BR112019020174A2 - Método para preparar conjugado anticorpo-fármaco - Google Patents

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antibody
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Zhang Xiaofei
Liang Zhi
Shi Ruijun
Zhong Jin
Liu Xun
Tao Weikang
Zhang Lianshan
Sun Piaoyang
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Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.
Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd
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Abstract

um método para preparar um conjugado anticorpo-fármaco (adc). em particular, o método utiliza principalmente uma combinação de biomoléculas de anticorpo e um transportador de troca iônica por meio de interação eletrostática para executar a preparação em fase sólida de um fármaco adc. as condições de eluição são otimizadas, para controlar uma razão de acoplamento de fármaco-a-anticorpo (dar) e separar um fármaco acoplado a polímero, reduzir a quantidade de fármaco usada em uma reação de acoplamento, e aprimorar o efeito terapêutico direcionado de um fármaco adc. o método de preparação apresenta menos etapas, operação simples, e controle programável, facilitando a produção industrial em escala, e também realizando retenção zero de agentes redutores e solventes orgânicos no processo de preparação, melhorando significativamente a segurança dos fármacos e reduzindo os custos de produção.

Description

MÉTODO PARA PREPARAR UM CONJUGADO DE PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO-FÁRMACO
[001] A presente invenção reivindica a prioridade do pedido de patente chinês N2: CN201710202043.1 depositado em 30 de março de 2017, pedido de patente chinês N2: CN201710233373.7 depositado em 11 de abril de 2017 e pedido de patente chinês N2: CN201710342257.9 depositado em 16 de maio de 2017. Todo o conteúdo deste documento é incorporado por referência.
Campo da Invenção
[002] A presente invenção refere-se a um método para a preparação de um conjugado de anticorpo-fármaco, refere-se especificamente a um método para a preparação de um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) usando coluna de troca iônica como transportador.
Antecedentes
[003] Os métodos de acoplamento convencionais para a preparação de um fármaco ADC incluem: acoplamento por lisina, acoplamento redutor por pontes dissulfeto intercadeias leve e pesada e acoplamento sítio-dirigido (Beck A, Reichert JM. Antibody-drug conjugates: Present and future; MAbs, 2014, 6: 1517; McCombs J R, Owen S C. Antibody-drug conjugates: design and selection of linker, payload and conjugation chemistry. The AAPS journal, 2015,17: 339-351). A tecnologia da plataforma de acoplamento por lisina utiliza um reagente agente de reticulação de grupo bifuncional para modificar aleatoriamente o resíduo de lisina do anticorpo e depois reagir com o grupo mercapto de molécula pequena tóxica, tal como o derivado de maitansina DM1, DM4 ou similar para obter o acoplamento. OT-DM1 (Kadcyla), que já está no mercado, adota essa tecnologia. O acoplamento redutor por pontes dissulfeto intercadeias leve e pesada é obtido através da redução das pontes dissulfeto entre a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo para produzir resíduos de cisteína e, em seguida, reação com
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2/66 polipeptídeo-agente de reticulação que contém toxina, tal como o derivado da aplysiatoxina Metil-auristatina E (MMAE) ou outros análogos para acoplamento. O fármaco ADC Adcetris, que já está no mercado, adota essa tecnologia. O acoplamento sítio-dirigido modifica principalmente a sequência de aminoácidos, introduzindo um novo aminoácido tal como cisteína, de modo que a molécula pequena tóxica é ligada direcionalmente ao anticorpo. A técnica está atualmente no estágio inicial de desenvolvimento (Panowski S, et al. Site-directed antibodydrug conjugates for cancer therapy. MAbs. Taylor & Francis, 2014, 6: 34-45). Atualmente, os fármacos ADC no mercado baseiam-se principalmente no acoplamento por lisina e no acoplamento redutor aleatório de pontes dissulfeto intercadeias leve e pesada. Os fármacos ADC obtidos por esses dois métodos apresentam uma grande diferença no número de fármacos acoplados ao anticorpo monoclonal, resultando em uma heterogeneidade de fármacos, o que é um grande desafio para a consistência da produção em lote do ADC (Wang L, et al. Structural characterization of the maytansinoid-monoclonal antibody immunoconjugate, huN901-DMl, by mass spectrometry. Protein science, 2005, 14: 2436-2446). A razão de acoplamento anticorpo-toxina de fármaco (DAR) representa o número médio de moléculas pequenas tóxicas de fármacos acopladas a cada anticorpo. Estudos demonstraram que o número de moléculas tóxicas acopladas ao anticorpo afeta a polimerização do ADC, a atividade de ligação a antígeno, a depuração na circulação sanguínea e a atividade e tolerância do ADC. Um valor DAR muito baixo reduzirá sua atividade, enquanto um valor DAR muito alto reduzirá a meia-vida e a tolerância do fármaco ADC na circulação sanguínea, o que prejudicará a ligação eficaz dos fármacos ADC aos antígenos. Enquanto isso, a eficácia do fármaco também pode ser reduzida com o aumento do valor DAR (Hamblett KJ, et al. Effects of drug loading on the antitumor activity of a monoclonal antibody-drug conjugate. Clin Cancer Res,
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2004, 10: 7063-7070). Para fármacos ADC atualmente disponíveis no mercado, o valor DAR ideal deve ser controlado entre 2 e 4.
[004] Embora o desenvolvimento de novos fármacos ADC tenha alcançado um sucesso sem precedentes, a técnica ainda precisa ser melhorada. Entre eles, o processo tradicional contém muitas etapas de acoplamento e operação complicada, o que pode levar à poluição ambiental. Também envolve a adição e agitação de solventes orgânicos, o que inevitavelmente leva a colisões entre proteínas de anticorpos e a produção de compostos e polímeros de reticulação. Além disso, é difícil remover completamente vários solventes orgânicos, que podem causar imunogenicidade e outros efeitos colaterais dos fármacos ADC, restringindo assim seu rápido desenvolvimento. Adicionalmente, o valor DAR também é um parâmetro-chave de controle de qualidade na preparação de fármacos ADC, o que também exige pesquisas sobre o processo de acoplamento e purificação. O valor DAR é controlado dentro do intervalo alvo para garantir consistência e estabilidade da produção em lote, e o teor de agregação de subprodutos deve ser controlado e removido o máximo possível.
[005] A patente (CN104208719A) ganhou controle do valor DAR e do polímero por purificação por cromatografia de troca catiônica, no entanto, a patente apenas forneceu um meio de purificação e separação, o que não mudou a complexidade do processo de produção de ADC, nem conseguiu remover completamente vários produtos reagentes orgânicos.
[006] Em termos da modificação do processo, Evans do Reino Unido inventou uma preparação em fase sólida de ADC (CN105579066A). Ele usou a resina de proteína A de carga de afinidade como fixador e ligou o anticorpo monoclonal à proteína A através da afinidade da mesma com a resina, depois o anticorpo monoclonal reagiu com agente de reticulação ou toxinas, respectivamente. Esta pesquisa reduziu as etapas de produção, mas devido ao
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4/66 alto custo e à baixa resistência aos álcalis das cargas de afinidade da proteína A, a disseminação e aplicação dessa tecnologia na produção foi severamente restringida.
[007] A patente CN101087611A, cujo conteúdo inteiro é aqui incorporado por referência, descreve um método de acoplamento de um anticorpo ao DM1, DM3, DM4 por um agente de reticulação compreendendo grupo maleimida, grupo mercapto e grupo haloacetil; em que o grupo maleimida é selecionado a partir de SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB e PMPI. O grupo haloacetila é selecionado a partir de SIAB, SIA, SBA e SBAP.
[008] A patente CN106029083A, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência, descreve um anel succinimida hidrolisado (ou ácido succínico) que acopla diretamente MMAE, MMAF a um anticorpo através de uma ligação tioéter.
[009] A patente CN106467575A, cujo conteúdo inteiro é aqui incorporado por referência, descreve o acoplamento de anticorpos a toxinas tais como MMAE, MMAF, PBD, SN-38 e Dox por acoplamento sítio-dirigido.
[010] Os pedidos anteriores da requerente WO2016127790A1 e WO2015/113476 envolvem novas moléculas de toxinas e conjugados, cujo todo conteúdo é aqui incorporado por referência. O pedido anterior da requerente CN106188293A descreve um conjugado de anticorpo c-Met e um método de preparação do mesmo. O pedido anterior do requerente (número de pedido CN201610526367.6) fornece um conjugado de fármaco-anticorpo EGFR e um método de preparação do mesmo.
[011] Portanto, um novo processo, que não só poderia reduzir as etapas de produção e reduzir custos, mas também facilitar a remoção de reagentes orgânicos e melhorar a controlabilidade do valor DAR, terá um significado prático importante para a síntese de fármaco ADC.
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Descrição Detalhada da Invenção
[012] A presente invenção fornece um método para preparar um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco (ADC), que realiza a preparação em fase sólida do fármaco ADC utilizando uma combinação de biomolécula de anticorpo e transportador de troca iônica por meio de interação eletrostática. As condições de eluição são otimizadas, para controlar a razão de acoplamento fármaco para anticorpo (DAR) e separar o fármaco acoplado ao polímero, reduzir a quantidade de fármaco usado na reação de acoplamento e aprimorar o efeito terapêutico alvo de um fármaco ADC. O método de preparação apresenta menos etapas, operação simples e controle programável, facilitando o escalonamento para produção industrial e permite a retenção zero de agentes redutores e solventes orgânicos no processo de preparação, melhorando significativamente a segurança do fármaco e reduzindo o custo de produção. O método de preparação compreende: imobilizar uma proteína de ligação a antígeno em um transportador de troca iônica, conectar o fármaco à proteína de ligação a antígeno imobilizada por acoplamento, o produto de acoplamento é eluído do transportador de troca iônica e o eluato é coletado; O conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco pode ser especificamente um conjugado de anticorpo-fármaco.
[013] Para alcançar os objetivos acima, a solução técnica da presente invenção é: um método para preparar um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco (ADC), que compreende as seguintes etapas:
1) imobilizar a proteína de ligação a antígeno no transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada;
2) contatar a proteína de ligação a antígeno imobilizada com o fármaco para formar um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco;
3) eluir o conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco do
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6/66 transportador de troca iônica.
[014] Preferencialmente, o método compreende as seguintes etapas:
1) imobilizar a proteína de ligação a antígeno no transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada;
2) contatar a proteína de ligação a antígeno imobilizada com o fármaco para uma reação de acoplamento para formar um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco; e a reação de acoplamento é realizada para acoplar a proteína de ligação a antígeno imobilizada ao fármaco;
3) eluir o conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco do transportador de troca iônica.
[015] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a proteína de ligação a antígeno é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo humanizado, um anticorpo de murino, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia simples, e um anticorpo biespecífico. A proteína de ligação a antígeno também pode ser um fragmento de ligação a antígeno selecionado a partir de, mas não limitado a, fragmentos Fab, F(ab')2 e scFv.
[016] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a proteína de ligação a antígeno é preferencialmente selecionada a partir de um anticorpo, mais preferencialmente um anticorpo monoclonal.
[017] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o transportador de troca iônica é selecionado a partir do grupo que consiste em, mas não se limita a, uma resina de troca iônica, uma membrana de troca iônica, uma fibra de troca iônica, preferencialmente uma resina de troca iônica. O transportador de troca iônica é selecionado a partir de um transportador de troca catiônica ou de um transportador de troca aniônica, preferencialmente um transportador de troca catiônica, mais preferencialmente um transportador de troca catiônica
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7/66 forte, e o trocador do transportador de troca iônica ou ligante de reação é selecionado a partir de ligantes de reação altamente ácidos, preferencialmente um grupo ácido sulfônico (-SO3H). A matriz usada no transportador de troca iônica compreende uma matriz hidrofóbica que pode ser selecionada a partir de, mas não se limitando a, polímeros hidrofóbicos de alto peso molecular, tais como poliestireno e polimetacrilato, preferencialmente polimetacrilato; e matriz hidrofílica, que pode ser selecionada a partir de, mas não se limitando a, um polímero hidrofílico, tal como agarose ou dextrano, preferencialmente agarose; a matriz usada no transportador de troca iônica também pode incluir um polímero de uma matriz neutra. Em algumas modalidades, transportador de troca iônica e transportador podem ser usados de forma intercambiável e têm o mesmo significado.
[018] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a reação de acoplamento na etapa 2) é tal que a proteína de ligação a antígeno e o fármaco são ligados por uma interação entre um grupo nucleofílico e um grupo eletrofílico;
Em que o grupo nucleofílico é opcionalmente derivado da proteína de ligação a antígeno ou do fármaco, preferencialmente da proteína de ligação a antígeno;
Em que o grupo eletrofílico é opcionalmente derivado da proteína de ligação a antígeno ou do fármaco, preferencialmente do fármaco.
[019] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que o grupo nucleofílico é selecionado a partir do grupo que consiste em um mercapto, um grupo hidroxila, um grupo amino, uma hidrazida, uma oxima, uma hidrazina, uma tiossemicarbazona, um carboxilato de hidrazina e um grupo aril hidrazida, desde que:
Quando o grupo nucleofílico é derivado do fármaco, o grupo nucleofílico é
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8/66 preferencialmente um mercapto;
Quando o grupo nucleofílico é derivado da proteína de ligação a antígeno, o grupo nucleofílico é preferencialmente um grupo amino (por exemplo, Modalidade 2 da presente invenção), um mercapto (por exemplo, Modalidade 9 da presente invenção), um grupo hidroxila; e o grupo amino é mais preferencialmente um grupo amino N-terminal, um grupo amino de cadeia lateral, um grupo amino de sacarídeo na proteína de ligação a antígeno glicosilada, o grupo hidroxila é mais preferencialmente um grupo hidroxila do sacarídeo na proteína de ligação a antígeno glicosilada, e o grupo mercapto é mais preferencialmente uma cadeia lateral de tiol, e mais preferencialmente uma cadeia lateral de tiol de uma cisteína.
[020] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que o mercapto é derivado de um ligante produzido por redução de divagem de um anticorpo, e o grupo amino é derivado de seu próprio ligante de um anticorpo que não sofreu uma redução por divagem.
[021] Em uma modalidade preferida da invenção, em que o grupo eletrofílico é selecionado a partir do grupo que consiste em um éster ativo, um haleto de hidrocarbila, um haleto de benzila, um aldeído, uma cetona, um grupo carboxila e um grupo maleimida, desde que:
Quando um grupo eletrofílico é derivado da proteína de ligação a antígeno, o grupo eletrofílico é preferencialmente derivado de um aldeído, uma cetona, um grupo carboxila e um grupo maleimida, mais preferencialmente um grupo maleimida;
Quando o grupo eletrofílico é derivado do fármaco, o grupo eletrofílico é preferencialmente um éster ativo, um haleto de hidrocarbila ou um grupo maleimida, mais preferencialmente um grupo maleimida; o éster ativo é preferencialmente um éster NHS, um éster HOBt, um haloformato, um haleto de
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9/66 ácido, o haleto de hidrocarbila é preferencialmente uma haloacetamida.
[022] Em uma modalidade preferida da invenção, em que o grupo eletrofílico é derivado do próprio fármaco ou de uma modificação do fármaco.
[023] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a reação de acoplamento é selecionada a partir do grupo que consiste em acoplamento por lisina, acoplamento redutor por pontes dissulfeto intercadeias leve e pesada ou acoplamento sítio-dirigido, preferencialmente acoplamento por lisina, acoplamento redutor por pontes dissulfeto intercadeias leve e pesada. O acoplamento redutor por pontes dissulfeto intercadeias leve e pesada descrito na presente invenção inclui o redutor acoplamento de pontes dissulfeto entre uma cadeia leve e uma cadeia pesada, e também inclui o acoplamento redutor por pontes dissulfeto entre cadeias pesadas.
[024] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a condutividade da proteína de ligação a antígeno da etapa 1) é ajustada para menos de 5 mS/cm antes de entrar em contato com o transportador de troca iônica.
[025] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a proteína de ligação a antígeno da etapa 1) é imobilizada em um transportador de troca iônica em um tampão com um pH de 5,5 a 7,0, preferencialmente 6,3, em que o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em tampão fosfato, tampão acetato, tampão citrato, tampão succinato, preferencialmente tampão fosfato.
[026] Em uma modalidade preferida da presente invenção, na reação de acoplamento descrita na etapa 2), a razão molar do fármaco para a proteína de ligação a antígeno é controlada para ser menor que 6:1 fluindo lentamente o fármaco através do transportador de troca iônica com vazão de 0,2 a 2 mL/min. A temperatura da reação é a temperatura ambiente, que é de 10 a 37°C; e o
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10/66 valor de temperatura é um número inteiro ou um decimal e, preferencialmente, de 20 a 25°C em modalidades não limitativas; a temperatura convencional para produção industrial é de 25°C. Temperaturas mais altas aumentarão a formação de polímeros.
[027] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a eluição da etapa 3) compreende a eluição gradual usando tampões com diferentes concentrações de sal, e o tampão possui um pH de 5,0 a 6,5, preferencialmente 5,5. O tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em tampão fosfato, tampão acetato, tampão citrato, tampão succinato, preferencialmente tampão citrato.
[028] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a eluição gradual compreende uma primeira etapa de eluição e uma segunda etapa de eluição, a concentração de sal da eluição da primeira etapa é de 100 a 140 mM, preferencialmente 110 mM, a concentração de sal da eluição da segunda etapa é de 150 a 200 mM, preferencialmente 180 mM.
[029] A invenção também se refere a um método otimizado para a preparação de um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco (ADC), que envolve a ligação de uma proteína de ligação a antígeno a um agente de reticulação para produzir um grupo nucleofílico. As modalidades ilustrativas da presente invenção são modalidades 2, 3, 4, 5 e 6; compreendendo:
1) imobilizar uma proteína de ligação a antígeno em um transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada;
2) contatar a proteína de ligação a antígeno imobilizada com um fármaco para a reação de acoplamento para formar um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco;
3) eluir o conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco do transportador de troca iônica;
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[030] A etapa 1) descrita na presente invenção inclui:
a) ligar a proteína de ligação a antígeno ao agente de reticulação para obter uma proteína de ligação a antígeno modificada;
b) imobilizar a proteína de ligação a antígeno modificada em um transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada.
[031] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a temperatura para ligação da proteína de ligação a antígeno ao agente de reticulação é de 20 a 40°C.
[032] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a ligação da proteína de ligação a antígeno ao agente de reticulação é realizada em um tampão com um pH de 4,0 a 5,5, preferencialmente 4,3; o tampão é preferencialmente um tampão acetato, mais preferencialmente um tampão acetato contendo acetonitrila.
[033] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a etapa
1) compreende, além disso, a etapa c:
c. adicionar um agente desprotetor e o agente desprotetor é preferencialmente NFhOH-HCI.
[034] A presente invenção também se refere a outro método otimizado para a preparação de um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco (ADC), que envolve a redução de uma proteína de ligação a antígeno para produzir um grupo nucleofílico e uma modalidade ilustrativa da qual na presente invenção é a modalidade 9. O método compreende: 1) imobilizar uma proteína de ligação a antígeno em um transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada;
2) contatar a proteína de ligação a antígeno imobilizada com um fármaco para a reação de acoplamento para formar um conjugado de proteína de ligação
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12/66 a antígeno-fármaco;
3) eluir o conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco do transportador de troca iônica;
[035] A etapa 1) descrita na presente invenção inclui:
A. imobilizar a proteína de ligação a antígeno em um transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada;
B. adicionar um agente redutor para reduzir a ponte dissulfeto da proteína de ligação a antígeno imobilizada para produzir um mercapto (um grupo nucleofílico tiol para acoplamento a um fármaco);
Em que o agente redutor é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em TCEP, DTT, mercaptoetilamina, Ac-Cys, mais preferencialmente TCEP. O agente redutor é utilizado numa quantidade de 4 a 8 vezes a concentração molar do anticorpo, preferencialmente 6 vezes a concentração molar do anticorpo.
[036] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a temperatura da reação de redução na etapa B é de 25 a 45°C, preferencialmente 40°C.
[037] Na invenção, o fármaco inclui uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa ou um fragmento da mesma derivado de bactérias, fungos, planta ou animal), um agente quimioterápico, um inibidor de crescimento, um inibidor de tubulina, um antibiótico, um radioisótopo, uma enzima nucleolítica e outros agentes citotóxicos; o fármaco precisa ser capaz de remover um tumor inibindo microtúbulos ou clivando o DNA de uma célula tumoral; a toxina inclui, mas não está limitada a, um fármaco de molécula pequena, tal como derivados de camptotecina, caliqueamicina, maitansinoides, dolastatina, auristatina, tricoteceno e fragmentos ativados citotoxicamente desses fármacos; o fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em um derivado de maitansinoides, preferencialmente DM1, DM3, DM4; também pode
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13/66 ser selecionado a partir de derivados de auristatina, preferencialmente MMAE, MMAF; ou pode ser selecionado a partir de alcalóides de camptotecina, preferencialmente CPT, 10-hidroxi-CPT, CPT-11 (irinotecano), SN-38 e topotecano, mais preferencialmente SN-38.
[038] No método da presente invenção, a proteína de ligação a antígeno se liga a um ou mais polipeptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em: HER2, HER3, CD33, VEGF, VEGFR, VEGFR-2, CD152, CD40, TNF, IL-1, IL-5, IL-17, IL-6R, IL-1, IL-2R, BLYS, OX40L, CTLA4, PCSK9, EGFR, c-Met, CD2, CD3, CDlla, CD19, CD30, CD38, CD20, CD52, CD60, CD80, CD86, TNF-ot, IL-12, IL-17, IL-23, IL6, IL-Ιβ, RSVF, IgE, RANK, BLyS, α4β7, PD-1, CCR4, SLAMF7, GD2, CD21, CD79b, IL20Ra, brevican, CD22, CD79a, CD72, IGF-1R e RANKL.
No método da presente invenção, a proteína de ligação a antígeno pode, além disso, ser selecionada a partir do grupo que consiste em: Humira (adalimumabe), Avastin (bevacizumabe), Erbitux (cetuximabe), Herceptina (trastuzumabe), Perjeta (pertuzumabe), Vectibix (panitumumabe), Theraloc (nimotuzumabe), Yervoy (ipilimumabe), Opdivo (nivolumabe), Lucentis (ranibizumabe), Enbrel (etanercepte), Myoscint (pentetato de imciromabe), ProstaScint (pendetide de capromabe), Remicade (infliximabe) ReoPro (abciximabe), Rituxan (rituximabe), Simulect (basiliximab), Synagis (palivizumabe), Verluma (nofetumomabe), Xolair (omalizumabe), Zenapax (daclizumabe), Cimzia (certolizumabe), Zevalin (ibritumomabe), Orthoclone (muromonabe), Panorex (edrecolomabe), Mylotarg (gentuzumabe), Soliris (eculizumabe), CNTO1275 (ustecinumabe), Amevive (alefacept), Raptiva (efalizumabe), Tysabri (natalizumabe), Actemra (tocilizumabe), Orencia (abatacepte), Arcalyst (rilonacept), Stelara (ustequinumabe), Removab (catumaxomabe), Simponi (golimumabe), llaris (canaquinumabe), Arzerra (ofatumumabe), Prolia (denosumabe), Benlysta (belimumabe), Nulojix
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14/66 (belatacepte), Eylea (aflibercepte), Campath (alentuzumabe), CEA-Scan (arcitumomabe) (fragmento fab), Poteligeo (mogamulizumabe), Abthrax (raxibacumabe), Gazyva (obinutuzumabe), Langmu (combercepte), Cyramza (ramucirumabe), Sylvant (siltuximabe), Entyvio (vedolizumabe), Keytruda (pembrolizumabe). Blincyto (blinatumomabe), Cosentyx (secuquinumabe), Unituxin (dinutuximabe), Darzalex (daratumumabe), Praluent (alirocumabe), Repatha (evolocumabe), Portrazza (necitumumabe), Empliciti (elotuzumabe), Nucala (mepolizumabe), Praxbind (idarucizumabe) e Bexxar (tositumomabe e tositumomabe 1-131).
[039] Em algumas modalidades, a proteína de ligação a antígeno é selecionada a partir de um anticorpo anti-EGFR ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e o anticorpo anti-EGFR ou seu fragmento de ligação a antígeno, preferencialmente compreende as regiões LCDR1, LCDR2 e LCDR3 com a sequência de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e variantes das mesmas, e regiões HCDR1, HCDR2, HCDR3 com a sequência das SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e variantes das mesmas, mais preferencialmente a cadeia leve de SEQ ID NO: 1 e a cadeia pesada de SEQ ID NO: 2.
mAbOOl-LCDRl: RSSQNIVHSNGNTYLD mAb001-LCDR2: KVSNRFS mAb001-LCDR3: FQYSHVPWT mAbOOl-HCDRl: NYYIY mAb001-HCDR2: GINPTSGGSNFNEKFKT mAb001-HCDR3: QGLWFDSDGRGFDF
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10
[040] A sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAbOOl é apresentada na SEQ ID NO:1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVS
NRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPS
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VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYE KH KVYACEVTH QG LSSPVTKSFN RG EC
[041] A sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAbOOl é apresentada na SEQ ID N0:2
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTS GGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSPG K
[042] Em outras modalidades, a proteína de ligação a antígeno também pode ser selecionada a partir de um anticorpo anti-c-Met ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, preferencialmente compreendendo as regiões LCDR1, LCDR2, LCDR3 tendo a sequência de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e variantes das mesmas, preferencialmente um LCDR1 de SEQ ID NO: 17 e as regiões HCDR1, HCDR2, HCDR3 de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e de variantes das mesmas, respectivamente; mais preferencialmente uma cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 4.
mAb002-LCDRl: RANKSVSTSTYNYLH mAb002-LCDR2: LASNLAS mAb002-LCDR3: QHSRDLPPT mAb002-HCDRl: NYGVH mAb002-HCDR2: VIWSGGSTNYAAAFVS mAb002-HCDR3: NHDNPYNYAMDY
SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 12
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 16
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16/66 mAb002-LCDRl otimizado: RADKSVSTSTYNYLH SEQ ID NO: 17
[043] A sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAb002 é apresentada na SEQ ID NO: 3
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRADKSVSTSTYNYLHWYQQKPGQPPKLLIYLASNL ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRDLPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYE KH KVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RG EC
[044] A sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAb002 é apresentada na SEQ ID NO: 4
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSNYGVHWVRQAPGKGLEWLAVIWSG GSTN YAAAFVSRLTISKDNSKNTVYLQM NSLRAE DTAVYYCARN H DN PYN YAM DYWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK SR WQQG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSPG K
[045] No método da presente invenção, o fármaco é um fármaco modificado ou não modificado, preferencialmente um fármaco modificado; a proteína de ligação a antígeno é uma proteína de ligação a antígeno modificada ou não modificada, preferencialmente uma proteína modificada. O acoplamento entre o fármaco e a proteína de ligação a antígeno é formado pela interação do grupo eletrofílico com o grupo nucleofílico ou pela interação entre o grupo nucleofílico e o grupo eletrofílico. O agente químico para modificar o fármaco e a proteína de ligação a antígeno pode ser qualquer substância capaz de formar dois tipos de grupos descritos acima, incluindo um agente de reticulação, pelo qual um ligante eficaz entre a proteína de ligação a antígeno e o fármaco pode
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Y7/Ç>Ç>
ser formado para gerar um fármaco ADC.
[046] No método da presente invenção, o ligante pode conectar eficazmente a proteína de ligação a antígeno e o fármaco, e o fármaco ADC sintetizado pode se autoquebrar no corpo humano sem efeitos tóxicos e colaterais, e exercer um efeito citotóxico eficaz do fármaco nas células tumorais.
[047] No tratamento utilizando fármacos ADC, o ligante desempenha um papel importante, além de garantir a estabilidade do fármaco no fluxo sanguíneo, também garante uma liberação rápida e eficiente do fármaco nas células tumorais. Atualmente, dois tipos principais de ligantes, clivável e não clivável, foram usados em fármacos ADC. Ao usar o ligante clivável, o ADC libera o fármaco com toxina por hidrólise ácida ou divagem de protease específica no endossomo celular ou lisossomo; ao usar um ligante não clivável, o ADC que é endocitado pela célula precisa ser digerido e degradado para liberar o fármaco de molécula pequena. O ligante clivável inclui: um ligante de hidrazona que é clivado em condições ácidas, um ligante de ponte dissulfeto que hidrolisa sob a ação de uma substância redutora tal como glutationa, um ligante de polipeptídeo hidrolisado por protease (Val-Cit, Phe-Lys) e um ligante de βglucosídeo, etc.; o ligante não clivável inclui principalmente um ligante que pode formar uma ligação tioéter e similares. Tanto o ligante clivável como o ligante não clivável descritos acima, preferencialmente um ligante não clivável, são adequados para uso no método da presente invenção.
[048] No método da presente invenção, o agente de reticulação usado para formar o ligante pode ser um agente de reticulação homobifuncional, preferencialmente um agente de reticulação amino-amino, que possui dois grupos reativos ativadores idênticos em ambas as extremidades, principalmente imidoésteres e ésteres de N-hidroxissuccinimida, que podem reagir com aminas primárias livres dos aminoácidos básicos na superfície da proteína, por exemplo
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18/66 dissuccinimidil glutarato (DSG) da succinimida ou imidato tal como dissuccinimidil
3,3'-ditiodipropionato (DSP), dimetil
3,3'ditiobispropioninimidato (DTBP), etc.
(DSG)
O b .
O' (DSP) .0,,
s..
(DTBP)
[049] Ele também pode ser um agente de reticulação heterobifuncional com dois grupos reativos ativadores diferentes em ambas as extremidades, que podem reagir com outros grupos de tipos diferentes, incluindo principalmente
N-hidroxissuccinimida-maleimida e N-hidroxissuccinimida-dimercaptopiridina, tal como SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB e
PMPI de N-hidroxissuccinimida-maleimida, 3-(2-piridinoditio)propionato de N succinimida (SPDP), 4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa (2-piridilditio) tolueno (SMPT) de N-hidroxisuccinimida-dimercaptopiridina.
CL, ,S,
N.
(SPDP)
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19/66 s -s (SMPT)
[050] Ele pode também ser outro agente de reticulação heterobifuncional, isto é, um agente de reticulação carboxi-amino, que é principalmente uma carbodi-imida para acoplamento com o grupo carboxila de aminoácido ácido no
C-terminal e amônia primária do aminoácido básico no N-terminal. O agente de reticulação pode formar um intermediário de produto de adição com um grupo carboxila e uma carbodi-imida e depois reagir com um grupo amino para formar uma ligação amida. Inclui principalmente cloridrato de diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC), cloridrato de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi-imida (EDC).
(DCC) (EDC)
[051] Ele também pode ser outro agente de reticulação heterobifuncional com um grupo haloacetila, incluindo principalmente SIAB, SIA, SBA e SBAP.
[052] Na presente invenção, certos métodos para a preparação de conjugados de anticorpo-fármaco por transportadores de troca iônica podem ser realizados por várias rotas usando reações, condições e reagentes químicos
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20/66 orgânicos conhecidos dos especialistas na técnica para a combinação de anticorpo e fármaco, incluindo: (1) realizar uma reação de um anticorpo com um agente de reticulação por meio de uma ligação covalente para formar um produto de ligação anticorpo-agente de reticulação contendo um grupo nucleofílico ou um grupo eletrofílico, seguido pela reação com um grupo eletrofílico ou um grupo nucleofílico do fármaco; (2) realizar uma reação de um fármaco com um agente de reticulação por meio de uma ligação covalente para formar um produto de ligação anticorpo-agente de reticulação contendo um grupo nucleofílico ou um grupo eletrofílico, seguido pela reação com um grupo eletrofílico ou um grupo nucleofílico do anticorpo; e (3) modificar o anticorpo para formar um grupo nucleofílico, seguido pela ligação a um fármaco contendo um grupo eletrofílico. O grupo nucleofílico ou grupo eletrofílico dos anticorpos e fármacos acima pode opcionalmente ser produzido por modificação de um agente químico ou um agente de reticulação sem qualquer limitação.
[053] Grupos nucleofílicos da proteína de ligação a antígeno da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, mercapto, grupo hidroxi, hidrazida, oxima, hidrazina, tiossemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupo aril hidrazida, preferencialmente mercapto; o grupo nucleofílico da proteína de ligação a antígeno é capaz de reagir com um agente de reticulação ou um grupo eletrofílico do fármaco para formar uma ligação covalente, o grupo eletrofílico do agente de reticulação ou fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em um éster ativo, um haleto de hidrocarbila, um haleto de benzila, um aldeído, uma cetona, um grupo carboxila e um grupo maleimida, preferencialmente um haleto de hidrocarbila ou um grupo maleimida, mais preferencialmente um grupo maleimida; o éster ativo é preferencialmente um éster NHS, um éster HOBt, formato halogenado, haletos de ácido, e o haleto de hidrocarbila é preferencialmente haloacetamida. Ou a proteína de ligação a
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21/66 antígeno possui um grupo eletrofílico selecionado a partir do grupo que consiste em um aldeído, uma cetona, um grupo carboxila e um grupo maleimida, preferencialmente um grupo maleimida; em que o fármaco possui um grupo nucleofílico selecionado a partir do grupo que consiste nos grupos mercapto, grupo hidroxi, hidrazida, oxima, hidrazina, tiossemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupos aril hidrazida; a proteína de ligação aa antígeno e o fármaco descritos acima foram combinados para formar um ADC.
[054] O grupo nucleofílico da proteína de ligação a antígeno da presente invenção também pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo amino N-terminal, um grupo amino de cadeia lateral, um grupo mercapto da cadeia lateral, um grupo hidroxila ou um grupo amino do sacarídeo em uma proteína de ligação a antígeno glicosilada, preferencialmente um grupo de cadeia lateral mercapto, mais preferencialmente um mercapto de cisteína. O fármaco possui um grupo eletrofílico selecionado a partir do grupo que consiste em um éster ativo, um haleto de hidrocarbila, um haleto de benzila, um aldeído, uma cetona, um grupo carboxila e um grupo maleimida, preferencialmente haleto de hidrocarbila, mais preferencialmente grupo maleimida; o éster ativo é preferencialmente um éster NHS, um éster HOBt, um haloformato, um haleto de ácido e os haletos de hidrocarbila são preferencialmente uma haloacetamida.
[055] O método para acoplar o anticorpo ao fármaco na presente invenção pode adotar um acoplamento por lisina ou um método de acoplamento redutor aleatório de pontes dissulfeto intercadeias leve e pesada, ou um método de acoplamento sítio-dirigido; diferentes métodos de acoplamento não são seletivos para o próprio anticorpo.
[056] Em algumas modalidades, o fármaco é selecionado a partir dos compostos de fórmula geral (Dr):
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Figure BR112019020174A2_D0001
Ou um tautômero, um mesômero, um racemato, um enantiômero, um diastereômero ou uma mistura dos mesmos, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:
R, Rx-R7 são selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo ciano, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
Pelo menos um dentre R8-R1:L é selecionado a partir do grupo que consiste em um halogênio, uma alquenila, uma alquila e uma cicloalquila, os restantes são átomos de hidrogênio;
Ou quaisquer dois dentre R8-R1:L formam grupos cicloalquila, e os dois grupos restantes são opcionalmente selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo alquila e um grupo cicloalquila;
R14 é selecionado a partir de arila ou heteroarila, e a arila ou heteroarila é também opcionalmente substituída pelo grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
R12-R13 são selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo alquila ou um halogênio;
[057] Em algumas modalidades, o composto (Dr) é modificado antes da ligação à proteína de ligação a antígeno, preferencialmente tendo um grupo eletrofílico após a modificação, seguido pela reação com uma proteína de ligação
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23/66 a antígeno contendo um grupo nucleofílico para formar um ADC; o grupo eletrofílico é preferencialmente um grupo maleimida ou um grupo haloacetila, mais preferencialmente um grupo maleimida, e o grupo nucleofílico é preferencialmente um grupo mercapto.
[058] Em algumas modalidades, o composto (Dr) é modificado antes da ligação à proteína de ligação a antígeno, preferencialmente tendo um grupo nucleofílico após a modificação, seguido pela reação com uma proteína de ligação a antígeno contendo um grupo eletrofílico para formar um ADC; o grupo nucleofílico é um mercapto e o grupo eletrofílico da proteína de ligação a antígeno é preferencialmente um grupo maleimida ou um grupo acetila halogenado.
[059] Em algumas modalidades preferidas, o fármaco é selecionado a partir dos compostos de fórmula (I):
Figure BR112019020174A2_D0002
(D
[060] Em algumas modalidades preferidas, o composto de fórmula (I) é modificado antes da ligação à proteína de ligação a antígeno, preferencialmente tendo um grupo eletrofílico após a modificação, seguido pela reação com uma proteína de ligação a antígeno portando um grupo nucleofílico para formar um ADC; o grupo eletrofílico é preferencialmente um grupo maleimida ou um grupo haloacetila, mais preferencialmente um grupo maleimida, preferencialmente um grupo mercapto.
[061] Em algumas modalidades, o composto de fórmula (I) é modificado
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24/66 antes da ligação à proteína de ligação a antígeno, preferencialmente tendo um grupo nucleofílico após a modificação, seguido pela reação com uma proteína de ligação a antígeno contendo um grupo eletrofílico para formar um ADC; o grupo nucleofílico é um grupo mercapto e o grupo eletrofílico da proteína de ligação a antígeno é preferencialmente um grupo maleimida ou um grupo acetila halogenado.
[062] Em outras modalidades, o fármaco modificado é selecionado a partir dos compostos da fórmula (Li-Dr):
Figure BR112019020174A2_D0003
(Li-Dr)
Entre eles
Em que a estrutura LI é a seguinte:
Figure BR112019020174A2_D0004
; preferencialmente MC:
Especificamente:
Figure BR112019020174A2_D0005
O-R (Li-Dr)
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25/66
Em que, n é 2-6, preferencialmente 2-5;
R, R2-R7 são selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo ciano, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
Pelo menos um dentre R8-R1:L é selecionado a partir do grupo que consiste em um halogênio, uma alquenila, uma alquila e uma cicloalquila, os restantes são átomos de hidrogênio;
Ou quaisquer dois dentre R8-R1:L formam um grupo cicloalquila, e os dois grupos restantes são opcionalmente selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo alquila e um grupo cicloalquila;
R14é selecionado a partir de arila ou heteroarila, e a arila ou heteroarila é, além disso, opcionalmente substituído pelo grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila.
[063] Em outras modalidades preferidas, o fármaco é selecionado a partir dos compostos de fórmula (II): (II) *
Figure BR112019020174A2_D0006
(II)
[064] No método da presente invenção, a preparação em fase sólida do fármaco ADC é realizada preferencialmente imobilizando a proteína de ligação a antígeno em um transportador de troca iônica usando um método de acoplamento por lisina, em que o anticorpo é modificado usando um agente de reticulação e depois combinado com o fármaco para formar um ADC. A
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26/66 modificação compreende opcionalmente uma modificação antes ou depois da proteína de ligação a antígeno ser imobilizada no transportador de troca iônica, preferencialmente uma modificação antes da proteína de ligação a antígeno ser imobilizada no transportador de troca iônica.
[065] Em uma modalidade preferida da presente invenção, em que a proteína de ligação a antígeno na etapa 1) é opcionalmente uma proteína de ligação a antígeno modificada ou uma proteína de ligação a antígeno não modificada, preferencialmente uma proteína de ligação a antígeno modificada; a proteína de ligação a antígeno modificada liga opcionalmente a proteína de ligação a antígeno a um reagente químico ou a um agente de reticulação, preferencialmente uma proteína de ligação a antígeno modificada ligada a um agente de reticulação;
Em que o fármaco na etapa 2) é opcionalmente modificado ou não modificado, preferencialmente modificado.
[066] Em algumas modalidades, a proteína de ligação a antígeno é modificada com um agente de reticulação antes da ligação da proteína de ligação a antígeno ao transportador de troca iônica, seguido pela imobilização da proteína de ligação a antígeno modificada em um transportador de troca iônica, seguido pela ligação ao fármaco para formar um ADC.
[067] Em uma modalidade, o agente de reticulação possui um composto da fórmula (L2):
q
R'5·' 1 RieTm S (L2)
T é selecionado a partir de H, terc-butila, acetila, n-propionila, isopropionila, trifenilmetila, metoximetila ou 2-(trimetilsilil)etoximetila, preferencialmente H ou acetila;
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27/66
R15 é selecionado a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo ciano, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
R16 é selecionado a partir do grupo que consiste em alquila, cicloalquila e heterociclo;
m é 0-5, preferencialmente 1-3;
Em que o fármaco possui um grupo eletrofílico selecionado a partir do grupo que consiste em um éster ativo, um haleto de hidrocarbila, um haleto de benzila, um aldeído, uma cetona, um grupo carboxila e um grupo maleimida, preferencialmente haleto de hidrocarbila ou grupo maleimida, mais preferencialmente grupo maleimida; o éster ativo é preferencialmente éster NHS, éster HOBt, haloformato, haleto de ácido, e os haletos de hidrocarbila são preferencialmente haloacetamida.
[068] Em uma modalidade preferida, o fármaco modificado é selecionado a partir dos compostos da fórmula (Ll-Dr).
[069] Em uma modalidade preferida, o fármaco é selecionado a partir do composto de fórmula (II).
[070] Em uma outra modalidade, o agente de reticulação possui um grupo maleimida ou uma porção de um grupo haloacetila; em que o agente de reticulação contendo um grupo maleimida é preferencialmente selecionado a partir de SMCC, LC-SMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB e PMPI, mais preferencialmente SMCC; em que o agente de reticulação contendo uma porção de um grupo haloacetila é preferencialmente selecionado a partir de SIAB, SIA, SBA e SBAP, mais preferencialmente SIAB; em que o fármaco contendo um grupo nucleofílico é preferencialmente selecionado a partir do grupo mercapto, grupo hidróxi, hidrazida, oxima, hidrazina, tiossemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupo aril hidrazida, mais preferencialmente grupo
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28/66 mercapto.
[071] No método da presente invenção, um grupo mercapto também pode serformado pela redução de uma ponte dissulfeto intercadeia, isto é, uma ponte de cisteína, de um anticorpo e, em seguida, reagindo com um fármaco contendo um grupo eletrofílico para formar um ADC; o fármaco pode ter um grupo eletrofílico próprio ou um grupo eletrofílico modificado por um agente químico ou pode ter um grupo eletrofílico que é modificado por um agente de reticulação.
[072] Em algumas modalidades, um agente redutor é adicionado para reduzir uma proteína de ligação a antígeno imobilizada em um transportador de troca iônica; em que o agente redutor é preferencialmente, mas não limitado a, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT), mercaptoetilamina, acetilcisteína (Ac-Cys), mais preferencialmente tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP); em que o fármaco possui um grupo eletrofílico, preferencialmente selecionado a partir de ésteres ativos, haletos de hidrocarbila, haletos de benzila, aldeídos, cetonas, grupos carboxila e grupos maleimida, preferencialmente haletos de hidrocarbila ou grupos maleimida, mais preferencialmente grupos maleimida. O éster ativo é preferencialmente um éster NHS, um éster HOBt, um haloformato, um haleto de ácido, e o haleto de hidrocarbila é preferencialmente uma haloacetamida; o próprio fármaco possui um grupo eletrofílico próprio ou um grupo eletrofílico que é modificado por um agente de reticulação e a modificação compreendendo a modificação com um reagente químico ou um agente de reticulação.
[073] Em uma modalidade, o agente redutor é selecionado a partir de tris(2-carboniletil)fosfina (TCEP), o fármaco possui um grupo eletrofílico que é modificado por um agente de reticulação, em que o agente de reticulação compreende um grupo maleimida, e o agente de reticulação que compreende
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29/66 um grupo maleimida é preferencialmente selecionado a partir de SMCC, LCSMCC, KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB e PMPI, mais preferencialmente SMCC.
[074] Em uma modalidade preferida, o agente redutor é selecionado a partir de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), e o agente de reticulação possui uma porção do grupo haloacetila; em que o agente de reticulação possuindo uma porção de um grupo haloacetila é preferencialmente selecionado a partir de SIAB, SIA, SBA e SBAP, mais preferencialmente SIAB.
[075] Em outra modalidade, o agente redutor é selecionado a partir de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), e o fármaco possui um grupo eletrofílico modificado por um agente químico, que é selecionado a partir dos compostos de fórmula (Dr).
[076] Em outra modalidade preferida, o fármaco é selecionado a partir de compostos de fórmula (I).
[077] Em outra modalidade, o agente redutor é selecionado a partir de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), e o fármaco que possui um grupo eletrofílico próprio é selecionado a partir dos compostos de fórmula (Ll-Dr).
[078] Em outra modalidade preferida, o fármaco é selecionado a partir dos compostos de fórmula (II).
[079] Os grupos nos quais a proteína de ligação a antígeno interage com o fármaco na presente invenção é principalmente um grupo mercapto e uma maleimida (ou um grupo acetila halogenado), que formam uma estrutura de uma ligação tioéter pertencente a um ligante não clivável. Para formar o ligante alvo, um agente de reticulação pode ser usado para modificar a proteína de ligação a antígeno ou fármaco, reagindo com um grupo reativo para formar um conjugado de anticorpo-fármaco. Qualquer agente de reticulação capaz de ligar estavelmente uma proteína de ligação a antígeno a um fármaco é adequado para
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30/66 uso na presente invenção. A posição da proteína de ligação a antígeno à qual o fármaco está ligado é intercambiável e a formação de uma ligação tioéter também pode ser obtida pela reação de um grupo acetila halogenado com um grupo mercapto livre.
[080] No método da presente invenção, o método para preparar um ADC usando um transportador de troca iônica compreende as seguintes etapas: modificar a proteína de ligação a antígeno (por exemplo, um anticorpo) por um agente de reticulação e imobilizar a proteína de ligação a antígeno em um transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada; contatar a proteína de ligação a antígeno imobilizada com um fármaco para formar um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco; eluir o conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco do transportador de troca iônica.
[081] Em uma modalidade, o agente de reticulação é selecionado a partir do composto de fórmula (L3), a proteína de ligação a antígeno compreende as regiões LCDR1, LCDR2, LCDR3 de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e variantes das mesmas, e as regiões HCDR1, HCDR2, HCDR3 de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e variantes das mesmas, e o fármaco é selecionado a partir do composto de fórmula (II).
O
Figure BR112019020174A2_D0007
[082] Em uma modalidade preferida, o agente de reticulação é selecionado a partir do composto da fórmula (L3), a proteína de ligação a antígeno compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 1, e a cadeia pesada de SEQ ID NO: 2, e o fármaco é selecionado a partir do composto de fórmula (II).
[083] Em uma outra modalidade, o agente de reticulação é selecionado a
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31/66 partir do composto de fórmula (L3), a proteína de ligação a antígeno compreende as regiões LCDR1, LCDR2, LCDR3 de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e variantes das mesmas, preferencialmente um LCDR1 de SEQ ID NO: 17 e as regiões HCDR1, HCDR2, HCDR3 de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e variantes das mesmas, e o fármaco é selecionado a partir do composto de fórmula (II).
[084] Em uma outra modalidade preferida, o agente de reticulação é selecionado a partir do composto da fórmula (L3), a proteína de ligação a antígeno compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 3, e a cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, e o fármaco é selecionado a partir do composto de fórmula (II).
[085] A modalidade preferida compreende as etapas de: (i) utilizar o mecanismo de acoplamento por lisina e a função de agente redutor, a lisina foi modificada por um agente de reticulação, de modo que a aminação redutiva do grupo amino da cadeia lateral de lisina do anticorpo com o grupo aldeído na extremidade do agente de reticulação fosse realizado para formar um conjugado de anticorpo-agente de reticulação, e o agente de reticulação livre foi removido; (ii) equilibrar a coluna de troca catiônica e enxaguar a coluna com agente de reticulação, re-equilibrar, seguido pelo carregamento do conjugado de anticorpo-agente de reticulação em uma coluna de troca iônica e enxaguar três vezes; (iii) desproteger o terminal do agente de reticulação; (iv) equilibrar e carregar toxina na coluna de troca iônica, seguido por enxágue secundário, eluição secundária e regeneração.
[086] Em um método adicional de preparação de um ADC da presente invenção, uma proteína de ligação a antígeno é acoplada a um fármaco por um método de redução de uma ponte dissulfeto intercadeia. Após a imobilização da proteína de ligação a antígeno no transportador de troca iônica, a etapa de adição de um agente redutor é realizada para reduzir a ponte dissulfeto da
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32/66 proteína de ligação a antígeno a um grupo mercapto livre, que reage com um fármaco contendo um grupo maleimida ou um grupo acetila halogenado para formar um fármaco contendo um grupo maleimida ou um grupo ADC ligado ao tioéter.
[087] Em uma outra modalidade, o agente de reticulação é selecionado a partir de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), a proteína de ligação a antígeno compreende as regiões LCDR1, LCDR2, LCDR3 de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e variantes das mesmas, e as regiões HCDR1, HCDR2, HCDR3 de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e variantes das mesmas, e o fármaco é selecionado a partir do composto de fórmula (II).
[088] Em uma modalidade preferida, o agente de reticulação é selecionado a partir de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), a proteína de ligação a antígeno compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 1 e a cadeia pesada de SEQ ID NO: 2, e o fármaco é selecionado a partir do composto de fórmula (II).
[089] Em uma outra modalidade, o agente de reticulação é selecionado a partir de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), a proteína de ligação a antígeno compreende as regiões LCDR1, LCDR2, LCDR3 de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e variantes das mesmas, preferencialmente um LCDR1 de SEQ ID NO: 17, uma região HCDR1, HCDR2, HCDR3 de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e variantes das mesmas, e o fármaco é selecionada a partir do composto de fórmula (II).
[090] Em uma outra modalidade preferida, o agente de reticulação é selecionado a partir de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), a proteína de ligação a antígeno compreende a cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e a cadeia pesada de SEQ ID NO: 4, e o fármaco é selecionado a partir do composto de fórmula (II).
[091] Uma modalidade preferida compreende as etapas de: (i) utilizar uma estratégia de acoplamento de ponte dissulfeto intercadeia e uma resina de troca
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33/66 catiônica como um transportador imobilizado, equilibrando a coluna e carregando amostra de anticorpo, seguido por enxágue, redução de ponte dissulfeto intercadeia de anticorpo por adição de agente redutor; (ii) carregar toxina na coluna de troca iônica, seguido por enxágue secundário, eluição secundária e regeneração.
[092] Em algumas modalidades, a temperatura da reação para reduzir a ponte dissulfeto intercadeia do anticorpo por agente redutor é de 25 a 45°C, preferencialmente 40°C.
[093] Em todas as modalidades da invenção, a ligação da proteína de ligação a antígeno ao transportador é seguida pela incubação na temperatura de 10°C a 37°C, preferencialmente 25°C, cujo valor é um número inteiro ou fração, e cuja temperatura em modalidades não limitativas pode ser 10°C, 11°C, 12°C,
13°C, 14°C, 15°C, 16°C, 17°C, 18°C, 19°C, 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C,
27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C ou 37°C.
[094] Além disso, a ligação da proteína de ligação a antígeno ao transportador é realizada em um tampão com um pH de 5,5 a 7,0, preferencialmente 6,3, o tampão inclui, mas não está limitado a, tampão fosfato, tampão acetato, tampão citrato, tampão succinato, preferencialmente tampão fosfato.
[095] Além disso, ao carregar a proteína de ligação a antígeno no transportador, uma vazão de carregamento otimizada é controlada a de 0,1 a 0,5 mL/min, a qual é ajustada de acordo com a quantidade do transportador de troca iônica usado no determinado experimento.
[096] Além disso, é necessário ajustar a condutividade da solução da proteína de ligação a antígeno dentro de um intervalo de 5 mS/cm antes de carregar a proteína de ligação a antígeno no transportador de troca iônica.
[097] Além disso, o acoplamento da proteína de ligação a antígeno
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34/66 imobilizada no transportador de troca iônica ao fármaco é realizado em uma coluna de troca iônica. A fim de reduzir a quantidade de fármaco usado na reação, o fármaco é carregado no transportador de troca iônica a uma vazão lenta; e a razão molar de fármaco para a proteína de ligação a antígeno é 6, 5, 4, 3, 2, 1, preferencialmente 6, e a vazão preferida é de 0,2 mL/min.
[098] Além disso, o conjugado de proteína de ligação a antígeno e fármaco precisa ser eluído do transportador de troca iônica após a ligação, e o pH do tampão é de 5,0 a 6,5, preferencialmente 5,5; o tampão inclui, mas não está limitado a, tampão fosfato, tampão acetato, tampão citrato e tampão succinato, preferencialmente tampão citrato; a concentração de tampão é de 10 a 50 mM, preferencialmente 20 mM.
[099] Além disso, para fazer com que os fármacos ADC sintetizados isolados contenham anticorpo polimérico superior, foi utilizado um método de eluição gradual. O tampão citrato utilizado no processo de eluição compreende NaCI, e a concentração de NaCI no tampão de eluição preparado para a primeira etapa de eluição é de 100 a 140 mM, preferencialmente 110 mM.
[0100] Além disso, no tampão de eluição preparado para a segunda etapa de eluição, o tampão compreende NaCI 150 a 200 mM, preferencialmente 180 mM.
[0101] Em algumas modalidades, a ligação da proteína de ligação a antígeno ao agente de reticulação é realizada a uma temperatura de 20°C a 40°C, cujo valor é um número inteiro ou uma fração, e cujas temperaturas em modalidades não limitativas são preferencialmente 20°C, 22°C, 24°C, 28°C, 32°C, 36°C, mais preferencialmente 28°C, e podem ser 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C em certas modalidades.
[0102] Além disso, a ligação da proteína de ligação a antígeno ao agente de
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35/66 reticulação é realizada em um tampão com um pH de 4,0 a 5,5, preferencialmente 4,3; o tampão é preferencialmente um tampão acetato, mais preferencialmente um tampão acetato compreendendo acetonitrila.
[0103] Além disso, para o agente de reticulação contendo um grupo protetor, após sua ligação à proteína de antígeno, o grupo protetor do agente de reticulação precisa ser removido, permitindo assim que o agente de reticulação se ligue ao fármaco; o agente desprotetor pode ser incluído, mas não está limitado a NHzOH-HCI, e a concentração do agente desprotetor varia de 10 a 50 mM, preferencialmente 20 mM.
[0104] No método da presente invenção, a ligação da proteína de ligação a antígeno ao transportador, a ligação da proteína de ligação a antígeno ao fármaco e a eluição da proteína de ligação a antígeno e do produto de acoplamento de fármaco são realizadas em uma coluna de troca iônica.
[0105] No método da presente invenção, uma etapa de enxágue pode ser opcionalmente incluída, e a coluna de troca iônica é enxaguada com um tampão contendo agente de reticulação para bloquear a hidrofobicidade da matriz de carga de troca iônica para impedir que o fármaco hidrofóbico se ligue à matriz que leva a uma dificuldade na eluição do fármaco ADC; se uma matriz de carga de troca iônica hidrofílica, tal como a agarose, fosse usada, a matriz reagiría com o resíduo de lisina na superfície do anticorpo, bloqueando assim o acoplamento do fármaco com o anticorpo. Portanto, de acordo com a estratégia de acoplamento por lisina, é preferida uma carga de troca iônica de matriz hidrofóbica.
Descrição Detalhada da Invenção
[0106] Para entender melhor a presente invenção, certos termos técnicos e científicos são especificamente definidos abaixo. A menos que especificado de outra forma claramente em outras partes da presente invenção, todos os outros
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36/66 termos técnicos e científicos utilizados na presente invenção têm o significado comumente entendido pelos especialistas na técnica
[0107] O termo anticorpo humanizado ou anticorpos humanizados, também referido na presente invenção como humanização de anticorpos ou anticorpos enxertados com CDR, que se refere ao enxerto de sequências de CDR de camundongo em estruturas de regiões variáveis de anticorpos humanos, ou seja, anticorpo produzido por diferentes tipos de sequências estruturais do anticorpo da linha germinativa humana.
[0108] O termo anticorpo de murino é um anticorpo monoclonal antihumano preparado usando camundongos de acordo com o conhecimento e as habilidades na técnica. Durante a preparação, o indivíduo do teste recebe uma injeção com antígeno e depois o hibridoma que expressa o anticorpo com as sequências desejadas ou propriedades funcionais é isolado. O anticorpo de murino ou seu fragmento de ligação a antígeno pode, além disso, compreender uma região constante de cadeia leve da cadeia κ, λ de murinos ou variantes dos mesmos, ou, além disso, compreender uma região constante de cadeia pesada de IgG 1, lgG2, lgG3 ou lgG4 de murinos ou variantes das mesmas.
[0109] O termo anticorpo humano refere-se ao anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de aminoácidos produzida por um humano ou célula humana ou derivada de anticorpo derivado de não humano utilizando biblioteca de anticorpos humanos ou outra sequência de codificação de anticorpos humanos. Esta definição de anticorpo humano exclui especificamente anticorpos humanizados compreendendo resíduos não humanos de ligação a antígeno.
[0110] O termo anticorpo quimérico é um anticorpo obtido pela fusão da região variável do anticorpo de murino com uma região constante do anticorpo humano, que pode diminuir a resposta imune induzida por um anticorpo de
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37/66 murino. Para construir um anticorpo quimérico, primeiro é construído o hibridoma que secreta o anticorpo monoclonal específico de murino, em seguida, o gene da região variável é obtido a partir da célula de hibridoma do camundongo e depois clonado no gene da região constante do anticorpo humano para expressão recombinante.
[0111] O termo anticorpo de cadeia simples refere-se a um anticorpo formado pela conexão de uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve através de um peptídeo curto de 15 a 20 aminoácidos. O anticorpo de cadeia simples é um anticorpo sintético artificial que é expresso em E. coli usando técnicas de engenharia genética, que contém apenas uma cadeia do anticorpo completo.
[0112] O anticorpo da presente invenção refere-se a qualquer forma de anticorpo que exiba a atividade biológica desejada. Assim, é utilizado no sentido mais amplo e inclui especificamente, mas não está limitado a, anticorpo completo, fragmentos ou derivados de ligação a anticorpos. As fontes de anticorpo incluem, mas não se limitam a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos geneticamente modificados (por exemplo, anticorpos biespecíficos).
[0113] O termo Fragmento Fab refere-se a um fragmento que consiste em uma cadeia leve completa e a região funcional VH e CHI de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar ponte dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.
[0114] O termo fragmento Fab compreende uma cadeia leve e a região funcional VH e CHI de uma cadeia pesada e compreende, além disso, uma região entre os domínios CHI e CH2 que pode formar uma ponte dissulfeto intercadeia entre duas cadeias pesadas de dois fragmentos Fab' para formar Moléculas F(ab')2.
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[0115] O termo fragmento F(ab')2 compreende duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que contêm uma região constante parcial entre os domínios CHI e CH2, de modo que pontes dissulfeto intercadeia são formadas entre as duas cadeias pesadas. Assim, o fragmento F(ab')2 consiste em dois fragmentos Fab' ligados entre si por pontes dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.
[0116] O termo fragmento scFv refere-se a uma região variável de cadeia simples (ScFv) produzida por métodos de engenharia genética, que é um fragmento do tipo Fv compreendendo regiões VH e VL ligadas entre si pelo polipeptídeo flexível.
[0117] O termo proteína de ligação a antígeno é um composto macromolecular capaz de reconhecer e se ligar ao antígeno ou receptor associado a uma célula alvo. A função da proteína de ligação a antígeno é apresentar o fármaco a uma população de células alvo que se liga à proteína de ligação a antígeno, incluindo, mas não se limitando a, hormônios proteicos, lectinas, fatores de crescimento, anticorpos ou outras moléculas capazes de se ligar às células, preferencialmente anticorpos.
[0118] O anticorpo da presente invenção refere-se ao anticorpo monoclonal ou mAb, que se refere ao anticorpo obtido a partir de uma única cepa celular clonal; a cepa celular não se limita à cepa celular clonal de fagos, eucariótica ou procariótica. O anticorpo monoclonal ou os fragmentos de ligação a antígeno podem ser obtidos por recombinação usando, por exemplo, técnica de hibridoma, técnica recombinante, técnica de exibição de fagos, técnicas sintéticas (por exemplo, enxerto de CDR) ou outra técnica anterior.
[0119] O anticorpo da presente invenção refere-se a uma imunoglobulina, que é uma estrutura de cadeia de tetrapeptídeos na qual duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas são ligadas por pontes dissulfeto intercadeia. A região constante da cadeia pesada de imunoglobulina possui
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39/66 diferentes composições de aminoácidos e ordem de arranjo, portanto sua antigenicidade também é diferente. Consequentemente, as imunoglobulinas podem ser classificadas em cinco classes, ou isotipicamente denominadas IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, e as cadeias pesadas correspondentes são cadeia μ, cadeia δ, cadeia γ, cadeia a e cadeia ε respectivamente. A mesma classe de Ig pode ser dividida em diferentes subclasses de acordo com a diferença na composição de aminoácidos da região de dobradiça e o número e posição de pontes dissulfeto de cadeia pesada. Por exemplo, a IgG pode ser classificada em IgG 1, lgG2, lgG3 e lgG4. As cadeias leves são classificadas em cadeia κ ou cadeia λ de acordo com as diferenças entre regiões constantes. Nas cinco classes de Ig, cada classe de Ig pode ter cadeia κ ou cadeia λ.
[0120] A sequência de cerca de 110 aminoácidos próximos ao N-terminal das cadeias pesada e leve do anticorpo varia muito e é denominada região variável (região V); e a sequência de aminoácidos restante próxima ao C-terminal é relativamente estável e denominada região constante (região C). A região variável inclui três regiões hipervariáveis (HVR) e quatro regiões estruturais relativamente conservadas (FR). As três regiões hipervariáveis determinam a especificidade do anticorpo, também conhecida como região determinante de complementariedade (CDR). Cada uma das regiões variáveis da cadeia leve (LCVR) e regiões variáveis da cadeia pesada (HCVR) consiste em três regiões CDR e quatro regiões FR, que são arranjadas sequencialmente do terminal amino ao terminal carboxi: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As três regiões CDR da cadeia leve se referem a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; e as três regiões CDR da cadeia pesada referem-se a HCDR1, HCDR2 e HCDR3. O número e a posição dos resíduos de aminoácidos CDR da região LCVR e da região HCVR do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno descritos na presente invenção estão em conformidade com as regras conhecidas de numeração Kabat (LCDR1-3, HCDE2-3) ou com as
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40/66 regras de numeração kabat e chothia (HCDR1).
[0121] Opcional ou opcionalmente significa que o evento ou ambiente descrito subsequentemente pode, mas não precisa, ocorrer, e a descrição inclui ocasiões em que o evento ou ambiente ocorre ou não. Por exemplo, opcionalmente compreendendo 1 a 3 regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo significa que uma sequência específica de regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo pode, mas não precisa, estar presente.
[0122] O termo agente de reticulação refere-se a uma classe de compostos de moléculas pequenas; moléculas tendo duas ou mais extremidades reativas para um grupo particular (amino, carboxila, tiol, etc.) em ambas as extremidades ou em uma estrutura molecular, a qual pode ser acoplada a duas ou várias outras moléculas. Várias moléculas que participam da reação são covalentemente ligadas ao agente de reticulação para formar uma nova molécula.
[0123] O termo ligante refere-se a um módulo químico compreendendo ligação covalente ou cadeia de átomos que liga covalentemente uma proteína de ligação a antígeno a um fármaco. O módulo químico é formado pela ligação de uma proteína de ligação a antígeno modificada a uma porção modificada de um fármaco.
[0124] O termo condutividade refere-se à capacidade de uma solução aquosa de conduzir corrente elétrica entre dois eletrodos. Em geral, a condutividade ou condutividade específica é uma medida da corrente de condução de uma substância. Em solução, a corrente flui através do transporte de íons. Portanto, à medida que o número de íons presentes na solução aquosa aumenta, a solução terá uma condutividade mais alta. A condutividade é medida em mmhos (mS/cm) e a condutividade da solução pode ser alterada alterando a concentração de íons nela. Por exemplo, a concentração do excipiente iônico na
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41/66 solução pode ser variada para atingir a condutividade desejada.
[0125] O termo fármaco refere-se a uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa ou um fragmento da mesma de derivado de bactérias, fungos, planta ou animal), um agente quimioterápico, um inibidor de crescimento, um inibidor de tubulina, um antibiótico, um radioisótopo, e uma enzima nucleolítica e outros agentes citotóxicos.
[0126] O termo toxina refere-se a qualquer substância capaz de produzir um efeito prejudicial no crescimento ou proliferação de células.
[0127] O termo inibidor de tubulina refere-se a uma classe de compostos que interferem no processo mitótico das células, inibindo a polimerização de tubulina ou promovendo a polimerização da tubulina, exercendo assim um efeito antitumoral. As suas modalidades não limitativas incluem: maitansinoides, caliqueamicina, taxanos, vincristina, colquicina, dolastatina/aluratina, preferencialmente maitansinoides ou dolastatina/auristatina.
[0128] Os maitansinoides são bem conhecidos na técnica e podem ser isolados de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos ou produzidos utilizando técnicas de engenharia genética (Yu et al. The biosynthetic gene cluster of the maytansinoid antitumor agent ansamitocin from Actinosynnema pretiosum. PNAS, 2002, 99: 7968-7973). O maitansinol e análogos do maitansinol também podem ser preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos. Modalidades não limitativas de módulos de fármaco de alcalóide maitansinoide incluem: DM1; DM3; e DM4, como descrito na patente
WO2016127790A1.
[0129] Auristatina é um fármaco totalmente sintético com uma fórmula estrutural química, que é relativamente fácil de modificar para otimizar suas propriedades físicas e propriedades de fármaco. Os derivados da auristatina
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42/66 utilizados para o acoplamento com o anticorpo incluem principalmente monometil auristatina E (MMAE) e monometil auristatina F (MMAF), e o primeiro é um pentapeptídeo sintético sintetizado pela adição de 2-amino-lfenilpropil-1-ol no C-terminal, que derivou do inibidor natural de tubulina polimerase dolastatina-10. A atividade inibitória do MMAE contra uma variedade de linhas celulares tumorais humanas é menor que 1 nanomolar. A fim de reduzir a atividade citotóxica de MMAE, a MMAF foi desenvolvida pela adição de uma fenilalanina ao C-terminal da dolastatina-10. Devido à introdução estrutural de um grupo carboxila, o MMAF possui baixa permeabilidade na membrana celular e, portanto, sua bioatividade para as células diminui significativamente. No entanto, a atividade inibitória para as células após o acoplamento com anticorpos foi bastante aumentada (US7750116).
[0130] CPT é uma abreviação de camptotecina e, no presente pedido, a CPT é usada para denotar a própria camptotecina ou um análogo ou derivado da camptotecina. A estrutura da camptotecina e alguns de seus análogos com o número mostrado e o anel marcado com as letras A-E é fornecida pela fórmula a seguir.
Figure BR112019020174A2_D0008
CPT: R1=R2=R3=H
10-hidroxi-CPT: R1=OH; R2=R3=H
K>O
Irinotecano (CPT-11): Rl=° ; R2= Etil; R3=H
SN-38: R1=OH; R2= Etil; R3=H
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Topotecano: R1=OH; R2=H; R3=CH-N(CH3)2
[0131] Conforme usado na presente invenção, conjugado de anticorpofármaco é referido como ADC de forma intercambiável.
[0132] O termo grupo mercapto livre na presente invenção significa um grupo estrutural que contém um átomo de enxofre, referindo-se principalmente a um grupo mercapto em um fármaco ou toxina, um grupo mercapto exposto após a redução de uma ponte dissulfeto de uma proteína de ligação a antígeno, ou um grupo mercapto na lisina ou cisteína de uma proteína de ligação a antígeno lisina ou uma cisteína.
[0133] O termo ligação tioéter refere-se a uma classe de ligações estruturais com a fórmula -S-.
[0134] O termo agente redutor é uma substância que perde elétrons ou possui um desvio eletrônico em uma reação redox. O agente redutor em si também é um antioxidante em um sentido amplo, que possui capacidade redutora e será oxidado, e seu produto é chamado de produto de oxidação. Em uma modalidade da presente invenção, o agente redutor é representado pelo RA, e as modalidades não limitativas do agente redutor incluem: H2, carbono (C), monóxido de carbono (CO), pó de ferro reduzido (Fe), pó de zinco (Zn), metal alcalino (geralmente Li, Na, K) e outros metais ativos (tais como Mg, Al, Ca, La , etc.), cloreto estanoso (SnCb), ácido oxálico, boro-hidreto de potássio (KBH4), boro-hidreto de sódio (NaBFk), cianoboro-hidreto de sódio (NaCNBFh), triacetoxiboro-hidreto de sódio ((CFhCOObBHNa), hidreto de alumínio e lítio (L1AIH4), ácido hipofosforoso, hipofosfito de sódio, tiossulfato de sódio (NazSzCb), tris(2-carboxiletil)fosfina (TCEP), ditiotreitol (DTT), mercaptoetilamina, acetilcisteína (Ac-Cys).
[0135] O transportador de troca catiônica na presente invenção significa um transportador contendo um grupo de troca ácida, incluindo um
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44/66 transportador de troca catiônica do tipo ácido forte e um transportador de troca catiônica do tipo ácido fraco. O transportador de troca catiônica compreende uma resina de troca catiônica, uma membrana de troca catiônica, uma fibra de troca catiônica, preferencialmente uma resina de troca catiônica, na forma de um transportador. Um transportador de troca catiônica do tipo ácido forte contém principalmente um grupo reativo fortemente ácido, tal como um grupo de ácido sulfônico (-SO3H), e esse transportador de troca iônica pode trocar todos os cátions. Um transportador de troca catiônica do tipo ácido fraco contém um grupo reativo fraco, tal como um grupo carboxila (grupo -COOH), um grupo fosfato, etc., e esse transportador de troca iônica só pode trocar cátions tais como Ca2+ e Mg2+ em uma base fraca, enquanto o íons tais como Na+ K+, etc., em uma base forte não podem ser trocados. Modalidades não limitativas de resinas de troca catiônica de ácido forte são: Millpore Fractogel SO3; Millpore Eshmuno S; Millpore Eshmuno CPX; Impacto CaptoS da GE; GE SP Sepharose Fast Flow; HiTrapTM Capto S ImpAct. Modalidades não limitativas de resinas de troca catiônica de ácido fraco são: Millpore EMD COO-; GE CM Sepharose Fast Flow.
[0136] O termo alquila refere-se a um radical hidrocarboneto alifático saturado incluindo grupos de cadeia linear e cadeia ramificada de 1 a 20 átomos de carbono, preferencialmente um grupo alquila contendo 1 a 12 átomos de carbono, mais preferencialmente 1 a 10 átomos de carbono, mais preferencialmente 1 a 6 átomos de carbono. Modalidades não limitativas incluem metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, terc-butila, secbutila, n-pentila, 1,1-dimetilpropila, 1,2-dimetilpropila, 2,2-dimetilpropila, 1etilpropila, 2-metilbutila, 3-metilbutila, n-hexila, l-etil-2-metilpropila, 1,1,2trimetilpropila, 1,1-dimetilbutila, 1,2-d imetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 1,3dimetilbutila, 2-etilbutila, 2-metilpentila, 3-metilpentila, 4-metilpentila, 2,3dimetilbutila, n-heptila, 2-metil-hexila, 3-metil-hexila, 4-metil-hexila, 5-metil
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45/66 hexila, 2,3-dimetilpentila, 2,4-dimetilpentila, 2,2-dimetilpentila, 3,3dimetilpentila, 2-etilpentila, 3-etilpentila, n-octila, 2,3-dimetil-hexila, 2,4dimetil-hexila, 2,5 -dimetil-hexila, 2,2-dimetil-hexila, 3,3-dimetil-hexila, 4,4dimetil-hexila, 2-etil-hexila, 3-etil-hexila, 4-etil-hexila, 2-metil-2-etilpentila, 2metil-3-etilpentila, n-decila, 2-metil-2-etil-hexila, 2-metil-3-etil-hexila, 2,2dietilpentila, n-decila, 3,3-dietil-hexila, 2,2-dietil-hexila e vários isômeros ramificados dos mesmos. Os mais preferidos são grupos alquila inferior com 1 a 6 átomos de carbono, modalidades não limitativas incluindo metila, etila, npropila, isopropila, n-butila, isobutila, terc-butila, sec-butila Base, n-pentila, 1,1dimetilpropila, 1,2-dimetilpropila, 2,2-dimetilpropila, 1-etilpropila, 2-metilbutila, 3-metilbutila, n-hexila, l-etil-2-metilpropila, 1,1,2-trimetilpropila, 1,1dimetilbutila, 1,2-dimetilbutila, 2,2-dimetilbutila, 1,3-dimetilbutila, 2-etilbutila, 2-metilpentila, 3-metilpentila, 4-metilpentila, 2,3-dimetilbutila e semelhantes. O grupo alquila pode ser substituído ou não substituído e, quando substituído, o substituinte pode ser substituído em qualquer local disponível para ligação, e um ou mais dos seguintes grupos são preferencialmente selecionados a partir do grupo que consiste em alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, fluorenila, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila, anel alcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio, heterocicloalquiltio e oxo independentemente.
[0137] 0 termo cicloalquila refere-se a um substituinte de hidrocarboneto cíclico, monocíclico ou policíclico, saturado ou parcialmente insaturado contendo 3 a 20 átomos de carbono, preferencialmente 3 a 12 átomos de carbono, mais preferencialmente 3 a 10 átomos de carbono, mais preferencialmente 3 a 8 átomos de carbono. Modalidades não limitativas de grupos cicloalquila monocíclicos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclopentenila, ciclo-hexila, ciclo-hexenila, ciclo-hexadienila, ciclo-heptila, ciclo
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46/66 heptatrienila, ciclo-octila, etc. O grupo cicloalquila policíclico inclui o grupo cicloalquila de um anel espiro, um anel fundido e um anel em ponte.
[0138] O termo heterociclila refere-se a um substituinte hidrocarboneto cíclico monocíclico ou policíclico saturado ou parcialmente insaturado contendo 3 a 20 átomos no anel, em que um ou mais átomos no anel são heteroátomos selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou S(O)m (em que m é um número inteiro de 0 a 2), mas excluindo a porção do anel de -00-, -OS- ou -SS-, e os átomos restantes do anel são carbono. Preferencialmente, contém 3 a 12 átomos no anel, em que 1 a 4 dos mesmos são heteroátomos; mais preferencialmente um anel do grupo cicloalquila contendo 3 a 10 átomos no anel. Modalidades não limitativas de grupos heterociclos monocíclicos incluem pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, morfolinila, tiomorfolila, homopiperazinila e semelhantes. Grupos heterociclos policíclicos incluem grupo heterociclo de anel espiro, anel fundido e anel em ponte.
[0139] O anel heterociclila pode ser fundido com um anel arila, heteroarila ou cicloalquila, em que o anel conectado à estrutura precursora é um grupo heterocíclico. Modalidades não limitativas das quais incluem:
[0140] O grupo heterocíclico pode ser opcionalmente substituído ou não substituído e, quando substituído, o substituinte é preferencialmente selecionado a partir de um ou mais dos seguintes grupos independentemente: alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquil sulfanila, alquilamino, halogênio, fluorenila, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio, heterocicloalquiltio e oxo.
[0141] O termo arila refere-se a um anel monocíclico todo de carbono ou
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47/66 policíclico fundido (ou seja, anéis que compartilham pares adjacentes de átomos de carbono) grupos de 6 a 14 átomos de carbono com um sistema π-elétron conjugado, preferencialmente 6 a 10 átomos, tal como fenila e naftila, preferencialmente fenila. O anel arila pode ser fundido a um anel heteroarila, heterociclila ou cicloalquila, em que o anel ao qual a estrutura precursora está ligada é um anel arila, modalidades não limitativas das quais incluem:
Figure BR112019020174A2_D0009
[0142] O grupo arila pode ser substituído ou não substituído e, quando substituído, o substituinte é preferencialmente um ou mais dos seguintes grupos selecionados independentemente a partir de alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, fluorenila, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicloalquiltio.
[0143] O termo heteroarila refere-se a um sistema heteroaromático contendo 1 a 4 heteroátomos e 5 a 14 átomos no anel, em que os heteroátomos são selecionados a partir do grupo que consiste em oxigênio, enxofre e nitrogênio. O grupo heteroarila é preferencialmente de 5 a 10 membros, mais preferencialmente 5 ou 6 membros, tal como furila, tienila, piridila, pirrolila, Nalquilpirrolila, pirimidinila, pirazinila, imidazolila, tetrazolila e semelhantes. O anel heteroarila pode ser fundido com um anel arila, heterocíclico ou cicloalquila, em que o anel conectado à estrutura precursora é um anel heteroarila, modalidades não limitativas das quais incluem:
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Figure BR112019020174A2_D0010
Figure BR112019020174A2_D0011
[0144] O grupo heteroarila pode ser opcionalmente substituído ou não substituído, e quando substituído, o substituinte é preferencialmente um ou mais dos seguintes grupos independentemente selecionados a partir de alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, fluorenila, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicloalquiltio.
[0145] O termo alcóxi refere-se a -O- (alquila) e -O- (cicloalquila não substituído), em que a alquila ou a cicloalquila é como definido acima. Modalidades não limitativas de grupos alcóxi incluem: metóxi, etóxi, propóxi, butóxi, ciclopropóxi, ciclobutóxi, ciclopentilóxi ou ciclo-hexilóxi. O grupo alcóxi pode ser opcionalmente substituído ou não substituído e, quando substituído, o substituinte é preferencialmente um ou mais dos seguintes grupos independentemente selecionados a partir de alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alquiltio, alquilamino, halogênio, fluorenila, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicloalquiltio.
[0146] O termo alquilamino refere-se a -N-(alquila) e -N-(cicloalquila não substituído), em que a alquila ou a cicloalquila é como definido acima. Modalidades não limitativas de grupos alquilamino incluem: metilamino, etilamino, propilamino, butilamino, ciclopropilamino, ciclobutilamino, ciclopentilamino ou ciclo-hexilamino. O grupo alquilamino pode ser opcionalmente substituído ou não substituído e, quando substituído, o
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49/66 substituinte é preferencialmente um ou mais dos seguintes grupos independentemente selecionados a partir de alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcanotio, alquilamino, halogênio, fluorenila, hidróxi, nitro, ciano, cicloalquila, heterocicloalquila, arila, heteroarila, cicloalcóxi, heterocicloalcóxi, cicloalquiltio e heterocicloalquiltio.
[0147] O termo ligação refere-se a uma ligação covalente representada por
[0148] O termo hidróxi refere-se a um grupo -OH.
[0149] O termo halogênio significa flúor, cloro, bromo ou iodo.
[0150] O termo grupo carboxilato refere-se a -C(O)O(alquila) ou (cicloalquila) em que a alquila ou a cicloalquila é como definido acima. Opcional ou opcionalmente significa que o evento ou ambiente descrito subsequentemente pode, mas não precisa, ocorrer, e a descrição inclui ocasiões em que o evento ou ambiente ocorre ou não. Por exemplo, grupo heterocíclico opcionalmente substituído por um grupo alquila significa que um grupo alquila pode estar presente, mas não necessariamente, e a descrição inclui a ocasião em que o grupo heterocíclico é substituído por um grupo alquila e a ocasião em que o grupo heterocíclico não é substituído por um grupo alquila.
[0151] Substituído refere-se a um ou mais átomos de hidrogênio no grupo, preferencialmente até 5, mais preferencialmente 1 a 3 átomos de hidrogênio, independentemente um do outro, substituídos por um número correspondente de substituintes. É evidente que os substituintes estão apenas em suas possíveis posições químicas, e os versados na técnica serão capazes de determinar (por experimento ou teoria) as substituições que podem ou não ser possíveis sem esforço indevido. Por exemplo, um grupo amino ou um grupo hidroxila com um hidrogênio livre pode ser instável quando combinado com um átomo de carbono com uma ligação insaturada (por exemplo, olefínica).
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Abreviação
MMAE = monometil auristatina E (MW718)
MMAF = Uma variante de auristatina E (MMAE) com fenilalanina no Cterminal do fármaco (MW731.5)
DM1 = N(2')-desacetil-N(2')-(3-mercapto-l-oxipropil)-maitansina
DM3 = N(2')-desacetil-N2-(4-mercapto-l-oxopentil)-maitansina
DM4 = N(2')-desacetil-N2-(4-mercapto-4-metil-l-oxopentil)-maitansina
SMCC = succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato
LC-SMCC = succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxi-(6amidocaproato)
KMUA = éster N-succinimidílico do ácido κ-maleimidaundecanoico
GMBS = éster N-succinimidílico de ácido γ-maleimidabutírico
EMCS = éster de N-hidroxissuccinimida de ácido ε-maleimidocaproico
MBS = éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida
AMAS = éster N-(a-maleimidoacetato)-succinimidílico
SMPH = succinimidil-6-(3-maleimidopropionamido)hexanoato
SMPB = 4-(p-maleimidofenil) -butirato de N-succinimidil
PMPI = N-(p-maleimidofenil)isocianato
SIAB = N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato
SIA = iodoacetato de N-succinimidil
SBA = bromoacetato de N-succinimidil
SBAP = 3-(bromoacetilamino)propionato de N-succinimidil
Método para sintetizar o composto da presente invenção
[0152] Para atingir os objetivos da presente invenção, a presente invenção adota as seguintes soluções técnicas:
Solução 1
[0153] A invenção também fornece um método de preparação da fórmula
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51/66 geral ADC-1, em que as etapas incluem a etapa a (tal como na modalidade 2), a etapa b (tal como na modalidade 4), a etapa c (tal como na modalidade 5 ) na etapa 1) acima e na etapa 2) e na etapa 3) (tal como na modalidade 6); detalhes a seguir:
Bmin-ação reáütb/a
, ------------mAh.. etapa lYa T imobilisBda para colis^e áe troca iônica Ί/R -ό·ζ etapa
£·:5 íteãprC-tSy t:Oí w. ----------------Kj, eíuiçao etspa
etapa l)-c. ' i 5·« fN - : r?..... L,.ΰ: ‘
AOC-1
[0154] Os mAbs descritos na presente invenção são as proteínas de ligação a antígeno da presente invenção, e as definições de Li-Dr e l_2 são como definidas na fórmula geral (Lz) e na fórmula (Li-Dr).
[0155] Modalidades não limitativas da fórmula geral ADC-1 preparada pela presente invenção são as seguintes:
Figure BR112019020174A2_D0012
[0156] O mAb descrito na presente invenção é o anticorpo EGFR descrito na Modalidade 2 e o anticorpo anti-c-Met descrito na Modalidade 11.
Solução 2
[0157] A presente invenção também fornece um método de preparação da fórmula geral ADC-2 (ver modalidade ilustrativa, tal como a Modalidade 9), as etapas incluindo a etapa A, a etapa B na etapa 1) acima e a etapa 2) e a etapa 3); detalhes a seguir:
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52/66 res.çã o tis reduçãs Li*Dr mAb mAb »-$h tapa ii-A etaps -r’P- 25 et3fS ~
ADO2
[0158] 0 mAb é a proteína de ligação a antígeno da presente invenção, e a proteína de ligação a antígeno é imobilizada no transportador de íons pela etapa A na etapa 1), e a reação de redução é adicionalmente realizada para reagir com o fármaco; a definição de Li-Dr é como descrita na fórmula geral (Li-Dr).
[0159] A modalidade não limitativa da fórmula geral ADC-2 preparada pela presente invenção é a seguinte:
Figure BR112019020174A2_D0013
Figure BR112019020174A2_D0014
[0160] O mAb descrito na presente invenção é o anticorpo EGFR descrito na Modalidade 9 e o anticorpo anti-c-Met descrito na Modalidade 11.
[0161] Os efeitos benéficos da invenção são:
1. Na presente invenção, a imobilização de biomoléculas é realizada por uma interação eletrostática entre uma biomolécula de anticorpo e uma resina de troca iônica, evitando assim a agregação de biomoléculas causadas por colisão mútua durante o processo de acoplamento.
2. As etapas do processo da invenção são simples e convenientes de operar. Ele realiza controle programático, evita erros humanos e melhora a eficiência da produção.
3. Ao imobilizar biomoléculas tal como anticorpos, a retenção zero de solventes orgânicos é alcançada e os efeitos colaterais dos fármacos são
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53/66 reduzidos.
4. Ao otimizar as condições de eluição, o valor DAR (razão de ligação a anticorpo-fármaco) pode ser efetivamente controlado dentro da faixa requerida, enquanto isso, o conjugado de anticorpo-fármaco contendo o polímero pode ser separado e removido.
5. As condições do processo de produção são suaves, evitando danos mecânicos às biomoléculas, tal como anticorpos, e garantindo a integridade do anticorpo.
6. A concentração e o uso de moléculas pequenas tóxicas e a toxicidade para o corpo humano e a poluição ambiental durante a operação podem ser reduzidas pelo presente processo.
7. A etapa de purificação do cátion no processo de purificação do anticorpo pode ser eliminada e a eficiência da purificação pode ser melhorada.
8. A síntese de fármacos ADC por meio de um transportador de troca iônica reduz o custo de produção, enquanto usa uma grande quantidade de amostra. Espera-se que cada litro de carga possa usar não menos do que 50 g de biomoléculas, tal como anticorpos, o que é útil para a produção de escala em lote.
Breve descrição dos desenhos
[0162] Figura 1. Equação da reação para anticorpo e agente de reticulação;
[0163] Figura 2. Efeito da razão molar de agente de reticulação para anticorpo no valor LAR;
[0164] Figura 3. Equação da reação de remoção para o grupo protetor teminal do agente de reticulação;
[0165] Figura 4. Diagrama de fluxo da ligação da toxina e a eluição do conjugado de anticorpo-fármaco;
[0166] Figura 5. Cromatograma de eluição gradual do conjugado de
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54/66 fármaco-anticorpo EGFR;
[0167] Figura 6. Cromatograma de eluição gradual de ADC obtido por acoplamento de ponte dissulfeto intercadeia de anticorpos EGFR;
[0168] Figura 7. Resultados da análise SEC de conjugados de anticorpofármaco eluídos usando acoplamento por lisina; (A) gráfico de análise do anticorpo-agente agente de reticulação; (B) gráfico de análise do pico de eluição A; (C) gráfico de análise do pico de eluição B; (D) gráfico de análise do pico de eluição C;
[0169] Figura 8. Análise por espectrometria de massa da ligação do anticorpo ao agente de reticulação;
[0170] Figura 9. Análise por espectrometria de massa de conjugados de fármaco-anticorpo EGFR;
[0171] Figura 10. Análise HIC do acoplamento de ponte dissulfeto intercadeia do anticorpo EGFR;
[0172] Figura 11. Análise dos resultados do acoplamento de fármaco ADC do anticorpo anti-c-Met; (A) espectrometria de massa dos resultados do acoplamento por lisina; (B) Diagrama HIC do acoplamento redutor por ponte dissulfeto intercadeia.
Descrição detalhada da modalidade preferida
[0173] A presente descrição não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas, as quais são pretendidas como ilustrações de aspectos individuais da divulgação, e o espírito e o escopo da invenção não se limitam a ela. Salvo indicação em contrário, os métodos experimentais nas modalidades da presente invenção são selecionados geralmente de acordo com as condições convencionais que são favoráveis à produção; ou de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante da matéria-prima ou da mercadoria. Salvo indicação em contrário, os reagentes utilizados na presente invenção estão
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55/66 comercialmente disponíveis.
Modalidade 1. Construção e expressão do anticorpo EGFR
[0174] O anticorpo EGFR mAbOOl é uma variante de imotuzumabe modificada por IgGl-YTE obtida por mutação pontual de nimotuzumabe.
[0175] Os iniciadores foram projetados para PCR construindo o fragmento do gene VH/VK do anticorpo e depois recombinados homologicamente com o veículo de expressão pHr (com peptídeo sinal e fragmento do gene da região constante (CH1-FC/CL)) para construir o veículo de expressão de anticorpo de comprimento total VH-CHl-FC-pHr/VK-CL-pHr. A forma original do plasmídeo pode expressar IgG 1 e o anticorpo IgGl-YTE compreendendo mutações de triplo sítio, isto é, M258Y/S260T/T262E (YTE), foi obtido por mutação pontual. A sequência final do anticorpo EGFR mAbOOl é apresentada na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Após o plasmídeo ter sido verificado por sequenciamento e isolado por um método bem conhecido na técnica, e a expressão transiente de célula 293 foi realizada, obtendo-se assim o sobrenadante da cultura contendo a proteína do anticorpo de interesse para isolamento e purificação.
[0176] A sequência de anticorpo de mAbOOl é a seguinte:
Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAbOOl: SEQ ID NO: 1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQNIVHSNGNTYLDWYQQTPGKAPKLLIYKVS NRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCFQYSHVPWTFGQGTKLQITRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYE KH KVYACEVTH QG LSSPVTKSFN RG EC
Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAbOOl: SEQ ID NO:2
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTNYYIYWVRQAPGQGLEWIGGINPTS GGSNFNEKFKTRVTITADESSTTAYMELSSLRSEDTAFYFCTRQGLWFDSDGRGFDFWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP
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APELLGGPSVFLFPPKPKDTLYIIREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSPG K
[0177] Nota: Duplo sublinhado representa os locais de mutação YTE. purificação e análise do anticorpo mAbOOl:
[0178] O sobrenadante da cultura celular acima foi centrifugado em alta velocidade para remover impurezas e, em seguida, foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de proteína A. A coluna foi enxaguada com PBS até a leitura do A280 cair para a linha de base. A proteína de interesse foi eluída com acetato de sódio 100 mM, pH 3,0 e neutralizada com Tris-HCI 1 Μ. A amostra eluída foi adequadamente concentrada e, além disso, purificada por peneira molecular utilizando a coluna de cromatografia em gel Superdex 200 (GE), que foi equilibrada com PBS, e as amostras do pico de absorção com monômeros de anticorpos foram coletadas e agrupadas. A amostra pôde ser concentrada ou o tampão da amostra pode ser substituído por métodos de ultrafiltração bem conhecidos na técnica para obter uma amostra final com concentração adequada.
Modalidade 2. Reação de aminação redutiva do anticorpo monoclonal anticorpo EGFR e agente de reticulação
[0179] Com base em um mecanismo de acoplamento por lisina, a solução estoque de 20 mg/mL de anticorpo monoclonal mAbOOl foi substituída por um tampão de modificação (ácido acético 100 mM + acetonitrila 10%, pH 4,3) e agente de reticulação bifuncional 3-acetil mercapto (ATPPA) 0,65-1,7 mM e 25 mM de agente redutor cianoboro-hidreto de sódio (NaBFhCN) foram adicionados, modificando assim a lisina a uma temperatura de 24 a 36°C com agitação a 100 rpm por 2 horas. O grupo amino (-NH2) no anticorpo monoclonal
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57/66 foi redutivamente aminado com o grupo aldeído no final do agente de reticulação para formar o intermediário I, e a equação da reação foi demonstrada na FIG. 1. O valor LAR diferiu da quantidade de mAb-agente de reticulação produzido sob condições de reação de temperatura diferente, como demonstrado na Tabela 1, na qual a razão molar do agente de reticulação para o anticorpo é 6. O agente de reticulação livre foi removido pelo sistema de ultrafiltração (UF) e o tampão do Intermediário I foi substituído por um novo tampão (tampão fosfato 20 mM, pH 6,3) e armazenado até o uso. FIG. 2 demonstra a otimização da razão molar do agente de reticulação para o anticorpo monoclonal. Quando a razão do agente de reticulação para o anticorpo monoclonal foi controlada a 8:1 a uma temperatura de 28°C por 2 horas, a razão de acoplamento da razão de agente de reticulação-anticorpo monoclonal (LAR) no produto pode ser controlada em cerca de 3,5.
O
3-acetil-mercapto (ATPPA)
Tabela 1 Efeito de diferentes temperaturas na ligação de mAbOOl e agente de reticulação
Temperatura (°C) Valor LAR Teor de mAb (%)
24 1,68 97,96
28 1,84 97,71
32 2,04 96,72
36 2,23 96,21
Modalidade 3. Enxágue de agente de reticulação para coluna de troca iônica
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[0180] No processo de sintetizar ADC por estratégia de acoplamento por lisina, 1 mL de resina de troca catiônica Fractogel®SO3 (M) da MercK Millipore foi usado com o transportador para sintetizar ADC. Uma forte matriz hidrofóbica foi bloqueada com agente de reticulação de acordo com as etapas a seguir.
1) Equilíbrio: 5 volumes de coluna (CV) de tampão acetato 100 mM (acetonitrila 5%, pH 4,3) fluíram através de 1 mL da coluna de troca catiônica Millipore SO3 (M) a uma vazão de 0,2 mL/min.
2) Enxágue: A solução de 3-acetil-mercapto (ATPPA) 650 mM foi preparada com o tampão de acetato acima descrita para equilíbrio, e a coluna foi enxaguada e equilibrada a uma vazão de 20 CV a 0,2 mL/min.
Modalidade 4. Ligação do anticorpo ligado ao agente de reticulação e coluna de troca iônica
1) Equilíbrio: Utilizando uma resina de troca catiônica forte (-SO3) como o meio, foram utilizados 5 CV do tampão de equilíbrio para enxaguar a resina a uma vazão de 0,2 mL/min.
2) Carregamento: Controlando a condutividade da solução intermediária I dentro de 5 mS/cm, ajustando o pH para 6,3 com ácido cítrico 1 M e Tris 1 M, fluindo a solução intermediária I através da coluna de troca iônica a uma vazão de 0,2 mL/min, e cuja capacidade foi controlada em 10 a 50 mg/mL.
3) Enxágue: Enxaguar a coluna com 3 CV de tampão de equilíbrio.
4) 2- enxágue: Remoção completa dos íons acumulados na coluna de troca iônica com 3 CV de tampão de reação (tampão de acetato 100 mM + acetonitrila a 5%, pH 4,3) a uma vazão de 0,2 mL/min.
5) 3^ enxágue: Remoção de acetonitrila com 5 CV de tampão de equilíbrio a uma vazão de 0,2 mL/min.
Modalidade 5. Desproteção no terminal do agente de reticulação
[0181] O intermediário I ligado à coluna de troca iônica contém agente de
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59/66 reticulação com o grupo protetor terminal, e o grupo protetor terminal do qual precisava ser convertido no grupo mercapto livre com agente desprotetor cloridrato de hidroxilamina (NH2OH HCI) para facilitar a ligação subsequente do intermediário I à toxina. Uma solução de cloridrato de hidroxilamina 20 mM foi preparada com o tampão de equilíbrio e a coluna foi enxaguada com 12 CV de solução de cloridrato de hidroxilamina a uma vazão de 0,2 mL/min para reduzir completamente o grupo sulfidril no terminal do agente de reticulação para formar o intermediário II. A equação da reação é demonstrada na FIG. 3. Após o término da reação, a coluna foi enxaguada diretamente com 5 CV de tampão de equilíbrio a uma vazão de 0,2 mL/min.
Modalidade 6. Acoplamento de anticorpo e toxina
[0182] A estrutura da toxina usada neste experimento é a seguinte:
[0183] As toxinas podem ser preparadas de acordo com o método do pedido de patente WO2016127790A1. No processo de acoplamento da toxina, um novo tampão de reação (tampão de fosfato 20 mM + acetonitrila a 5%, pH 6,3) é usado para preparar 40 CV de solução de toxina de 10 mM. Veja a Figura 4 para todo o processo.
1) Equilíbrio: A coluna de troca iônica ligada ao intermediário II foi equilibrada com um total de 5 CV de novo tampão (tampão fosfato 20 mM + acetonitrila a 5%, pH 6,3) a uma vazão de 5 CV a uma vazão de 0,2 mL/min.
2) Carregamento: 30 a 50 CV de toxina 10 mM foram fluidos através da
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60/66 coluna de troca iônica a uma vazão de 0,2 mL/min e reagiram à temperatura ambiente.
3) Enxágue: As toxinas não ligadas na reação foram enxaguadas com 5 CV de tampão (tampão de fosfato 20 mM + acetonitrila a 5%, pH 6,3) a uma vazão de 0,2 mL/min.
4) Enxágue secundário: Enxaguar a acetonitrila residual com 5 CV de tampão de equilíbrio (tampão fosfato 100 mM, pH 6,3) a uma vazão de 0,2 mL/min.
5) Eluição: A eluição foi realizada com 15 CV de tampão de eluição (ácido cítrico 20 mM + NaCI 110 mM, pH 5,5) a uma vazão de 0,2 mL/min.
6) Eluição secundária: outro tampão de 15 CV de eluição (ácido cítrico 20 mM + NaCI 180 mM, pH 5,5) foram utilizados para eluir o polímero que pode ser produzido a uma vazão controlada de 0,2 mL/min. Toda a cromatografia de eluição é mostrada na Figura 5 e a análise de dados relevantes é mostrada na Tabela 2.
7) Regeneração: A coluna de troca iônica foi regenerada com 5 CV de NaOH 1 M a uma vazão de 0,2 mL/min.
[0184] Como resultado, a estrutura de ADC ilustrada obtida pela presente invenção é a seguinte:
Figure BR112019020174A2_D0015
Tabela 2 Caracterização dos picos de eluição em diferentes estágios
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61/66 ,A„, Teorde
LAR/ q
Amostra _ polímeros'2DAR® (%)
Teor de mAb® fragmento (%) (%)
.. I Concen- Quantidade Volume '-oncen .
tração pH produzida (mL) (mg/mL) (%)
Estratégia de Acoplamento por Lisina mAb-
agente de reticulação 3,58 5,28 94,39 0,33 22 1,8 6,3 100
Pico A 2,59 3,23 96,77 0 8,1 3,73 5,5 75,5
Pico B 2,88 44,89 55,11 0 3,3 0,73 5,5 6,08
Pico C 3,26 56,07 53,93 0 1,0 0,9 5,5 2,27
Estratégia de Acoplamento por Ponte Dissulfeto Intercadeia
mAb 0 2,37 96,93 0,7 10,6 1,88 7,4 100
Pico A 3,34 0,6 98,94 0,46 3,57 2,23 5,5 39,8
Pico B 4,61 21,5 76,56 1,94 2 0,78 5,5 7,8
[0185] Nota: (D Para a estratégia de acoplamento por lisina, os dados são derivados dos resultados da análise da MS; para a estratégia de acoplamento de ponte dissulfeto intercadeia, os dados são derivados dos resultados da análise de HIC; (2)Os dados são derivados dos resultados da análise de SEC.
Modalidade 7. Método de análise por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)
[0186] Na preparação de fármacos ADC, apenas os conjugados de anticorpos monoclonais e toxinas são realmente curativos. Para analisar o teor de ingredientes ativos nos fármacos ADC, coluna Waters X Bridge® BEH SEC (PN:
186007640; SN: 01143613316121; Tamanho: 7,8x300 mm, 200 A, 3,5 pm), coluna pré-empacotada (PN: 186007638; SN: 01093616216101; Tamanho: 7,8 x mm, 200 A, 3,5 pm), com vazão de 100 mM, pH 6,7 tampão fosfato contendo sulfato de sódio 20 mM e isopropanol a 3% (v/v). A análise SEC foi realizada nos diferentes picos de eluição nos resultados cromatográficos. Foram injetados 100 pg de proteína e o pico de absorção a 280 nm foi medido a uma vazão de 0,5
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62/66 mL/min. Os resultados são demonstrados na Fig. 7.
Modalidade 8. Análise por espectrometria de massa da razão de acoplamento toxina de fármaco-anticorpo (DAR) de toxina de fármaco de molécula pequena para anticorpo
[0187] O fármaco ADC (pico A) eluído da coluna de troca catiônica acima foi tratado por Waters Xevo G2-XS Q-TOF (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) em um modo ESI de íon positivo na faixa de 500-5000 m/z, e dados de espectrometria de massa de moléculas ADC desglicosiladas foram obtidos. A temperatura do gás de dessolvatação foi de 450°C, a vazão de gás foi de 800 L/h, a temperatura da fonte de íons foi de 120°C e a tensão capilar foi de 3000 V, respectivamente. Os dados brutos foram convertidos em uma espectrometria de massa de carga zero usando o algoritmo de deconvolução de máxima entropia no software UNIFI versão 1.8. O peso molecular do anticorpo mAbOOl, do agente de reticulação e da toxina são 147.458 Da, 132 Da e 955 Da, respectivamente. A quantidade de carga da molécula ADC desglicosilada é de 1 pg e a razão de acoplamento toxina de fármaco-anticorpo (DAR) é calculada como:
DAR =
[0188] Nota: DAR: razão de acoplamento de toxina para anticorpo; Vn: área de pico do anticorpo acoplado a n moléculas de fármaco; n = 0, 1, 2, 3 ... (n>0)
[0189] A razão de acoplamento toxina de fármaco-anticorpo (DAR) é crítico para a eficácia dos fármacos ADC, e a razão do agente de reticulaçãoanticorpo monoclonal (LAR) afeta diretamente a DAR subsequente. A Figura 8 é um espectrograma de massa de anticorpo EGFR acoplado ao agente de reticulação com um valor LAR de 3,58; a Figura 9 é uma análise espectrométrica
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63/66 de massa de fármaco ADC de anticorpo de EGFR com um valor de DAR de 2,59.
Modalidade 9. Reação de redução da ponte dissulfeto intercadeia do anticorpo EGFR monoclonal
[0190] A estratégia de acoplamento para a ponte dissulfeto intercadeia diferiu do mecanismo de acoplamento por lisina. Antes do anticorpo EGFR se ligar ao transportador, a ponte dissulfeto não é quebrada e a matriz de transportador hidrofílica não interage com a ponte dissulfeto. Portanto, 1 mL da resina de troca catiônica da GE, HiTrapTM Capto S ImpAct, é usado como transportador imobilizado, cuja matriz é a agarose hidrofílica.
[0191] A coluna foi equilibrada com tampão de fosfato 20 mM, pH 6,3, contendo EDTA 2 mM, a uma vazão de 0,2 mL/min. Então, 60 CV da amostra de anticorpo EGFR monoclonal foram carregados na mesma vazão e a carga foi controlada a 20 mg. O tampão de equilíbrio foi usado para continuar a enxaguar e remover o anticorpo monoclonal não ligado ou as impurezas. Subsequentemente, a coluna de troca iônica foi transferida para uma camada intermediária isolante a 40°C (para garantir que os anticorpos TCEP e EGFR do agente redutor reagissem a 40°C). 24 CV do agente redutor TCEP tendo 6 vezes a concentração molar do anticorpo foram dissolvidos no tampão de equilíbrio e fluíram lentamente através da coluna a uma vazão de 0,2 mL/min. Imediatamente após a reação de redução, a coluna de troca iônica foi retirada da camada intermediária isolante e colocada à temperatura ambiente (20 a 25°C, produção industrial de rotina com 25°C), e os fármacos foram adicionados e colocados em contato com a proteína de ligação a antígeno imobilizada, garantindo que a reação do fármaco com o grupo mercapto reduzido fosse realizada à temperatura ambiente. O agente redutor restante não precisa ser enxaguado e é enxaguado diretamente e removido na próxima etapa de acoplamento com o fármaco.
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[0192] A estrutura de ADC obtida por esse método é a seguinte. A ligação à toxina e a eluição do produto são semelhantes às da Modalidade 6. A cromatografia de eluição é demonstrada na Fig. 6 e a análise de dados relevante é demonstrada na Tabela 2.
Figure BR112019020174A2_D0016
Modalidade 10. Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC)
[0193] Como a estratégia de acoplamento da ponte dissulfeto exige a quebra da ponte dissulfeto primeiro entre as cadeias pesadas ou entre a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo EGFR, uma série de picos de espectrometria de massa de cadeias pesadas e cadeias leves será obtida ao analisar o valor de acoplamento do fármaco por espectrometria de massa, o que dificulta a análise do valor DAR. Portanto, o valor DAR foi determinado por análise de HIC aqui de acordo com a forte hidrofobicidade do fármaco de ligação a anticorpo.
[0194] A cromatografia hidrofóbica foi realizada usando uma coluna TOSOH TSK-butil NPR com um gradiente linear de 0 a 100% de tampão A e B dentro de 12 minutos a uma vazão de 0,5 mL/min, em que o tampão A contém 1,5 M de acetato de amônio e 25 mM de fosfato de sódio, pH 6,95, e o tampão B contém 25 mM de fosfato de sódio, 25% de IPA, pH 6,95. A razão de acoplamento fármaco-anticorpo do conjugado foi determinada pela absorbância integradora a 280 nm da área do pico de eluição. A Figura 10 demonstra os resultados do acoplamento aleatório de pontes dissulfeto de anticorpos EGFR (DAR = 3,34). O
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65/66 método utilizado na presente invenção possui certa versatilidade e não é limitado pelos tipos de anticorpos.
Modalidade 11. Preparação do conjugado de anticorpo anti-c-Met-fármaco [0195] A fim de verificar a versatilidade da presente invenção no campo da aplicação de anticorpos monoclonais, outro anticorpo: anticorpo c-Met foi selecionado para a preparação do fármaco ADC. Dois métodos de acoplamento, o acoplamento por lisina e estratégia de acoplamento ponte dissulfeto intercadeia, também foram utilizados, e os métodos experimentais específicos e toxinas utilizados na presente invenção são semelhantes aos conjugados de fármaco-anticorpo EGFR preparados na modalidade acima.
[0196] O anticorpo c-Met mAb002 é um anticorpo monoclonal humanizado preparado de acordo com o método da CN106188293A.
[0197] A sequência de anticorpos de mAb002 é a seguinte: Sequência de aminoácidos da cadeia leve de mAb002: SEQ ID NO:3
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRADKSVSTSTYNYLHWYQQKPGQPPKLLIYLASNL ASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSRDLPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYE KH KVYACEVTHQG LSSPVTKSFN RG EC
Sequência de aminoácidos da cadeia pesada de mAb002: SEQ ID NO:4
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSNYGVHWVRQAPGKGLEWLAVIWSG GSTN YAAAFVSRLTISKDNSKNTVYLQM NSLRAE DTAVYYCARN H DN PYN YAM DYWG QGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPS REEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK SR WQQG N VFSCSVM H EALH N H YTQKSLSLSPG K
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[0198] Os resultados do acoplamento por lisina do conjugado de anticorpo c-Met-fármaco foram analisados usando MS, como demonstrado na Figura 11A. A estrutura de ADC-anticorpo c-Met obtido pelo método de acoplamento por lisina é a seguinte:
Figure BR112019020174A2_D0017
[0199] Durante o acoplamento de ponte dissulfeto intercadeia, o agente redutor foi substituído por DTT do TCEP original e a concentração de DTT foi 8 vezes a concentração molar de anticorpo c-Met. A etapa de acoplamento e outros parâmetros são semelhantes aos do anticorpo EGFR. A análise HIC do produto acoplado é demonstrada na Figura 11B. A ponte dissulfeto entre as cadeias de anticorpos c-Met é quase totalmente quebrada, e o DAR do fármaco ADC é de 4,85. A estrutura do fármaco ADC do anticorpo c-Met de acoplamento redutor da ponte dissulfeto intercadeia é a seguinte:

Claims (34)

1) imobilizar uma proteína de ligação a antígeno em um transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada;
1. Método para preparar um conjugado de proteína de ligação a antígenofármaco, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
2/12
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido transportador de troca iônica é selecionado a partir do grupo que consiste em resinas de troca iônica, membranas de troca iônica e fibras de troca iônica, preferivelmente resinas de troca iônica.
2) contatar a proteína de ligação a antígeno imobilizada com um fármaco para formar um conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco;
3/12 quando o grupo eletrofílico é do fármaco, o grupo eletrofílico é preferivelmente um éster ativo, um haleto de hidrocarbila, um grupo maleimida, mais preferivelmente um grupo maleimida; o éster ativo é preferivelmente um éster NHS, um éster HOBt, um haloformato e um haleto de ácido, em que o haleto de hidrocarbila é preferivelmente uma haloacetamida.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o transportador de troca iônica é um transportador de troca catiônica, em que o transportador de troca catiônica contém preferivelmente um ligante de reação fortemente ácido, e o ligante de reação fortemente ácido é preferivelmente um sulfonato.
3) eluir o conjugado de proteína de ligação a antígeno-fármaco do transportador de troca iônica.
4/12 seguinte fórmula (L2):
R13 * 15^ ^R16fcTVT (L2)
T é selecionado a partir de H, terc-butila, acetila, n-propionila, isopropionila, trifenilmetila, metoximetila, 2-(trimetilsilila) etoximetila, preferivelmente H ou acetila;
R15 é selecionado a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo ciano, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
R16 é selecionado a partir do grupo que consiste em alquila, cicloalquila e heterociclo;
m é 0-5, preferivelmente 1-3.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno imobilizada na etapa 2) é acoplada a um fármaco, em que a reação de acoplamento é tal que a proteína de ligação a antígeno e o fármaco são ligados através de uma interação entre um grupo nucleofílico e um grupo eletrofílico;
em que o grupo nucleofílico é opcionalmente da proteína de ligação a antígeno ou do fármaco, preferivelmente da proteína de ligação a antígeno, e em que o grupo eletrofílico é opcionalmente da proteína de ligação a antígeno ou do fármaco, preferivelmente do fármaco.
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5/12 preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em SIAB, SIA, SBA e SBAP, mais preferivelmente SIAB.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o grupo nucleofílico é selecionado a partir do grupo que consiste em um mercapto, um grupo hidroxila, um grupo amino, uma hidrazida, uma oxima, uma hidrazina, uma tiossemicarbazona, um carboxilato de hidrazina e um grupo aril hidrazida, desde que:
quando o grupo nucleofílico é do fármaco, o grupo nucleofílico é preferivelmente um grupo mercapto;
quando o grupo nucleofílico é da proteína de ligação a antígeno, o grupo nucleofílico é preferivelmente um grupo amino, um grupo mercapto ou um grupo hidroxila; e o grupo amino é mais preferivelmente um grupo amino Nterminal, um grupo amino da cadeia lateral ou um grupo amino de um sacarídeo em uma proteína de ligação a antígeno glicosilada; o grupo hidroxila é mais preferivelmente um grupo hidroxila de um sacarídeo em uma proteína de ligação a antígeno glicosilada, e o grupo mercapto é mais preferivelmente uma cadeia lateral de tiol e, mais preferivelmente, uma cadeia lateral de tiol de uma cisteína.
6/12 hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo ciano, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
pelo menos um dentre R8-R1:L é selecionado a partir do grupo que consiste em halogênio, alquenila, alquila e cicloalquila, e o restante são átomos de hidrogênio;
ou quaisquer dois dentre R8-R1:L formam grupos cicloalquila, e os dois grupos restantes são selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo alquila e um grupo cicloalquila;
R14 é selecionado a partir de arila ou heteroarila, e a arila ou heteroarila é opcionalmente ainda substituída com um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
R12-R13 são selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo alquila ou um halogênio;
preferivelmente, a fórmula (Dr) é um composto da seguinte fórmula (I):
Figure BR112019020174A2_C0004
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o conjugado de proteína de ligação a antígenofármaco é acoplado por um ligante selecionado a partir de um ligante clivável ou um ligante não clivável.
7/12
Figure BR112019020174A2_C0005
(Li-Dr) em que:
a estrutura Li é a seguinte:
o
Figure BR112019020174A2_C0006
0 ; preferivelmente MC;
n é 2-6, preferivelmente 2-5;
R, R2-R7 são selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo ciano, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
pelo menos um dentre R8-R1:L é selecionado a partir do grupo que consiste em halogênio, alquenila, alquila e cicloalquila, e o restante são átomos de hidrogênio;
ou quaisquer dois dentre R8-R1:L formam um grupo cicloalquila, e os dois grupos restantes são selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo alquila e um grupo cicloalquila;
R12-R13 são selecionados a partir de um átomo de hidrogênio, um grupo alquila ou um halogênio;
R14 é selecionado a partir de arila ou heteroarila, e a arila ou heteroarila é opcionalmente ainda substituída com um substituinte selecionado a partir do grupo que consiste em um átomo de hidrogênio, um halogênio, um grupo hidroxila, um grupo alquila, um grupo alcóxi e um grupo cicloalquila;
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 87/93
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o grupo eletrofílico é selecionado a partir do grupo que consiste em um éster ativo, um haleto de hidrocarbila, um haleto de benzila, um aldeído, uma cetona, um grupo carboxila e um grupo maleimida, desde que:
quando o grupo eletrofílico é da proteína de ligação a antígeno, o grupo eletrofílico é preferivelmente derivado de um aldeído, uma cetona, um grupo carboxila e um grupo maleimida, mais preferivelmente um grupo maleimida;
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 82/93
8/12 mais preferivelmente, a fórmula (Li-Dr) é um composto representado por (II):
Figure BR112019020174A2_C0007
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o grupo eletrofílico é derivado do próprio fármaco ou de uma modificação do fármaco.
9/12 de que a proteína de ligação a antígeno é selecionada a partir do grupo que consiste em: Humira (adalimumabe), Avastin (bevacizumabe), Erbitux (cetuximabe), Herceptina (trastuzumabe), Perjeta (pertuzumabe), Vectibix (panitumumabe), Theraloc (nimotuzumabe), Yervoy (ipilimumabe), Opdivo (nivolumabe), Lucentis (ranibizumabe), Enbrel (etanercepte), Myoscint (pentetato de imciromabe), ProstaScint (pendetide de capromabe), Remicade (infliximabe) ReoPro (abciximabe), Rituxan (rituximabe), Simulect (basiliximab), Synagis (palivizumabe), Verluma (nofetumomabe), Xolair (omalizumabe), Zenapax (daclizumabe), Cimzia (certolizumabe), Zevalin (ibritumomabe), Orthoclone (muromonabe), Panorex (edrecolomabe), Mylotarg (gentuzumabe), Soliris (eculizumabe), CNTO1275 (ustecinumabe), Amevive (alefacept), Raptiva (efalizumabe), Tysabri (natalizumabe), Actemra (tocilizumabe), Orencia (abatacepte), Arcalyst (rilonacept), Stelara (ustequinumabe), Removab (catumaxomabe), Simponi (golimumabe), llaris (canaquinumabe), Arzerra (ofatumumabe), Prolia (denosumabe), Benlysta (belimumabe), Nulojix (belatacepte), Eylea (aflibercepte), Campath (alentuzumabe), CEA-Scan (arcitumomabe) (fragmento fab), Poteligeo (mogamulizumabe), Abthrax (raxibacumabe), Gazyva (obinutuzumabe), Langmu (combercepte), Cyramza (ramucirumabe), Sylvant (siltuximabe), Entyvio (vedolizumabe), Keytruda (pembrolizumabe), Blincyto (blinatumomabe), Cosentyx (secuquinumabe), Unituxin (dinutuximabe), Darzalex (daratumumabe), Praluent (alirocumabe), Repatha (evolocumabe), Portrazza (necitumumabe), Empliciti (elotuzumabe), Nucala (mepolizumabe), Praxbind (idarucizumabe) e Bexxar (tositumomabe e tositumomabe 1-131), ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno imobilizada é acoplada a um fármaco selecionado a partir do grupo que consiste em acoplamento por lisina, acoplamento redutor por ponte dissulfeto intercadeias leve e pesada e acoplamento sítio-dirigido, preferivelmente acoplamento por lisina e acoplamento redutor por ponte dissulfeto intercadeias leve e pesada.
10/12 a antígeno do mesmo, ou um anticorpo anti-c-Met ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo;
em que o anticorpo anti-EGFR ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende a região LCDR1, LCDR2, LCDR3 da SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e variantes das mesmas, região HCDR1, HCDR2, HCDR3 da SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e variantes das mesmas, preferivelmente a sequência de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2;
alternativamente, em que o anticorpo anti-c-Met ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende a região LCDR1, LCDR2, LCDR3 da SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 e variantes das mesmas, preferivelmente LCDR1 é SEQ ID NO: 17 e a região HCDR1, HCDR2, HCDR3 da SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e variantes das mesmas; em que o anticorpo anti-c-Met ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreende preferivelmente a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 3 e da cadeia pesada da SEQ ID NO: 4.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno na etapa 1) é opcionalmente selecionada a partir de uma proteína de ligação a antígeno modificada ou de uma proteína de ligação a antígeno não modificada, preferivelmente uma proteína de ligação a antígeno modificada, em que a proteína de ligação a antígeno modificada é opcionalmente uma proteína de ligação a antígeno que se liga a um reagente químico ou agente de reticulação, preferivelmente uma proteína de ligação a antígeno modificada que se liga a um agente de reticulação;
em que o fármaco na etapa 2) é opcionalmente modificado ou não modificado, preferivelmente modificado.
11/12
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido agente de reticulação tem preferivelmente um composto da
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 83/93
12/12 preferivelmente NFLOH-HCI.
12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido agente de reticulação representado pela fórmula (L2) é um composto da fórmula (L3):
O
Figure BR112019020174A2_C0001
13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente de reticulação tem um grupo maleimida ou uma porção haloacetila;
em que o agente de reticulação que possui um grupo maleimida é preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em SMCC, LC-SMCC,
KMUA, GMBS, EMCS, MBS, AMAS, SMPH, SMPB e PMPI, mais preferivelmente SMCC;
em que o agente de reticulação que possui uma porção haloacetila é
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 84/93
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em uma toxina, um agente quimioterápico, um inibidor de crescimento, um inibidor de tubulina, um antibiótico, um radioisótopo e um agente citotóxico.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em um derivado de maitansinoide, um derivado de auristatina, um alcalóide de camptotecina; em que o derivado de maitansinoide é preferivelmente selecionado a partir de DM1, DM3 e DM4; o derivado de auristatina é preferivelmente selecionado a partir de MMAE e MMAF; o alcalóide de camptotecina é preferivelmente selecionado a partir de CPT, 10-hidróxi-CPT, CPT-11, SN-38 e topotecano, mais preferivelmente SN-38.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o fármaco é selecionado a partir do grupo que consiste em um composto representado pela seguinte fórmula (Dr):
Figure BR112019020174A2_C0002
Figure BR112019020174A2_C0003
ou um tautômero, um mesômero, um racemato, um enantiômero, um diastereômero ou uma mistura dos mesmos, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:
R, Rx-R7 são selecionados a partir do grupo que consiste em um átomo de
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 85/93
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o fármaco é um composto modificado, preferivelmente é um composto da seguinte fórmula (Li-Dr):
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 86/93
18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo humanizado, um anticorpo de murino, um anticorpo humano, um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia simples e um anticorpo biespecífico, preferivelmente um anticorpo humanizado.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação a antígeno selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos Fab, F(ab')2 e scFv.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se liga a um ou mais polipeptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em HER2, HER3, CD33, VEGF, VEGFR, VEGFR-2, CD152, CD40, TNF, IL-1, IL-5, IL-17, IL-6R, IL-1, IL2R, BLYS, OX40L, CTLA4, PCSK9, EGFR, c-Met, CD2, CD3, CDlla, CD19, CD30, CD38, CD20, CD52, CD60, CD80, CD86, TNF-ot, IL-12, IL-17, IL-23, IL-6, IL-Ιβ, RSVF, IgE, RANK, BLyS, α4β7, PD-1, CCR4, SLAMF7, GD2, CD21, CD79b, IL20Ra, brevican, CD22, CD79a, CD72, IGF-1R e RANKL, ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos; preferivelmente EGFR, c-Met ou um fragmento de ligação a antígeno dos mesmos.
21. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 88/93
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo anti-EGFR ou fragmento de ligação
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 89/93
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a condutividade da proteína de ligação a antígeno da etapa 1) é ajustada para menos de 5 mS/cm antes de contatar o transportador de troca iônica.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno descrita na etapa 1) é imobilizada em um transportador de troca iônica em um tampão com um pH de 5,5 a 7,0, preferivelmente 6,3.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em tampão fosfato, tampão acetato, tampão citrato e tampão succinato, preferivelmente tampão fosfato.
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 90/93
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno imobilizada da etapa 2) é acoplada a um fármaco, e uma reação de acoplamento é realizada pelo fluxo lento do fármaco através do transportador de troca iônica para controlar a razão molar entre o fármaco e a proteína de ligação a antígeno a um valor inferior a 6:1 e uma vazão de 0,2 a 2 mL/min.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que a eluição da etapa 2) compreende a eluição gradual usando tampões com diferentes concentrações de sal, em que o pH do tampão é de 5,0 a 6,5, preferivelmente 5,5.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em tampão fosfato, tampão acetato, tampão citrato e tampão succinato, preferivelmente tampão citrato.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que a eluição gradual compreende uma primeira eluição e uma segunda eluição, em que a concentração de sal da primeira eluição é de 100 a 140 mM, preferivelmente 110 mM, e a concentração de sal da segunda eluição é de 150 a 200 mM, preferivelmente 180 mM.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a referida etapa 1) compreende:
a) ligação da proteína de ligação a antígeno ao agente de reticulação para obter uma proteína de ligação a antígeno modificada;
b) imobilizar a proteína de ligação a antígeno modificada em um transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada; e
c) adição de um agente desprotetor, em que o agente desprotetor é
Petição 870190122124, de 22/11/2019, pág. 91/93
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno se liga ao agente de reticulação a uma temperatura de 20 a 40°C.
32. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a ligação da proteína de ligação a antígeno ao agente de reticulação é realizada em um tampão com um pH de 4,0 a 5,5, preferivelmente a um pH de 4,3; em que o tampão é preferivelmente um tampão acetato, mais preferivelmente um tampão acetato contendo acetonitrila.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que a referida etapa 1) compreende:
A) imobilizar a proteína de ligação a antígeno em um transportador de troca iônica para formar uma proteína de ligação a antígeno imobilizada; e
B) adicionar um agente redutor para reduzir pontes dissulfeto da proteína de ligação a antígeno imobilizada, em que o agente redutor é preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em TCEP, DTT, mercaptoetilamina e Ac-Cys, mais preferivelmente TCEP.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a reação de redução da etapa B é realizada a uma temperatura de 25 a 45°C, preferivelmente 40°C.
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