KR20190034318A - Ido1억제제 및 이의 제조방법과 응용 - Google Patents

Ido1억제제 및 이의 제조방법과 응용 Download PDF

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KR20190034318A
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Abstract

본 발명은 인돌아민-2,3-디옥시게나아제1(IDO1)억제제인 화합물 및 IDO1 관련 질환분야에서의 응용에 관한 것이다. 구체적으로, 식(I)로 표시되는 화합물 및 그 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

Description

IDO1억제제 및 이의 제조방법과 응용
본 발명은 인돌아민-2,3-디옥시게나아제1(IDO1)억제제인 화합물 및 IDO1 관련 질환분야에서의 응용에 관한 것이다. 구체적으로, 식(I)로 표시되는 화합물 및 그 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
인돌아민-2,3-디옥시게나아제(Indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO)는 1967년 Hayaishi 그룹에 의해 최초로 세포내에서 발견된 헴을 함유하는 단합체효소로서, cDNA에 의해 코딩되는 단백질은 403개 아미노산으로 구성되고, 분자량은 455kDa이며, 트립토판-카이누레닌 경로에 따라 분해대사하는 율속효소이고, 여러 종류 포유동물의 조직에서 광범위한 발현이 있다(Hayaishi O.등 Science, 1969, 164, 389-396). 종양 환자의 세포에서, IDO는 종양 미세환경의 면역내성을 유도하는 것으로서, 중요한 생리작용을 일으키며, 그가 매개하는 트립토판(Tryptophan,Trp) 카이누레닌(Kynurenine,Kyn) 대사 경로는 종양 면역성 이탈에 참여하나, IDO는 종양 미세환경의 면역내성을 유도하는데서도 중요한 역할을 일으키고 있다.
트립토판(Trp)은 생합성단백질, 니코틴산 및 신경전달물질인 5-히드록시트립타민(세로토닌)이 필요하는 일종 필수아미노산이다. 최근에 Trp 고갈에 의한 면역조절작용은 아주 많은 주목을 받고 있다. IDO는 트립토판, 5-히드록시트립타민 및 멜라토닌의 인돌부분을 분해하여 카이누레닌으로 총칭하는 신경활성 및 면역조절대사물을 유발하여 생성한다. 트립토판 국부소모와 세포사멸을 촉진하는 카이누레닌의 증가에 의해 수지상세포(DC)로 발현되는 IDO는 T세포의 증식과 생존에 극대한 영향을 줄수 있다. DC에서 IDO의 유발은 조절T세포에 의해 구동되는 소모내성의 일반적인 기제일 수 있다. 이런 유형의 관용원성반응은 여러 종류의 생리학적 병리학적 병증에서 역할을 일으키는 것으로 예상될 수 있고 트립토판 대사 및 카이누레닌의 생성은 면역 및 신경시스템 사이에서의 관건적인 계면인 것을 대표할 수 있기 때문이다(Grohmann 등, 2003, Trends Immunol., 24: 242-8). 지속적인 면역활성화 상태에서, 이용될 수 있는 유리혈청 Trp이 감소되고, 5-히드록시트립타민의 생성이 감소됨에 의해 5-히드록시트립타민성 기능도 영향받을 수 있다(Wirleitner 등, 2003, Curr. Med. Chem., 10: 1581-91).
IDO 관련 질환을 치료 및 예방하는 IDO억제제가 개발되고 있다. 비포화 상태인 거대한 시장을 앞두고 해당 분야에서는 여전히 치료 수요을 만족시키기 위한 활성이 더 좋은 IDO억제제가 필요된다.
본 발명은 식(I)로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00001
D는 O, S 또는 -S(=O)-에서 선택되고,
L는 단일결합에서 선택되거나 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 -(C1-10)알킬-, -(C3-6)시클로알킬-, -(C3-6)시클로알킬-(C1-3)알킬-, -페닐-, -3 내지 6 원자헤테로시클로알킬-, -3 내지 6 원자헤테로시클로알킬-(C1-3)알킬-에서 선택되며;
R1은 H, F, Cl, Br, I, OH, NH2에서 선택되거나 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C3-6)시클로알킬, (C1-6)헤테로알킬, N,N-디((C1-6)알킬)아미노, 3 내지 6 원자헤테로시클로알킬, (C2-6)알케닐, 페닐, 5 내지 9 원자헤테로아릴,
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
Figure pct00007
,
Figure pct00008
,
Figure pct00009
에서 선택되며;
R2는 OH 또는 CN에서 선택되며;
R3, R4 및 R5는 각각 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C3-6)시클로알킬, (C1-6)헤테로알킬, N,N-디((C1-6)알킬)아미노, 3 내지 6 원자헤테로시클로알킬에서 선택되며;
R는 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R'에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C1-6)헤테로알킬, N,N-디((C1-6)알킬)아미노, (C3-6)시클로알킬, (C2-6)알케닐, 페닐, 티에닐에서 선택되며;
R'는 F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되며,
상기 -3 내지 6 원자헤테로시클로알킬-, -3 내지 6 원자헤테로시클로알킬-(C1-3)알킬-, (C1-6)헤테로알킬, 3 내지 6 원자헤테로시클로알킬 및 5 내지 9 원자헤테로아릴에서 "헤테로"는 각각 독립적으로 -C(＝O)NH-、 -NH-、 -S(＝O)2NH-、 -S(＝O)NH-、 N、 -O-、 -S-、 ＝O、 ＝S、 -C(＝O)O-、 -C(＝O)-、 -C(＝S)-、 -S(＝O)-、 -S(＝O)2-、 -NHC(＝O)NH-、 -NHC(＝S)NH-、 -H2P(＝O)-NH-에서 선택되며;
상기 임의의 경우에 있어서, 헤테로원자 또는 원자단 개수는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R는 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R'에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C1-6)알콕시, (C1-6)알킬아미노, N,N-디((C1-6)알킬)아미노, (C2-6)알케닐, (C3-6)시클로알킬, 페닐, 티에닐에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R는 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R'에 의해 치환 또는 비치환된 Me, Et,
Figure pct00010
,
Figure pct00011
,
Figure pct00012
,
Figure pct00013
,
Figure pct00014
,
Figure pct00015
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R는 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, Me, Et, CF3, CHF2, CH2F,
Figure pct00016
,
Figure pct00017
,
Figure pct00018
,
Figure pct00019
,
Figure pct00020
,
Figure pct00021
,
Figure pct00022
,
Figure pct00023
,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 L는 단일결합에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 -(C1-5)알킬-, -(C3-6)시클로알킬-, -(C3-6)시클로알킬-(C1-3)알킬-, -3내지아자헤테로시클로알킬-(C1-3)알킬-에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 L는 단일결합에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 -CH2-,
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
,
Figure pct00030
,
Figure pct00031
,
Figure pct00032
,
Figure pct00033
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 L는 단일결합, -CH2-,
Figure pct00034
,
Figure pct00035
,
Figure pct00036
, ,
Figure pct00038
,
Figure pct00039
,
Figure pct00040
,
Figure pct00041
,
Figure pct00042
,
Figure pct00043
,
Figure pct00044
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C1-6)알콕시, (C1-6)알킬티오, (C1-6)알킬아미노, N,N'-디((C1-3)알킬)아미노, (C3-6)시클로알킬, 테트라하이드로퓨라닐, 옥세타닐, (C2-6)알케닐, 페닐, 티에닐, 피리딜, 이미다졸릴, 티아졸릴, 2-케토-이미다졸릴알킬, NH2C(＝S)-NH-、 (C1-6)알킬-S(＝O)-、 (C1-6)알킬-S(＝O)2-、 (C1-6)알콕시-C(＝O)-NH-、 NH2-S(＝O)-NH-、 -NH2-C(＝O)-、 NH2-C(＝O)-NH-、 H-C(＝O)-NH-、 H-S(＝O)2-NH-,
Figure pct00045
,
Figure pct00046
,
Figure pct00047
,
Figure pct00048
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 Me, Et, BOC-NH-, CH2＝CH-,
Figure pct00049
,
Figure pct00050
,
Figure pct00051
,
Figure pct00052
,
Figure pct00053
,
Figure pct00054
,
Figure pct00055
Figure pct00056
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, OH, NH2, Me, CF3, BOC-NH-, CH2＝CH-,
Figure pct00057
,
Figure pct00058
Figure pct00059
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 구조단위 R1-L-은 H, NH2, Me, BOC-NH-,
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R3, R4 및 R5는 각각 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 Me, Et, (C3-6)시클로알킬, (C1-3)알콕시에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R3, R4 및 R5는 각각 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 Me, Et,
Figure pct00063
,
Figure pct00064
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R3, R4 및 R5는 각각 H, F, Cl, Br, I, CN, CH2F、CHF2、CF3,
Figure pct00065
,
Figure pct00066
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 구조단위
Figure pct00067
는
Figure pct00068
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 구조단위
Figure pct00069
는
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염은
Figure pct00073
에서 선택된다:
그중에서, R2, R3, R4 및 R5는 상기 정의한바와 같고;
R6는 H에서 선택되거나 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R'에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-3)알킬, (C3-6)시클로알킬에서 선택되나, Me에서 선택되지 않는다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 R6는 H, CF3, Et,
Figure pct00074
,
Figure pct00075
,
Figure pct00076
에서 선택된다.
본 발명의 일부 양태에 있어서, 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염은
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
에서 선택된다.
본 발명은 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 활성성분 및 약학적으로 허용 가능한 담체로 하는 것도 제공한다.
본 발명은 상기 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 함유하는 조성물이 IDO1 관련 질환을 치료하는 약물의 제조에서의 응용도 제공한다.
새로운 IDO1억제제로서, 본 발명의 화합물은 체외 활성이 현저하고 용해도 및 삼투성이 우수하며 약물동력학 및 효능이 좋다.
도 1은 종양마우스의 체중에 대한 테스트 약물의 영향을 나타낸다.
도 2는 이식종양의 체적에 대한 테스트 약물의 영향을 나타낸다.
도 3은 이식종양의 중량에 대한 테스트 약물의 영향을 나타낸다.
별도의 설명이 없는 한, 본문에서 사용되는 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 가진다. 하나의 특정된 용어 또는 문구에 있어서, 특별히 정의하지 않았더라도 불확정 적이거나 불명료한 것으로 간주하여서는 아니되며, 통상적인 의미로 이해하여야 한다. 본문에서 상품명칭이 나타났을 경우, 이에 대응되는 상품 또는 그의 활성성분을 의미한다.
여기서 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형을 대상으로, 안정적인 의학 판단 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 과도한 독성, 자극성, 알레르기성 반응 또는 기타 다른 문제 또는 합병증이 없으며 합리적인 이익/위험 비율을 의미한다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명 화합물의 염으로서, 본 발명에서 발견된 특정된 치환기를 가진 화합물 및 상대적으로 독성이 없는 산 또는 염기로 제조된다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 산성을 띤 관능기가 함유될 경우, 순수한 용액 또는 적합한 비활성 용매에서, 충분한 양의 염기를 상기 화합물의 중성형태와 접촉시키는 방식으로 염기 부가염을 얻을수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기암모니아 또는 마그네슘염 또는 유사한 염이 포함된다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 염기성을 띤 관능기가 함유될 경우, 순수한 용액 또는 적합한 비활성 용매에서, 충분한 양의 산을 상기 화합물의 중성형태와 접촉시키는 방식으로 산 부가염을 얻을수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산 부가염의 실시예로, 예하면, 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 중탄산기, 인산, 인산수소기, 인산이수소기, 황산, 황산수소기, 요오드화수소산, 아인산 등 무기산의 무기산염; 및 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베린산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 시트르산, 타르타르산 및 메탄술폰산 등과 같은 유기산의 유기산염을 포함하고, 아미노산(예하면, 아르기닌 등)의 염 및 예하면 글루쿠론산 등과 같은 유기산의 염도 포함된다(Berge 등.,"Pharmaceutical Salts",Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977) 참조). 본 발명의 부분 특정된 화합물은 염기성과 산성의 관능기가 함유되어 임의의 염기부가염 또는 산부가염으로 전환될 수 있다.
바람직하게는, 통상적인 방법으로 염과 염기 또는 산을 접촉시킨 다음 모체화합물을 분리하며, 이로써 화합물의 중성형태를 재생시키는 방식을 사용한다. 화합물의 모체 형식과 이들의 다양한 염 형식의 상이한 점은 예하면, 극성 용매에서의 용해도가 상이한 것과 같은 일부 물리적 성질에 있다.
본문에서 사용되는 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물의 파생물에 속한 것으로서, 여기서, 산 부가염 또는 염기 부가염의 방법으로 상기 모체 화합물을 수식시킨다. 약학적으로 허용 가능한 염의 실시예는 아민과 같은 염기의 무기산 또는 유기산염, 카르복실산과 같은 산기의 알칼리금속 또는 유기염 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 약학적으로 허용 가능한 염은 통상적인 무독성 염 또는 모체 화합물의 제4급 암모늄 염을 포함하는 것으로서 예하면, 무독성 무기산 또는 유기산으로 형성된 염이 포함된다. 통상적인 무독성 염은 무기산 및 유기산으로부터 유도된 염을 포함하나 이에 한정되지 않고 상기 무기산 또는 유기산은 2-아세톡시벤조산, 2-히드록시에탄술폰산, 아세트산, 아스코르브산, 벤젠술폰산, 안식향산, 중탄산기, 카보네이트산, 시트르산, 에데트산, 에탄디술폰산, 에탄술폰산, 푸마르산, 글루코헵토오스, 글루콘산, 글루타민산, 글리콜산, 브롬화수소산, 염산, 요오드화수소산염, 히드록시, 히드록시나플탈렌, 이세티온산, 락트산, 락토스, 도데실술폰산, 말레산, 말산, 만델산, 메탄술폰산, 질산, 옥살산, 팜산, 판토펜산, 페닐아세트산, 인산, 폴리갈락투론산(polygalacturonic acid), 프로피온산, 살리실산, 스테아르산, 폴리네이트칼슘, 숙신산, 술팜산, p-아미노벤젠술폰산, 황산, 타닌, 타르타르산 및 p-톨루엔술폰산에서 선택된다.
본 발명의 약학적으로 허용 가능한 염은 산기 또는 염기가 함유되는 모체 화합물로부터 통상적인 화학방법에 의해 합성될 수 있다. 일반적인 경우, 이러한 염의 제조방법은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물에서 유리산 또는 염기 형태의 이런 화합물과 화학계량의 적당한 염기 또는 산을 반응시켜 제조한다. 일반적으로 에테르, 에틸아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴 등 비수성매질이 바람직하다.
본 발명의 일부 화합물은 비대칭 탄소원자(광학중심) 또는 이중결합을 가질수 있다. 라세미체, 부분입체 이성질체, 기하 이성질체 및 단일 이성질체 모두가 본 발명의 범위내에 포함된다.
별도의 설명이 없는 한, 쐐기형 결합 및 점선 결합(
Figure pct00082
)으로 하나의 입체중심의 절대배치를 표시하고,
Figure pct00083
로 하나의 입체중심의 상대배치를 표시한다. 본문의 상기 화합물에 올레핀계 이중결합 또는 다른 기하 비대칭중심이 함유되고, 별도의 설명이 없는 한, 이들은 (E), (Z)기하 이성질체가 포함된다. 마찬가지로, 모든 호변 이성 형태는 모두 본 발명의 범위내에 포함된다.
본 발명의 화합물은 특정된 기하 이성질체 또는 입체 이성질체 형태로 존재할수 있다. 본 발명에서 모든 이 유형의 화합물은 시스 및 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)-거울상 이성질체, (R)- 및 (S)-거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체 및 이들의 라세미 혼합물과 다른 혼합물을 포함하고, 예하면 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체이 풍부한 혼합물일 경우 모든 이러한 혼합물은 본 발명의 범위에 속한다고 가정한다. 알킬기와 같은 치환기에는 별도의 비대칭 탄소원자가 존재할수 있다. 모든 이러한 이성질체 및 이들의 혼합물은 모두 본 발명의 범위내에 포함된다.
키랄합성 또는 키랄시약 또는 다른 통상적인 기술에 의해 광학활성의 (R)-와 (S)-이성질체 및 (D)와 (L)-이성질체를 제조할수 있다. 본 발명의 화합물의 일종의 거울상 이성질체를 얻고자 할 경우 비대칭 합성 또는 키랄 조제의 유도작용에 의해 제조할수 있으며 생성된 부분입체 이성질체 혼합물을 분리하고 관능기를 절단하는 것을 보조하여 원하는 정제된 거울상 이성질체를 제공한다. 또는 분자에 염기성 관능기(예하면, 아미노기) 또는 산성 관능기(예하면, 카르복실기)가 함유될 경우, 적합한 광학활성의 산 또는 염기와 부분입체 이성질체의 염을 형성한 다음 본 분야에 공지된 통상적인 방법으로 부분입체 이성질체에 대해 분리한 후 회수하여 정제된 거울상 이성질체를 얻는다. 또한, 거울상 이성질체와 부분입체 이성질체의 분리는 통상적으로 크로마토그래피법으로 완성되고 상기 크로마토그래피법은 키랄고정상이 사용되며 선택적으로 화학적 유도체화법과 결합된다(예하면, 아민으로부터 카르바민산염을 생성).
용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 본 발명의 유효량의 활성물질을 전달하고 활성물질의 생물학적 활성을 방해하지 않으며 숙주 또는 환자에게 있어서 독성과 부작용이 없는 임의의 제제 또는 담체 매개물을 말한다. 대표적인 담체는 물, 오일, 야채 및 미네랄, 크림베이스, 로션베이스, 연고베이스 등이 포함된다. 이런 베이스는 현탁제, 증점제, 경피촉진제 등이 포함된다. 그들의 제형은 화장품 분야 또는 일부 약물 분야의 당업자들에게 잘 알려진 것이다. 담체에 관한 기타 정보는Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2005)를 참조할수 있으며, 해당 문헌의 내용은 인용되는 방식으로 본문에 원용된다.
약학 또는 약리학적 활성제에 있어서, 용어 "유효량" 또는 "치료량"은 독성없이 원하는 효과를 달성할수 있는 약물 또는 약제의 충분한 양을 말한다. 본 발명의 경구투여 제형의 경우, 조성물의 활성물질의 "유효량"은 상기 조성물의 다른 활성물질과 함께 사용시 원하는 효과를 달성하는데 필요한 양을 말한다. 유효량은 사람에 따라 다를수 있으며 수용체의 나이 및 일반적인 상태에 의해 결정되지만 구제적인 활성물질에 의해서도 결정되며, 경우에 따라 당업자가 통상적인 시험에 의해 적합한 유효량을 결정할수 있다.
용어 "활성성분", "치료제", "활성물질" 또는 "활성제"는 표적장애, 질환 또는 병증을 효과적으로 치료할수 있는 화학적 실체를 말한다.
"임의로 선택" 또는 "임의의 선택적인"은 후술하는 사건 또는 상황이 있을수 있으나 필수적으로 나타나는 것은 아니며 상기 사건 또는 상황이 발생되는 경우 및 상기 사건 또는 상황이 발생되지 않는 경우가 포함된다.
용어 "치환된"은 특정된 원자의 임의의 한개 또는 여러개의 수소 원자가 치환기에 의해 치환된 것을 말하며, 중수소와 수소의 변체를 포함하며 특정된 원자의 원자가 상태가 정상적이고 치환된 후의 화합물이 안정적이면 된다. 치환기가 케톤기(즉=O)인 경우, 2개의 수소 원자가 치환된 것을 의미한다. 방향기에는 케톤 치환이 발생하지 않는다. 용어 "치환 또는 비치환된"은 치환될 수도 있고 치환되지 않을수도 있는 것을 의미하고 별도의 규정이 없는 한, 치환기의 종류 및 개수는 화학적으로 실현 가능한 범위내에서 임의일 수 있다.
임의의 변수(예하면 R)가 화합물의 조성 또는 구조에서 한번이상 나타날 경우, 경우에 따라 정의는 독립적이다. 따라서, 예를 들면, 하나의 관능기가 0-2개의 R에 의해 치환되면 상기 관능기는 최고 2개의 R에 의해 치환될 수 있으며 경우에 따라 R는 독립적인 선택사항이 있을수 있다. 또한, 치환기 및/또는 변체의 조합은 이런 조합에 의해 안정적인 화합물이 생성되는 경우에서만 허용된 것이다.
하나의 연결 관능기의 개수가 0일 경우, 예하면 -(CRR)0-인 경우, 상기 연결 관능기가 단일결합인 것을 표시한다.
그중 하나의 변수가 단일결합에서 선택될 경우, 연결되는 2개의 관능기는 직접 연결된 것으로서 예하면 A-L-Z에서 L가 단일결합을 표시하는 경우 상기 구조는 실질상 A-Z이다.
하나의 치환기가 비어있을 경우, 상기 치환기는 존재하지 않는 것을 의미하며, 예하면 A-X에서 X가 비어있을 경우 상기 구조는 실질상 A이다. 하나의 치환기의 결합이 하나의 고리의 2개 원자에 교차 연결될 수 있을 경우, 이런 치환기는 상기 고리의 임의의 원자와 결합될 수 있다. 열거된 치환기에서 어느 원자에 의해 화학식에서 포함되나 구체적으로 언급되지 않은 화합물에 연결될 경우, 이런 치환기는 이들의 임의의 원자에 의해 결합될 수 있다. 치환기 및 /또는 이들의 변체의 조합은 이러한 조합에 의해 안정적인 화합물이 생성되는 경우에만 허용되는 것이다. 예하면, 구조단위
Figure pct00084
또는
Figure pct00085
는 시클로헥실기 또는 시클로헥사디엔에 임의의 자리에서 치환이 일어날수 있는 것을 표시한다.
별도의 규정이 없는 한, 용어 "헤테로"는 헤테로원자 또는 헤테로원자단(즉 헤테로원자가 함유되는 원자단)을 표시하고 탄소(C)와 수소(H)를 제외한 원자 및 이들 헤테로원자가 함유되는 원자단을 포함하며, 예하면 산소(O), 인(P), 질소(N), 유황(S), 실리콘(Si), 게르마늄(Ge), 알루미늄(Al), 붕소(B), -O-、 -S-、 ＝O、 ＝S、 -C(＝O)O-、 -C(＝O)-、 -C(＝S)-、 -S(＝O)、 -S(＝O)2-、
Figure pct00086
및 치환 또는 비치환된 -C(＝O)N(H)-、 -N(H)-、 -C(＝NH)-、 -S(＝O)2N(H)-、 또는 -S(＝O)N(H)-가 포함된다.
별도의 규정이 없는 한, "고리"는 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클로알케닐, 시클로알키닐, 헤테로시클로알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴을 표시한다. 고리는 단일고리, 연결고리(joint ring), 스피로 고리, 융합고리 또는 브리지 고리가 포함된다. 고리의 원자 개수는 통상적으로 고리에 배열되는 원자의 개수로 정의되는 것으로서, 예하면 "5-7원자고리"는 고리로 배열되어 구성되는 원자가 5-7개를 말한다. 별도의 규정이 없는 한, 상기 고리는 1-3개 헤테로 원자를 포함 또는 비포함한다. 따라서, "5-7원자고리"는 예하면 페닐기, 피리디닐기 및 피페리디닐기가 포함된다. 한편, 용어 "5-7원자헤테로시클로알킬고리"는 피리디닐기 및 피페리디닐기를 포함하나 페닐기가 포함되지 않는다. 용어 "고리"는 적어도 하나의 고리가 함유되는 고리 시스템을 더 포함하고 각 "고리"는 상기 정의에 독립적으로 부합된다.
별도의 규정이 없는 한, 용어 "헤테로 고리" 또는 "헤테로시클로기"는 안정적인 헤테로 원자 또는 헤테로 원자단 함유 단일고리, 이중고리 또는 삼중고리를 말하고 이들은 포화되거나 부분적으로 포화되거나 또는 비포화(방향족)일 수 있으며, 탄소원자와 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 N, O 및 S에서 선택되는 시클로헤테로 원자를 포함하며, 상기 임의의 헤테로 고리는 하나의 벤젠고리에 융합되어 이중고리를 형성할 수 있다. 질소 및 유황의 헤테로 원자는 선택적으로 산화될 수 있다(즉 NO 및 S(O)p, p는 1또는 2). 질소원자는 치환 또는 비치환될 수 있다(즉 N 또는 NR, 그중에서 R는 H 또는 본문에서 이미 정의된 다른 치환기임). 상기 헤테로 고리는 임의의 헤테로 원자 또는 탄소원자의 사이드 그룹에 부착되어 안정한 구조를 형성할 수 있다. 생성된 화합물이 안정적일 경우, 본문의 헤테로 고리는 탄소자리 또는 질소자리에서 치환이 일어날 수 있다. 헤테로 고리의 질소원자는 선택적으로 4급 암모니아화된다. 바람직한 실시양태로서, 헤테로 고리에서 S 및 O 원자의 총 개수가 하나를 초과할 경우, 이런 헤테로 원자는 서로 인접되지 않는다. 다른 하난 바람직한 실시양태로서, 헤테로 고리에서 S 및 O원자의 총 개수는 하나를 초과하지 않는다. 본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "방향족 헤테로시클로 관능기" 또는 "헤테로 아릴기"는 안정적인 5, 6, 7원자 단일고리 또는 이중고리 또는 7, 8, 9 또는 10 원자 이중고리 헤테로시클로기의 방향족고리를 말하며, 탄소원자와 1, 2, 3 또는 4개의 독립적으로 N, O 및 S에서 선택되는 시클로헤테로원자가 포함된다. 질소원자는 치환 또는 비치환될 수 있다(즉 N 또는 NR, 그중에서 R는 H 또는 본문에서 이미 정의된 다른 치환기임). 질소 및 유황 헤테로 원자는 선택적으로 산화될 수 있다(즉 NO 및 S(O)p, p는 1또는 2이다). 방향족 헤테로 고리의 S 및 O원자의 총 개수는 하나를 초과하지 않는 것을 유의해야 할 것이다. 브리지 고리도 헤테로 고리의 정의에 포함된다. 한개 또는 여러개의 원자(즉 C, O, N 또는S)에 의해 인접하지 않는 2개의 탄소원자 또는 질소원자가 연결될 경우 브리지 고리가 형성된다. 바람직하게는, 브리지 고리는 1개 탄소원자, 2개 탄소원자, 1개 질소원자, 2개 질소원자 및 1개 탄소-질소기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 1개 브리지는 항상 단일고리를 삼중고리로 전환하는 것을 유의해야 할 것이다. 브리지 고리에서 고리의 치환기 또한 브리지에 나타날수 있다.
헤테로고리화합물의 실시예로서 아크리디닐, 아조시닐, 벤조이미다졸일, 벤조퓨릴, 벤조메캅토퓨릴, 벤조메캅토페닐, 벤조옥사졸일, 벤조옥사졸리닐, 벤조티아졸일, 벤조트리아졸일, 벤조테트라졸일, 벤조이소옥사졸일, 벤조이소티아졸일, 벤조이미다졸리닐, 카바졸일, 4aH-카바졸일, 카르볼리닐, 벤조디히드로피라닐, 크로멘, 신놀릴데카히드로퀴놀리닐, 2H,6H-1,5,2-디티아지닐, 디히드로푸로(2,3-b)테트라히드로퓨릴, 퓨릴, 푸라잔, 이미다졸알킬, 이미다졸리닐, 이미다졸릴, 1H-인다졸일, 인돌알케닐, 인돌린, 인돌리지닐, 인돌일, 3H-인돌일, 이소벤조퓨릴, 이소인돌일, 이소인돌린, 이소퀴놀일, 이소티아졸일, 이소옥사졸일, 메틸렌디옥시페닐, 모르폴리닐, 나프티리디닐, 옥타히드로이소퀴놀리닐, 옥사디아졸일, 1,2,3-옥사디아졸일, 1,2,4-옥사디아졸일, 1,2,5-옥사디아졸일, 1,3,4-옥사디아졸일, 옥사졸리디닐, 옥사졸일, 옥신돌, 피리미디닐, 페난트리디닐, 페난스롤리닐, 페나진, 페노티아진, 벤조잔틴, 페녹사지닐, 프탈라지닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리디논, 4-피페리디논, 피페로닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 피라졸일, 피리다지닐, 피리도옥사졸, 피리도이미다졸, 피리도티아졸, 프리딜, 피롤리디닐, 피롤리닐, 2H-피롤릴, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀리닐, 4H-퀴놀리지닐, 퀴녹살리닐, 퀴누클리디닐, 테트라히드로퓨릴, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 테트라히드로퀴놀일, 테트라졸일, 6H-1,2,5-티아디아지닐, 1,2,3-티아디아졸일, 1,2,4-티아디아졸일, 1,2,5-티아디아졸일, 1,3,4-티아디아졸일, 티안트레닐, 티아졸일, 이소티아졸일티오페닐, 티에노옥사졸일, 티에노티아졸일, 티에노이미다졸일, 티에닐, 트라이아진일, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 1,2,5-트리아졸릴, 1,3,4-트리아졸릴 및 크산테닐을 포함히나 이에 한정되지 않는다. 융합고리 및 스피로고리 화합물을 더 포함한다.
별도의 규정이 없는 한, 용어 "탄화수소기" 또는 그 하위개념(예하면, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴 등) 자체 또는 다른 치환기의 일부분으로서 직쇄적인, 분지쇄적인 또는 고리형상의 탄화수소 원자단 또는 그 조합을 표시하고, 완전 포화(예하면 알킬기)되거나 1가 또는 다가 불포화(예하면 알케닐, 알키닐, 아릴)인 것일 수 있으며, 단일 치환 또는 다중 치환인 것일 수 있으며, 1가(예하면 메틸), 2가(예하면 메틸렌) 또는 다가(예하면 메틴)일 수 있으며, 2가 또는 다가원자단이 포함될 수 있고 지정된 개수의 탄소원자(예하면 C1-C12는 1 내지 12개의 탄소를 표시하고, C1-C12는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 및 C12에서 선택되며; C3-12는 C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11 및 C12에서 선택된다)를 가진다. "탄화수소기"는 지방족탄화수소기 및 방향족 탄화수소기를 포함하나 이에 한정되지 않고 상기 지방족 탄화수소기는 쇄형상 및 고리형상을 포함하며, 구체적으로 알킬, 알케닐, 알키닐을 포함하나 이에 한정되지 않으며 상기 방향족 탄화수소기는 예하면 벤젠, 나프탈렌 등 과 같은 6-12원자방향족 탄화수소기를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서 용어 "탄화수소기"는 직쇄 또는 분지쇄의 원자단 또는 이들의 조합을 표시하고 완전 포화되거나 1가 또는 다가 불포화인 것일 수 있으며, 2가 및 다가 원자단이 포함될 수 있다. 포화탄화수소 원자단의 예로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 이소부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸 및 n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등 원자단의 동족체 또는 이성질체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 불포화 탄화수소기는 1개 또는 여러개 이중 결합 또는 삼중 결합을 구비하고, 실시예로서 비닐, 2-프로페닐, 부테닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에테닐, 1-프로피닐 및 3-프로피닐, 3-부티닐 및 더 고급의 동족체 및 이성질체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
별도의 규정이 없는 한, 용어 "헤테로 탄화수소기" 또는 그 하위개념(예하면 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 헤테로아릴 등) 자체 또는 다른 용어와 함께 안정적인 직쇄, 분지쇄 또는 고리형상의 탄화수소 원자단 또는 그 조합을 표시하고 일정한 개수의 탄소원자와 적어도 하나의 헤테로 원자에 의해 구성된다. 일부분 실시예에서 용어 "헤테로 알킬기" 자체 또는 다른 용어와 함께 안정적인 직쇄, 분지쇄의 탄화수소 원자단 또는 그 조성물을 표시하고, 일정한 개수의 탄소원자와 적어도 하나의 헤테로 원자에 의해 구성된다. 하나의 전형적인 실시예에 있어서, 헤테로원자는 B, O, N 및 S에서 선택되고, 그중에서 질소와 유황원자는 선택적으로 산화되며 질소헤테로원자는 선택적으로 4급화된다. 헤테로원자 또는 헤테로원자단은 헤테로 탄화수소기의 내부에 임의로 위치할수 있으며, 상기 탄화수소기가 분자의 나머지 부분에 부착하여 위치하는 것을 포함하나 용어 "알콕시", "알킬아미노", "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 통상적인 발현에 속한 것으로서 하나의 산소원자, 아미노기 또는 유황원자에 의해 분자의 나머지 부분에 연결되는 알킬 관능기를 말한다. 실시예로서 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2、-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH＝CH-O-CH3, -CH2-CH＝N-OCH3 및 -CH＝CH-N(CH3)-CH3을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 최고로 2개의 헤테로원자가 연속될 수 있으며 예하면 -CH2-NH-OCH3이 있다.
별도의 규정이 없는 한, 용어 "시클로탄화수소기", "헤테로시클로탄화수소기" 또는 그 하위개념(예하면, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클로알케닐, 시클로알키닐, 헤테로시클로알키닐 등) 자체 또는 다른 용어와 함께 각각 고리화된 "탄화수소기", "헤테로탄화수소기"를 표시한다. 또한, 헤테로탄화수소기 또는 헤테로시클로탄화수소기(예하면, 헤테로알킬기, 헤테로시클로알킬기)에 있어서, 헤테로원자는 상기 헤테로고리가 분자 나머지 부분에 부착되는 위치를 차지할수 있다. 시클로탄화수소기의 실시예로서, 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 헤테로시클로기의 비한정적인 실시예로서, 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리디닐), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란인돌-3-일, 테트라히드로티오펜-2-일, 테트라히드로티오펜-3-일, 1-피페라지닐 및 2-피페라지닐이 포함된다.
별도의 규정이 없는 한, 용어 "알킬기"는 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소기를 표시하고, 단일치환(예하면, -CH2F) 또는 다중치환(예하면, -CF3)일 수 있고, 1가(예하면 메틸), 2가(예하면 메틸렌) 또는 다가(예하면 메틴)일 수 있다. 알킬기의 예로서 메틸(Me), 에틸(Et), 프로필(예하면, n-프로필 및 이소프로필), 부틸(예하면, n-부틸, 이소부틸, s-부틸, t-부틸), 펜틸(예하면, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸) 등이 포함된다.
별도의 규정이 없는 한, "알케닐기"는 사슬의 임의의 위치에서 1개 또는 여러개의 탄소-탄소 이중결합을 가지는 알킬기를 말하며 단일치환 또는 다중치환일 수 있고 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 알케닐기의 예로서, 비닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 부타디에닐, 펜타디에닐, 헥사디에닐 등이 포함된다.
별도의 규정이 없는 한, 시클로알킬기는 임의의 안정적인 고리형상 또는 다환탄화수소기를 포함하고, 임의의 탄소원자는 모두 포화된 것이며, 단일치환 또는 다중 치환일 수 있고 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 이런 시클로알킬기의 예로서 시클로프로필, 노르보닐알킬, (2.2.2)디시클로옥탄, (4.4.0)디시클로데칸 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
별도의 규정이 없는 한, 시클로알케닐기는 임의의 안정적인 고리형상 또는 다환탄화수소기를 포함하고, 해당 탄화수소기는 고리의 임의의 위치에서 1개 또는 여러개의 불포화된 탄소-탄소 이중결합을 가지며, 단일치환 또는 다중치환일 수 있고 1가, 2가 또는 다가일 수 있다. 이런 시클로알케닐기의 예로서 시클로펜테닐, 시클로헥세닐 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
별도의 규정이 없는 한, 용어 "할로" 또는 "할로겐" 자체 또는 다른 치환기의 일부분으로서 불소, 염소, 브롬 또는 요드원자를 표시한다. 또한, 용어 "할로알킬"은 단일할로알킬과 다할로알킬을 포함한다. 예하면, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸 및 3-브로모프로필 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 별도의 규정이 없는한 할로겐알킬의 예로서 트리플루오로메틸, 트리클로로메틸, 펜타플루오로에틸 및 펜타클로로에틸을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
"알콕시"는 옥소브리지에 의해 연결되는 특정된 개수의 탄소원자를 가진 상기 알킬기를 표시하고, 별도의 규정이 없는 한, C1-6알콕시기는 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6의 알콕시기를 포함한다. 알콕시기의 예로서, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜틸옥시 및 S-펜틸옥시를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 별도의 규정이 없는 한, 용어 "아릴"은 다가 불포화 방향족 탄화수소 치환기를 표시하고, 단일치환 또는 다중치환일 수 있으며 1가, 2가 또는 다가일 수 있으며, 단일고리 또는 멀티고리(예하면 1 내지 3개 고리이고 그중에서 적어도 1개 고리는 방향족인 것)일 수 있으며 그들은 서로 융합되거나 공유 결합될 수 있다. 용어 "헤테로아릴기"는 1 내지 4개 헤테로원자를 함유하는 아릴(또는 고리)을 말한다. 하나의 대표적인 실시예로서, 헤테로원자는 B, N, O 및 S에서 선택되며 그중에서 질소 및 유황원자는 선택적으로 산화되고 질소원자는 선택적으로 4급화된다. 헤테로아릴기는 헤테로원자에 의해 분자의 나머지 부분에 연결될 수 있다. 아릴기 또는 헤테로아릴기의 비한정적인 실시예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤일, 2-피롤일, 3-피롤일, 3-피라졸일, 2-이미다졸일, 4-이미다졸일, 피라지닐, 2-옥사졸일, 4-옥사졸일, 2-페닐-4-옥사졸일, 5-옥사졸일, 3-이소옥사졸일, 4-이소옥사졸일, 5-이소옥사졸일, 2-티아졸일, 4-티아졸일, 5-티아졸일, 2-퓨릴, 3-퓨릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미디닐, 4-피리미디닐, 5-벤조티아졸일, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌, 1-이소퀴놀일, 5-이소퀴놀일, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀일 및 6-퀴놀일이 포함된다. 상기 임의의 아릴기 및 헤테로아릴기 고리계의 치환기는 하기에서 설명하는 허용 가능한 치환기에서 선택된다.
별도의 설명이 없는 한, 아릴이 다른 용어와 함께 사용될 경우(예하면 아릴옥시, 아릴티오, 아릴알킬) 상기와 같이 정의된 아릴과 헤테로아릴고리를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 아릴이 알킬의 원자단(예하면 벤질, 페닐에틸, 피리딜메틸 등)에 부착되는 것을 포함하고, 그중에서 탄소원자(예하면 메틸렌)가 예하면 산소원자로 이미 대체된 알킬기를 포함하고, 예하면 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸3-(1-나프틸옥시)프로필 등이 있다.
본 발명의 화합물은 당업자에게 숙지된 여러 합성방법에 의해 제조될 수 있고 하기 열거된 구체적인 실시방법, 다른 화학합성 방법과의 결합에 의해 형성된 실시방법 및 당업자에게 숙지된 균등한 대체방법을 포함하고 바람직한 실시예는 본 발명의 실시예를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용매는 시중에서 판매하는 것에 의해 얻을 수 있다. 본 발명에서 하기와 같은 약어를 사용한다: aq는 물을 표시하고; HATU는 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로포스페이트를 표시하고; EDC는 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드염산염을 표시하고; m-CPBA는 3-클로로퍼옥시벤조산을 표시하고; eq는 당량, 등량을 표시하고; CDI는 카르보닐디이미다졸을 표시하고; DCM는 디클로로메탄을 표시하고; PE는 석유에테르를 표시하고; DIAD는 디이소프로필아조디카르복실레이트를 표시하고; DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 표시하고; DMSO는 디메틸술폭사이드를 표시하고; EtOAc는 에틸아세테이트를 표시하고; EtOH는 에탄올을 표시하고; MeOH는 메탄올을 표시하고; CBz는 아민 보호기의 일종으로서 벤질옥시카르보닐을 표시하고; BOC는 아민 보호기의 일종으로서 t-부톡시카르보닐을 표시하고; HOAc는 아세트산을 표시하고; NaCNBH3은 소듐시아노보로하이드라이드를 표시하고; r.t.는 실온을 표시하고; O/N는 밤샘을 표시하고; THF는 테트라히드로퓨란을 표시하고; Boc2O는 디-t-부틸디카보네이트를 표시하고; TFA는 트리플루오로아세테이트를 표시하고; DIPEA는 디이소프로필에틸아민을 표시하고; SOCl2는 염화티오닐을 표시하고; CS2는 이황화탄소를 표시하고; TsOH는 P-톨루엔술폰산을 표시하고; NFSI는 N-플루오로-N-(페닐술포닐)벤젠술폰아미드를 표시하고; NCS는 1-클로로피롤리딘-2,5-디온을 표시하고; n-Bu4NF는 테트라부틸암모늄플루오라이드를 표시하고; iPrOH는 2-프로판올을 표시하고; HCl는 염산을 표시하고, ACN는 아세토니트릴을 표시하고, mp는 융점을 표시하고; LDA는 디이소프로필아미노리튬을 표시하고; NFK는 N-메틸카이누레닌을 표시하고; DPBS는Dulbecco's인산 버퍼를 표시하고; LCMS는 액체 크로마토그래피 질량 분석계를 표시하고; HPLC는 고성능 액체 크로마토그래피를 표시하고; TLC는 박층 크로마토그래피를 표시하고, MS는 질량분석법을 표시하고, ESI는 질량분석법의 검출기의 일종을 표시하고, H NMR는 핵자기공명을 표시하고, CDCl3는 중수소화 클로로폼을 표시하고, CD3OD는 중수소화메탄올을 표시하고, P-gp는 세포막에서 발현되는 배출단백질의 일종으로서 P-당단백질을 표시하고; HEPES는 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진]에탄술폰산을 표시하고; 화합물231과 화합물0231은 동일한 화합물을 표시하고; 화합물117과 화합물0117은 동일한 화합물을 표시하고; 화합물227과 화합물0227은 동일한 화합물을 표시하고; 화합물360은 INCB024360을 표시한다. 화합물은 인위적 또는 ChemDraw®소프트웨어로 명명되고 시중에서 판매되는 화합물은 제공자 목록 명칭을 사용한다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
참조예1: 단편BB-1
Figure pct00087
합성경로:
Figure pct00088
단계1: 화합물 BB-1-2의 합성
BB-1-1(20.00g, 302.76mmol, 19.05mL, 1.00eq)을 물(436.00mL)에 용해시켜 5분간 교반한 후, 반응액을 얼음욕조로 0℃로 냉각시킨 후, 아질산나트륨(22.98g, 333.04mmol, 18.09mL, 1.10eq)을 넣은 후, 염산(6M, 3.53mL, 0.07eq)을 넣는다. 15분뒤에 얼음욕조를 제거하고 25℃에서 반응액을 1.5시간 동안 교반한 후, 한번에 50％의 히드록실아민수용액(60.00g, 908.28mmol, 3.00eq)을 넣고 25℃에서 계속하여 1시간 동안 교반한 후, 환류될 때까지 천천히 가열하여 환류반응을 2시간 시킨 후, 25℃로 천천히 냉각시켜 계속하여 16시간 동안 반응시킨다. 0℃에서 6N의 염산(70mL을 약30분 동안 천천히 적하하여 첨가함)으로 pH＝7.0으로 조절한 다음, 0℃에서 계속하여 1시간 동안 교반하고, 석출된 고체에 대해 감압여과, 수세를 진행하여 감압여과에 의해 얻은 연황색 고체를 수집한다. 얻은 고체를 건조시키지만 정제할 필요는 없다. 최종적으로 연황색 고체산물BB-1-2(38.08g, 수율: 87.89％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 144[M+H]+.
단계2: 화합물 BB-1-3의 합성
BB-1-2(38.08g, 266.11mmol, 1.00eq)를 물(532.00mL)과 아세트산(270.00mL) 및 염산(6M, 133.06mL, 3.00eq)의 혼합액에 용해시킨 후 45℃로 가열하여 용액이 완전히 청정될 때까지(약0.5시간) 교반하고 염화나트륨(46.65g, 798.33mmol, 3.00eq)을 넣고 반응혼합액을 0℃로 냉각시키며 아질산나트륨(17.99g, 260.79mmol, 14.17mL, 0.98eq)(63mL의 물에 용해시킴)을 반응액에 천천히 적하하여 첨가시키고(0.5시간 초과), 그 동안 온도를 0℃로 유지시키며 첨가 완료된 후 0℃에서 계속하여 2시간 동안 교반한다. LCMS 검출에서 원료가 완전히 반응된 것으로 나타났다. 석출된 고체에 대해 감압여과, 수세(6*60mL)를 진행하고, 감압여과에 의해 얻은 고체를 에틸아세테이트(400mL)에 용해시키고 무수황산나트륨으로 건조시켜 여과하며, 여액은 감압증발에 의해 회전증발시키지만 정제할 필요는 없다. 최종적으로 연황색 고체산물BB-1-3(18.83g, 수율: 40.63％, 순도: 93.33％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 163[M+H]+.
단계3: 화합물 BB-1-5의 합성
화합물 BB-1-3(2.00g, 12.30mmol, 1.00eq)을 에틸알코올(25.00mL)에 용해시키고 화합물 BB-1-4(4.67g, 24.60mmol, 2.00eq)를 넣어 반응혼합액을 85℃에서 16시간 동안 반응시키며, 가열된 후 반응액은 점차적으로 갈색으로 변한다. LCMS 검출에서,원료가 완전히 반응되고 필요되는 화합물이 생성된 것으로 나타났다. 반응액을 감압증류를 통해 회전증발시키고 플래시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피법을 사용하여 조품을 분리 정제한다(석유에테르: 에틸아세테이트＝2:1). 옅은 회색의 고체산물 BB-1-5(3.60g, 수율: 88.39％, 순도: 95.46％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 316, 318[M+H]+.
단계4: 화합물 BB-1-6의 합성
화합물 BB-1-5(3.60g, 11.39mmol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(30.00mL)에 용해시키고, 카르복실디이미다졸(2.03g, 12.53mmol, 1.10eq)을 넣어 반응혼합액을 65℃에서 1시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서, 원료가 완전히 반응되었음을 나타냈다. 20mL의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(25mL*3)하여 유기상을 혼합시킨 다음, 1M염산 세척(20mL*2), 염수세척을 진행하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 감압증류를 통해 회전증발시키지만 추가 정제는 하지 않는다. 암회색 고체산물 BB-1-6(3.55g, 수율: 91.11％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 342, 344[M+H]+.
단계5: 화합물 BB-1의 합성
0℃에서 황산(35.00mL)을 과산화수소(41.30g, 364.30mmol, 35.00mL, 30％의 순도, 41.97eq)에 천천히 넣은 다음, 텅스텐산나트륨(2.55g, 8.68mmol, 1.00eq)을 넣고 화합물BB-1-6(2.97g, 8.68mmol, 1.00eq)을 넣은 다음 25℃로 승온시켜 16시간 동안 교반시킨다. LCMS 검출에서, 약 반의 원료가 남아있음을 나타냈다. 250mL의 물을 넣어 희석하고 감압여과하여 얻은 백색 고체를 물로 수세(25mL*3)한 다음, 당해 고체를 에틸아세테이트(200mL)로 용해시키고 무수황산나트륨으로 건조시킨 다음에 여과하여 여액을 감압증류를 통해 회전증발시킨다. 플래시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피법으로 정제(석유에테르 : 에틸아세테이트＝ 10 : 1)하여 연황색 고체산물BB-1(1.29g, 수율: 39.20％, 순도: 98.14％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 372, 374[M+H]+.
참조예2: 단편 BB-2
Figure pct00089
합성경로:
Figure pct00090
단계1: 화합물 BB-2의 합성
화합물 BB-2-1(25.00mg, 328.73umol, 20.00uL, 1.00eq)을 메틸아민(44.39mg, 657.46umol, 2.00eq, 염산염)과 함께 N,N-디메틸포름아미드(1.00mL)에 용해시키고 디이소프로필에틸아민(254.91mg, 1.97mmol, 344.47uL, 6.00eq), HATU(187.49mg, 493.10umol, 1.50eq)을 넣으면 반응액은 무색으로부터 황색으로 변하고, 반응액을 4℃에서 16시간 동안 반응시킨다. TLC검출(석유에테르 : 에틸아세테이트＝ 1 : 1)에 의해, 원료가 완전히 반응되었음을 나타냈다. 반응액에 5mL의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(5mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발하여 조품을 얻었다. 반응 성공 후 연황색 액체산물BB-2(30.00mg, 조품)을 얻었다.
참조예3: 단편 BB-3
Figure pct00091
합성경로:
Figure pct00092
단계1: 화합물 BB-3의 합성
화합물BB-3-1(571.78mg, 4.04mmol, 350.79uL, 1.00eq)을 디클로로메탄(5mL)에 넣은 다음, 0℃에서 t-부탄올(314.42mg, 4.24mmol, 403.10uL, 1.05eq)의 디클로로메탄(8mL)용액을 적하하여 첨가하며 반응액을 0℃에서 1시간 동안 교반한다. 목표산물 BB-3(871.00mg, 조품)의 디클로로메탄용액(13mL)을 직접 다음 단계 반응에 사용한다.
참조예4: 단편 BB-4
Figure pct00093
합성경로:
Figure pct00094
단계1: 화합물 BB-4-2의 합성
화합물 BB-1(1.00g, 2.69mmol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(15.00mL) 및 물(500.00uL)에 용해시키고 화합물 BB-4-1(650.44mg, 4.04mmol, 625.42uL, 1.50eq), 수산화나트륨(118.36mg, 2.96mmol, 1.10eq)을 넣으며 반응액을 25℃에서 16시간 동안 교반한다. LCMS 검출에서, 원료가 완전히 반응되고 필요되는 화합물이 생성된 것으로 나타났다. 5mL의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(5mL*3)한 다음 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시키고 추가 정제는 하지 않으며, 황색 오일 형태의 액체산물BB-4-2(1.73g, 조품)을 얻었다.
단계2: 화합물 BB-4의 합성
화합물 BB-4-2(1.73g, 3.56mmol, 1.00eq)을 디클로로메탄(10.00mL)에 용해시키고, 염산/디옥산(4M, 889.46uL, 1.00eq)을 넣으면 반응액은 황색으로부터 백색의 혼탁상태로 되며, 25℃에서 1시간 동안 반응시켜 백색 고체가 석출되며, LCMS 검출에서, 원료가 완전히 반응되고 하나의 주요한 산물 피크가 생성된 것으로 나타났다. 반응액을 회전증발시켜 조품을 얻고 정제하지 않으며 반응은 성공된다. 백색 고체산물BB-4(1.48g, 조품, 염산염)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 386, 388[M+H]+.
참조예5: 단편 BB-5
Figure pct00095
Figure pct00096
합성경로:
Figure pct00097
단계1: 화합물 BB-5-2의 합성
화합물BB-1(2.50g, 6.72mmol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(20.00mL) 및 물(1.00mL)에 용해시키고 수소탄산나트륨(846.74mg, 10.08mmol, 392.01uL, 1.50eq)을 넣어 혼합액을 14℃에서 16시간 동안 반응시킨다. LCMS의 검출에서, 원료가 완전히 반응되고 하나의 주요한 산물 피크가 생성된 것으로 나타났다. 반응에 20mL의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(30mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시킨다. 플래시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피법으로 정제(석유에테르 : 에틸아세테이트＝4 : 1)한다. 반응 성공 후 백색 고체산물 BB-5-2(3.29g, 수율: 97.47％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 502, 504[M+H]+.
단계2: 화합물 BB-5의 합성
화합물 BB-5-2(4.09g, 8.14mmol, 1.00eq)을 디클로로메탄(30.00mL)에 용해시키고 염산/디옥산(4M, 30.00mL, 14.74eq)을 넣어 반응액을 14℃에서 1시간 동안 반응시킨다. LCMS의 검출에서, 9.4％의 원료가 남아있고 목표화합물이 생성된 것으로 나타났다. 반응액을 직접 감압증류를 통해 회전증발시켜 조품을 얻었다. 반응 성공후, 백색 고체산물BB-5(3.57g, 조품, 염산염)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 402, 404[M+H]+.
참조예6: 단편BB-6
Figure pct00098
합성경로:
Figure pct00099
단계1: 화합물 BB-6-2의 합성
화합물 BB-1(200.00mg, 537.55umol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(4.00mL) 및 물(800.00uL)에 용해시키고 수소탄산나트륨(112.90mg, 1.34mmol, 52.27uL, 2.50eq) 및 화합물 BB-6-1(68.47mg, 645.06umol, 58.52uL, 1.20eq)을 넣어 반응액을 15℃에서 14시간 동안 반응시킨다. 반응액과 30mg양의 다른 한군의 반응액을 혼합 및 농축시키고 테트라히드로퓨란 용매를 제거한 다음, 물5mL을 넣어 희석하고 에틸아세테이트(10mL*3)로 추출한 후 혼합하고 무수황산나트륨으로 유기상을 건조시키고 농축시켜 조품을 얻었다. 조품을 10mL의 에틸아세테이트로 용해시키고 실리카 겔과 혼합하여 자동 칼럼 크로마토그래피로(automatic column chromatography) 분리(석유에테르 : 에틸아세테이트＝ 1 : 0 - 3 : 1)시켜 백색 고체산물 BB-6-2(200.00mg, 수율: 71.90％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 431, 433[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CDCl3)δ7.66(dd, J＝5.77, 2.51Hz, 1H), 7.29-7.39(m, 2H), 4.09(s, 2H), 3.83(s, 3H).
단계2: 화합물 BB-6의 합성
화합물 BB-6-2(100.00mg, 231.92umol, 1.00eq)을 메탄올(2.00mL) 및 물(1.00mL)에 용해시키고 수산화나트륨(37.11mg, 927.68umol, 4.00eq)을 넣어 반응액을 15℃에서 1.5시간 동안 반응시킨다. 반응액을 농축시켜 용매를 제거하고 물5mL을 넣어 희석한 후 에틸아세테이트(5mL*3)로 추출한 다음 혼합 및 농축하여 연황색 오일형태의 액체조품을 얻었다. 조품에 5mL의 디클로로메탄을 넣어 농축하고 용매를 제거하여 백색 고체산물 BB-6(90.00mg, 조품)을 얻어 직접 다음 단계 반응에 사용된다. MS(ESI)m/z: 413, 415[M+Na]+.
참조예7: 단편BB-7
Figure pct00100
합성경로:
Figure pct00101
화합물 BB-1, BB-7-1를 원료로, 참조예4의 단편BB-4의 합성단계1-2를 참조하여 참조예 BB-7을 합성한다. MS(ESI)m/z: 412, 414[M+H]+.
참조예8: 단편BB-8
Figure pct00102
합성경로:
Figure pct00103
화합물BB-1, BB-8-1을 원료로, 참조예4의 단편BB-4의 합성단계1-2를 참조하여 참조예 BB-8를 합성한다. MS(ESI)m/z: 400, 402[M+H]+.
참조예9: 단편BB-9
Figure pct00104
합성경로:
Figure pct00105
화합물BB-1, BB-9-1을 원료로, 참조예4의 단편BB-4의 합성단계1-2를 참조하여 참조예 BB-9를 합성한다. MS(ESI)m/z: 462, 464[M+H]+.
참조예10: 단편BB-10
Figure pct00106
합성경로:
Figure pct00107
화합물 BB-1, BB-10-1을 원료로, 참조예4의 단편BB-4의 합성단계1-2를 참조하여 참조예 BB-10를 합성한다. MS(ESI)m/z: 400, 402[M+H]+.
참조예11: 단편BB-11
Figure pct00108
합성경로:
Figure pct00109
화합물BB-1, BB-11-1을 원료로, 참조예4의 단편BB-4의 합성단계1-2를 참조하여 참조예BB-11를 합성한다. MS(ESI)m/z: 400, 402[M+H]+.
참조예12: 단편BB-12
Figure pct00110
합성경로:
Figure pct00111
단계1: 화합물 BB-12-2의 합성
화합물 BB-1, BB-11-1을 원료로, 참조예4의 단편BB-4의 합성단계1를 참조하여 단편 BB-12-2를 합성한다. MS(ESI)m/z: 534, 536[M+Na]+.
단계2: 화합물BB-12의 합성
화합물BB-12-2(110.00mg, 214.72umol, 1.00eq)을 디클로로메탄(10.00mL)에 용해한 다음, 트리플루오로아세트산(1.54g, 13.51mmol, 1.00mL, 62.90eq)을 상기 반응액에 넣고 25℃의 조건에서 1시간 동안 교반한다. LCMS검출에서, 원료가 완전히 사라지고 원하는 산물이 생성된 것으로 나타났다. 반응액을 약 pH 8-9으로 조절한 다음 100 밀리리터의 디클로로메탄을 넣고 세척(30mL*3)하며 유기상을 무수황산나트륨으로 건조하고 펌프감압에 의해 농축하여 회색 오일형태의 액체산물BB-12(85.00mg, 조품)을 얻고, 추가 정제하지 않고 직접 다음 단계로 진입한다. MS(ESI)m/z: 412, 414[M+H]+.
참조예13: 단편BB-13
Figure pct00112
합성경로:
Figure pct00113
화합물BB-1, BB-13-1을 원료로, 참조예4의 단편BB-4의 합성단계1-2를 참조하여, 참조예BB-13를 합성한다. MS(ESI)m/z: 440, 442[M+H]+.
참조예14: 단편BB-14
Figure pct00114
합성경로:
Figure pct00115
화합물 BB-1, BB-14-1를 원료로, 참조예4의 단편BB-4의 합성단계1-2를 참조하여 참조예 BB-14를 합성한다. MS(ESI)m/z: 412, 414[M+H]+.
참조예15: 단편BB-15
Figure pct00116
합성경로:
Figure pct00117
단계1: 화합물BB-15-2의 합성
화합물 BB-1, BB-15-1을 원료로, 참조예6의 단편BB-6의 합성단계1를 참조하여 단편 BB-15-2을 합성한다. MS(ESI)m/z: 459, 461[M+H]+.
단계2: 화합물BB-15의 합성
화합물BB-15-2(400.00mg, 870.99umol, 1.00eq)을 물(600.00uL) 및 테트라히드로퓨란(1.80mL)에 용해시키고 수산화리튬수화물(73.09mg, 1.74mmol, 2.00eq)을 넣어서 20℃에서 교반하면서 3시간 동안 반응시키면 산물이 생성되는데 양이 아주 적고 계속하여 교반하면서 20시간 동안 반응시킨다. 반응액에 염산(6M)을 넣어 pH를 6-7로 조절하고 회전증발시킨 다음, 메탄올(5mL)을 넣어 여과한 후, 고성능액체크로마토그래피(Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um, water(0.05％HCl)-ACN)로 분리하며 동결건조하여 황색의 고체 목표화합물 BB-15(60.00mg, 수율: 17.00％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 405, 407[M+H]+.
참조예16: 단편BB-16
Figure pct00118
합성경로:
Figure pct00119
화합물 BB-1-3, BB-16-1을 원료로, 참조예1의 단편BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-16을 합성한다. MS(ESI)m/z: 319[M+H]+.
참조예17: 단편BB-17
Figure pct00120
합성경로:
Figure pct00121
화합물 BB-1-3, BB-17-1을 원료로, 참조예1의 단편BB-1의 합성단계3-5, 단편BB-4합성단계1-2를 참조하여 단편BB-17을 합성한다. MS(ESI)m/z: 376[M+H]+.
참조예18: 단편BB-18
Figure pct00122
합성경로:
Figure pct00123
단계1: 화합물BB-18의 합성
화합물BB-1-4(1.00g, 5.26mmol, 1.00eq), 화합물BB-18-1(587.38mg, 6.84mmol, 1.30eq), 인산칼륨(3.91g, 18.41mmol, 3.50eq), 트리페닐포스핀(137.96mg, 526.00umol, 0.10 eq), 팔라듐아세테이트(59.05mg, 263.00umol, 0.05eq)를 톨루엔(24.00mL) 및 물(2.00mL)에 용해시키고 질소의 보호하에 100℃로 가열하여 16시간 동안 반응하며, 가열 후의 반응액은 갈색으로부터 점차적으로 짙은 갈색으로 변한다. LCMS의 검출에 의하면, 원료는 완전히 반응되고 목표화합물이 생성된 것으로 나타났다. 반응액을 23℃로 냉각시키고 20mL의 물을 넣으며 에틸아세테이트로 추출(20mL*3)한 다음 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시키고 플래시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피법으로 정제(석유에테르 : 에틸아세테이트＝ 10 : 1)한다. 반응 성공 후, 황색 액체산물BB-18(790.00mg, 수율: 99.35％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 152[M+H]+.
참조예19: 단편BB-19
Figure pct00124
합성경로:
Figure pct00125
화합물 BB-1-3, BB-18을 원료로, 참조예1의 단편BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-19을 합성한다. MS(ESI)m/z: 334[M+H]+.
참조예20: 단편BB-20
Figure pct00126
합성경로:
Figure pct00127
단계1: 화합물BB-20-2의 합성
0℃에서 화합물BB-3(5.39g, 24.99mmol, 1.00eq)의 디클로로메탄용액(20mL)에 트리에틸아민(7.59g, 75.03mmol, 10.40mL, 3.00eq)을 넣고 0℃에서 30분간 교반하며 화합물BB-20-1(1.60g, 26.13mmol, 1.58mL, 1.05eq)을 넣어 혼합액을 23℃로 승온시켜 16시간 동안 반응시킨다. TLC(석유에테르 : 에틸아세테이트＝1 : 1)검출에서, 원료가 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액에 대해 감압증류를 진행하여 디클로로메탄을 회전증발(rotary evaporation)시켜 1M염산으로pH＝5로 조절하고 에틸아세테이트로 추출(20mL*3)한 후, 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키고 여과하며 여액은 감압증류를 통해 회전증발되고 백색 고체산물BB-20-2(5.44g, 조품)을 얻었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3)δ7.83(s, 1H)5.88(t, 1H)3.73-3.80(t, 2H)3.26(q, 2H)1.48-1.50(m, 9H).
단계2: 화합물BB-20의 합성
화합물BB-20-2(2.00g, 8.32mmol, 1.00eq)을 디클로로메탄(10.00mL)에 용해시키고 염산/디옥산(4M, 10.00mL, 4.81eq)을 넣어 혼합액을 24℃에서 2시간 동안 반응시킨다. TLC(석유에테르 : 에틸아세테이트＝ 1 : 1) 검출에서, 원료가 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액을 직접 감압증류를 통해 회전증발시켜 갈색 액체산물BB-20(1.10g, 조품)을 얻었다. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ6.49(s, 2H)3.81-4.19(s, 1H)3.43-3.52(t, 2H)2.91-2.99(t, 2H).
참조예21: 단편BB-21
Figure pct00128
합성경로:
Figure pct00129
단계1: 화합물BB-21의 합성
화합물BB-21-1(2.00g, 10.47mmol, 1.00eq)을 메탄올(20.00mL)에 용해시킨 다음 10％의 팔라듐 카본(200.00mg)을 넣어 반응액을 25℃에서 15Psi의 수소에서 16시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서, 반응물1이 전부 소모되고 하나의 산물 피크가 생성된 것으로 나타났다. 반응액을 여과하고 여액을 회전증발시켜 황색 오일형태의 산물BB-21(1.60g, 조품)을 얻고 직접 다음 단계 반응에 사용한다. MS(ESI)m/z: 162[M+H]+.
참조예22: 단편BB-22
Figure pct00130
합성경로:
Figure pct00131
화합물 BB-1-3, BB-21을 원료로, 참조예1의 단편BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편BB-22을 합성한다. MS(ESI)m/z: 344[M+H]+.
참조예23: 단편BB-23
Figure pct00132
합성경로:
Figure pct00133
화합물 BB-1-3, BB-23-1을 원료로, 참조예1의 단편BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-23을 합성한다. MS(ESI)m/z: 346[M+H]+.
참조예24: 단편BB-24
Figure pct00134
합성경로:
Figure pct00135
화합물 BB-1-3, BB-24-1을 원료로, 참조예1의 단편BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-24을 합성한다. MS(ESI)m/z: 342[M+H]+.
참조예25: 단편BB-25
Figure pct00136
합성경로:
Figure pct00137
화합물 BB-1-3, BB-25-1을 원료로, 참조예1의 단편 BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-25을 합성한다. MS(ESI)m/z: 344[M+H]+.
참조예26: 단편BB-26
Figure pct00138
합성경로:
Figure pct00139
화합물 BB-1-3, BB-26-1을 원료로, 참조예1의 단편 BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-26을 합성한다. MS(ESI)m/z: 312[M+H]+.
참조예27: 단편BB-27
Figure pct00140
합성경로:
Figure pct00141
화합물 BB-1-3, BB-27-1을 원료로, 참조예1의 단편 BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-27을 합성한다. MS(ESI)m/z: 378[M+H]+.
참조예28: 단편BB-28
Figure pct00142
합성경로:
Figure pct00143
화합물 BB-1-3, BB-28-1을 원료로, 참조예1의 단편 BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-28을 합성한다. MS(ESI)m/z: 390, 392[M+H]+.
참조예29: 단편BB-29
Figure pct00144
합성경로:
Figure pct00145
화합물 BB-1-3, BB-29-1을 원료로, 참조예1의 단편 BB-1의 합성단계3-5를 참조하여 단편 BB-29을 합성한다. MS(ESI)m/z: 328[M+H]+.
참조예30: 단편BB-30
Figure pct00146
합성경로:
Figure pct00147
화합물 BB-17-4, BB-5-1을 원료로, 참조예5의 단편 BB-5의 합성단계1-2를 참조하여 참조예 BB-30를 합성한다. MS(ESI)m/z: 392[M+H]+.
참조예31: 단편BB-31
Figure pct00148
합성경로:
Figure pct00149
단계1: 화합물BB-31-2의 합성
0℃에서 황산(30.00mL)을 과산화수소(35.40g, 312.26mmol, 30.00mL, 30％순도, 27.93eq)에 천천히 넣은 다음 텅스텐산나트륨(3.28g, 11.18mmol, 1.00eq)을 넣고 화합물BB-31-1(1.60g, 11.18mmol, 1.00eq)을 넣은 후, 15℃로 승온하여 3시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서, 1.88％의 원료가 남아 있는 것으로 나타났다. 반응액에 30mL의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(50mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 수세(50mL*3)한 후 포화염화나트륨용액으로 세척(50mL*3)하고 무수황산나트륨으로 건조시키고 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시켜 황색 액체산물BB-31-2(1.40g, 수율: 72.35％, 조품)을 얻었다.1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ4.00-4.02(s, 3H).
단계2: 화합물BB-31-3의 합성
화합물BB-31-2(1.40g, 8.09mmol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(10.00mL) 및 물(1.00mL)에 용해시키고 화합물BB-5-1(1.58g, 8.90mmol, 1.10eq)을 넣고 수소탄산나트륨(1.36g, 16.18mmol, 629.63uL, 2.00eq)을 넣어 혼합액을 15℃에서 2시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서, 원료가 완전히 반응되었음을 나타냈다. 10mL의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(15mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시킨다. 플래시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피법으로 정제(석유에테르 : 에틸아세테이트＝4 : 1)한다. 반응 성공 후, 라이트핑크색 고체산물BB-31-3(2.57g, 수율: 96.28％, 순도: 91.93％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 304[M+H]+.
단계3: 화합물BB-31-4의 합성
화합물BB-31-3(2.57g, 8.47mmol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(10.00mL) 및 물(5.00mL)에 용해시키고 수산화리튬수화물(888.50mg, 21.18mmol, 2.50eq)을 넣어 반응액을 15℃에서 1시간 동안 반응시킨다. LCMS의 검출에서, 원료가 완전히 반응된 것으로 나타났다. 5mL의 물을 넣고 농염산으로 pH＝6이 되도록 조절하며 에틸아세테이트으로 추출(15mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시킨다. 반응 성공 후, 연황색 고체산물BB-31-4(2.70g, 조품)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 290[M+H]+.
단계4: 화합물BB-31-5의 합성
화합물BB-31-4(590.00mg, 2.04mmol, 1.00eq)을 N, N-디메틸포름아미드(10.00mL)에 넣은 다음 화합물BB-33(531.68mg, 2.24mmol, 1.10eq), HATU(930.50mg, 2.45mmol, 1.20eq), 디이소프로필에틸아민(527.13mg, 4.08mmol, 712.33uL, 2.00eq)을 넣어 반응액을 15℃에서 2시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서 반응이 완전히 진행되었음을 타나냈다. 반응액에 1N염산을 넣어 pH값을 5로 조절하고 에틸아세테이트(30mL×2)로 추출한 다음, 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 회전증발시켜 황색 오일형태의 산물BB-31-5(850.00mg, 수율: 81.97％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 531[M+Na]+.
단계5: 화합물BB-31-6의 합성
화합물BB-31-5(100.00mg, 196.73umol, 1.00eq)을 톨루엔(3.00mL)에 넣은 다음 피리딘(147.00mg, 1.86mmol, 150.00uL, 9.45eq), 오염화인(81.93mg, 393.46umol, 2.00eq)을 넣어 반응액을 80℃에서 2시간 동안 반응시킨다. TLC(석유에테르: 에틸아세테이트＝4: 1) 검출에서, 반응물1이 전부 소모되고 주요한 산물 피크가 생성되었음을 나타냈다. 반응액을 회전증발시켜 황색 고체산물BB-31-6(105.00mg, 조품)을 얻었다.
단계6: 화합물BB-31-7의 합성
화합물BB-31-6(100.00mg, 189.84umol, 1.00eq)을 에틸알코올(3.00mL)에 넣고 0℃로 냉각시킨 다음 50％의 히드록실아민수용액(251.03mg, 3.80mmol, 20.02eq)을 넣어 반응액을 0℃에서 2시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서, 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액에 에틸아세테이트(30mL×2)를 넣어 추출한 다음 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 회전증발시켜 황색 오일형태의 조품을 얻었다. 조품은 두꺼운 제조판(preparative plate)으로 분리(에틸아세테이트) 및 정제되어 백색 고체산물BB-31-7(70.00mg, 수율: 64.82％, 순도: 92％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 546[M+Na]+.
단계7: 화합물BB-31-8의 합성
화합물BB-31-7(80.00mg, 152.87umol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(3.00mL)에 넣은 다음 카르복실디이미다졸(27.27mg, 168.16umol, 1.10eq)을 넣어 반응액을 60℃에서 1시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서, 반응이 완료된 것으로 나타났다. 반응액에 에틸아세테이트(50mL)를 넣어 희석하고 포화식염수로 세척(10mL)하며 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 회전증발시켜 황색 고체산물BB-31-8(80.00mg, 조품)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 550[M+H]+.
단계8: 화합물BB-31의 합성
화합물BB-31-8(80.00mg, 145.64umol, 1.00eq)을 디클로로메탄(2.00mL)에 넣은 다음 염산/디옥산(4M, 1.90mL, 52.31eq)에 넣어 반응액을 15℃에서 2시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서 반응이 완료된 것으로 나타났다. 반응액을 회전증발시켜 황색 오일형태의 산물BB-31(71.00mg, 조품, 염산염)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 450[M+H]+.
참조예32: 단편BB-32
Figure pct00150
합성경로:
Figure pct00151
화합물 BB-31-4, BB-32-1을 원료로, 참조예31의 단편BB-31의 합성단계4-8를 참조하여 참조예 BB-32를 합성한다. MS(ESI)m/z: 432[M+H]+.
참조예33: 단편BB-33
Figure pct00152
합성경로:
Figure pct00153
단계1: 화합물BB-33-2의 합성
화합물BB-33-1(1.20g, 7.69mmol, 1.00eq)을 염산(4.00mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시키며 아질산나트륨(583.67mg, 8.46mmol, 459.58uL, 1.10eq)을 2.6mL의 물에 용해시켜 적하하면서 반응액에 넣고 15분간 교반한 다음 혼합액을 천천히 요오드화칼륨(4.47g, 26.92mmol, 3.50eq)의 수용액(16mL)에 넣고 10℃로 승온시키며 16시간 동안 교반한다. TLC(석유에테르 : 에틸아세테이트＝10 : 1) 검출에서, 원료가 완전히 반응되고 목표화합물이 생성되었음을 나타났다. 에틸아세테이트로 희석(30mL)하고 10％의 수산화나트륨으로 세척(25mL*2)하고 5％아황산나트륨으로 세척(25mL*2)한 다음, 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시킨다. 플래시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피법으로 정제(석유에테르 : 에틸아세테이트＝10 : 1)한다. 반응 성공 후, 황색 고체산물 BB-33-2(550.00mg, 수율: 21.22％, 순도: 79.22％)을 얻었다.1H NMR(400MHz, CDCl3)δ8.60(dd, J＝5.3, 2.8Hz, 1H), 8.19(ddd, J＝9.0, 4.3, 2.8Hz, 1H), 7.09-7.17(m, 1H).
단계2: 화합물BB-33의 합성
화합물BB-33-2(1.45g, 5.43mmol, 1.00eq)을 아세트산(10.00mL) 및 에틸알코올(10.00mL)에 용해시키고 철분말(1.52g, 27.15mmol, 5.00eq)을 넣어 반응액을 60℃에서 20분간 반응시킨다. LCMS 검출에서, 원료가 완전이 반응되고 목표화합물이 생성된 것으로 나타났다. 반응액을 여과하고 여액을 감압증류를 통해 회전증발시킨 다음 40mL의 에틸아세테이트에 용해시키고 포화수소탄산나트륨으로 세척(30mL*3)하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시킨다. 플래시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피법으로 정제(석유에테르 : 에틸아세테이트＝4 : 1)한다. 반응 성공 후, 갈색 액체산물BB-33(900.00mg, 수율: 53.92％, 순도: 77.1％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 238[M+H]+.
참조예34: 단편BB-34
Figure pct00154
합성경로:
Figure pct00155
단계1: 단편BB-34의 합성
화합물BB-34-1(293.00mg,2.00mmol,1.00eq,HCl)을 DMF(500.00uL)에 용해시키고 DIEA(258.49mg,2.00mmol,349.31uL,1.00eq)를 넣으며 반응액은 25℃에서 64hr 반응하고 반응액은 점차적으로 백색의 혼탁액으로 변하여 단편BB-34(200.00mg,crude,HCl)의 DMF용액(0.5ml)을 얻었다.
실시예1: 화합물0052
Figure pct00156
합성경로:
Figure pct00157
단계1: 화합물0052의 합성
화합물BB-1-7(300.00mg, 806.32umol, 1.00eq)을 메탄올(4.00mL)에 용해시키고 수산화나트륨(129.01mg, 3.23mmol, 4.00eq)을 물(1.00mL)에 용해시켜 반응액에 넣고 수산화나트륨을 넣으면 반응액은 무색으로부터 황색으로 변하고 고체가 석출되며 계속하여 교반하면 고체는 점차적으로 사라지며, 실온에서 16시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서, 원료가 완전히 반응되고 필요되는 화합물이 생성된 것으로 나타났다. 1M염산으로 pH＝5로 되게 조절하면서 감압증류를 통해 메탄올을 회전하여 회전증발하고 에틸아세테이트로 추출(10mL*3)한 다음 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시키고 메탄올에 용해시켜 여과한다. 여액을 고성능액체크로마토그래피(Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um water(0.05％HCl)-ACN)로 분리시킨다. 산물0052(167.72mg, 수율: 62.82％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 331, 333[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD)δ7.10-7.15(m, 1H), 7.06(t, 1H), 6.77-6.81(m, 1H), 3.95(s, 3H).
실시예2: 화합물0103
Figure pct00158
합성경로:
Figure pct00159
화합물BB-16을 원료로, 실시예1의 화합물0052의 합성단계1를 참조하여 화합물0103을 합성한다. MS(ESI)m/z: 278[M+H]+. 1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ11.69(s, 1H), 9.14(s, 1H), 7.34(t, 1H), 7.23(dd, 1H), 7.07-7.17(m, 1H), 4.00(s, 2H).
실시예3: 화합물0124
Figure pct00160
합성경로:
Figure pct00161
단계1: 화합물0124의 합성
화합물BB-1-7(50.00mg, 134.39umol, 1.00eq)을 물(100.00uL) 및 테트라히드로퓨란(4.00mL)에 넣은 다음 화합물0124-1(23.68mg, 268.78umol, 21.73uL, 2.00eq), 수산화나트륨(21.50mg, 537.56umol, 4.00eq)을 넣고 반응액은 25℃에서 16시간 동안 교반한다. LCMS 검출에서 반응물1이 완전히 소모되고 하나의 주요한 산물 피크가 생성된 것으로 나타났다. 반응액을 6M염산으로 pH값을 5로 조절하고 여과한다. 여액은 고성능액체크로마토그래피(column: Boston Green ODS 150*30 5u; mobile phase: [water(0.05％HCl)-ACN]; B％: 40％-70％, 10min)에 의해 정제하여 산물0124(35.00mg, 수율: 61.48％, 순도: 100％, 염산염)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 387, 389[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ＝7.19-7.11(m, 1H), 7.10-7.01(m, 1H), 6.82-6.72(m, 1H), 5.19-5.09(m, 1H), 3.88-3.63(m, 4H), 2.25-2.13(m, 1H), 1.92-1.81(m, 1H).
실시예3(화합물0124)의 단계1의 합성방법을 참조하여 하기 표의 각 실시예를 합성한다:
Figure pct00162
Figure pct00163
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
실시예34: 0026
Figure pct00169
합성경로:
Figure pct00170
단계1: 화합물0026의 합성
화합물BB-1(100.00mg, 268.77umol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(2.00mL) 및 물(1.00mL)에 용해시킨 다음 수산화나트륨(43.00mg, 1.08mmol, 4.00eq)을 넣고 25℃에서 2시간 동안 교반한다. 반응액을 회전증발시켜 황색 오일형태의 조품을 얻었다. 조품은 고성능액체크로마토그래피(컬럼: Boston Green ODS 150*30 5u, 조건: water(0.05％HCl)-ACN)에 의해 정제하여 산물0026(15.00mg, 수율: 17.60％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 317, 319[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ7.25-7.13(m, 1H), 7.12-6.99(m, 1H), 6.94-6.77(m, 1H).
실시예35: 0077
Figure pct00171
합성경로:
Figure pct00172
단계1: 화합물0077의 합성
화합물0078(20.00mg, 46.27umol, 1.00eq)을 디클로로메탄(500.00uL)에 용해시킨 다음 트리플루오로아세트산(256.69mg, 2.25mmol, 166.68uL, 48.65eq)을 넣고 25℃에서 1시간 동안 교반한다. LCMS의 검출에서 대부분이 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액에 포화수소탄산나트륨을 넣어 pH값을 7로 되게 조절하고 여과하며 여액을 회전증발시켜 조품을 얻었다. 조품을 고성능액체크로마토그래피(water(0.05％ammonia hydroxide v/v)-ACN, 컬럼: DuraShell150*25mm*5um)에 의해 정제하여 산물0077(8.00mg, 수율: 51.16％, 순도: 98.27％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 332, 334[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ7.21-7.15(m, 1H), 7.08-6.97(m, 2H), 6.85-6.79(m, 1H), 6.76-6.67(m, 2H).
실시예36: 0147
Figure pct00173
합성경로:
Figure pct00174
단계1: 화합물0147의 합성
화합물BB-4(560.00mg, 1.33mmol, 1.00eq, 염산)을 메탄올(6.00mL) 및 물(2.00mL)에 용해시킨 다음 수산화나트륨(4M, 1.33mL, 4.00eq)을 넣고 반응액은 25℃에서 16시간 동안 교반한다. LCMS 검출에서 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액에 60mL의 에틸아세테이트를 넣어 희석하고 식염수로 세척(20mL × 2)하며 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 회전증발시켜 조품을 얻었다. 그중의 조품(80.00mg)을 고성능액체크로마토그래피(column: Boston Green ODS150*30 5u; mobile phase: [water(0.05％HCl)-ACN]; B％: 13％-43％, 10min)에 의해 산물0147(60.00mg, 수율: 67.76％, 순도: 99.5％, 염산염)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 360, 362[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ7.23-7.14(m, 1H), 7.11-7.03(m, 1H), 6.88-6.78(m, 1H), 4.60-4.49(m, 2H), 3.42-3.36(m, 2H).
실시예37: 0108
Figure pct00175
합성경로:
Figure pct00176
단계1: 화합물0108의 합성
화합물0147(80.00mg, 222.14umol, 1.00eq)을 디클로로메탄(2.00mL)에 넣은 다음 디이소프로필에틸아민(86.13mg, 666.42umol, 116.39uL, 3.00eq), 염화벤조일(37.47mg, 266.57umol, 30.97uL, 1.20eq)을 넣고 반응액은 25℃에서 16시간 동안 교반한다. LCMS의 검출에서 완전히 반응되었으나 일부 디벤조일기 산물이 있는 것으로 나타났다. 반응액을 회전증발시켜 황색 오일형태의 조품(120.00mg, 조품)을 얻었다. 조품(110.00mg, 193.54umol, 1.00eq)을 메탄올(2.00mL) 및 물(1.00mL)에 넣은 다음 수산화나트륨(23.23mg, 580.63umol, 3.00eq)을 넣고 반응액을 25℃에서 1시간 동안 교반한다. LCMS의 검출에서 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액을 여과한다. 여액을 고성능액체크로마토그래피(Boston Green ODS 150*30 5u, water(0.1％TFA)-ACN)로 분리시켜 산물0108(20.00mg, 수율: 22.26％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 464, 466[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ7.89-7.80(m, 2H), 7.61-7.53(m, 1H), 7.52-7.45(m, 2H), 7.14-7.09(m, 1H), 6.94-6.88(m, 1H), 6.83-6.74(m, 1H), 4.48-4.33(m, 2H), 3.79-3.65(m, 2H).
실시예38: 0015
Figure pct00177
합성경로:
Figure pct00178
단계1: 화합물0015-1의 합성
화합물BB-4(1.48g, 3.50mmol, 1.00eq, 염산)을 디클로로메탄(15mL)에 넣고 디이소프로필에틸아민(452.63mg, 3.50mmol, 611.66uL, 1.00eq)을 넣으면 반응액은 혼탁상태로부터 갈색 청정액으로 변화되고 화합물BB-3(830.25mg, 3.85mmol, 1.10eq)의 디클로로메탄(13mL)용액을 적하하며 첨가하면 반응액은 점차적으로 황색으로 변하고 0℃에서 2시간 동안 교반하면 반응액은 백색의 혼탁형태로 변화되고 LCMS 검출에서 약 40％의 원료가 남아있는 것으로 나타났다. 디이소프로필에틸아민(1.36g, 10.50mmol, 1.83mL, 3.00eq)을 추가해 넣으면 반응액은 갈색의 청정형태로 변화되고 화합물BB-3(830.25mg, 3.85mmol, 1.10eq)을 적하하여 첨가하며 25℃에서 16시간 동안 계속하여 반응한다. TLC(석유에테르 : 에틸아세테이트＝1 : 1) 검출에서 원료가 완전히 반응된 것으로 나타났고, 반응액을 회전증발시켜 황색 오일형태의 액체산물0015-1(2.14g, 조품)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 565, 567[M+H]+.
단계2: 화합물0015-2의 합성
화합물0015-1(2.14g, 3.79mmol, 1.00eq)을 디클로로메탄(10.00mL)에 용해시키고 염산/디옥산(4M, 10.00mL, 10.55eq)을 넣어 25℃에서 1시간 동안 반응시킨다. LCMS의 검출에서 원료가 완전히 반응된 것으로 나타냈고, 반응액을 감압증류를 통해 회전증발시켜 황색 액체산물0015-2(1.78g, 조품)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 465, 467[M+H]+.
단계3: 화합물0015의 합성
화합물0015-2(1.78g, 3.83mmol, 1.00eq)을 메탄올(8.00mL) 및 물(4.00mL)에 용해시키고 수산화나트륨(612.20mg, 15.30mmol, 4.00eq)을 넣어 혼합액을 25℃에서 20시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서 반응이 완료된 것으로 나타났다. 1M염산으로 pH＝5로 조절하며 에틸아세테이트로 추출(15mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시킨 후 메탄올에 용해시켜 여과한다. 여액을 고성능액체크로마토그래피(Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um water(0.05％HCl)-ACN)로 분리시켜 산물0015(532.65mg, 수율: 31.66％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 439, 441[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD)δ7.12-7.18(m, 1H), 7.05-7.11(m, 1H), 6.85(ddd, 1H), 4.36(t, 2H), 3.38(t, 2H).
실시예38(화합물0015)에서 단계1-3의 합성방법을 참조하여 하기 표의 각 실시예에 대해 합성한다:
Figure pct00179
Figure pct00180
실시예51: 0068
Figure pct00181
합성경로:
Figure pct00182
단계1: 화합물0068-1의 합성
화합물BB-1(50.00mg, 134.39umol, 1.00eq)을 물(100.00uL) 및 테트라히드로퓨란(5.00mL)에 용해시킨 다음 소디움티오메톡시드(18.84mg, 268.78umol, 17.13uL, 2.00eq)를 넣고25℃에서 16시간 동안 교반한다. LCMS의 검출에서 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액을 회전증발시켜 황색 오일형태의 산물0068-1(51.00mg, 조품)을 얻고 다음 단계 반응에 직접 사용한다. MS(ESI)m/z: 373, 375[M+H]+.
단계2: 화합물0068의 합성
화합물0068-1(50.00mg, 133.99umol, 1.00eq)을 물(300.00uL) 및 테트라히드로퓨란(2.00mL)에 용해시킨 다음 수산화나트륨(18.76mg, 468.97umol, 17.13uL, 3.50eq)을 넣고 25℃에서 3시간 동안 교반한다. LCMS 검출에서 대부분이 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액에 1M염산을 넣어 pH값을 7로 조절하고 여과하며 여액은 고성능액체크로마토그래피(water(0.05％HCl)-ACN, 컬럼: Boston Green ODS 150*30 5u)에 의해 산물0068(15.00mg, 수율: 32.25％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 347, 349[M+H]+.
1H NMR(400MHz, CD3OD): δ7.08-7.04(m, 2H), 6.78-6.77(m, 1H), 2.62(s, 3H).
실시예52: 0148
Figure pct00183
합성경로:
Figure pct00184
단계1: 화합물0148-2의 합성
화합물 BB-4(50.00mg, 118.32umol, 1.00eq, 염산)을 디클로로메탄(1.00mL)에 용해시키고 디이소프로필에틸아민(45.88mg, 354.96umol, 61.99uL, 3.00eq), 화합물0148-1(15.17mg, 130.15umol, 8.67uL, 1.10eq)을 넣어 혼합액을 23℃에서 2시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서 원료가 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액을 직접 감압증류를 통해 회전증발시켜 무색의 액체산물0148-2(56.00mg, 조품)을 얻었다.
단계2: 화합물0148의 합성
화합물0148-2(56.00mg, 120.12umol, 1.00eq)을 메탄올(1.00mL) 및 물(120.00uL)에 용해시키고 수산화나트륨(28.83mg, 720.72umol, 6.00eq)을 넣으면 반응액은 점차적으로 갈색용액으로 변하며 혼합액을 21℃에서 16시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서 원료가 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응액을 감압증류를 통해 메탄올을 회전하여 제거하고 3mL의 물을 넣고 1M염산으로 pH＝2로 조절하며 에틸아세테이트로 추출(5mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시키고 3mL의 메탄올에 용해시켜 여과하고 여액을 고성능액체크로마토그래피(Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um water(0.05％HCl)-ACN)로 분리시켜 산물0148(15.73mg, 수율: 27.47％, 순도: 100％, 염산염)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 438, 440[M-H]-.
1H NMR(400MHz, CD3OD)δ7.18(dd, 1H), 7.08(t, 1H), 6.81-6.89(m, 1H), 4.56-4.63(m, 2H), 3.55-3.66(m, 2H).
실시예52(화합물0148)의 단계1-2의 합성방법을 참조하여 하기 표의 각 실시예를 합성한다:
Figure pct00185
Figure pct00186
실시예67: 0153
Figure pct00187
합성경로:
Figure pct00188
단계1: 화합물0153-1의 합성
화합물 BB-4(50.00mg, 129.49umol, 1.00eq) 및 포름산(8.94mg, 194.24umol, 7.33uL, 1.50eq)을 N,N-디메틸포름아미드(1.00mL)에 용해시키고 디이소프로필에틸아민(66.94mg, 517.96umol, 90.46uL, 4.00eq), HATU(59.08mg, 155.39umol, 1.20eq)을 넣어 반응혼합액을 20℃에서 16시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서 원료가 완전히 반응되고 목표화합물이 생성된 것으로 나타났다. 5mL의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(5mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시켜 연황색 액체산물0153-1(55.00mg, 조품)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 414, 416[M+H]+.
단계2: 화합물0153의 합성
화합물0153-1(55.00mg, 132.81umol, 1.00eq)을 메탄올(1.00mL) 및 물(200.00uL)에 용해시키고 수산화나트륨(21.25mg, 531.22umol, 4.00eq)을 넣어 혼합액을 21℃에서 16시간 동안 반응시킨다. LCMS의 검출에서 원료가 완전히 반응되고 목표화합물이 생성되는 것으로 나타났다. 감압증류를 통해 메탄올을 회전하여 제거하고 1M염산으로 pH＝2로 조절하며 에틸아세테이트로 추출(5mL*3)한 다음 유기상을 혼합하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 감압증류를 통해 회전증발시키고 3mL의 메탄올에 용해시켜 여과한다. 여액을 고성능액체크로마토그래피(Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um water(0.05％HCl)-ACN)로 분리시켜 산물0153(40.09mg, 수율: 71.09％, 순도: 100％, 염산염)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 388, 390[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD)δ8.12(s, 1H), 7.34(dd, 1H), 7.09-7.19(m, 1H), 6.86-7.02(m, 1H), 4.27(t, 2H), 3.54(t, 2H).
실시예67(화합물0153)의 단계1-2의 합성방법을 참조하여 하기 표의 각 실시예를 합성한다:
Figure pct00189
실시예67(화합물0153)의 단계1의 합성방법을 참조하여 하기 표의 각 실시예를 합성한다:
Figure pct00190
Figure pct00191
실시예80: 0251
Figure pct00192
합성경로:
Figure pct00193
단계1: 화합물0251의 합성
메탄올/암모니아용액(5.00mL, 4M)을 측정된 화합물BB-6-2(50.00mg, 115.96umol, 1.00eq)이 있는 플라스크에 넣고 25℃에서 교반하여 3시간 동안 반응시킨다. 그중에 메탄올(2mL)을 넣고 여과한 다음 고성능액체크로마토그래피(Kromasil150*25mm*10um, water(0.05％ammonia hydroxide v/v)-ACN)로 분리시켜 산물0251(24.50mg, 수율: 54.15％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 390, 392[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ7.13(dd, J＝2.6, 5.9Hz, 1H), 7.05(t, J＝8.7Hz, 1H), 6.81(ddd, J＝2.6, 4.0, 8.9Hz, 1H), 3.96(s, 2H).
실시예81: 0262
Figure pct00194
합성경로:
Figure pct00195
단계1: 화합물0262의 합성
화합물BB-15-2(180.00mg, 392.79umol, 1.00eq)을 넣은 플라스크에 메탄올/암모니아용액(13.00mL)(4M)을 넣어 15℃에서 교반하면서 6시간 동안 반응시켰다. 이때, 생성된 산물은 없었고, 계속하여 교반하면서 20시간 동안 반응시켰다. 이때, 산물이 생성되었으며 계속하여 20시간 반응시켰다. 20℃에서 회전 증발을 통해 절반 용매를 제거하고 여과하며 고성능액체크로마토그래피(DuraShell150*25mm*5um, water(0.05％HCl)-ACN)로 분리시켜 산물0262(15.85mg, 수율: 9.98％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 404, 406[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ7.10(dd, J＝2.6, 5.9Hz, 1H), 7.05(t, J＝8.7Hz, 1H), 6.77(ddd, J＝2.8, 4.0, 8.8Hz, 1H), 3.40(t, J＝6.9Hz, 2H), 2.74(t, J＝6.9Hz, 2H).
실시예82: 0231
Figure pct00196
합성경로:
Figure pct00197
단계1: 화합물0231-1의 합성
화합물BB-5(50.00mg, 113.98umol, 1.00eq, 염산염) 및 시안산칼륨(9.25mg, 113.98umol, 1.00eq)을 물(2.00mL)에 용해시키고 온도를 100℃로 승온시켜 2시간 동안 반응시킨다. 반응액에 물(5mL)을 넣고 에틸아세테이트(5mL*3)를 넣어 추출한 다음 유기상을 혼합시킨 후 무수황산나트륨으로 건조시키며 회전증발시켜 연황색 오일형태의 산물0231-1(50.00mg, 조품)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 445, 447[M+H]+.
단계2: 화합물0231의 합성
화합물0231-1(50.00mg, 112.30umol, 1.00eq)을 메탄올(1.50mL) 및 물(1.00mL)에 용해시키고 수산화나트륨(17.97mg, 449.20umol, 4.00eq)을 넣어 20℃에서 교반하면서 1.5시간 동안 반응시킨다. 반응액에 염산(6M)을 넣어 pH를 6-7로 조절하고 메탄올(2mL)을 넣어 여과하며 여액을 고성능액체크로마토그래피(Phenomenex Synergi C18150*30mm*4um, water(0.05％HCl)-ACN)로 분리시켜 산물0231(23.00mg, 수율: 48.51％, 순도: 99.3％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 419, 421[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ7.11(dd, J＝2.8, 6.0Hz, 1H), 7.06(t, J＝8.7Hz, 1H), 6.79(ddd, J＝2.8, 4.0, 8.8Hz, 1H), 3.59(t, J＝6.4Hz, 3H), 3.36(br.s., 1H).
실시예83: 0309
Figure pct00198
합성경로:
Figure pct00199
화합물 BB-32을 원료로 실시예82의 화합물0231의 합성단계1-2를 참조하여 화합물0309을 합성한다. MS(ESI)m/z: 471[M+Na]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD)δ7.33(d, 1H), 7.18(t, 1H), 6.95(t, 1H), 6.75(dd, 1H), 3.51(t, 2H), 3.26-3.31(t, 2H).
실시예84: 0239
Figure pct00200
합성경로:
Figure pct00201
단계1: 화합물0239의 합성
화합물0117(40.00mg, 87.86umol, 1.00eq)을 디클로로메탄(1.00mL)에 용해시키고 m-클로로퍼옥시벤조산 (27.57mg, 87.86umol, 순도: 55％, 1.00eq)을 넣어 반응액을 10℃에서 1시간 동안 반응시킨다. LCMS 검출에서 원료가 완전히 반응되고 목표화합물이 생성된 것으로 나타났다. 3mL의 메탄올을 넣고 반응액을 여과한다. 여액을 고성능액체크로마토그래피(Phenomenex Synergi C18 150*30mm*4um water(0.05％HCl)-ACN)로 분리시켜 산물0239(11.57mg, 수율: 25.94％, 순도: 100％, 염산염)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 471, 473[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD)δ7.27(d, 1H), 7.09(t, 1H), 6.96(d, 1H), 3.73-3.85(m, 1H), 3.53-3.71(m, 3H).
실시예85: 0069
Figure pct00202
합성경로:
Figure pct00203
단계1: 화합물0069-2의 합성
화합물0069-1(2.50g, 19.37mmol, 1.00eq)을 N, N-디메틸포름아미드(60.00mL)에 용해시키고 순차적으로 화합물BB-1-4(3.68g, 19.37mmol, 1.00eq), HATU(8.84g, 23.24mmol, 1.20eq) 및 디이소프로필에틸아민(5.01g, 38.74mmol, 6.77mL, 2.00eq)을 넣어 반응액을 25℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응액은 황색으로 변화된다. LCMS 검출에서 완전히 반응된 것으로 나타났다. 반응물에 240mL의 물을 넣고 여과하며 여과 케이크는 물로 세척(20mL*3)하고 자연적으로 건조시켜 회색 고체산물0069-2(5.50g, 수율: 92.43％, 순도: 98％)을 얻었다. 이를 직접 다음 단계 반응에 사용한다. MS(ESI)m/z: 301, 303[M+H]+.
단계2: 화합물0069-3의 합성
0℃에서 황산(9.00mL)을 과산화수소(10.62g, 93.64mmol, 9.00mL, 순도: 30％, 56.41eq)에 천천히 넣은 다음 텅스텐산나트륨(487.96mg, 1.66mmol, 1.00eq)을 넣고 화합물0069-2(500.00mg, 1.66mmol, 1.00eq)을 넣은 후 25℃로 승온시켜 16시간 동안 교반한다. LCMS 검출에서 반응이 완료된 것으로 나타났다. 반응액에 20mL의 물을 넣고 희석하고 여과하며 여과 케이크를 회전증발시켜 백색 고체산물0069-3(520.00mg, 수율: 89.89％, 순도: 95％)을 얻었다. 이를 직접 다음 단계 반응에 사용한다. MS(ESI)m/z: 331, 333[M+H]+.
단계3: 화합물0069-4의 합성
화합물0069-3(500.00mg, 1.51mmol, 1.00eq)을 테트라히드로퓨란(5.00mL), 물(100.00uL) 및 메탄올(1.00mL)에 용해시킨 다음 수산화나트륨(84.58mg, 2.11mmol, 1.40eq)을 넣는다. 그리고 25℃에서 16시간 동안 교반시킨다. LCMS 검출에서 대부분이 반응 완료된 것으로 나타났다. 반응액에 1N염산을 넣어 pH값을 7로 조절하고 반응액에 50mL의 에틸아세테이트를 넣어 희석하고 포화식염수로 세척(10mL × 3)하며 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과한 다음 여액을 회전증발시켜 황색 고체산물0069-4(430.00mg, 조품)을 얻었다. 이를 직접 다음 단계 반응에 사용한다. MS(ESI)m/z: 316, 318[M+H]+.
단계4: 화합물0069-5의 합성
화합물0069-4(200.00mg, 632.75umol, 1.00eq)을 톨루엔(2.00mL)에 용해시킨 다음 Lawesson시약(511.86mg, 1.27mmol, 2.00eq)을 넣고 90℃에서 16시간 동안 교반한다. LCMS 검출에서 대부분이 반응 완료된 것으로 나타났다. 반응액을 회전증발시켜 조품을 얻었다. 조품을 플래시칼럼크로마토그래피로 분리시켜 (석유에테르에 에틸아세테이트가 0-40％ 포함됨) 붉은색 고체산물0069-5(120.00mg, 수율: 51.96％, 순도: 91％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 332, 334[M+H]+.
단계5: 화합물0069-6의 합성
화합물0069-5(150.00mg, 451.60umol, 1.00eq)을 디클로로메탄(3.00mL)에 용해시킨 다음 디이소프로필에틸아민(175.09mg, 1.35mmol, 236.61uL, 3.00eq)을 넣고 메틸트리플루오로메탄술포네이트 (111.16mg, 677.40umol, 74.11uL, 1.50eq)를 적하하여 25℃에서 3시간 동안 교반한다. TLC(석유에테르 : 에틸아세테이트＝3 : 1) 검출에서 반응이 완료된 것으로 나타났다. 반응액을 회전증발시켜 조품을 얻었다. 조품을 플래시칼럼크로마토그래피로 분리시켜( 석유에테르에 에틸아세테이트가 0-40％ 포함됨)황색 오일형태산물0069-6(130.00mg, 수율: 82.82％, 순도: 99.6％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 346, 348[M+H]+.
단계6: 화합물0069의 합성
화합물0069-6(100.00mg, 288.87umol, 1.00eq)을 에틸알코올(3.00mL)에 용해시킨 다음 디이소프로필에틸아민(112.00mg, 866.60umol, 151.35uL, 3.00eq)을 넣고 시안아미드(36.43mg, 866.60umol, 36.43uL, 3.00eq)를 넣으며 마이크로파 와이어로 전이시키고 100℃에서 1시간 동안 마이크로파 반응시킨다. LCMS 검출에서 완전히 반응되고 주요한 산물 피크가 생성한 것으로 나타났다. 여과하고 여액을 회전증발시켜 조품을 얻었다. 조품을 고성능액상크로마토그래피(water(0.05％HCl)-ACN, Boston Green ODS 150*30 5u)로 정제하여 산물0069(18.00mg, 수율: 18.32％, 순도: 100％)을 얻었다. MS(ESI)m/z: 340, 342[M+H]+. 1H NMR(400MHz, CD3OD): δ＝8.22-7.98(m, 1H), 7.82-7.62(m, 1H), 7.43-7.26(m, 1H), 4.25(br.s., 3H).
실시예85: 화합물0310
Figure pct00204
합성경로:
Figure pct00205
단계1: 화합물0310-1의 합성
단편 BB-5(100.00mg, 227.97umol, 1.00eq, HCl)을 소디움디시안아미드(60.89mg, 683.91umol, 3.00eq)과 함께 DMF(2.00mL)에 용해시키고 HCl(2M, 115.12uL, 1.01eq)을 넣어 반응액을 110℃로 가열하여 2hr 반응시킨다. 반응액에 8ml의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(8ml*3)한 다음 유기상을 혼합시킨 후 염수로 세척(20ml*3)하고 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과하고 여액을 감압증류를 통해 회전증발시켜 화합물0310-1을 얻었다. MS(ESI)m/z: 469.0, 471.0[M+H]+.
단계2: 화합물0310의 합성
화합물0310-1(106.00mg, 225.89umol, 1.00eq)을 MeOH(1.00mL) 및H2O(500.00uL)에 용해시키고 NaOH(36.14mg, 903.56umol, 4.00eq)를 넣어 반응액을 22℃에서 2hr 동안 반응시킨다. 반응액을 여과하고 여액을 Pre-HPLC(Kromasil 150*25mm*10um water(0.05％ammonia hydroxide v/v)-ACN)로 분리하고 정제시켜 화합물0310을 얻었다. MS(ESI)m/z:464.9, 466.9[M+Na]+ 1HNMR(400MHz,MeOD):δ＝7.01-7.14(m, 2H), 6.77(ddd, 1H), 3.51-3.66(m, 2H), 3.28-3.32(m, 2H).
실시예86: 화합물0383
Figure pct00206
합성경로:
Figure pct00207
단계1: 화합물0383-2의 합성
단편BB-5(50.00mg, 113.98umol, 1.00eq, HCl)을 DMF(1.00mL)에 용해시키고 DIEA(103.12mg, 797.86umol, 139.35uL, 7.00eq)를 넣은 다음 화합물0383-1(33.41mg, 227.96umol, 2.00eq)을 넣어 반응액을 23℃에서 2hr 동안 반응시킨다. 5ml의 물을 넣고 에틸아세테이트로 추출(5ml*3)한 다음 유기상을 혼합시킨 후 무수황산나트륨으로 건조시키며 여과하고 여액을 감압증류를 통해 회전증발시켜 화합물0383-2를 얻었다. MS(ESI)m/z: 444.0, 446.0[M+H]+
단계2: 화합물0383의 합성
화합물0383-2(100.00mg, 225.10umol, 1.00eq)을 THF(1.00mL) 및 H2O(500.00uL)에 용해시키고 NaOH(18.01mg, 450.20umol, 2.00eq)를 넣어 반응액을 25℃에서 1hr 동안 반응시킨다. 농염산으로 pH＝5로 조절하고 3ml의 메탄올을 넣고 여과하며 여액을 pre-HPLC(YMC-Actus Triart C18 150*30 5u water(0.05％HCl)-ACN)로 분리하고 정제시켜 화합물0383을 얻었다. MS(ESI)m/z:417.9, 419.9[M+H]+1H NMR(400MHz, MeOD):δ＝7.13-7.03(m, 2H), 6.85-6.73(m, 1H), 3.70-3.54(m, 2H), 3.45-3.35(m, 2H).
실시예87: 화합물0384
Figure pct00208
합성경로:
Figure pct00209
단계1: 화합물0384-1의 합성
단편BB-5(50.00mg, 113.98umol, 1.00eq, HCl)을 CH3CN(1.00mL)에 용해시키고 DIEA(58.92mg, 455.92umol, 79.63uL, 4.00eq)를 넣은 다음 단편BB-34(107.49mg, 569.90umol, 5.00eq, HCl)의 DMF용액(0.25ml)을 넣어 반응액을 20℃에서 64hr 동안 반응시킨다. 반응액을 직접 감압증류를 통해 회전증발시켜 화합물0384-1을 얻었다. MS(ESI)m/z:485.9, 487.9[M+H]+.
단계2: 화합물0384의 합성
화합물0384-1(55.00mg, 113.10umol, 1.00eq)을 THF(1.00mL) 및 H2O(500.00uL)에 용해시키고 NaOH(36.19mg, 904.80umol, 8.00eq)를 넣어 반응액을 20℃에서 1hr동안 반응시킨다. 농염산으로 pH＝6로 조절하고 3ml의 메탄올을 넣고 여과한다. 여액을 pre-HPLC(YMC-Actus Triart C18 150*30 5u water(0.05％HCl)-ACN)로 분리하고 정제시켜 화합물0384을 얻었다. MS(ESI)m/z:460.0, 462.0[M+H]+ 1H NMR(400MHz, MeOD):δ＝7.13-7.04(m, 2H), 6.85-6.77(m, 1H), 3.80(t, J＝6.8Hz, 2H), 3.49(br t, J＝6.5Hz, 2H).
시험예1: 생물활성에 대한 테스트
ㄱ、hIDO1 체외 활성에 대한 테스트
1、hIDO1 체외 효소활성에 대한 테스트
1.1 실험목적:
NFK greenTM 형광분자로 IDO1효소대사산물인 NFK생성의 변화를 검출한다. 화합물의 IC50값을 지표(index)로, 재조합 인간 유래 IDO1효소에 대한 화합물의 억제작용을 평가한다.
1.2 실험재료:
NFK greenTM시약, Netherlands Translational research center
IDO1효소활성검출키트, NTRC#NTRC-hIDO-10K
384웰 효소반응플레이트, PerkinElmer#6007279
384웰 화합물플레이트, Greiner#781280
마이크로플레이트 실러, PerkinElmer#6050185
Envision 멀티모드 플레이트 판독기, PerkinElmer
Bravo 자동화된 액체성 핸들링 플랫폼, Agilent
1.3 실험단계 및 방법:
1.3.1 화합물 샘플 첨가:
디메틸술폭사이드(DMSO)로 화합물을 1mM로 희석하고, 3배로 희석한 다음, 10개 구배인 2-웰을 사용한다. Bravo 자동화된 액체성 핸들링 플랫폼을 통해 pH6.5인 48μL 50mM의 인산염 버퍼를 화합물 플레이트에 전이시킨다. 다음 2μL의 희석된 화합물 DMSO용액을 균일하게 혼합시킨 후, 10μL를 취해 효소반응플레이트에 전이한다.
1.3.2 IDO1효소활성검출실험:
반응버퍼(50mM 인산염 버퍼 pH6.5, 0.1％Tween-20, 2％글리세롤, 20mM 아스코르브산, 20μg/ml카탈라아제 및 20μM메틸렌블루)에 IDO1효소를 20nM로 희석한 후, 20μL를 취해 효소반응플레이트에 전이시켜 23℃에서 30분간 배양한다. 10μL인 400μM L형 트립토판 기질을 넣고 반응을 시작하며 23℃에서 90분간 배양한다. 10μL NFK greenTM형광염료를 넣고 마이크로플레이트 실러로 봉한 후, 37℃에 방치하여 4시간 배양한 후, Envision 멀티모드 플레이트 판독기로 수치를 판독한다(Ex 400nm/Em 510nm).
1.3.3 데이터분석:
IDO1효소를 넣고 화합물을 넣지 않은 참조홀을 0％억제율로 정하고, IDO1효소를 넣지 않은 참조홀을 100％억제율로 정하며, XLFit 5로 데이터에 대해 분석하여 화합물의 IC50값을 산출한다. 그 테스트 결과는 하기 표1에 표시된 바와 같다.
2、hIDO1세포학 활성에 대한 테스트
2.1 실험목적:
LCMS방법으로 Hela세포 카이누레닌의 변화를 검출한다. 화합물의 IC50값을 지표(index)로, IDO1효소에 대한 화합물의 억제작용을 평가한다.
2.2 실험재료:
셀 라인: Hela세포
배지: RPMI 1640페놀을 함유하지 않은 레드, Invitrogen#11835030
10％소태아혈청, Gibco#10099141
1X 페니실린/스트렙토마이신, Gibco#15140-122
침전제: 4μM L-카이누레닌-d4를 100％아세토니트릴에 용해시킴, CacheSyn#CSTK008002
판크레아틴, Invitrogen#25200-072
DPBS, Hyclone#SH30028.01B
재조합 인간유래 γ형 인터페론, Invitrogen#PHC4033
5％(w/v)트리클로로아세트산, Alfa Aesar#A11156
96웰 세포플레이트, Corning#3357
96웰 화합물플레이트, Greiner#781280
96웰 V베이스플레이트, Axygen#WIPP02280
CO2 인큐베이터, Thermo#371
원심분리기, Eppendorf#5810R
Vi-cell세포계수기, Beckman Coulter
2.3 실험절차 및 방법:
2.3.1 Hela세포의 접종:
37℃에서 수욕으로 배지, 판크레아틴、DPBS에 대해 예열한다. 세포배양의 배지를 흡수제거하고 10mL DPBS로 세척하며; 예열된 판크레아틴을 배양플라스크에 넣고, 판크레아틴이 균일하게 배양플라스크를 피복하도록 배양플라스크를 회전하며, 37℃、5％CO2 인큐베이터에 방치하여 1-2분간 소화한다. 10-15mL배지로 각 T150 세포에 대해 현탁하고 800rpm로 5분간 원심분리하며, 10mL배지로 세포에 대해 재현탁하고 1mL세포 재현탁액을 흡수하여, Vi-cell로 수량을 계측한다. 배지로 Hela세포를 5Х105/mL으로 희석한 후, 80μL를 취해 96웰 세포플레이트에 놓고 5％CO2 인큐베이터를 사용하여 37℃로 5-6시간 배양한다.
2.3.2 화합물 샘플의 첨가:
DMSO로 화합물을 1mM로 희석하고 3배로 희석한 다음, 9개 구배인 2-웰을 사용한다. 희석된 화합물 DMSO용액 5μL을 95μL 배지 함유 화합물플레이트에 투여한다. 균일하게 혼합시킨 후, 10μL를 취해 세포플레이트에 전이시킨다.
1)세포학활성에 대한 테스트:
10μL의 재조합 인간 유래 γ형 인터페론을 최종농도가 100ng/ml 되도록 투여하여 IDO1의 발현을 유도한다. 5％CO2 인큐베이터 내에 방치하여 37℃에서 20시간 배양한다. 4μL의 5％(w/v)트리클로로아세트산을 투여하여 균일하게 혼합시킨 후, 50℃에서 30분간 배양한다. 2400rpm로 10분간 원심분리하고 40μL의 상청액을 96웰 V베이스플레이트에 투여하고 침전제를 추가한다. 균일하게 혼합시킨 후, 4000rpm로 10분간 원심분리한다. 100μL의 상청액을 새로운 96웰 V베이스플레이트에 전이시키고 LCMS로 카이누레닌의 함량을 검출한다.
2)데이터 분석:
γ형 인터페론을 넣고 화합물을 넣지 않은 참조홀을 0％억제율로 정하고, Hela세포를 넣지 않은 참조홀을 100％억제율로 정하며, XLFit 5로 데이터에 대해 분석하여 화합물의 IC50값을 산출한다. 그 테스트 결과는 하기 표1에 표시된 바와 같다:
표 1: 본 발명의 화합물 체외 스크리닝 시험 결과
Figure pct00210
Figure pct00211
결론: 본 발명의 화합물의 체외활성은 우수하다.
ㄴ、열역학 용해도에 대한 측정
1、열역학 용해도 용액
버퍼A(pH 2.0): 50mM 인산염 버퍼, pH값은 2.0임.
버퍼B(pH 7.4): 50mM 인산염 버퍼, pH값은 7.4임.
2、표준용액의 제조
50％의 아세토니트릴용액 및 50％의 버퍼(A,B)를 혼합하여 희석용액을 얻는다. 10mM(20μL/ 화합물)스톡 용액을 아세토니트릴(480μL/화합물)에 넣고 버퍼(A,B)(500μL/화합물)와 혼합시켜 200μM의 UV검출표준용액을 만든다. 10배 또는 200배 양의 희석액으로 200μM의 UV검출표준용액을 희석하여 20Mm, 1μM의 UV검출표준용액을 얻는다. 1, 20 및 200 Mm의 UV검출표준용액을 열역학용해성 테스트의 표준샘플로 한다.
3、방법
3.1 샘플의 제조, 셰이킹 및 여과
적어도 2 mg 샘플 분말을 측정하여 Whatman miniuniprep의 병에 넣는다. 여러 버퍼(A,B)에서의 샘플열역학용해도 테스트가 필요할 경우, 각 테스트에 별도로 병을 하나씩 준비할 필요가 있다. 450μL의 버퍼(A,B)를 각각 Whatman miniuniprep병에 첨가한다. 버퍼를 첨가한 후, Whatman miniuniprep의 여과기능이 있는 피스톤 캡을 장착하고 액면 상부까지 가압하여 셰이킹과정에 여과메쉬가 버퍼(A,B)에 접촉되도록 한다. 용해도 샘플에 대해 1분간 볼텍스 셰이킹시킨다. 그리고 용액현상에 대해 기록한다. 600rpm/ 분의 속도로 실온(약22-25℃)에서 24시간 셰이킹한다. Whatman Miniunipreps여과병캡을 저부까지 가압하여 용해도 샘플용액의 여액을 얻는다. 모든 샘플병에 대해 여과전후의 불용물질 및 누출현을 측정한다. 버퍼(A,B)를 50배로 희석하여 샘플 희석액을 얻는다.
3.2 검출 및 분석
저농도로부터 고농도로의 순서로 3개의 UV표준용액을 HPLC에 주입한 다음 측정대기 화합물의 희석액 및 상청액을 주입한다. 측정대기 샘플을 일식이부 준비한다. UV크로마토그래피 피크에 대해 적분한다. 표준곡선을 시물레이션하고 샘플의 열역학 용해도를 산출하며 결과는 표2에 표시된 바와 같다. HPLC조건은 하기와 같다:
시험방법: HPLC-UV 검출
기기: Agilent 1200
이동상: A:물+0.69％TFA; B: 아세토니트릴+0.62％TFA
크로마토그래피 컬럼: Agilent TC C18(2.1×50mm,4.6μm)
비율:
Figure pct00212
본 발명 화합물의 용해도
화합물 열역학용해도
(pH: 2.0)		 열역학용해도
(pH: 7.4)
360 65 160
0015 138 298
0117 2616 2607
0231 155 125
결론: 본 발명의 화합물 용해도는 우수하다.
ㄷ、삼투성에 대한 테스트
1、삼투성MDR1에 대한 테스트
1.1 스톡 용액의 제조
테스트용 화합물을 디메틸술폭사이드(DMSO) 또는 다른 적합한 용매에 용해시켜 10mM스톡 용액으로 제조한다. 적당한 내부표준(internal standard,IS)을 아세토니트릴(acetonitrile,ACN) 또는 다른 유기용매에 용해시켜 정지액으로 하고 구체적인 정보는 연구보고에서 설명한다.
페노테롤(페노테롤), 프로프라놀롤(프로프라놀롤) 및 디곡신(디곡신)은 본 연구에서 각각 저삼투압대조물, 고삼투압대조물 및 P-gp기질로 한다. 이런 화합물의 스톡 용액은 DMSO로 제조되고 2-8℃에서 저장되며 3개월내 사용해야만 효과적이다.
1.2 투여액 및 접수액의 제조
본 고안은 10mM HEPES을 함유하는 Hank's평형염액 버퍼를 운반버퍼로 한다. 투여액 및 접수액의 제조방법은 하기 표3에 표시된 바와 같다.
투여액 및 접수액의 제조방법
용액명칭 조성성분 pH DMSO
최종농도
상단 및 기저단 투여액 운반버퍼로 농도가 2μM인 샘플 또는 대조물을 제조 ND 0.4%
상단 및 기저단 접수액 운반버퍼 ND 0%
비고: ND는 "비검출"을 표시한다.
1.3 세포배양
MDR1-MDCK II세포를 α-MEM배지(α-Minimum Essential Media)로 배양하고 37±1℃, 5％ CO2 및 포화상대습도를 배양조건으로 한다. 그 후, 세포를 BD Transwell-96웰 플레이트(BD Gentest)에 접종하고 접종밀도를2.3×105개 세포/cm2로 한 다음, 세포를 CO2 인큐베이터에서 4-7일 배양한 후, 운반실험에 사용한다.
1.4 운반실험
테스트용 화합물과 디곡신 투여농도를 2μM로 하고 양방향(A-B 및 B-A방향)으로 투여하며 모두2-well을 사용한다. 페노테롤과 프로프라놀롤의 테스트 농도를 모두 2μM로 하고 단방향(A-B방향)으로 투여하며 2-well를 사용한다.
사용대기 용액을 37±1℃의 수욕으로 30분간 예비배양한다. 투여액과 접수액 각각을 대응되는 세포웰 위치에 넣고(상단과 기저단 웰에 각각 75 및 250μL로 샘플을 첨가) 양방향 운반실험을 시작한다. 샘플을 첨가한 후 세포플레이트를 37±1℃, 5％ CO2 및 포화상대습도의 인큐베이터에서 150분간 배양한다. 샘플에 대한 수집정보는 표4에서 나타낸 바와 같다.
샘플에 대한 수집정보
샘플유형 웰당 수집된 샘플의 체적
(μL)		 정지액 체적
(μL)		 운반버퍼 체적
(μL)
A-B투여단 50 250 100
A-B접수단 150 250 0
B-A투여단 50 250 100
B-A접수단 50 250 100
T0 50 250 100
모든 샘플에 대해 볼텍스 셰이킹 후, 3220g를 취해 10분간 원심분리하고 적당한 체적의 상청액을 샘플 분석 플레이트에 전이시켜 봉한 후, 샘플에 대해 LC/MS/MS방법을 사용하여 분석을 진행하되, 즉시 분석하지 않을 경우 2-8℃에 저장한다.
1.5 세포막 완전성에 대한 테스트
운반실험이 완료된 후 형광옐로 리젝션 어세이(Lucifer Yellow Rejection Assay)를통해 MDR1-MDCK II세포의 완전성에 대하여 테스트한다. 형광옐로 용액을 30분간 배양한 후 형광옐로 샘플을 수집하며 2e Plate Reader는 425/528nm(여기/방출)스펙트럼에서 셈플 중 형광옐로의 알에프유(the relative fluorescence unit,RFU)를 검출한다.
1.6 샘플분석
반정량 분석을 사용하여 샘플, 대조물페노테롤, 프로프라놀롤 및 디곡신에 대해 분석하고 피분석물 및 내부표준의 피크면적의 비율을 대조물의 농도로 한다.
본 발명의 화합물의 삼투성MDR1:
화합물 A to B(10-6cm/s) B to A(10-6cm/s)
360 1.61 13.32
0015 1.76 13.59
0117 3.2 11.3
0227 12.53 18.03
0228 6.78 10.46
0231 3.79 17.85
2、삼투성Caco2에 대한 테스트
2.1 스톡 용액의 제조
테스트용 화합물을 디메틸술폭사이드(DMSO) 또는 다른 적합한 용제에 용해시켜 10mM인 스톡 용액을 제조한다. 적합한 내부표준(internal standard,IS)을 아세토니트릴(acetonitrile,ACN) 또는 다른 유기용매에 용해시켜 정지액으로 하고 구체적인 정보는 연구보고에서 설명한다.
페노테롤(fenoterol), 프로프라놀롤(propranolol) 및 디곡신(digoxin)은 본 연구에서 각각 저삼투압대조물, 고삼투압대조물 및 P-gp(P-glycoprotein)기질로 한다. 이런 화합물의 스톡 용액은 DMSO로 제조되고 2-8℃에서 저장되며 3개월내 사용해야만 효과적이다.
2.2 투여액 및 접수액의 제조
본 고안은 10mM HEPES을 함유하는 Hank's평형염액 버퍼를 운반버퍼로 한다. 투여액 및 접수액의 제조방법은 하기 표6에 표시된 바와 같다.
HEPES: 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid, 제공자: gibco, 상품코드: 15630-080
Hank's평형염액 버퍼: Hank's balanced salt solution, HBSS로 약칭하고 gibco에서 구매되며 상품코드: 14025-076.
투여액 및 접수액의 제조방법
용액명칭 조성성분 pH DMSO
최종농도
상단 및 기저단 투여액 운반버퍼로 농도가 2μM인 샘플 또는 대조물을 제조 ND 0.4%
상단 및 기저단 접수액 운반버퍼 ND 0%
비고: ND는 "비검출"을 표시함.
2.3 세포배양
Caco-2세포를 MEM배지(Minimum Essential Media)로 배양하고 37±1℃, 5％ CO2 및 포화상대습를 배양조건으로 한다. 다음에 세포를 BD Transwell-96웰 플레이트에 접종하고 접종밀도를 1×105개 세포/ cm2로 한 다음, 세포를 CO2 인큐베이터에서 21-28일 배양한 다음 운반실험에 사용한다.
2.4 운반실험
테스트용 화합물과 디곡신의 투여농도는 2μM이고, 양방향(A-B 및 B-A방향)투여하며 모두 2-well을 사용한다. 페노테롤과 프로프라놀롤의 테스트 농는 모두 2μM이고 단방향(A-B방향)투여하며 2-well를 사용한다.
사용대기 용액을 37±1℃의 수욕으로 30분간 예비배양한다. 투여액과 접수액 각각을 대응되는 세포웰 위치에 넣고(상단과 기저단 웰에 각각 75 및 250μL로 샘플을 첨가) 양방향 운반실험을 시작한다. 샘플을 첨가한 후 세포플레이트를 37±1℃, 5％ CO2 및 포화상대습도인 인큐베이터에서 120분간 배양한다. 샘플에 대한 수집정보는 표7에서 나타낸 바와 같다.
샘플에 대한 수집정보
샘플유형 웰당 수집된 샘플의 체적
(μL)		 정지액 체적
(μL)		 운반버퍼 체적
(μL)
A-B투여단 50 250 100
A-B접수단 150 250 0
B-A투여단 50 250 100
B-A접수단 50 250 100
T0 50 250 100
모든 샘플에 대해 볼텍스 셰이킹 후, 3220g를 취해 10분간 원심분리하고 적당한 체적의 상청액을 샘플 분석 플레이트에 전이시켜 봉한 후, 샘플에 대해 LC/MS/MS방법을 사용하여 분석을 진행하되 즉시 분석하지 않을 경우 2-8℃에서 저장한다.
2.5 세포막 완전성에 대한 테스트
운반실험이 완료된 후 형광옐로 리젝션 어세이(Lucifer Yellow Rejection Assay)를통해 Caco-2세포의 완전성에 대하여 테스트한다. 형광옐로 용액을 30분간 배양한 후 형광옐로 샘플을 수집하며 2e Plate Reader는 425/528nm(여기/방출)스펙트럼에서 셈플 중 형광옐로의 알에프유(the relative fluorescence unit,RFU)를 검출한다.
2.6 샘플분석
반정량 분석을 사용하여 테스트용 화합물, 대조물 페노테롤, 프로프라놀롤 및 디곡신에 대해 분석하고 피분석물 및 내부표준의 피크면적의 비율을 대조물의 농도로 한다.
본 발명의 화합물의 삼투성Caco2:
화합물 A to B(10-6cm/s) B to A(10-6cm/s)
360 0.39 19.63
0117 2.97 12.19
0231 2.58 20.13
결론: 본 발명의 화합물의 삼투성은 우수하다.
시험예2: 항mice결장암CT26의 효능에 대한 연구
1. 연구목적
본 연구는 결장암 CT26 모델을 사용하여 231화합물과 360 및 117 화합물의 항종양 작용의 차이에 대하여 비교한다.
2.실험재료
2.1 세포
세포주의 기본정보
세포주 명칭 CT26.WT(ATCC CRL-2638)
종양유형 mice결장직장암세포
배양조건 RPMI 1640 배지, 10％ 소태아혈청, 37℃, 5％ CO2
배양과정 격일로 배양액을 바꾸고, 2-3일에 한 번씩 계대배양하며 1:2-1:5의 비율로 계대배양한다.
세포유래 중국과학원전형배양물보장위원회셀뱅크
2.2 실험동물
실험동물의 기본정보
동물품종 BALB/c mice
등급 SPF급
성별 수컷
동물 수량 200마리
주령 4-5w
체중 16-20g
검역/적응 실험시작전 적어도 1주일간 예비적응시킴
사육조건 사료: 일반 mice 생장 번식 사료(베이징 커아우협력), 물: 탈이온 정제수
온도: 21 ±2℃, 습도: 30-70%, 광 조사: 낮과 밤을 12hr씩 교체함
동물 유래 베이징 비탈리워 실험동물 기술유한회사,
동물인증서번호:SCXK(징)2012-0001
2.3 테스트용 화합물
서로 다른 IDO억제제의 기본정보
화합물 분자량 제공자 제품번호
360 438.2 샹하이 승덕의약과학기술 SEND20160920-37-3
117 455.3
231 419.2
3. 투여량의 설계 및 투여경로와 빈도
전기 실험연구에 의하면, 화합물360을 100mg/kg bid로 경구 투여할 경우, CT26에 대한 종양억제율은 30-50％이고 기본적으로 최대효능 레벨에 도달한 것으로 나타났다. 따라서, 본 실험에서 화합물 360, 화합물 117 이 두 화합물의 투여량을 모두 100mg/kg으로 정한다. 231의 투여량-효능 관련성을 조사하기 위하여 본 실험에서 231화합물의 투여량을 25、50、100、200mg/kg로 설정하였다. 모든 약물은 모두 경구투여에 의해 투여되고 하루에 두번씩 투여한다.
4. 모델의 선택과 제조
문헌에 따르면, mice결장암 CT26은 면역류 약물을 평가하는데 자주 사용되는 종양 모델인 바, IDO억제제 화합물360이 상기 모델에 대해 종양의 생장을 효과적으로 억제할수 있는 것으로 기재되었다. 따라서, 본 실험은 종양마우스 CT26의 BALB/c 모델을 선택하여 효능 및 조직분포에 대하여 연구한다.
대수생장기의 종양세포를 무혈청 배지에 수집하고 재현탁하며 세포농도를 5×105개/mL로 조절하고 세포현탁액에 동일한 체적의 마트리겔을 넣어 세포의 최종농도가 5×105개/mL로 되도록 한다. 슈퍼클린 벤치에서 각 mice 견갑위치에 0.2mL의 종양세포현탁액을 피하 접종시키고 접종량은 1×105개/마리이다. 종양 덩어리가 500-1000mm3로 자라면 종양 덩어리를 박리시키고 가위로 절단시킨 후, 피부매입이식천자바늘(subcutaneous embedding implantation puncture needle)(직경 1.2mm)로 mice 등부위의 견갑 위치의 피하에 접종시킨다.
5. 그룹 분획 및 투여
종양 접종한 당일을 Day0로 정의하고 접종 동물은 접종 당일에 랜덤으로 그룹 분획된다. 접종한 후 이튿날(Day1)부터 투여하기 시작한다. 실험은 총 7개 그룹으로 나누고 그룹 당 12마리 동물을 포함하며 동물의 그룹 분획 및 투여 정보는 표12에 표시된 바와 같다.
Figure pct00213
6. 지표관찰
대조 그룹의 종양 체적이 3000mm3로 될 때까지를 실험주기로 하고 실험기간에 하기 지표를 관찰한다:
(1) 종양생장곡선: 종양 측정이 가능하게 되면 2일에 한번씩 종양의 최대직경(a) 및 최소직경(b)을 측정하고, 종양체적(계산공식: V＝1/2×a×b2)을 계산하며 테스트 약물의 항종양 효과를 동적으로 관찰한다.
(2) 진행비율(progression rate): 실험 완료시 각 그룹 동물의 진행비율을 관찰한다.
(3) 동물체중: 종양을 측정할 때 또는 약물 투여전에 한번씩 mice의 체중을 측정하고 하루에 한번씩 동물의 사망 상황을 관찰한다.
(4) 종양억제율: 실험 완료시 경추탈골을 통해 mice를 희생시키고, 종양 덩어리를 박리시켜 중량을 측정하고, 종양억제율을 계산하며 억제율＝(대조 그룹 평균 종양 중량-치료 그룹 평균 종양 중량)/대조 그룹 평균 종양 중량×100％이며 디지털 카메라로 종양 덩어리에 대하여 촬상하여 기록한다.
7. 실험결과
7.1 종양마우스 사망 및 체중
실험 전체 기간에 동물 사망은 없었고 각 그룹의 생존한 동물의 체중은 투여전에 비해 모두 증가되고 실험 완료시 대조 그룹의 동물의 체중은 16.0％ 증가되고 약물 투여된 각 그룹의 체중 증가 폭도는 다소 낮아졌다(4.4％-12.0％). 결과는 도1 및 표12에 표시된 바와 같다. 실험 완료시 117그룹 및 231 50-200mg/kg그룹의 동물의 체중은 대조 그룹에 비해 현저히 낮고(P<0.05), 360그룹 및 231 25mg/kg그룹의 동물의 체중은 대조 그룹에 비해 현저한 차이가 없다(P>0.05). 따라서, 높은 투여량일 경우 231화합물은 동물 체중의 증가 폭도를 경미하게 저하시킬 수 있으나 동물의 체중은 여전히 증가되고 있다.
표 12 : 종양마우스에 대한 테스트 약물의 영향(단위: g,
Figure pct00214
)
Figure pct00215
비고: *은 P<0.05을 의미하며, 이는 대조 그룹의 체중에 비해 얻은 것이다.
7.2 종양체적
실험기간에 360그룹과 117그룹의 종양 평균체적은 항상 대조 그룹보다 낮지만 통계적 차이는 없다(P>0.05). 231에서 저투여량인 25mg/kg그룹의 종양체적은 Day10과 Day12에서 대조 그룹보다 현저히 낮고(P<0.05); 231 50mg/kg이상 투여량의 그룹의 종양체적은 Day10부터 실험완료 될때까지 항상 대조 그룹보다 낮다(P<0.05). 결과 및 통계분석은 도2 및 표13에 표시된 바와 같다.
표 13: 각 시점에서 각 종양 모델 그룹의 종양 평균체적(단위: mm3,
Figure pct00216
)
Figure pct00217
비고: *은 P<0.05을 의미하며, 대조 그룹에 비해 얻은 것이다.
7.3 종양중량
실험 완료 시, 360과 117그룹의 종양 평균중량은 대조 그룹보다 낮지만 통계적 차이는 없다. 231화합물의 종양 억제작용은 용량 의존성으로 나타나고 25、50、100mg/kg일 경우 종양 평균중량은 대조군보다 낮지만 통계적 차이는 없으며; 231이 200mg/kg일 경우 종양 평균중량은 대조군보다 현저히 낮으며 (P<0.05), 종양 억제율은 56.8％이다. 100mg/kg인 동일한 투여량에서 231 및 360의 종양 억제작용은 비슷하며, 117그룹보다 우수하다. 117그룹 동물중 에서 1마리만 실험 완료될 때까지 종양 덩어리가 생기지 않았다. 결과 및 통계분석은 도3 및 표14에 표시된 바와 같다.
표 14 :이식종양 중량에 대한 테스트 약물의 영향(
Figure pct00218
)
Figure pct00219
비고: *은 P<0.05을 의미하며, 대조 그룹에 비해 얻은 것이다.
8. 결론
본 실험의 연구목적은 CD-1마우스, SD마우스 및 인간 간 마이크로좀에서 테스트용 화합물의 1상 대사 안정성을 평가하는데 있다. 본 실험조건에서 화합물231은 용량 의존적으로 CT26이식종양의 생장을 억제할수 있고 화합물117과 화합물360보다 작용이 우수하나 종양마우스의 체중 상승을 경미하게 감소시킬수 있다.
시험예3: 인간 간 마이크로좀의 안정성에 대한 실험
본 테스트 레짐에서 사용되는 동물과 인간 간 마이크로좀은 BD Gentest, Xenotech, Corning 또는 BioreclamationIVT로부터 구매되며 사용전에 -80℃의 랭장고에 저장된다.
테스트용 화합물과 대조물은 37℃의 조건에서 마이크로좀과 공동으로 60분간 배양하고 지정된 시점에서 내부표준물이 함유된 냉온의 아세토니트릴 용액(또는 다른 유기용매)으로 반응을 정지시킨다. 원심분리 후 생성된 상청액에 대해 액체크로마토그래피 질량분석법(LC/MS/MS)으로 반정량적으로 측정한다. 소프트웨어Analyst(AB Sciex,Framingham,Massachusetts,USA)로 분석물과 내부표준의 보유시간, 크로마토그램의 수집 및 크로마토그램의 적분에 대해 처리한다.
샘플과 내부표준 피크면적의 비율을 잔유률로 전환하는 것을 통해, 샘플의 체외 제거속도상수ke를 구하고 테스트용 화합물의 체외제거율과 반감기를 계산한다. 결과는 표15에 표시된 바와 같다:
테스트용 화합물 231 227
Remaining％(60min),H/R/M 81.6/64.8/35.8 56.9/21.6/11.0
Intrinsic clearance(mL/min/kg) <8.6, 23.7, 134.3 15.3, 91.9, 274.8
결론: 화합물231은 인간, Rats 간 마이크로좀에서 대사가 비교적 안정적이고 mice에서의 대사는 신속하다. 화합물 227은 인간 간 마이크로좀에서의 대사는 중등 정도이며 Rats, mice에서의 대사는 모두 신속하다. 대사 안정성은 화합물231보다 차하다.
시험예4: 인간 간 마이크로좀에서 CYP에 대한 억제 실험
고안을 연구하는 목적은 CYP동질효소의 5 in 1 프로브 기판으로 인간 간 마이크로좀의 세포 색소 P450동질효소(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 및 CYP3A4)에 대한 테스트용 화합물의 억제성을 평가하는데 있다.
인간 간 마이크로좀(HLM)은 Corning Inc.(Steuben,New York,USA) 또는 XenoTech,LLC.(Lenexa,KS,USA) 또는 다른 제공자로부터 구매되며 사용 전 모두 -70℃보다 낮은 조건에서 저장한다.
희석된 시리즈 농도의 테스트용 화합물 실험용액을 인간 간 마이크로좀, 프로브 기판 및 순환시스템의 보조인자를 함유하는 배양시스템에 넣고 테스트용 화합물을 포함하지 않고 용매를 함유하는 대조물을 효소 활성 대조물(100％)로 한다. 액체크로마토그래피 질량분석법(LC-MS/MS)으로 샘플중 프로브 기판이 생성하는 대사산물의 농도에 대해 측정한다. SigmaPlot(V.11)를 사용하여 농도에 대한 테스트용 화합물 평균활성비율에 대하여 비선형 회귀분석을 진행한다. 3 파라미터 또는 4 파라미터 변곡 로그방정식(inflection logarithmic equation)으로 IC50값을 계산한다. 테스트 결과는 표16과 같다:
테스트용 화합물 231 227
CYP1A2, 2C9, 2D6, 3A4
(IC50, μM)		 >50, >50, 36.4, >50, >50 13.0, 15.9, 3.61, 26.1, 39.2
결론: 화합물231이 5개의 CYP동질효소에 대한 억제 정도는 모두 약하다. 화합물227이 5개의 CYP동질효소에 대한 억제정도는 모두 화합물231보다 강하고 CYP2C19에 대하여 중등정도 강도로 억제한다.
시험예5: mice 체내 약물동력학 실험
본 실험은 테스트용 화합물을 1차로 정맥주사한 다음 수컷 CD-1 mice의 혈장에서의 약물동력학 상황에 대해 연구하고자 한다.
1. 실험방법:
정맥 그룹에서 3마리 동물에 대해 정맥주사를 통해 1mg/kg의 테스트용 화합물을 투여하고 제제는 5％ DMSO/ 95％(10％ HP-β-CD)의 0.2mg/mL 상청용액이다. 약후 투여 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 24시간 후에 각각 혈액을 수집하여 혈장 샘플을 만들며 혈액응고 방지제로EDTA-K2를 사용한다. 샘플은 LC-MS/MS분석을 거쳐 혈장 농도 데이터를 얻었다.
2. 데이터 분석
WinNonlinTMVersion 6.3(Pharsight,Mountain View,CA)약물동력학 소프트웨어를 사용하여, 비구획모델로서 혈장의 약물 농도 데이터에 대해 처리한다. 리니어 로그 트래피조이드 법(linear-log trapezoidal method)으로 하기 약물동력학 파라미터를 계산한다: 제거상 반감기(T1/2), 겉보기 분포용적(Vdss) 및 제거율(CL), 0시부터 종말시점까지 약물이 체내에서의 평균체류시간(MRT0-last), 0시부터 무한한 시간내에서 약물이 체내에서의 평균체류시간(MRT0-inf), 0시부터 종말시점까지 시간-혈장농도 곡선하면적(AUC0-last), 0시부터 무한한 시간-혈장농도 곡선하면적(AUC0-inf), 초기농도(C0). 결과는 표17에 표시된 바와 같다:
약물동력학 파라미터 231 227
Mouse PK (IV1mg/kg) CL(mL/min/kg) 55.1 64.2
Vd(L/kg) 4.85 2.66
AUC0-last/inf(nM.h) 852/881 624/628
Conc.(8h/24h, nM) 8.16/ND ND/ND
T1/2(h): 2.44 0.867
결론: 두 화합물은 mice체내에서의 소모속도는 모두 중등정도이고 화합물231의 AUC는 화합물227보다 높고, 겉보기 분포용적 및 반감기도 화합물227보다 훨씬 크다.

Claims (21)

  1. 식(I)로 표시되는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염：
    Figure pct00220

    D는 O, S 또는 -S(=O)-에서 선택되고,
    L는 단일결합에서 선택되거나 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 -(C1-10)알킬-, -(C3-6)시클로알킬-, -(C3-6)시클로알킬(C1-3)알킬-, -페닐-, -3 내지 6 원자헤테로시클로알킬-, -3 내지 6 원자헤테로시클로알킬-(C1-3)알킬-에서 선택되며;
    R1은 H, F, Cl, Br, I, OH, NH2에서 선택되거나 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C3-6)시클로알킬, (C1-6)헤테로알킬, N,N-디((C1-6)알킬)아미노, 3 내지 6 원자헤테로시클로알킬, (C2-6)알케닐, 페닐, 5 내지 9 원자헤테로아릴,
    Figure pct00221
    ,
    Figure pct00222
    ,
    Figure pct00223
    ,
    Figure pct00224
    ,
    Figure pct00225
    ,
    Figure pct00226
    ,
    Figure pct00227
    ,
    Figure pct00228
    에서 선택되며;
    R2는 OH 또는 CN에서 선택되며;
    R3, R4 및 R5는 각각 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C3-6)시클로알킬, (C1-6)헤테로알킬, N,N-디((C1-6)알킬)아미노, 3 내지 6 원자헤테로시클로알킬에서 선택되며;
    R는 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R'에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C1-6)헤테로알킬, N,N-디((C1-6)알킬)아미노, (C3-6)시클로알킬, (C2-6)알케닐, 페닐, 티에닐에서 선택되며;
    R'는 F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되며;
    상기 -3 내지 6 원자헤테로시클로알킬-, -3 내지 6 원자헤테로시클로알킬-(C1-3)알킬-, (C1-6)헤테로알킬, 3 내지 6 원자헤테로시클로알킬 및 5 내지 9 원자헤테로아릴에서 "헤테로"는 각각 독립적으로 -C(＝O)NH-、 -NH-、 -S(＝O)2NH-、 -S(＝O)NH-、 N、 -O-、 -S-、 ＝O、 ＝S、 -C(＝O)O-、 -C(＝O)-、 -C(＝S)-、 -S(＝O)-、 -S(＝O)2-、 -NHC(＝O)NH-、 -NHC(＝S)NH-、 -H2P(＝O)-NH-에서 선택되며;
    상기 임의의 경우에 있어서, 헤테로원자 또는 원자단 개수는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3에서 선택된다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R는 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R'에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C1-6)알콕시, (C1-6)알킬아미노, N,N-디((C1-6)알킬)아미노, (C2-6)알케닐, (C3-6)시클로알킬, 페닐, 티에닐에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 R는 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R'에 의해 치환 또는 비치환된 Me, Et,
    Figure pct00229
    ,
    Figure pct00230
    ,
    Figure pct00231
    ,
    Figure pct00232
    ,
    Figure pct00233
    ,
    Figure pct00234
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 R는 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2, Me, Et, CF3, CHF2, CH2F,
    Figure pct00235
    ,
    Figure pct00236
    ,
    Figure pct00237
    ,
    Figure pct00238
    ,
    Figure pct00239
    ,
    Figure pct00240
    ,
    Figure pct00241
    ,
    Figure pct00242
    ,
    Figure pct00243
    ,
    Figure pct00244
    ,
    Figure pct00245
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L는 단일결합에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 -(C1-5)알킬-, -(C3-6)시클로알킬-, -(C3-6)시클로알킬-(C1-3)알킬-, -3 내지 6 원자아자헤테로시클로알킬-(C1-3)알킬-에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 L는 단일결합에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 -CH2-,
    Figure pct00246
    ,
    Figure pct00247
    ,
    Figure pct00248
    ,
    Figure pct00249
    ,
    Figure pct00250
    ,
    Figure pct00251
    ,
    Figure pct00252
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 L는 단일결합, -CH2-,
    Figure pct00253
    ,
    Figure pct00254
    ,
    Figure pct00255
    ,
    Figure pct00256
    ,
    Figure pct00257
    ,
    Figure pct00258
    ,
    Figure pct00259
    ,
    Figure pct00260
    ,
    Figure pct00261
    ,
    Figure pct00262
    ,
    Figure pct00263
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-6)알킬, (C1-6)알콕시, (C1-6)알킬티오, (C1-6)알킬아미노, N,N'-디((C1-3)알킬)아미노, (C3-6)시클로알킬, 테트라하이드로퓨라닐, 옥세타닐, (C2-6)알케닐, 페닐, 티에닐, 피리딜, 이미다졸릴, 티아졸릴, 2-케토-이미다졸릴알킬, NH2C(＝S)-NH-、 (C1-6)알킬-S(＝O)-、 (C1-6)알킬-S(＝O)2-、 (C1-6)알콕시-C(＝O)-NH-、 NH2-S(＝O)-NH-、 -NH2-C(＝O)-、 NH2-C(＝O)-NH-、 H-C(＝O)-NH-、 H-S(＝O)2-NH-,
    Figure pct00264
    ,
    Figure pct00265
    ,
    Figure pct00266
    ,
    Figure pct00267
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된Me, Et, BOC-NH-, CH2＝CH-,
    Figure pct00268
    ,
    Figure pct00269
    ,
    Figure pct00270
    ,
    Figure pct00271
    ,
    Figure pct00272
    ,
    Figure pct00273
    ,
    Figure pct00274
    ,
    Figure pct00275
    ,
    Figure pct00276
    ,
    Figure pct00277
    ,
    Figure pct00278
    ,
    Figure pct00279
    ,
    Figure pct00280
    ,
    Figure pct00281
    ,
    Figure pct00282
    ,
    Figure pct00283
    ,
    Figure pct00284
    ,
    Figure pct00285
    ,
    Figure pct00286
    ,
    Figure pct00287
    ,
    Figure pct00288
    ,
    Figure pct00289
    ,
    Figure pct00290
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 R1은 H, F, Cl, Br, I, OH, NH2,
    Figure pct00291
    ,
    Figure pct00292
    ,
    Figure pct00293
    , Me, CF3, BOC-NH-, CH2=CH-,
    Figure pct00294
    ,
    Figure pct00295
    ,
    Figure pct00296
    ,
    Figure pct00297
    ,
    Figure pct00298
    ,
    Figure pct00299
    ,
    Figure pct00300
    ,
    Figure pct00301
    ,
    Figure pct00302

    Figure pct00303

    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  11. 제7항 또는 제10항에 있어서,
    상기 구조단위 R1-L-은 H, NH2,
    Figure pct00304
    ,
    Figure pct00305
    ,
    Figure pct00306
    , Me, BOC-NH-,
    Figure pct00307
    ,
    Figure pct00308
    ,
    Figure pct00309
    ,
    Figure pct00310

    Figure pct00311

    Figure pct00312
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 R3, R4 및 R5는 각각 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 Me, Et, (C3-6)시클로알킬, (C1-3)알콕시에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 R3, R4 및 R5는 각각 H, F, Cl, Br, I, OH, CN, NH2에서 선택되거나, 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R에 의해 치환 또는 비치환된 Me, Et,
    Figure pct00313
    ,
    Figure pct00314
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 R3, R4 및 R5는 각각 H, F, Cl, Br, I, CN, CH2F、CHF2、CF3,
    Figure pct00315
    ,
    Figure pct00316
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 구조단위
    Figure pct00317
    는
    Figure pct00318
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 구조단위
    Figure pct00319
    는
    Figure pct00320
    ,
    Figure pct00321
    ,
    Figure pct00322
    에서
    선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  17. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물은
    Figure pct00323
    이고,
    R2, R3, R4 및 R5는 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항에서 정의한바와 같고;
    R6는 H에서 선택되거나 또는 선택적으로 1, 2 또는 3개의 R'에 의해 치환 또는 비치환된 (C1-3)알킬, (C3-6)시클로알킬에서 선택되나, Me에서 선택되지 않는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 R6는 H, CF3, Et,
    Figure pct00324
    ,
    Figure pct00325
    ,
    Figure pct00326
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 화합물 및 그의 약학적으로 허용 가능한 염은
    Figure pct00327

    Figure pct00328

    Figure pct00329

    Figure pct00330

    Figure pct00331

    Figure pct00332

    Figure pct00333
    ,
    Figure pct00334
    ,
    Figure pct00335
    ,
    Figure pct00336

    Figure pct00337
    에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염.
  20. 치료유효량의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 활성성분 및 약학적으로 허용 가능한 담체로 포함하는 약물조성물.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 제20항의 조성물의 IDO1 관련 질환을 치료하는 약물의 제조에서의 응용.
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