대체 IgG1 서열은 SEQ ID NO: 47에 의해 제공된다:
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
상이한 아미노산 서열 (예컨대, 그것의 Fc 도메인-함유 폴리펩타이드 사슬은 동일하지 않을 것이 바람직함)의 Fc-도메인-함유 폴리펩타이드 사슬을 갖는 것이 바람직한 특정 항체, 디아바디 및 3가 결합 분자의 경우, 동일한 사슬의 CH2-CH3 도메인 사이 (예컨대, 2개의 제1 폴리펩타이드 사슬 사이 또는 2개의 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인 사이)에서 발생하는 호모다이머화를 감소 또는 방지하는 것이 바람직하다. 이러한 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 서열이 동일할 필요는 없고, 유익하게는 2개의 폴리펩타이드 사슬 사이에서 복합화를 강화하기 위해 변형된다. 예를 들어, 입체적 간섭이 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방해하고 돌연변이된 도메인이 그 안에 상보하는, 또는 부응하는(accommodating) 돌연변이가 조작되는 도메인, 즉, "구멍(hole)"과 쌍을 이루는 것 (예컨대, 글리신으로의 치환)을 강요하도록 아미노산 치환 (바람직하게는 "손잡이(knob)"를 형성하는 부피가 큰 측면 기를 포함하는 아미노산, 예컨대 트립토판으로의 치환)이 CH2 또는 CH3 도메인에 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 세트는 헤테로다이머화를 강화하기 위해 Fc 도메인을 형성하는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 임의의 쌍 안으로 조작될 수 있다. 호모다이머화보다 헤테로다이머화를 선호하는 단백질 조작 방법은, 특히 면역글로불린-유사 분자의 조작과 관련하여, 기술분야에 잘 알려져 있고, 본원에 포함된다 (예컨대, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization", Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library", J. Mol. Biol. 270: 26-35, 및 Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis", J. Immunol. Methods 296:95-101; (이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
바람직한 손잡이는 변형 T366W를 함유하도록 IgG Fc 도메인을 변형시킴으로써 생성된다. 바람직한 구멍은 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 IgG Fc 도메인을 변형시킴으로써 생성된다. 최종 이중특이적 헤테로다이머 Fc 도메인-함유 분자로부터 구멍-포함 폴리펩타이드 사슬 호모다이머를 정제하는 것을 돕기 위하여, 폴리펩타이드 사슬의 구멍-포함 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 부위는 바람직하게 위치 435에서 아미노산 치환에 의해 돌연변이된다 (H435R). 그러므로, 구멍-포함 폴리펩타이드 사슬 호모다이머는 단백질 A에 결합하지 않는 반면, 이중특이적 헤테로다이머는 손잡이-포함 폴리펩타이드 사슬 상의 단백질 A 결합 부위를 통하여 단백질 A에 결합하는 능력을 보유할 것이다. 대체 구체예에서, 구멍-포함 폴리펩타이드 사슬은 위치 434 및 435에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다 (N434A/N435K).
본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 한 Fc 도메인-함유 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 IgG1 아미노산 서열은 "손잡이-포함" 서열을 가질 것이다 (SEQ ID NO:48):
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
M252Y/S254T/T256E 치환 및 "손잡이-포함" 서열을 가지는, 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 한 Fc 도메인-함유 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 대체 IgG1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:49이다:
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 다른 Fc 도메인-함유 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 IgG1 아미노산 서열은 "구멍-포함" 서열을 가질 것이다 (SEQ ID NO:50):
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X
이고, 여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
M252Y/S254T/T256E 치환 및 "구멍-포함" 서열을 가지는, 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 다른 Fc 도메인-함유 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 대체 IgG1 아미노산 서열은 SEQ ID NO:51이다:
APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL
TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
주지되는 것과 같이, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, 및 SEQ ID NO:51의 CH2-CH3 도메인은 위치 234에서 알라닌으로의 치환 및 235에서 알라닌으로의 치환을 포함하며, 그로써 (야생형 Fc 도메인 (SEQ ID NO:10)에 의해 나타난 결합에 비해) 감소된 (또는 실질적으로는 없는) 결합 FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)를 나타내는 Fc 도메인을 형성한다. 발명은 또한 야생형 알라닌 잔기, 대체 및/또는 Fc 도메인의 이펙터 기능 및/또는 FγR 결합 활성을 변형시키는 추가적인 치환을 포함하는 그러한 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 발명은 또한 하나 이상의 반감기 연장 아미노산 치환을 추가로 포함하는 그러한 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 특히, 발명은 M252Y/S254T/T256E를 추가로 포함하는 그러한 구멍-포함 및 그러한 손잡이-포함 CH2-CH3 도메인을 포함한다.
본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 IgG4 아미노산 서열은 그것의 Y252/T254/E256의 소유로 인해 (IgG1 CH2 및 CH3 도메인에 비해) 향상된 혈청 반감기를 가진다 (SEQ ID NO:52):
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL
TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
이러한 IgG4 CH2-CH3 아미노산 서열의 "손잡이-포함" 변이체는 SEQ ID NO:53의 아미노산 서열을 가진다:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK NQVSL W CLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL
TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
이러한 IgG4 CH2-CH3 아미노산 서열의 "구멍-포함" 변이체는 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열을 가진다:
APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK
PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
LPPSQEEMTK NQVSL S CA V K GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SRL
TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSLG X ,
여기서 X 는 리신 (K)이거나 없다.
제1 폴리펩타이드 사슬은 "손잡이-포함" CH2-CH3 서열을 가지는 것, 예컨대 SEQ ID NO:48 또는 SEQ ID NO:49의 서열을 가지는 것이 바람직하다. 그러나, 인지하게 되는 것과 같이, "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대, SEQ ID NO:50 또는 SEQ ID NO:51)이 제1 폴리펩타이드 사슬에 사용될 수 있고, 그 경우에, "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (예컨대, SEQ ID NO:48 또는 SEQ ID NO:49)은 2개의 폴리펩타이드 사슬을 가지는 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 제2 폴리펩타이드 사슬에 (또는 3, 4, 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 가지는 Fc 도메인-함유 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬에) 사용될 수 있을 것이다.
다른 구체예에서, 발명은 기술분야에 알려져 있는 돌연변이를 사용하여 호모다이머화보다 헤테로다이머화를 선호하도록 조작된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 도메인-함유 결합 분자, 예컨대 PCT 공개 번호 WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867 (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 개시된 것들을 포함한다.
III. Fc 도메인을 함유하는 3가 결합 분자
본 발명의 추가의 구체예는 제1 에피토프, 제2 에피토프 및 제3 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 포함하는 3가 결합 분자에 관련되며, 여기서 이러한 에피토프 중 적어도 하나는 다른 것과 동일하지 않다. 이러한 3가 결합 분자는 3개의 에피토프-결합 도메인을 포함하며, 그 중 2개는 디아바디-형 결합 도메인으로, 결합 부위 A 및 결합 부위 B를 제공하고, 그 중 하나는 Fab-형 결합 도메인, 또는 scFv-형 결합 도메인으로, 결합 부위 C를 제공한다 (예컨대, 도 6A-6F, PCT 공개 번호 WO 2015/184207 및 WO 2015/184203 참조). 그러므로 이러한 3가 결합 분자는 제1 에피토프에 결합할 수 있는 "VL1" / "VH1" 도메인 및 제2 에피토프에 결합할 수 있는 "VL2" / "VH2" 도메인 및 이러한 3가 결합 분자의 "제3" 에피토프에 결합할 수 있는 "VL3" 및 "VH3" 도메인을 포함한다. "디아바디-형 결합 도메인"은 상기에서 기술된 것과 같이 디아바디에 존재하는 에피토프-결합 도메인의 유형이다. "Fab-형 결합 도메인" 및 "scFv-형 결합 도메인"의 각각은 면역글로불린 경쇄의 VL 도메인과 면역글로불린 중쇄의 상보하는 VH 도메인의 상호작용에 의해 형성되는 에피토프-결합 도메인이다. Fab-형 결합 도메인은 Fab-형 결합 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드 사슬이 단일 에피토프-결합 도메인만을 포함하는 반면, 디아바디-형 결합 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드 사슬은 적어도 2개의 에피토프-결합 도메인을 포함한다는 점에서 디아바디-형 결합 도메인과 다르다. 유사하게, scFv-형 결합 도메인 또한 그것이 단일 에피토프-결합 도메인만을 포함하는 점에서 디아바디-형 결합 도메인과 다르다. 그러므로, 본원에서 사용되는 바와 같이, Fab-형, 및 scFv-형 결합 도메인은 디아바디-형 결합 도메인과 구별된다.
전형적으로, 본 발명의 3가 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 포함하겠지만 (도 6A-6B 참조), 그러나, 분자는 예를 들어 이러한 폴리펩타이드 사슬을 (예컨대, 펩타이드 결합을 통해) 서로 융합함으로써 또는 추가적인 폴리펩타이드 사슬을 형성하기 위하여 이러한 폴리펩타이드 사슬을 나눔으로써, 또는 다이설파이드 결합을 통해 더 적은 또는 추가적인 폴리펩타이드 사슬과 회합함으로써, 더 적거나 더 큰 수의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 도 6C-6F는 3개의 폴리펩타이드 사슬을 가지는 이러한 분자를 개략적으로 도시함으로써 본 발명의 이런 측면을 예시한다. 도 6A-6F에서 제공되는 것과 같이, 본 발명의 3가 결합 분자는 디아바디-형 결합 도메인이 Fc 도메인에 대해 N-말단이거나 (도 6A, 6C 및 6D) 또는 C-말단인 (도 6B, 6E 및 6F) 대체 방향을 가질 수 있다. 3가 결합 분자의 생성에 유용한 CH2 및 CH3 도메인은 상기에서 제공되며 손잡이-포함 및 구멍-포함 도메인을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 이러한 3가 결합 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬은: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인, (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인, 및 (iv) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. VL1 및 VL2 도메인은 표 4에서 제시된 것과 같이 CH2-CH3-함유 도메인에 대해 N-말단 또는 C-말단에 위치한다 (또한 도 6A 및 6B 참조). 이러한 구체예의 제2 폴리펩타이드 사슬은: (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인, 및 (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유한다. 이러한 구체예의 제3 폴리펩타이드 사슬은: (i) VH3-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제3 폴리펩타이드 사슬은 VH3 및 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체의 중쇄, 또는 그러한 도메인을 함유하는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 구체예의 제4 폴리펩타이드는: (i) VL3-함유 도메인 및 (ii) CL-함유 도메인을 함유한다. 제4 폴리펩타이드 사슬은 제3 폴리펩타이드 사슬의 VH3에 상보하는 VL3을 함유하는 항체의 경쇄, 또는 이러한 도메인을 함유하는 폴리펩타이드일 수 있다. 제3 또는 제4 폴리펩타이드 사슬은 자연적으로 발생하는 항체로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 그것들은 재조합에 의해, 합성에 의해 또는 다른 수단에 의해 구성될 수 있다.
제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 경쇄 가변 도메인은 제1 또는 제2 에피토프 중 어느 하나에 결합할 수 있는 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위하여 그것들의 VL1/VH2 (또는 그것들의 VL2/VH1) 도메인이 함께 회합하는 것을 허용하기에는 너무 짧은 길이를 가지는 개재 스페이서 펩타이드에 의해 이러한 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 가변 도메인으로부터 분리된다. 이런 목적을 위한 바람직한 개재 스페이서 펩타이드 (링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:16): GGGSGGGG를 가진다. 3가 결합 분자의 다른 도메인은, 선택적으로 시스테인 잔기를 포함하는 하나 이상의 개재 스페이서 펩타이드 (링커)에 의해 분리될 수 있다. 특히, 상기에서 제공된 것과 같이, 이러한 링커는 전형적으로 가변 도메인 (즉, VH 또는 VL)과 펩타이드 헤테로다이머-촉진 도메인 (예컨대, E-코일 K-코일) 사이에 및 이러한 펩타이드 헤테로다이머-촉진 도메인 (예컨대, E-코일 또는 K-코일)과 CH2-CH3 도메인 사이에 포함된다. 3가 결합 분자의 생성에 유용한 예시의 링커는 상기에서 제공되고 또한 PCT 출원 번호: PCT/US15/33081; 및 PCT/US15/33076에서 제공된다. 그러므로, 이러한 3가 결합 분자의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위와, 뿐만 아니라 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위를 형성한다. 이러한 3가 결합 분자의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제3 에피토프에 결합할 수 있는 VL3/VH3 결합 부위를 형성한다.
상기에서 기술된 것과 같이, 본 발명의 3가 결합 분자는 3개의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 3가 결합 분자는 제4 폴리펩타이드의 도메인을 제3 폴리펩타이드의 VH3-함유 도메인에 대해 N-말단으로 연결함으로써 (예컨대, 개재 스페이서 펩타이드 (링커 4)를 사용하여) 얻어질 수 있다. 대안으로, 다음의 도메인: (i) VL3-함유 도메인, (ii) VH3-함유 도메인, 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유하는 발명의 3가 결합 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬이 이용되고, 여기서 VL3 및 VH3은 에피토프-결합 도메인을 형성하기 위하여 이들 도메인의 회합을 허용하기 위해 충분히 긴 (적어도 9개 이상의 아미노산 잔기) 개재 스페이서 펩타이드에 의해 서로 공간적으로 떨어져 있다. 이런 목적에 바람직한 한 개재 스페이서 펩타이드는 서열: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:41)를 가진다.
이러한 3가 결합 분자의 VL1/VH1, VL2/VH2, 및 VL3/VH3 도메인은 단일 특이적이거나, 이중특이적이거나 또는 삼중특이적인 결합을 허용하기 위하여 상이할 수 있는 것이 이해될 것이다. 특히, VL 및 VH 도메인은 3가 결합 분자가 제1 에피토프에 대한 2개의 결합 부위 및 제2 에피토프에 대한 1개의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 1개의 결합 부위 및 제2 에피토프에 대한 2개의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 1개의 결합 부위, 제2 에피토프에 대한 1개의 결합 부위 및 제3 에피토프에 대한 1개의 결합 부위를 포함하도록 선택될 수 있다.
발명의 대표적인 3가 결합 분자의 폴리펩타이드 사슬의 일반 구조가 도 6A-6F 및 표 5에 제공된다:
4-사슬
제1 방향		 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH
제2 사슬 NH2-VL3-CL-COOH
4-사슬
제2 방향		 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
제3 사슬 NH2-VH3-CH1-CH2-CH3-COOH
제2 사슬 NH2-VL3-CL-COOH
3 사슬
제1 방향		 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-VL1-VH2-HPD-CH2-CH3-COOH
제3 사슬 NH2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH
3 사슬
제2 방향		 제2 사슬 NH2-VL2-VH1-HPD-COOH
제1 사슬 NH2-CH2-CH3-VL1-VH2-HPD-COOH
제3 사슬 NH2-VL3-VH3-HPD-CH2-CH3-COOH
HPD = 헤테로다이머-촉진 도메인
상기에서 제공된 것과 같이, 이러한 3가 결합 분자는 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다.
IV. 발명의 구체예
상기에서 진술된 것과 같이, 본 발명은 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인, CDRH3 도메인, CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 rCD3-결합 도메인의 상응하는 CDR의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한, vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이다. 특정 vCD3-결합 도메인과의 이러한 비교에 사용될 rCD3-결합 도메인은 그러한 특정 vCD3-결합 도메인과의 CDR 서열의 최대 동일성을 나타내는 분리된 CD3-결합 항체의 CD3-결합 도메인이다. rCD3-결합 도메인은 바람직하게 또한 프레임워크 영역에서 적어도 95% 내지 100% 동일성을 나타낸다. 바람직한 rCD3-결합 도메인은 CD3 mAb-1의 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인, CDRH3 도메인, CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함한다. 이러한 vCD3-결합 도메인을 포함하는 본 발명의 DA x CD3 결합 분자는 그러한 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 CD3에 대한 변경된 친화성을 나타낸다. 발명은 특히 CD3에 대해 감소된 친화성을 나타내고 질환 항원을 발현하는 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있으며, rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 감소된 수준의 사이토카인 방출을 나타내는, vCD3-결합 도메인을 포함하는 그러한 DA x CD3 결합 분자에 관한 것이다. 발명은 특히 암 및 병원체-관련 질환의 치료에서의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 분자(들)를 포함하는 제약학적 조성물에도 관련된다.
그러므로 발명은 vCD3-결합 도메인의 하나 이상의 VH 및/또는 VL 도메인, 또는 보다 바람직하게, 그러한 도메인의 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3, 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 부분을 포함하는 DA x CD3 결합 분자를 포함한다. 발명의 바람직한 구체예에서, 이러한 DA x CD3 결합 분자 결합 분자는 추가적으로 이러한 분자가 하나, 둘, 또는 그 이상의 질환 항원의 에피토프(들)에 결합하는 것을 허용하기에 충분한 결합 도메인을 함유할 것이다. 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 이러한 DA x CD3 결합 분자는 이러한 분자가 T 림프구, 천연 살해 (NK) 세포, 항원-제공 세포 또는 다른 단핵 세포에서 발현되는, CD2, CD8, CD16, T-세포 수용체 (TCR), NKp46, NKG2D, 등과 같이, 이펙터 세포의 표면에서 발현되는 또 다른 분자의 에피토프(들)에 결합하는 것을 허용하기에 충분한 추가적인 결합 도메인을 함유할 것이다.
본 발명은 또한 이러한 DA x CD3 결합 분자(들)를 포함하는 제약학적 조성물에 관한 것이다.
CD3 및 질환 항원에 면역특이적으로 결합하기에 충분한 결합 도메인을 가짐으로써, 본 발명의 분자는 그 표면에 질환 항원을 배열하는 표적 세포 (예컨대, 암세포 또는 병원체-감염 세포)의 재지시된 사멸을 매개하는 능력을 가진다. 두 가지의 이러한 결합 친화성의 조합된 존재는 그것이 표적 세포의 사멸을 매개할 수 있도록 표적 세포의 부위로 CD3-발현 이펙터 세포를 국지화시키는 (즉, 이펙터 세포를 "재지시하는") 작용을 한다. 상기에서 논의된 것과 같이, 이러한 분자는 이중특이적이거나, 또는 둘 이상의 에피토프에 결합할 수 있다 (예컨대, 삼중특이적).
CD3 결합 분자를 사용하려는 노력은 이러한 치료법에 의해 유발된 높은 수준의 면역 활성화 및 일부 환자에서 고수준의 사이토카인의 유해한 생성에 의해 방해를 받아왔다. 그러므로, 비록 항-CD3 치료법이 수령 환자에서, 크게 증가된 효능과 상관이 있는 상당한 정도의 면역 활성화를 초래했을지라도, 이러한 분자의 사용은 주지할만한 독성과 관련이 있었다 (Frey, N.V. et al. (2016) "Cytokine Release Syndrome With Novel Therapeutics For Acute Lymphoblastic Leukemia", Hematol. Am. Soc. Hematol. Educ Program. (1):567-572; Teachey, D.T. et al. (2013) "Cytokine Release Syndrome After Blinatumomab Treatment Related To Abnormal Macrophage Activation And Ameliorated With Cytokine-Directed Therapy", Blood 121(26):5154-5157; Le Jeune, C. et al. (2016) "Potential For Bispecific T-Cell Engagers: Role Of Blinatumomab In Acute Lymphoblastic Leukemia", Drug Des. Devel. Ther. 10:757-765; Newman, M.J. et al. (2016) "A Review Of Blinatumomab, A Novel Immunotherapy", J. Oncol. Pharm. Pract. 22(4):639-645; Fitzgerald, J.C. et al. (2017) "Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia", Crit. Care Med. 45(2):e124-e131; Teachey, D.T. et al. (2016) "Identification of Predictive Biomarkers for Cytokine Release Syndrome after Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy for Acute Lymphoblastic Leukemia", Cancer Discov. 6(6):664-679; Goebeler, M.E. et al. (2016) "Blinatumomab: A CD19/CD3 Bispecific T Cell Engager (Bite) With Unique Anti-Tumor Efficacy", Leuk. Lymphoma 57(5):1021-1032; Barrett, D.M. et al. (2014) "Toxicity Management For Patients Receiving Novel T-Cell Engaging Therapies", Curr. Opin. Pediatr. 26(1):43-49).
본 발명은 높은 세포독성 및 높은 사이토카인 방출을 모두 나타내는 모(parental) CD3-결합 도메인 (즉, rCD3-결합 도메인)이 DA x CD3 결합 분자에 통합될 때 재지시된 사멸을 매개할 수 있고 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비해 감소된 수준의 사이토카인 방출을 나타내는, CD3에 대한 변경된 친화성을 가진 변이체 (즉, vCD3-결합 도메인)를 생성하도록 조작될 수 있음을 입증함으로써 이런 방해물을 해결한다. 특히, 발명의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 및/또는 IL-6 중 임의의 하나 이상의 감소된 수준의 방출을 나타낸다.
본 발명은 부분적으로는, 세포독성 및 사이토카인 방출이 DA x CD3 결합 분자의 분리 가능한 특성이라는 인식으로부터 유래된다. 본 발명은 고수준의 세포독성을 보유하는 한편 감소된 수준의 사이토카인 방출을 나타내는 변이체 CD3-결합 도메인 (즉, vCD3-결합 도메인), 및 질환의 치료에서 이러한 CD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 이러한 CD3-결합 도메인과 관련하여 용어 "변이체"는 "참조" CD3-결합 도메인 (즉, rCD3-결합 도메인)의 "상응하는" CDRH 및/ CDRL과 상이한 적어도 하나의 CDRH, 및/또는 적어도 하나의 CDRL을 가지는 CD3-결합 도메인을 나타내는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 용어 "상응하는" CDRH 및/ CDRL은 두 개의 그러한 CDR이 CDH1 도메인이거나, 두 개의 그러한 CDR이 CDH2 도메인이거나, 두 개의 그러한 CDR이 CDH3 도메인이거나, 두 개의 그러한 CDR이 CDL1 도메인이거나, 두 개의 그러한 CDR이 CDL2 도메인이거나, 또는 두 개의 그러한 CDR이 CDL3 도메인인, 두 CDR 서열 사이의 비교를 나타낸다. 본원에서 기술된 예시의 vCD3-결합 도메인에 대한 바람직한 rCD3-결합 도메인은 CD3 mAb 1의 CDR: CDH1, CDRH2, CDRH3 및 CDL1, CDRL2, 및 CDRL3 중 적어도 5개, 적어도 4개, 적어도 3개, 적어도 2개 또는 적어도 1개를 가지는 CD3-결합 도메인이다. 바람직하게, 이러한 예시의 vCD3-결합 도메인은 CD3 mAb 1의 CDR: CDH1, CDRH2, CDRH3 및 CDL1, CDRL2, 및 CDRL3 중 적어도 5개를 가질 것이다. vCD3-결합 도메인은 rCD3-결합 도메인의 하나 이상의 CDR의 화학적 변형을 통해 얻어질 수 있지만, 보다 바람직하게는 원하는 vCD3-결합 도메인을 암호화하기 위하여 변경되는 것을 제외하고, rCD3-결합 도메인의 이러한 하나 이상의 CDR를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 형성한 후, 적절한 단백질 발현 시스템 (예컨대, 세포, 또는 시험관내 번역 시스템)에서 이러한 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 얻어질 것이다. 세포독성은 임의의 적합한 방식 (예컨대, EC50, 최대, 등을 측정하기 위한 CTL 검정)으로 측정될 수 있다. 사이토카인 방출은 임의의 적합한 방식 (예컨대, EC50, 최대, 등을 측정하기 위한 CTL 검정)으로 IFN-감마, TNF-알파, IL-6 또는 IL-2 중 임의의 하나 이상을 검정함으로써 측정될 수 있다.
특히, 절대 수준의 최대 세포독성 및 사이토카인 방출은 후보 CD3-결합 도메인이 본 발명에 포함된 적합한 vCD3-결합 도메인인지 여부를 평가하기 위해 사용되는 유일한 기준이 아니다. 더불어, 또는 대안으로, EC50 값이 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 것과 같이, 적합한 vCD3-결합 도메인은, DA x CD3 결합 분자에 포함될 때, 고수준의 세포독성 (즉, 낮은 EC50 농도)을 매개할 수 있는 한편 감소된 수준의 사이토카인 방출을 나타낼 수 있는 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 DA x CD3 결합 분자에 통합될 때, rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 의해 매개된 세포독성의 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%인 최대 세포독성 (예컨대, 18 내지 48시간째에 CTL 검정으로 측정됨)으로 세포 재지시된 세포 사멸을 매개하는 vCD3-결합 도메인을 제공한다. 추가적으로, 또는 대안으로, 발명의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 의해 나타난 세포독성의 약 10% 미만, 약 20% 미만, 약 30% 미만, 약 40% 미만, 약 50% 미만, 약 60% 미만, 약 70% 미만, 약 80% 미만, 약 90% 미만, 약 100% 미만, 약 200% 미만, 약 300% 미만, 약 400% 미만, 또는 약 500% 미만으로 증가된 세포독성의 EC50을 나타낸다 (예컨대, 18 내지 48시간째에 CTL 검정으로 측정됨). 추가적으로, 또는 대안으로 발명의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자의 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 대한 세포독성의 EC50 (예컨대, 18 내지 24시간째에 CTL 검정으로 측정됨)의 비율 (EC50 변이체/ EC50 참조)은 약 2 미만, 약 5 미만, 약 10 미만, 약 20 미만, 약 40 미만, 약 60 미만, 약 80 미만, 약 100 미만, 또는 약 200 미만이다.
특정 구체예에서, 발명의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 의해 나타난 하나 이상의 사이토카인의 최대 방출의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 그 이상 감소한 하나 이상의 사이토카인의 최대 방출을 나타낸다 (예컨대, 18 내지 24시간째에 CTL 검정으로 측정됨). 추가적으로, 또는 대안으로, 발명의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 의해 나타난 하나 이상의 사이토카인의 방출의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80, 적어도 약 90%, 또는 그 이상 증가한 하나 이상의 사이토카인의 방출의 EC50을 나타낸다 (예컨대, 18 내지 48시간째에 CTL 검정으로 측정됨). 특정 구체예에서, 방출된 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 및 IL-6으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가적으로, 또는 대안으로 발명의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자의 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 대한 하나 이상의 사이토카인의 방출의 EC50 (예컨대, 18 내지 24시간째에 CTL 검정으로 측정됨)의 비율 (EC50 변이체/ EC50 참조)은 약 2 이상, 약 5 이상, 약 10 이상, 약 20 이상, 약 40 이상, 약 60 이상, 약 80 이상, 약 100 이상, 또는 약 200 이상이다.
추가적으로, 발명의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 의해 나타난 생체내 활성 (예컨대, 항-종양, 항-병원체 활성)의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%를 보유한다. 본 개시의 관점에서 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 의해 나타난 생체내 활성의 적어도 약 50% 이상인 생체내 활성을 이루기 위해 고용량으로 투여될 수 있지만, 이러한 고용량은 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비교하여 감소된 수준의 사이토카인 방출을 나타낼 것이 이해될 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 이러한 DA x CD3 결합 분자는 단일 CD3의 에피토프에만 및 단일 질환 항원의 에피토프에만 결합하는 능력을 가지도록 단일특이적일 것이다.
대안으로, 이러한 DA x CD3 결합 분자는 다중특이적, 즉, 임의의 방식으로 CD3의 1, 2개, 또는 그 이상의 에피토프(들) 및 하나 이상의 질환 항원(들)의 1, 2, 3, 4개, 또는 4개 이상의 에피토프(들)에 결합하도록 배분될 수 있는, 1, 2, 3, 4개, 또는 4개 이상의 에피토프에 결합할 수 있다.
특정 구체예에서, 이러한 DA x CD3 결합 분자가 단일 질환 항원에만 면역특이적으로 결합할 수 있는 경우, 이것들은 단지 하나의 CD3 에피토프와 이러한 질환 항원의 1, 2개의 에피토프(들) (이 두 질환 항원은 동일하거나 상이할 수 있음)에 면역특이적으로 결합할 수 있거나, 또는 이것들은 단지 하나의 CD3 에피토프와 이러한 질환 항원의 3개의 에피토프(들) (이 3개의 동일할 수 있고, 또는 상이할 수 있고, 또는 2개의 에피토프는 동일하고 1개의 에피토프는 상이함)에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
다른 구체예에서, 이러한 DA x CD3 결합 분자가 2개의 상이한 질환 항원 (예컨대, 제1 질환 항원 및 제2 질환 항원)에 면역특이적으로 결합할 수 있는 경우에, 이것들은 단지 하나의 CD3 에피토프 및 제1 질환 항원의 하나 또는 2개의 에피토프(들) (이 두 제1 질환 항원 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있음) 및 제2 질환 항원의 둘 또는 하나의 에피토프(들) (이 두 제2 질환 항원 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있음)에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이러한 DA x CD3 결합 분자는 3개의 상이한 질환 항원 (예컨대, 제1 질환 항원, 제2 질환 항원 및 제3 질환 항원) 및 단지 하나의 CD3 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 이러한 DA x CD3 결합 분자는 하나 또는 2개의 상이한 질환 항원 (예컨대, 제1 질환 항원 및 제2 질환 항원), 단지 하나의 CD3 에피토프, 및 이펙터 세포 (동일한 유형의 이펙터 세포이거나 상이한 유형의 이펙터 세포일 수 있음)의 하나 또는 2개의 상이한 세포 표면 분자 (동일한 세포 표면 분자이거나 상이한 표면 분자일 수 있음)에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
그러므로, 예를 들어, 이러한 DA x CD3 결합 분자는:
(1) 단일 CD3의 에피토프 및 표적 세포의 표면에 배열되는 단일 질환 항원의 에피토프;
(2) 단일 CD3의 에피토프 및 표적 세포의 표면에 배열되는 동일한 질환 항원의 2개의 에피토프;
(3) 단일 CD3의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 제1 질환 항원의 에피토프 및 표적 세포의 표면에 배열되는 제2 질환 항원의 에피토프;
(4) 단일 CD3의 에피토프 및 표적 세포의 표면에 배열되는 동일한 질환 항원의 3개의 에피토프;
(5) 단일 CD3의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 제1 질환 항원의 2개의 에피토프, 및 표적 세포의 표면에 배열되는 제2 질환 항원의 하나의 에피토프;
(6) 단일 CD3의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 제1 질환 항원의 에피토프, 및 표적 세포의 표면에 배열되는 제2 질환 항원의 에피토프;
(7) 단일 CD3의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 단일 질환 항원의 에피토프 및 이펙터 세포 (CD3을 배열하는 것과 동일한 유형의 이펙터 세포이거나 상이한 유형의 이펙터 세포일 수 있음)의 표면에 배열되는 CD3 이외의 세포 표면 분자의 단일 에피토프;
(8) 단일 CD3의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 질환 항원의 2개의 에피토프 및 이펙터 세포 (CD3을 배열하는 것과 동일한 유형의 이펙터 세포이거나 상이한 유형의 이펙터 세포일 수 있음)의 표면에 배열되는 CD3 이외의 세포 표면 분자의 단일 에피토프;
(9) 단일 CD3의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 제1 질환의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 제2 질환의 에피토프 및 이펙터 세포 (CD3을 배열하는 것과 동일한 유형의 이펙터 세포이거나 상이한 유형의 이펙터 세포일 수 있음)의 표면에 배열되는 CD3 이외의 세포 표면 분자의 단일 에피토프;
(10) 단일 CD3의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 질환 항원의 에피토프, 및 이펙터 세포 (CD3을 배열하는 것과 동일한 유형의 이펙터 세포이거나 상이한 유형의 이펙터 세포일 수 있음)의 표면에 배열되는 CD3 이외의 세포 표면 분자의 2개의 에피토프; 또는
(11) 단일 CD3의 에피토프, 표적 세포의 표면에 배열되는 질환 항원의 에피토프, 이펙터 세포 (CD3을 배열하는 것과 동일한 유형의 이펙터 세포이거나 상이한 유형의 이펙터 세포일 수 있음)의 표면에 배열되는 CD3 이외의 제1 세포 표면 분자의 에피토프, 및 이펙터 세포 (CD3을 배열하는 것과 동일한 유형의 이펙터 세포이거나 상이한 유형의 이펙터 세포일 수 있음)의 표면에 배열되는 CD3 이외의 제2 세포 표면 분자의 에피토프에 결합할 수 있다.
그러므로 발명은 CD3의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 제1 에피토프-결합 도메인 및 이러한 표적 세포에 배열되는 질환 항원의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 제2 에피토프-결합 도메인 및 이펙터 세포 (동일한 유형의 이펙터 세포이거나 상이한 유형의 이펙터 세포일 수 있음)의 상이한 세포 표면 분자의 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 제3 에피토프-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 이펙터 세포의 상이한 세포 표면 분자는 CD8이다. 표 6은 발명의 예시의 분자의 가능한 조합 결합 특이성을 예시한다.
표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 발명의 예시의 분자에 의해 인식된
에피토프의 수
결합 도메인의 총 수 CD3 에피토프 다른 이펙터 세포 에피토프 제1 질환 항원 에피토프 제2 질환 항원 에피토프 제3 질환 항원 에피토프
2 1 0 1 0 0
3 1 0 1 1 0
3 1 1 1 0 0
3 1 0 1 1 0
3 2 0 1 0 0
4 1 0 1 1 1
4 1 0 1 2 0
4 1 0 2 1 0
4 1 1 2 0 0
4 1 1 1 1 0
4 1 2 1 0 0
4 2 0 1 1 0
4 2 0 1 1 0
4 2 1 1 0 0
보다 복잡한 분자를 형성함으로써, 당업자는 CD3 및 하나 이상의 질환 항원 및 선택적으로 4개 이상의 에피토프-결합 도메인을 가지는 이펙터 세포의 상이한 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 DA x CD3 결합 분자를 얻을 수 있다. 분자(들)가 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있도록, 추가적인 결합 용량이 그러한 결합으로부터의 CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 분자 또는 그것의 결합 도메인을 방해하지 않고 그러한 결합으로부터의 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 분자 또는 그것의 결합 도메인을 방해하지 않는 것 외에는, 본 발명의 분자에 의해 결합될 수 있는 에피토프 또는 추가적인 에피토프의 성질 또는 수에 대한 제한은 없다.
V. 예시의 결합 분자
본 발명은 CD3 및 질환 항원, 예컨대 암 항원 또는 병원체-관련 항원에 결합할 수 있는 DA x CD3 결합 분자 (예컨대, 디아바디, 이중특이적 항체, 이중특이적, 3가 분자, BiTe, TandAb, 등)에 관한 것이다. 이러한 결합 분자는 항체의 CDR로부터 및 항체의 VL 및 VH 도메인으로부터 쉽게 제조될 수 있다. 하기에 본 발명의 결합 분자 및 병용 요법을 생성하기 위해 사용될 수 있는 예시의 항체가 열거된다.
A. 항-CD3 항체 CD3 mAb 1
본 발명은 항-인간 CD3 항체, 또는 그것의 CD3-결합 부분의 경쇄 가변 (VL) 도메인 및 중쇄 가변 (VH) 도메인을 포함하고, CD3에 대한 변이체 결합을 매개하는 CD3-결합 도메인 (즉, vCD3-결합 도메인)을 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "변이체 결합"은 그것의 CDR이 변이체 CD3-결합 도메인의 CDR에 대한 최고 서열 동일성을 나타내는 참조 항체의 CD3-결합 도메인에 의해 나타나는 비교 결합을 나타내는 것으로 의도된다. 본 발명의 예시의 vCD3-결합 도메인에 대한 CD3-결합 참조 항체는 CD3 mAb 1이고, 그것의 rCD3-결합 도메인은 인간 CD3 및 비인간 영장류 (예컨대, 시노몰구스 원숭이)의 CD3에 결합할 수 있다.
CD3 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:55)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:56)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG
Figure pct00001
"CD3 mAb 1"의 rCD3-결합 도메인은 SEQ ID NO:55의 잔기 68에 상응하는, Kabat 위치 65에서 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)을 가지는 CD3 mAb 1 VH 도메인 (즉, SEQ ID NO:55 에서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)임) 및 및 CD3 mAb 1 의 VL 도메인 (SEQ ID NO:56)을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 이러한 CD3 mAb 1 VH 도메인이 그것의 잔기 68로서 글리신 (G)을 가지는 경우에, 그것의 서열은 하기 제시되는 SEQ ID NO:63이다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨, Kabat 위치 65는 이중 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK GRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS.
본 발명의 vCD3-결합 도메인을 가지는 CD3-결합 분자는:
(1) 잠재적으로 vCD3-결합 도메인을 가지는 이중특이적 암 항원 x CD3 디아바디 (예를 들어, CD123 x CD3 디아바디 또는 5T4 x CD3 디아바디), 및
(2) 상응하는 rCD3-결합 도메인 (예컨대, CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인 of )을 가지는 이중특이적 암 항원 x CD3 디아바디
가 이펙터 Pan-T-세포 (또는 PBMC) 및 표적 종양 세포 (예컨대, MOLM-13 또는 A498 세포)와, 5:1 (또는 PBMC의 경우 15:1)의 이펙터:표적 세포 비율에서 18, 24, 또는 42 시간 동안 별도로 인큐베이션되고, 백분율 세포독성 (즉, 세포 사멸) 및/또는 EC50이 측정되는 (예를 들어, 손상된 세포에 의해 락테이트 탈수소효소 (LDH)가 배지로 방출되는 것을 CytoTox 96® 비방사능 세포독성 검정 키트 (Promega)에 의해 측정함으로써) CTL 검정을 사용하여 인식될 수 있다. 한 구체예에서, IFN-γ, TNF-α, IL-6, 및 IL-2 사이토카인의 방출은 CTL 검정이 끝날 때 측정될 수 있다. CD4+ 및CD8+ T 림프구 집단은 또한 CTL 검정이 끝날 때 활성화 마커 CD69 및 CD25의 상향 조절에 대해 평가될 수 있다. 잠재적으로 vCD3-결합 도메인을 가지는 이중특이적 암 항원 x CD3 디아바디에 대한 백분율 세포독성 및/또는 EC50과 rCD3-결합 도메인을 가지는 암 항원 x CD3 디아바디의 그것과의 비교는 원하는 변이체 CD3 결합 및/또는 감소된 수준의 사이토카인 방출을 나타내는 vCD3-결합 도메인을 식별한다.
본 발명의 vCD3-결합 도메인을 가지는 CD3-결합 분자는 대안으로:
(1) 잠재적으로 vCD3-결합 도메인을 가지는 이중특이적 암 항원 x CD3 디아바디, 및
(2) rCD3-결합 도메인 (예컨대, CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인)을 가지는 이중특이적 암 항원 x CD3 디아바디
가 FACS 분석에 의하여 종양 항원-발현 세포주의 세포 (MOLM-13 또는 A498 세포)의 표면에 결합하는 그것들의 능력에 대해 별도로 평가되는 결합 검정을 사용하여 인식될 수 있다. 간단히 설명하면, 세포는 미세역가 플레이트에서 디아바디 분자와 함께 인큐베이션된다 (10% 인간 AB 혈청을 함유한 FACS 완충액에서). 그런 후 세포는 세척되고 표지된 항-인간 Fc 이차 항체와 또는 디아바디의 E-코일/K-코일 (EK) 헤테로다이머-촉진 도메인을 인식하는 비오틴-컨쥬게이트된 마우스 항-EK-코일 항체와 함께 인큐데이션되고, 스트렙트아비딘-피코에리트린과 혼합된다. 그런 후 세포는 세척되고 FACS 완충액으로 재현탁되고 유동 세포분석에 의해 분석되고 비교된다.
본 발명의 vCD3-결합 도메인을 가지는 CD3-결합 분자는 대안으로, 예를 들어, NOD/SCID 마우스와 같은 Co-Mix 이종이식 모델을 사용하여 인식될 수 있다. 이러한 검정에서, 마우스는 활성화된 인간 CD4+ 또는 CD8+ T-세포 (E:T = 1:5)와 함께 혼합된 종양 세포 (예컨대, KG1A (AML) 세포)로 주사된다. 잠재적으로 vCD3-결합 도메인을 가지는 이중특이적 암 항원 x CD3 디아바디 또는 rCD3-결합 도메인을 가지는 암 항원 x CD3 디아바디가 동물에 주사되고 종양 성장의 정도가 모니터링되고 비교된다.
대안으로, 본원에서 "CD3 mAb 1 M3" - "CD3 mAb 1 M26"로서 표시된, CD3 mAb 1의 예시의 변이체의 임의의 하나, 둘, 또는 둘 이상이 본 발명의 DA x CD3 결합 분자의 vCD3-결합 도메인을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 발명은 VH 도메인이 Kabat 위치 65에서 아스파테이트 (D) 또는 Kabat 위치 65에서 글리신 (G)을 가지는 CD3 mAb 1 M3 - CD3 mAb 1 M26의 임의의 VL 및 VH 도메인을 가지는 항-CD3 항체를 전체적으로 포함한다. CD3 mAb 1, CD3 mAb 1 M3 - CD3 mAb 1 M26의 예시의 변이체는 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인, CDRH3 도메인, CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및CDRL3 도메인을 포함하는 vCD3-결합 도메인을 가지고, 이것들 중 적어도 하나는 rCD3-결합 도메인 (CD3 mAb 1)의 상응하는 CDR의 아미노산 서열; 및 상기 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 도메인의 아미노산 서열에 비해, 아미노산 서열이 상이하다. 상기 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자는 변경된 친화성으로 CD3에 결합하고 재지시된 사멸을 매개할 수 있으며 저수준의 사이토카인 방출을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 변이체 항-CD3 VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:55의 변이체이고 SEQ ID NO:207에 의해 표시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS X 1 X 2 X 3 MN WVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT
YYADSVKX 4 RF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HX 5 NX 6 X 7 NSX 8 ST X 9 FAX 10 WGQGTL
VTVSS
여기서: X 1 은 T, D, 또는 E이고; X 2 는 Y, D 또는 T이며; X 3 은 A 또는 G이고; X 4 는 D 또는 G이며; X 5 는 G, D, E, 또는 K이고; X 6 은 F 또는 I이며; X 7 은 G 또는 I이고; X 8 은 Y, A, G, 또는 Q이며; X 9 는 W, F, 또는 Y이고; 그리고 X 10 은 Y 또는 E이다.
본 발명의 바람직한 변이체 항-CD3 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56의 변이체이고 SEQ ID NO:208에 의해 표시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G X 1 TNX 2 RAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC AX 3 WYSNLWV F GGGTKLTVLG
여기서: X 1 은 G 또는 D이고; X 2 는 K 또는 G이며; 그리고 X 3 은 L, E 또는 Q이다.
B. 변이체 항-CD3 항체
1. CD3 mAb 1 M1
CD3 mAb 1 M1은 CD3 mAb 1의 저친화성 변이체이고, 따라서 또한 "CD3 mAb 1 로우(Low)"로도 언급된다. CD3 mAb 1 M1의 VH 도메인의 아미노산 서열은 하기에서 SEQ ID NO:64로서 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:64는 S100dT 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat으로 표시됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:64의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYV T WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M1의 VL 도메인의 바람직한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00002
2. CD3 mAb 1 M2
CD3 mAb 1 M2는 보다 빠른 오프-속도(off-rate)를 가지며, 따라서 또한 "CD3 mAb 1 패스트(Fast)"로도 언급된다. CD3 mAb 1 M2의 VH 도메인의 아미노산 서열은 하기에서 SEQ ID NO:66로서 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:66은 Kabat에서와 같이 넘버링된, G96K 및 S100dT 치환 (서열 잔기 110, 이중 밑줄로 나타냄)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:66의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H K NFGNSYV T WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M2의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00003
3. CD3 mAb 1 M3
CD3 mAb 1 M3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:68)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:68은 G99I 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:68의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNF I NSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M3의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00004
4. CD3 mAb 1 M4
CD3 mAb 1 M4의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:70)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:70은 Y100bA 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하고; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:70의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNS A VS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M4의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00005
5. CD3 mAb 1 M5
CD3 mAb 1 M5의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:72)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:72는 Y100bG 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:72의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNS G VS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M5의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00006
Figure pct00007
6. CD3 mAb 1 M6
CD3 mAb 1 M6의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:74)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:74는 Y100bQ 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:74의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNS Q VS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M6의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00008
7. CD3 mAb 1 M7
CD3 mAb 1 M7의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:76)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:76은 G96D 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:76의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H D NFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M7의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00009
8. CD3 mAb 1 M8
CD3 mAb 1 M8의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:78)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:78은 G99E 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:78의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H E NFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M8의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00010
9. CD3 mAb 1 M9
CD3 mAb 1 M9의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:80)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:80은 G99K 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:80의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H K NFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M9의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00011
Figure pct00012
10. CD3 mAb 1 M10
CD3 mAb 1 M10의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:82)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:82는 F98I 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:82의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGN I GNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M10의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00013
11. CD3 mAb 1 M11
CD3 mAb 1 M11의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:84)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:84는 W100eF 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:84의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS F FAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M11의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00014
12. CD3 mAb 1 M12
CD3 mAb 1 M12의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:86)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:86은 W100eY 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:86의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS Y FAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M12의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00015
13. CD3 mAb 1 M13
CD3 mAb 1 M13의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:88)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:88은 Y102E 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:88의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFA EWGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 s 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M13의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00016
Figure pct00017
14. CD3 mAb 1 M14
CD3 mAb 1 M14의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:90)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:90은 T31D 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:90의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS D YAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M14의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00018
15. CD3 mAb 1 M15
CD3 mAb 1 M15의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:92)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:92는 T31E 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:92의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS E YAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M15의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00019
16. CD3 mAb 1 M16
CD3 mAb 1 M16의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:94)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:94는 Y32D 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:94의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS T D AMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M16의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00020
17. CD3 mAb 1 M17
CD3 mAb 1 M17의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:96)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:96은 Y32T 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:96의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS T T AMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M17의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00021
Figure pct00022
18. CD3 mAb 1 M18
CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:98)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:98은 A33G 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:98의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TY G MN WVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M18의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00023
19. CD3 mAb 1 M19
CD3 mAb 1 M19의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:100)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:100은 G96K 및 F98I 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:100의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H K N I GNSYVS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M19의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00024
20. CD3 mAb 1 M20
CD3 mAb 1 M20의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:102)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:102는 G96K 및 Y100bG 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:102의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H K NFGNS G VS WFAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M20의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00025
21. CD3 mAb 1 M21
CD3 mAb 1 M21의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:104)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:104는 G96K 및 W100eF 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:104의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H K NFGNSYVS F FAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M21의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00026
Figure pct00027
22. CD3 mAb 1 M22
CD3 mAb 1 M22의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:106)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:55에 비해, SEQ ID NO:106은 G96K 및 W100eY 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유하며; 추가적으로, 또한 이중 밑줄로 나타낸, Kabat에서와 같이 넘버링된, SEQ ID NO:106의 위치 65는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)일 수 있다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMN WVRQA PGKGLEWVG R IRSKYNNYAT
YYADSVK XRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR H K NFGNSYVS Y FAY WGQGTL
VTVSS,
여기서 X는 아스파테이트 (D) 또는 글리신 (G)이다.
CD3 mAb 1 M22의 바람직한 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:56이다.
Figure pct00028
23. CD3 mAb 1 M23
CD3 mAb 1 M23의 바람직한 VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:63이다.
CD3 mAb 1 M23의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:108)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:56에 비해, SEQ ID NO:108은 L95E 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유한다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC A E WYSNLWV F GGGTKLTVLG.
Figure pct00029
24. CD3 mAb 1 M24
CD3 mAb 1 M24의 바람직한 VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:63이다.
CD3 mAb 1 M24의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:110)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:56에 비해, SEQ ID NO:110은 L95Q 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유한다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC A Q WYSNLWV F GGGTKLTVLG.
Figure pct00030
25. CD3 mAb 1 M25
CD3 mAb 1 M25의 바람직한 VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:63이다.
CD3 mAb 1 M25의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:112)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:56에 비해, SEQ ID NO:112는 G50D 치환 (이중 밑줄로 표시되고, Kabat에서와 같이 넘버링됨)을 함유한다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI GD TNKRAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG.
Figure pct00031
26. CD3 mAb 1 M26
CD3 mAb 1 M26의 바람직한 VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:55 또는 SEQ ID NO:63이다.
CD3 mAb 1 M26의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:114)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨). SEQ ID NO:56에 비해, SEQ ID NO:114는 K53G 치환 (이중 밑줄로 나타냄)을 함유한다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TC RSSTGAVT TSNYAN WVQQ KPGQAPRGLI G GTN G RAP WT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWV F GGGTKLTVLG.
Figure pct00032
C. 이펙터 세포의 세포 표면 분자의 결합하는 예시의 항체
본원에서 사용되는 바, 용어 "이펙터 세포"는 표적 세포 (예컨대, 외래 세포, 감염된 세포 또는 암세포)의 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 매개하는 세포를 나타낸다. 이펙터 세포의 예로는 헬퍼 T-세포, 세포독성 T-세포, 천연 살해 (NK) 세포, 혈장 세포 (항체-분비 B 세포), 대식세포 및 과립구를 들 수 있다. 이러한 세포의 바람직한 세포 표면 분자는 CD2, CD3, CD8, CD16, TCR, 및 NKG2D 수용체를 포함한다. 따라서, 이러한 분자의 에피토프에, 또는 다른 이펙터 세포 표면 분자에 면역특이적으로 결합할 수 있는 분자는 본 발명의 원리에 따라 사용될 수 있다. 그것의 VH 및 VL 도메인이 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 분자를 구성하기 위해 사용될 수 있는 예시의 항체가 하기에 제공된다.
1. 예시의 항-CD2 항체
한 구체예에서, 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 본 발명의 분자는 이펙터 세포에, 이러한 이펙터 세포의 표면에 존재하는 CD2의 에피토프에 면역특이적으로 결합함으로써 결합할 것이다. CD2에 특이적으로 결합하는 분자는 항-CD2 항체 "CD2 mAb Lo-CD2a"를 포함한다.
CD2 mAb Lo-CD2a의 VH 도메인의 아미노산 서열 (ATCC 수탁 번호: 11423); SEQ ID NO:116)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMY WVKQR PKQGLELVG R IDPEDGSIDY
VEKFKK KATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCAR GK FNYRFAY WGQ GTLVTVSS.
CD2 mAb Lo-CD2a의 VL 도메인의 아미노산 서열 (ATCC 수탁 번호: 11423; SEQ ID NO:117)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISC RSSQSLL HSSGNTYLN W LLQRTGQSPQ PLIY LVSKLE
S GVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYC MQFTHYP YT FGAGTKLE LK.
2. 예시의 항-CD8 항체
한 구체예에서, 표적 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 본 발명의 분자는 이펙터 세포에, 이러한 이펙터 세포의 표면에 존재하는 CD8의 에피토프에 면역특이적으로 결합함으로써 결합할 것이다. CD8에 특이적으로 결합하는 분자는 항-CD8 항체 "OKT8" 및 "TRX2"를 포함한다.
OKT8의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:118)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKA SGYTFT DYNMH WVKQS HGKSLEWIG Y IYPYTGGTGY
NQKFKN KATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS.
OKT8의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:119)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMH WY QQKPGQPPKV LIY LASNLES
GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YC QQNNEDPY T FGGGTKLEI KR.
TRX2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:120)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMN WVRQA PGKGLEWVA L IYYDGSNKFY
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TRX2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:121)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KGSQDIN NYLA WYQQKP GKAPKLLIY N TDILHT GVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYC YQ YNNGYT FGQG TKVEIK.
VI. 예시의 암 및 병원체-관련 항원
A. 암세포의 표면에 배열된 예시의 암 항원
본원에서 사용되는 바, 용어 "암 항원"은 암세포 표면에서 특징적으로 발현되고, 따라서 항체-기반 분자 또는 면역조절 분자로 처리될 수 있는 항원을 나타낸다. 암 항원의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 다음을 들 수 있다: 결장암, 위암 뮤신에서 발견되는 19.9; 4.2; ADAM-9 (미국 특허 출원 공개 번호 2006/0172350; PCT 공개 번호 WO 06/084075); 위암에서 발견되는 AH6; ALCAM (PCT 공개 번호 WO 03/093443); APO-1 (악성 인간 림프구 항원) (Trauth, B.C. et al. (1989) "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis", Science 245:301-304); B1 (Egloff, A.M. et al. (2006) "Cyclin B1 And Other Cyclins As Tumor Antigens In Immunosurveillance And Immunotherapy Of Cancer", Cancer Res. 66(1):6-9); B7-H3 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands", Genome Biol. 6:223.1-223.7). Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production", Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes", J. Immunol. 168:6294-6297); BAGE (Bodey, B. 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항체 및 항체-기반 분자
항체 명칭 암 항원 치료 표적 적용
3F8 Gd2 신경모세포종
8H9 B7-H3 신경모세포종, 육종, 전이성 뇌암
아바고보맙(Abagovomab) CA-125 난소암
아데카투무맙(Adecatumumab) Epcam 전립선 및 유방암
아푸투주맙(Afutuzumab) CD20 림프종
알라시주맙(Alacizumab) VEGFR2 암
알투모맙(Altumomab) CEA 대장암
아마툭시맙(Amatuximab) 메소텔린 암
아나투모맙 마페나톡스(Anatumomab Mafenatox) TAG-72 비-소세포 폐 암종
아니프롤루맙(Anifrolumab) 인터페론 A/B 수용체 전신성 홍반성 루푸스
안루킨주맙(Anrukinzumab) IL-13 암
아폴리주맙(Apolizumab) HLA-DR 혈액암
아르키투모맙(Arcitumomab) CEA 위장암
아티누맙(Atinumab) RTN4 암
벡투모맙(Bectumomab) CD22 비호지킨 림프종 (검출)
벨리무맙(Belimumab) BAFF 비호지킨 림프종
베바시주맙(Bevacizumab) VEGF-A 전이성 암, 미숙아 망막병증
비바투주맙(Bivatuzumab) CD44 V6 편평 세포 암종
블리나투모맙(Blinatumomab) CD19 암
브렌툭시맙(Brentuximab) CD30 (TNFRSF8) 혈액암
칸투주맙(Cantuzumab) MUC1 암
칸투주맙 메르탄신(Cantuzumab Mertansine) 뮤신 Canag 대장암
카플라시주맙(Caplacizumab) VWF 암
카프로맙(Capromab) 전립선 암종 세포 전립선암 (검출)
카를루맙(Carlumab) MCP-1 종양학/면역 적응증
카투막소맙(Catumaxomab) Epcam, CD3 난소암, 악성 복수, 위암
Cc49 Tag-72 종양 검출
세툭시맙(Cetuximab) EGFR 전이성 대장암 및 두경부암
Ch.14.18 미결정 신경모세포종
시타투주맙(Citatuzumab) Epcam 난소암 및 기타 고체 종양
식수투무맙(Cixutumumab) IGF-1 수용체 고체 종양
클리바투주맙(Clivatuzumab) MUC1 췌장암
코나투무맙(Conatumumab) TRAIL-R2 암
다세투주맙(Dacetuzumab) CD40 혈액암
달로투주맙(Dalotuzumab) 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체 암
다라투무맙(Daratumumab) CD38 암
뎀시주맙(Demcizumab) DLL4 암
데투모맙(Detumomab) B-림프종 세포 림프종
드로지투맙(Drozitumab) DR5 암
둘리고투맙(Duligotumab) HER3 암
두시지투맙(Dusigitumab) ILGF2 암
에크로멕시맙(Ecromeximab) GD3 강글리오시드 악성 흑색종
에쿨리주맙(Eculizumab) C5 발작성 야간 혈색뇨
에드레콜로맙(Edrecolomab) Epcam 대장 암종
엘로투주맙(Elotuzumab) SLAMF7 다발성 골수종
엘실리모맙(Elsilimomab) IL-6 암
에나바투주맙(Enavatuzumab) TWEAK 수용체 암
엔리모맙(Enlimomab) ICAM-1 (CD54) 암
에노키주맙(Enokizumab) IL9 천식
에노티쿠맙(Enoticumab) DLL4 암
엔시툭시맙(Ensituximab) 5AC 암
에피투모맙 시툭세탄(Epitumomab Cituxetan) 에피시알린 암
에프라투주맙(Epratuzumab) CD22 암, SLE
에르투막소맙(Ertumaxomab) HER2/Neu, CD3 유방암
에타라시주맙(Etaracizumab) 인테그린 Avβ3 흑색종, 전립선암, 난소암
파랄리모맙(Faralimomab) 인터페론 수용체 암
파를레투주맙(Farletuzumab) 엽산 수용체 1 난소암
파시누맙(Fasinumab) HNGF 암
Fbta05 CD20 만성 림프구성 백혈병
리클라투주맙(Ficlatuzumab) HGF 암
피지투무맙(Figitumumab) IGF-1 수용체 부신피질 암종, 비-소세포 폐 암종
플란보투맙(Flanvotumab) TYRP1
(당단백질 75)		 흑색종
폰톨리주맙(Fontolizumab) IFN-γ 크론병
프레솔리무맙(Fresolimumab) TGF-B 특발성 폐 섬유증, 초점성 분절성 사구체 경화증, 암
푸툭시맙(Futuximab) EGFR 암
갈릭시맙(Galiximab) CD80 B 세포 림프종
가니투맙(Ganitumab) IGF-I 암
겜투주맙 오조가미신(Gemtuzumab Ozogamicin) CD33 급성 골수성 백혈병
게보키주맙(Gevokizumab) IL-1β 당뇨병
기렌툭시맙(Girentuximab) 탄산 탈수효소 9 (CA-IX) 투명 세포 신장 세포 암종
글렘바투무맙 베도틴(Glembatumumab Vedotin) GPNMB 흑색종, 유방암
골리무맙(Golimumab) TNF-A 류머티스양 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염
이브리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab Tiuxetan) CD20 비호지킨 림프종
이크루쿠맙(Icrucumab) VEGFR-1 암
이고보맙(Igovomab) CA-125 난소암 (진단)
Imab362 Cldn18.2 위장 선암종 및 췌장 종양
임가투주맙(Imgatuzumab) EGFR 암
인클라쿠맙(Inclacumab) 셀렉틴 P 암
인다툭시맙 라브탄신(Indatuximab Ravtansine) SDC1 암
이노투주맙 오조가미신(Inotuzumab Ozogamicin) CD22 암
인테투무맙(Intetumumab) CD51 고체 종양 (전립선암, 흑색종)
이필리무맙(Ipilimumab) CD152 흑색종
이라투무맙(Iratumumab) CD30 (TNFRSF8) 호지킨 림프종
이톨리주맙(Itolizumab) CD6 암
라베투주맙(Labetuzumab) CEA 대장암
람브롤리주맙(Lambrolizumab) PDCD1 항신생물제
람팔리주맙(Lampalizumab) CFD 암
렉사투무맙(Lexatumumab) TRAIL-R2 암
리비비루맙(Libivirumab) B형 간염 표면 항원 B형 간염
리겔리주맙(Ligelizumab) IGHE 암
린투주맙(Lintuzumab) CD33 암
리릴루맙(Lirilumab) KIR2D 암
로르보투주맙(Lorvotuzumab) CD56 암
루카투무맙(Lucatumumab) CD40 다발성 골수종, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종
루밀릭시맙(Lumiliximab) CD23 만성 골수성 백혈병
마파투무맙(Mapatumumab) TRAIL-R1 암
마르게툭시맙(Margetuximab) Ch4d5 암
마투주맙(Matuzumab) EGFR 대장암, 폐암 및 위암
밀라투주맙(Milatuzumab) CD74 다발성 골수종 및 기타 혈액 악성 종양
민레투모맙(Minretumomab) TAG-72 암
미투모맙(Mitumomab) GD3 강글리오시드 소세포 폐 암종
모가물리주맙(Mogamulizumab) CCR4 암
모롤리무맙(Morolimumab) 레서스 인자 암
목세투모맙 파수도톡스(Moxetumomab Pasudotox) CD22 암
나콜로맙 타페나톡스(Nacolomab Tafenatox) C242 항원 대장암
나밀루맙(Namilumab) CSF2 암
나프투모맙 에스타페나톡스(Naptumomab Estafenatox) 5T4 비-소세포 폐 암종, 신장 세포 암종
나르나투맙(Narnatumab) RON 암
네바쿠맙(Nebacumab) 내독소 협착증
네시투무맙(Necitumumab) EGFR 비-소세포 폐 암종
네렐리모맙(Nerelimomab) TNF-A 암
네스바쿠맙(Nesvacumab) 안지오포이에틴 2 암
니모투주맙(Nimotuzumab) EGFR 편평 세포 암종, 두경부암, 비인두암, 신경교종
니볼루맙(Nivolumab) PD-1 암
노페투모맙 메르펜탄(Nofetumomab Merpentan) 미결정 암
오카라투주맙(Ocaratuzumab) CD20 암
오파투무맙(Ofatumumab) CD20 만성 골수성 백혈병
올라라투맙(Olaratumab) PDGF-R A 암
올로키주맙(Olokizumab) IL6 암
오나르투주맙(Onartuzumab) 인간 산란 인자 수용체 키나제 암
온툭시주맙(Ontuxizumab) TEM1 암
오포르투주맙 모나톡스(Oportuzumab Monatox) Epcam 암
오레고보맙(Oregovomab) CA-125 난소암
오르티쿠맙(Orticumab) Oxldl 암
오틀레르투주맙(Otlertuzumab) CD37 암
파니투무맙(Panitumumab) EGFR 대장암
판코맙(Pankomab) MUC1의 종양 특이적 글리코실화 난소암
파르사투주맙(Parsatuzumab) EGFL7 암
파트리투맙(Patritumab) HER3 암
펨브롤리주맙(Pembrolizumab) PD-1 암
펨투모맙(Pemtumomab) MUC1 암
페라키주맙(Perakizumab) IL17A 관절염
페르투주맙(Pertuzumab) HER2/Neu 암
피딜리주맙(Pidilizumab) PD-1 암 및 감염성 질환
피나투주맙 베도틴(Pinatuzumab Vedotin) CD22 암
핀투모맙(Pintumomab) 선암종 항원 선암종
플라쿨루맙(Placulumab) 인간 TNF 암
폴라투주맙 베도틴(Polatuzumab Vedotin) CD79B 암
프리톡삭시맙(Pritoxaximab) 대장균 시가 독서 제1형 암
프리투무맙(Pritumumab) 비멘틴(Vimentin) 뇌암
퀼리주맙(Quilizumab) IGHE 암
라코투모맙(Racotumomab) N-글리콜릴뉴라민산 암
라드레투맙(Radretumab) 피브로넥틴 엑스트라 도메인-B 암
라무시루맙(Ramucirumab) VEGFR2 고체 종양
릴로투무맙(Rilotumumab) HGF 고체 종양
리툭시맙(Rituximab) CD20 림프종, 백혈병, 일부 자가면역 장애
로바투무맙(Robatumumab) IGF-1 수용체 암
롤레두맙(Roledumab) RHD 암
사말리주맙(Samalizumab) CD200 암
사투모맙 펜데티드(Satumomab Pendetide) TAG-72 암
세리반투맙(Seribantumab) ERBB3 암
세톡삭시맙(Setoxaximab) 대장균 시가 독소 제1형 암
Sgn-CD19a CD19 급성 림프구성 백혈병 및 B 세포 비호지킨 림프종
Sgn-CD33a CD33 급성 골수성 백혈병
시브로투주맙(Sibrotuzumab) FAP 암
실툭시맙(Siltuximab) IL-6 암
솔리토맙(Solitomab) Epcam 암
손투주맙(Sontuzumab) 에피시알린(Episialin) 암
타발루맙(Tabalumab) BAFF B 세포 암
타카투주맙 테트락세탄(Tacatuzumab Tetraxetan) 알파-피토단백질 암
타플리투모맙 팝톡스(Taplitumomab Paptox) CD19 암
텔리모맙(Telimomab) 미결정 암
테나투모맙(Tenatumomab) 테낙신 C 암
테넬릭시맙(Teneliximab) CD40 암
테프로투무맙(Teprotumumab) CD221 혈액 종양
티실리무맙(Ticilimumab) CTLA-4 암
티가투주맙(Tigatuzumab) TRAIL-R2 암
Tnx-650 Il-13 호지킨 림프종
토시투모맙(Tositumomab) CD20 소포성 림프종
토베투맙(Tovetumab) CD140a 암
트라스투주맙(Trastuzumab) HER2/Neu 유방암
Trbs07 Gd2 흑색종
트레멜리무맙(Tremelimumab) CTLA-4 암
투코투주맙 셀몰레우킨(Tucotuzumab Celmoleukin) Epcam 암
우빌리툭시맙(Ublituximab) MS4A1 암
우렐루맙(Urelumab) 4-1BB 암
반틱투맙(Vantictumab) Frizzled 수용체 암
바팔릭시맙(Vapaliximab) AOC3 (VAP-1) 암
바텔리주맙(Vatelizumab) ITGA2 암
벨투주맙(Veltuzumab) CD20 비호지킨 림프종
베센쿠맙(Vesencumab) NRP1 암
볼로식시맙(Volociximab) 인테그린 A5β1 고체 종양
보르세투주맙(Vorsetuzumab) CD70 암
보투무맙(Votumumab) 종양 항원 CTAA16.88 대장 종양
잘루투무맙(Zalutumumab) EGFR 두경부의 편평 세포 암종
자툭시맙(Zatuximab) HER1 암
지랄리무맙(Ziralimumab) CD147 암
그것의 VH 및 VL 도메인이 암세포의 표면에서 배열된 암 항원에 결합할 수 있고 그러한 암세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 본 발명의 결합 분자를 구성하기 위해 사용될 수 있는 예시의 항체가 표 7에서 열거되고, 암세포 표면에 배열된 암 항원에 결합할 수 있고 그러한 암세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 분자를 구성하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 항체가 하기에 제공된다.
1. 예시의 항-B7-H3 항체
B7-H3은 광범위한 다양한 고체 종양 유형에서 과다발현되고 면역 조절에 관여하는 분자의 B7 패밀리의 구성원인 암 항원이다 (미국 특허 제 8,802,091호; US 2014/0328750; US 2013/0149236; Loo, D. et al. (2012) "Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity", Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845 참조). 특히, 여러 독립적인 연구가 인간 악성 암세포 (예컨대, 신경모세포종 및 위암, 난소암, 췌장암, 및 비-소세포 폐암의 암세포)가 B7-H3 단백질의 발현에서 현저한 증가를 나타내고 이런 증가된 발현이 증가된 질환 중증도와 관련되었음을 밝혀냈고 (Zang, X. et al. (2007) "The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition", Clin. Cancer Res. 13:5271-5279), 이것은 B7-H3이 면역 회피 경로로서 종양에 의해 탐색되는 것을 시사한다 (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
B7-H3은 또한 CD4+ 및 CD8+ T-세포 증식을 동시 자극하는 것으로 나타났다. B7-H3은 또한 IFN-γ 생성 및 CD8+ 용해 활성을 자극한다 (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production", Nature Immunol. 2:269-274; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2:116-126). 그러나, 단백질은 또한 T-세포 활성화를 억제하기 위하여 NFAT (활성화된 T 세포에 대한 핵 인자), NF-κB (핵 인자 카파 B), 및 AP-1 (활성화제 단백질-1) 인자를 통해 작용할 가능성이 있다 (Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4", Immunol. Rev. 229:145-151). B7-H3은 또한 생체내에서 Th1, Th2, 또는 Th17을 억제하는 것으로 여겨진다 (Prasad, D.V. et al. (2004) "Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells", J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) "B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice", Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4", Immunol. Rev. 229:145-151).
바람직한 B7-H3-결합 분자는 인간화된 항-인간 B7-H3 단클론성 항체 "B7-H3 mAb-B", "B7-H3 mAb-C", "B7-H3 mAb-D"의 VL 및/또는 VH 도메인, 또는 본원에 제공된 임의의 항-B7-H3 항체를 가지며; 보다 바람직하게는 그러한 항-B7-H3 단클론성 항체의 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 가진다.
인간화될 때, 항체 B7-H3 mAb-B는 2개의 변이체 VH 도메인, B7-H3 mAb-B VH1 및 B7-H3 mAb-B VH2; 및 2개의 변이체 VL 도메인 B7-H3 mAb-B VH1 VL1 및 B7-H3 mAb-B VL2를 유발하며, 이것들은 기능성 B7-H3 결합 도메인을 유발하기 위하여 VH/VL 도메인의 임의의 조합에 사용될 수 있다.
B7-H3 mAb-B VH1의 VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:122 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGDGDTRY
TQKFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS.
B7-H3 mAb-B VH2의 VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:123 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨)이다:
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGGGDTRY
TQKFQG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS.
B7-H3 mAb-B VL1의 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:124 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨)이다.
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK.
B7-H3 mAb-B VL2의 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:125 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨)이다.
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQSIS SYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLQS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK.
인간화된 B7-H3 mAb-C의 VH 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:126 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨)이다:
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMS WVRQA PGKGLEWVA T INSGGSNTYY
PDSLKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR HD GGAMDY WGQG TTVTVSS.
인간화된 B7-H3 mAb-C의 VL 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:127 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨)이다.
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASESIY SYLA WYQQKP GKAPKLLVY N TKTLPE GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYGTPPWT FG QGTRLEIK.
B7-H3 mAb-D의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:128)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨).
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVAY ISSGSGTIYY
ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR HG YRYEGFDY WG QGTTVTVSS.
B7-H3 mAb-D의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:129)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨).
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK.
특히 바람직한 것은, 한정하는 것은 아니지만 "에노블리투주맙(Enoblituzumab)" (MGA271로도 알려져 있음; CAS Reg No. 1353485-38-7)을 포함한, 인간화된 VH 및/또는 VL 도메인을 가진 B7-H3-결합 분자이다. 에노블리투주맙은 HER2/neu에 결합하고 증강된 ADCC 활성을 매개하는 Fc-최적화된 단클론성 항체이다. 에노블리투주맙의 완전한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 기술분야에 알려져 있다 (예컨대, WHO Drug Information, 2017, Recommended INN: List 77, 31(1):49 참조). 에노블리투주맙의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:130)이다 (CDRH는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY
ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS.
에노블리투주맙의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:131)이다 (CDRL은 밑줄로 표시됨):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK.
상기 확인된 바람직한 항-B7-H3 결합 분자 외에, 발명은 다음의 항-B7-H3 결합 분자 중 임의의 것의 사용을 고려한다: LUCA1; BLA8; PA20; 또는 SKN2 (미국 특허 제 7,527,969호; 8,779,098호 및 PCT 특허 공보 WO 2004/001381 참조); M30; cM30; M30-H1-L1; M30-H1-L2; M30-H1-L3; M30-H1-L4; M30-H1-L5; M30-H1-L6; M30-H1-L7; M30-H4-L1; M30-H4-L2; M30-H4-L3; 및 M30-H4-L4 (미국 특허 공보 2013/0078234호 및 PCT 특허 공보 WO 2012/147713 참조); 및 8H9 (미국 특허 제 7,666,424호; 7,737,258호; 7,740,845호; 8,148,154호; 8,414,892호; 8,501,471호; 9,062,110호; 미국 특허 공보 2010/0143245 및 PCT 특허 공보 WO 2008/116219 참조).
2. 예시의 항-CEACAM5 및 항-CEACAM6 항체
암배아 항원-관련된 세포 부착 분자 5 (CEACAM5) 및 6 (CEACAM6)은 갑상선 수질암, 대장암, 췌장암, 간세포 암종, 위암, 폐암, 두경부암, 비뇨기 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁내막암, 유방암, 조혈세포 암, 백혈병 및 난소암 (PCT 공개 번호 WO 2011/034660), 및 특히 대장암, 위장암, 췌장암, 비-소세포 폐암 (NSCL), 유방암, 갑상선암, 위암, 난소암 및 자궁 암종을 포함한 다양한 유형의 암과 관련된 것으로 나타났다 (Zheng, C. et al. (2011) "A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity", PLoS One 6(6):e21146, pp. 1-11).
CEACAM5는 위장암, 대장암 및 췌장암의 90%에서, 비-소세포 폐암 세포의 70%에서 및 유방암의 50%에서 과다발현되는 것으로 나타났다 (Thompson, J.A. et al. (1991) "Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives", J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366). 과다발현된 암배아 항원-관련된 세포 부착 분자 6 (CEACAM6)은 갑상선 수질암, 대장암, 췌장암, 간세포 암종, 위암, 폐암, 두경부암, 비뇨기 방광암, 전립선암, 자궁암, 자궁내막암, 유방암, 조혈세포 암, 백혈병 및 난소암을 포함한, 다양한 인간 암의 침습 및 전이에서 중요할 역할을 한다 (PCT 공개 번호 WO 2011/034660; Deng, X. et al. (2014) "Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma", Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) "Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis", Mol. Cancer 11:74, pp. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) "Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung", Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) "Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer", Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) "Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells", Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) "Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers", BMC Cancer. 7:2, pp. 1-15). CEACAM5 및 CEACAM6에 면역특이적으로 결합하는 항체는 상업적으로 입수 가능하다 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC; Abnova Corporation).
인간화된 항- CEACAM5 / 항-CEACAM6 항체 16C3 (EP 2585476)의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:132)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGS GYTFT DYAMH WVKQS HAKSLEWIG L ISTYSGDTKY
NQNFKG KATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAR GD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S.
인간화된 항-CEACAM5 / 항-CEACAM6 항체 16C3 (EP 2585476)의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:133)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC GASENIY GALN WYQRKP GKSPKLLIW G ASNLAD GMPS
RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYY CQN VLSSPYT FGG GTKLEIK.
인간화된 항-CEACAM5 / CEACAM6 항체 hMN15 (WO 2011/034660)의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:134)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SC SSSGFALT DYYMS WVRQA PGKGLEWLG F IANKANGHTT
DYSPSVKG RF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S.
인간화된 항-CEACAM5 / CEACAM6 항체 hMN15 (WO 2011/034660)의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:135)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTC SASSRVS YIH WYQQKPG KAPKRWIY GT STLAS GVPAR
FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYC QQW SYNPPT FGQG TKVEIKR.
본 발명은 CEACAM5 및/또는 CEACAM6에 결합할 수 있는 CEACAM5/CEACAM6 결합 분자 (예컨대, CEACAM5/CEACAM6 x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-CEACAM5/CEACAM6 단클론성 항체 16C3 또는 hMN15의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2, 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2, 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
3. 예시의 항-EGRF 항체
상피 성장 인자 수용체 (EGFR)는 특정 전이성 대장암, 전이성 비-소세포 폐암 및 두경부암의 암 항원이다. 인간 EGRF에 결합하는 예시의 항체는 "세툭시맙" 및 "파니투무맙"이다. 세툭시맙은 재조합 인간-마우스 키메라 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) IgG1 단클론성 항체이다 (Govindan R. (2004) "Cetuximab In Advanced Non-Small Cell Lung Cancer", Clin. Cancer Res. 10(12 Pt 2):4241s-4244s; Bou-Assaly, W. et al. (2010) "Cetuximab (Erbitux)", Am. J. Neuroradiol. 31(4):626-627). 파니투무맙 (Vectibix®, Amgen)은 전체적으로 인간화된 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) IgG2 단클론성 항체이다 (Foon, K.A. et al. (2004) "Preclinical And Clinical Evaluations Of ABX-EGF, A Fully Human Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Antibody", Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 58(3):984-990; Yazdi, M.H. et al. (2015) "A Comprehensive Review of Clinical Trials on EGFR Inhibitors Such as Cetuximab and Panitumumab as Monotherapy and in Combination for Treatment of Metastatic Colorectal Cancer", Avicenna J. Med. Biotechnol. 7(4):134-144).
키메라 항-EGFR 항체 세툭시맙의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:136)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVS GFSLT NYGVH WVRQS PGKGLEWLG V IWSGGNTDYN
TPFTS RLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCAR ALT YYDYEFAY WG QGTLVTVSA.
키메라 항-EGFR 항체 세툭시맙의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:137)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSC RASQSIG TNIH WYQQRT NGSPRLLIK Y ASESIS GIPS
RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYC QQ NNNWPTT FGA GTKLELKR.
파니투무맙의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:138)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVS GGSVS SGDYY WTWIR QSPGKGLEWI G HIYYSGNTN
YNPSLKS RLT ISIDTSKTQF SLKLSSVTAA DTAIYYCVR D RVTGAFDI WG QGTMVTVSS.
파니투무맙의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:139)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY D ASNLET GVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QH FDHLPLA FGG GTKVEIKR.
본 발명은 EGFR에 결합할 수 있는 EGFR 결합 분자 (예컨대, EGFR x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-EGFR 단클론성 항체 세툭시맙 또는 파니투무맙의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 전부 3개의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
4. 예시의 항-EphA2 항체
수용체 티로신 키나제, 에프린 A형 수용체 2 (EphA2)는 보통 성인 상피 조직에서 세포-대-세포 접촉 부위에서 발현되지만, 최근 연구는 그것이 또한 다양한 유형의 상피 암종에서 과다발현되며, 전이성 병변에서 가장 큰 수준의 EphA2 발현이 관찰된 것을 나타냈다. EphA2의 높은 발현 수준은 전립선암, 유방암, 비-소세포 폐암 및 흑색종을 포함한, 광범위한 암 및 수많은 암세포주에서 발견되었다 (Xu, J. et al. (2014) "High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome", Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) "EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma", Cancer Discov. pii: CD-14-0295). EphA2는 단순히 암에 대한 마커를 나타내기보다는, 오히려 수많은 인간 암에서 지속적으로 과다발현되고 기능적으로 변화되는 것으로 나타난다 (Chen, P. et al. (2014) "EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells", Oncol. Lett. 8(1):41-46). 인간 EphA2에 결합하는 예시의 항체는 "EphA2 mAb 1", "EphA2 mAb 2" 및 "EphA2 mAb 3"이다.
EphA2 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:140)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVH WVRQP PGKGLEWLG M IWGGGSTDYN
SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCAR KHG NYYTMDY WGQ GTSVTVSS.
EphA2 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:141)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS
RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GYTLYT FGGG TKLEIK.
EphA2 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:142)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMN WVKQA PGKGLKWMG W INTYIGEPTY
ADDFKG RFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAR EL GPYYFDY WGQ GTTLTVSS.
EphA2 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:143)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSSGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP T FGSGTKLEI K.
EphA2 mAb 3의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:144)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMY WVRQT PEKRLEWVA T ISDGGSFTSY
PDSVKG RFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTR DE SDRPFPY WGQ GTLVTVSS.
EphA2 mAb 3의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:145)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITC KASQDVT TAVA WYQQKP GQSPKLLIF W ASTRHA GVPD
RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYC QQ HYSTPYT FGG GTKLEIK.
본 출원은 EphA2에 결합할 수 있는 EphA2 결합 분자 (예컨대, EphA2 x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-EphA2 단클론성 항체 EphA2 mAb 1, EphA2 mAb 2 및 EphA2 mAb 3의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
5. 예시의 항-gpA33 항체
43kD 경막 당단백질 A33 (gpA33)은 모든 대장 암종의 >95%에서 발현된다 (Heath, J.K. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) "Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium", Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) "EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia", J. Clin. Pathol. 59(3):260-263). 인간 gpA33에 결합하는 예시의 항체는 "gpA33 mAb 1"이다.
gpA33 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:146)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMN WVRQA PGQGLEWIG R IYPGDGETNY
NGKFKD RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR IY GNNVYFDV WG QGTTVTVSS.
gpA33 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:147)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIK.
본 출원은 gpA33에 결합할 수 있는 gpA33 결합 분자 (예컨대, gpA33x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-gpA33 단클론성 항체 gpA33 mAb 1의, 또는 WO 2015/026894에서 제공된 항-gpA33 단클론성 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다. 본 발명은 추가적으로 WO 2015/026894에서 제공된 예시의 gpA33 x CD3 이중특이적 결합 분자를 포함하고 포함한다.
6. 예시의 항-HER2/neu 항체
HER2/neu는 원래 화학적으로 처리된 래트의 신경모세포종으로부터의 변형 유전자의 생성물로서 확인되었던 185 kDa 수용체 단백질이다. HER2/neu는 여러 인간 암종 (유방암 및 위암을 포함함)에서 및 포유류 발달에서의 그것의 역할 때문에 광범위하게 조사되었다 (Hynes et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184; Dougall et al. (1994) Oncogene 9:2109-2123; Lee et al. (1995) Nature 378:394-398). 인간 HER2/neu에 결합하는 예시의 항체로는 "마르게툭시맙", "트라스투주맙" 및 "페르투주맙"을 들 수 있다. 마르게툭시맙 (MGAH22로도 알려져 있음; CAS Reg No. 1350624-75-7)은 HER2/neu에 결합하고 증강된 ADCC 활성을 매개하는 Fc-최적화된 단클론성 항체이다. 트라스투주맙 (rhuMAB4D5로도 알려져 있고, Herceptin®로서 판매중임; CAS Reg No 180288-69-1; 미국 특허 제 5,821,337호 참조) 은 IgG1/카파 불변 영역을 가지는 항체 4D5의 인간화된 버전이다. 페르투주맙 (rhuMAB2C4로도 알려져 있고, PerjetaTM으로서 판매중임; CAS Reg No 380610-27-5; 예를 들어, WO2001/000245 참조)은 IgG1/카파 불변 영역을 가지는 항체 2C4의 인간화된 버전이다.
본 출원은 Her2/Neu에 결합할 수 있는 Her2/Neu 결합 분자 (예컨대, Her2/Neu x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-Her2/Neu 단클론성 항체 마르게툭시맙, 트라스투주맙 또는 페르투주맙의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
마르게툭시맙의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:148)이다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY
DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS.
마르게툭시맙의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:149)이다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GHSPKLLIY S ASFRYT GVPD
RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYC QQ HYTTPPT FGG GTKVEIK.
마르게툭시맙의 완전한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 기술분야에 알려져 있다 (예컨대, WHO Drug Information, 2014, Recommended INN: List 71, 28(1):93-94 참조).
트라스투주맙의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:150)이다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DT Y IH WVRQA PGKGLEWVA R IY PTN G Y T R Y
ADSVKG RFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSR WG GDG F Y A MD Y W GQGTLVTVSS.
트라스투주맙의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:151)이다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQ DVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S AS F L Y SGVPS
RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ H Y T TPPT FGQ GTKVEIK.
페르투주맙의 VH 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:152)이다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMD WVRQA PGKGLEWVA D VNPNSGGSIY
NQRFKG RFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR NL GPSFYFDY WG QGTLVTVSS.
페르투주맙의 VL 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:153)이다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVS IGVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YYIYPYT FGQ GTKVEIK.
상기에서 확인된 바람직한 항-HER2/neu 결합 분자 외에, 발명은 다음의 항-Her-2 결합 분자: 1.44.1; 1.140; 1.43; 1.14.1; 1.100.1; 1.96; 1.18.1; 1.20; 1.39; 1.24; 및 1.71.3 (미국 특허 제 8,350,011호; 8,858,942호; 및 PCT 특허 공보 WO 2008/019290); F5 및 C1 (미국 특허 제 7,892,554호; 8,173,424호; 8,974,792호; 및 PCT 특허 공보 WO 99/55367); 및 또한 미국 특허 공보 US2013017114 및 PCT 특허 공보 WO2011/147986 및 WO 2012/143524의 항-Her-2 결합 분자 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 Her2/Neu 결합 분자를 포함한다. 본 발명은 추가적으로 WO 2012/143524에서 제공된 예시의 Her2/Neu x CD3 이중특이적 결합 분자를 포함하고 포함한다.
7. 예시의 항-VEGF 항체
VEGF-A는 다양한 질환에서, 특히 전이성 결장암과 같은 특정 전이성 암에서, 및 특정 폐암, 신장암, 난소암, 및 뇌의 교모세포종 다형태에서 혈관신생을 자극하는 화학적 신호이다. 인간 VEGF-A에 결합하는 예시의 항체는 "베바시주맙" (Avastin®)이다. 베바시주맙은 재조합 인간화된 IgG1 단클론성 항체이다 (Midgley, R. et al. (2005) "Bevacizumab - Current Status And Future Directions", Ann. Oncol. 16(7):999-1004; Hall, R.D. et al. (2015) "Angiogenesis Inhibition As A Therapeutic Strategy In Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC)", Transl. Lung Cancer Res. 4(5):515-523; Narita, Y. (2015) "Bevacizumab For Glioblastoma", Ther. Clin. Risk Manag. 11:1759-1765).
베바시주맙의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:154)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYTFT NYGMN WVRQA PGKGLEWVG W INTYTGEPTY
AADFKR RFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCA KYP HYYGSSHWYF DV WGQGTLVT VSS.
베바시주맙의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:155)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC SASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKVLIY F TSSLHS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YSTVPWT FGQ GTKVEIKR.
본 출원은 VEGF에 결합할 수 있는 VEGF 결합 분자 (예컨대, VEGF x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-VEGF 단클론성 항체 베바시주맙의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
8. 예시의 항-5T4 항체
종양태아 단백질, 5T4는 신장, 결장, 전립선, 폐 암종을 포함한 많은 암종의 세포막에서 및 급성 림프모세포성 백혈병에서 나타나는 종야-관련 단백질이다 (Boghaert, E.R. et al. (2008) "The Oncofetal Protein, 5T4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin", Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) "Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin", Curr. Oncol. Rep. 16:370, pp. 1-6 참조). 인간 5T4에 결합하는 예시의 항체로는 "5T4 mAb 1" 및 "5T4 mAb 2"를 들 수 있다.
5T4 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:156)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKAS GYTFT SFWMH WVRQA PGQGLEWMG R IDPNRGGTEY
NEKAKS RVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAG GN PYYPMDY WGQ GTTVTVSS.
5T4 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:157)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQGIS NYLA WFQQKP GKAPKSLIY R ANRLQS GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC LQ YDDFPWT FGQ GTKLEIK.
5T4 mAb 2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:158)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKAS GYTFT SYWIT WVKQR PGQGLEWIG D IYPGSGRANY
NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCAR YG PLFTTVVDPN SYAMDY WGQG
TSVTVSS.
5T4 mAb 2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:159)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSIV YSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF
S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP FT FGSGTKLE IK.
본 출원은 항-5T4 단클론성 항체 5T4 mAb 1 또는 5T4 mAb 2의, 또는 WO 2013/041687 또는 WO 2015/184203에서 제공된 항-5T4 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 5T4 결합 분자 (예컨대, 5T4 x CD3 이중특이적 결합 분자)를 구체적으로 포함하고 포함한다. 본 발명은 추가적으로 WO 2015/184203에서 제공된 예시의 5T4 x CD3 이중특이적 결합 분자를 포함하고 포함한다.
본 출원은 추가적으로 5T4에, CD3에 및 CD8에 결합할 수 있는 5T4 x CD3 x CD8 삼중특이적 결합 분자, 및 특히 항-HIV 단클론성 항체 5T4 mAb 1 또는 5T4 mAb 2의 또는 WO 2015/184203에서 제공된 항-5T4 단클론성 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH, 및/또는 본원에서 제공된 항-CD8 단클론성 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 삼중특이적 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
9. 예시의 항-IL13Rα2 항체
인터류킨-13 수용체 α2 (IL-13Rα2)는 교모세포종, 대장암, 경부암, 췌장암, 다발성 흑색종, 골육종, 백혈병, 림프종, 전립선암 및 폐암을 포함한 다양한 암에서 과다발현된다 (PCT 공개 번호 WO 2008/146911; Brown, C.E. et al. (2013) "Glioma IL13Rα2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis", PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) "High Expression Of IL-13 Receptor A2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis", Cancer Res. 72(11):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) "IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Rα2", J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O. et al. (2010) "Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas", Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) "A Novel Role Of Interleukin-13 Receptor Alpha2 In Pancreatic Cancer Invasion And Metastasis", Cancer Res. 69(22):8678-8685). IL13Rα2에 면역특이적으로 결합하는 항체는 상업적으로 입수 가능하며 기술분야에 기술되어 있다 (Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals; 또한 PCT 공개 번호 WO 2008/146911 참조). 인간 IL-13Rα2에 결합하는 예시의 항체로는 "hu08"을 들 수 있다 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 2014/072888 참조).
hu08의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:160)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS RNGMS WVRQA PGKGLEWVA T VSSGGSYIYY
ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QG TTALATRFFD V WGQGTLVTV SS.
hu08의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:161)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVG TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRST GVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYSAPWT FGG GTKVEIK.
본 출원은 IL13Rα2에 결합할 수 있는 IL13Rα2 결합 분자 (예컨대, IL13Rα2 x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-IL13Rα2 단클론성 항체 hu08의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
10. 예시의 항-CD123 항체
CD123 (인터류킨 3 수용체 알파, IL-3Ra)은 40 kDa 분자이고 인터류킨 3 수용체 복합체의 일부이다 (Stomski, F.C. et al. (1996) "Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization, Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding", Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046). 인터류킨 3 (IL-3)은 다능성 줄기 세포의 적혈구, 골수 및 림프 전구체의 세포로의 초기 분화를 구동시킨다. CD123은 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 B 림프 모세포성 백혈병 (B-ALL), 털세포 백혈병 (HCL), 수포성 형질세포성 수지상 세포 신 생물 (BPDCN), 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 B 림프모세포성 백혈병 (B-ALL), 털세포 백혈병 (HCL), 수포성 형질세포성 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 및 골수이형성 증후군 (MDS)을 포함한 광범위한 혈액 악성종양의 악성 세포에서 과다발현되는 것으로 보고되었다 (Munoz, L. et al. (2001) "Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies", Haematologica 86(12):1261-1269). CD123의 과다발현은 AML에서의 더 좋지 못한 예후와 관련된다 (Tettamanti, M.S. et al. (2013) "Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor", Br. J. Haematol. 161:389-401).
인간 CD123에 결합하고, 본 발명에서 사용될 수 있는 예시의 항체는 "CD123 mAb 1"이다 (예컨대, PCT 특허 공보 WO 2015/026892 참조).
CD123 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:162)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMK WVRQA PGQGLEWIG D IIPSNGATFY
NQKFKG RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SH LLRASWFAY W GQGTLVTVSS.
CD123 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:163)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSC KSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIY WASTR
ES GVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC QNDYSY PYT FGQGTKL EIK.
본 출원은 CD123에 결합할 수 있는 CD123 결합 분자 (예컨대, CD123 x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-CD123 단클론성 항체 CD123 mAb 1의, 및 또한 US 2017/081424 및 WO 2016/036937에서 개시된 항-CD123 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다. 본 발명은 추가적으로, 플로테투주맙 (aka MGD007; CAS Registry No. 1664355-28-5), JNJ-63709178 (Johnson & Johnson, 또한 WO 2016/036937 참조) 및 XmAb14045 (Xencor, 또한 US 2017/081424 참조)을 포함하는, 예시의 CD123 x CD3 이중특이적 결합 분자를 포함하고 포함한다.
11. 예시의 항-CD19 항체
CD19 (B 림프구 표면 항원 B4, Genbank 수탁 번호 M28170)는 B-세포-수용체 (BCR) 복합체의 구성요소이고, B-세포 활성화 및 체액 면역에 대한 한계값을 조절하는 B-세포 신호전달의 양성 조절자이다. CD19는 B-세포 계통에서 가장 편재적으로 발현되는 항원 중 하나이고 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 만성 골수성 백혈병 (CLL), 및 비호지킨 림프종 (NHL)을 포함한, B-세포 악성의 95% 이상에서 발현된다. 특히, CD19 발현은 항-CD20 치료법에 대해 내성이 되는 B-세포 림프종에서 유지된다 (Davis et al. (1999) "Therapy of B-Cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression". Clin Cancer Res, 5:611-615, 1999). CD19는 또한 자가면역 질환을 치료하기 위한 표적으로서 제안되었다 (Tedder (2009) "CD19: A Promising B-Cell Target For Rheumatoid Arthritis", Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577).
인간 CD19에 결합하고, 본 발명에서 사용될 수 있는 예시의 인간화된 항체는 WO 2016/048938에서 개시된 항-CD19 항체 (본원에서 "CD19 mAb 1"로 언급됨)이다.
CD19 mAb 1의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:164)이 하기에 제시된다 (CDRH 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVG WIR QPPGKALEWL A HIWWDDDKR
YNPALKS RLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCAR M ELWSYYFDY W GQGTTVTVSS.
CD19 mAb 1의 VL 도메인의 아미노산 서열 of CD19 mAb 1 (SEQ ID NO:165)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITC RASQSVS YMH WYQQKPG QAPRLLIY DA SNRAS GVPSR
FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYC FQG SVYPF TFGQG TKLEIK.
CD19 mAb 1의 대체 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:195)이 하기에 제시된다 (CDRL 잔기는 밑줄로 표시됨):
ENVLTQSPAT LSVTPGEKVT ITC SASSSVS YMH WYQQKPG QAPRLLIY DT SKLAS GVPSR
FSGSGSGTDH FLTISSLEAE DAATYYC FQG SVYPFT FGQG TKLEIK.
본 출원은 CD19에 결합할 수 있는 CD19 결합 분자 (예컨대, CD19 x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-CD19 단클론성 항체 CD19 mAb 1의, 또는 미국 특허 US 7,112,324에서 개시된 항-CD19 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다. 본 발명은 블리나투모맙 (BLINCYTO®; WHO Drug Information, 2009, Recommended INN: List 62, 23(3):240-241에서 찾아볼 수 있는 아미노산 서열) 및 두보르툭시주맙 (aka MGD011; WHO Drug Information, 2016, Proposed INN: List 116, 30(4):627-629에서 찾아볼 수 있는 아미노산 서열)을 포함한, 본 발명에서 사용될 수 있는 예시의 CD19 x CD3 이중특이적 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
B. 예시의 병원체-관련 항원
본원에서 사용되는 바, 용어 "병원체 항원"은 병원체-감염 세포의 표면에서 특징적으로 발현되고, 따라서 항체-기반 분자 또는 면역조절 분자로 처리될 수 있는 항원을 나타낸다. 병원체 항원의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 다음으로 감염된 세포 표면에서 발현되는 항원들을 포함한다: 헤르페스 단순 바이러스 (예컨대, 감염된 세포 단백질 (ICP)47, gD, 등), 수두-대상포진 바이러스, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스 (예컨대, LMP-1, LMP-2A, LMP-2B, 등), 사이토메갈로바이러스 (예컨대, UL11, 등), 인간 면역결핍 바이러스 (예컨대, env 단백질 gp160, gp120, gp41, 등), 인간 유두종 바이러스 (예컨대, E6, E7, 등), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 (예컨대, env 단백질 gp64, gp46, gp21, 등), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 바실루스, 시트로박터(Citrobacter), 콜레라(Cholera), 디프테리아(Diphtheria), 엔테로박터(Enterobacter), 고노코쿠스(Gonococci), 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 클레브시엘라(Klebsiella), 레지오넬라(Legionella), 메닝고코쿠스(Meningococci), 미코박테리아(mycobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas), 뉴모노코쿠스(Pneumonococci), 리케챠 박테리아(rickettsia bacteria), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia), 스타필로코쿠스(Staphylococci), 스트렙토코쿠스(Streptococci), 파상풍(Tetanus), 아스퍼길루스(Aspergillus)　(푸미가투스(fumigatus), 니거(niger), 등), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다(Candida)　(알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis), 등),　크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 뮤코랄레스 속(Genus　Mucorales)　(뮤코(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizopus)),　스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenkii), 파라코키디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 코키디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis),　히스토플라스마 캅슐라툼(Histoplasma capsulatum), 렙토스피로시스(Leptospirosis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 기생충 (십이지장충, 조충, 흡충, 편형동물 (예컨대 스키스토소미아(Schistosomia)), 지아르디아 람비아(Giardia lambia), 트리키넬라(trichinella), 디엔타모에바 프라길리스(Dientamoeba Fragilis), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 및 레이시마니아 도노바니(Leishmania donovani)). 이러한 항체는 광범위한 공급처로부터 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 마우스 또는 다른 동물 (단클론성 항체의 생성을 위한 것을 포함하여)을 이러한 항원으로 면역화함으로써 얻어질 수 있다.
그것의 VH 및 VL 도메인이 병원체-감염 세포의 표면에서 배열된 병원체 항원에 결합할 수 있는 분자를 구성하기 위해 사용될 수 있는 예시의 항체가 하기에 제공되며, 추가적인 항체가 기술분야에 알려져 있다.
1. 예시의 항-HIV env 항체
HIV의 env 단백질은 예시의 병원체-관련 항원이고, HIV의 env 단백질에 결합하는 항체는 병원체-관련 항원에 결합할 수 있는 예시의 항체이다.
HIV-1 감염의 초기 단계는 세포 표면 CD4의 트라이머 HIV-1 엔벨로프 당단백질 (env), 경막 당단백질 (gp41)의 헤테로다이머 및 표면 당단백질 (gp120)에의 결합으로 일어난다. gp120 및 gp41 당단백질은 비공유적으로 회합된 gp120/gp41 복합체를 생성하기 위해 후속적으로 절단되는 단일 gp160 폴리펩타이드로서 처음에 합성된다. env의 엑토도메인은 대략 140 kDa의 질량을 가지며, 전체 gp120 구성요소, 및 대략 20 kDa의 gp41로 구성된 헤테로다이머이다 (Harris, A. et al. (2011) "Trimeric HIV-1 Glycoprotein Gp140 Immunogens And Native HIV-1 Envelope Glycoproteins Display The Same Closed And Open Quaternary Molecular Architectures", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 108(28):11440-11445). env 단백질에 면역특이적으로 결합하는 항체는 상업적으로 입수 가능하고 기술분야에 기술되어 있다 (예컨대, GenBank 수탁 번호 AFQ31503; Buchacher, A. et al. (1994) "Generation Of Human Monoclonal Antibodies Against HIV-1 Proteins; Electrofusion And Epstein-Barr Virus Transformation For Peripheral Blood Lymphocyte Immortalization", AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(4):359-369; Shen, R. (2010) "GP41-Specific Antibody Blocks Cell-Free HIV Type 1 Transcytosis Through Human Rectal Mucosa And Model Colonic Epithelium", J. Immunol. 184(7):3648-3655; WO 2012/162068; 및 WO 2016/054101). HIV env에 결합하는 예시의 항체로는 "7B2" (GenBank 수탁 번호 AFQ31503) 및 "A32" (PCT 공개 번호 WO 2014/159940)를 들 수 있다. 항체 A32의 다중 VH 도메인은 보고된 프레임워크 영역 1 및/또는 4에서 미미한 변화를 가진 것으로 기술분야에서 보고되었다 (예컨대, Protein Data Base 수탁 번호 PDB: 4YBL_H, US 2015/0239961 및 WO 2006/044410 참조). 이들 변이체 항체 A32 VH 도메인 중 어느 것이든지 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
7B2의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:166)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMT WVRQA PGKGLEWLAY ISKNGEYSKY
SPSSNG RFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCAR AD GLTYFSELLQ YIFDL WGQGA
RVTVSS.
7B2의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:167)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCK SSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP KLLLY WASMR
LS GVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYC HQYSSH PPT FGHGTRV EIK.
A32의 예시의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:168)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWS WIR QYPGKGLEWI G YIHYSGNTY
YNPSLKS RIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCAR G TRLRTLRNAF DI WGQGTXVT VSS,
여기서: X는 L 또는 M이다.
A32의 그러한 예시의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:209) (X는 L임)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWS WIR QYPGKGLEWI G YIHYSGNTY
YNPSLKS RIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCAR G TRLRTLRNAF DI WGQGTLVT VSS.
A32의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:169)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SC TGTSSDVG GYNYVS WYQH HPGKAPKLII S EVNNRPS GV
PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL.
본 출원은 HIV에 결합할 수 있는 HIV 결합 분자 (예컨대, HIV x CD3 이중특이적 결합 분자), 및 특히 항-HIV 단클론성 항체 7B2 또는 A32의, 및 또한 WO 2016/054101, WO 2017/011413, WO 2017/011414에 개시된 항-HIV 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다. 본 발명은 구체적으로 WO 2014/159940, WO 2015/184203, WO 2017/011413, 및 WO 2017/011414에서 제공된 예시의 HIV x CD3 이중특이적 결합 분자를 포함하고 포함한다.
본 출원은 추가적으로 HIV에, CD3에 및 CD8에 결합할 수 있는 HIV x CD3 x CD8 삼중특이적 결합 분자, 및 특히 항-HIV 단클론성 항체 7B2 또는 A32의 또는 WO 2015/184203, WO 2016/054101, WO 2017/011413, WO 2017/011414에서 제공된 항-HIV 단클론성 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH, 및/또는 WO 2015/184203에서 제공된 항-CD8 단클론성 항체 중 어느 것의 VL 및/또는 VH 도메인, 및/또는 VL 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRL 및/또는 VH 도메인의 1, 2 또는 3개 전부의 CDRH를 포함하는 그러한 삼중특이적 결합 분자를 구체적으로 포함하고 포함한다.
2. 예시의 항-RSV 당단백질 F 항체
추가의 예시적인 병원체-관련 항원은 RSV 당단백질 F이다. 예시의 항-RSV 당단백질 F 항체는 팔리비주맙(Palivizumab)이다 (예컨대, Protein Data Bank (PDB) ID No. 2HWZ 참조). 대체 항-RSV 당단백질 F 항체로는 모타비주맙(motavizumab) (예컨대, PDB ID No. 3IXT 참조) 및 팔리비주맙의 CDRL1에서 시스테인 잔기가 제거되도록 조작된 팔리비주맙의 변이체를 들 수 있다. 팔리비주맙의 변이체의 VH 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:144)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVG WIR QPPGKALEWL A DIWWDDKKD
YNPSLKS RLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCAR S MITNWYFDV W GAGTTVTVSS.
팔리비주맙의 변이체의 VL 도메인의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:171)이 하기에 제시된다 (CDR 잔기는 밑줄로 표시됨):
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITC RASQSVG YMH WYQQKPG KAPKLLIY DT SKLAS GVPSR
FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYC FQG SGYPFT FGGG TKLEIK.
VII. 본 발명의 예시의 결합 분자
하기에서 논의되는 것과 같이, 본 발명은 종양 세포의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 분자를 포함하는 상이한 구조를 가진 여러 DA x CD3 결합 분자 (예컨대, 하기에서 논의되는 "DART-A"-형 디아바디 또는 "DART-B"-형 디아바디 또는 3가-형 분자)를 사용하여 예시된다.
A. DART-A-형 디아바디
DART-A-형 디아바디는 Fc 도메인을 포함하지 않는 CD3 및 질환 항원 (예컨대, 암 항원)에 결합할 수 있는 이중특이적 디아바디이다. 본원에는 CD3에 대한 한 개의 결합 부위 및 암 항원 CD128에 대한 한 개의 결합 부위를 가지는 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 예시의 DART-A-형 디아바디가 제공된다 (예컨대, 도 1 참조).
예시적인 DART-A-형 디아바디 ("DART-A-WT"로 표시됨)는 SEQ ID NO:172의 아미노산 서열을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKDR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT
LVTVSS GGCG GG KVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:162)에 상응한다. 이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. 이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:55)에 상으하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. 이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-252 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. 이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "K-코일" ( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E; SEQ ID NO:30)에 상응한다.
이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디 DART-A-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:173의 아미노산 서열을 가진다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
QLVQSGAELK KPGASVKVSC KASGYTFTDY YMKWVRQAPG QGLEWIGDII PSNGATFYNQ
KFKGRVTITV DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARSHLL RASWFAYWGQ GTLVTVSS GG
CGGG EVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK.
이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디 DART-A-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 CD3 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:56)에 상응한다. 이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. 이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-238은 CD123 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. 이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 239-244 (밑줄)은 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. 이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 245-272는 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다.
본 개시의 관점에서 인시되는 것과 같이, 대체 질환 항원에 대한 결합 부위 및/또는 변이체 항-CD3 항체의 CD3 결합 도메인 (즉, vCD3-결합 도메인)을 가지는 추가적인 DART-A-형 디아바디는 마찬가지로 (예시적인 DART-A-형 디아바디의 VL 및 VH 도메인 대신 이러한 항체의 VL 및 VH 도메인을 사용함으로써) 구성될 수 있다. 유사하게, 본원에서 제공되는 것과 같이, 대체 DART-A-형 분자는 대체 링커 및/또는 대체 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함시킴으로써 유사하게 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기에서 제공된 DART-A-WT 디아바디와 동일한 구조를 갖지만, 상기 제공된 CD3 mAb 1 변이체 (M1-M26) 중 하나의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 CD123 x CD3 DART-A-형 디아바디의 예시적인 패널이 생성되었다.
패널의 각각의 예시적인 CD123 x CD3 DART-A-형 디아바디는 SEQ ID NO:189의 아미노산 서열을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF SX 1 X 2 X 3 MNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKX 4 R FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHX 5 NX 6 X 7 NSX 8 V
X 9 X 10 FAX 11 WGQGT LVTVSS GGCG GG KVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE,
여기서: X 1 은 T, D, 또는 E이고; X 2 는 Y, D 또는 T이며; X 3 은 A 또는 G이고; X 4 는 D 또는 G이며; X 5 는 G, D, E, 또는 K이고; X 6 은 F 또는 I이며; X 7 은 G 또는 I이고; X 8 은 Y, A, G, 또는 Q이며; X 9 는 S 또는 T이고; X 10 은 W, F, 또는 Y이며; 그리고 X 11 은 Y 또는 E이다.
예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:162)에 상응한다. 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16; 이중 밑줄)에 상응한다. 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1 M1 - CD3 mAb 1 M22의 VH 도메인 (SEQ ID NO: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104 또는 106)에 상응한다. 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 잔기 247-252 (단일 밑줄)은 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "K-코일" ( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E; SEQ ID NO:30)에 상응한다.
이러한 예시적인 DART-A-형 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:190의 아미노산 서열을 가진다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GX 1 TNX 2 RAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC AX 3 WYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
QLVQSGAELK KPGASVKVSC KASGYTFTDY YMKWVRQAPG QGLEWIGDII PSNGATFYNQ
KFKGRVTITV DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARSHLL RASWFAYWGQ GTLVTVSS GG
CGGG EVAALE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK,
여기서: X 1 은 G 또는 D이고; X 2 는 K 또는 G이며; 그리고 X 3 은 L, E 또는 Q이다.
예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 CD3 mAb 1 M23 - CD3 mAb 1 M26의 VL 도메인 (SEQ ID NOs:108, 110, 112, 및 114)에 상응한다. 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16; 이중 밑줄)에 상응한다. 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-238은 CD123 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 239-244 (밑줄)은 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17; 단일 밑줄)에 상응한다. 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 245-272는 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다.
CD3 mAb 1 변이체의 VL 및 VH를 포함하는 예시적인 DART-A-형 디아바디의 패널의 아미노산 서열 및 표시가 하기 표 8에 제공된다.
예시적인 DART-A-형 디아바디
표시 제1 폴리펩타이드 사슬
SEQ ID NO: 		제2 폴리펩타이드 사슬
SEQ ID NO.
DART-A-M1 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 T; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M2 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 K; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 T; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M3 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 I; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M4 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 A; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M5 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 G; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M6 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Q; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M7 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 D; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M8 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 E; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M9 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 K; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M10 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 I; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M11 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 F; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M12 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 Y; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M13 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 E임 173
DART-A-M14 189 - 여기서: X 1 은 D; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M15 189 - 여기서: X 1 은 E; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M16 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 D; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M17 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 T; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M18 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 G; X 4 는 D; X 5 는 G; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M19 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 K; X 6 은 I; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M20 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 K; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 G; X 9 는 S; X 10 은 W; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M21 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 K; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 F; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M22 189 - 여기서: X 1 은 T; X 2 는 Y; X 3 은 A; X 4 는 D; X 5 는 K; X 6 은 F; X 7 은 G; X 8 은 Y; X 9 는 S; X 10 은 Y; 및 X 11 은 Y임 173
DART-A-M23 172 190 - 여기서: X 1 은 G; X 2 는 K; 및 X 3 은 E임
DART-A-M24 172 190 - 여기서: X 1 은 G; X 2 는 K; 및 X 3 은 Q임
DART-A-M25 172 190 - 여기서: X 1 은 D; X 2 는 K; 및 X 3 은 L임
DART-A-M26 172 190 - 여기서: X 1 은 G; X 2 는 G; 및 X 3 은 L임
B. DART-B-형 디아바디
DART-B-형 디아바디는 Fc 도메인을 포함하는 CD3 및 질환 항원 (예컨대, 암 또는 감염성 질환 항원)에 결합할 수 있는 이중특이적 디아바디이다. 본원에는 3개의 폴리펩타이드 사슬로 구성되고 한 개의 CD3에 대한 결합 부위 및 암 항원 CD123, 5T4, 또는 CD19에 대한 한 개의 결합 부위를 가지는 예시적인 DART-B-형 디아바디 (표 9)가 제공된다 (예컨대, 도 4A 참조).
DART-B-형 No. 질환 항원-결합 도메인 CD3
결합 도메인 		폴리펩타이드 사슬 표시
제1 제2 제3
CD123 / CD3 결합 도메인 Fc 도메인
1 CD123 mAb 1 CD3 mAb 1 SEQ ID NO:174 SEQ ID NO:175 SEQ ID NO:176 CD123-WT
2 CD3 mAb 1 M1 SEQ ID NO:177 CD123-M1
3 CD3 mAb 1 M2 SEQ ID NO:178 CD123-M2
4 CD3 mAb 1 M18 SEQ ID NO:179 CD123-M18
5 CD3 mAb 1 M13 SEQ ID NO:198 CD123-M13
6 CD3 mAb 1 M17 SEQ ID NO:199 CD123-M17
7 CD3 mAb 1 M19 SEQ ID NO:200 CD123-M19
8 5T4 mAb 1 CD3 mAb 1 SEQ ID NO:180 SEQ ID NO:181 5T4-WT
9 CD3 mAb 1 M1 SEQ ID NO:182 5T4-M1
10 CD3 mAb 1 M2 SEQ ID NO:183 5T4-M2
11 CD3 mAb 1 M18 SEQ ID NO:184 5T4-M18
12 HIV mAb A32 CD3 mAb 1 SEQ ID NO:185 SEQ ID NO:186
 HIV-WT
13 CD3 mAb 1 M18 SEQ ID NO:196 HIV-M18
14 CD19 mAb 1 (표시되는 경우 대체 VL) CD3 mAb 1 SEQ ID NO: 191 SEQ ID NO: 192
 CD19-WT
15 CD3 mAb 1 M18 SEQ ID NO: 197 CD19-M18
16 CD3 mAb 1 M18 SEQ ID NO: 193 SEQ ID NO: 194 CD19.1-M18
17 CD3 mAb 1 M13 SEQ ID NO:201 CD19.1-M13
18 CD3 mAb 1 M17 SEQ ID NO:202 CD19.1-M17
19 CD3 mAb 1 M19 SEQ ID NO:203 CD19.1-M19
1. 제1 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD123-WT (CD123 x CD3 mAb 1)
제1 예시적인 DART-B-형 디아바디 ("CD123-WT"로 표시됨)는 SEQ ID NO:174:의 아미노산 서열을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKDR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT
LVTVSS GGCG GG EVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGG DKTHTCP PCP APEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
CD123-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. CD123-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD123-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:55)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD123-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-252 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD123-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD123-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 281-283은 GGG 링커에 상응한다. CD123-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 284-293 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD123-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 294-510은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD123-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:175의 아미노산 서열을 가진다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV
QLVQSGAELK KPGASVKVSC KASGYTFTDY YMKWVRQAPG QGLEWIGDII PSNGATFYNQ
KFKGRVTITV DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCARSHLL RASWFAYWGQ GTLVTVSS GG
CGGG KVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE.
CD123-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 CD3 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:56)에 상응한다. CD123-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은o 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD123-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-238은 CD123 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:162)에 상응한다. CD123-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 239-244 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD123-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 245-272는 헤테로다이머-촉진 "K-코일" ( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E; SEQ ID NO:30)에 상응한다.
CD123-WT의 제3 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:176의 아미노산 서열을 가진다:
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK
GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK.
CD123-WT의 제3 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-10은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD123-WT의 제3 폴리펩타이드 사슬의 잔기 10-227은 IgG1 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:50)에 상응한다.
인식되는 것과 같이, CD123-WT의 제3 폴리펩타이드 사슬은 어떠한 에피토프-결합 도메인도 함유하지 않으며 따라서 이러한 DART-B-형 구조를 가지는 다양한 DA x CD3 결합 분자에 사용될 수 있다.
2. 제2 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD123-M1 (CD123 x CD3 mAb 1 M1)
제2 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-WT 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M1의 VH 도메인을 함유하며 "CD123-M1"로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M1은 CD3 mAb 1의 저친화성 변이체 (또한 "CD3 mAb 1 로우(Low)"로도 언급됨)이다. 또한 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M1의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제2 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD123-M1)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:177)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKDR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV TWFAYWGQGT
LVTVSS GGCG GG EVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGG DKTHTCP PCP APEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
CD123-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. CD123-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD123-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1 M1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:55)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD123-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-252 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD123-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD123-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 281-283은 GGG 링커에 상응한다. CD123-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 284-293 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD123-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 294-510은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M1의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD123-M1의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬 (즉, SEQ ID NO:175)과 동일하다. 유사하게, CD123-M1의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
3. 제3 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD123-M2 (CD123 x CD3 mAb 1 M2)
제3 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-M1 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M2의 VH 도메인을 함유하고 "CD123-M2"로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M2는 CD3 mAb 1보다 더 빠른 오프-속도를 가지며, 따라서 또한 "CD3 mAb 1 패스트"로서 언급된다. 또한 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M2의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제3 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD123-M2)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:178)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKDR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHKNFGNSYV TWFAYWGQGT
LVTVSS GGCG GG EVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGG DKTHTCP PCP APEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
CD123-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. CD123-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD123-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1 M2의 VH 도메인 (SEQ ID NO:59)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD123-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-252 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD123-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD123-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 281-283은 GGG 링커에 상응한다. CD123-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 284-293 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD123-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 294-510은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M2의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD123-M2 의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:175)과 동일하다. 유사하게, CD123-M2의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
4. 제4 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD123-M18 (CD123 x CD3 mAb 1 M18)
제4 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-M2 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인을 함유하고 "CD123-M18"로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M18의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제4 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD123-M18)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:179)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYGMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKDR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT
LVTVSS GGCG GG EVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGG DKTHTCP PCP APEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
CD123-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. CD123-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD123-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인 (SEQ ID NO:98)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD123-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-252 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD123-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD123-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 281-283은 GGG 링커에 상응한다. CD123-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 284-293 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD123-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 294-510은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M18의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD123-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:175)과 동일하다. 유사하게, CD123-M18의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
5. Fifth 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD123-M13 (CD123 x CD3 mAb 1 M13)
제5 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-WT 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M13의 VH 도메인을 함유하고 "CD123-M13"으로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M13의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제5 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD123-M13)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:198)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKDR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAEWGQGT
LVTVSS GGCG GG EVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGG DKTHTCP PCP APEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
CD123-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. CD123-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD123-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1 M13의 VH 도메인 (SEQ ID NO:88)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD123-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-252 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD123-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD123-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 281-283은 GGG 링커에 상응한다. CD123-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 284-293 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD123-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 294-510은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M13의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD123-M13의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:175)과 동일하다. 유사하게, CD123-M1의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
6. 제6 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD123-M17 (CD123 x CD3 mAb 1 M17)
제6 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-WT 디아바디와 상이하지만, CD3 mAb 1 M17의 VH 도메인을 함유하며 "CD123-M17"로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M17의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제6 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD123-M17)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:199)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STTAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKDR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT
LVTVSS GGCG GG EVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGG DKTHTCP PCP APEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
CD123-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. CD123-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD123-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1 M17의 VH 도메인 (SEQ ID NO:96)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD123-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-252 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD123-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD123-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 281-283은 GGG 링커에 상응한다. CD123-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 284-293 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD123-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 294-510은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M17의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD123-M17의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:175)과 동일하다. 유사하게, CD123-M17의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
7. 제7 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD123-M19 (CD123 x CD3 mAb 1 M19)
제7 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-WT 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M19의 VH 도메인을 함유하며 "CD123-M19"로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M19의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제7 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD123-M19)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:200)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIYWASTR
ESGVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYCQNDYSY PYTFGQGTKL EIKGGGSGGG
GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA
TYYADSVKDR FTISRDDSKN SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHKNIGNSYV SWFAYWGQGT
LVTVSS GGCG GG EVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGG DKTHTCP PCP APEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE
MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK.
CD123-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-113은 CD123 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:163)에 상응한다. CD123-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 114-121 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD123-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 122-246은 CD3 mAb 1 M19의 VH 도메인 (SEQ ID NO:100)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD123-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-252 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD123-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 253-280은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD123-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 281-283은 GGG 링커에 상응한다. CD123-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 284-293 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD123-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 294-510은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M19의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD123-M19의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:175)과 동일하다. 유사하게, CD123-M1의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
8. 제8 예시적인 DART-B-형 디아바디
5T4-WT (5T4 x CD3 mAb 1)
제8 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-M18 디아바디와 유사하지만, CD123-M18 디아바디의 CD123 결합 도메인 대신 5T4 결합 도메인을 포함한다. 추가적으로, 제8 예시적인 DART-B-형 디아바디는 CD3 mAb 1의 VH 도메인을 함유한다. 이 제8 예시적인 DART-B-형 디아바디는 "5T4-WT"로 표시된다.
그러므로, 제8 예시적인 DART-B-형 디아바디 (5T4-WT)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:180)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGG EVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGG DKT HTCPPCP APE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
5T4-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-107은 5T4 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:157)에 상응한다. 5T4-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 108-115 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. 5T4-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 116-240은 CD3 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:55)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 글리신 (G)이다. 5T4-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 241-246 (밑줄)은 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. 5T4-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-274는 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. 5T4-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 275-277은 GGG 링커에 상응한다. 5T4-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 278-287 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. 5T4-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 288-504는 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
5T4-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:181)을 가진다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE
KAKSRVTMTA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSS GGCG
GG KVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE.
5T4-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 CD3 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:56)에 상응한다. 5T4-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. 5T4-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-236은 5T4 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:156)에 상응한다. 5T4-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 237-242 (밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. 5T4-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 243-280은 헤테로다이머-촉진 "K-코일" ( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E; SEQ ID NO:30)에 상응한다.
5T4-WT의 제3 폴리펩타이드 사슬은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
9. 제9 예시적인 DART-B-형 디아바디
5T4-M1 (5T4 x CD3 mAb 1 M1)
제9 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 5T4-WT 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M1의 VH 도메인을 포함하며 "5T4-M1"로 표시된다.
그러므로, 제9 예시적인 DART-B-형 디아바디 (5T4-M1)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:182)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVTWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGG EVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGG DKT HTCPPCP APE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
5T4-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-107은 5T4 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:157)에 상응한다. 5T4-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 108-115 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. 5T4-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 116-240은 CD3 mAb 1 M1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:64)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. 5T4-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 241-246 (밑줄)은 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. 5T4-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-274는 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. 5T4-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 275-277은 GGG 링커에 상응한다. 5T4-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 278-287 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. 5T4-M1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 288-504는 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M1의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, 5T4-M1의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 5T4-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:181)과 동일하다. 유사하게, 5T4-M1의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
10. 제10 예시적인 DART-B-형 디아바디
5T4-M2 (5T4 x CD3 mAb 1 M2)
제10 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 5T4-M1 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M2의 VH 도메인을 포함하며 "5T4-M2"로 표시된다.
그러므로, 제10 예시적인 DART-B-형 디아바디 (5T4-M2)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:183)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHKNFG NSYVTWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGG EVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGG DKT HTCPPCP APE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
5T4-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-107은 5T4 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:157)에 상응한다. 5T4-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 108-115 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다.5T4-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 116-240은 CD3 mAb 1 M2의 VH 도메인 (SEQ ID NO:66)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. 5T4-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 241-246 (밑줄)은 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. 5T4-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-274는 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. 5T4-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 275-277은 GGG 링커에 상응한다. 5T4-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 278-287 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. 5T4-M2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 288-504는 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M2의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, 5T4-M2의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 5T4-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:181)과 동일하다. 유사하게, 5T4-M2의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
11. 제11 예시적인 DART-B-형 디아바디
5T4-M18 (5T4 x CD3 mAb 1 M18)
제11 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 5T4-WT 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인을 포함하며 "5T4-M18"로 표시된다
그러므로, 제11 예시적인 DART-B-형 디아바디 (5T4-M18)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:184)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYGMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS
VKDRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
GGCGGG EVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGG DKT HTCPPCP APE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV
SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV
SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK.
5T4-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-107은 5T4 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:157)에 상응한다. 5T4-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 108-115 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. 5T4-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 116-240은 CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인 (SEQ ID NO:98)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. 5T4-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 241-246 (밑줄)은 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. 5T4-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-274는 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. 5T4-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 275-277은 GGG 링커에 상응한다. 5T4-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 278-287 (밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. 5T4-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 288-504는 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M18의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, 5T4-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 5T4-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:181)과 동일하다. 유사하게, 5T4-M18의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
12. 제12 예시적인 DART-B-형 디아바디
HIV-WT (HIV x CD3 mAb 1)
제12 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-WT 디아바디와 유사하지만, CD123-WT 디아바디의 CD123 결합 도메인 대신 항-HIV 항체 A32의 HIV 결합 도메인을 포함한다. 이 제12 예시적인 DART-B-형 디아바는 "HIV-WT"로 표시된다.
그러므로, 제12 예시적인 DART-B-형 디아바디 (HIV-WT)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:185)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV
PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV
QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSTY AMNWVRQAPG KGLEWVGRIR SKYNNYATYY
ADSVKGRFTI SRDDSKNSLY LQMNSLKTED TAVYYCVRHG NFGNSYVSWF AYWGQGTLVT
VSS ASTKG EV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGG D KTHTCPPCP A PEAAGGPSVF
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR
VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN
QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN
VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK.
HIV-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 A32의 VL 도메인 (SEQ ID NO:169)에 상응한다. HIV-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. HIV-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-243은 CD3 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:55)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 글리신 (G)이다. HIV-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 244-248 (밑줄)은 링커 2 (ASTKG; SEQ ID NO:21; 단일 밑줄)에 상응한다. HIV-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 249-276은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:31)에 상응한다. HIV-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 277-279는 GGG 링커에 상응한다. HIV-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 280-289 (밑줄)는 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40; 단일 밑줄)에 상응한다. HIV-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 290-506은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
HIV-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:186)을 가진다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
QLQESGPGLV KPSQTLSLSC TVSGGSSSSG AHYWSWIRQY PGKGLEWIGY IHYSGNTYYN
PSLKSRITIS QHTSENQFSL KLNSVTVADT AVYYCARGTR LRTLRNAFDI WGQGTLVTVS
S ASTKG KVAA CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE.
HIV-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 CD3 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:56)에 상응한다. HIV-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. HIV-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-241은 A32의 VH 도메인 (SEQ ID NO:209 (즉, SEQ ID NO:168, 여기서 X는 L임))에 상응한다. HIV-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 242-246 (밑줄)은 링커 2 (ASTKG; SEQ ID NO:21)에 상응한다. HIV-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 247-274는 헤테로다이머-촉진 "K-코일" ( K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E; SEQ ID NO:32)에 상응한다.
HIV-WT의 제3 폴리펩타이드 사슬은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
13. 제13 예시적인 DART-B-형 디아바디
HIV-M18 (HIV x CD3 mAb 18)
제13 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 HIV-WT 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인을 함유한다. 이 예시적인 DART-B-형 디아바디는 "HIV-M18"로 표시된다.
그러므로, 제13 예시적인 DART-B-형 디아바디 (HIV-M18)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:196)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV
PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV
QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSTY GMNWVRQAPG KGLEWVGRIR SKYNNYATYY
ADSVKGRFTI SRDDSKNSLY LQMNSLKTED TAVYYCVRHG NFGNSYVSWF AYWGQGTLVT
VSS ASTKG EV AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGG D KTHTCPPCP A PEAAGGPSVF
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR
VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN
QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN
VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK.
HIV-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 A32의 VL 도메인 (SEQ ID NO:169)에 상응한다. HIV-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. HIV-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-243은 CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인 (SEQ ID NO:55)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 글리신 (G)이다. HIV-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 244-248 (밑줄)은 링커 2 (ASTKG; SEQ ID NO:21; 단일 밑줄)에 상응한다. HIV-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 249-276은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:31)에 상응한다. HIV-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 277-279는 GGG 링커에 상응한다. HIV-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 280-289 (밑줄)는 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40; 단일 밑줄)에 상응한다. HIV-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 290-506은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M18의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, HIV-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 HIV-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:186)과 동일하다. 유사하게, HIV-M18의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
14. 제14 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD19-WT (CD19 x CD3 mAb 1)
제14 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 HIV-WT 디아바디와 유사하지만, A32 결합 도메인 대신 CD19 mAb 1을 포함한다. 이 제14 예시적인 DART-B-형 디아바디는 "CD19-WT"로 표시된다.
그러므로, 제14 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD19-WT)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:191)을 가지는 제1 폴리펩타이드 서열을 가진다:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR
FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSS A
STKG EVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGG DKTHT CPPCP APEAA GGPSVFLFPP
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK.
CD19-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-106은 CD19 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:165)에 상응한다. CD19-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 107-114 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD19-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 115-239는 CD3 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:55)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 글리신 (G)이다. CD19-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 240-244 (밑줄)는 링커 2 (ASTKG; SEQ ID NO:21; 단일 밑줄)에 상응한다. CD19-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 245-272는 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:31)에 상응한다. CD19-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 273-275는 GGG 링커 (이중 밑줄)에 상응한다. CD19-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 276-285 (단일 밑줄)는 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD19-WT의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 286-502는 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD19-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:192)을 가진다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
TLRESGPALV KPTQTLTLTC TFSGFSLSTS GMGVGWIRQP PGKALEWLAH IWWDDDKRYN
PALKSRLTIS KDTSKNQVFL TMTNMDPVDT ATYYCARMEL WSYYFDYWGQ GTTVTVSSAS
TKGKVAACKE KVAALKEKVA ALKEKVAALK E.
CD19-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 CD3 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:56)에 상응한다. CD19-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD19-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-238은 CD19 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:164)에 상응한다. CD19-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 239-243 (밑줄)은 링커 2 (ASTKG; SEQ ID NO:21)에 상응한다. CD19-WT의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 244-271은 헤테로다이머-촉진 "K-코일" ( K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E; SEQ ID NO:32)에 상응한다.
CD19-WT의 제3 폴리펩타이드 사슬은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
15. 제15 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD19-M18 (CD19 x CD3 mAb 1 M18)
제15 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD19-WT 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인을 함유한다. 이 제15 예시적인 DART-B-형 디아바디는 "CD19-M18"로 표시된다.
그러므로, 제15 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD19-M18)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:197)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR
FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYGMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSS A
STKG EVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGG DKTHT CPPCP APEAA GGPSVFLFPP
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK.
CD19-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-106은 CD19 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:165)에 상응한다. CD19-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 107-114 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD19-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 115-239는 CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인 (SEQ ID NO:98)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 글리신 (G)이다. CD19-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 240-244 (밑줄)는 링커 2 (ASTKG; SEQ ID NO:21; 단일 밑줄)에 상응한다. CD19-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 245-272는 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:31)에 상응한다. CD19-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 273-275는 GGG 링커에 상응한다. CD19-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 276-285 (단일 밑줄)는 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD19-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 286-502는 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M18의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD19-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD19-WT 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:192)과 동일하다. 유사하게, CD19-M18의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
16. 제16 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD19.1-M18 (CD19.1 x CD3 mAb 1 M18)
제16 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD123-M18 디아바디와 유사하지만, CD123-M18의 결합 도메인 대신 CD19 mAb 1의 대체 VL 도메인을 함유하는 CD19 결합 도메인을 포함한다. 이런 예시적인 DART-B-형 디아바디는 "CD19.1-M18"로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M18의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제16 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD19.1-M18)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:193)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKVT ITCSASSSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDT SKLASGVPSR
FSGSGSGTDH FLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYGMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KDRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSS G
GCGGG EVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGG DKTH TCPPCP APEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
CD19.1-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-106은 대체 CD19 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:195)에 상응한다. CD19.1-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 107-114 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD19.1-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 115-239는 CD3 mAb 1 M18의 VH 도메인 (SEQ ID NO:98)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD19.1-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 240-245 (단일 밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD19.1-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 246-273은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD19.1-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 274-276은 GGG 링커에 상응한다. CD19.1-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 277-286 (단일 밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD19.1-M18의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 287-503은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD19.1-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:194)을 가진다:
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT
PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV
TLRESGPALV KPTQTLTLTC TFSGFSLSTS GMGVGWIRQP PGKALEWLAH IWWDDDKRYN
PALKSRLTIS KDTSKNQVFL TMTNMDPVDT ATYYCARMEL WSYYFDYWGQ GTTVTVSS GG
CGGG KVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE.
CD19.1-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-110은 CD3 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:56)에 상응한다. CD19.1-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 111-118 (이중 밑줄)은 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD19.1-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 119-238은 CD19 mAb 1의 VH 도메인 (SEQ ID NO:164)에 상응한다. CD19.1-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 239-244 (단일 밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD19.1-M18의 제2 폴리펩타이드 사슬의 잔기 245-272는 헤테로다이머-촉진 "K-코일" ( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E; SEQ ID NO:30)에 상응한다.
CD19.1-M18의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
17. 제17 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD19.1-M13 (CD19.1 x CD3 mAb 1 M13)
제17 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD19.1-M18 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M13의 VH 도메인을 함유하며 "CD19.1-M13"으로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M13의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제17 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD19.1-M13)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:201)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKVT ITCSASSSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDT SKLASGVPSR
FSGSGSGTDH FLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KDRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAEWG QGTLVTVSS G
GCGGG EVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGG DKTH TCPPCP APEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
CD19.1-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-106은 CD19 mAb 1의 대체 VL 도메인 (SEQ ID NO:195)에 상응한다. CD19.1-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 107-114 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD19.1-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 115-239는 CD3 mAb 1 M13의 VH 도메인 (SEQ ID NO:88)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD19.1-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 240-245 (단일 밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD19.1-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 246-273은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD19.1-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 274-276은 GGG 링커에 상응한다. CD19.1-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 277-286 (단일 밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD19.1-M13의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 287-503은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M13의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD19.1-M13의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD19.1-M18 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:194)과 동일하다. CD19.1-M13의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
18. 제18 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD19.1-M17 (CD19.1 x CD3 mAb 1 M17)
제18 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD19.1-M18 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M17의 VH 도메인을 함유하며 "CD19.1-M17"로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M17의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제18 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD19.1-M17)은 아미노산 서열 (SEQ ID NO:202)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKVT ITCSASSSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDT SKLASGVPSR
FSGSGSGTDH FLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTTAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KDRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSS G
GCGGG EVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGG DKTH TCPPCP APEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
CD19.1-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-106은 대체 CD19 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:195)에 상응한다. CD19.1-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 107-114 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD19.1-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 115-239는 CD3 mAb 1 M17의 VH 도메인 (SEQ ID NO:96)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD19.1-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 240-245 (단일 밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD19.1-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 246-273은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD19.1-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 274-276은 GGG 링커에 상응한다. CD19.1-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 277-286 (단일 밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD19.1-M17의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 287-503은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M17의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD19.1-M17의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD19.1-M18 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:194)과 동일하다. CD19.1-M17의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
19. 제19 예시적인 DART-B-형 디아바디
CD19.1-M19 (CD19.1 x CD3 mAb 1 M19)
제19 예시적인 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD19.1-M18 디아바디와 유사하지만, CD3 mAb 1 M19의 VH 도메인을 함유하며 "CD19.1-M19"로 표시된다. 상기에서 표시된 것과 같이, CD3 mAb 1 M19의 VL 도메인은 CD3 mAb 1의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열을 가진다.
그러므로, 제19 예시적인 DART-B-형 디아바디 (CD19.1-M19)는 아미노산 서열 (SEQ ID NO:203)을 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 가진다:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKVT ITCSASSSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDT SKLASGVPSR
FSGSGSGTDH FLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KDRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHKNIGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSS G
GCGGG EVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGG DKTH TCPPCP APEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS
VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS
LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK.
CD19.1-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-106은 CD19 mAb 1의 VL 도메인 (SEQ ID NO:195)에 상응한다. CD19.1-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 107-114 (이중 밑줄)는 링커 1 (GGGSGGGG; SEQ ID NO:16)에 상응한다. CD19.1-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 115-239는 CD3 mAb 1 M9의 VH 도메인 (SEQ ID NO:100)에 상응하고, 여기서 Kabat 위치 65 (이중 밑줄)는 아스파테이트 (D)이다. CD19.1-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 240-245 (단일 밑줄)는 링커 2 (GGCGGG; SEQ ID NO:17)에 상응한다. CD19.1-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 246-273은 헤테로다이머-촉진 "E-코일" ( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K; SEQ ID NO:29)에 상응한다. CD19.1-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 274-276은 GGG 링커에 상응한다. CD19.1-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 277-286 (단일 밑줄)은 링커 DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:40)에 상응한다. CD19.1-M19의 제1 폴리펩타이드 사슬의 잔기 287-503은 IgG1 "손잡이-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:48)에 상응한다.
CD3 mAb 1 M19의 VL 도메인이 CD3 mAb 1의 그것과 동일하기 때문에, CD19.1-M19의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD19.1-M18 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:194)과 동일하다. CD19.1-M13의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 CD123-WT 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)과 동일하다.
구체적으로 포함되는 추가적인 CD19 x CD3 DART-B-형 디아바디는 상기 기술된 CD19-WT (제14 예시적인 DART-B-형 디아바디 참조)와 유사하지만 CD3 mAb 1 M13, M17, 또는 M19의 VH 도메인을 포함할 것이다. 이러한 디아바디는 다음의 아미노산 서열 중 하나를 가지는 제1 폴리펩타이드 사슬을 포함할 것이다:
CD3 mAb 1 M13의 VH 도메인을 포함하는 그러한 디아바디의 경우 SEQ ID NO:204:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR
FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAEWG QGTLVTVSS A
STKG EVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGG DKTHT CPPCP APEAA GGPSVFLFPP
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK.
CD3 mAb 1 M17의 VH 도메인을 포함하는 그러한 디아바디의 경우 SEQ ID NO:205:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR
FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTTAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSS A
STKG EVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGG DKTHT CPPCP APEAA GGPSVFLFPP
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK.
CD3 mAb 1 M19의 VH 도메인을 포함하는 그러한 디아바디의 경우 SEQ ID NO:206:
ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITCRASQSVS YMHWYQQKPG QAPRLLIYDA SNRASGVPSR
FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYCFQG SVYPFTFGQG TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE
SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV
KGRFTISRDD SKNSLYLQMN SLKTEDTAVY YCVRHKNIGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSS A
STKG EVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKGGG DKTHT CPPCP APEAA GGPSVFLFPP
KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV
LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
WCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC
SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK.
이러한 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬은 CD19-WT의 동일한 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:192)을 가질 것이고 이러한 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬은 CD123-WT의 제3 폴리펩타이드 사슬과 동일한 아미노산 서열 (즉, SEQ ID NO:176)을 가질 것이다.
본 발명의 관점에서 인식되는 것과 같이, 대체 질환 항원에 대한 결합 부위를 가지는 및/또는 대체 변이체 항-CD3 항체의 CD3 결합 도메인 (즉, vCD3-결합 도메인)을 가지는 추가적인 DART-B-형 디아바디가 유사하게 (이러한 항체의 VL 및 VH 도메인을 사용함으로써) 구성될 수 있다. 유사하게, 본원에서 제공되는 것과 같이, 대체 링커 및/또는 대체 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 대체 DART-B-형 분자가 유사하게 구성될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 질환 항원을 발현하는 세포 (예컨대, 종양 세포)의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 추가적인, 예시의 분자는 다음에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다: CD19 및 CD3 (예컨대, 미국 특허 제 7,235,641GH 및 WO 2016/048938 참조); CD123 및 CD3 (예컨대, Kuo, S.R. et al. , (2012) "Engineering a CD123xCD3 Bispecific scFv Immunofusion For The Treatment Of Leukemia And Elimination Of Leukemia Stem Cells", Protein Eng Des Sel. 25:561-9; WO 2015/026892; WO 2016/086189 참조); gpA33 및 CD3 (예컨대, WO 2015/026894); CEA 및 CD3 (예컨대, WO 2013/012414; WO 2017/118675); B7-H3 및 CD3 (예컨대, WO 2017/030926); HER2 및 CD3 (예컨대, WO 2012/143524); 5T4 및 CD3 (예컨대, WO 2015/184203 및 WO 2013/041687), 및 CD3 결합 도메인을 가지는 다른 분자 (예컨대, 등, WO 2013/026835, WO 2013/158856, WO 2014/110601, WO 2016/182751, WO 2017/053469 참조). 본 발명의 관점에서 인식되는 것과 같이, 본 발명의 vCD3-결합 도메인은 이러한 분자에 포함될 수 있다.
C. 3가-형 분자
3가-형 분자는 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 3가 분자이다. 특히, 본 발명의 3가-형 분자는 CD3 및 질환 항원 (예컨대, 암 또는 감염성질환 항원)에 결합할 수 있고 추가로 추가적인 질환 항원 (예컨대, 암 또는 감염성질환 항원) 또는 이펙터 세포 (예컨대, CD8)의 표면에서 발현된 추가적인 항원과 같은 추가 항원에 결합할 수 있거나, 또는 제2 CD3의 에피토프 또는 제2 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있다. 3가-형 분자는 Fc 도메인을 포함한다. 본원에는 4개의 폴리펩타이드 사슬로 구성되고 CD3에 대한 한 개의 결합 부위, 암 항원 CD3 또는 암 항원 5T4에 대한 한 개의 결합 부위, 및 CD8에 대한 한 개의 결합 부위를 가지는 예시적인 3가-형 디아바디가 제공된다 (예컨대, 도 6A 참조). 발명의 예시적인 3가-형 분자는 상기 제공된 DART-B-형 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬을, CD8 결합 도메인을 제공하는, 하기 제공되는 예시적인 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬과 함께 사용하여 생성된다. 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 CD3 및 DA 결합 도메인을 형성하는 한편 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 CD8 결합 도메인을 형성한다. 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 Fc 도메인을 형성한다.
하기 제공되는 예시적인 3가-형 분자는 각각 SEQ ID NO:187:의 아미노산 서열을 가지는 제3 폴리펩타이드 사슬을 포함한다:
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL IYYDGSNKFY
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE
EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG K.
이러한 예시적인 3가-형 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-121은 항-CD8 항체 TRX2의 VH 도메인 (SEQ ID NO:120)에 상응한다. 이러한 예시적인 3가-형 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬의 잔기 121-219는 IgG1 CH1 도메인 (SEQ ID NO:1)에 상응한다. 이러한 예시적인 3가-형 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬의 잔기 220-234는 IgG1 힌지 도메인 (SEQ ID NO:5)에 상응한다. 잔기 235-451은 IgG1 "구멍-포함" CH2-CH3 도메인 (SEQ ID NO:50)에 상응한다.
하기 기술되는 예시적인 3가-형 분자는 각각 SEQ ID NO:188의 아미노산 서열을 가지는 제4 폴리펩타이드 사슬을 포함한다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN TDILHTGVPS
RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL
SKADYEKHKV YACEVTHQGL SSPVTKSFNR GEC.
이러한 예시적인 3가-형 분자의 제4 폴리펩타이드 사슬의 잔기 1-106은 항-CD8 항체 TRX2의 VL 도메인 (SEQ ID NO:121)에 상응한다. 잔기 107-213은 CL 카파 도메인 (SEQ ID NO:14)에 상응한다.
예시적인 3가-형 분자의 폴리펩타이드 사슬의 SEQ ID NO가 표 10에 요약된다.
CD123 x CD3 x CD8 TRIDENT 분자
TRIDENT-형
번호 		질환 항원-결합 도메인 CD3
결합 도메인 		폴리펩타이드 사슬 표시
제1 제2 제3 제4
CD123 / CD3 결합
도메인 		CD8 결합 도메인
1 CD123 mAb 1 CD3 mAb 1 SEQ ID NO:174 SEQ ID NO:175 SEQ ID NO:187 SEQ ID NO:188 T-CD123-WT
2 CD3 mAb 1 M1 SEQ ID NO:177 T-CD123-M1
3 CD3 mAb 1 M2 SEQ ID NO:178 T-CD123-M2
4 CD3 mAb 1 M18 SEQ ID NO:179 T-CD123-M18
1. 제1 예시적인 3가-형 분자
T-CD123-WT (CD123 mAb 1 x CD3 mAb 1 x TRX2)
제1 예시적인 3가-형 분자 (designated "T-CD123-WT")는 CD123 mAb 1의 VH 및 VL 도메인, CD3 mAb 1의 VH 및 VL 도메인, 및 항-CD8 항체 TRX2의 VH 및 VL 도메인을 함유한다. 상기에서 표시된 것과 같이, 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 상기 기술된 CD123-WT 디아바디의 그것 (SEQ ID NO:174)과 동일하다. 유사하게, 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 상기 기술된 CD123-WT 디아바디의 그것 (SEQ ID NO:175)과 동일하다. 또한 상기에서 표시된 것과 같이, 모든 예시적인 3가-형 분자의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:187 및 SEQ ID NO:188이다.
2. 제2 예시적인 3가-형 분자
T-CD123-M1 (CD123 mAb 1 x CD3 mAb 1 M1 x TRX2)
제2 예시적인 3가-형 분자 ("T-CD123-M1"로 표시됨)는 CD123 mAb 1의 VH 및 VL 도메인, CD3 mAb 1 M1의 VH 및 VL 도메인, 및 TRX2의 VH 및 VL 도메인을 함유한다. 상기에서 표시된 것과 같이, 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 상기 기술된 CD123-M1 디아바디의 그것 (SEQ ID NO:177)과 동일하다. 유사하게, 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 상기 기술된 CD123-WT 디아바디의 그것 (SEQ ID NO:175)과 동일하다. 또한 상기에서 표시된 것과 같이, 모든 예시적인 3가-형 분자의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:187 및 SEQ ID NO:188이다.
3. 제3 예시적인 3가-형 분자
T-CD123-M2 (CD123 mAb 1 x CD3 mAb 1 M2 x TRX2)
T-CD123-M2로 표시된 제3 예시적인 3가-형 분자는 CD123 mAb 1의 VH 및 VL 도메인, CD3 mAb 1 M2의 VH 및 VL 도메인, 및 TRX2의 VH 및 VL 도메인을 함유한다. 상기에서 표시된 것과 같이, 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 상기 기술된 CD123-M2 디아바디의 그것 (SEQ ID NO:178)과 동일하다. 유사하게, 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 상기 기술된 CD123-WT 디아바디의 그것 (SEQ ID NO:175)과 동일하다. 또한 상기에서 표시된 것과 같이, 모든 예시적인 3가-형 분자의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:187 및 SEQ ID NO:188이다.
4. 제4 예시적인 3가-형 분자
T-CD123-M18 (CD123 mAb 1 x CD3 mAb 1 M18 x TRX2)
T-CD123-M18로 표시된 제4 예시적인 3가-형 분자는 CD123 mAb 1의 VH 및 VL 도메인, CD3 mAb 1 M18의 VH 및 VL 도메인, 및 TRX2의 VH 및 VL 도메인을 함유한다. 상기에서 표시된 것과 같이, 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 상기 기술된 CD123-M18 디아바디의 그것 (SEQ ID NO:179)과 동일하다. 유사하게, 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 상기 기술된 CD123-WT 디아바디의 그것 (SEQ ID NO:175)과 동일하다. 또한 상기에서 표시된 것과 같이, 모든 예시적인 3가-형 분자의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:187 및 SEQ ID NO:188이다.
본 개시의 관점에서 인식되는 것과 같이, 대체 질환 항원에 대한 결합 부위 및/또는 대체 변이체 항-CD3 항체의 CD3 결합 도메인 (즉, vCD3-결합 도메인)을 가지는 추가적인 3가-형 디아바디가 유사하게 (이러한 항체의 VL 및 VH 도메인을 사용함으로써) 구성될 수 있다. 유사하게, 본원에서 제공되는 것과 같이, 대체 링커 및/또는 대체 헤테로다이머-촉진 도메인을 포함하는 대체 3가-형 분자가 유사하게 구성될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 질환 항원을 발현하는 세포 (예컨대, 종양 세포)의 재지시된 사멸을 매개할 수 있는 추가적인, 예시의 분자는 다음에 결합할 수 있는 3가 분자를 포함한다: B7-H3, CD3 및 CD8 (예컨대, WO 2015/184203 참조); 5T4, CD3 및 CD8 (예컨대, WO 2015/184203 참조); ROR1, CD3 및 CD8 (예컨대, WO 2015/184203 및 WO 2017/106061 참조); HIV, CD3 및 CD8 (예컨대, WO 2015/184203; WO2017/011413; 및 WO2017/011414 참조); gpA33, CD3 및 DR5 (예컨대, WO 2015/184207 참조); EphA2, CD3 및 DR5 (예컨대, WO 2015/184207 참조); gpA33, CD3 및 EphA2 (예컨대, WO 2015/184207 참조); 및 다른 3가 분자 (예컨대, WO 2016/105450; WO 2016/115274; WO 2017/180913 참조). 본 개시의 관점에서 인식되는 것과 같이, 본 발명의 vCD3-결합 도메인은 이러한 분자에 포함될 수 있다.
VIII. 제조 방법
본 발명의 분자는 가장 바람직하게는, 기술분야에 잘 알려져 있는 것과 같이, 그러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 재조합 발현을 통해 제조된다.
발명의 폴리펩타이드는 고상 펩타이드 합성을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다 (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis", Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century", Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).
항체는 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 재조합에 의해 만들어지고 발현될 수 있다. 항체는 먼저 숙주 동물로부터 만들어진 항체를 분리하고, 유전자 서열을 얻고, 숙주 세포 (예컨대, CHO 세포)에서 재조합적으로 항체를 발현하기 위해 유전자 서열을 사용함으로써 재조합에 의해 만들어질 수 있다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 식물 (예컨대, 담배) 또는 유전자 도입 우유에서 항체 서열을 발현하는 것이다. 식물 또는 우유에서 재조합적으로 항체를 발현하기 위해 적합한 방법은 개시되어 있다 (예를 들어, Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants", Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice", Int. Rev. Immunol 13:65-93; 및 Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies", J. Immunol. Methods 231:147-157 참조). 항체 유도체, 예컨대, 인간화된, 단일-사슬, 등을 제조하기 위한 적합한 방법은 기술분야에 알려져 있고, 상기에서 기술되어 있다. 또 다른 대안으로, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합적으로 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,565,332호; 5,580,717호; 5,733,743호; 6,265,150호; 및 Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology", Annu. Rev. Immunol. 12.433-455 참조).
관심 있는 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 본 발명의 결합 분자의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)를 함유한 벡터는 전기천공, 염화 칼슘, 염화 루비듐, 인산 칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 사용하는 트랜스펙션; 미세발사체 폭발(microprojectile bombardment); 리포펙션; 및 감염 (예컨대, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염성 병원체인 경우)을 포함한 많은 적절한 수단 중 임의의 수단에 의해 숙주 세포로 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 선택은 자주 숙주 세포의 특징에 좌우될 것이다.
이종성 DNA를 과다발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심 있는 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현할 목적으로 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 비제한적 예로는 한정하는 것은 아니지만 COS, HeLa, 및 CHO 세포를 들 수 있다.
발명은 본 발명의 결합 분자의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 기술분야에 알려져 있는 과정들에 의해 만들어질 수 있다. 폴리펩타이드는 항체의 단백질 가수분해성 또는 다른 분해에 의해, 상기 기술된 것과 같은 재조합 방법 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩타이드)에 의해 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 항체의 폴리펩타이드, 특히 약 50개 아미노산까지의 더 짧은 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 편리하게 만들어진다. 화학적 합성 방법은 기술분야에 알려져 있고 상업적으로 입수 가능하다.
발명은 증강된 또는 감소된 활성을 가지는 변이체뿐만 아니라 그러한 분자의 특성에 유의하게 영향을 주지 않는 기능적으로 동등한 폴리펩타이드를 포함한, 개시된 결합 분자의 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드의 변형은 기술분야에서 기본적인 실시이고 본원에서 상세하게 기술될 필요는 없다. 변형된 폴리펩타이드의 예로는 아미노산 잔기의 보존성 치환, 기능적 활성을 상당히 해롭게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 삭제 또는 첨가, 또는 화학적 유사체의 사용을 포함한 폴리펩타이드를 포함한다. 서로에 대해 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기로는, 한정하는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 글리신/알라닌; 세린/트레오닌; 발린/아이소류신/류신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신. 이들 폴리펩타이드는 또한 글리코실화된 및 글리코실화되지 않은 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 다른 번역 후 변형, 예를 들면, 상이한 당으로의 글리코실화, 아세틸화, 및 인산화가 있는 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게, 아미노산 치환은 보존적일 것이다, 즉, 치환된 아미노산은 원래의 아미노산의 화학적 특성과 유사한 특성을 가질 것이다. 이러한 보존성 치환은 기술분야에 알려져 있고, 예는 상기에서 제공되었다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산을 변화 또는 변형시키는 것으로부터 영역, 예컨대 가변 도메인의 완전한 재설계에 이르기까지 다양할 수 있다. 가변 도메인의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 다른 변형 방법으로는, 한정하는 것은 아니지만 효소적 수단, 산화성 치환 및 킬레이트화를 포함한, 기술분야에 알려져 있는 결합 기법을 사용하는 것을 들 수 있다. 변형은, 예를 들어, 면역검정을 위한 표지의 부착, 예컨대 방사성 면역검정을 위한 방사성 모이어티의 부착을 위해 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는 기술분야에 확립된 과정을 사용하여 만들어질 수 있고 기술분야에 알려져 있는 표준 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
한 구체예에서, 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 둘 다를 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 이종성 면역글로불린 불변 영역을 함유한다. 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 공개적으로 기탁된 하이브리도마로부터 제조된 항체의 VH 및 VL 도메인을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해, 항체 융합 단백질은 단백질이 CD3에, 또는 CD3과 질환 항원 둘 다에 특이적으로 결합하고, 천연 분자에서 부착되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어, 또 다른 영역으로부터의 이종성 서열 또는 상동성 서열을 함유하는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인을 함유한다.
본 발명은 특히 진단적 또는 치료적 모이어티에 컨쥬게이션된 이러한 결합 분자 (예컨대, 항체, 디아바디, 3가 결합 분자, 등)를 포함한다. 진단 목적을 위해, 발명의 결합 분자는 검출 가능한 물질에 결합될 수 있다. 이러한 결합 분자는 임상적 테스트 과정의 일부로서 질환의 발달 또는 진행을 모니터링 및/또는 예측하는 것, 예컨대 특정 치료법의 효능을 측정하기에 유용하다. 검출 가능한 물질의 예로는 다양한 효소 (예컨대, 양고추냉이 과산화효소, 베타-갈락토시다제, 등), 보결 기 (예컨대, 아비딘/비오틴), 형광 물질 (예컨대, 움벨리페론, 플루오레세인, 또는 파이코에리트린), 발광 물질 (예컨대, 루미놀), 생물발광 물질 (예컨대, 루시페라제 또는 에쿼린), 방사성 물질 (예컨대, 탄소-14, 망간-54, 스트론튬-85 또는 아연-65), 양전자 방출 금속, 및 비방사능 쌍자성 금속 이온을 들 수 있다. 검출 가능한 물질은 기술분야에 알려져 있는 기법들을 사용하여 결합 분자에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 링커)를 통해 간접적으로 결합되거나 컨쥬게이션될 수 있다.
치료적 목적을 위해, 발명의 결합 분자는 세포독소 (예컨대, 세포증식 억제제 또는 세포파괴제), 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예컨대, 알파-방출제와 같은 치료 모이어티에 컨쥬게이션될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는, 예를 들어, 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, 보툴리눔 독소 A부터 F, 리신 아브린, 사포린, 및 그러한 작용제의 세포독성 단편과 같은, 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다. 치료제는 장애를 예방적으로 또는 치료적으로 처리하기 위한 치료 효과를 가지는 임의의 작용제를 포함한다. 이러한 치료제는 화학적 치료제, 단백질 또는 폴리펩타이드 치료제일 수 있고, 원하는 생물학적 활성을 가지거나 및/또는 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료제를 포함한다. 치료제의 예로는 알킬화제, 혈관신생 억제제, 유사분열 방지제, 호르몬 치료제, 및 세포 증식성 장애의 치료에 유용한 항체를 들 수 있다. 치료 모이어티는 기술분야에 알려져 있는 기법을 사용하여 결합 분자에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 링커)를 통해 간접적으로 결합되거나 컨쥬게이션될 수 있다.
IX. 본 발명의 결합 분자의 용도
상기에서 논의된 것과 같이, CD3 및 질환 항원에 결합할 수 있는 분자는 그것의 세포 표면에서 그러한 질환 항원을 발현하는 표적 세포 (즉, 암세포, 또는 병원체-감염 세포)의 재지시된 세포 사멸을 매개할 수 있다. 이러한 분자는 치료 목적으로, 예를 들어 암 또는 감염을 가진 대상체에서 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 결합 분자는 그러한 표적 세포의 표면에서 질환 항원, 특히 암 항원 또는 병원체-관련 항원의 발현과 관련된 또는 발현을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 상태를 치료하는 능력을 가진다. 그러므로, 제한 없이, 본 발명의 결합 분자는 암, 특히 암 항원의 발현을 특징으로 하는 암의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 분자는 감염, 특히 병원체-관련 항원의 발현을 특징으로 하는 감염의 치료에 사용될 수 있다.
특히, 본 발명은 CD3에 결합할 수 있는 분자가 CD3에 결합할 수 있는 항체의 에피토프-결합 도메인을 포함하며 또한 표적 세포의 재지시된 사멸을 (예를 들어, 재지시된 세포 사멸 (예컨대, 재지시된 T-세포 또는 재지시된 NK-세포 세포독성)을 매개함으로써) 매개하기 위하여 표적 세포의 표면에서 질환 항원 (특히 암 항원 또는 병원체-관련 항원)에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하는 그러한 방법을 포함한다.
특정 구체예에서, CD3 및 질환 항원에 결합할 수 있는 분자는 이중 특이적 항체, 또는 그것의 에피토프-결합 도메인 (이중특이적 scFv, BiTe, TandAb를 포함함)을 포함하는 분자이다.
특정 구체예에서, CD3 및 질환 항원에 결합할 수 있는 분자는 이중특이적 디아바디이다.
특정 구체예에서, CD3 및 질환 항원에 결합할 수 있는 분자는 3가 결합 분자이다.
"치료법을 제공하는 것" 또는 "치료하는"은, 제한 없이, 질환으로부터 유발되는 증상을 감소시키는 것, 감염의 증상 (예컨대, 바이러스 로드, 열, 통증, 패혈증, 등)을 약화시키는 것, 종양의 크기를 수축시키는 것 (암 맥락에서, 예를 들어, 유방의 종양, 위암 또는 전립선암), 암세포 성장의 지체, 전이의 발병, 발달 또는 진행의 지연, 질환으로부터 유발되는 증상을 감소시키는 것, 수령 대상체의 삶의 질을 증가시키는 것, 대상체 질환을 치료하기 위해 제공되는 다른 약물의 용량을 감소시키는 것, 표적화 및/또는 내부화를 통하는 것과 같이 다른 약물의 효과를 향상시키는 것, 질환의 진행의 지연, 및/또는 수령 대상체의 생존을 연장시키는 것과 같은 임의의 임상 결과를 포함한, 유익한 또는 원하는 결과의 임의의 표시와 관련된 조성물의 임의의 투여를 나타낸다.
치료를 위한 대상체는 동물, 가장 바람직하게는 비영장류 (예컨대, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 등) 또는 영장류 (예컨대, 시노몰구스 원숭이와 같은 원숭이, 인간, 등)를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 인간이다.
본 발명의 다양한 구체예에 의해 치료될 수 있는 예시의 장애로는, 한정하는 것은 아니지만, 증식성 장애, 세포 증식성 장애, 및 암 (특히 재지시된 세포 사멸을 매개할 수 있는 분자에 의해 결합된 암 항원을 발현하는 암), 병원체-관련 질환 (특히 재지시된 세포 사멸을 매개할 수 있는 분자에 의해 결합된 병원체-관련 항원의 발현과 관련된 만성 바이러스 감염)을 들 수 있다. 다양한 구체예에서, 발명은 본 발명의 결합 분자의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애의 치료, 예방 또는 관리를 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 그러한 분자는 특히 원발성 종양, 및 종양의 전이의 예방, 억제, 성장의 감소, 또는 퇴행, 및 병원체 로드의 감소, 또는 병원체-감염 세포 제거에 특히 유용하다. 비록 특정 작용 메커니즘에 의해 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 그러한 분자는 표적 세포에 대한 이펙터 기능을 매개할 수 있고, 표적 세포에 대한 면역 체계의 활성화를 촉진할 수 있으며, 세포-표면 항원 및/또는 수용체를 표적 세포에 가교 결합시킬 수 있고, 세포자멸사 또는 음성 성장 조절 신호전달을 증강시킬 수 있거나, 이것들의 조합으로, 표적 세포의 제거 및/또는 표적 세포의 수의 감소를 초래할 수 있다.
본 발명의 분자에 의해, 및 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 암은, 한정하는 것은 아니지만, 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비-소세포 폐암, 혈액암, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 망막 세포 암종, 고환암, 및 자궁암을 포함한다.
특히, 본 발명의 CD19 x CD3 결합 분자, CD19 x CD3 x CD8 결합 분자, CD123 x CD3 결합 분자 및 CD123 x CD3 x CD8 결합 분자는, 한정하는 것은 아니지만 다음을 포함하는 혈액암의 치료에 사용될 수 있다: 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 골수이형성 증후군 (MDS), 급성 B 림프 모세포성 백혈병 (B-ALL), 리히터 증후군 또는 CLL의 리히터 변형을 포함한 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 털세포 백혈병 (HCL), 수포성 형질세포성 수지상 세포 신생물 (BPDCN), 맨틀 세포 림프종 (MCL) 및 작은 림프구성 림프종 (SLL)을 포함한 비호지킨성 림프종 (NHL), 호지킨성 림프종, 전신성 비만세포증, 및 버킷 림프종.
본 발명의 LAG-3-결합 분자에 의해 치료될 수 있는 병원체-관련 질환은 만성 바이러스, 박테리아, 진균 및 기생충 감염을 포함한다. 본 발명의 LAG-3-결합 분자에 의해 치료될 수 있는 만성 감염은 엡스타인 바 바이러스, A형 간염 바이러스 (HAV); B형 간염 바이러스 (HBV); C형 간염 바이러스 (HCV); 헤리페스 바이러스 (예컨대 HSV-1, HSV-2, HHV-6, CMV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 바실루스, 시트로박터, 콜레라, 디프테리아, 엔테로박터, 고노코쿠스, 헬리코박터 파이로리, 클레브시엘라, 레지오넬라, 메닝고코쿠스, 미코박테리아, 슈도모나스, 뉴모노코쿠스, 리케챠 박테리아, 살모넬라, 세라티아, 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 파상풍, 아스퍼길루스　(푸미가투스, 니거, 등), 블라스토미세스 더마티티디스, 칸디다　(알비칸스, 크루세이, 글라브라타, 트로피칼리스, 등),　크립토코쿠스 네오포르만스, 뮤코랄레스 속　(뮤코, 압시디아, 리조푸스),　스포로트릭스 쉔키이, 파라코키디오이데스 브라실리엔시스, 코키디오이데스 이미티스,　히스토플라스마 캅슐라툼, 렙토스피로시스, 보렐리아 부르그도르페리, 기생충 (십이지장충, 조충, 흡충, 편형동물 (예컨대 스키스토소미아), 지아르디아 람비아, 트리키넬라, 디엔타모에바 프라길리스, 트리파노소마 브루세이, 트리파노소마 크루지, 및 레이시마니아 도노바니)를 포함한다.
X. 제약학적 조성물
본 발명은 CD3에 결합할 수 있고 또한 질환 항원 (예컨대, DA x CD3 결합 분자, 이를테면, 예를 들어, DA x CD3 x CD8 결합 분자, DA x CD3 x DA 결합 분자, 등)에 결합할 수 있는 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 발명의 조성물은 제약학적 조성물의 제조에 유용한 벌크 약물 조성물 (예컨대, 순수하지 않거나 멸균되지 않은 조성물) 및 단위 투여 형태의 제조에 사용될 수 있는 제약학적 조성물 (즉, 대상체 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)을 포함한다. 이러한 조성물은 표적 세포 (예컨대, 암세포, 병원체-감염 세포, 등)의 재지시된 사멸을 매개할 수 있게 되도록 CD3에 결합할 수 있고 또한 질환 항원에 결합할 수 있는 분자, 또는 그러한 작용제와 제약학적으로 허용되는 담체의 조합의 예방학적 또는 치료적 유효량을 포함한다. 바람직하게, 발명의 조성물은 본 발명의 결합 분자의 예방학적 또는 치료적 유효량 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 바람직한 측면으로, 이러한 조성물은 실질적으로 정제된다 (즉, 그것의 효과를 제한하거나 바람직하지 못한 부작용을 유발하는 물질이 실질적으로 없다).
이러한 조성물의 다양한 제제가 투여에 사용될 수 있다. 약물학적으로 활성인 작용제(들) 외에, 본 발명의 조성물은 기술분야에 잘 알려져 있고 약물학적으로 효과적인 물질의 투여를 용이하게 하거나 작용 부위로의 전달을 위해 제약학적으로 사용될 수 있는 제제로의 활성 화합물의 가공을 용이하게 하는 상대적으로 비활성인 물질인 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 일관성을 제공하거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제로는, 한정하는 것은 아니지만, 안정화제, 습윤 및 유화제, 오스몰 농도를 다르게 하기 위한 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 향상제를 들 수 있다.
특정 구체예에서, 용어 "제약학적으로 허용되는"은 동물, 보다 구체적으로는 인간에서 사용하기 위해 미국 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 다른 일반적으로 인식된 약전에서 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제 (예컨대, 프로인트 보조제 (완전 및 불완전)), 부형제, 또는 비히클을 나타낸다. 일반적으로, 발명의 조성물의 성분은 단위 투여 형태로, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 사셰트와 같은 밀폐 밀봉 용기에 건조 동결건조된 분말로서 또는 물 유리 농축물로서 별도로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 멸균된 제약 등급 물 또는 식염수를 함유한 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되어야 하는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공될 수 있다.
발명은 또한 본 발명의 결합 분자가 단독으로 또는 그러한 제약학적으로 허용되는 담체로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트를 제공한다. 추가적으로, 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제가 또한 제약 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 발명은 또한 발명의 제약학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)와 선택적으로 관련된 것은 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 주의사항일 수 있고, 이 주의사항은 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다.
본 발명은 상기 방법에서 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 키트는 본 발명의 임의의 결합 분자를 포함할 수 있다. 키트는 추가로 암의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방 및/또는 치료제를, 하나 이상의 용기에 포함할 수 있다.
XI. 투여 방법
본 발명의 조성물은 본 발명의 유효량의 본 발명의 제약학적 조성물을 대상체에게 투여함으로써 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방, 및 개선을 위해 제공될 수 있다. 바람직한 측면으로, 이러한 조성물은 실질적으로 정제된다 (즉, 그것의 효과를 제한하거나 바람직하지 못한 부작용을 유발하는 물질이 실질적으로 없다). 특정 구체예에서, 대상체는 동물, 바람직하게는 비영장류와 같은 포유류 (예컨대, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 등) 또는 영장류 (예컨대, 시노몰구스 원숭이와 같은 원숭이, 인간, 등)이다. 바람직한 구체예에서, 대상체는 인간이다.
발명의 분자 또는 조성물을 투여하는 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 비경구 투여 (예컨대, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외, 및 점막 (예컨대, 비내 및 구강 경로)을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 근육내로, 정맥내로, 또는 피하로 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 대용량 주사에 의해, 상피 또는 점막 (예컨대, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등) 라이닝을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다.
발명은 또한 본 발명의 결합 분자의 조제물이 분자의 양을 표시하는 앰풀 또는 사셰트와 같은 밀폐 밀봉 용기에 포장되는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 이러한 분자는 밀폐 밀봉 용기에 건조 멸균된 동결건조 분말 또는 물 유리 농축물로서 공급되며 대상체에게 투여하기에 적절한 농도로, 예컨대, 물 또는 식염수로 재구성될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 결합 분자는 밀폐 밀봉 용기 중의 건조 멸균 동결건조 분말로서 공급된다.
본 발명의 결합 분자의 동결건조 조제물은 2℃ 내지 8℃에서 그것의 원래 용기에 보관되어야 하고 분자는 재구성된 후 12시간 내에, 바람직하게는 6시간 내에, 5시간 내에, 3시간 내에, 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 대체 구체예에서, 이러한 분자는 분자, 융합 단백질, 또는 컨쥬게이션된 분자의 양 및 농도를 표시하는 밀폐 밀봉 용기에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 이러한 결합 분자는 액체 형태로 제공될 때, 밀폐 밀봉 용기로 공급된다.
장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 또는 개선에 효과적일 발명의 이러한 조제물의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 제제에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 상태의 중증도에 좌우될 것이고, 의사의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 제약학적 조성물의 "유효량"은, 제한 없이, 질환으로부터 유발되는 증상을 감소시키는 것, 감염의 증상 (예컨대, 바이러스 로드, 열, 통증, 패혈증, 등) 또는 암의 증상 (예컨대, 암세포의 증식, 종양 존재, 종양 전이, 등)을 약화시키고, 그로서 질환에 걸린 대상체의 삶의 질을 증가시키는 것, 질환을 치료하기 위해 필요한 다른 약물의 용량을 감소시키는 것, 표적화 및/또는 내부화를 통하는 것과 같이 또 다른 약물의 효과를 증강시키는 것, 질환의 징행을 지연시키는 것, 및/또는 개체의 생존을 연장시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한 유익한 또는 원하는 결과를 이루기에 충분한 양이다. 단독으로 투여된 개별적인 활성 성분에 적용될 때, 용어는 그 성분 단독을 나타낸다. 조합에 적용될 때, 용어는 함께, 연속적으로, 또는 동시에 투여되는 것과 관계없이, 치료 효과를 초래하는 활성 성분의 조합된 양을 나타낸다.
유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 약물, 화합물, 또는 제약학적 조성물의 유효량은: 암세포를 살해 및/또는 증식을 감소, 및/또는 암의 원발성 부위로부터 전이의 발생을 제거, 감소 및/또는 지연; 또는 감염성 병원체의 증식 (또는 효과)을 감소 및 병원체-매개된 질환의 발생을 직접적으로 또는 간접적으로 감소 및/또는 지연시키기 위해 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 약물, 화합물, 또는 제약학적 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물, 또는 제약학적 조성물과 함께 이루어질 수 있거나 이루어지지 않을 수 있다. 그러므로, "유효량"은 하나 이상의 화학요법제를 투여하는 맥락에서 고려될 수 있고, 단일 작용제는 만약 하나 이상의 다른 작용제와 함께 바람직한 결과가 있을 수 있거나 이루어진다면, 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다. 개체가 필요로 하는 것은 달라지지만, 각 구성요소의 유효량의 최적 범위의 결정은 기술분야의 숙련도 내에 있다.
발명에 포함된 결합 분자의 경우, 환자에게 투여된 투여량은 바람직하게 수령 대상체의 체중 (kg)을 토대로 결정된다. 발명에 포함된 결합 분자의 경우, 환자에게 투여된 투여량은 전형적으로 대상체 체중 kg당 약 0.01 μg 내지 약 30 mg 또는 그 이상이다.
본 발명의 결합 분자의 투여의 투여량 및 빈도는 예를 들어, 지질화와 같은 변형에 의한 분자의 흡수 및 조직 침투를 증강시킴으로써 감소 또는 변경될 수 있다.
환자에게 투여되는 발명의 결합 분자의 투여량은 단일 작용제 요법으로서 사용하기 위해 계산될 수 있다. 대안으로, 분자는 다른 치료 조성물과 함께 사용될 수 있고 환자에게 투여된 투여량은 상기 분자가 단일 작용제 요법으로서 사용될 때보다 적다.
발명의 제약학적 조성물은 치료를 필요로 하는 구역에 국소적으로 투여될 수 있다; 이것은 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 국소 주입에 의해, 주사에 의해, 또는 이식편에 의해 이루어질 수 있고, 상기 이식편은 막, 예컨대 시알스틱 막, 또는 섬유를 포함한, 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 물질의 것이다. 바람직하게, 발명의 분자가 투여될 때, 분자가 흡수하지 않는 물질을 사용하기 위해 주의가 기울여져야 한다.
발명의 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery", Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327 참조).
본 발명의 결합 분자의 치료적 또는 예방적 유효량으로의 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있고, 또는 바람직하게, 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상체는 약 1 내지 10주, 바람직하게는 2 내지 8주, 보다 바람직하게는 약 3 내지 7주, 보다 더 바람직하게는 약 4, 5, 또는 6주 동안 발명의 제약학적 조성물로 치료된다. 발명의 제약학적 조성물은 1일 1회 투여될 수 있고, 이러한 투여는 주 1회, 주 2회, 2주마다 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 년 2회 또는 1년에 1회 등으로 이루어질 수 있다. 대안으로, 발명의 제약학적 조성물은 1일 2회 투여될 수 있고 이러한 투여는 주 1회, 주 2회, 2주마다 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 년 2회 또는 1년에 1회 등으로 이루어질 수 있다. 대안으로, 발명의 제약학적 조성물은 1일 3회 투여될 수 있고 이러한 투여는 주 1회, 주 2회, 2주마다 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 2개월마다 1회, 년 2회 또는 1년에 1회 등으로 이루어질 수 있다. 또한 치료에 사용된 분자의 효과적인 투여량은 특정 치료 과정에 걸쳐 증가 또는 감소할 수 있는 것이 인지될 것이다.
XII. 발명의 특정 구체예
발명의 특정 구체예는 구체예 E1-E27을 포함한다:
E1. CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 CD3-결합 도메인 및 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 질환 항원-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 CD3-결합 도메인은:
(I) (A) SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95 및 SEQ ID NO:97로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
(II) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(C) SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105 및 SEQ ID NO:107로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
(III) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(F) SEQ ID NO:109 또는 SEQ ID NO:111로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
(IV) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(E) SEQ ID NO:113 및 SEQ ID NO:115로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인
을 포함한다.
E2. E1의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 CD3-결합 도메인은:
(I) (A) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(B) SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104 및 SEQ ID NO:106으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 또는
(II) (A) SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112; 및 SEQ ID NO:114로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
(B) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인
을 포함하는 것인 DA x CD3 결합 분자.
E3. E1 또는 E2의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 DA x CD3 결합 분자는 이중특이적 항체, 이중특이적 디아바디, 이중특이적 scFv, 이중특이적 TandAb, 또는 3가 결합 분자인 것인 DA x CD3 결합 분자.
E4. E1 내지 E3 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 DA x CD3 결합 분자는 하나 이상의 질환 항원 및/또는 이펙터 세포의 상이한 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 것인 DA x CD3 결합 분자.
E5. E1 내지 E4 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 질환 항원은 암 항원인 것인 DA x CD3 결합 분자.
E6. E1 내지 E5 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 질환 항원은 병원체-관련 항원인 것인 DA x CD3 결합 분자.
E7. E4 내지 E6 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 이펙터 세포의 상기 상이한 세포 표면 분자는 CD2, CD8, CD16, TCR, NKp46, 또는 NKG2D인 것인 DA x CD3 결합 분자.
E8. E5 또는 E7의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 암 항원은 다음의 암 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 DA x CD3 결합 분자: 19.9, 4.2, ADAM-9, AH6, ALCAM, B1, B7-H3, BAGE, 베타-카테닌, 혈액형 ALeb/Ley, 버킷 림프종 항원-38.13, C14, CA125, 카르복시펩티다제 M, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD36, CD40/CD154, CD45, CD56, CD46, CD52, CD56, CD79a/CD79b, CD103, CD123, CD317, CDK4, CEA, CEACAM5/CEACAM6, CO17-1A, CO-43, CO-514, CTA-1, CTLA-4, 사이토케라틴 8, D1.1, D156-22, DR5, E1 시리즈, EGFR, 에프린 수용체, EphA2, Erb, GAGE, GD2/GD3/GM2 강글리오시드, GICA 19-9, gp100, Gp37, gp75, gpA33, HER2/neu, HMFG, 인간 유두종 바이러스-E6/인간 유두종 바이러스-E7, HMW-MAA, I 항원, IL13Rα2, 인테그린 β6, JAM-3, KID3, KID31, KS 1/4 pan-암종 항원, L6,L20, LEA, LUCA-2, M1:22:25:8, M18, M39, MAGE, MART, 메소텔린, MUC-1, MUM-1, Myl, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, 네오당단백질, NS-10, OFA-1, OFA-2, 온코스타틴 M, p15, p97, PEM, PEMA, PIPA, PSA, PSMA, 전립선 산 포스페이트, R24, ROR1, 스핑고지질, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, sTn, T-세포 수용체 유래 펩타이드, T5A7, TAG-72, TL5, TNF-수용체, TNF-γ 수용체, TRA-1-85, 트랜스페린 수용체, 5T4, TSTA, VEGF, VEGF 수용체, VEP8, VEP9, VIM-D5, 및 Y 합텐, Ley.
E9. E8의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 질환 항원은 B7-H3, CEACAM5/CEACAM6, EGRF, EphA2, gpA33, HER2/neu, VEGF, 5T4, IL13Rα2, CD123, CD19, 또는 ROR1인 것인 DA x CD3 결합 분자.
E10. E6 또는 E7의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 병원체-관련 항원은 다음의 병원체-관련 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 DA x CD3 결합 분자: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21.
E11. E1 내지 E10 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 DA x CD3 결합 분자는 서로에게 공유 결합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서:
(A) 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
(i) (1) 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLDA)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및
(2) CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하고,
하위도메인 1A 및 1B는 펩타이드 링커에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1; 및
(ii) 헤테로다이머-촉진 도메인인 도메인 2를 포함하고;
(B) 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
(i) (1) CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및
(2) 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHDA)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하고;
하위도메인 1A 및 1B는 펩타이드 링커에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1; 및
(ii) 헤테로다이머-촉진 도메인인 도메인 2를 포함하며,
여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 상이하고;
(a) 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인은 회합하여 질환 항원-결합 도메인을 형성하며, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 회합하여 CD3-결합 도메인을 형성하거나; 또는
(b) 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인 및 제2폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인은 회합하여 CD3-결합 도메인을 형성하며, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인 및 제2폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 회합하여 질환 항원-결합 도메인을 형성한다.
E12. E11의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서:
(a) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 E-코일 도메인이고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 K-코일 도메인이거나; 또는
(b) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 K-코일 도메인이고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 E-코일 도메인인 것인 DA x CD3 결합 분자.
E13. E11 또는 E12의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 제1 또는 제2 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 도메인 3을 추가적으로 포함하는 것인 DA x CD3 결합 분자.
E14. E13의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 DA x CD3 결합 분자는 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드 사슬을 추가로 포함하는 것인 DA x CD3 결합 분자.
E15. E11 내지 E14 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 DA x CD3 결합 분자는 CD8-결합 도메인을 추가로 포함하는 것인 DA x CD3 결합 분자.
E16. E11 내지 E15 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 DA x CD3 결합 분자는:
(I) (A) SEQ ID NO:179를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:175를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(II) (A) SEQ ID NO:184를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:181을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(III) (A) SEQ ID NO:196을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:186을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(IV) (A) SEQ ID NO:197을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:192를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(V) (A) SEQ ID NO:193을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:194를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
(C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
(VI) (A) SEQ ID NO:179를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:175를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
(C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
(D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
(VII) (A) SEQ ID NO:184를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:181을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
(C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
(D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
(VIII) (A) SEQ ID NO:196을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:186을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
(C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
(D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
(IX) (A) SEQ ID NO:193을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
(B) SEQ ID NO:194를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
(C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
(D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드
를 포함하는 것인 DA x CD3 결합 분자.
E17. E1 내지 E16 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
E18. E1 내지 E16 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자 또는 E17의 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 방법.
E19. E18의 방법으로서, 여기서 상기 질환은 암인 것인 방법.
E20. E18의 방법으로서, 여기서 상기 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비-소세포 폐암, 혈액암, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 망막 세포 암종, 고환암, 및 자궁암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
E21. E18의 방법으로서, 여기서 상기 질환은 병원체-관련 질환인 것인 방법.
E22. E21의 방법으로서, 여기서 상기 병원체-관련 항원은 다음의 병원체-관련 항원: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
E23. 질환의 치료에 사용하기 위한 E1 내지 E16 중 어느 하나의 DA x CD3 결합 분자 또는 E16의 제약학적 조성물.
E24. E23의 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물로서, 여기서 상기 질환은 암인 것인 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
E25. E24의 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물로서, 여기서 상기 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비-소세포 폐암, 혈액암, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 망막 세포 암종, 고환암, 및 자궁암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
E26. E23의 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물로서, 여기서 상기 질환은 병원체-관련 질환인 것인 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
E27. E26의 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물로, 여기서 상기 병원체-관련 항원은 다음의 병원체-관련 항원: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
실시예
이제 발명이 일반적으로 설명되었고, 발명은 다음의 실시예를 참조함으로써 보다 쉽게 이해될 것이며, 실시예는 예시에 의해 제공되며 명시되지 않는 한 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1
CD3 mAb 1 M3 - CD3 mAb 1 M26의 평가
29개의 CDR 위치에서의 CD3 mAb 1 scFv 포화-돌연변이 라이브러리를 구성하였고 대장균 (XL-1 Blue)에서 발현시켰다. 다중-웰 포맷을 사용하여 가용성 scFv를 생성하였다. scFv-함유 상층액을 항-His 표면에 포획하였고 재조합 CD3 (ε/γ 사슬 Fos/Jun 헤테로다이머)에의 결합에 대해 Attana 바이오센서를 사용하여 스크리닝하여 vCD3-결합 도메인을 확인하였다.
확인된 scFv를 포함하는 CD123 x CD3 DART-A-형 디아바디 (DART-A-WT로 표시됨; 아미노산 서열은 상기 제공됨)의 변이체를 생성하였다. 그러므로, vCD3-결합 도메인을 포함하는, DART-A-M1 - DART-A-M26으로 표시된 DART-A-형 디아바디의 패널 (이러한 vCD3-결합 도메인은 각각 "CD3 mAb 1 M1 - CD3 mAb 1 M26"으로 표시됨)을 생성하였다. DART-A-M1 - DART-A-M26의 CD3-결합 동역학을 BIACORE®에 의해 측정하였고 DART-A-WT와 비교하였다. 표 11은 DART-A-WT 및 CD3 mAb 1 M1 - CD3 mAb 1 M26의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DART-A-형 디아바디의 CD3-결합 동역학을, k a 에 의해 순위를 매겨서 요약한다 (R은 DART-A-WT (CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인을 포함함)에 대한 변이체 DART-A-형 디아바디 (vCD3-결합 도메인을 포함함)의 k a , k d , 또는 k D 비율을 나타냄).
CD123 x CD3 DART-A-형 디아바디
CD3 mAb 1 M1 -- CD3 mAb 1 M26의 CD3-결합 동역학
CD3 mAb1
변이체 		치환
(CD3 Mab-1에 대한) 		ka
(M -1 s -1 ) 		R kd
(s -1 ) 		R KD
(M) 		R
M25 G50D/VL 1.54 x 105 0.3 1.92 x 10-2 4.7 1.25 x 10-7 15
M18 A33G/VH 2.87 x 105 0.6 5.88 x 10-2 14 2.05 x 10-7 25
M14 T31D/VH 3.08 x 105 0.6 1.43 x 10-2 3.5 4.66 x 10-8 5.7
M26 K53G/VL 3.19 x 105 0.6 1.74 x 10-2 4.3 5.44 x 10-8 6.7
M13 Y102E/VH 3.21 x 105 0.6 2.20 x 10-2 5.4 6.86 x 10-8 8.4
M16 Y32D/VH 3.47 x 105 0.7 1.04 x 10-1 25 3.01 x 10-7 37
M15 T31E/VH 3.52 x 105 0.7 3.75 x 10-2 9.2 1.07 x 10-7 13
M1 S100dT/VH 4.08 x 105 0.8 6.50 x 10-2 16 1.59 x 10-7 19
M3 G99I/VH 4.49 x 105 0.9 8.30 x 10-3 2 1.85 x 10-8 2.3
M23 L95E/VL 4.59 x 105 0.9 1.24 x 10-2 3 2.69 x 10-8 3.3
CD3 Mab-1 야생형 5.00 x 10 5 1 4.09 x 10 -3 1 8.17 x 10 -9 1
M24 L95Q/VL 5.94 x 105 1.2 8.61 x 10-3 2.1 1.45 x 10-8 1.8
M6 Y100bQ/VH 6.99 x 105 1.4 2.01 x 10-2 4.9 2.88 x 10-8 3.5
M10 F98I/VH 7.17 x 105 1.4 3.10 x 10-2 7.6 4.33 x 10-8 5.3
M19 G96K/F98I/VH 7.53 x 105 1.5 4.11 x 10-2 10 5.46 x 10-8 6.7
M4 Y100bA/VH 7.90 x 105 1.6 2.03 x 10-2 5 2.57 x 10-8 3.1
M17 Y32T/VH 8.37 x 105 1.7 4.78 x 10-2 12 5.72 x 10-8 7
M12 W100eY/VH 8.66 x 105 1.7 1.11 x 10-2 2.7 1.28 x 10-8 1.6
M7 G96D/VH 1.02 x 106 2 2.29 x 10-2 5.6 2.25 x 10-8 2.8
M8 G96E/VH 1.13 x 106 2.3 7.84 x 10-3 1.9 6.91 x 10-9 0.8
M5 Y100bG/VH 1.31 x 106 2.6 2.80 x 10-2 6.8 2.14 x 10-8 2.6
M11 W100eF/VH 1.39 x 106 2.8 2.67 x 10-2 6.5 1.92 x 10-8 2.4
M9 G96K/VH 2.15 x 106 4.3 7.16 x 10-3 1.8 3.33 x 10-9 0.4
M22 G96K/W100eY/VH 2.37 x 106 4.7 1.56 x 10-2 3.8 6.60 x 10-9 0.8
M21 G96K/W100eF/VH 2.45 x 106 4.9 1.03 x 10-2 2.5 4.18 x 10-9 0.5
M2 G96K/S100dT/VH 3.07 x 106 6.1 3.91 x 10-2 9.6 1.27 x 10-8 1.6
M20 G96K/Y100bG/VH 3.87 x 106 7.7 7.32 x 10-2 18 1.89 x 10-8 2.3
DART-A-M1 - DART-A-M26 (vCD3-결합 도메인을 포함함)의 T-세포 재지시된 세포 사멸을 매개하는 능력을 CTL 검정으로 측정하고 DART-A-WT (rCD3-결합 도메인을 포함함)와 비교하였다. 간단히 설명하면, DART-A-형 디아바디를 이펙터 Pan-T-세포 및 MOLM-13 표적 종양 세포와 함께 5:1의 이펙터:표적 세포 비율로 18 및 42시간 동안 인큐베이션하고, EC50을 손상된 세포에 의한 락테이트 탈수소효소 (LDH)의 배지로의 방출을 측정함으로써 (예컨대, LDH 방출을 정량적으로 측정하는 CytoTox 96® 비방사능 세포독성 검정 키트 (Promega), 또는 유사한 것을 사용함으로써) 측정하였다. CD3 mAb 1의 CD3 결합 도메인을 가지는 4420 x CD3 플루오레세인-결합 DART-A-형 디아바디를 음성 대조군으로서 사용하였다. 더불어, DART-A-형 디아바디의 안정성을 DSF를 사용하여 Tm을 측정함으로써 평가하였다. DART-A-WT; DART-A-M1; DART-A-M2; DART-A-M15; DART-A-M17; DART-A-M18; DART-A-M19; 및 DART-A-M20에 대한 대표적인 세포독성 곡선을 도 7A에 제시한다. 표 12는 18-시간 EC50에 의해 순위를 매긴, DART-A-M1 - DART-A-M26의 세포독성 (즉, T-세포 재지시된 사멸 활성)을 요약한다 (R은 DART-A-WT (CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인을 포함함)에 대한 변이체 DART-A-형 디아바디 (vCD3-결합 도메인을 포함함)의 비율을 나타낸다; △Tm은 WT에 비교한 Tm의 증가를 나타낸다 (Tm = 63℃)). 동역학 파라미터와 세포용해 능력의 관계를 도 7B-7D에 도표화한다 (도 7B: 친화성 대비 세포용해 (18 시간 EC50), 도 7C: 회합 속도 대비 세포용해 (EC50). 도 7C: 분해 속도 대비 세포용해 (EC50)). CD3 mAb1 (○), M18 (■), M2 (▲) 및 M1 (▼) 변이체가 표시된다.
항체 CD3 mAb 1 M1 - CD3 mAb 1 M26의 세포독성
CD3
mAb 1
변이체 		치환
(CD3 Mab-1에 대한) 		MOLM-13 (E:T=5:1)
EC 50 (ng/mL) R 최대 % 세포독성 EC 50 (ng/mL) R 최대 % 세포독성 R
△Tm (℃)
18 시간 42 시간
M21 G96K/W100eF/VH 0.026 0.3 36.54 0 0 29.92 -1
M8 G96E/VH 0.069 0.9 38.43 0.005 1.7 29.35 1
M22 G96K/W100eY/VH 0.072 0.9 38.26 0.01 3.5 31.58 -0.5
M9 G96K/VH 0.075 1 38.25 0.001 0.4 30.46 0
CD3 Mab-1 야생형 0.079 1 38.97 0.003 1 29.13 -
M3 G99I/VH 0.108 1.4 39.69 0.006 2.3 28.58 0
M6 Y100bQ/VH 0.162 2.1 41.86 0.011 3.9 29.46 1
M4 Y100bA/VH 0.176 2.2 41.69 0.011 3.9 29.8 1
M11 W100eF/VH 0.223 2.8 48.55 0.016 5.8 32.43 0.5
M5 Y100bG/VH 0.225 2.9 40.75 0.011 3.8 28.41 1
M20 G96K/Y100bG/VH 0.259 3.3 37.48 0.038 13.5 30.89 -0.5
M7 G96D/VH 0.304 3.8 41.38 0.03 10.8 32.54 1
M24 L95Q/VL 0.34 4.3 49.41 0.031 11.1 31.12 0.5
M12 W100eY/VH 0.372 4.7 49.72 0.067 24 31.54 0.5
M23 L95E/VL 0.421 5.3 49.29 0.061 21.6 31.37 -0.5
M10 F98I/VH 0.426 5.4 39.26 0.095 33.7 29.87 0
M26 K53G/VL 0.444 5.6 44.23 0.078 27.9 28.19 0
M14 T31D/VH 0.492 6.2 44.69 0.11 39.3 31.36 1.5
M25 G50D/VL 0.585 7.4 46.56 0.1 35.7 30.41 0
M19 G96K/F98I/VH 0.68 8.6 41.01 0.11 39.1 32.83 -0.5
M13 Y102E/VH 1.223 15.5 45.08 0.203 72.3 31.48 -0.5
M17 Y32T/VH 1.283 16.2 44.23 0.126 44.9 30.69 -0.5
M15 T31E/VH 4.164 52.7 42.74 0.975 347.2 32.05 1.5
M18 A33G/VH 4.687 59.3 41.3 0.91 324 30.58 0.5
M2 G96K/S100dT/VH 8.113 102.7 32.33 0.693 246.9 32.77 -1
M1 S100dT/VH 19.64 248.6 32.32 2.336 831.9 32.37 0
M16 Y32D/VH NA NA NA NA NA NA -0.5
표 11-12에서 나타낸 것과 같이, DART-A-M1 - DART-A-M26 변이체는 다양한 결합 동역학 및 CTL 활성을 나타낸 한편, 그것의 열 안정성을 보유하였다. 이러한 DA x CD3 결합 분자, 및 이것의 vCD3-결합 도메인은 CD3 결합, 재지시된 T-세포 사멸 활성, 및/또는 T-세포 자극 활성을 조절하는 데 유용하다.
실시예 2
대표적인 변이체의 CTL 활성 및 사이토카인 방출
변이체 CD3 mAb 1 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 대표적인 세트의 DART-A-형 디아바디의 세포독성 (CTL) 활성 및 사이토카인 방출 프로파일을 DART-A-WT; DART-A-M2; DART-A-M7; DART-A-M13; 및 DART-A-M15를 5:1의 이펙터:표적 세포 비율의 Pan-T-세포 이펙터 세포 및 MV-4-11 백혈병 표적 종양 세포의 존재 하에 24시간 동안 인큐베이션함으로써 평가하였다. 백분율 세포독성 (즉, 세포 사멸) 및/또는 EC50을 손상된 세포에 의한 락테이트 탈수소효소 (LDH)의 배지로의 방출을 측정함으로써 (예컨대, LDH 방출을 정량적으로 측정하는 CytoTox 96® 비방사능 세포독성 검정 키트 (Promega), 또는 유사한 것을 사용함으로써) 측정하고 도 8A에 도표화한다. CTL 중에 상층액으로 방출된 사이토카인을 (예컨대, 효소-결합 면역스팟 (ELISPOT) 검정 또는 복합 사이토카인 검정을 사용하여) 측정하였다. 사이토카인 방출을 도 8B-8E에 도표화한다 (도 8B: INF-γ, 도 8C: TNF-α, 도 8D: IL-6, 및 도 8E: IL-2). 세포독성 및 사이토카인 방출에 대한 EC50 값을 표 13으로 제공한다. CD3 mAb 1의 CD3 결합 도메인을 가지는 4420 x CD3 플루오레세인-결합 DART-A-형 디아바디를 음성 대조군으로 사용하였다 (NegCtrl).
DART-A-형 EC 50 CTL EC 50 INF-γ EC 50 TNFα EC 50 IL-6 EC50-IL2
WT 0.029 0.11 0.76 0.13 0.85
M2 0.92 1.7 4.7 10 27
M7 0.052 0.98 6.6 1.1 7.0
M13 0.12 0.83 0.12 1.3 7.5
M15 0.39 3.5 18 7.5 30
이들 연구로부터의 결과는 변경된 친화성을 가지는 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자가 rCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비교하여 세포용해 활성을 보유하며 하나 이상의 감소된 사이토카인 반응 (최대 반응 및/또는 EC50)을 나타내는 것을 보여준다.
실시예 3
DART-B-형 디아바디의 생성
CD3 mAb 1 M18의 도메인을 가지는 디아바디를 추후 특성화 및 CD3 mAb 1, CD3 mAb 1 M1 및 CD3 mAb 1 M2의 VH 도메인을 가지는 디아바디와의 비교를 위해 선택하였다. 그러므로, 암 항원 CD123, 5T4, 또는 CD19에 결합하는 질환 항원 (DA) 결합 도메인을 포함하는 표 9의 DART-B-형 디아바디를 제조하였다. 각 사슬의 아미노산 서열은 본원에서 상세하게 제공된다 (제1 -제10 예시적인 DART-B-형 디아바디, 상기 참조). 간단히 설명하면, 디아바디를 CHO 세포에서 발현시키고 (일시적 또는 안정적으로 트랜스펙션됨) 단백질 A 친화성 수지 (예컨대, MabSelect) 상에서 정제한 후 HPLC 크기 배제 크로마토그래피를 하였다.
실시예 4
질환 항원에 결합하는 DART-B-형 디아바디의 능력
MOLM-13 백혈병 (CD123) 또는 A-498 신장 암종 (5T4) 표적 암세포 상에서 이러한 디아바디의 그것의 각각의 질환 항원 (즉, CD123 또는 5T4)에 결합하는 능력을 FACS를 사용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 세포를 미세역가 플레이트에서 (10% 인간 AB 혈청을 함유하는 FACS 완충액에서) 디아바디 분자와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 스트렙트아비딘-피코에리트린과 혼합된 디아바디의 E-코일/K-코일 (EK) 헤테로다이머-촉진 도메인을 인식하는 비오틴-컨쥬게이션된 마우스 항-EK-코일 항체와 함께 인큐베이션하였다. 이러한 검정의 대표적인 데이터를 도 9A-9B에 나타낸다. 데이터는 대표적인 디아바디가 그것들의 각각의 질환 항원에 결합할 수 있었음을 보여준다.
실시예 5
CD4 + 및 CD8 + T-세포에 결합하는 DART-B-형 디아바디의 능력
CD123-결합 디아바디: CD123-WT, CD123-M1, CD123-M2 및 CD123-M18의 CD4+ 및 CD8+ T-세포에 결합하는 능력을 또한 FACS를 사용하여 평가하였다. CD3 mAb 1의 CD3 결합 도메인을 가지는 4420 x CD3 플루오레세인-결합 DART-A-형 디아바디를 CD3 결합에 대한 대조군으로서 사용하였다 ("4420-CD3"). 간단히 설명하면, CD4+ 및 CD8+ T-세포를 미세역가 플레이트에서 (10% 인간 AB 혈청을 함유하는 FACS 완충액에서) 디아바디 분자와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 표지된 항-인간 Fc 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그런 후 세포를 세척하고 FACS 완충액으로 재현탁하고, 유동 세포분석에 의해 분석하였다. 이러한 검정의 대표적인 데이터를 도 10A (CD8+ T-세포에 대한 결합) 및 도 10B (CD4+ T-세포에 대한 결합)에 나타낸다. T-CD123-M1 및 T-CD123-M18은 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 발현하는 CD3에 대한 감소된 결합을 나타낸다.
CD123-결합 디아바디: CD123-WT, CD123-M1, CD123-M2 및 CD123-M18의 인간 CD3 및 CD123에 결합하는 능력을 또한 BIAcore®를 사용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 62.5-1000 nM의 농도의 디아바디를 표면 (표준화됨; 1:1 결합 피트)에 고정시켜 놓은 가용성 인간 CD3 위를 통과시켰다. 약한 CD3 상호작용에 대한 파라미터의 평가를 허용하기 위해 분석물의 고농도 (62.5-1000 nM)를 사용하였지만, 고농도의 분석물은 비특이적 결합에 기여하면서 회합될 수 있다. 별도의 연구로 62.5-100 nM 농도의 디아바디를 His-태그된 가용성 CD123 위를 통과시켜서 항-펜타His 표면 (표준화됨; 1:1 결합 피트)에 포획시켰다. 표 14는 이들 연구로부터 계산된 k a , k d 및 KD를 나타낸다.
CD3 변이체 인간 CD3에 대한 결합 인간 CD123에 대한 결합
k a
(x10 4 )		 k d
(x10 -3 )		 KD
(nM) 		k a
(x10 5 )		 k d
(x10 -4 )		 KD
(nM)
CD123-WT 9.1 6.1 67 2.7 5.3 2.0
CD123-M1 9.5 80 842 3.2 3.9 1.2
CD123-M2 3.8 41 108 4.2 4.5 1.1
CD123-M18 8.6 51 593 2.4 5.4 2.3
5T4-결합 디아바디: 5T4-WT, 5T4-M1, 5T4-M2 및 5T4-M18의 CD3에 결합하는 능력을 또한, 상기에서 기술된 것과 같이, BIAcore®를 사용하여 평가하였다. 표 15A는 계산된 k a , k d 및 KD를 나타낸다.
Figure pct00033
추가적인 연구로 CD123-결합 디아바디: CD123-WT, CD123-M13, CD123-M17 및 CD123-M19의 인간 CD3 및 시노몰구스 CD3에 결합하는 능력을 또한 BIAcore®를 사용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 6.25-400 nM 농도의 디아바디를 고정된 인간 CD3 또는 cyno CD3 (1:1 랑뮈어 결합 피트) 위로 통과시켰다. 표 15B는 계산된 k a , k d 및 KD를 나타낸다.
Figure pct00034
실시예 6
예시의 DART-B-형 디아바디의 재지시된 세포 사멸을 매개하는 능력
예시의 DART-B-형 디아바디를 재지시된 세포 사멸을 매개하는 그것들의 능력에 대해 평가하였다. 표시된 경우, HIV-WT 또는 HIV-M18 (상기 기술됨)을, 그것들이 암 항원에 결합하지 않기 때문에 여기에서 음성 대조군으로서 사용한다. HIV-WT 및 HIV-M18 디아바디가 그것들의 세포 표면 (예컨대, HIV 감염 세포)에서 A32 항체 (HIV env)에 의해 결합된 에피토프를 발현하는 세포에 결합할 것이고 (예를 들어: WO 2014/1599401 및 WO 2016/054101 참조), 이러한 세포의 재지시된 세포 사멸을 매개하는 것이 인식될 것이다.
예시의 CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구의 결과를 도 11A-11Q, 도 12A-12E, 및 도 26A-26E에 나타낸다. 예시의 5T4 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구의 결과를 도 13A-13Q에 나타낸다. 예시의 CD19 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구의 결과를 도 14A-14J.에 나타낸다. 이들 검정을 본질적으로 상기에서 기술한 것과 같이 표시된 이펙터 및 표적 세포, 이펙터:표적 세포 비율, 및 하기에서 기술된 인큐베이션 시간을 사용하여 수행하였다 (또한 도 11A, 12A, 13A 및 14A 참조). 표시되는 경우, IFN-γ, TNF-α, IL-6, 및 IL-2 사이토카인의 방출을 표준 상업적 시약을 사용하여 CTL 검정이 끝날 때 측정하였다.
도 11A-11Q는 Pan-T 이펙터 세포 및 MOLM-13 급성 단세포성 백혈병 (AML) 표적 세포 (E:T= 5:1, 24 h)를 사용하는 CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐) CD123-WT, CD123-M2 및 CD123-M18에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구의 결과를 보여준다. 퍼센트 세포독성을 도 11A에 도표화한다. 사이토카인 반응 및 세포독성을 도 11B-11Q에 도표화한다 (도 11B-11E: IFN-감마; 도 11F-11I: TNF-알파; 도 11J-11M: IL-6; 도 11N-11Q: IL-2). 도 11B, 11F, 11J 및 11N: CD123-WT; 도 11C, 11G, 11K 및 11O: CD123-M2; 도 11D, 11H, 11L 및 11P: CD123-M18; 도 11E, 11I, 11M 및 11Q: HIV-WT (음성 대조군). 유사한 세포독성을 또 다른 AML 세포주, MV-4-11에 대해 관찰하였다.
도 11A는 상이한 CD3 mAb 1 변이체를 포함하는 CD123 x CD3 결합 분자가 특히 EC50을 비교함으로써 측정되는 것과 같이 세포독성을 매개하는 현저하게 상이한 능력을 나타냈지만, 유사한 최대 세포독성에 도달했음을 보여준다. 더불어, 이들 분자는 사이토카인 반응을 매개하는 상이한 능력을 나타냈다. 예를 들어, 도 11B-11Q에서 나타난 것과 같이, 비록 CD123-M18이 CD123-WT에 의해 나타난 것과 유사한 최대 세포독성 수준을 나타내긴 했지만, CD123-M18로의 처리에 의해 방출된 사이토카인 IFN-α, TNF-α 및 IL-6의 수준은 CD123-WT로의 처리에 의해 방출된 수준의 대략 50%였고, CD123-M18로 관찰된 IL-2의 수준은 CD123-WT로 관찰된 IL-2 수준보다 상당히 더 적었다. 그러므로, CD123-M18은 CD123-WT의 것과 비슷한 치료값을 제공할 수 있지만, 부작용은 CD123-WT보다 더 적은 것으로 나타났다.
도 12A-12E는 PBMC 이펙터 세포 및 MOLM-13 AML 표적 세포를 사용하여 CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐)에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구의 결과를 보여준다. 퍼센트 세포독성을 도 12A에 도표화한다 (E:T= 15:1, 24 h). 사이토카인 반응 (복합 사이토카인 검정으로 측정함)을 도 12B-12E에 도표화한다 (도 12B: IFN-감마; 도 12C: TNF-알파; 도 12D: IL-6; 도 12E: IL-2).
결과는 다시 CD123-WT 및 CD123-M18이 유사한 수준의 최대 세포독성을 나타내지만, CD123-M18은 현저하게 감소된 사이토카인 반응을 나타냈다. 추가적으로, IFN-γ, TNF-α 또는 IL-6의 방출에 대한 CD123-M18의 EC50 값은 실질적으로 CD123-WT의 것보다 더 크고, 이것은 CD123-M18로의 처리가 CD123-WT로의 처리에 비교하여 상당히 더 적은 사이토카인 방출을 초래하였다.
도 26A-26D 및 도 27A-27D는 Pan-T 이펙터 세포 및 MOLM-13 급성 단세포성 백혈병 (AML) 표적 세포 (E:T= 5:1, 48 내지 96시간)를 사용하여 CD123 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐) CD123-WT, CD123-M1, CD123-M13, CD123-M17, CD123-M18 및 CD123-M19에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 결과를 보여준다. 하기에서 주지된 것과 같이, DART-A-WT를 일부 연구에서 비교기로서 포함시켰다. 도 26A-26D는 48시간 동안 수행한 대표적인 연구 결과를 보여준다. 도 26A에 세포독성을, 방출된 %LDH의 함수로서 도표화한다. 사이토카인 반응 및 세포독성을 도 26B-26E에 도표화한다 (도 26B: IFN-감마; 도 26C: TNF-알파; 도 26D: IL-6; 도 26E: IL-2). 도 27A-27D는 48 및 96시간 동안 수행한, DART-A-WT를 포함한 4 내지 7개의 이러한 연구로부터의 결과를 요약한다. 도 27A-27C는 4개의 이러한 연구로부터의 48 및 96시간째의 세포독성 (CTL) 활성의 비교 도표를 제공한다 (도 27A: CTL 활성 EC50 값, pM; 도 27B: CTL 활성, CD123-WT의 EC50 값의 배수, 도 27C: CTL 활성 Emax, CD123-WT의 퍼센트). 도 27D는 사이토카인 IL-2에 대한 CTL 활성에 대한 ㅊ치료 지수를 도표화한다.
도 26A는 상이한 CD3 mAb 1 변이체를 포함하는 CD123 x CD3 결합 분자가 CD123-M13, CD123-M17, CD123-M18 및 CD123-M19로 현저하게 상이한 세포독성 곡선을 나타낸 한편, 이것들은 유사한 최대 세포독성에 도달할 수 있는 것을 보여준다. 상기에서 나타낸 것과 같이, 변이체의 각각은 더 낮은 사이토카인 반응을 매개하였다. 예를 들어, 도 26B-26D에서 나타난 것과 같이, CD123-M13, CD123-M17, CD123-M18 및 CD123-M19가 CD123-WT에 의해 나타낸 것과 유사한 최대 세포독성 수준을 나타냈지만, 방출된 사이토카인 IFN-α, TNF-α, IL-6 및 IL-2의 수준은 CD123-WT 처리로 관찰된 수준보다 상당히 더 적었다. 그러므로, CD3 mAb 1 변이체 M13, M17, M18 및 M19를 포함하는 디아바디 분자의 각각은 야생형 CD3 mAb 1을 포함하는 디아바디 구성물의 그것과 비슷한 치료 값을 제공할 수 있지만, 부작용은 덜 나타나는 것으로 나타났다.
도 27A-27C에서 나타난 결과는 CD123-M13, CD123-M17, CD123-M18 및 CD123-M19는 현저한 상이한 세포독성 EC50 값을 나타내지만 CD123-WT 및 DART-A-WT에 비슷한 최대 CTL 활성에 도달한 것을 추가로 입증한다. IL-2를 대표적인 사이토카인으로서 사용하여, 치료 지수 (TI)를 다음과 같이 측정하였다:
TI = Emax (CTL) : Emax (사이토카인)
CD123-WT에 대한 값으로 표준화된 계산된 TI 값을 도 27D에 도표화하고, 이것은 CD3 mAb 1 변이체 M13, M17, M18 및 M19를 포함하는 DA x CD3 결합 분자가 야생형 CD3 mAb 1을 포함하는 것을 능가하는 향상된 TI를 나타내는 것을 추가로 입증한다.
도 13A-13Q는 Pan-T 이펙터 세포 및 A498 신장 세포 암종 표적 세포 (E:T= 5:1, 24 h)를 사용하여, 5T4 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐) 5T4-WT, 5T4-M1, 5T4-M2, 및 5T4-M18에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구의 결과를 보여준다. 사이토카인 반응 및 세포독성을 도 13B-13Q에 도표화한다 (도 13B-13E: IFN-감마; 도 13F-13I: TNF-알파; 도 13J-13M: IL-6; 도 13N-13Q: IL-2). 도 13B, 13F, 13J 및 13N: 5T4-WT; 도 13C, 13G, 13K 및 13O: 5T4-M2; 도 13D, 13H, 13L 및 13P: 5T4-M18; 도 13E, 13I, 13M 및 13Q: HIV-WT (음성 대조군). 세포독성을 또한 JIMT-1 유방 암종 세포에 대해 관찰하였다. 이들 결과는 5T4-WT 및 5T4-M18이 유사한 수준의 최대 세포독성을 나타내지만, 5T4-M18로의 현저하게 상이한 사이토카인 반응은, 5T4-WT와 비교하여 상당히 감소된 수준의 사이토카인 방출을 나타낸다.
도 14A-14J는 Pan-T, 또는 PBMC 이펙터 세포 및 Raji 림프모세포양 표적 세포 (E:T= PBMC의 경우 30:1 및 Pan-T-세포의 경우 10:1, 24-48 h)를 사용하여, CD19 x CD3 DART B-형 디아바디 구성물 (Fc 도메인을 가짐), CD19-WT, 및 CD19.1-M18에 의해 매개된 재지시된 세포 사멸의 대표적인 연구의 결과를 보여준다. PBMC를 사용하는 48시간 째의 사이토카인 반응을 도 14B-14E (PBMC) 및 도 14G-14J (Pan T-세포)에 도표화한다 (도 14B 및 14G: IFN-감마; 도 14C 및 14H: TNF-알파; 도 14D 및 14I: IL-6; 도 14E 및 14J: IL-2; HIV-M18 (음성 대조군)). CD19.1-M18은 Daudi 표적 세포에 대해 유사한 세포독성 및 감소된 사이토카인 방출을 나타냈다. 이들 결과는 CD19-WT 및 CD19.1-M18이 유사한 수준의 최대 세포독성을 나타내지만, CD19.1-M18로의 현저하게 상이한 사이토카인 반응은 CD19-WT와 비교하여 상당히 감소된 수준의 사이토카인 방출을 나타낸다.
상기 연구의 결과는 CD3 mAb 1 M18 변이체를 포함하는 구성물이 CTL 검정에서 M1 및 M2 변이체를 포함하는 것들보다 더 높은 세포독성 (CTL) 활성을 나타냈음을 확인해준다. CTL 연구는 또한 M18 변이체를 포함하는 구성물이 WT와 비교하여 더 낮은 사이토카인 반응을 나타냈고, 활성이 더 적은 M2 변이체에 의해 나타난 것과 유사하거나 단지 약간 더 높은 뿐인 것을 나타낸다. 그러므로, M18 변이체는 사이토카인 방출 대비 CTL 활성에 대한 더 큰 창을 가지는 것으로 나타난다.
실시예 7
예시의 DART-B-형 디아바디의 T-세포 활성화를 매개하는 능력
T-세포 활성화를 매개하는 능력을, CD4+ 및 CD8+ T-세포 집단에서, T-세포 활성화의 마커인 CD25 및 CD69의 발현에 영향을 미치는 디아바디의 능력을 평가함으로써 측정하였다. T-세포 집단을 본질적으로 상기에서 기술한 것과 같이 수행한 CTL 검정으로부터 얻었다. 표시된 경우, CD4+ 및 CD8+ T 림프구 집단을 CTL 검정이 끝날 때 유동 세포분석에 의해 활성화 마커 CD69 및 CD25의 상향 조절에 대해 평가하였다.
CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디 구성물에 대한 대표적인 데이터를 도 15A-15E에 나타낸다. 세포독성을 도 15A에 도표화한다. CD25를 측정함으로써 결정한 CD4+ T-세포의 활성화를 도 15B에 도표화한다. CD69를 측정함으로써 결정한 CD4+ T-세포의 활성화를 도 15C에 도표화한다. CD25를 측정함으로써 결정한 CD8+ T-세포의 활성화를 도 15D에 도표화한다. CD69를 측정함으로써 결정한 CD8+ T-세포의 활성화를 도 15E에 도표화한다.
5T4 x CD3 DART-B-형 디아바디 구성물에 대한 대표적인 데이터를 도 16A-16E에 나타낸다. 세포독성을 도 16A에 도표화한다. CD25를 측정함으로써 결정한 CD4+ T-세포의 활성화를 도 16B에 도표화한다. CD69를 측정함으로써 결정한 CD4+ T-세포의 활성화를 도 16C에 도표화한다. CD25를 측정함으로써 결정한 CD8+ T-세포의 활성화를 도 16D에 도표화한다. CD69를 측정함으로써 결정한 CD8+ T-세포의 활성화를 도 16E에 도표화한다.
이들 연구 결과는 CD3-M18 변이체를 포함하는 구성물이 M1 및 M2 변이체를 포함하는 구성물에 비해 향상된 T-세포 활성화 활성을 나타냈음을 보여준다.
실시예 8
쥐과 모델에서 예시의 DART-B-형 디아바디의 생체내 활성
CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디 CD123-WT 및 CD123-M18의 생체내 활성을 공동-혼합 KG1A 세포 AML 모델 (E:T = 1:5)에서 평가하였다. 간단히 설명하면, NOD/SCID 마우스 (그룹당 6마리)를 활성화된 인간 CD4+ 또는 CD8+ T-세포 (E:T = 1:5)와 공동 혼합된 KG1A (AML) 세포로 제0일에 주사하였다. 비히클 대조군, CD123-WT (50 μg/kg), 또는 CD123-M18 (5 μg/kg 또는 50 μg/kg)을 계속해서 투여하였다. 종양 부피를 연구 과정 동안 모니터링하였다.
이 연구의 결과를 도 17A (CD4+ T-세포) 및 도 17B (CD8+ T-세포)에 도표화한다. 결과는 M18 변이체를 포함하는 구성물이 WT CD3 결합 도메인을 포함하는 구성물의 그것과 비슷한 항-종양 활성을 나타냈음을 보여준다.
CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디의 생체내 활성을 평가하기 위한 추가의 연구를, 5 x 106 KG1A (AML) 세포를 MHCI-/- 마우스 (그룹당 5마리의 암컷)에 제0일에 피하로 (SC) 주사한 재구성된 종양 모델을 사용하여 수행하였다. 제9일에 1 x 107 PBMC 세포를 복강내 (IP) 주사하였다. 비히클 대조군, CD123-WT, CD123-M2 또는 CD123-M18 (각각 0.5, 5, 50, 또는 500 μg/kg)을 제15일에 시작하여 주 2회 (2QW) 정맥내로 (IV) 투여하였다. 종양 부피를 연구 과정 동안 모니터링하였다.
이 연구의 결과를 도 18A-18D에 제동한다. 결과는 CD123-M2가 이 모델에서 활성을 나타내지 않았음을 보여준다 (도 18B). 대조적으로, CD123-M18 (도 18C)은 특히 50 μg/kg 및 500 μg/kg 용량 (도 18D)에서 CD123-WT의 그것 (도 18A)과 비슷한 항-종양 활성을 나타냈다.
CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디의 생체내 활성을 평가하기 위한 또 다른 연구를 5 x 106 MV4-11 (백혈병) 세포를 SC로 주사하고 1 x 107 PBMC 세포를 안와 뒤쪽으로 (RO) MHCI-/- 마우스 (그룹당 6마리 수컷)에 제0일에 주사하는 PBMC 이식 모델을 사용하여 수행하였다. 비히클 대조군, CD123-WT (0.5, 5, 50, 또는 500 μg/kg), CD123-M18 또는 CD123-M2 (각각 5, 50, 500 또는 1000 μg/kg)를 제14일에 시작하여 정맥내로 (IV) 주 2회 (2QW) 투여하였다. 종양 부피를 연구 과정 동안 모니터링하였다.
이 연구의 결과를 도 19A-19D에 제공한다. 결과는 CD123-WT가 0.5 μg/kg 및 그 이상에서 항-종양 활성을 나타냈음을 보여준다 (도 19A). CD123-M18은 50 μg/kg 및 그 이상에서 항-종양 활성을 나타냈다 (도 19B). 대조적으로, CD123-M2는 1000 μg/kg에서만 항-종양 활성을 나타냈다 (도 19C). 도 19D에서 나타낸 것과 같이, CD123-M18 항-종양 활성은 500 μg/kg에서 CD123-WT의 그것과 비슷한 한편, CD123-M2는 이 농도에서 항-종양 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다.
5T4 x CD3 DART-B-형 디아바디, 5T4-WT, 5T4-M1 및 5T4-M18의 생체내 활성을 5 x 106 SKOV3 (난소 암종) 세포를 SC로 주사하고 1 x 107 PBMC 세포를 RO로 MHCI-/- 마우스 (그룹당 8마리 암컷)에 제0일에 주사하는 PBMC 이식 모델에서 평가하였다. 비히클 대조군, 5T4-WT (10, 50, 100, 또는 500 μg/kg), 5T4-M18 (10, 50, 100, 또는 500 μg/kg), 또는 5T4-M2 (500 μg/kg)를 제7일에 시작하여 정맥내로 (IV) 주 2회 (2QW) 투여하였다. 종양 부피를 연구 과정 동안 모니터링하였다.
이 연구의 결과를 도 20A-20B에 제공한다. 결과는 5T4-WT가 테스트한 모든 용량에서 강력한 항-종양 활성을 나타냈음을 보여준다 (도 20A). 5T4-M18은 500 μg/kg에서 5T4-WT와 비슷한 용량 의존성 항-종양 활성을 나타낸 한편, 5T4-M2는 500 μg/kg에서 상당히 더 낮은 활성을 나타냈다 (도 20B).
CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디에 의해 유도된 생체내 사이토카인 방출 프로파일을 PBMC 공동 혼합 모델에서 조사하였다. 간단히 설명하면, 5 x 106 KG1A (AML) 및 1 x 107 PBMC 세포를 혼합하고 밤새 인큐베이션한 후, 다음날 혼합된 세포를 SC로 NSG 마우스 (그룹당 6마리 수컷)에 주사하고 비히클 대조군, CD123-WT, CD123-M18 또는 CD123-M2 (각각 50, 또는 500 μg/kg)의 단일 용량을 정맥내로 (IV) 투여하였다. 투여 후 6시간 후에 혈청 사이토카인 수준을 평가하였다. 사이토카인 방출 프로파일을 도 20A-20D에 도표화한다 (도 21A: IFN-γ; 도 21B: TNF-α; 도 21C: IL-6; 및 도 21D: IL-2). 이들 연구의 결과는 CD3 mAb 1 M2, 및 CD3 mAb 1 M18의 변이체 VL 및 VH 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자로의 처리가 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 나타내는 것을 보여준다.
CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디의 생체내 활성을 평가하기 위한 2개의 추가의 연구를 PBMC 재구성된 (제0일에 8 x 106 PBMC가 안와 뒤쪽으로 주사된) NSG/MHCI-/- 마우스 (마우스당 7-8 마우스)의 피하에 (SC) 제7일에 5 x 106 KG1A (AML) 세포로 주사하는 재구성된 종양 모델을 사용하여 수행하였다. 한 연구에서, CD123-WT (0.5 mg/kg), CD123-M18 및 CD123-M13 (0.005, 0.05, 0.5 및 1 mg/kg) 또는 비히클을 제28일에 시작하여 정맥내로 (IV) 주 2회 (2QW) 투여하였다. 다른 연구에서 CD123-WT (0.05 mg/kg), CD123-M18 및 CD123-M17 (0.005, 0.05, 0.5 및 1 mg/kg) 또는 비히클을 제28일에 시작하여 정맥내로 (IV) 주 2회 (2QW) 투여하였다. 종양 부피를 연구 과정 동안 모니터링하였다.
이들 연구의 결과를 도 28A-28B (CD123-WT, CD123-M18 및 CD123-M13으로의 처리) 및 도 29A-29B (CD123-WT, CD123-M18 및 CD123-M17로의 처리)에 제공한다. 결과는 CD123-M18 항-종양 활성이 0.5 mg/kg 및 그 이상의 용량에서 CD123-WT의 그것과 유사하고 (도 28A 및 29A) CD123-M13 및 CD123-M17이 CD123-M18에 대한 것보다 10배 더 낮은 용량인 바로 0.05 mg/kg에서 시작하여, CD123-WT의 그것과 유사한 항-종양 활성을 나타낸 것을 보여준다 (도 28B 및 29B).
CD123 x CD3 DART-B-형 디아바디 CD123-WT, CD123-M13, CD123-M17 및 CD123-M18에 의해 유도된 생체내 사이토카인 방출 프로파일을 PBMC 공동 혼합 모델에서 조사하였다. 간단히 설명하면, 5 x 106 KG1A (AML) 및 1 x 107 PBMC 세포를 혼합하고 밤새 인큐베이션하고, 다음날 혼합된 세포를 SG로 NSG 마우스 (그룹당 8마리)에 주사하고 단일 용량의 CD123-WT (0.5 mg/kg), CD123-M13, CD123-M17 및 CD123-M18 (0.05, 0.5 및 1 mg/kg), 또는 비히클을 정맥내로 (IV) 투여하였다. 투여 후 6시간 후에 혈청 사이토카인 수준을 평가하였다. 한 연구에서 동물을 CD123-WT, CD123-M18 및 CD123-M13으로 처리하고,별도의 연구에서, 동물을 CD123-WT, CD123-M18 및 CD123-M17로 처리하였다. IL-2 사이토카인 방출 프로파일을 도 30A-30B에 도표화하고 (도 30A: CD123-WT, CD123-M18 및 CD123-M13); 도 30B: CD123-WT, CD123-M18 및 CD123-M17), 변이체 CD3 mAb 1 VL 및 VH 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자로의 처리가 야생형 VL 및 VH 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비교하여 감소된 수준의 사이토카인 방출을 초래한 것을 보여준다.
이들 동물 연구의 결과는 CD3 mAb 1의 변이체 VL 및 VH 도메인, 특히 CD3 mAb 1 M2, CD3 mAb 1 M13, CD3 mAb M17, 및 CD3 mAb 1 M18의 VL 및 VH 도메인 (즉, vCD3-결합 도메인)을 포함하는 DA x CD3 결합 분자가 CD3 mAb 1의 VL 및 VH 도메인 (즉, rCD3-결합 도메인)을 포함하는 DA x CD3 결합 분자에 비교하여 감소된 수준의 사이토카인 방출을 초래한 것을 보여준다. 특히, 이들 연구의 결과는 CD3 mAb 1 M13, CD3 mAb M17, 및 CD3 mAb 1 M18의 변이체 VL 및 VH 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자가 생체내에서 항-종양 활성을 보유하면서 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 나타내는 것을 입증한다.
실시예 9
3가-형 분자의 생성
CD3 mAb 1, CD3 mAb 1 M1, CD3 mAb 1 M2, 또는 CD3 mAb 1 M18의 VH 및 VL 도메인을 사용하여 암 항원 CD123에 결합하는 질환 항원 (DA) 결합 도메인 및 이펙터 세포 항원 CD8에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 3가-형 분자 ("DA x CD3 x CD8 3가-형 분자")를 생성하였다. 표 10은 각각의 폴리펩타이스 사슬에 대한 CD3 결합 도메인 및 SEQ ID NO를 요약한다. 각 사슬의 아미노산 서열을 기에서 상세하게 제공한다 (상기 제1 - 제4 예시적인 3가-형 분자 참조).
실시예 10
DA x CD3 x CD8 3가-형 분자의 특성확인
MOLM-13 세포 상에 발현된 CD123에 결합하는 T-CD123-WT, T-CD123-M1, T-CD123-M2 및 T-CD123-M18의 능력을 본질적으로 상기 기술한 것과 같이 평가하였다. 더불어, 이들 분자의 CD4+ T-세포 및 CD8+ T-세포에 결합하는 능력을 본질적으로 상기 기술한 것과 같이 평가하였다. DART-B-형 디아바디 CD123-WT를 비교를 위해 이들 연구에 포함시켰다. 이들 연구로부터의 대표적인 데이터를 도 22A (MOLM-13 세포에 대한 결합), 도 22B (CD4+ T-세포에 대한 결합) 및 도 22C (CD8+ T-세포에 대한 결합)에 제공한다. 테스트한 분자는 모두 CD123 발현 MOLM-13 세포 및 CD8 발현 CD8+ T-세포에 대해 비슷한 결합을 나타낸다. T-CD123-M1 및 T-CD123-M18은 MFI (geo 평균)에 의해 측정되는 바 CD3 발현 CD4+ T-세포에 대해 상당히 감소된 결합을 나타낸다. CD8+ T-세포에 대한 결합은 3가-형 분자에 존재하는 CD3- 및 CD8-결합 도메인 둘 다에 의해 매개된다.
T-CD123-WT, T-CD123-M1, T-CD123-M2 및 T-CD123-M18의 재지시된 세포 사멸을 매개하는 능력을 평가하였다. 간단히 설명하면, 3가-형 분자를 1:1의 이펙터:표적 세포 비율에서 Pan-T-세포 또는 정제된 CD4+ 또는 CD8+ T-세포 이펙터 세포 및 MOLM-13 표적 종양 세포의 존재 하에 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포독성을 손상된 세포에 의한 락테이트 탈수소효소 (LDH)의 배지로의 방출을 측정함으로써 (예컨대, LDH 방출을 정량적으로 측정하는 ytoTox 96® 비방사능 세포독성 검정 키트 (Promega), 또는 유사한 것을 사용하여) 측정하였다. 사이토카인 반응을 Pan-T-세포 샘플에서 조사하였다. DART-B-형 디아바디 CD123-WT를 비교를 위해 이들 연구에 포함시켰다. 퍼센트 세포독성을 도 23A-23C에 도표화한다 (도 23A: Pan-T-세포; 도 23B: CD4+ T-세포; 및 도 23C: CD8+ T-세포). 사이토카인 반응을 도 23D-23G에 도표화한다 (도 23D: IFN-감마; 도 23E: TNF-알파; 도 23F: IL-6; 도 23G: IL-2).
실시예 11
독물학 연구
대표적인 CD123 x CD3 결합 분자의 안전성 및 사이토카인 방출 프로파일을 시노몰구스 원숭이에서 투약 연구로 평가하였다. 이 연구에서 반복된 정맥내 주입에 의해 투여되었을 때, CD123-M18 (CD3 mAb 1 M18의 vCD3-결합 도메인을 포함함) 및 CD123-WT (CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인을 포함함)의 잠재적 독성 및 사이토카인 방출 프로파일을 평가하였다. 세포 사멸 활성은 이 모델에서 쉽게 접근할 수 없다. 연구 설계를 표 16에 나타낸다.
그룹 번호 테스트 물질 용량 수준 (mg/kg) 투약일 동물의 수
(수컷)
1 대조군 0 0 2
2 CD123-WT 0.003 0, 7 3
3 CD123-M18 10 0, 7 3
4 CD123-M18 20 0, 7 2
CD123-M18 처리 그룹 (10 및 20 mg/kg)에서 사망, 체중 손실 또는 다른 유해한 관찰사항을 관찰하지 못하였다. 더불어, 유의할만한 혈액학 또는 임상 화학 변화는 이들 그룹에서 관찰되지 않았다. 대조적으로, CD123-WT 분자 (0.003 mg/kg)는 잘 허용되지 못하였다. 사이토카인 방출 증후군 및 사망 (1/3)을 이 그룹에서 관찰하였다. 혈청 사이토카인 수준 (0-9일)을 도 24A-24E에 도표화한다 (도 24A: IFN-γ, 도 24B: TNF-α, 도 24C: IL-6, 도 24D: IL-2, 및 도 24E: IL-15). 더불어, T-세포 증식을 증식 세포의 마커로서 Ki67의 발현을 사용하여 FACS에 의해 조사하였다. 도 24F는 Ki67에 대해 양성인 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 퍼센트 (0-14일)로서, CD4+ T-세포 팽창을 도시하고, 도 24G는 CD8+ T-세포 행창을 도시한다. 도 24H-24I는 처리 그룹에서 동물에 대한 유의성의 여러 혈액학 및 임상 화학 마커의 도표를 나타낸다 (도 24H: 혈소판 수; 도 24I: C-반응성 단백질; 도 24J: 우레아 질소). 이 연구의 결과는 vCD3-결합 도메인 CD3 mAb 1 M18을 포함하는 DA x CD3 결합 분자가 시노몰구스 원숭이에서 잘 허용되었고, 계획된 치료 수준을 초과하는 용량에서도 TNF-α, IFN-γ, IL-2 및 IL-6의 방출의 최소한의, 일시적인 증가를 나타내며, 다중 임상 화학 마커에서 더 작은 변화를 나타낸 것을 보여준다. 더불어, vCD3-결합 도메인 CD3 mAb 1 M18을 포함하는 DA x CD3 결합 분자가 CD8+ T-세포의 증식을 우선적으로 자극하는 것으로 나타났다.
추가의 독물학 연구를 1 mg/kg 및 10 mg/kg으로 투여한 CD123-M13 (CD3 mAb 1 M13의 vCD3-결합 도메인을 포함함), 1 mg/kg 및 10 mg/kg으로 투여한 CD123-M17 (CD3 mAb 1 M17의 vCD3-결합 도메인을 포함함), 및 10 mg/kg으로 투여한 CD123-M19 (CD3 mAb 1 M19의 vCD3-결합 도메인을 포함함)로 수행하였다. 이들 연구에서 CD123-M13이, 특히 10 mg/kg 그룹에서 CD123-M17 또는 CD123-M19보다 더 높은 사이토카인 방출을 나타낸 것으로 관찰되었다. 약간의 사망이 이 연구에서, 특히 CD123-M13 고용량 그룹에서 관찰되었고, 일시적인 혈액학 및 임상 화학 변화가 관찰되었다. 표 17은 이 연구 및 CD123-WT 및 CD123-M19를 사용한 이전의 독물학 연구로부터의 관찰된 사망률의 요약을 제공한다.
CD3 변이체 용량 투여 횟수 사망 수
CD123-WT 10 μg/kg 1 1 제3일에 안락사함
3 → 3 μg/kg
(1 → 8일)		 3 1 제8일에 안락사함
3 → 10 μg/kg
(1 → 8일)		 2 1 제8일에 안락사함
3 → 30 μg/kg
(1 → 8일)		 2 2 제8일 또는 9일에 안락사함
CD123-M13 1 mg/kg 2 1 제3일에 안락사함
10 mg/kg 2 2 제3일에 사망 또는 안락사함
CD123-M17 1 mg/kg 2 0 사망 없음
10 mg/kg 5 1 제4일에 안락사함
CD123-M18 10 (n=3) 또는 20 mg/kg (n=2)에서 사망 없음
CD123-M19 10 mg/kg (n=2)에서 사망 없음 (더 높은 용량은 테스트하지 않음)
표 17에서 나타낸 것과 같이, 사망은 3 μg/kg (0.003 mg/kg) CD123-M13 (CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인을 포함함) 정도로 적은 양으로 처리된 동물에서 관찰된 한편 CD3 mAb 1 M13, M17, M18, 및 M19의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 CD123 x CD3 결합 분자는 훨씬 더 높은 용량에서 허용될 수 있고 CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인을 포함하는 CD123-M13과 비교하여 감소된 사이토카인 방출 프로파일을 나타낸다. 이들 연구로부터의 허용된 용량 순위는 CD123-M18 ≥ CD123-M19 > CD123-M17 > CD123-M13 > CD123-WT이다. 이들 발견은 상기에서 제공된 치료 지수 평가로 추적된다.
실시예 12
예시의 CD123 x CD3 분자의 AML 블라스트 고갈을 매개하는 능력
예시의 CD123 x CD3 디아바디를 AML 환자로부터의 말초혈 샘플로부터의 AML 모세포(blast cell) 고갈을 매개하는 그것의 능력에 대해 평가하였다. 간단히 설명하면, AML 환자로부터의 말초혈 세포를 증가하는 농도의 DART-A-WT, CD123-WT, CD123-M1 및 CD123-M18의 존재 하에 보충된 배지에서 인큐베이션하였다. 세포질(Cellularity)(CD34+ 블라스트, CD3+ 및 CD8+ T-세포)을 0시간 및 제6일에 유동 세포분석에 의해 분석하고 미처리 대조군의 퍼센트로서 또는 기준선의 배수 증가로서 도표화한다. 사이토카인 수준을 인큐베이션 4일 째에 수득한 상층액에 대한 사이토카인-비드 어레이 (BD)에 의해 분석하였다. 이 연구의 결과를 도 25A-25G에 나타낸다. 도 25A에서 나타낸 것과 같이, CD123-M18은 AML 모세포가 DART-A-WT 및 CD123-WT와 동일한 정도로 고갈되는 것을 매개할 수 있었다. 그러나, CD123-M18은 T-세포 집단의 상당히 감소된 팽창을 나타냈다 (도 25B: CD4+ T-세포; 도 25C: CD8+ T-세포). 나아가, CD123-M18은 상당히 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 나타냈다 (도 25D: IFN-γ; 도 25E: TNF-α; 도 25F: IL-6; 및 도 25G: IL-2).
이들 결과는 CD3 mAb 1 M18의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자가 효능이 약간 감소되면서 최대 사멸 잠재력을 보유하였지만, 시험관내 및 생체내에서 표적-유도 사이토카인 방출에서는 비교할 수 없이 더 큰 감소를 보였음을 추가로 입증한다. 이러한 vCD3-결합 도메인을 DA x CD3 결합 분자에 통합시켜서 재지시된 T-세포 사멸 적용에서 치료 지수를 팽창시킬 수 있다.
실시예 13
예시의 CD19 x CD3 분자의 자가 B-세포 고갈을 매개하는 능력
연구의 한 세트에서, 예시의 CD19 x CD3 디아바디 CD19-WT (CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인을 포함하는 양성 대조군) 및 CD19.1-M18 (CD3 mAb 1 M18의 vCD3-결합 도메인을 포함함)을 시험관내 및 생체내에서 자가 B-세포 고갈을 매개하는 그것들의 능력에 대해 평가하였다. 시험관내 연구의 경우, 인간 및 시노몰구스 원숭이로부터의 PMBC를 이용하였다. 간단히 설명하면, 인간 또는 시노몰구스로부터 ㅂ분리한 PMBC를 증가하는 농도의 CD19-WT (양성 대조군) 또는 CD19.1-M18 또는 음성 대조군 HIV-M18의 존재 하에 보충된 배지에서 인큐베이션하였다. B-세포 수준을 인큐베이션 후 48시간 째에 유동 세포분석 (B-세포 마커로서 CD20을 사용함)에 의해 분석하였다. 인간 샘플로부터의 상층액 중의 사이토카인 수준을 사이토카인-비드 어레이 (BD)에 의해 분석하였다. 이 연구의 결과를 도 31A-31F에 나타낸다. 도 31A-31B,에서 나타낸 것과 같이, CD19.1-M18은 인간 및 시노몰구스 원숭이 PMBC 둘 다로부터의 자가 B-세포를 CD19-WT와 동일한 정도로 고갈시킬 수 있었다. 나아가, CD19.1-M18은 상당히 더 낮은 수준의 사이토카인 방출을 나타냈다 (도 31C: IFN-γ; 도 31D: TNF-α; 도 31E: IL-6; 및 도 31F: IL-2).
생체내에서 자가 B-세포 고갈을 매개하는 양성 대조군, CD19-WT 및 CD19.1-M18 (CD3 mAb 1 M18의 vCD3-결합 도메인을 포함함)의 능력을 시노몰구스 원숭이에서의 투약 연구로 평가하였다. 연구 설계를 표 18에 나타낸다.
그룹 번호 테스트 물질 용량 수준 (mg/kg) 동물의 수 (수컷)
1 CD19-WT 0.1 2
2 CD19.1-M18 1 2
3 CD19.1-M18 10 2
4 CD19.1-M18 30 2
CD19 x CD3 디아바디를 제0일에 단일 2-시간 정맥내 주입에 의해 투여하였다. 말초혈 샘플을 투여 전과 주기적으로 투여 후에 얻었다. 말초혈 샘플 중의 B-세포 수준을 유동 세포분석 (B-세포 마커로서 CD20을 사용함)에 의해 분석하였다. 그룹 1 내지 3에서 테스트한 2마리 원숭이 중 하나로부터의 대표적인 데이터를 도 32A-32D에 나타낸다 (도 32A: 투여 전 0일; 도 32B: 제1일; 도 32C: 제8일; 도 32D: 제15일; B-세포 집단은 타원형으로 표시됨). 더불어, 사타구니 림프절을 투여 전, 제7일, 및 제15일에 수집하여 B-세포에 대해 염색하였다 (B-세포 마커로서 CD20을 사용함). 그룹 1, 3 및 4에서 테스트한 2마리 원숭이 중 하나로부터의 투여 전 및 제7일 샘플로부터의 대표적인 면역조직화학 이미지를 도 33A-33C에 나타낸다 (도 33A: 그룹 1; 도 33B: 그룹 3; 도 33C: 그룹 4; 투여 전은 좌측에, 제7일은 우측에 있음; 염색된 B-세포는 진하게 나타남). 이 생체내 연구의 결과는 B-세포가 하루 내에 말초혈에서 효율적으로 고갈되었고 고갈이 단일 용량의 예시의 CD19 x CD3 디아바디 CD19.1-M18의 투여 후 최대 15일 동안 지속되었음을 보여준다 (도 32A-32D 참조). 유사하게, B-세포는 7일 (투여 후 조사된 가장 초기의 시점) 이내에 림프절에서 효율적으로 고갈되었고 이것은 1 mg/kg 정도로 적은 용량에서 CD19.1-M18이 CD19-WT 양성 대조군과 유사한 정도로 생체내에서 T-세포 재지시된 사멸을 통해 자가 B-세포 고갈을 매개할 수 있음을 입증한다.
추가적인 CD19 x CD3 결합 분자의 자가 B-세포 고갈을 매개하는 능력을 시노몰구스 원숭이에서 평가하였다. 이 연구에서 CD19-WT (CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인을 포함하는 양성 대조군); CD19.1-M13 (CD3 mAb 1 M13의 vCD3-결합 도메인을 포함함); 및 CD19.1-M17 (CD3 mAb 1 M17의 vCD3-결합 도메인을 포함함)의 활성을, 반복된 정맥내 주입에 의해 투여되었을 때 자가 B-세포 고갈을 매개하는 능력에 대해 평가하였다. 연구설계를 표 19에 나타낸다.
그룹 번호 테스트 물질 용량 수준 (mg/kg) 투약일 동물의 수
1 CD19-WT 0.1 1, 8 2M
2 CD19.1-M13 1 1, 8 3M
3 CD19.1-M17 1 1, 8 3M
사망, 체중 손실 또는 다른 유해한 관찰사항을 관찰하지 못하였고, 제1일에 그룹 3의 한 동물에서 및 제8일에 그룹 2의 한 동물에서 투여 후에 사지 저온이 관찰되었으며, 두 경우 모두 다음날 해소되었다. 말초혈 샘플 (투여 전 및 주기적으로 투여 후에 얻음)에서의 B-세포 수준을 유동 세포분석 (B-세포 마커로서 CD20을 사용함)에 의해 분석하였다. 더불어, 조직 샘플 (비장, 고룻 및 림프절 (LN))을 CD20 염색에 대해 면역조직화학에 의해 평가하였다. 그룹 1 내지 3으로부터의 유동 세포분석 데이터를 도 34에 나타내며 각 동물 (및 미처리 음성 대조군 동물)로부터의 조직 염색 데이터를 표 20에 요약한다. 혈청 사이토카인 수준은 연구 과정 (투여 전 및 주기적으로 투여 후) 동안 평가하였다. 각 처리 그룹에 대해 TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-6, 및 IL-15의 혈청 수준을 각각 도 35A-35E에 도표화한다. 더불어, 말초혈 중의 T-세포 집단을 세포 증식의 마커로서 Ki67의 발현을 사용하여 FACS에 의해 조사하였다. 도 36A는 CD4+ T-세포 팽창을, 그리고 도 36B는 CD8+ T-세포 팽창을 Ki67에 대해 양성인 CD4+ 또는 CD8+ 세포 (투여 전과 주기적으로 투여 후에 얻음)의 퍼센트로서 도시한다.
CD20 조직 염색
음성 대조군‡ CD19-WT
동물 번호 5001 1001 1002
비장 X 2+ 1+
골수 2+ 0 0
LN, 겨드랑이 3+ 1+ 1+
LN, 아래턱뼈 3+ 1+ 1+
LN, 장간막 3+ 1+ 1+
LN, 사타구니 3+ 1+ 1+

CD19.1-M13
동물 번호 2001 2002 2003
비장 1+ 2+ 1+
골수 0 0 0
LN, 겨드랑이 1+ 2+ 1+
LN, 아래턱뼈 1+ 1+ 1+
LN, 장간막 0 1+ 1+
LN, 사타구니 1+ 1+ 1+

CD19.1-M17
동물 번호 3001 3002 3003
비장 1+ 1+ 1+
골수 0 1+ 1+
LN, 겨드랑이 1+ 2+ 2+
LN, 아래턱뼈 1+ 2+ 2+
LN, 장간막 1+ 1+ 2+
LN, 사타구니 1+ 2+ 2+
‡ 음성 대조군 그룹에서 한 마리의 동물;
X - 조사하지 않음; 0 - 관찰된 염색 없음;
1+ - 약한 염색이 관찰됨; 2+ - 중간 정도의 염색이 관찰됨;
3+ - 강한 염색이 관찰됨
이 연구의 결과는 vCD3-결합 도메인 CD3 mAb 1 M13 또는 CD3 mAb 1 M17을 포함하는 CD19 x CD3 결합 분자가 1 mg/kg CD19.1-M13으로 처리된 동물과 활성이었고 CD19-WT 양성 대조군과 유사한 정도로 자가 B-세포 고갈을 나타냈음을 보여준다. 1 mg/kg CD19.1-M17로 처리된 동물 또한 자가 B-세포 고갈을 나타냈지만, 양성 대조군보다는 약간 더 적은 정도였다. CD19.1-M17은 더 높은 투여량으로 비슷한 고갈을 이룰 것으로 예상된다. 변이체는 INF-γ, TNF-α, IL-2, 및 IL-6의 방출에서 훨씬 더 적은 증가 및 IL-15의 방출에서 약가의 감소를 매개하였다. 더불어, CD3 mAb 1 M13 및 CD3 mAb 1 M17을 포함하는 결합 분자는 T-세포의 증식을 자극하는 것으로 나타났고, CD3 mAb 1 M13을 포함하는 분자로는 더 높은 수준의 증식을 나타냈다. 더불어, 두 분자 모두 CD8+ T-세포의 증식의 우선적인 자극을 나타냈다.
상기 실시예에서 제공된 연구들은 함께 CD3 mAb 1 (예컨대, M13, M17, M18, M19)의 vCD3-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자가 다양한 결합 친화성, 다양한 세포독성 EC50 값을 나타내지만 모두 CD3 mAb 1의 rCD3-결합 도메인을 포함하는 분자와 비슷한 최대 CTL 활성에 도달하고, 그로써 향상된 치료 지수를 나타내는 것을 보여준다. 이들 연구는 추가로 이러한 분자가 허용되며 T-세포 재지시된 세포 사멸을 매개하고, 생체내에서 T-세포 활성화 및 증식을 자극하는데 활성인 것을 보여준다.
본 명세서에서 언급된 모든 출판물 및 특허는 각각의 개별적인 출판물 또는 특허 출원이 구체적이며 개별적으로 그 전문이 참조로 포함된 것으로 표시된 것과 같은 정도로 참조로 본원에 포함된다. 발명이 그것의 특정 구체예들과 관련하여 기술되었지만, 추가로 변형될 수 있고 본 출원은 본 발명이 속하는 기술 내에서 공지된 또는 관례적인 관행 내에 있으며, 지금까지 설명된 필수 특징에 적용될 수 있는 것으로서 일반적으로 발명의 원리를 따르고 본 개시로부터의 그러한 벗어남을 포함하는 발명의 임의의 변화, 사용, 또는 응용을 포함하는 것으로 의도되는 것이 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> MacroGenics, Inc. Bonvini, Ezio Huang, Ling Lam, Chia-Ying Chichili, Gurunadh Reddy Alderson, Ralph Froman Moore, Paul A. Johnson, Leslie S. <120> Variant CD3-Binding Domains and Their Use in Combination Therapies for the Treatment of Disease <130> 1301.0150PCT <150> US 62/738,632 <151> 2018-09-18 <150> US 62/631,043 <151> 2018-02-15 <160> 209 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(98) <223> Exemplary Human IgG1 CH1 Domain <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(98) <223> Exemplary Human IgG2 CH1 Domain <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 450 455 460 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 465 470 475 480 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 485 490 495 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 185 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of the HIV x CD3 DART-B-type Diabody HIV-WT <400> 185 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Ile Ile Ser Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asp Ile 85 90 95 His Asn Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 130 135 140 Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr 165 170 175 Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 180 185 190 Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr 195 200 205 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn 210 215 220 Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu 245 250 255 Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala 260 265 270 Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 275 280 285 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 290 295 300 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 305 310 315 320 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 325 330 335 Tyr Val Asp Gly 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220 Arg Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala 245 250 255 Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu 260 265 270 Lys Glu <210> 187 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Third Polypeptide Chain of Illustrative TRIVALENT-Type Molecules <400> 187 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro His Tyr Asp Gly Tyr Tyr His Phe Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala 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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 188 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fourth Polypeptide Chain of Illustrative TRIVALENT-Type Molecules <400> 188 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asp Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 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(T), Aspartate (D), or Glutamate (E) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (153)..(153) <223> Xaa is Tyrosine (Y), Aspartate (D), or Threonine (T) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (154)..(154) <223> Xaa is Alanine (A) or Glycine (G) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (189)..(189) <223> Xaa is Aspartate (D) or Glycine (G) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (223)..(223) <223> Xaa is Glycine (G), Aspartate (D), Glutamate (E), or Lysine (K) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (225)..(225) <223> Xaa is Phenylalanine (F) or Isoleucine (I) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (226)..(226) <223> Xaa is Glycine (G) or Isoleucine (I) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (229)..(229) <223> Xaa is Tyrosine (Y), Alanine (A), Glycine (G), or Glutamine (Q) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (231)..(231) <223> Xaa is Serine (S) or Threonine (T) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (232)..(232) <223> Xaa is Tryptophan (W), Phenylalanine (F), or Tyrosine (Y) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (235)..(235) <223> Xaa is Tyrosine (Y) or Glutamate (E) <400> 189 Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 130 135 140 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Xaa Xaa Met Asn Trp Val Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 165 170 175 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Xaa Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Xaa Asn 210 215 220 Xaa Xaa Asn Ser Xaa Val Xaa Xaa Phe Ala Xaa Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala 245 250 255 Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys 260 265 270 Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 275 280 <210> 190 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of Illustrative CD123 x CD3 DART-A-type Diabody Having the Structure of DART-A-WT Diabody, but Comprising the VL and VH Domain of one of CD3 mAb 1 variants M1-M26 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is Glycine (G) or Aspartate (D) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is Lysine (K) or Glycine (G) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(92) <223> Xaa is Leucine (L), Glutamate (E), or Glutamine (Q) <400> 190 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 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Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 <210> 191 <211> 502 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of the CD19 x CD3 DART-B-type Diabody CD19-WT <400> 191 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val 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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 355 360 365 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 370 375 380 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 385 390 395 400 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 405 410 415 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 420 425 430 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 435 440 445 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 450 455 460 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 465 470 475 480 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 485 490 495 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 192 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Second Polypeptide Chain of the CD19 x CD3 DART-B-type Diabody CD19-WT <400> 192 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala 115 120 125 Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly 130 135 140 Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro 145 150 155 160 Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp 165 170 175 Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp 180 185 190 Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val 195 200 205 Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Glu Leu Trp Ser Tyr Tyr 210 215 220 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 225 230 235 240 Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys 245 250 255 Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu 260 265 270 <210> 193 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of the CD19 x CD3 DART-B-type Diabody CD19.1-M18 <400> 193 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp His Phe Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Thr Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 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Val Phe Ser 465 470 475 480 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 485 490 495 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 202 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of the CD19 x CD3 DART-B-type Diabody CD19.1-M17 <400> 202 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp His Phe Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Thr Thr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr 165 170 175 Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys 180 185 190 Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser 210 215 220 Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 225 230 235 240 Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala 245 250 255 Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu 260 265 270 Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 275 280 285 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 290 295 300 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 305 310 315 320 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 325 330 335 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 340 345 350 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 355 360 365 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 370 375 380 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 385 390 395 400 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 405 410 415 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 420 425 430 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 435 440 445 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 450 455 460 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 465 470 475 480 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 485 490 495 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 203 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of the CD19 x CD3 DART-B-type Diabody CD19.1-M19 <400> 203 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp His Phe Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr 165 170 175 Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys 180 185 190 Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Lys Asn Ile Gly Asn Ser Tyr Val Ser 210 215 220 Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 225 230 235 240 Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala 245 250 255 Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu 260 265 270 Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 275 280 285 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 290 295 300 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 305 310 315 320 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 325 330 335 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 340 345 350 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 355 360 365 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 370 375 380 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 385 390 395 400 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 405 410 415 Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 420 425 430 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 435 440 445 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 450 455 460 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 465 470 475 480 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 485 490 495 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 204 <211> 502 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of a CD19 x CD3 DART-B-type Diabody comprising the VL Domain of CD19 mAb 1 and the VH Domain of CD3 mAb 1 M13 <400> 204 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr 165 170 175 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys 180 185 190 Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser 210 215 220 Trp Phe Ala Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 225 230 235 240 Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 275 280 285 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 290 295 300 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 305 310 315 320 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 325 330 335 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 340 345 350 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 355 360 365 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 370 375 380 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 385 390 395 400 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 405 410 415 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 420 425 430 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 435 440 445 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 450 455 460 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 465 470 475 480 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 485 490 495 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 205 <211> 502 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of a CD19 x CD3 DART-B-type Diabody comprising the VL Domain of CD19 mAb 1 and the VH Domain of CD3 mAb 1 M17 <400> 205 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Thr Thr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr 165 170 175 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys 180 185 190 Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser 210 215 220 Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 225 230 235 240 Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 275 280 285 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 290 295 300 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 305 310 315 320 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 325 330 335 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 340 345 350 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 355 360 365 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 370 375 380 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 385 390 395 400 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 405 410 415 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 420 425 430 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 435 440 445 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 450 455 460 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 465 470 475 480 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 485 490 495 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 206 <211> 502 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> First Polypeptide Chain of a CD19 x CD3 DART-B-type Diabody comprising the VL Domain of CD19 mAb 1 and the VH Domain of CD3 mAb 1 M19 <400> 206 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 115 120 125 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 130 135 140 Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 145 150 155 160 Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr 165 170 175 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys 180 185 190 Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Lys Asn Ile Gly Asn Ser Tyr Val Ser 210 215 220 Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 225 230 235 240 Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 260 265 270 Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 275 280 285 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 290 295 300 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 305 310 315 320 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 325 330 335 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 340 345 350 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 355 360 365 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 370 375 380 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 385 390 395 400 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 405 410 415 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 420 425 430 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 435 440 445 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 450 455 460 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 465 470 475 480 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 485 490 495 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 500 <210> 207 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(125) <223> VH Domain of Variants of Anti-Human CD3 Antibody CD3 mAb 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31)..(31) <223> Xaa is Threonine (T), Aspartate (D), or Glutamate (E) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32) <223> Xaa is Tyrosine (Y), Aspartate (D) or Threonine (T) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> Xaa is Aspartate (D) or Glycine (G) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102)..(102) <223> Xaa is Glycine (G), Aspartate (D), Glutamate (E), or Lysine (K) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104) <223> Xaa is Phenylalanine (F) or Isoleucine (I) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa is Glycine (G) or Isoleucine (I) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa is Tyrosine (Y), Alanine (A), Glycine (G), or Glutamine (Q) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> Xaa is Tryptophan (W), Phenylalanine (F), or Tyrosine (Y) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (114)..(114) <223> Xaa is Tyrosine (Y) or Glutamate (E) <400> 207 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Xaa Asn Xaa Xaa Asn Ser Xaa Ser Thr Xaa Phe 100 105 110 Ala Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 208 <211> 110 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(110) <223> VL Domain of Variants of Anti-Human CD3 Antibody CD3 mAb 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is is Glycine (G) or Aspartate (D) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55) <223> Xaa is is Lysine (K) or Glycine (G) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (92)..(92) <223> Xaa is is Leucine (L), Glutamate (E) or Glutamine (Q) <400> 208 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Xaa Thr Asn Xaa Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Xaa Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 209 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(123) <223> VH Domain of the Human Anti-HIV(env) Antibody A32, wherein residue 118 is Leucine (L) <400> 209 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ser Ser Ser Gly 20 25 30 Ala His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Gln His Thr Ser Glu Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Arg Thr Leu Arg Asn Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (27)

  1. CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 CD3-결합 도메인 및 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 질환 항원-결합 도메인을 포함하는 DA x CD3 결합 분자로서, 여기서 상기 CD3-결합 도메인은:
    (I) (A) SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95 및 SEQ ID NO:97로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
    (B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
    (C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
    (D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
    (E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
    (F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
    (II) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
    (B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
    (C) SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105 및 SEQ ID NO:107로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
    (D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
    (E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
    (F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
    (III) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
    (B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
    (C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
    (D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
    (E) SEQ ID NO:61의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
    (F) SEQ ID NO:109 또는 SEQ ID NO:111로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인; 또는
    (IV) (A) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
    (B) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
    (C) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
    (D) SEQ ID NO:60의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
    (E) SEQ ID NO:113 및 SEQ ID NO:115로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
    (F) SEQ ID NO:62의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인
    을 포함하는 DA x CD3 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD3-결합 도메인은:
    (I) (A) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (B) SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104 및 SEQ ID NO:106으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 또는
    (II) (A) SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112; 및 SEQ ID NO:114로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인;
    (B) SEQ ID NO:55의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DA x CD3 결합 분자는 이중특이적 항체, 이중특이적 디아바디, 이중특이적 scFv, 이중특이적 TandAb, 또는 3가 결합 분자인 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DA x CD3 결합 분자는 하나 이상의 질환 항원 및/또는 이펙터 세포의 상이한 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 항원은 암 항원인 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 항원은 병원체-관련 항원인 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 세포의 상기 상이한 세포 표면 분자는 CD2, CD8, CD16, TCR, NKp46, 또는 NKG2D인 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  8. 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 암 항원은 암 항원: 19.9, 4.2, ADAM-9, AH6, ALCAM, B1, B7-H3, BAGE, 베타-카테닌, 혈액형 ALeb/Ley, 버킷 림프종 항원-38.13, C14, CA125, 카르복시펩티다제 M, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD33, CD36, CD40/CD154, CD45, CD56, CD46, CD52, CD56, CD79a/CD79b, CD103, CD123, CD317, CDK4, CEA, CEACAM5/CEACAM6, CO17-1A, CO-43, CO-514, CTA-1, CTLA-4, 사이토케라틴 8, D1.1, D156-22, DR5, E1 시리즈, EGFR, 에프린 수용체, EphA2, Erb, GAGE, GD2/GD3/GM2 강글리오시드, GICA 19-9, gp100, Gp37, gp75, gpA33, HER2/neu, HMFG, 인간 유두종 바이러스-E6/인간 유두종 바이러스-E7, HMW-MAA, I 항원, IL13Rα2, 인테그린 β6, JAM-3, KID3, KID31, KS 1/4 pan-암종 항원, L6,L20, LEA, LUCA-2, M1:22:25:8, M18, M39, MAGE, MART, 메소텔린, MUC-1, MUM-1, Myl, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, 네오당단백질, NS-10, OFA-1, OFA-2, 온코스타틴 M, p15, p97, PEM, PEMA, PIPA, PSA, PSMA, 전립선 산 포스페이트, R24, ROR1, 스핑고지질, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, sTn, T-세포 수용체 유래 펩타이드, T5A7, TAG-72, TL5, TNF-수용체, TNF-γ 수용체, TRA-1-85, 트랜스페린 수용체, 5T4, TSTA, VEGF, VEGF 수용체, VEP8, VEP9, VIM-D5, 및 Y 합텐, Ley로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 질환 항원은 B7-H3, CEACAM5/CEACAM6, EGRF, EphA2, gpA33, HER2/neu, VEGF, 5T4, IL13Rα2, CD123, CD19, 또는 ROR1인 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 병원체-관련 항원은 병원체-관련 항원: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DA x CD3 결합 분자는 서로에게 공유 결합된 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 여기서:
    (A) 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (i) (1) 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLDA)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및
    (2) CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHCD3)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하고,
    하위도메인 1A 및 1B는 펩타이드 링커에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1; 및
    (ii) 헤테로다이머-촉진 도메인인 도메인 2를 포함하고;
    (B) 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로:
    (i) (1) CD3의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인 (VLCD3)을 포함하는 하위도메인 (1A); 및
    (2) 질환 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인 (VHDA)을 포함하는 하위도메인 (1B)을 포함하며;
    하위도메인 1A 및 1B는 펩타이드 링커에 의해 서로 분리되어 있는 도메인 1; 및
    (ii) 헤테로다이머-촉진 도메인인 도메인 2를 포함하고,
    여기서 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 헤테로다이머-촉진 도메인은 상이하며;
    (a) 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인은 회합하여 질환 항원-결합 도메인을 형성하고, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 회합하여 CD3-결합 도메인을 형성하거나; 또는
    (b) 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인 및 제2폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인은 회합하여 CD3-결합 도메인을 형성하며, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인 및 제2폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 회합하여 질환 항원-결합 도메인을 형성하는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    (a) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 E-코일 도메인이고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 K-코일 도메인이거나; 또는
    (b) 상기 제1 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 K-코일 도메인이고, 상기 제2 폴리펩타이드 사슬의 상기 헤테로다이머-촉진 도메인은 E-코일 도메인인 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 제1 또는 제2 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 도메인 3을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 DA x CD3 결합 분자는 면역글로불린 Fc 도메인의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드 사슬을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DA x CD3 결합 분자는 CD8-결합 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DA x CD3 결합 분자는:
    (I) (A) SEQ ID NO:179를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:175를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
    (C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
    (II) (A) SEQ ID NO:184를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:181을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
    (C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
    (III) (A) SEQ ID NO:196을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:186을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
    (C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
    (IV) (A) SEQ ID NO:197을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:192를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
    (C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
    (V) (A) SEQ ID NO:193을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:194를 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및
    (C) SEQ ID NO:176을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 또는
    (VI) (A) SEQ ID NO:179를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:175를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
    (C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
    (D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
    (VII) (A) SEQ ID NO:184를 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:181을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
    (C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
    (D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
    (VIII) (A) SEQ ID NO:196을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:186을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
    (C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
    (D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드; 또는
    (IX) (A) SEQ ID NO:193을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (B) SEQ ID NO:194를 포함하는 제2 폴리펩타이드;
    (C) SEQ ID NO:187을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
    (D) SEQ ID NO:188을 포함하는 제4 폴리펩타이드
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DA x CD3 결합 분자 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  18. 질환의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 DA x CD3 결합 분자 또는 제17항의 제약학적 조성물의 치료적 유효량을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 질환은 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비-소세포 폐암, 혈액암, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 망막 세포 암종, 고환암, 및 자궁암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 질환은 병원체-관련 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 병원체-관련 항원은 병원체-관련 항원: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항 또는 제16항에 있어서, 질환의 치료에 사용하기 위한 것인 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 질환은 암인 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비-소세포 폐암, 혈액암, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 망막 세포 암종, 고환암, 및 자궁암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
  26. 제23항에 있어서, 상기 질환은 병원체-관련 질환인 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 병원체-관련 항원은 병원체-관련 항원: 헤르페스 단순 바이러스 감염된 세포 단백질 (ICP)47, 헤르페스 단순 바이러스 gD, 엡스타인-바 바이러스 LMP-1, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2A, 엡스타인-바 바이러스 LMP-2B, 인간 면역결핍 바이러스 gp160, 인간 면역결핍 바이러스 gp120, 인간 면역결핍 바이러스 gp41, 인간 유두종 바이러스 E6, 인간 유두종 바이러스 E7, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp64, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp46, 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스 gp21로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DA x CD3 결합 분자 또는 제약학적 조성물.
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