KR20200041998A - 항-egfr 항체 약물 컨쥬게이트(adc) 및 이의 용도 - Google Patents

항-egfr 항체 약물 컨쥬게이트(adc) 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시는 링커에 의해 항-EGFR 항체에 연결된 세포독성제 또는 세포증식 억제제를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC), ADC를 포함하는 조성물, ADC를 제조하는 방법, 및 암을 앓는 대상에게 ADC를 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시는 EGFR, 특히 인간 EGFR(hEGFR)에 특이적으로 결합하는 ADC를 제공한다. 본원에 기재된 항-EGFR Ab는 중쇄 불변 영역에 S239C 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함한다. 특정 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다.

Description

항-EGFR 항체 약물 컨쥬게이트(ADC) 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2017년 9월 2일자 출원된 미국 가출원 제62/553,837호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
기술분야
본 개시는, 특히, 인간 표피 성장 인자 수용체(EGFR, 또한 HER-1 또는 Erb-B1로 공지됨) 항체 약물 컨쥬게이트(ADC), 이러한 ADC를 포함하는 조성물, ADC를 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
암 치료법은 수술, 방사선 및 화학요법을 포함하는 광범위한 치료 접근법을 포함한다. 종종 상보적 접근법은 의사에게 암을 치료할 수 있는 광범위한 선택을 가능하게 하지만, 기존 치료제는 정상적인 건강한 세포에 비해 암 세포를 표적으로 하는 선택성의 결여, 및 치료에 대한 암의 내성 발달과 같은 많은 단점을 가지고 있다.
항체와 같은 표적 치료제를 기반으로 하는 암 치료에 대한 최근의 접근법은, 방사선 치료와 같은 비(非)표적 치료에 비해 보다 적은 부작용을 갖는 화학요법을 유도하였다. 항체의 항-종양 효능을 증강시키기 위한 하나의 효과적인 접근법은, 표적 세포에 의해 내재화될 수 있는 단일클론 항체에 세포독성 약물 또는 독소를 연결하는 것을 포함한다. 이러한 작용제는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)로 지칭된다. 환자에게 투여 시, ADC는 이의 항체 부분을 통해 표적 세포에 결합하고 내재화되어, 약물 또는 독소가 이의 효과를 발휘할 수 있게 한다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2005/0180972 및 US2005/0123536 참조).
인간 표피 성장 인자 수용체는 c-erbB 원종양유전자에 의해 인코딩된 170 kDa 막관통 수용체이며, 고유한 티로신 키나아제 활성을 나타낸다([Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)]; [Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)]). SwissProt 데이터베이스 항목 P00533은 인간 EGFR의 서열을 제공한다. EGFR은 티로신-키나아제 매개 신호전달 경로를 통해, 비제한적으로, 세포 증식, 분화, 세포 생존, 세포자멸사, 혈관신생, 유사분열 및 전이를 제어하는 신호전달 경로의 활성화를 포함하는 수많은 세포 과정을 조절한다([Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003)]; [Tsao and Herbst, Signal 4:4-9 (2003)]; [Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)]; [Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)]).
EGFR의 공지된 리간드에는, EGF, TGFA/TGF-알파, 암피레굴린(amphiregulin), 에피겐/EPGN, BTC/베타셀룰린, 에피레굴린(epiregulin)/EREG 및 HBEGF/헤파린-결합 EGF가 포함된다. EGFR에 의한 리간드 결합은 핵심 세포질 잔기의 수용체 동종- 및/또는 이종이량체화, 및 자가인산화를 촉발시킨다. 인산화된 EGFR은 GRB2와 같은 어댑터 단백질을 모집하여, 결국 적어도 하기 주요 다운스트림 신호전달 연쇄반응을 포함하는 복잡한 다운스트림 신호전달 연쇄반응을 활성화시킨다: RAS-RAF-MEK-ERK, PI3 키나아제-AKT, PLC감마-PKC 및 STAT 모듈. 이러한 자가인산화는 또한 그 자체의 포스포티로신-결합 SH2 도메인을 통해 인산화된 티로신과 관련된 몇몇 다른 단백질에 의해 다운스트림 활성화 및 신호전달을 유도한다. 이러한 다운스트림 신호전달 단백질은 몇몇 신호전달 연쇄반응, 주로 세포 증식을 유도하는 MAPK, Akt 및 JNK 경로를 개시한다. EGFR에 의한 리간드 결합은 또한 NF-카파-B 신호전달 연쇄반응을 활성화시킬 수 있다. 리간드 결합은 또한 RGS16과 같은 다른 단백질을 직접 인산화시켜, 이의 GTPase 활성을 활성화시키고, 잠재적으로는 EGF 수용체 신호전달을 G 단백질-결합된 수용체 신호전달에 연결한다. 리간드 결합은 또한 MUC1을 인산화시켜, SRC 및 CTNNB 1/베타-카테닌과의 이의 상호작용을 증가시킨다.
EGFR의 과발현은 방광, 뇌, 두경부, 췌장, 폐, 유방, 난소, 결장, 전립선 및 신장의 암을 포함하는 수많은 인간 악성 병태에서 보고되었다 ([Atalay et al., Ann. Oncology 14:1346-1363 (2003)]; [Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)] 및 [Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)]). 이러한 병태 중 다수에서, EGFR의 과발현은 환자의 불량한 예후와 상관관계가 있거나 관련이 있다([Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)] 및 [Modjtahedi et al., Br. J. Cancer 73:228-235 (1996)]). EGFR은 또한, 일반적으로 악성 세포에서보다는 낮은 수준이지만, 정상 조직, 특히 피부, 간 및 위장관의 상피 조직의 세포에서도 발현된다([Herbst and Shin, Cancer 94:1593-1611 (2002)]).
EGFR 유전자의 증폭을 포함하는 상당한 비율의 종양(즉, EGFR 유전자의 다수의 카피)은 또한 de2-7 EGFR, ΔEGFR, EGFRvIII 또는Δ2-7 (이들 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용됨)로 공지된([Olapade-Olaopa et al. (2000) Br. J. Cancer. 82, 186-94]) 수용체의 절단된 버전을 동시 발현한다([Wikstrand et al. (1998) J. Neurovirol. 4, 148-158]). de2-7 EGFR에서 볼 수 있는 재배열은 엑손 2-7에 걸친 801 개의 뉴클레오티드가 결여된 인프레임(in-frame) 성숙 mRNA를 유도한다([Wong et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 2965-9]; [Yamazaki et al. (1990) Jpn. J. Cancer Res. 81, 773-9]; [Yamazaki et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 1816-20] 및 [Sugawa et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 8602-6]). 상응하는 EGFR 단백질은 세포외 도메인의 잔기 6-273 및 융합 접합부에 신규한 글리신 잔기를 포함하는 267 아미노산 결실을 갖는다(Sugawa et al., 1990). 글리신 잔기의 삽입과 함께 이러한 결실은, 결실 계면에서 고유한 접합 펩티드를 생성한다(Sugawa et al., 1990).
EGFRvIII은 신경교종, 유방, 폐, 난소 및 전립선을 포함하는 다수의 종양 유형에서 보고되었다([Wikstrand et al. (1997) Cancer Res. 57, 4130-40]; [Olapade-Olaopa et al. (2000) Br. J. Cancer. 82, 186-94]; [Wikstrand, et al. (1995) Cancer Res. 55, 3140-8]; [Garcia de Palazzo et al. (1993) Cancer Res. 53, 3217-20]). 이러한 절단된 수용체는 리간드에 결합하지 않지만, 낮은 구성적 활성을 보유하고, 누드 마우스에서 종양 이종이식편으로 성장된 신경교종 세포에 유의한 성장 이점을 부여하며([Nishikawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7727-31]), NIH3T3 세포 ([Batra et al. (1995) Cell Growth Differ. 6, 1251-9]) 및 MCF-7 세포를 형질전환시킬 수 있다. 신경교종 세포에서 de2-7 EGFR에 의해 이용되는 세포 메커니즘은 완전히 정의되어 있지 않지만, 세포자멸사의 감소([Nagane et al. (1996) Cancer Res. 56, 5079-86]) 및 증식의 약간의 증강(Nagane et al., 1996)을 포함하는 것으로 보고되어 있다. 이러한 절단된 수용체의 발현이 종양 세포로 제한됨에 따라, 이는 항체 요법에 고도로 특이적인 표적을 나타낸다.
따라서, 당업계에서는 암의 치료에서 치료 목적에 사용될 수 있는 항-EGFR 항체 및 ADC가 여전히 필요하다.
본 개시는 링커에 의해 항-EGFR 항체에 연결된 세포독성제 또는 세포증식 억제제를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC), ADC를 포함하는 조성물, ADC를 제조하는 방법, 및 암을 앓는 대상에게 ADC를 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 실시예에 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, 임의의 특정 작동 이론에 구애되지 않으면서, 본원에 포함된 데이터는 특정 링커와 특정 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제(즉, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체)를 포함하는 항-EGFR ADC가 강력한 항-종양 활성을 발휘한다는 것을 입증한다. 나아가, 본 개시의 항-EGFR ADC는 고정된 낮은 약물 부하(drug loading)를 특징으로 하며, 이는 놀랍게도 매우 효과적인 ADC를 제공한다.
따라서, 구현예에서, 본 개시는 EGFR, 특히 인간 EGFR(hEGFR)에 특이적으로 결합하는 ADC를 제공한다.
구현예에서, 본 개시는 링커에 의해 항체에 연결된 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제공하며, 여기서 ADC는 하기 구조식(I)에 따른 화합물 또는 이의 염이다:
[D-L-XY]n-Ab
(I)
[식 중, D는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 포함하고, L은 링커이고, Ab는 항-인간 표피 성장 인자 수용체 항체임]. 구현예에서, 항-EGFR Ab는 (i) 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH1 도메인, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH2 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH3 도메인; (ii) 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL1 도메인, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL2 도메인 및 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL3 도메인; 및 (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함한다. XY는 S239C 돌연변이를 통해 항체 Ab에 링커 L을 연결하는 공유결합적 연결을 나타낸다. 구현예에서, n은 임의의 정수이다. 구현예에서, n은 2이다. 구현예에서, 항체 Ab는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 구현예에서, 항체 Ab는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다. 구현예에서, XY는 말레이미드-술프히드릴 연결이다. 구현예에서, L은 화학식 III, IV, V, VI, VII, VIII 또는 IX에 기재된 바와 같은 링커를 포함한다. 예를 들어, 구현예에서, L은 화학식 IX에 기재된 바와 같은 링커를 포함한다. 구현예에서, 링커는 말레이미도카프로일-발린-알라닌(mc-Val-Ala) 링커이다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형(isotype)을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
구현예에서, 본 개시는 링커에 의해 항체에 연결된 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 제공하며, 여기서 항체 약물 컨쥬게이트는 하기 구조식 (I)에 따른 화합물 또는 이의 염이다:
[D-L-XY]n-Ab
(I)
[식 중, D는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 포함하고; L은 링커이고; Ab는 (i) 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역, (ii) 서열번호 7을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하는 항-EGFR 항체이고; XY는 항체 Ab에 링커 L을 연결하는 공유결합적 연결을 나타내고; n은 임의의 정수임]. 구현예에서, n은 2 또는 4이다. 구현예에서, n은 2이다. 구현예에서, XY는 항체 Ab 상의 술프히드릴기와 함께 형성된 연결이다. 구현예에서, XY는 말레이미드-술프히드릴 연결이다. 구현예에서, L은 화학식 III, IV, V, VI, VII, VIII 또는 IX에 기재된 바와 같은 링커를 포함한다. 구현예에서, L은 화학식 IX에 기재된 바와 같은 링커를 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
구현예에서, 본 개시는 링커에 의해 항체에 연결된 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 항체 약물 컨쥬게이트는 하기 구조식(I)에 따른 화합물 또는 이의 염이다:
[D-L-XY]n-Ab
(I)
[식 중, D는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 포함하고; L은 링커이고; Ab는 (i) 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, (ii) 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-EGFR 항체이고; XY는 항체 Ab에 링커 L을 연결하는 공유결합적 연결을 나타내고; n은 임의의 정수임]. 구현예에서, n은 2 또는 4이다. 구현예에서, n은 2이다. 구현예에서, XY는 항체 Ab 상의 술프히드릴기와 함께 형성된 연결이다. 구현예에서, XY는 말레이미드-술프히드릴 연결이다. 구현예에서, L은 화학식 III, IV, V, VI, VII, VIII 또는 IX에 기재된 바와 같은 링커를 포함한다. 구현예에서, L은 화학식 IX에 기재된 바와 같은 링커를 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
구현예에서, 본 개시는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함하는 ADC를 특징으로 한다:
Figure pct00001
(X),
[식 중, Ab는 (i) 서열번호 3을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호 4를 포함하는 CDRH2 서열 및 서열번호 5를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 8을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호 9를 포함하는 CDRL2 서열 및 서열번호 10을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하는 항-EGFR 항체를 포함하고; n은 2임]. 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 2를 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 7을 포함한다. 구현예에서, ADC는 서열번호 1을 포함하는 전장 중쇄 및 서열번호 6을 포함하는 전장 경쇄를 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
구현예에서, 본 개시는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함하는 ADC를 특징으로 한다:
Figure pct00002
(X),
[식 중, Ab는 (i) 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 7을 포함하는 경쇄 가변 영역; (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하는 항-EGFR 항체를 포함하고; n은 2임]. 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 2를 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 7을 포함한다. 구현예에서, ADC는 서열번호 1을 포함하는 전장 중쇄 및 서열번호 6을 포함하는 전장 경쇄를 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
구현예에서, 본 개시는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함하는 ADC를 특징으로 한다:
Figure pct00003
(X),
[식 중, Ab는 (i) 서열번호 1을 포함하는 중쇄; (ii) 서열번호 6을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-EGFR 항체를 포함하고; n은 2임].
구현예에서, 본 개시는 본원에 기재된 ADC를 포함하는 조성물을 제공한다. 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 부형제, 담체 및/또는 희석제를 추가로 포함한다. 구현예에서, 본 개시의 조성물은 인간에서의 약학적 용도를 위해 제형화된다.
구현예에서, 본 개시는 항-EGFR 항체를 구조식(Ia) D-L-Rx(식 중, D는 세포막을 가로지를 수 있는 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제이고, L은 리소좀 효소에 의해 절단될 수 있는 링커이고, Rx는 항체에 신톤을 공유결합적으로 연결할 수 있는 관능기를 포함함)에 따른 신톤과, 신톤이 항체에 신톤을 공유결합적으로 연결하는 조건 하에서, 접촉시키는 단계를 포함하는 ADC를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 D는 PBD 이량체이고, 상기 항체는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
구현예에서, 본 개시는 항-EGFR 항체를 구조식(Ia) D-L-Rx(식 중, D는 세포막을 가로지를 수 있는 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제이고, L은 리소좀 효소에 의해 절단될 수 있는 링커이고, Rx 는 항체에 신톤을 공유결합적으로 연결할 수 있는 관능기를 포함함)에 따른 신톤과, 신톤이 항체에 신톤을 공유결합적으로 연결하는 조건 하에서, 접촉시키는 단계를 포함하는 ADC를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 D는 PBD 이량체이고, 상기 항체는 (i) 서열번호 3을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호 4를 포함하는 CDRH2 서열 및 서열번호 5를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 8을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호 9를 포함하는 CDRL2 서열 및 서열번호 10을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
구현예에서, 본 개시는 항-EGFR 항체를 구조식(Ia) D-L-Rx(식 중, D는 세포막을 가로지를 수 있는 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제이고, L은 리소좀 효소에 의해 절단될 수 있는 링커이고, Rx는 항체에 신톤을 공유결합적으로 연결할 수 있는 관능기를 포함함)에 따른 신톤과, 신톤이 항체에 신톤을 공유결합적으로 연결하는 조건 하에서, 접촉시키는 단계를 포함하는 ADC를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 D는 PBD 이량체이고, 상기 항체는 (i) 서열번호 3을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호 4를 포함하는 CDRH2 서열 및 서열번호 5를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 8을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호 9를 포함하는 CDRL2 서열 및 서열번호 10을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하고; Rx는 술프히드릴기 또는 말레이미드-술프히드릴기이다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
구현예에서, 본 개시는 항-EGFR 항체를 구조식(Ia) D-L-Rx(식 중, D는 세포막을 가로지를 수 있는 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제이고, L은 리소좀 효소에 의해 절단될 수 있는 링커이고, Rx는 항체에 신톤을 연결할 수 있는 관능기를 포함함)에 따른 신톤과 접촉시키는 단계를 포함하는 ADC를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 D는 PBD 이량체이고; L은 화학식 III, IV, V, VI, VII, VIII 또는 IX에 기재된 바와 같은 링커를 포함하고, 상기 항체는 (i) 서열번호 3을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호 4를 포함하는 CDRH2 서열 및 서열번호 5를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 8을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호 9를 포함하는 CDRL2 서열 및 서열번호 10을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하고; Rx는 술프히드릴기 또는 말레이미드-술프히드릴기이다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
구현예에서, 본 개시는 항-EGFR 항체를 구조식(Ia) D-L-Rx(식 중, D는 세포막을 가로지를 수 있는 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제이고, L은 리소좀 효소에 의해 절단될 수 있는 링커이고, Rx는 항체에 신톤을 연결할 수 있는 관능기를 포함함)에 따른 신톤과 접촉시키는 단계를 포함하는 ADC를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 D는 PBD 이량체이고; L은 화학식 IX에 기재된 바와 같은 링커를 포함하고, 상기 항체는 (i) 서열번호 3을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호 4를 포함하는 CDRH2 서열 및 서열번호 5를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 8을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호 9를 포함하는 CDRL2 서열 및 서열번호 10을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하고; Rx는 술프히드릴기 또는 말레이미드-술프히드릴기이다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 IgG1 동형을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 인간화 항체이다.
도 1은, EGFR과 Ab1 및 Ab2에 의해 결합된 영역(세툭시맙(cetuximab)의 동일한 6 개의 CDR 아미노산 서열을 갖는 항체)의 개략도를 나타낸다.
도 2는, AbA(S239C)-PBD의 제조를 나타낸다. 컨쥬게이션 과정은 실시예 2에 기재된 바와 같이, 쇄간 디술파이드의 환원, 정량적 산화 및 과량의 PBD 약물 링커와의 컨쥬게이션으로 이루어진다.
도 3은, Ab1 및 AbA의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역 아미노산 서열을 제공한다. VH 및 VL 영역 내 CDR 서열은 박스로 묶여 있으며, Ab1 VH 서열과 AbA VH 서열 사이의 차이는 음영 처리되어 있다.
도 4는, Ab1 및 AbA에 대한 전장 경쇄 및 중쇄를 나타낸다. 중쇄에서 Ab1 서열과 AbA 서열 사이의 차이는 강조표시 되어있다.
도 5는, 인간 세포에 대한 Ab1 및 AbA, S239C 돌연변이체 형태 Ab1(S239C) 및 AbA(S239C), 및 PBD 컨쥬게이트 Ab1(S239C)-PBD 및 AbA(S239C)-PBD의 유세포 분석을 나타낸다. 증가하는 농도의 항체를, Ab1 및 AbA에 의해 인식된 EGFR 에피토프가 노출된 야생형 EGFR-과발현(도 5a) 및 EGFR CA 돌연변이체-과발현(도 5b) NR6 세포에 첨가하였다. 실시예 3에 제시 및 기재된 바와 같이, PBD에의 Cys-조작된 AbA(S239C)의 컨쥬게이션은 모 항체 AbA(S239C) 또는 AbA와 비교하여 결합 특성을 변경시키지 않는다.
도 6은, 다른 EGFR-과발현 세포주의 수와 비교하여, SW-48(EGFR을 발현하는 결장직장 선암종 세포주, 세포 당 200,000개 초과의 수용체, IHC H-점수 228), NCI-H441(중간 내지 낮은 EGFR 발현을 갖는 폐 선종 이종이식편 모델, 세포 당 ~100,000개의 수용체; IHC H-점수 150) 및 LoVo(더 낮은 EGFR 발현을 갖는 KRAS 돌연변이 결장직장 선암종, 세포 당 100,000개 미만의 수용체, IHC H-점수 140)에 대한 EGFR 수를 나타낸다. 세포 표면 밀도(세포 당 항원 결합 능력)는 세툭시맙과 함께 QIFIT 검정을 사용하여 배양된 세포에서 세포 표면 항원의 FACS 분석에 의해 결정하였다.
도 7은, 상이한 수준으로 표면 EGFR을 발현하는(즉, 낮은, 중간 또는 높은 EGFR 발현) 종양 세포주의 패널에 대하여, 상응하는 아우리스타틴(auristatin) 컨쥬게이트(AbA-MMAE)에 비해 AbA (S239C)-PBD의 개선된 세포독성 활성을 나타낸다. SW-48(도 7a), NCI-H441(도 7b), LoVo(도 7c) 및 A431(도 7d) 종양 세포를, ADC가 제시된 농도로 첨가된 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 37℃에서 72 시간 후, 세포 생존능을 ATPlite 발광 검정을 사용하여 평가하였다. 도 7a 내지 7d에 제시된 바와 같이, 각각의 EGFR 발현 수준에 대하여, 상응하는 아우리스타틴 컨쥬게이트(AbA-MMAE ADC)에 비해 PBD 컨쥬게이트 AbA(S239C)-PBD로의 처리 후 4 개의 모든 세포주에서 세포독성 활성이 개선되었다.
도 8a는, NCI-H441 폐 선암종 이종이식편 모델에서 AbA(S239C)-PBD의 생체내 효능을 나타내는 그래프이다. 괄호 안의 숫자는 mg/kg 단위의 용량을 나타낸다. 화살표는 투약일을 나타낸다. 도 8a에 제시되고 실시예 5에 기재된 바와 같이, 0.3 mg/kg으로 투여된 AbA(S239C)-PBD는, 동물의 100%에서 완전하고 지속되는 퇴행을 유도하였다.
도 8b는, LoVo 결장직장 선암종 이종이식편 종양 모델에서 AbA(S239C)-PBD의 생체내 효능을 나타내는 그래프이다. 괄호 안의 숫자는 mg/kg 단위의 용량을 나타낸다. 화살표는 투약일을 나타낸다. 도 8b에 제시되고 실시예 5에 기재된 바와 같이, 상응하는 EGFR ADC(AbA-MMAE)는 이러한 모델에서 활성을 나타내었지만, AbA(S239C)-PBD보다 훨씬 높은 용량(구체적으로, 10 배 더 높은 용량)을 필요로 하였다.
도 9a 및 9b는, SW-48 결장직장암 이종이식편 종양 모델에서 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 생체내 효능을 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 mg/kg 단위의 용량을 나타낸다. 화살표는 투약일을 나타낸다.
도 10a는, 환자-유래 이종이식편 모델 CTG-0162(NSCLC)에서 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 생체내 효능을 나타낸다 (도 10a). 괄호 안의 숫자는 mg/kg 단위의 용량을 나타내고, 화살표는 투약일을 나타낸다. 도 10a에 제시되고 실시예 5에 논의된 바와 같이, CTG-0162 NSCLC 모델에서, AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD는 종양 성장을 억제하는데 매우 효과적이었지만, AbA-MMAE는 AbA(S239C)-PBD 또는 Ab1(S239C)-PBD보다 10 배 더 높은 용량으로 투여되었음에도 덜 효과적이었다.
도 10b는, 환자-유래 이종이식편 CTG-0786 두경부암(HNC) 모델에서 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 생체내 효능을 나타낸다. 괄호 안의 숫자는 mg/kg 단위의 용량을 나타내고, 화살표는 투약일을 나타낸다. 도 10b에 제시되고 실시예 5에 논의된 바와 같이, AbA(S239C)-PBD 및 AbA(S239C)-PBD는 종양 성장을 억제하는데 효과적이었지만, 아우리스타틴-기반 ADC AbA-MMAE는 효능을 달성하기 위해 훨씬 더 높은 용량을 필요로 하였다.
도 11a는, AbA(S239C)에 대한 단백질 응집 및 단편화를 나타내는 그래프이다. "0" 시간(t0)에서의 응집체% 및 단편%는 1 일 단편 증가% 및 1 일 응집체 증가%로서 제시되어 있다. 실시예 6에 제시 및 기재된 바와 같이, AbA(S239C) mAb 및 AbA(239C)-PBD DAR2의 시험관내 혈장 안정성은 AbA-vcMMAE보다 더 우수하지 않은 경우 이와 유사하였다.
도 11b는, AbA(S239C)-PBD DAR2에 대한 단백질 응집 및 단편화를 나타내는 그래프이다. "0" 시간(t0)에서의 응집체% 및 단편%는 1 일 단편 증가% 및 1 일 응집체 증가%로서 제시되어 있다. 실시예 6에 제시 및 기재된 바와 같이, AbA(S239C) mAb 및 AbA(S239C)-PBD DAR2의 시험관내 혈장 안정성은 AbA-vcMMAE보다 더 우수하지 않은 경우 이와 유사하였다.
본 개시는 EGFR을 표적으로 하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC) 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 개시의 ADC는 선행 기술에 개시된 다른 ADC에 비해 분명한 이점을 제공하는 유리한 속성을 보유한다. 예를 들어, 본 개시의 ADC는, 하기 실시예 3 내지 5에 제시된 바와 같이, 본질적으로 동일한 항체 백본을 사용한 경우 아우리스타틴-기반 ADC보다 상당히 더 강력하다. 즉, 본 개시의 ADC는 (1) 동일한 용량으로 투여될 때 상응하는 아우리스타틴 ADC보다 더 큰 효능을 나타내고, (2) 상당히 더 낮은 용량(즉, 10 배 더 낮은 용량)으로 투여될 때 상응하는 아우리스타틴 ADC와 유사한 효능을 나타낸다. 나아가, 본 개시의 ADC는 하기 실시예 6에 제시된 바와 같이, 다양한 조건 하에서 안정하다. 본 개시의 항체는 또한 높은 수준의 효능을 유지하면서 약 2의 낮은 단일 종 약물 부하(또는 약물 대 항체의 평균 비 약 2)를 갖는다.
따라서, 본 개시는 링커에 의해 항-EGFR 항체에 연결된 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제(예를 들어, PBD)를 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트, 본 개시의 ADC를 포함하는 조성물, 본 개시의 ADC를 제조하는 방법, 및 EGFR의 과발현 또는 증폭과 관련된 암과 같은 암을 치료하기 위해 ADC를 사용하는 방법에 관한 것이다.
구현예에서, 본 개시는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함하는 ADC를 특징으로 한다:
Figure pct00004
(X)
[식 중, Ab는 (i) 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH1 도메인, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH2 도메인 및 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDRH3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역; (ii) 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL1 도메인, 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL2 도메인, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDRL3 도메인; (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하는 항-EGFR 항체를 포함하고, (iv) n은 2임].
구현예에서, 본 개시는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함하는 ADC를 특징으로 한다:
Figure pct00005
(X)
[식 중, Ab는 (i) 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역, (ii) 서열번호 7을 포함하는 경쇄 가변 영역; (iii) 중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하는 항-EGFR 항체를 포함하고, (iv) n은 2임].
구현예에서, 본 개시는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함하는 ADC를 특징으로 한다:
Figure pct00006
(X)
[식 중, Ab는 (i) 서열번호 1을 포함하는 중쇄, (ii) 서열번호 6을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-EGFR 항체를 포함하고; (iii) n은 2임].
구현예에서, 본 개시는 링커에 의해 항-EGFR 항체에 연결된 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제를 포함하는, 하기 구조식 (I)에 따른 화합물 또는 이의 염인 ADC를 특징으로 한다:
[D- L-XY] n Ab
(I)
[식 중, D는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 포함하고; L은 링커이고; Ab는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-EGFR 항체이고; XY는 항체 Ab에 링커 L을 연결하는 공유결합적 연결을 나타내고, n은 정수임]. 특히, 본원에 기재된 특정 링커와 특정 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제(예를 들어, PBD 이량체)를 포함하는 항-EGFR ADC는, 특히 아우리스타틴에 연결된 본질적으로 동일한 항체를 포함하는 ADC와 비교할 때, 놀랍게도 강력한 항-종양 활성을 발휘한다. 나아가, 본 개시의 항-EGFR ADC는 낮은 고정된 단일 종 약물 부하를 특징으로 하며, 이는 놀랍게도, 예를 들어, 높거나 낮은 EGFR 발현 수준과 관련된 암의 치료에서 매우 효과적인 ADC를 유도한다. 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, AbA(239C)-PBD는 상응하는 AbA-아우리스타틴 ADC보다 더 강력한 컨쥬게이트이다. 본원에 사용된 바, "AbA"는 서열번호 11을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6을 포함하는 경쇄를 갖는 항체를 나타낸다. "AbA(S239C)"는 서열번호 1을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6을 포함하는 경쇄를 갖는 항체를 나타낸다. AbA는, 위치 239(Kabat 넘버링)에 세린을 갖는 것을 제외하고는, AbA(S239C)와 동일한 중쇄 서열을 갖는다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항체 및/또는 결합 단편은 사실상 "모듈식(modular)"이다. 본 개시 전반에 걸쳐, 항체 및/또는 결합 단편을 포함하는 다양한 "모듈"의 다양한 특정 구현예가 기재된다. 특정한 비제한적인 예로서, 가변 중쇄(VH) CDR, VH 쇄, 가변 경쇄 (VL) CDR 및VL 쇄의 다양한 특정 구현예가 기재된다. 본원에 개시된 ADC은 또한 사실상 "모듈식"이다. 본 개시 전반에 걸쳐, ADC를 포함하는 다양한 "모듈"의 다양한 특정 구현예가 기재된다. 특정한 비제한적인 예로서, ADC를 구성할 수 있는 항체, 링커, 및 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제의 특정 구현예가 기재된다.
본원에 기재된 ADC는 염의 형태, 일부 특정 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 염의 형태일 수 있다. 충분한 산성, 충분한 염기성 또는 둘 모두인 관능기를 갖는 본 개시의 ADC는, 다수의 무기 염기, 및 무기 및 유기 산 중 임의의 것과 반응하여 염을 형성할 수 있다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시와 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "항-표피 성장 인자(EGF) 수용체 항체" 또는 "항-EGFR 항체"는, EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 나타낸다. 관심 항원, 즉, EGFR에 "결합하는" 항체는, 항체가 항원을 발현하는 세포를 표적으로 하는데 유용하도록 충분한 친화성으로 항원에 결합할 수 있는 항체이다. 바람직한 구현예에서, 항체는 인간 EGFR(hEGFR)에 특이적으로 결합한다. 항-EGFR 항체의 예는 하기 실시예 1에 개시되어 있다. 달리 지시되지 않는 한, 용어 "항-EGFR 항체"는, 야생형 EGFR, 또는 EGFRvIII와 같은 EGFR의 임의의 변이체에 결합하는 항체를 나타내는 것으로 여겨진다.
야생형 인간 EGFR의 아미노산 서열은 하기 서열번호 12로 제공되며, 여기서 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-24)는 밑줄이 그어져 있고, 세포외 도메인의 아미노산 잔기(ECD, 아미노산 잔기 25-645)는 볼드체로 강조표시 되어있다. EGFR의 절단된 야생형 ECD(본원에서 또한 EGFR(1-525)로 지칭됨)는 서열번호 12의 아미노산 1 내지 525와 동일하다. 야생형 EGFR의 성숙한 형태는, 신호 펩티드, 즉, 서열번호 12의 아미노산 잔기 25 내지 1210가 없는 단백질에 해당한다.
Figure pct00007
Figure pct00008
인간 EGFR의 ECD의 아미노산 서열은 하기 서열번호 13으로 제공되며, 이는 신호 서열(밑줄 그어짐)을 포함한다.
Figure pct00009
EGFR의 전체적인 구조는 도 1에 기재되어 있다. EGFR의 ECD는 4 개의 도메인을 갖는다([Cochran et al. (2004) J. Immunol. Methods, 287, 147-158]). 도메인 I 및 III은 리간드에 대한 고 친화성 결합 부위 형성에 기여하는 것으로 제안되었다. 도메인 II 및 IV는 단백질 폴딩을 안정화시키고 가능한 EGFR 이량체화 계면을 함유하는, 시스테인이 풍부한 라미닌 유사(laminin-like) 영역이다. 상기 도면은 추가로 Ab1 및 Ab2에 의해 결합된 영역을 나타낸다. Ab1은 서열번호 15에 제공된 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH) 서열(각각, 서열번호 16, 17 및 18에 제시된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 세트를 가짐) 및 서열번호 7에 제공된 바와 같은 경쇄 가변 영역 (VL) 아미노산 서열(각각, 서열번호 8, 9 및 10에 제시된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 세트를 가짐)을 갖는 인간화 EGFR 항체이다. Ab2는 세툭시맙의 동일한 6 개의 CDR 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
EGFR 변이체는 EGFR 유전자 증폭을 수반하는 유전자 재배열에서 생성될 수 있다. EGFRvIII은 인간 암에서 EGFR의 가장 흔히 발생하는 변이체이다([Kuan et al. Endocr Relat Cancer. 8(2):83-96 (2001)]). 유전자 증폭의 과정 동안, 267 아미노산 결실이 융합 접합부에 삽입된 글리신 잔기를 갖는 EGFR의 세포외 도메인에서 발생한다. 따라서, EGFRvIII은 야생형 EGFR의 세포외 도메인의 아미노산 6-273이 결실되어 있고, 접합부에 글리신 잔기 삽입을 포함한다. EGFR의 EGFRvIII 변이체는 글리신이 결실 접합부에 삽입되는 세포외 도메인에서 267 아미노산 잔기의 결실을 함유한다. EGFRvIII 아미노산 서열은 하기 서열번호 14로 제시되어 있다(ECD는 볼드체로 강조 표시되어 있고, 신호 서열은 밑줄 그어져 있음).
Figure pct00010
EGFRvIII은 리간드 독립적 방식으로 구성적 신호전달을 통해 종양 진행에 기여한다. EGFRvIII은 정상 조직에서는 발현하는 것으로 공지되어 있지 않지만([Wikstrand et al. Cancer Research 55(14): 3140-3148 (1995)]; [Olapade-Olaopa et al. Br J Cancer. 82(1):186-94 (2000)]), 종양 세포, 특히 다형성 교모세포종에서는 유의한 발현을 나타낸다([Wikstrand et al. Cancer Research 55(14): 3140-3148 (1995)]; [Ge et al. Int J Cancer. 98(3):357-61 (2002)]; [Wikstrand et al. Cancer Research 55(14): 3140-3148 (1995)]; [Moscatello et al. Cancer Res. 55(23):5536-9 (1995)]; [Garcia de Palazzo et al. Cancer Res. 53(14):3217-20 (1993)]; [Moscatello et al. Cancer Res. 55(23):5536-9 (1995)] 및 [Olapade-Olaopa et al. 2(1):186-94 (2000)]).
본원에 사용된 바, 용어 "항체"(Ab)는, 특정한 항원, 즉 hEGFR에 특이적으로 결합하거나, 이와 면역학적으로 반응성인 면역글로불린 분자를 나타낸다. 항체는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두에서 또한 초가변(hypervariable) 영역으로 공지된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크(FR, framework)로 불린다. 당업계에 공지된 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 나타내는 아미노산 위치/경계는 문맥 및 당업계에 정의된 다양한 정의에 따라 달라질 수 있다. 가변 도메인 내 일부 위치는 이러한 위치가 한 세트의 기준에서 초가변 영역 내에 있는 것으로 간주될 수 있는 하이브리드 초가변 위치로 볼 수 있지만, 다른 세트의 기준에서는 초가변 영역 외부에 있는 것으로 간주될 수 있다. 이러한 위치 중 하나 이상은 또한 확장된 초가변 영역에서 발견될 수 있다. 본래의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각, 주로 루프 연결을 형성하는 3 개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 구조를 채택함으로써, 일부 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성함으로써, 4 개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR 영역에 의해 서로 근접하게 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다. [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)] 참조. 본원에 사용된 바, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은, 달리 지시되지 않는 한, Kabat 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따라 이루어진다.
본원에 사용된 바, 용어 "단일클론 항체"는, 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체에 제한되지 않는다. 단일클론 항체는 당업계에 공지되어 있거나 이용 가능한 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론에서 유도된다. 본 개시에 유용한 단일클론 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 인간에서의 항-EGFR 항체를 포함하는 ADC의 생체내 사용을 포함하는 본 개시의 다수의 용도에서, 키메라, 영장류화, 인간화 또는 인간 항체가 적합하게 사용될 수 있다. 구현예에서, 본 개시의 항-EGFR 항체는 인간화된 것이다.
비(非)인간(예를 들어, 쥐과) 항체의 "인간화" 형태는, 비인간 면역글로불린에서 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것에 해당하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린 공통 서열의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체 인간화 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 개시의 항-EGFR ADC는 EGFR에 특이적으로 결합할 수 있는 전장(원형(intact)) 항체 분자를 포함할 수 있다. 구현예에서, 본 개시의 ADC는 전장 AbA(S239C) 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바, 용어 "세포독성제 및/또는 세포증식 억제제"는, 세포의 성장 및/또는 복제를 억제하고/하거나 세포를 사멸하는 것으로 공지된 임의의 작용제 또는 약물을 나타내는 것으로 여겨진다. 하나의 구현예에서, 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제는 피롤로벤조디아제핀("PBD") 및 PBD 이량체와 같은 세포 투과성 DNA 소홈(minor groove) 결합제이다.
용어 "항체 약물 컨쥬게이트" 또는 "ADC"는, 하나 이상의 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제에 화학적으로 연결된 항체를 나타낸다. 구현예에서, ADC는 항체, 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제, 및 항체에의 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제의 부착 또는 컨쥬게이션을 가능하게 하는 링커를 포함한다. 본 개시의 ADC는 전형적으로 1, 2 또는 3 개의 부하된 약물 종을 포함하여, 항체에 컨쥬게이션된 1 내지 3 개의 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제를 갖는다.
본원에 개시된 ADC는 항체의 구성, 및 적어도 부분적으로 컨쥬게이션을 가능하게 하는데 사용되는 방법에 따라, 약물 분자 및 항체 모이어티를 다양한 화학량론적 몰비로 포함할 수 있다.
본 개시의 목적을 위하여, 당업자는 "약물 부하"와 "약물 대 항체 비"(또한 DAR로 지칭됨)가 구별된다는 것을 이해할 것이다. DAR은 적어도 2 개의 ADC 분자의 집단에서 항체 당 약물 분자의 평균 몰비를 나타내며, 약물 부하는 개별 ADC 분자에서 항체 당 약물 분자의 몰비를 나타낸다. 약물 부하는 주로 ADC의 구성 및 설계와 관련이 있지만, DAR은 주로 환자에 투여되는 치료적 ADC 조성물과 관련이 있다.
용어 "약물 부하"는, 개별 ADC 분자에서 항체 당 약물 분자의 몰비를 나타낸다. 특정 구현예에서, 약물 부하는 1 내지 2 개, 1 내지 4 개의 약물 분자, 2 내지 4 개의 약물 분자, 1 내지 3 개의 약물 분자, 또는 2 내지 3 개의 약물 분자를 포함할 수 있다(즉, 여기서 상기 각각에 대하여, ADC 분자의 일반식은 A(-L-D)n이며, 식 중 n은 언급된 약물 분자의 범위를 나타내는 정수 또는 정수의 범위임).
용어 "약물 대 항체 비" 또는 "DAR"은, 적어도 2 개의 ADC 분자의 집단에서 항체 당 약물 분자의 가중 평균 몰비를 나타낸다. 조작된 항체 구조체, 선택적 시스테인 환원 및 제조후 정제와 같은 기술에 의해 제공되는 상대적 컨쥬게이트 특이성에도 불구하고, 주어진 ADC 집단은 상이한 약물 부하(예를 들어, IgG1 항체의 경우 1 내지 8 범위)를 갖는 ADC 분자를 포함할 수 있다. 즉, 컨쥬게이션 후, 본 발명의 ADC 조성물은 상이한 약물 부하를 갖는 ADC의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 집단은 다양한 이유로 발생할 수 있지만, 이는 특히 배치(batch) 가변성 및 화학적 컨쥬게이션 반응이 완전하게 완료되지 못한 경우를 포함할 수 있다. 따라서, DAR은 전체로서의 ADC 집단(즉, 모든 ADC 분자가 함께 취해짐)에 대한 약물 부하의 가중 평균을 나타낸다. ADC 집단은 비교적 낮은 수준의 우세하지 않거나 바람직하지 않은 ADC 종(예를 들어, 약물 부하가 1, 2, 3 또는 4 등인 ADC)과 함께, 단일 우세 또는 바람직한 ADC 종(예를 들어, 약물 부하가 2인 ADC)을 함유할 수 있거나, 또는 다양한 비율의 약물 부하를 갖는 임의의 다양한 종(예를 들어, DAR이 2.0 ± 0.1, ± 0.2, ± 0.3, ± 0.4, ± 0.5 등인)을 함유할 수 있다.
구현예에서, 본 개시의 ADC는 약물 부하가 2인, 세포독성제 또는 세포증식 억제제(예를 들어, PBD)에 컨쥬게이션된 항-EGFR 항체(예를 들어, AbA (S239C))를 포함한다. 구현예에서, 본 개시의 ADC 조성물 또는 제제는 DAR이 약 2인, 세포독성제 또는 세포증식 억제제(예를 들어, PBD)에 컨쥬게이션된 항-EGFR 항체(예를 들어, AbA (S239C))를 포함한다.
구현예에서, 본 개시의 ADC는 서열번호 3, 4 및 5에 제시된 CDR 세트(CDRH1, CDRH2, CDRH3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8, 9 및 10에 제시된 CDR 세트(CDRL1, CDRL2, CDRL3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-EGFR 항체를 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 PBD에 컨쥬게이션 부위를 제공하도록 조작된 시스테인 돌연변이를 갖는 중쇄 불변 영역을 갖는 IgG1 동형이다. 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 중쇄의 위치 239에 있다. 구현예에서, 돌연변이는 S239C(Kabat에 따라 넘버링됨)이다. 본원에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체 AbA(S239C)는, 각각, 서열번호 3, 4 및 5에 제시된 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 각각, 서열번호 8, 9 및 10에 제시된 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 중쇄 불변 영역의 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다.
구현예에서, 본 개시의 ADC는 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-EGFR 항체를 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 PBD에 컨쥬게이션 부위를 제공하도록 조작된 시스테인 돌연변이를 갖는 중쇄 불변 영역을 갖는 IgG1 동형이다. 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 중쇄의 위치 239에 있다. 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 S239C(Kabat에 따라 넘버링됨)이다. 본원에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체 AbA(S239C)는 서열번호 2를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다. 구현예에서, 본 개시의 항-EGFR 항체는 중쇄 불변 영역의 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다.
구현예에서, 본 개시의 ADC는 서열번호 1을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6을 포함하는 경쇄를 포함하는 항-EGFR 항체를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체 AbA(S239C)는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 갖는다. 서열번호 1은, 서열번호 1이 S239C 돌연변이를 함유한다는 것만 서열번호 11과 다르다.
본원에 기재된 항-EGFR ADC의 구현예는 적어도 하나의 불변 영역 매개 생물학적 이펙터(effector) 기능을 변경하도록 서열이 변형된 항체 또는 단편일 수 있다. 예를 들어, 구현예에서, 항-EGFR ADC는 변형되지 않은 항체에 비해 적어도 하나의 불변 영역 매개 생물학적 이펙터 기능을 감소시키도록, 예를 들어, Fc 수용체(FcγR)에 대한 결합을 감소시키도록 변형될 수 있다. FcγR 결합은 FcγR 상호작용에 필요한 특정한 영역에서 항체의 면역글로불린 불변 영역 분절을 돌연변이시킴으로써 감소될 수 있다(예를 들어, [Canfield and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491] 및 [Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662] 참조). FcγR 결합을 감소시키는 것은, 옵소닌화(opsonization), 식균작용 및 항원-의존성 세포독성("ADCC")과 같은 FcγR 상호작용에 의존하는 다른 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다.
항-EGFR ADC에 포함된 항체는 푸코오스의 수준이 낮거나 푸코오스가 결여되어 있을 수 있다. 푸코오스가 결여된 항체는, 특히 낮은 용량의 항체에서 증강된 ADCC 활성과 관계가 있었다. [Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740], [Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73] 참조. 푸코오스가 없는 항체를 제조하는 방법은 래트 골수종 YB2/0 세포(ATCC CRL 1662)에서의 성장을 포함한다. YB2/0 세포는 폴리펩티드의 푸코실화에 필요한 효소인 α-1,6-푸코실트랜스퍼라아제를 인코딩하는 FUT8 mRNA를 낮은 수준으로 발현한다.
항-EGFR ADC에 포함된 항체는, 예를 들어, FcRn 상호작용에 관여하는 특정한 영역에서 면역글로불린 불변 영역 분절을 돌연변이시킴으로써, 신생아 Fc 수용체인 FcRn에 대한 이의 결합 친화성을 증가 또는 감소시키는 변형을 포함할 수 있다(예를 들어, WO 2005/123780 참조). 항-EGFR 항체 및/또는 결합 단편은, 예를 들어 [Jung & Pluckthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966]; [Yazaki et al., 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9] 및 미국 특허 출원 제2007/0280931호에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 초가변 영역에 삽입된 하나 이상의 아미노산을 가질 수 있다.
항체는, 예를 들어 국제 출원 공개 번호 WO2015/143382 및 WO2010/096434(이들은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같은 다수의 기술 중 임의의 것에 의해 생성될 수 있다.
EGFR, 예를 들어, 인간 EGFR에 대하여 높은 친화성을 갖는 항-EGFR 항체 및/또는 결합 단편은 치료적 용도에 바람직할 수 있다. 따라서, 본 개시는 EGFR, 특히 인간 EGFR에 대한 높은 결합 친화성을 갖는 항-EGFR 항체 및/또는 결합 단편을 포함하는 ADC를 고려한다. 특정 구현예에서, 항체 및/또는 결합 단편은 적어도 약 100 nM의 친화성으로 EGFR에 결합하지만, 예를 들어, 적어도 약 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.1 nM, 0.01 nM 또는 심지어 그 이상의 더 높은 친화성을 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 약 1 pM 내지 약 100 nM 범위의 친화성, 또는 임의의 상기 값들 사이의 친화성 범위로 EGFR에 결합한다.
EGFR에 대한 항체 및/또는 결합 단편의 친화성은, 예를 들어, 비제한적으로, ELISA, 등온 적정 열량측정법(ITC), 표면 플라즈몬 공명, 유세포 분석 또는 형광 편광 검정법과 같은, 당업계에 널리 공지되어 있거나 본원에 기재된 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
항-EGFR 항체는 [Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989)]에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 표준 재조합 DNA 방법론을 사용하여, 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 일부의 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 DNA는, 유전자가 전사 및 번역 제어 서열에 작동적으로 연결되어 숙주 세포로 형질전환되도록, 발현 벡터에 삽입된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있거나, 또는 보다 전형적으로는, 두 유전자 모두 동일한 발현 벡터에 삽입되며, 이는 당업계에 공지된 방법에 의해 달성된다. 항체는 또한 화학적 합성에 의해(예를 들어, [Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, IL]에 기재된 방법에 의해) 생성될 수 있다.
본 개시의 항-EGFR ADC는 일반적으로 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 링커에 의해 연결된, 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제를 갖는 항-EGFR 항체(예를 들어, AbA (S239C))를 포함한다. 구현예에서, 항-EGFR ADC는 하기 구조식 (I)에 따른 화합물 또는 이의 염이다:
[D-L-XY] n -Ab
(I)
[식 중, 각각의 "D"는, 서로 독립적으로, 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제("약물")를 나타내고; 각각의 "L"은, 서로 독립적으로, 링커를 나타내고; "Ab"는 항-EGFR 항체를 나타내고; 각각의 "XY"는 링커 상의 관능기R x 와 항원 결합 모이어티 상의 "상보적" 관능기 R y 사이에 형성된 연결을 나타내고; n은 Ab에 연결된 약물의 수(즉, 단일 종 약물 부하)를 나타냄]. 구조식 (I)에 따른 ADC를 구성할 수 있는 다양한 항-EGFR 항체의 특정 구현예는 상기 기재되어 있다.
구조식 (I)의 ADC 또는 이의 염의 구현예에서, 각각의 D는 동일하고/하거나 각각의 L은 동일하다.
항-EGFR ADC를 구성할 수 있는 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제(D) 및 링커(L)의 특정 구현예는, 하기에 보다 상세하게 기재된다.
구현예에서, ADC는 화학식 (I)의 구조 또는 이의 염을 갖고, 식 중 D는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 나타내고; L은 링커이고; Ab는 서열번호 1을 포함하는 항체이고; XY는 항체 Ab에 링커 L을 연결하는 공유결합적 연결을 나타내고; n은 임의의 정수이다. 구현예에서, n은 2 또는 4이다. 구현예에서, n은 2이다.
구현예에서, ADC의 DAR이 적어도 2 개의 ADC 분자의 집단에서 항체 당 약물 분자의 평균 몰비를 나타내는 경우, DAR은 약 2이다. 이러한 맥락에서, 용어 "약"은 실제 값의 ±7.5% 내의 양을 의미한다. 즉, "약 2"는, 1.85, 1.86, 1.87, 1.88, 1.89, 1.90, 1.91, 1.92, 1.93, 1.94, 1.95, 1.96, 1.97, 1.98, 1.99, 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.08, 2.09, 2.10, 2.11, 2.12, 2.13, 2.14, 2.15, 및 임의의 이들 사이의 범위를 의미한다.
본 개시의 ADC뿐 아니라, 대안적인 ADC 구조에 사용될 수 있는 약물 (화학식 (I)의 D) 및 링커(화학식 (I)의 L)에 대한 추가의 세부사항은 하기에 기재된다. 구현예에서, 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제는 피롤로벤조디아제핀 (PBD), 예를 들어, PBD 이량체이다.
PBD의 구조는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2013/0028917호 및 제2013/0028919호, 및 WO 2011/130598 A1에서 확인할 수 있으며, 이들 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. PBD의 일반 구조는 하기 화학식 (II)로 제공된다.
Figure pct00011
(II)
PBD는 방향족 A 고리 및 피롤로 C 고리 둘 모두에서의 치환기의 수, 유형 및 위치, 및 C 고리의 포화도에 있어서 상이하다. B 고리에는, 일반적으로 DNA의 알킬화를 담당하는 친전자성 중심인 N10-C11 위치에 이민(N=C), 카르비놀아민 (NHCH(OH)) 또는 카르비놀아민 메틸 에테르(NHCH(OMe))가 존재한다. 공지된 천연 생성물은 모두 C 고리에서 A 고리 쪽으로 볼 때 오른손 방향 비틀림(right-handed twist)을 제공하는 키랄 C11a 위치에 (S)-입체배치를 갖는다. 본원에 제공된 PBD 예는 본 개시의 항-EGFR 항체에 컨쥬게이션될 수 있다. 본 개시의 항-EGFR 항체에 컨쥬게이션될 수 있는 PBD의 추가예는, 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제2013/0028917 A1호 및 제2013/0028919 A1호, 미국 특허 번호 제7,741,319 B2호, 및 WO 2011/130598 A1 및 WO 2006/111759 A1에서 확인할 수 있으며, 이들 문헌은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
본원에 기재된 항-EGFR ADC에서, 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제는 링커에 의해 항체에 연결된다. 링커는 짧거나, 길거나, 소수성이거나, 친수성이거나, 가요성이거나 또는 강성일 수 있으며, 링커가 상이한 특성을 갖는 분절을 포함할 수 있도록 독립적으로 상기 언급된 특성 중 하나 이상을 갖는 분절로 구성될 수 있다. 링커는 항체 상의 단일 부위에 하나 초과의 작용제가 공유결합적으로 연결되도록 다가이거나, 또는 항체 상의 단일 부위에 단일 작용제가 공유결합적으로 연결되도록 1가일 수 있다.
특정 구현예에서, 선택된 링커는 생체내에서 절단 가능하다. 절단 가능한 링커는 화학적으로 또는 효소적으로 불안정하거나 분해 가능한 연결을 포함할 수 있다. 절단 가능한 링커는 일반적으로 세포질에서의 환원, 리소좀에서 산성 환경에의 노출, 또는 세포 내 특정한 프로테아제 또는 다른 효소에 의한 절단과 같은, 약물을 유리시키기 위한 세포 내부의 과정에 의존한다. 절단 가능한 링커는 일반적으로 화학적으로 또는 효소적으로 절단 가능한 하나 이상의 화학 결합을 포함하지만, 링커의 나머지는 절단 가능하지 않다. 특정 구현예에서, 링커는 히드라존 및/또는 디술파이드기와 같은 화학적으로 불안정한 기를 포함한다. 화학적으로 불안정한 기를 포함하는 링커는 혈장과 일부 세포질 구획 사이의 차별적인 특성을 이용한다. 히드라존 함유 링커에 대한 약물 방출을 용이하게 하기 위한 세포내 조건은 엔도좀 및 리소좀의 산성 환경이며, 디술파이드 함유 링커는 높은 티올 농도, 예를 들어, 글루타티온을 함유하는 시토졸에서 환원된다. 특정 구현예에서, 화학적으로 불안정한 기를 포함하는 링커의 혈장 안정성은 화학적으로 불안정한 기 근처의 치환기를 사용하여 입체 장애를 도입함으로써 증가될 수 있다.
히드라존과 같은 산 불안정 기는 혈액의 중성 pH 환경(pH 7.3 내지 7.5)에서는 전신 순환 동안 온전한 상태로 유지되고, ADC가 세포의 약산성 엔도좀(pH 5.0 내지 6.5) 및 리소좀(pH 4.5 내지 5.0) 구획으로 내재화되면, 가수분해를 거쳐 약물을 방출한다. 이러한 pH 의존적 방출 메커니즘은 약물의 비특이적 방출과 관련이 있다. 링커의 히드라존기의 안정성을 증가시키기 위해, 링커를 화학적 변형, 예를 들어, 치환에 의해 변형시켜, 순환에서 손실을 최소화하면서 리소좀에서 보다 효과적인 방출을 달성하도록 조정할 수 있다.
히드라존 함유 링커는 추가의 산 불안정 절단 부위 및/또는 효소적으로 불안정한 절단 부위와 같은 추가의 절단 부위를 함유할 수 있다. 예시적인 히드라존 함유 링커를 포함하는 ADC는 하기 화학식 (III), (IV), 및 (V)의 구조, 또는 이들의 염을 포함한다:
Figure pct00012
[식 중, D 및 Ab는, 각각, 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제(약물) 및 항체를 나타내고, n은 항체에 연결된 약물-링커의 수를 나타냄]. (화학식 (III))에서와 같은 특정한 링커에서, 링커는 2 개의 절단 가능한 기 - 디술파이드 및 히드라존 모이어티를 포함한다. 이러한 링커의 경우, 변형되지 않은 유리된 약물의 효과적인 방출은 산성 pH, 또는 디술파이드 환원 및 산성 pH를 필요로 한다. 화학식 (IV) 및 (V)에서와 같은 링커는 단일 히드라존 절단 부위에 효과적인 것으로 나타났다.
링커에 포함될 수 있는 다른 산 불안정 기는 시스-아코니틸 함유 링커를 포함한다. 시스-아코니틸 화학은 산성 조건 하에서 아민 가수분해를 촉진시키기 위해 아미드 결합과 병치된(juxtaposed) 카르복실산을 사용한다.
절단 가능한 링커는 또한 디술파이드기를 포함할 수 있다. 디술파이드는 생리학적 pH에서 열역학적으로 안정하며, 시토졸이 세포외 환경에 비해 유의하게 더 환원적인 환경을 제공하는 세포 내로의 내재화 시 약물을 방출하도록 설계되어 있다. 디술파이드 결합의 절단은 일반적으로, 디술파이드 함유 링커가 순환에서 상당히 안정적이 되어 시토졸에서 약물을 선택적으로 방출할 수 있도록, (환원된) 글루타티온(GSH)과 같은 세포질 티올 보조인자의 존재를 필요로 한다. 세포내 효소 단백질 디술파이드 이성질화효소 또는 디술파이드 결합을 절단할 수 있는 유사한 효소는, 또한 세포 내부에서 디술파이드 결합의 우선적인 절단에 기여할 수 있다. GSH는 대략 5 μM의 순환에서 가장 풍부한 저분자량 티올인 시스테인 또는 GSH의 상당히 더 낮은 농도와 비교하여, 0.5 내지 10 mM 범위의 농도로 세포에 존재하는 것으로 보고되어 있다. 종양 세포는, 불규칙한 혈류가 저산소 상태로 이어지는 경우, 환원성 효소의 활성을 증강시켜, 글루타티온 농도를 보다 높인다. 특정 구현예에서, 디술파이드 함유 링커의 생체내 안정성은 링커의 화학적 변형, 예를 들어, 디술파이드 결합에 인접한 입체 장애의 사용에 의해 증강될 수 있다.
예시적인 디술파이드 함유 링커를 포함하는 ADC는, 하기 화학식 (VI), (VII) 및 (VIII)의 구조 또는 이들의 염을 포함한다:
Figure pct00013
Figure pct00014
[식 중, D 및 Ab는, 각각, 약물 및 항체를 나타내고, n은 항체에 연결된 약물-링커의 수를 나타내고, R은, 각각의 경우 독립적으로, 예를 들어, 수소 또는 알킬에서 선택됨]. 특정 구현예에서, 디술파이드 결합에 인접한 입체 장애를 증가시키는 것은, 링커의 안정성을 증가시킨다. (VI) 및 (VIII)과 같은 구조는, 하나 이상의 R기가 메틸과 같은 저급 알킬에서 선택되는 경우, 증가된 생체내 안정성을 나타낸다.
사용될 수 있는 또 다른 유형의 절단 가능한 링커는 효소에 의해 특이적으로 절단되는 링커이다. 이러한 링커는 전형적으로 펩티드 기반이거나, 또는 효소에 대한 기질로서 작용하는 펩티드 영역을 포함한다. 펩티드 기반 링커는 화학적으로 불안정한 링커보다 혈장 및 세포외 환경에서 보다 안정한 경향이 있다. 리소좀 단백질 분해 효소가 내인성 억제제, 및 리소좀에 비해 혈액의 바람직하지 않은 높은 pH 값으로 인해 혈액에서 매우 낮은 활성을 갖기 때문에, 펩티드 결합은 일반적으로 양호한 혈청 안정성을 갖는다. 항체로부터의 약물의 방출은 리소좀 프로테아제, 예를 들어, 카텝신(cathepsin) 및 플라스민(plasmin)의 작용으로 인해 특이적으로 일어난다. 이러한 프로테아제는 특정 종양 세포에서 상승된 수준으로 존재할 수 있다.
예시적인 구현예에서, 절단 가능한 펩티드는 Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu와 같은 테트라펩티드, 또는 Val-Cit, Val-Ala, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, Phe-Lys, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Me3Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys와 같은 디펩티드로부터 선택된다. 구현예에서, 절단 가능한 펩티드는 Val-Ala이다. 구현예에서, 링커는 말레이미도카프로일-발린-알라닌(mc-Val-Ala) 링커이다. 특정 구현예에서, 디펩티드는 보다 긴 펩티드의 소수성으로 인해 보다 긴 폴리펩티드보다 바람직하다.
항체에 독소루비신(doxorubicin), 미토마이신(mitomycin), 캄프토테신(campotothecin), 탈리소마이신(tallysomycin) 및 아우리스타틴/아우리스타틴 패밀리 구성원과 같은 약물을 연결하는데 유용한 다양한 디펩티드 기반 절단 가능한 링커가 기재되어 있다 ([Dubowchik et al., 1998, J. Org. Chem. 67:1866-1872]; [Dubowchik et al., 1998, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(21):3341-3346]; [Walker et al., 2002, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:217-219]; [Walker et al., 2004, Bioorg. Med. Chem. Lett.14:4323-4327]; [Francisco et al., 2003, Blood 102:1458-1465] 및 [Dornina et al., 2008, Bio conjugate Chemistry 19:1960-1963] 참조, 상기 문헌들은 각각 본원에 참조로서 인용됨). 이러한 디펩티드 링커 또는 이러한 디펩티드 링커의 변형된 버전은 모두 본원에 기재된 ADC에 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 디펩티드 링커에는 Seattle Genetics의 브렌툭시맙 베도틴(Brentuximab Vedotin) SGN-35 (Adcetris™), Seattle Genetics의 SGN-75(항-CD-70, Val-Cit-MMAF), Celldex Therapeutics의 글렘바투무맙(glembatumumab) (CDX-011) (항-NMB, Val-Cit-MMAE) 및 Cytogen의 PSMA-ADC(PSMA-ADC-1301) (항-PSMA, Val-Cit-MMAE)과 같은 ADC에서 발견되는 것들이 포함된다.
효소적으로 절단 가능한 링커는 효소적 절단 부위로부터 약물을 공간적으로 분리하기 위한 자기 희생(self-immolative) 스페이서를 포함할 수 있다. 펩티드 링커에의 약물의 직접적인 부착은 약물의 아미노산 부가물의 단백질 가수분해적 방출을 유도하여, 이의 활성을 손상시킬 수 있다. 자기 희생 스페이서의 사용은, 아미드 결합 가수분해 시, 완전 활성의 화학적으로 변형되지 않은 약물의 제거를 가능하게 한다.
하나의 자기 희생 스페이서는 아미노기를 통해 펩티드에 연결되어 아미드 결합을 형성하는 이관능성 파라-아미노벤질 알코올기이며, 아민 함유 약물은 카르바메이트 관능기를 통해 링커(PABC)의 벤질계 히드록실기에 부착될 수 있다. 생성된 전구약물은 프로테아제 매개 절단 시 활성화되어, 변형되지 않은 약물, 이산화탄소 및 링커 기의 잔류물을 방출하는 1,6-제거 반응을 유도한다. 하기 반응식은 p-아미도벤질 에테르의 단편화 및 약물의 방출을 도시한다:
Figure pct00015
[식 중, X-D는 변형되지 않은 약물을 나타냄].
이러한 자기 희생기의 헤테로시클릭 변형이 또한 기재되어 있다. 예를 들어, US 7,989,434 참조 (이는 본원에 참조로서 인용됨).
일부 구현예에서, 효소적으로 절단 가능한 링커는 β-글루쿠론산 기반 링커이다. 약물의 용이한 방출은 리소좀 효소 β-글루쿠로니다아제에 의한 β-글루쿠로니드 글리코시드 결합의 절단을 통해 실현될 수 있다. 이러한 효소는 리소좀 내에서 풍부하게 존재하며, 일부 종양 유형에서 과발현되지만, 세포 외에서의 효소 활성은 낮다. β-글루쿠론산 기반 링커는 β-글루쿠로니드의 친수성 성질로 인해 ADC가 응집하게 되는 경향을 회피하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, β-글루쿠론산 기반 링커는 소수성 약물에 연결되는 ADC를 위한 링커로서 바람직하다. 하기 반응식은 β-글루쿠론산 기반 링커를 함유하는 ADC로부터의 약물의 방출을 도시한다.
Figure pct00016
항체에 아우리스타틴, 캄프토테신 및 독소루비신 유사체와 같은 약물, CBI 소홈 결합제 및 심베린(psymberin)을 연결하는데 유용한 다양한 절단 가능한 β-글루쿠론산 기반 링커가 기재되어 있다 ([Nolting, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology의 Chapter 5 "Linker Technology in Antibody-Drug Conjugates", vol. 1045, pp. 71-100, Laurent Ducry (Ed.), Springer Science & Business Medica, LLC, 2013]; [Jeffrey et al., 2006, Bioconjug. Chem. 17:831-840]; [Jeffrey et al., 2007, Bioorg. Med. Chem. Lett. 17:2278-2280] 및 [Jiang et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127:11254-11255] 참조, 이들 문헌은 각각 본원에 참조로서 인용됨). 이러한 β-글루쿠론산 기반 링커는 모두 본원에 기재된 항-EGFR ADC에 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시의 ADC에 사용되는 링커는 하기 화학식 (IX) 또는 이의 염으로 제시되며, 식 중 Y는 Val이고, Z는 Ala이고, D는 약물 (예를 들어, PBD 이량체)이고, q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다:
Figure pct00017
구현예에서, q는 5이다.
하나의 양태에서, 본 개시는 링커에 의해 항체에 연결된 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제를 포함하는 ADC를 기재하며, 여기서 항체 약물 컨쥬게이트는 구조식 (I)에 따른 화합물 또는 이의 염이고, 식 중 D는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 포함하고; L은 링커이고; Ab는 서열번호 1을 포함하는 항체이고; XY는 항체 Ab에 링커 L을 연결하는 공유결합적 연결을 나타내고; n은 임의의 정수이다. 하나의 구현예에서, XY는 항체 Ab에 링커 L을 연결하는 공유결합적 연결을 나타내며, 여기서 XY는 항체 Ab 상의 술프히드릴기와 함께 형성된 연결이다. 또 다른 구현예에서, XY는 말레이미드-술프히드릴 연결이다.
특정 구현예에서, 본 개시의 ADC는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함한다:
Figure pct00018
(X),
[식 중, Ab는 서열번호 3, 4 및 5에 제시된 CDR 세트(CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8, 9 및 10에 제시된 CDR 세트(CDRL1, CDRL2 및 CDRL3)를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체이고, n은 2 또는 4임]. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 PBD에 대한 컨쥬게이션 부위를 제공하도록 조작된 시스테인 돌연변이를 갖는 불변 영역을 갖는 IgG1 동형이다. 하나의 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 중쇄의 위치 239에 있다. 구현예에서, 돌연변이는 S239C (여기서 넘버링은 Kabat에 따름)이다. 하나의 구현예에서, n은 약 2 또는 약 4이다. 구현예에서, n은 약 2이다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다.
구현예에서, 본 개시의 ADC는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함한다:
Figure pct00019
(X),
[식 중, Ab는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체임]. 구현예에서, 항-EGFR 항체는 PBD에 대한 컨쥬게이션 부위를 제공하도록 조작된 시스테인 돌연변이를 갖는 불변 영역을 갖는 IgG1 동형이다. 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 중쇄의 위치 239에 있다. 구현예에서, 시스테인 돌연변이는 S239C(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)이다. 하나의 구현예에서, n은 약 2 또는 약 4이다. 또 다른 구현예에서, n은 약 2이다. 구현예에서, 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역은 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함한다.
구현예에서, 본 개시의 ADC는 하기 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함한다:
Figure pct00020
(X),
[식 중, Ab는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체임]. 구현예에서, n은 약 2 내지 약 4이다. 구현예에서, n은 약 2 또는 약 4이다. 구현예에서, n은 약 2이다.
본 개시의 ADC는 당업계에 공지된 화학을 사용하여 합성될 수 있다. 선택되는 화학은, 특히, 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제(들), 링커, 및 항체에 링커를 부착시키는데 사용되는 기의 정체성에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 화학식 (I)에 따른 ADC는 하기 반응식에 따라 제조될 수 있다:
Figure pct00021
[식 중, D, L, Ab, XY 및 n은 상기 정의된 바와 같고, R x 및 R y 는 상기 논의된 바와 같이, 서로 공유결합적 연결을 형성할 수 있는 상보적 기를 나타냄].
기 R x 및 R y 의 정제성은 항체에 신톤 D-L-R x 를 연결하는데 사용되는 화학에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 사용되는 화학은 항체의 온전성, 예를 들어 이의 표적과 결합하는 이의 능력을 변경시켜서는 안된다. 바람직하게는, 컨쥬게이션된 항체의 결합 특성은 컨쥬게이션되지 않은 항체의 특성과 매우 유사할 것이다. 항체와 같은 생물학적 분자에 분자를 컨쥬게이션하는 다양한 화학 및 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 특히 항체에 대한 것이 널리 공지되어 있다. 예를 들어, [Amon et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy 중 "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Reisfeld et al., Eds., Alan R. Liss, Inc., 1985]; [Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery 중 "Antibodies For Drug Delivery", Robinson et al., Eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd Ed. 1987]; [Thorpe, Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications 중 "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Pinchera et al.,Eds., 1985]; [Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy 중 "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Baldwin et al., Eds., Academic Press, 1985]; [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]; PCT 공보 WO 89/12624 참조. 이러한 화학 중 임의의 것이 항체에 신톤을 연결하는데 사용될 수 있다.
접근 가능한 리신 잔기에 신톤을 연결하는데 유용한 다수의 관능기 R x 및 화학은 공지되어 있으며, 이에는, 예로서, 비제한적으로, NHS-에스테르 및 이소티오시아네이트가 포함된다.
시스테인 잔기의 접근 가능한 유리된 술프히드릴기에 신톤을 연결하는데 유용한 다수의 관능기 R x 및 화학은 공지되어 있으며, 이에는, 예로서, 비제한적으로, 할로아세틸 및 말레이미드가 포함된다.
하지만, 컨쥬게이션 화학은 이용 가능한 측쇄기에 제한되지 않는다. 아민과 같은 측쇄는, 아민에 적절한 소분자를 연결함으로써, 히드록실과 같은 다른 유용한 기로 전환될 수 있다. 이러한 전략은 항체의 접근 가능한 아미노산 잔기의 측쇄에 다관능성 소분자를 컨쥬게이션함으로써, 항체 상의 이용 가능한 연결 부위의 수를 증가시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 "전환된" 관능기에 신톤을 공유결합적으로 연결하는데 적합한 관능기 R x 는 신톤에 포함되어 있다.
항체는 또한 컨쥬게이션을 위한 아미노산 잔기를 포함하도록 조작될 수 있다. 인코딩되지 않은 아미노산에 신톤을 연결하는데 유용한 화학 및 관능기와 같은, ADC의 맥락에서 약물을 컨쥬게이션하는데 유용한 비(非)유전적으로 인코딩된 아미노산 잔기를 포함하도록 항체를 조작하는 접근법이 [Axup et al., 2012, Proc Natl Acad Sci U S A. 109(40):16101-16106]에 기재되어 있다.
전형적으로, 신톤은, 예를 들어, 접근 가능한 리신 잔기의 1차 아미노기 또는 접근 가능한 시스테인 잔기의 술프히드릴기를 포함하는 항체의 아미노산 잔기의 측쇄에 연결된다. 유리된 술프히드릴기는 쇄간 디술파이드 결합을 환원시킴으로써 수득될 수 있다.
R y 가 술프히드릴기인 경우(예를 들어, R x 가 말레이미드인 경우)의 연결에서, 항체는 일반적으로 시스테인 잔기 사이의 쇄간 디술파이드 브릿지를 파괴시키기 위해 먼저 완전히 또는 부분적으로 환원된다. 항체 중쇄에 존재하는 경우, 특정 시스테인 잔기 및 쇄간 디술파이드 브릿지는, 술프히드릴기에의 컨쥬게이션에 적합한 기를 포함하는 약물-링커 신톤의 부착을 위해 환원될 수 있으며, 이에는, 예로서, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 인간 IgG1 중쇄 상의 잔기 C233, C239 및 C242(Kabat 넘버링 시스템; Eu 넘버링의 잔기 C220, C226 및 C229에 상응함), 및 인간 Ig 카파 경쇄 상의 잔기 C214(Kabat 넘버링 시스템). 하지만, 항체 중쇄가 부착 부위에 시스테인 잔기를 함유하지 않는 경우, 항체는 주어진 위치, 예를 들어, 위치 239에 시스테인을 함유하도록 조작될 수 있다.
디술파이드 브릿지에 참여하지 않는 신톤 부착을 위한 시스테인 잔기는 하나 이상의 코돈의 돌연변이에 의해 항체로 조작될 수 있다. 이러한 짝을 이루지 않은 시스테인을 환원시키는 것은, 컨쥬게이션에 적합한 술프히드릴기를 생성한다. 조작된 시스테인을 혼입시키는데 바람직한 위치에는, 예로서, 비제한적으로, 인간 IgG1 중쇄 상의 위치 S112C, S113C, A114C, S115C, A176C, S180C, S239C, S252C, V286C, V292C, S357C, A359C, S398C, S428C(Kabat 넘버링), 및 인간 Ig 카파 경쇄 상의 위치 V110C, S114C, S121C, S127C, S168C, V205C(Kabat 넘버링)가 포함된다(예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호, 미국 특허 제7,855,275호 및 미국 특허 제 8,455,622호 참조). 하나의 구현예에서, 잔기 S239(Kabat 넘버링 시스템)는 항체 AbA에의 PBD의 컨쥬게이션을 가능하게 하도록 시스테인으로 돌연변이된다. 이러한 돌연변이는 본원에서 "S239C"로 지칭된다.
특정 구현예에서, 본 개시의 ADC는 조작된 시스테인을 통해 약물 부하가 2이다.
특정 구현예에서, 본 개시는, 각각, 서열번호 1 및 6에 제시된 항체 중쇄 및 경쇄를 구조식(Ia) (식 중, D는 세포막을 가로지를 수 있는 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제이고, L은 리소좀 효소에 의해 절단될 수 있는 링커이고, Rx는 항체에 신톤을 공유결합적으로 연결할 수 있는 관능기를 포함함)에 따른 신톤과, 신톤이 항체에 신톤을 공유결합적으로 연결하는 조건 하에서, 접촉시키는 단계를 포함하는 ADC를 제조하는 방법을 특징으로 하며, 여기서 D는, 예를 들어, PBD 이량체이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 항체 분자에 연결되는 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제의 수는 달라질 수 있어, ADC 제제는 사실상 이종성(heterogeneous)이 될 수 있으며, 여기서 제제 중 일부 항체는 하나의 연결된 작용제, 일부는 2 개, 일부는 3 개 등 (및 일부는 0 개)의 연결된 작용제를 함유한다. 이종성의 정도는, 특히, 세포독성제 및/또는 세포증식 억제제를 연결하는데 사용되는 화학에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 항체가 부착을 위한 술프히드릴기를 생성하도록 환원되는 경우, 분자 당 0, 2, 4, 6 또는 8 개의 연결된 작용제를 갖는 항체의 이종 혼합물이 종종 생성된다. 나아가, 부착 화합물의 몰비를 제한함으로써, 분자 당 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 연결된 작용제를 갖는 항체가 종종 생성된다. 따라서, 문맥에 따라, 언급된 약물 항체 비 (DAR)는 항체의 수집에 대한 평균일 수 있다고 이해될 것이다. 예를 들어, "DAR4"는, 특정 DAR 피크를 단리하기 위한 정제에 적용되지 않고, 항체 당 부착된 상이한 수의 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제(예를 들어, 항체 당 0, 2, 4, 6, 8 개의 작용제의 단일 종 약물 부하)를 갖는 ADC 분자의 이종 혼합물을 포함하지만, 평균 약물 대 항체 비가 4인 ADC 제제를 나타낸다.
이종 ADC 제제는 특정된 관심 DAR(또는 둘 이상의 특정된 DAR의 혼합물)을 갖는 ADC가 강화된 제제를 생성하도록, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피("HIC")에 의해 처리될 수 있다. 이러한 강화된 제제는 본원에서 "EX"로 설계되며, 여기서 "E"는 처리되어 특정 DAR을 갖는 ADC 집단이 강화된 ADC 제제를 나타내고, "X"는 ADC 분자 당 연결된 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제의 수를 나타낸다. 2 개의 특정 DAR을 갖는 ADC의 혼합물이 강화된 제제는 "EX/EY"로, 3 개의 특정 DAR을 갖는 ADC의 혼합물이 강화된 제제는 "EX/EY/EZ"등으로 지정되며, 여기서 "E"는 특정 종을 강화시키기 위해 처리된 ADC 제제를 나타내고, "X", "Y" 및 "Z"는 강화된 종을 나타낸다. 특정예로서, "E2"는 ADC 분자 당 2 개의 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제가 연결된 ADC를 주로 함유하도록 강화된 ADC 제제를 나타낸다. "E4"는 ADC 분자 당 4 개의 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제가 연결된 ADC를 주로 함유하도록 강화된 ADC 제제를 나타낸다. "E2/E4"는, ADC 분자 당 2 개의 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제가 연결된 하나의 ADC 제제, 및 ADC 분자 당 4 개의 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제가 연결된 또 다른 ADC 제제인, 주로 2 개의 ADC 집단을 함유하도록 강화된 ADC 제제를 나타낸다.
본원에 사용된 바, 강화된 "E" 제제는 일반적으로 언급된 DAR ADC에서 적어도 약 80%의 순도를 가질 것이지만, 적어도 약 85%, 90%, 95%, 98% 또는 그 이상과 같은 보다 높은 순도가 수득될 수 있고, 바람직할 수 있다. 예를 들어, "EX" 제제는 일반적으로 ADC 분자 당 X 개의 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제가 연결된 ADC에서 적어도 약 80%의 순도를 가질 것이다. 예를 들어, "EX/EY" 제제와 같은 "보다 고차로" 강화된 제제의 경우, ADC 분자 당 X 및 Y 개의 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제가 연결된 ADC의 총합은 일반적으로 제제 중 총 ADC의 적어도 약 80%를 차지할 것이다. 유사하게, 강화된"EX/EY/EZ" 제제에서, ADC 분자 당 X, Y 및 Z 개의 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제가 연결된 ADC의 총합은 제제 중 총 ADC의 적어도 약 80%를 차지할 것이다.
순도는 당업계에 공지된 바와 같은 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 특정예로서, ADC 제제는 HPLC 또는 다른 크로마토그래피를 통해 분석될 수 있으며, 순도는 생성된 피크의 곡선 하 면적을 분석함으로써 평가될 수 있다.
구현예에서, 본 개시는 DAR이 2(DAR E2)인 AbA(S239C)-PBD ADC를 포함하는 이종 조성물을 포함하며, 여기서 DAR E2 종은 조성물 중 모든 ADC의 80% 초과(80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 초과)로 존재한다. 예를 들어, 구현예에서, 본 출원은 DAR이 2(DAR E2)인 AbA(S239C)-PBD ADC를 포함하는 이종 조성물을 포함하며, 여기서 DAR E2 종은 조성물 중 모든 ADC의 집단의 85% 초과 (85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%)로 존재한다. 구현예에서, 본 출원은 DAR이 2(DAR E2)인 AbA(S239C)-PBD ADC를 포함하며, 여기서 DAR E2 종은 조성물 중 모든 ADC의 집단의 90% 초과(90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%)로 존재한다.
특정 구현예에서, 본 개시의 ADC의 DAR은 약 2 또는 약 4이다. 추가의 구현예에서, 본 개시의 ADC의 DAR은 약 2이다.
본원에 기재된 ADC는 ADC와 하나 이상의 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물의 형태로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 수의학적 용도 또는 인간에서의 약학적 용도와 같은 특정 용도로 제형화될 수 있다.
서열의 간단한 설명
본원에 개시된 핵산 및/또는 아미노산 서열이 포함되어 있는, 서열번호 1 내지 서열번호 20을 포함하는 Sequence_Listing_12389라는 명칭의 서열 목록은, 그 전체가 참조로서 포함된다. 서열 목록은 ASCII 텍스트 형식으로 제출되었다. 상기 서열은 2018년 8월31일자에 생성되었으며, 크기는 45.1 KB이다.
실시예
항-EGFR ADC의 예시적인 구현예의 특정한 특징 및 특성을 강조하는 하기 실시예는, 예시의 목적으로 제공되며, 제한하고자 하는 것이 아니다.
달리 기재되지 않는 한, 실시예에 기재된 PBD ADC의 대략적인 DAR이 약 2라는 점에 유의해야 한다.
실시예 1. 항-EGFR AbA(S239C)의 생성
항체 1(Ab1)은 인간화 항-EGFR 항체이다. Ab1의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 20에 기재되어 있다. 중쇄 가변 영역은 이탤릭체로 표시되어 있으며(서열번호 15), CDR은 밑줄 그어져 있다.
Figure pct00022
Ab1의 중쇄 가변 영역 (VH) 아미노산 서열은 하기 서열번호 15로 제공된다. Ab1의 VH CDR 아미노산 서열은 하기에 밑줄 그어져 있으며, 다음과 같다: GYSISSDFAWN(VH CDR1; 서열번호 16); YISYSGNTRYQPSLKS(VH CDR2; 서열번호 17) 및 AGRGFPY(VH CDR3; 서열번호 18).
Ab1 VH 서열
Figure pct00023
Ab1의 경쇄 가변 영역(VL) 아미노산 서열은 하기에 서열번호 7로 제공된다. Ab1의 VL CDR 아미노산 서열은 하기에 밑줄 그어져 있으며, 다음과 같다: HSSQDINSNIG(VL CDR1; 서열번호 8); HGTNLDD (VL CDR2; 서열번호 9) 및 VQYAQFPWT(VL CDR3; 서열번호 10).
Ab1 VL 서열
Figure pct00024
스크리닝을 수행하여, Ab1에 비해 개선된 특성을 갖는 항-EGFR 항체를 동정하였다. Ab1 변이체의 동정에 대한 세부사항은, 예를 들어, WO2015/143382에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
동정된 Ab1 변이체 항체 중 하나는 AbA이다. AbA는 동일한 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열(각각, 서열번호 8, 9 및 10에 기재됨)을 포함하여, Ab1(서열번호 7)과 동일한 가변 경쇄 서열을 갖는다. AbA의 VH 아미노산 서열은 하기 서열번호 2에 제공된다. AbA의 VH CDR 아미노산 서열은 GYSISRDFAWN(CDR1; 서열번호 3); YISYNGNTRYQPSLKS(CDR2; 서열번호 4) 및 ASRGFPY(CDR3; 서열번호 5)이며, 하기에 밑줄 그어져 있다. Ab1에 비해 AbA의 중쇄 가변 영역에서 상이한 잔기는 하기에 볼드체로 표시되어 있다.
AbA VH 아미노산 서열
Figure pct00025
도 3 및 도 4는, Ab1 및 AbA의 VH 및 VL 영역(도 3), 및 완전한 중쇄 및 경쇄(도 4)의 아미노산 서열의 정렬을 제공한다. Ab1 및 AbA의 경쇄 아미노산 서열은 동일하다(서열번호 6). 하지만, Ab1 및 AbA의 중쇄 아미노산 서열은 CDR에 존재하는 3 개의 서열 중 2 개의 서열 사이에 6 개의 아미노산 차이를 갖는다. Ab1 VH 아미노산 서열과 AbA VH 아미노산 서열 사이의 차이는 도 3에 음영 처리되어 있으며, 각각의 VH CDR에서 발견된다. AbA의 가변 중쇄의 CDR1 도메인은 세린(Ab1)에서 아르기닌으로의 아미노산 변화를 포함하고 있다. 가변 중쇄의 CDR2 도메인은 Ab1의 세린에서 AbA의 아스파라긴으로의 아미노산 변화를 포함하고 있다. 최종적으로, 가변 중쇄의 CDR3 도메인은 Ab1의 글리신에서 AbA의 세린으로의 아미노산 변화를 포함하고 있다. AbA 내 아미노산 변화 중 2 개는 중쇄의 불변 영역에 존재한다(D354E 및 L356M). AbA에서 Fc 영역 아미노산 돌연변이는 z, a 동종이형(allotype)에서 z, 비(非)-a 동종이형으로의 인간 IgG 동종이형 변화를 나타낸다. 다른 변화 이외에, 제1 아미노산이, 예를 들어, 도 3에 기재된 바와 같이, 글루타민(Q)에서 글루탐산(E)으로 변화되었다. 따라서, AbA 항체는 Ab1 항체에 비해 상보성 결정 영역에서 3 개의 아미노산 차이를 함유한다. 하지만, AbA는 EGFR에 대하여 Ab1보다 개선된 결합 친화성을 갖고, 또한, 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 WO2015/143382에 기재된 바와 같이, Ab1에 비해 고유한 시험관내 및 생체내 특성을 나타낸다.
항-EGFR 항체 AbA의 동정 후, 탄두(warhead) PBD의 부위-특이적 컨쥬게이션 부위를 조작하기 위해 항체를 변형시켰다. 구체적으로, DAR2와 PBD 이량체의 부위-특이적 컨쥬게이션을 가능하게 하기 위해, 당업자의 통상의 기술의 사용하여 조작된 시스테인 항체(C239)를 생성하였다. 이러한 돌연변이된 항체는 본원에서 AbA(S239C)로 지칭되며, 이는 AbA 경쇄 및 변형된 AbA(C239) 중쇄 서열을 포함한다. AbA(S239C)의 중쇄 아미노산 서열은 하기 서열번호 1에 기재되어 있다. CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3) (각각, 서열번호 3, 4 및 5)은 밑줄 그어져 있으며, 가변 영역(서열번호 2)은 이탤릭체로 표시되어 있다.
Figure pct00026
AbA(S239C)의 중쇄 불변 영역은 이의 모(parent) 항체 AbA에 비해 변형된 잔기를 함유한다. 구체적으로, 잔기 239(Kabat 넘버링)가 AbA의 중쇄에 대해 S에서 C로 돌연변이되었다. 이러한 잔기는 상기 서열번호 1에 밑줄/볼드체로 표시되어 있다. S239C(Kabat 넘버링)가 서열번호 1의 아미노산 잔기 238(S238C)에 해당한다는 점에 유의해야 한다.
AbA(S239C)의 경쇄 아미노산 서열(서열번호 6)이 하기에 제공되어 있으며, 여기서 CDR1, CDR2 및 CDR3(각각, 서열번호 8, 9 및 10)은 밑줄 그어져 있고, 가변 영역(서열번호 7)은 이탤릭체로 표시되어 있다.
Figure pct00027
AbA(S239C)를 PBD 이량체에 추가로 컨쥬게이션하고, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, ADC로서 시험하였다.
탄두 PBD의 부위-특이적 컨쥬게이션 부위를 조작하기 위해 Ab1를 또한 변형시켰다. 구체적으로, DAR2와 PBD 이량체의 부위-특이적 컨쥬게이션을 가능하게 하기 위해, 당업자의 통상의 기술의 사용하여 조작된 시스테인 항체(C239)를 생성하였다. 이러한 돌연변이된 항체는 본원에서 Ab1(S239C)로 지칭되며, 이는 Ab1 경쇄 및 변형된 Ab1(C239) 중쇄 서열을 포함한다. Ab1(S239C)의 중쇄 아미노산 서열은 하기 서열번호 19에 기재되어 있다. CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3) (서열번호 16 내지 18)은 밑줄 그어져 있으며, 가변 영역(서열번호 15)은 이탤릭체로 표시되어 있다.
Figure pct00028
Ab1(S239C)의 중쇄 불변 영역은 이의 모 항체에 비해 변형된 잔기를 함유한다. 구체적으로, 잔기 239(Kabat 넘버링)가 Ab1의 중쇄에 대해 S에서 C로 돌연변이되었다. 이러한 잔기는 상기 서열번호 19에 밑줄/볼드체로 표시되어 있다. S239C(Kabat 넘버링)가 서열번호 19의 아미노산 잔기 238(S238C)에 해당한다는 점에 유의해야 한다.
Ab1(S239C)을 PBD 이량체에 추가로 컨쥬게이션하고, ADC로서 시험하였으며, 여기서 Ab1(S239C)-PBD는 Cys 조작된 항-EGFR 항체 Ab1(S239C)에 컨쥬게이션된 2 개의 PBD 약물-링커 분자로 구성되어 있다.
실시예 2: PBD 컨쥬게이트의 생성 및 물리화학적 특징 분석
AbA(S239C)-PBD는 Cys 조작된 항-EGFR 항체 AbA(S239C)에 컨쥬게이션된 2 개의 PBD 약물-링커 분자로 구성된다. PBD 및 링커의 구조는 도 2에 기재되어 있다. 도 2는 또한 AbA(S239C)-PBD가 제조되는 과정을 기재한다. 컨쥬게이션 과정은 쇄간 디술파이드의 환원, 정량적 산화 및 과량의 PBD 약물 링커와의 컨쥬게이션을 포함하고 있다. 컨쥬게이션 과정은 조작된 및 쇄간 디술파이드 둘 모두의 정량적 환원으로 이루어져 있다. 이어서, 환원 혼합물을 정제하여 과량의 시약 및 부산물을 제거한 후, 쇄간 디술파이드의 정량적 산화 및 과량의 PBD 약물-링커와의 컨쥬게이션을 수행하였다. 퀀칭 후, 반응 혼합물을 정제하고, 완충액 교환하여, 도 2에 기재된 바와 같이, 85% 초과의 DAR2 약물 부하를 갖는 AbA(S239C)-PBD를 수득하였다. 정제 후, AbA(S239C) - PBD ADC의 전체 수율은 대략 90%였다. 컨쥬게이션 과정은 대략 2.5중량% 부하(~2 g)의 PBD 약물 링커의 사용을 필요로 하였다.
Cys-조작된 항-EGFR 항체 Ab1(S239C)에 컨쥬게이션된 2 개의 PBD 약물-링커 분자로 구성된 Ab1(S239C)-PBD를, 또한 상기 기재되고 도 2에 제시된 바와 같은 과정에 따라 제조하였다.
실시예 3: 유세포 분석
PBD에의 Cys-조작된 AbA(S239C)의 컨쥬게이션이 모 항체 AbA와 비교하여 결합 특성을 변경시키지 않을 것이라는 것을 확인하기 위해, 야생형 EGFR, 또는 Ab1 및 AbA에 의해 인식되는 크립틱(cryptic) 에피토프를 노출시키는 것으로 공지된 점 돌연변이체인 EGFR의 CA 돌연변이체 버전(EGFR C271A,C283A)을 발현하도록 조작된 NR6 인간 섬유아세포을 이용하여 유세포 분석 기반 검정을 수행하였다. Ab1 및 AbA, Cys-조작된 Ab1(S239C) 및 AbA(S239C) 돌연변이체, 및 PBD-컨쥬게이션된 Ab1(S239C)-PBD 및 AbA(S239C)-PBD를 포함하는 6가지 항체/ADC를 분석에 포함시켰다. 항체의 농도를 증가시키면서, 야생형 EGFR-과발현(도 5a) 및 EGFR CA 돌연변이체-과발현(도 5b) NR6 세포에 첨가하였다.
도 5에 제시된 바와 같이, 과발현된 EGFR을 이용한 결합 곡선은 AbA, AbA(S239C) 및 AbA(S239C)-PBD에 대하여 유사하다. 야생형 EGFR-발현 NR6 세포와 비교하여 CA 돌연변이체와의 전체적인 결합이 더 크다. 도 5b에 제시된 바와 같이, 6가지 항체/ADC는 모두 EGFR CA 돌연변이체-발현 세포에 결합하였다. 이러한 결과는, PBD에의 Cys-조작된 AbA(S239C)의 컨쥬게이션이 모 항체와 비교하여 결합 특성을 변경시키지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 4: AbA(S239C)-PBD ADC 대 AbA-MMAE ADC의 시험관내 비교
Ab1(S239C)-PBD와 함께, AbA(S239C)-PBD의 세포독성 활성을, 세포 사멸 검정에서 상이한 수준으로 표면 EGFR을 발현하는 종양 세포주의 패널에 대하여 평가하였다. 특히 A431, SW48, NC1-H441 및 LoVo 종양 세포를, 제시된 농도의 ADC(AbA(S239C)-PBD 및 AbA-MMAE 포함)가 첨가된 96 웰 플레이트에 씨딩하였다. 37℃에서 72 시간 인큐베이션 후, ATPlite 발광 검정으로 세포 생존능을 평가하였다. 이러한 분석의 결과는 도 7에 제시되어 있다. 도 7에 제시된 바와 같이, 상응하는 아우리스타틴 컨쥬게이트인 AbA-MMAE ADC와 비교하여, PBD 컨쥬게이트 AbA (S239C)-PBD의 처리 후 4 개의 모든 세포주에서 세포독성 활성이 개선되었다.
본 개시의 목적을 위하여, "AbA-MMAE" 또는 ("AbA-vcMMAE")는 절단 가능한 발린-시트룰린(VC) 링커를 통해 아우리스타틴 탄두 모노메틸 아우리스타틴 E에 컨쥬게이션된 AbA를 포함하는 아우리스타틴 기반 ADC를 나타낸다. 달리 기재되지 않는 한, 본 개시의 실시예에서 사용된 AbA-MMAE ADC의 DAR이 약 3이라는 점에 유의해야 한다. 본 개시의 목적을 위하여, "Ab1-MMAF"는 절단 가능하지 않은 말레이미도카프로일 링커를 통해 아우리스타틴 탄두 모노메틸 아우리스타틴 F에 컨쥬게이션된 인간화 IgG1 항체 Ab1를 갖는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 나타낸다. 달리 기재되지 않는 한, 본 개시의 실시예에서 사용된 Ab1-MMAF ADC의 DAR이 약 3.8이라는 점에 유의해야 한다.
이러한 분석에 사용된 세포 상의 EGFR 수가 다른 EGFR-과발현 세포주의 수와 비교하여 도 6에 제시되어 있다. A431은 증폭된 EGFR(세포 당 2 x 106 개 초과의 수용체)을 갖는 표피 암종 세포주이다. SW-48은 EGFR을 발현하는(세포 당 200,000 개 초과의 수용체; IHC H-점수 228) 결장직장 선암종 세포주이고, NCI-H441은 중간 내지 낮은 EGFR 발현(세포 당 ~100,000 개의 수용체; IHC H-점수 150)을 갖는 폐 선종 이종이식편 모델이고, LoVo는 보다 낮은 EGFR 발현(세포 당 100,000 개 미만의 수용체; IHC H-점수 140)을 갖는 KRAS 돌연변이 결장직장 선암종이다(도 6).
AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD를 또한 상이한 수준으로 EGFR을 발현하는 22 개의 결장직장암 세포주 패널의 성장을 억제하는 능력에 대하여 평가하였다(표 1). 세포 증식 검정에서 아우리스타틴 ADC Ab1-MMAF 및 AbA-MMAE와 함께, ADC에 대한 민감성은, IC50 값으로 표시되어 있다. 본 연구에 사용된 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD 컨쥬게이트는 85% 초과의 DAR 2 약물 부하를 함유한다.
Figure pct00029
마이크로튜불린 억제제는 EGFR-양성 결장직장 종양을 포함하는 일부 질환 설정에서 유의한 효능을 입증하지 못했다. Perez EA 참조. [Perez EA. Microtubule Inhibitors: Differentiating tubulin-inhibiting agents based on mechanisms of action, clinical activity, and resistance. Mol Cancer Ther 2009; 8(8): 2086-95] 참조. IHC 분석에 따르면 CRC의 25% 초과가 EGFR을 발현하며, CRC는 몇몇 EGFR 기반 요법에 대하여 승인된 적응증이다. [Mendelsohn J, Baselga J. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer. Semin Oncol 2006; 33(4):369-85]; [Herbst RS, Kim ES, Harari PM. IMC-C225, an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, for treatment of head and neck cancer. Expert Opin Biol Ther 2001;1(4):719-32]; [Lynch DH, Yang XD. Therapeutic potential of ABX-EGF: a fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody for cancer treatment. Semin Oncol 2002;29(1 Suppl 4):47-50] 참조.
표 1에 제시된 바와 같이, 대부분의 세포주는 IC50 값이 일반적으로 100 nm 초과인 것에 의해 입증되는 바와 같이, 아우리스타틴 기반 ADC(AbA-MMAE ADC 및 Ab1-MMAF ADC)에 대하여 크게 둔감하였지만, PBD 컨쥬게이트 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD는 세포 성장을 억제하는데 있어서 훨씬 더 효과적이었다. 나아가, 중요하게는, 세포 성장의 억제는 EGFR 발현 수준과 상관관계가 없었으며, 이는 본 개시의 PBD ADC가 낮은 발현 EGFR 결장직장 종양 세포주에 대하여 효과적일 수 있음을 시사한다. 또한, EGF 리간드-유도 자가분비 활성화 및 상응하는 AbA 에피토프의 증가된 노출은 이러한 종양 세포주 중 일부의 민감성에 기여할 수 있다. 비(非)표적화 PBD ADC 제어는 또한 선택된 종양 세포주에 대하여 약간의 억제 활성을 가졌지만, 전체적인 활성은 EGFR-표적화 PBD에서 관찰된 바와 비교하여 유의하게 감소되었다. 요약하면, 이러한 결과는, EGFR-PBD ADC의 활성이 아우리스타틴 기반 ADC에 대하여 크게 둔감한 낮은 수준 및 중간 수준 EGFR-발현 결장직장 종양으로 확장될 수 있음을 나타낸다.
EGFR-PBD ADC AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 활성을 또한 인간 교모세포종(GBM) 종양 세포주의 패널에 대하여 평가하였다.
Figure pct00030
표 2에 나타난 바와 같이, AbA-MMAE 및 Ab-1 MMAF는, 이러한 패널에 포함된 세포주가(U87MGde2-7을 제외하고) EGFR을 증폭시키지 않았기 때문에, 이러한 종양 세포주의 증식을 억제하는데 있어서 크게 효과가 없었다. 이러한 종양 세포주 상에서 발현된 EGFR의 수준이 낮음에도 불구하고, PBD 컨쥬게이트 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD는 개선된 효능 가졌으며, 이는 EGFR-PBD 컨쥬게이트가 EGFR-증폭 또는 과발현된 종양보다 GBM에서 활성일 수 있다는 사실과 일치한다.
실시예 5: EGFR ADC의 생체내 특징분석
마우스 대상에서 낮은 내지 높은 다양한 EGFR 발현 수준을 갖는 이종이식편 모델을 사용한 생체내 연구를, AbA 컨쥬게이션된 아우리스타틴 페이로드(payload) 및 PBD 페이로드 둘 모두를 사용하여 수행하였다.
NCI-H441은, 도 6에 제시된 바와 같이, 보통 내지 낮은 EGFR 발현을 갖는 폐 선종 이종이식편 모델이다(세포 당 ~100,000 개의 수용체, IHC H-점수 150). NCI-H441(폐 선암종)에서 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 효능은 도 8a에 제시되어 있다. 도 8a에 제시된 바와 같이, AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD는 총 6회의 용량에 대하여 7일마다(Q7Dx6) 0.3 mg/kg으로 투여되어, 동물의 100%에서 완전하고 지속되는 퇴행을 유도하였지만, Ab1-MMAF는 10 배 더 높은 용량(3 mg/kg) Q7Dx6으로 투여되었음에도 동물의 40%에서만 완전 반응을 유도하였다. 완전 반응(CR)은 적어도 3회의 연속 측정 동안 종양 부피가 25 mm3 미만인 것으로 정의된다. 모든 종양은 결국 Ab1-MMAF 처리 후 재발하였다. 음성 대조군 ADC인, Ab095-PBD는 또한 동물의 100%에서 지속되는 완전 반응을 유도하였다. 다른 ADC에서 관찰된 이러한 민감성은, 종양 관련 항원의 인식이 아닌 NCI-H441 종양에서 PBD 민감성 및 항체 축적의 조합으로부터 증강된 투과성 및 잔류 효과를 유도할 수 있다. IHC에 따르면, NCI-H441 종양 세포의 세포막 상의 EGFR의 발현은 3+였다.
도 8b는 결장직장 선암종 LoVo 이종이식편에서 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 효능을 나타낸다. LoVo는 NCI-H441보다 낮은 EGFR 발현을 갖는 KRAS 돌연변이 결장직장 선암종이다(세포 당 100,000 개 미만의 수용체, IHC H-점수 140). 결장직장 선암종 모델인, NCI-H441보다 낮은 표적 발현을 갖는 LoVo에서, AbA(S239C)-PBD는 완전하고 지속되는 반응을 유도하였지만, Ab1(S239C)-PBD로의 투여 중단 후 종양은 재발하였다(도 8b). 두 가지 컨쥬게이트 모두 q7dx6 요법으로(마우스에게 6주 동안 7일마다 투여함) 0.5 mg/kg으로 투여하였다. 이러한 모델에서, 항-EGFR 컨쥬게이트의 특이성은 음성 대조군인 컨쥬게이트 Ab095 PBD와 비교하여 증가된 반응 지속성에 의해 입증되었다. AbA-MMAE는 또한 이러한 모델에서 활성이었으며, 이는 Ab1(S239C)-PBD에서 관찰된 바와 유사한 활성을 가졌지만, AbA(S239C)-PBD에서 만큼 활성은 아니었다. 나아가, 이러한 결과를 달성하기 위해, AbA-MMAE는 AbA(S239C)-PBD보다 훨씬 더 높은 용량(구체적으로, 10 배 더 높은 용량으로) 투여되어야 했다. 도 8a 및 도 8b에서, 괄호 안의 숫자는 mg/kg 단위의 용량을 나타낸다. 화살표는 투약일을 나타낸다. HC에 따르면, LoVo 종양 세포의 세포막 상에서의 EGFR의 발현은 3+이다.
AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 효능을 결장직장 선암종의 제2 모델인, SW48(세포 당 200,000 개 초과의 수용체; EGFR H-점수: 228)에서 상응하는 아우리스타틴 ADC와 비교하여 평가하였다. 0.1 mg/kg의 단일 투여 후, AbA(S239C)-PBD는, 도 9a에 제시된 바와 같이, Ab1(S239C)-PBD보다 더 오래 지속되는 반응을 유도하였다. 0.2 mg/kg로의 Ab1(S239C)-PBD 투여 후 반응의 지속성은 0.1 mg/kg로의 AbA(S239C)-PBD에서 관찰된 바와 유사하였으며, 이는 이러한 모델에서, 도 9b에 제시된 바와 같이, AbA(S239C)-PBD가 Ab1(S239C)-PBD보다 적어도 2 배 더 강력함을 시사한다. 도 9a 및 도 9b에서, 괄호 안의 숫자는 mg/kg 단위의 용량을 나타낸다. 화살표는 투약일을 나타낸다. IHC에 의해 결정된 SW48 이종이식편에서의 EGFR의 발현은 3+이다.
AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 효능을 또한 CTG-0162 비소세포 폐암 모델에서 Ab1 및 AbA-MMAE에 대하여 평가하였다. 도 10a에 제시된 바와 같이, CTG-0162 NSCLC 모델에서, q7x6으로 투여된 AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD는 종양 성장을 억제하는데 매우 효과적이었지만, AbA-MMAE는 AbA(S239C)-PBD 또는 Ab1(S239C)-PBD보다 10 배 더 높은 용량으로 투여되었음에도 불구하여 덜 효과적이었다. Ab1 또한 이러한 모델에서 효과적이지 않았다.
AbA(S239C)-PBD 및 Ab1(S239C)-PBD의 효능을 또한 CTG-9786 두경부암 모델에서 Ab1 및 AbA-MMAE에 대하여 평가하였다. 도 10b에 제시된 바와 같이, CTG-9786 두경부암 모델에서, q7x6으로 투여된 Ab1(S239C)-PBD 및 AbA(S239C)-PBD는 종양 성장을 억제하는데 매우 효과적이었다. AbA-MMAE 또한 효과적이었으나, 훨씬 더 높은 용량을 필요로 하였다.
요약하면, 이러한 생체내 결과는, PBD 컨쥬게이트가 보다 더 강력하며, 낮은 EGFR-발현 결장직장 종양을 포함하는 다양한 상이한 종양 유형에 걸쳐 아우리스타틴 기반 컨쥬게이트보다 더 오래 지속되는 항-종양 반응을 생성함을 나타낸다. AbA(S239C)-PBD를 이용한 NSCLC, CRC 및 H&N 이종이식편의 치료는 종양 성장을 유의하게 감소시켰다. AbA(S239C)-PBD에 의한 이종이식편 억제의 정도 및 지속성은, 통상적으로 동일한 요법에서 아우리스타틴 컨쥬게이트의 용량의 1/10로 시험된 경우, 아우리스타틴 컨쥬게이트와 비교하여 증가되었다.
실시예 6: 시험관내 혈장 안정성
형광 표지된 AbA(S239C) 항체 및 AbA(S239C)-PBD DAR2의 안정성을 마우스, 래트, 시노몰구스 원숭이(cyno) 및 인간으로부터의 혈장뿐 아니라 완충액 중에서, 37℃에서 6일 동안 시험관내에서 평가하였다. 단백질 응집 및 단편화는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정하였다. 컨쥬게이션되지 않은 PBD는 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC/MS/MS)으로 결정하였다.
AbA(S239C) 단일클론 항체의 시험관내 혈장 안정성은 도 11a에 제시되어 있다. AbA(S239C) 단일클론 항체는 완충액 및 혈장에서 t0에서 2.3 내지 3.1%의 초기 응집체를 나타냈으며, 완충액 및 혈장에서 1 일 응집체의 증가율은 낮았다(0.7% 이하). AbA(S239C) 항체는 완충액 및 혈장에서 t0에서 0%의 초기 단편을 가졌으며, 완충액 및 혈장에서 1 일 단편 증가율은 낮았다(1.5% 이하).
AbA(S239C) PBD DAR2 ADC의 시험관내 혈장 안정성은 도 11b에 제시되어 있다. AbA(S239C) PBD DAR 2 ADC는 완충액 및 혈장에서 높은 초기 응집체(11-13%)를 나타냈으며, 완충액 및 혈장에서 1 일 응집체 증가%는 낮아 졌거나 (0.3% 이하) 감소하였다. AbA(S239C) PBD DAR 2 ADC는 완충액 및 혈장에서 0%의 초기 단편을 가졌으며, 완충액 및 혈장에서 1 일 최소 증가%를 가졌다 (0.3% 이하).
PBD 탄두 그 자체를 시험하였고, 모든 혈장 매트릭스에서 37℃에서 6일 동안 혈장에서 안정한 것으로 확인되었다. AbA(S239C) PBD DAR2 ADC에서 방출된 컨쥬게이션되지 않은 탄두는 모든 시점 및 모든 매트릭스에서 정량 수준 미만이었다. 이는 투여된 탄두 당량의 0.5% 미만에 해당한다.
형광 표지된 AbA-MMAE의 안정성을 또한 혈장(인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 래트) 및 완충액에서 37℃에서 6일 동안 시험관내에서 평가하였다. 단백질 응집 및 단편화는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정하였다. AbA MMAE ADC는 완충액 및 혈장에서 1.8 내지 4.1%의 초기 응집체를 나타냈으며, 혈장에서 1 일 응집체 증가%는 3.1 내지 6.2%였다. AbA MMAE ADC는 완충액 및 혈장에서 t0에서 0 내지 1.2%의 초기 단편을 가졌으며, 완충액 및 혈장에서 1 일 단편 증가%는 1.4% 이하로 나타났다.
전체적으로, 높은 초기 응집체를 가짐에도 불구하고, AbA(S239C) PBD DAR2 ADC의 시험관내 혈장 안정성은 AbA-MMAE ADC(보다 우수하지 않은 경우)와 유사하였다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌이 개별적으로 모든 목적을 위하여 참조로서 인용되는 것으로 지시된 바와 동일한 정도로, 모든 목적을 위하여 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
다양한 특정 구현예가 예시 및 기재되었지만, 본 개시의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한 다양한 변화가 이루어질 수 있다고 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE INC. <120> ANTI-EGFR ANTIBODY DRUG CONJUGATES (ADC) AND USES THEREOF <130> ABV12389WOO1 <140> US 62/553,837 <141> 2017-09-02 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Arg Asp 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asn Gly Asn Thr Arg Tyr Gln Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ala Ser Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu 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Val Met Gly Glu Asn 325 330 335 Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu 340 345 350 Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly 355 360 365 Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val 370 375 380 Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe 385 390 395 400 Met Arg Arg Arg His Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu 405 410 415 Gln Glu Arg Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro 420 425 430 Asn Gln Ala Leu Leu Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile 435 440 445 Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp 450 455 460 Ile Pro Glu Gly Glu Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Leu Lys Glu Leu 465 470 475 480 Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala 485 490 495 Tyr Val Met Ala Ser Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly 500 505 510 Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe 515 520 525 Gly Cys Leu Leu Asp Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser 530 535 540 Gln Tyr Leu Leu Asn Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr 545 550 555 560 Leu Glu Asp Arg Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val 565 570 575 Leu Val Lys Thr Pro Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala 580 585 590 Lys Leu Leu Gly Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys 595 600 605 Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr 610 615 620 Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu 625 630 635 640 Met Thr Phe Gly Ser Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile 645 650 655 Ser Ser Ile Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys 660 665 670 Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala 675 680 685 Asp Ser Arg Pro Lys Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met 690 695 700 Ala Arg Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met 705 710 715 720 His Leu Pro Ser Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp 725 730 735 Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro 740 745 750 Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu 755 760 765 Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp 770 775 780 Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln 785 790 795 800 Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp 805 810 815 Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys 820 825 830 Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu 835 840 845 Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr 850 855 860 Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val 865 870 875 880 Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His 885 890 895 Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys 900 905 910 Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala 915 920 925 Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala 930 935 940 <210> 15 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Gln Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp Phe Ala Trp Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Gln Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr 1 5 <210> 19 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Gln Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Cys Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 20 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Gln Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445

Claims (20)

  1. 화학식 (X)의 구조 또는 이의 염을 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC, antibody-drug conjugate):
    Figure pct00034

    여기서, 화학식 (X)는 세포독성 탄두(cytotoxic warhead)에 컨쥬게이션된 항-EGFR 항체(Ab)를 포함하고,
    상기 항-EGFR 항체는
    서열번호 3을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호 4를 포함하는 CDRH2 서열 및 서열번호 5를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 8을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호 9를 포함하는 CDRL2 서열 및 서열번호 10을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하고,
    상기 항-EGFR 항체는 상기 S239C를 포함하는 돌연변이를 통해 상기 세포독성 탄두에 컨쥬게이션되며,
    n은 2임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 2를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 7을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 전장 중쇄 및 서열번호 6을 포함하는 전장 경쇄를 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 IgG1동형(isotype)을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  5. 제2항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 IgG1 동형을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  6. 제1항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역에 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  7. 제2항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역에 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  8. 제3항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역에 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  9. 제1항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 인간화 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  10. 제2항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 인간화 항체인, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  11. 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제와 조합으로 제1항의 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 약학적 조성물의 약물 항체 비가 약 2인, 약학적 조성물.
  13. 화학식 (IX)의 구조 또는 이의 염을 포함하는 항체 약물 컨쥬게이트(ADC):
    Figure pct00035

    여기서, D는 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이량체를 포함하고, Ab는 항-EGFR 항체이고, Y는 Val이고, Z는 Ala이고, q는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이며, 상기 항-EGFR 항체는
    서열번호 3을 포함하는 CDRH1 서열, 서열번호 4를 포함하는 CDRH2 서열 및 서열번호 5를 포함하는 CDRH3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역;
    서열번호 8을 포함하는 CDRL1 서열, 서열번호 9를 포함하는 CDRL2 서열 및 서열번호 10을 포함하는 CDRL3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
    중쇄 불변 영역에 S239C를 포함하는 돌연변이(여기서 넘버링은 Kabat에 따름)를 포함하고,
    상기 항-EGFR 항체 Ab는 상기 S239C를 포함하는 돌연변이를 통해 상기 화학식 (IX)의 구조에 컨쥬게이션되며,
    n은 2임.
  14. 제13항에 있어서, q가 5인, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  15. 제13항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 2를 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 7을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  16. 제13항에 있어서, 상기 중쇄가 서열번호 1을 포함하고, 상기 경쇄가 서열번호 6을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  17. 제13항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체가 IgG1 동형을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  18. 제14항에 있어서, 상기 항-EGFR 항체의 중쇄 불변 영역에 C-말단 리신이 결여되어 있거나, 또는 상기 중쇄 불변 영역의 C-말단에 리신 이외의 아미노산을 포함하는, 항체 약물 컨쥬게이트(ADC).
  19. 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제와 조합으로 제13항의 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 포함하는 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 약학적 조성물의 약물 항체 비가 약 2인, 약학적 조성물.
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