KR20170080675A - 항-fgfr2/3 항체 및 이의 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중 특이적 항-FGFR2 및 FGFR3 (FGFR2/3) 항체, 및 상기 항체를 포함한 조성물 그리고 상기 항체의 이용 방법을 제공한다.

Description

항-FGFR2/3 항체 및 이의 이용 방법{ANTI-FGFR2/3 ANTIBODIES AND METHODS USING SAME}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은, 본원에서 전체적으로 참고로 편입되는, 2014년 11월 5일 출원된 미국 가출원 번호 62/075,740의 우선권을 주장한다.
서열 목록
없음.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 이중 특이적 항-FGFR2/3 항체, 및 이의 용도에 관한 것이다.
섬유아세포 성장 인자 (FGFs) 및 그의 수용체 (FGFRs)는 배아 발생, 조직 항상성 및 대사 동안 중대한 역할을 한다 (Eswarakumar, V.P., Lax, I., 및 Schlessinger, J. 2005. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev 16:139-149; L'Hote, C.G., 및 Knowles, M.A. 2005. Cell responses to FGFR3 signalling: growth, differentiation and apoptosis. Exp Cell Res 304:417-431; Dailey, L., Ambrosetti, D., Mansukhani, A., 및 Basilico, C. 2005. Mechanisms underlying differential responses to FGF signaling. Cytokine Growth Factor Rev 16:233-247). 인간에서, 티로신 키나제 도메인 (FGFR1-4)을 갖는 22 FGFs (FGF1-14, FGF16-23) 및 4 FGF 수용체가 있다. FGFRs는 2 또는 3 면역글로불린-유사 도메인 (IgD1-3)을 갖는 세포외 리간드 결합 영역, 단일-통행 막통과 영역, 및 세포질성, 갈라진 티로신 키나제 도메인으로 이루어진다. FGFR1, 2 및 3 각각은, IIIb 및 IIIc로 지정된, 2개의 주요 대안적으로 스플라이싱된 동형체를 갖는다. 이들 동형체는 IgD3의 제2 절반에서 약 50 아미노산만큼 상이하고, 상이한 조직 분포 및 리간드 특이성을 갖는다. 일반적으로, IIIb 동형체는 상피성 세포에서 발견되고, 반면에 IIIc는 간엽 세포에서 발현된다. 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 협력하여 FGF 결합시, FGFRs는 이량체화하고 특이적 티로신 잔기에서 포스포릴화된다. 이는 임계적 어댑터 단백질, 예컨대 FGFR 기질 2α (FRS2α)의 동원을 용이하게 하여, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 (MAPK) 및 PI3K-AKT 경로를 포함하는, 다중 신호전달 캐스케이드의 활성화를 초래한다 (Eswarakumar, V.P., Lax, I., 및 Schlessinger, J. 2005. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev 16:139-149; Dailey, L., Ambrosetti, D., Mansukhani, A., 및 Basilico, C. 2005. Mechanisms underlying differential responses to FGF signaling. Cytokine Growth Factor Rev 16:233-247; Mohammadi, M., Olsen, S.K., 및 Ibrahimi, O.A. 2005. Structural basis for fibroblast growth factor receptor activation. Cytokine Growth Factor Rev 16:107-137). 결과적으로, FGFs 및 그의 동족 수용체는, 맥락-의존적 방식으로, 증식, 분화, 이동 및 생존을 포함하여, 세포성 공정의 넓은 배열을 조절한다.
비정상적으로 활성화된 FGFRs는 특이적 인간 악성종양에 연루되었다 (Eswarakumar, V.P., Lax, I., 및 Schlessinger, J. 2005. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev 16:139-149; Grose, R., 및 Dickson, C. 2005. Fibroblast growth factor signaling in tumorigenesis. Cytokine Growth Factor Rev 16:179-186). 특히, t(4;14) (p16.3;q32) 염색체 전좌는 다발성 골수종 환자의 약 15-20%에서 발생하여, FGFR3의 과발현을 초래하고 더 짧은 전체 생존율과 상관한다 (Chang, H., Stewart, A.K., Qi, X.Y., Li, Z.H., Yi, Q.L., 및 Trudel, S. 2005. Immunohistochemistry accurately predicts FGFR3 aberrant expression and t(4;14) in multiple myeloma. Blood 106:353-355; Chesi, M., Nardini, E., Brents, L.A., Schrock, E., Ried, T., Kuehl, W.M., 및 Bergsagel, P.L. 1997. 다발성 골수종에서 빈번한 전좌 t(4;14)(p16.3;q32.3)는 섬유아세포 성장 인자 수용체 3의 증가된 발현 및 활성화 돌연변이와 관련된다. Nat Genet 16:260-264; Fonseca, R., Blood, E., Rue, M., Harrington, D., Oken, M.M., Kyle, R.A., Dewald, G.W., Van Ness, B., Van Wier, S.A., Henderson, K.J., 등 2003. Clinical and biologic implications of recurrent genomic aberrations in myeloma. Blood 101:4569-4575; Moreau, P., Facon, T., Leleu, X., Morineau, N., Huyghe, P., Harousseau, J.L., Bataille, R., 및 Avet-Loiseau, H. 2002. 재발성 14q32 전좌는, 특히 집중적인 화학요법을 받는 환자에서, 다발성 골수종의 예측을 결정한다. Blood 100:1579-1583). FGFR3은 배양액에서 골수종 세포주에 화학내성의 부여에 또한 연루되고 (Pollett, J.B., Trudel, S., Stern, D., Li, Z.H., 및 Stewart, A.K. 2002. Overexpression of the myeloma-associated oncogene fibroblast growth factor receptor 3 confers dexamethasone resistance. Blood 100:3819-3821), 종래의 화학요법에 t(4;14)+ 환자의 좋지 못한 임상 반응과 일치된다 (Fonseca, R., Blood, E., Rue, M., Harrington, D., Oken, M.M., Kyle, R.A., Dewald, G.W., Van Ness, B., Van Wier, S.A., Henderson, K.J., 등 2003. Clinical and biologic implications of recurrent genomic aberrations in myeloma. Blood 101:4569-4575). 돌연변이적으로 활성화된 FGFR3의 과발현은 하기에서 종양발생 전환을 유도하는데 충분하다: 조혈 세포 및 섬유아세포 (Bernard-Pierrot, I., Brams, A., Dunois-Larde, C., Caillault, A., Diez de Medina, S.G., Cappellen, D., Graff, G., Thiery, J.P., Chopin, D., Ricol, D., 등 2006. Oncogenic properties of the mutated forms of fibroblast growth factor receptor 3b. Carcinogenesis 27:740-747; Agazie, Y.M., Movilla, N., Ischenko, I., 및 Hayman, M.J. 2003. 포스포티로신 포스파타제 SHP2는 종양발생 섬유아세포 성장 인자 수용체 3에 의해 유도된 전환의 임계적 매개체이다. Oncogene 22:6909-6918; Ronchetti, D., Greco, A., Compasso, S., Colombo, G., Dell'Era, P., Otsuki, T., Lombardi, L., 및 Neri, A. 2001. Deregulated FGFR3 mutants in multiple myeloma cell lines with t(4;14): comparative analysis of Y373C, K650E and the novel G384D mutations. Oncogene 20:3553-3562; Chesi, M., Brents, L.A., Ely, S.A., Bais, C., Robbiani, D.F., Mesri, E.A., Kuehl, W.M., 및 Bergsagel, P.L. 2001. 활성화된 섬유아세포 성장 인자 수용체 3은 다발성 골수종에서 종양 진행에 기여하는 종양유전자이다. Blood 97:729-736; Plowright, E.E., Li, Z., Bergsagel, P.L., Chesi, M., Barber, D.L., Branch, D.R., Hawley, R.G., 및 Stewart, A.K. 2000. 섬유아세포 성장 인자 수용체 3의 이소성 발현은 골수종 세포 증식을 촉진시키고 세포자멸사를 예방한다. Blood 95:992-998), 및 쥣과 골수 이식 모델 (Chen, J., Williams, I.R., Lee, B.H., Duclos, N., Huntly, B.J., Donoghue, D.J., 및 Gilliland, D.G. 2005. Constitutively activated FGFR3 mutants signal through PLCgamma-dependent and -independent pathways for hematopoietic transformation. Blood 106:328-337; Li, Z., Zhu, Y.X., Plowright, E.E., Bergsagel, P.L., Chesi, M., Patterson, B., Hawley, T.S., Hawley, R.G., 및 Stewart, A.K. 2001. 골수종-관련된 종양유전자 섬유아세포 성장 인자 수용체 3은 조혈 세포에서 형질전환되고 있다. Blood 97:2413-2419). 따라서, FGFR3은 다발성 골수종에서 포텐셜 치료적 표적으로서 제안되었다. 사실상, FGFRs를 표적한 몇 개의 소-분자 저해제는, FGFR3에 선택적이지 않아도 및 특정 다른 키나제에 대하여 교차-저해된 활성을 가져도, 배양액 및 마우스 모델에서 FGFR3-양성 골수종 세포에 대해 세포독성을 입증하였다 (Trudel, S., Ely, S., Farooqi, Y., Affer, M., Robbiani, D.F., Chesi, M., 및 Bergsagel, P.L. 2004. Inhibition of fibroblast growth factor receptor 3 induces differentiation and apoptosis in t(4;14) myeloma. Blood 103:3521-3528; Trudel, S., Li, Z.H., Wei, E., Wiesmann, M., Chang, H., Chen, C., Reece, D., Heise, C., 및 Stewart, A.K. 2005. CHIR-258, a novel, multitargeted tyrosine kinase inhibitor for the potential treatment of t(4;14) multiple myeloma. Blood 105:2941-2948; Chen, J., Lee, B.H., Williams, I.R., Kutok, J.L., Mitsiades, C.S., Duclos, N., Cohen, S., Adelsperger, J., Okabe, R., Coburn, A., 등 2005. FGFR3 as a therapeutic target of the small molecule inhibitor PKC412 in hematopoietic malignancies. Oncogene 24:8259-8267; Paterson, J.L., Li, Z., Wen, X.Y., Masih-Khan, E., Chang, H., Pollett, J.B., Trudel, S., 및 Stewart, A.K. 2004. Preclinical studies of fibroblast growth factor receptor 3 as a therapeutic target in multiple myeloma. Br J Haematol 124:595-603; Grand, E.K., Chase, A.J., Heath, C., Rahemtulla, A., 및 Cross, N.C. 2004. Targeting FGFR3 in multiple myeloma: inhibition of t(4;14)-positive cells by SU5402 and PD173074. Leukemia 18:962-966).
FGFR3 과발현은 또한 방광암의 높은 분율로 문서화되었다 (Gomez-Roman, J.J., Saenz, P., Molina, M., Cuevas Gonzalez, J., Escuredo, K., Santa Cruz, S., Junquera, C., Simon, L., Martinez, A., Gutierrez Banos, J.L., 등 2005. 섬유아세포 성장 인자 수용체 3은 요로 암종에서 과발현되고 신생물성 세포 성장을 조절한다. Clin Cancer Res 11:459-465; Tomlinson, D.C., Baldo, O., Harnden, P., 및 Knowles, M.A. 2007. FGFR3 protein expression and its relationship to mutation status and prognostic variables in bladder cancer. J Pathol 213:91-98). 더욱이, FGFR3에서 체세포 활성화 돌연변이는 유두상의 60-70% 및 근육-침습성 방광 암종의 16-20%에서 확인되었다 (Tomlinson, D.C., Baldo, O., Harnden, P., 및 Knowles, M.A. 2007. FGFR3 protein expression and its relationship to mutation status and prognostic variables in bladder cancer. J Pathol 213:91-98; van Rhijn, B.W., Montironi, R., Zwarthoff, E.C., Jobsis, A.C., 및 van der Kwast, T.H. 2002. Frequent FGFR3 mutations in urothelial papilloma. J Pathol 198:245-251). 세포 배양 실험에서, RNa 간섭 (Bernard-Pierrot, I., Brams, A., Dunois-Larde, C., Caillault, A., Diez de Medina, S.G., Cappellen, D., Graff, G., Thiery, J.P., Chopin, D., Ricol, D., 등 2006. Oncogenic properties of the mutated forms of fibroblast growth factor receptor 3b. Carcinogenesis 27:740-747; Tomlinson, D.C., Hurst, C.D., 및 Knowles, M.A. 2007. shRNA에 의한 녹다운은 방광암에서 포텐셜 치료적 표적으로서 S249C 돌연변이체 FGFR3을 확인한다. Oncogene 26:5889- 5899) 또는 FGFR3 단일-쇄 Fv 항체 단편 저해된 방광암 세포 증식 (Martinez-Torrecuadrada, J., Cifuentes, G., Lopez-Serra, P., Saenz, P., Martinez, A., 및 Casal, J.I. 2005. 인간 단일-쇄 Fv 항체를 갖는 섬유아세포 성장 인자 수용체 3의 세포외 도메인의 표적화는 방광 암종 세포주 증식을 저해시킨다. Clin Cancer Res 11:6280-6290). 최근 연구는 FGFR3 항체-독소 콘주게이트가 종양에 FGFR3-매개된 독소 전달을 통해 방광암 세포주의 이종이식 성장을 약화시킨다는 것을 입증하였다 (Martinez-Torrecuadrada, J.L., Cheung, L.H., Lopez-Serra, P., Barderas, R., Canamero, M., Ferreiro, S., Rosenblum, M.G., 및 Casal, J.I. 2008. 방광 암종의 이종이식 마우스 모델에서 섬유아세포 성장 인자 수용체 3-특이적 면역독소의 항종양 활성은 세포자멸사에 의해 매개된다. Mol Cancer Ther 7:862-873). 그러나, FGFR3 신호전달이 사실상 방광 종양의 생체내 성장의 종양발생 드라이버인지는 불확실하게 남아있다. 또한, 방광암에서 FGFR3 표적화에 대하여 치료 잠재성은 생체내 모델을 기반으로 하여 정의되지 않았다. FGFR3 및 항-FGFR3 항체에 관련한 간행물은 하기를 포함한다: 미국 특허 공개 번호 2005/0147612; Rauchenberger 등, J Biol Chem 278 (40):38194-38205 (2003); WO2006/048877; Martinez-Torrecuadrada 등, (2008) Mol Cancer Ther 7(4): 862-873; WO2007/144893; Trudel 등 (2006) 107(10): 4039-4046; Martinez-Torrecuadrada 등 (2005) Clin Cancer Res 11 (17): 6280-6290; Gomez-Roman 등 (2005) Clin Cancer Res 11:459-465; Direnzo, R 등 (2007) Proceedings of AACR Annual Meeting, Abstract No. 2080; WO2010/002862. FGFR3:항-FGFR3 항체의 결정 구조는 미국 특허 공개 번호 20100291114에 개시된다.
FGFR2 및 FGFR3이 성인-조직 항상성의 방해 없이 저해될 수 있는 반면, 특이적 대사성 기능을 조절하는, 밀접하게 관련된 FGFR1 및 FGFR4의 블록킹은 더 큰 안전성 위험을 담지한다. 미국 특허 공개 번호 20100291114에 개시된 항-FGFR3 항체는 FGFR3 및 FGFR2에 이중 특이성으로 결합하지만 그러나 FGFR1 및 FGFR4를 아끼는 기능-블록킹 항체를 창출하기 위해 여기에서 재-조작되었다. 따라서 FGFR2 및 FGFR3 (즉, FGFR2/3)에 FGF 결합을 블록킹하고, 그렇게 함으로써 FGFR1 또는 FGFR4의 블록킹 없이 다운스트림 신호전달을 저해하는 이중-특이적 항체가 설계되었고 제조되었다.
명백하게는, 치료제로서 개발에 최적인 임상 속성을 갖는 제제에 대한 필요성이 계속되고 있다.
본원에서 기재된 바와 같이, FGFR3에 단일특이적으로 결합하는 항체는, FGFR2에 결합 동원 및 FGFR4에 결합 제거를 포함하여, 조작의 다중 라운드를 통해 다른 FGFR 계열 구성원에 결합을 위하여 재설계되었다. 조작의 제1 단계는 파아지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 FGFR2 결합을 얻기 위해 수행되었다. 각 파아지 라이브러리는 CDR을 함유하는 것의 돌연변이유발을 구성하였고, 돌연변이유발의 범위는 라이브러리 크기에 의해 허용되는 만큼 그 CDR에서 많은 잔기로서 포함하였다. 돌연변이유발에 대하여 다중 연속적인 위치는 CDR 골격에서 유의미한 자유도를 허용하였다. FGFR2를 관여할 수 있었던 대부분의 수득한 클론은 CDR H2에서 모든 5 돌연변이를 제공하였다. 결정 구조는 돌연변이유발의 전체 범위가 CDR 루프의 기하학의 완벽한 리모델링과 커플링되었음을 입증하였다. FGFR2에 대한 결합을 얻었던 다양한 H2 돌연변이체의 확인에 의해 입증된 바와 같이, CDR의 공간적 재편에 대한 해결책은 다수이다. 그와 같은 아주 다양한 해결책은 전형적으로 표준 친화도 성숙 실험의 결과로서 보여지지 않고, 이로써 회수된 서열은 보통 개별 CDRs에서 빈약한 위치를 함유한다. 따라서, 상동성 항원을 위한 추가의 특이성 획득은 친화도 성숙보다 더 큰 돌연변이유발 자유도를 필요로 할 수 있다.
조작의 제2 라운드는 FGFR4 결합을 제거하기 위한 특이성의 개량이었다. 항체 CDR 루프와 항원 표면 사이에서 접촉 잔기의 상세한 구조적 분석은 파아지 디스플레이 라이브러리의 설계를 인도하도록 사용되었다. 선택된 항체 변이체는 FGFR2/3에 결합의 체류와 FGFR4 결합에서 감소를 보여주었다. 상기 특이성 개량 단계에 대한 서열 해결책은 조작의 제1 라운드에 비교하여 더욱 제한되었다. 개량 단계는 밀접하게 관련된 항원 항체 재-조작 중에서 결합 특이성을 분간하기 위한 능력을 추가로 입증하였다.
본원에서 기재된 항체 조작을 통해 생성된 이중-특이적 항체는 2 밀접하게 관련된 항원, 즉 FGFR2 및 FGFR3 (항-FGFR2/3 항체)에 결합한다. 이들 항-FGFR2/3 항체 (2B.1.3 항체 변이체)는 이들이 동일한 중쇄 및 경쇄를 이용한다는 점에서 규칙적 IgG 분자이다. 본 발명의 특정 항-FGFR2/3 항체는 2가 또는 1가 방식 각각으로 2 FGFR2 동형체, 2 FGFR3 동형체 또는 1 FGFR2 및 1 FGFR3 동형체에 결합할 수 있다. 이는, 1가 방식으로 2 상이한 항원에 결합하는 2 상이한 중/경-쇄 쌍을 통상적으로 이용하는, 종래의 이중특이적 IgG와 대조한다. 기재된 이중-특이적 항체는 "투-인-원" 항체와 일부 유사성을 공유한다 (Grand, E.K., Chase, A.J., Heath, C., Rahemtulla, A., 및 Cross, N.C. 2004. Targeting FGFR3 in multiple myeloma: inhibition of t(4;14)-positive cells by SU5402 and PD173074. Leukemia 18:962-966). Bostrom 등은 HERCEPTIN의 모든 3 경-쇄 CDRs를 무작위화시켰고 제2 특이성 뿐만 아니라 친계 특이성을 선택하였다. 예상대로, 제2 특이성은 경-쇄 CDRs의 우세한 기여에서 나온다 (Grand, E.K., Chase, A.J., Heath, C., Rahemtulla, A., 및 Cross, N.C. 2004. Targeting FGFR3 in multiple myeloma: inhibition of t(4;14)-positive cells by SU5402 and PD173074. Leukemia 18:962-966; Gomez-Roman, J.J., Saenz, P., Molina, M., Cuevas Gonzalez, J., Escuredo, K., Santa Cruz, S., Junquera, C., Simon, L., Martinez, A., Gutierrez Banos, J.L., 등 2005. 섬유아세포 성장 인자 수용체 3은 요로 암종에서 과발현되고 신생물성 세포 성장을 조절한다. Clin Cancer Res 11:459-465). 하나의 사례에서, EGFR 및 Her3이 상동성이어도, 항-EGFR/Her3 "투-인-원" 항체에 의한 결합 에피토프는 상이하다 (Gomez-Roman, J.J., Saenz, P., Molina, M., Cuevas Gonzalez, J., Escuredo, K., Santa Cruz, S., Junquera, C., Simon, L., Martinez, A., Gutierrez Banos, J.L., 등 2005. 섬유아세포 성장 인자 수용체 3은 요로 암종에서 과발현되고 신생물성 세포 성장을 조절한다. Clin Cancer Res 11:459-465). 본원에서 기재된 접근법은 2 상동성 항원 사이에서 서열 및 구조 유사성을 인식한다는 점, 및 조작 동안 친계 에피토프를 보유하기 위해 돌연변이유발의 더 많은 제한된 세트에 집중한다는 점에서 "투-인-원" 항체와 상이하다.
여기에서 나타낸 항체 조작은 암 요법에 대하여 포텐셜 유용성을 갖는 현존하는 및 광범위하게 특성화된 항체 항-FGFR 항체로부터 출발하였다. 1980년대 중반에서 제1 치료적 모노클로날 항체의 도입 이후부터, 트라스투주맙, 세툭시맙, 아달리무맙, 베바시주맙, 등을 포함하여, 상이한 질환 영역에서 많은 임상적으로 및 상업적으로 성공적인 항체 약물이 있었다. 이들 항체는 그의 분자 표적의 저해에서 예외적인 활성을 표시하였다. 다른 한편으로, FGFR 계열처럼, 다중 상동성 단백질은 그의 다양한 질환 관련에 대하여 분자 표적으로서 추구되었다. 기능성 에피토프를 표적하는 항체를 수득하기 위한 전통적 발견 경로, 동물 면역화 또는 다른 표시-기반된 라이브러리 선택은 성공되도록 보장되지 않는다. 대안적으로, 본원에서 기재된 바와 같이, 항체는 상동성 표적에 대하여 특이성을 획득하도록 조작될 수 있고, 그렇게 함으로써 항체 발견에 대하여 대안적인 경로를 제공한다. 또한, 상기 접근법은 기능성 에피토프 및 짐작컨대 생물학적 기능 역시 유지함으로써 이전에 개발된 항체의 호의적인 특성을 이용한다. 임상 항체 레퍼토리가 확장함에 따라, 더 많은 항체가 처음부터 발견되는 대신 조작될 수 있다. 포텐셜 적용은 질환 표적으로서 다중 구성원을 포함하는 단백질 계열, 예컨대 하기를 포함할 수 있다: EGFR 계열 (Tomlinson, D.C., Baldo, O., Harnden, P., 및 Knowles, M.A. 2007. FGFR3 protein expression and its relationship to mutation status and prognostic variables in bladder cancer. J Pathol 213:91-98), TNFR 계열 (van Rhijn, B.W., Montironi, R., Zwarthoff, E.C., Jobsis, A.C., 및 van der Kwast, T.H. 2002. Frequent FGFR3 mutations in urothelial papilloma. J Pathol 198:245-251), TAM 계열 (Tomlinson, D.C., Hurst, C.D., 및 Knowles, M.A. 2007. shRNA에 의한 녹다운은 방광암에서 포텐셜 치료적 표적으로서 S249C 돌연변이체 FGFR3을 확인한다. Oncogene 26:5889-5899; Martinez-Torrecuadrada, J., Cifuentes, G., Lopez-Serra, P., Saenz, P., Martinez, A., 및 Casal, J.I. 2005. 인간 단일-쇄 Fv 항체를 갖는 섬유아세포 성장 인자 수용체 3의 세포외 도메인의 표적화는 방광 암종 세포주 증식을 저해시킨다. Clin Cancer Res 11:6280-6290), 에프린 계열 (Martinez-Torrecuadrada, J.L., Cheung, L.H., Lopez-Serra, P., Barderas, R., Canamero, M., Ferreiro, S., Rosenblum, M.G., 및 Casal, J.I. 2008. 방광 암종의 이종이식 마우스 모델에서 섬유아세포 성장 인자 수용체 3-특이적 면역독소의 항종양 활성은 세포자멸사에 의해 매개된다. Mol Cancer Ther 7:862-873). 전통적 발견 공정에서와 같이, 동족체에 대한 조작된 항체는 신규 분자로서 고려될 수 있고, 임의의 포텐셜 치료적 적용에 대하여 그의 생화학적, 생체물리학적 및 생물학적 특성의 전체 특성규명이 여전히 필요하다.
특허 출원 및 공개를 포함한, 본원에서 인용된 모든 참조문헌은 전체적으로 참고로 편입된다.
발명의 요약
본 발명은 FGFR2 및 FGFR3 ("FGFR2/3")을 결합하는 다양한 FGFR 결합제 (예컨대 항체, 및 이의 단편)의 확인에 부분적으로 기반된다. FGFR3은 중요한 및 유리한 치료적 표적을 나타내고, 본 발명은 FGFR3에 제제, 특이적으로 FGFR을 결합하는 제제의 결합에 기반된 조성물 및 방법을 제공한다. 특이적으로, 발명은 FGFR2/3에 제제의 결합 (즉, FGFR2 및 FGFR3에 대하여 이중 특이성을 갖는 제제의 결합)에 기반된 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 FGFR2/3 결합제는, 본원에서 기재된 바와 같이, FGFR3 및/또는 FGFR2 신호전달 경로의 발현 및/또는 활성과 관련된 병태의 치료에서 사용을 위하여 중요한 치료적 및 진단 제제를 제공한다. 따라서, 본 발명은 FGFR3 및 FGFR2 결합에 관련된 방법, 조성물, 키트, 및 제조 물품을 제공한다.
본 발명은 FGFR2 및 FGFR3에 결합하는 항체 (항-FGFR2/3 항체)를 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 FGFR3을 결합시키는 단리된 항체를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 항체는 FGFR3 IIIb 동형체 및/또는 FGFR3 IIIc 동형체를 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 돌연변이된 FGFR3 (예를 들면, 하나 이상의 FGFR3 IIIb R248C, S249C, G372C, Y375C, K652E, 및/또는 하나 이상의 FGFR3 IIIc R248C, S249C, G370C, Y373C, K650E)을 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 단량체성 FGFR3 (예를 들면, 단량체성 FGFR3 IIIb 및/또는 IIIc 동형체)를 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는, 예컨대 이량체성 FGFR3 형태에 비하여 단량체성 FGFR3 형태를 안정화시킴으로써 단량체성 FGFR3의 형성을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 FGFR2 또는 이의 변이체를 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 본원에서 기재된 FGFR2 및 임의의 하나 이상의 FGFR3 변이체를 결합시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명은 단리된 항-FGFR2/3 항체를 제공하고, 여기에서 항체의 전장 IgG 형태는 1 x 10-7 M 또는 더 높은 친화도의 Kd로 인간 FGFR3을 결합시킨다. 하나의 측면에서, 본 발명은 단리된 항-FGFR2/3 항체를 제공하고, 여기에서 항체의 전장 IgG 형태는 1 x 10-7 M 또는 더 높은 친화도의 Kd로 인간 FGFR2를 결합시킨다. 당해 기술에서 정착된 바와 같이, 리간드의 그의 수용체에 대한 결합 친화도는 임의의 다양한 검정을 이용하여 결정될 수 있고, 다양한 정량적 값에 관하여 발현될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 결합 친화도는 Kd 값으로서 표현되고 (예를 들면, 최소화된 결합능 효과를 갖는) 고유 결합 친화도를 반영한다. 일반적으로 및 바람직하게는, 결합 친화도는 무세포 또는 세포-관련된 셋팅이든 아니든 시험관내 측정된다. 본원에서 기재된 것을 포함한, 당해 기술에서 공지된 임의의 수의 검정은, 예를 들어, Biacore, 방사선면역검정 (RIA), 및 ELISA를 포함한, 결합 친화도 측정을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체의 전장 IgG 형태는 1 x 10-8 M 또는 더 높은 친화도의 Kd, 1 x 10-9 M 또는 더 높은 친화도의 Kd, 또는 1 x 10-10 M 또는 더 높은 친화도의 Kd로 인간 FGFR3을 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체의 전장 IgG 형태는 1 x 10-8 M 또는 더 높은 친화도의 Kd, 1 x 10-9 M 또는 더 높은 친화도의 Kd, 또는 1 x 10-10 M 또는 더 높은 친화도의 Kd로 인간 FGFR2를 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체의 전장 IgG 형태는 1 x 10-8 M 또는 더 높은 친화도의 Kds, 1 x 10-9 M 또는 더 높은 친화도의 Kds, 또는 1 x 10-10 M 또는 더 높은 친화도의 Kds로 인간 FGFR2 및 FGFR3을 결합시킨다.
일반적으로, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 길항제 항체이다. 따라서, 하나의 측면에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 활성 (예를 들면, FGFR3-IIIb 및/또는 FGFR3-IIIc 활성)을 저해시킨다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체 (일반적으로 2가 형태로)는 실질적인 FGFR3 작용제 기능을 보유하지 않는다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 길항제 항체 (일반적으로 2가 형태로)는 거의 없는 또는 무 FGFR3 작용제 기능을 보유한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 (일반적으로 2가 형태로)는 통계적 유의도인 배경 수준 초과인 FGFR3 작용제 활성 수준을 나타내지 않는다.
하나의 측면에서, FGFR3에 항체의 결합은 수용체의 또 다른 유니트와 수용체의 이량체화를 저해시킬 수 있고, 이로써 수용체의 활성화는 (적어도 부분적으로, 수용체 이량체화의 부족 때문에) 저해된다. 저해는 직접적 또는 간접적일 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 실질적인 세포자멸적 활성을 보유하지 않는 (예를 들면, 세포, 예를 들면, 과도기적 세포 암종 세포 또는 다발성 골수종 세포, 예컨대 FGFR3 전좌, 예컨대 t(4;14) 전좌를 포함한 다발성 골수종 세포의 세포자멸사를 포함하지 않는) 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 거의 없는 또는 무 세포자멸적 기능을 보유한다. 일부 구현예에서, FGFR2/3 항체는 통계적 유의도인 배경 수준 초과인 세포자멸적 기능을 나타내지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 실질적인 FGFR3 하향-조절을 유도하지 않는 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 거의 없는 또는 무 수용체 하향-조절을 유도한다. 일부 구현예에서, FGFR2/3 항체는 통계적 유의도인 배경 수준 초과인 수용체 하향-조절을 유도하지 않는다.
하나의 측면에서, 본 발명은 효과기 기능을 보유하는 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 하나의 구현예에서, 효과기 기능은 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC)을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체 (일부 구현예에서, 노출된 항-FGFR2/3 항체)는 세포, 일부 구현예에서, 다발성 골수종 세포 (예를 들면, 전좌, 예를 들면, t(4;14) 전좌를 포함한 다발성 골수종 세포)를 사멸시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 약 10,000 FGFR3 분자 / 세포 이상 (예컨대 약 11,000, 약 12,000, 약 13,000, 약 14,000, 약 15,000, 약 16,000, 약 17,000, 약 18,000 이상 FGFR3 분자 / 세포)를 발현시키는 세포를 사멸시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 약 2000, 약 3000, 약 4000, 약 5000, 약 6000, 약 7000, 약 8000, 이상 FGFR3 분자 / 세포를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 약 10,000 FGFR2 분자 / 세포 이상 (예컨대 약 11,000, 약 12,000, 약 13,000, 약 14,000, 약 15,000, 약 16,000, 약 17,000, 약 18,000 이상 FGFR3 분자 / 세포)를 발현시키는 세포를 사멸시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 약 2000, 약 3000, 약 4000, 약 5000, 약 6000, 약 7000, 약 8000, 이상 FGFR2 분자 / 세포를 발현시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 구성적 FGFR3 활성을 저해시킨다. 일부 구현예에서, 구성적 FGFR3 활성은 리간드-의존적 FGFR3 구성적 활성이다. 일부 구현예에서, 구성적 FGFR3 활성은 리간드-독립적 구성적 FGFR3 활성이다. 하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 구성적 FGFR2 활성을 저해시킨다. 하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 구성적 FGFR2 및 FGFR3 활성을 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbR248C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 저해시킨다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "FGFR3-IIIbR248C에 상응하는 돌연변이를 포함한"은 FGFR3-IIIbR248C 및 FGFR3-IIIcR248C, 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb R248에 상응하는 위치에서 R 내지 C 돌연변이를 포함한 추가의 FGFR3 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 당해 분야의 숙련가는 각각의 FGFR3 서열 사이에서 상응하는 잔기를 확인하기 위해 FGFR3 서열의 배열 방법, 예를 들면, FGFR3-IIIb에서 R248 위치에 상응하는 FGFR3에서 위치를 확인하기 위해 FGFR3-IIIb 서열과 FGFR3-IIIc 서열의 배열을 이해한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbR248C 및/또는 FGFR3-IIIcR248C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbK652E에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 저해시킨다. 편의상, 용어 "FGFR3-IIIbK652E에 상응하는 돌연변이"는 FGFR3-IIIbK652E 및 FGFR3-IIIcK650E, 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb K652에 상응하는 위치에서 K 내지 E 돌연변이를 포함한 추가의 FGFR3 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 당해 분야의 숙련가는 각각의 FGFR3 서열 사이에서 상응하는 잔기를 확인하기 위해 FGFR3 서열의 배열 방법, 예를 들면, FGFR3-IIIb에서 K652 위치에 상응하는 FGFR3에서 위치를 확인하기 위해 FGFR3-IIIb 서열과 FGFR3-IIIc 서열의 배열을 이해한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbK652E 및/또는 FGFR3-IIIcK650E를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbS249C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 저해시킨다. 편의상, 용어 "FGFR3-IIIbS249C에 상응하는 돌연변이를 포함한"은 FGFR3-IIIbS249C 및 FGFR3-IIIcS249C, 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb S249에 상응하는 위치에서 S 내지 C 돌연변이를 포함한 추가의 FGFR3 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbS249C 및/또는 FGFR3-IIIcS249C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbG372C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 저해시킨다. 편의상, 용어 "FGFR3-IIIbG372C에 상응하는 돌연변이를 포함한"은 FGFR3-IIIbG372C 및 FGFR3-IIIcG370C, 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb G372에 상응하는 위치에서 G 내지 C 돌연변이를 포함한 추가의 FGFR3 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbG372C 및/또는 FGFR3-IIIcG370C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbY375C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 저해시킨다. 편의상, 용어 "FGFR3-IIIbY375C에 상응하는 돌연변이를 포함한"은 FGFR3-IIIbY375C 및 FGFR3-IIIcY373C, 뿐만 아니라 FGFR3-IIIb S249에 상응하는 위치에서 S 내지 C 돌연변이를 포함한 추가의 FGFR3 형태를 포함하는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbY375C 및/또는 FGFR3-IIIcY373C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 (a) FGFR3-IIIbK652E 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3IIIbG372C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 (a) FGFR3-IIIcK650E 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 및 FGFR3IIIcG370C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 (a) FGFR3-IIIbR248C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbG372C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 (a) FGFR3-IIIcR248C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 및 FGFR3-IIIcG370C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 (a) FGFR3-IIIbG372C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbR248C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 (a) FGFR3-IIIcG370C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 및 FGFR3-IIIcR248C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbG372C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIcR248C, FGFR3-IIIcK650E, FGFR3-IIIcY373C, FGFR3-IIIcS249C, 및 FGFR3-IIIcG370C를 저해시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함한 단리된 항-FGFR2/3 항체를 제공한다: 서열식별번호 1: RASQDVDTSLA, 서열식별번호 2: SASFLYS, 서열식별번호 3: QQSTGHPQT, 서열식별번호 4: GFPFTSQGIS, 서열식별번호 5: RTHLGDGSTNYADSVKG, 및 서열식별번호 6: ARTYGIYDTYDKYTEYVMDY. 특정 구현예에서, 본 발명은 HVR-L1: RASQDVDTSLA, HVR-L2: SASFLYS, HVR-L3: QQSTGHPQT, HVR-H1: GFPFTSQGIS, HVR-H2: RTHLGDGSTNYADSVKG, 및 HVR-H3: ARTYGIYDTYDKYTEYVMDY를 포함한 2B.1.3.10 항-FGFR2/3 항체를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 초가변 영역 (HVR) 서열을 포함한 단리된 항-FGFR2/3 항체를 제공한다: 서열식별번호 7: RASQDVDTSLA, 서열식별번호 8: SASFLYS, 서열식별번호 9: QQSTGHPQT, 서열식별번호 10: GFPFTSTGIS, 서열식별번호 11: RTHLGDGSTNYADSVKG, 및 서열식별번호 12: ARTYGIYDTYDMYTEYVMDY. 특정 구현예에서, 본 발명은 HVR-L1: RASQDVDTSLA, HVR-L2: SASFLYS, HVR-L3: QQSTGHPQT, HVR-H1: GFPFTSTGIS, HVR-H2: RTHLGDGSTNYADSVKG, 및 HVR-H3: ARTYGIYDTYDMYTEYVMDY를 포함한 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 본원에서 기재된 항-FGFR2/3 항체의 HVR-H1은 서열식별번호:4의 위치 4-6에서 서열 FTS를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 기재된 항-FGFR2/3 항체의 적어도 하나의 HVR은 변이체 HVR이고, 여기에서 변이체 HVR 서열은 서열식별번호:1-6에서 묘사된 서열의 적어도 하나의 잔기 (적어도 2 잔기, 적어도 3 이상 잔기)의 변형을 포함한다. 변형은 바람직하게는 치환, 삽입, 또는 결실이다. 일부 구현예에서, HVR-L1 변이체는 1-6 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)개의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, HVR-L2 변이체는 1-6 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)개의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, HVR-L3 변이체는 1-6 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)개의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, HVR-H1 변이체는 1-6 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)개의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, HVR-H2 변이체는 1-6 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)개의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, HVR-H3 변이체는 1-6 (1, 2, 3, 4, 5, 또는 6)개의 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에서 기재된 항-FGFR2/3 항체의 HVR-H1은 변이체 HVR-H1이고 여기에서 변이체 HVR-H1은 아미노산 P3 및/또는 Q7 (서열식별번호:4)에서 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H1은 P3T 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H1은 Q7T 또는 Q7L 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H1은 P3T 및 Q7L 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H1은 P3T 및 Q7T 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H1은 표 11에서 열거된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다: TFTST, PFTSL, PFTSQ, 및 PFTST.
특정 구현예에서, 본원에서 기재된 항-FGFR2/3 항체의 HVR-H3은 변이체 HVR-H3이고 여기에서 변이체 HVR-H3은 아미노산 T9, D11, 및/또는 K12 (서열식별번호:6)에서 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 T9I 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 T9L 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 D11V 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 D11G 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 D11E 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 K12D 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 K12N 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 K12G 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 K12E 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 K12M 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 T9L, D11V, 및 K12D 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 단지 K12D 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 T9I, D11G, 및 K12G 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 단지 K12E 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 T9I 및 D11E 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 단지 K12M 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 변이체 HVR-H3은 표 11에서 열거된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다: LYVD, TYDN, IYGG, TYDE, IKEK, TYDK, 및 TYDM.
특정 구현예에서, 본원에서 기재된 항-FGFR2/3 항체의 HVR-H1은 변이체 HVR-H1이고 여기에서 변이체 HVR-H1은 아미노산 P3 및/또는 Q7 (서열식별번호:4)에서 치환을 포함하고 본원에서 기재된 항-FGFR2/3 항체의 HVR-H3은 변이체 HVR-H3이고 여기에서 변이체 HVR-H3은 아미노산 T9, D11, 및/또는 K12 (서열식별번호:6)에서 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체의 변이체 HVR-H1 및 HVR-H3은 표 11에서 열거된 군으로부터 선택된 서열을 포함한다: TFTST (HVR-H1) 및 LYVD (HVR-H3), TFTST (HVR-H1) 및 TYDN (HVR-H3), TFTST (HVR-H1) 및 IYGG (HVR-H3), TFTST (HVR-H1) 및 TYDE (HVR-H3), PFTSL (HVR-H1) 및 IYEK (HVR-H3), PFTSQ (HVR-H1) 및 TYDK (HVR-H3), PFTST (HVR-H1) 및 TYDM (HVR-H3).
특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호:13-44에서 인용된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 HVR-H2 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호:45-50에서 인용된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 HVR-H2 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb (서열식별번호: 51 및 52), FGFR2-IIIc (서열식별번호: 53 및 54), FGFR3-IIIb (서열식별번호: 55 및 56), 및/또는 FGFR3-IIIc (서열식별번호: 57 및 58)에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb, FGFR2-IIIc, FGFR3-IIIb, 및 FGFR3-IIIc에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb, FGFR2-IIIc, FGFR3-IIIb, 및 FGFR3-IIIc로 이루어진 군으로부터 선택되는 FGFR에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb, FGFR2-IIIc, FGFR3-IIIb, 및 FGFR3-IIIc로 이루어진 군으로부터 선택되는 2 FGFRs에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb, FGFR2-IIIc, FGFR3-IIIb, 및 FGFR3-IIIc로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 FGFRs에 결합한다.
본 발명의 항체는 임의의 적합한 프레임워크 가변 도메인 서열을 포함할 수 있고, FGFR3 및 FGFR2에 제공된 결합 활성은 실질적으로 유지된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 하위그룹 III 중쇄 프레임워크 공통 서열을 포함한다. 이들 항체의 하나의 구현예에서, 프레임워크 공통 서열은 위치 71, 73, 및/또는 78에서 치환을 포함한다. 이들 항체의 일부 구현예에서, 위치 71은 A, 73은 T 및/또는 78은 A이다. 하나의 구현예에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함한다 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (또한 미국 특허 번호 6,407,213 & 5,821,337, and Lee 등, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093에서 참조됨). 하나의 구현예에서, 이들 항체는 인간 κΙ 경쇄 프레임워크 공통 서열을 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 이들 항체는 미국 특허 번호 6,407,213 & 5,821,337에서 기재된 바와 같이 huMAb4D5-8의 경쇄 HVR 서열을 포함한다.) 하나의 구현예에서, 이들 항체는 huMAb4D5-8의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다 (HERCEPTIN®, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA) (또한 미국 특허 번호 6,407,213 & 5,821,337, 및 Lee 등, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093에서 참조됨).
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호: 59를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:60을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:61을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:62를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:63을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:64를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:65를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:66을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:75를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:76을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:77을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:78을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:79를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:80을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:81을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 서열식별번호:82를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 아미노산 서열식별번호: 59를 포함한 경쇄 및 서열식별번호:75를 포함한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:60을 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:76을 포함한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:61을 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:77을 포함한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:62를 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:78을 포함한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:63을 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:79를 포함한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:64를 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:60을 포함한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:65를 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:81을 포함한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:66을 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:82를 포함한 중쇄 아미노산 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:67을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:68을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:69를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:70을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:71을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:72를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:73을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 경쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:74를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:83을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:84를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:85를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:86을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:87을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:88을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 핵산 서열은 서열식별번호:89를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 중쇄의 핵산 서열은 서열식별번호: 90을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 핵산 서열식별번호:67을 포함한 경쇄 및 서열식별번호:83을 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:68을 포함한 경쇄 핵산 서열 및 서열식별번호:84를 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:69를 포함한 경쇄 핵산 서열 및 서열식별번호:85를 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:70을 포함한 경쇄 핵산 서열 및 서열식별번호:86을 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:71을 포함한 경쇄 핵산 서열 및 서열식별번호:87을 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:72를 포함한 경쇄 핵산 서열 및 서열식별번호:88을 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:73을 포함한 경쇄 핵산 서열 및 서열식별번호:89를 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 서열식별번호:74를 포함한 경쇄 핵산 서열 및 서열식별번호: 90을 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호:65를 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:81을 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 하기 CDRs를 갖는다:
HVR-L1: RASQDVDTSLA (서열식별번호:1)
HVR-L2: SASFLYS (서열식별번호:2)
HVR-L3: QQSTGHPQT (서열식별번호:3)
HVR-H1: GFPFTSQGIS (서열식별번호:4)
HVR-H2: RTHLGDGSTNYADSVKG (서열식별번호: 5)
HVR-H3: ARTYGIYDTYDKYTEYVMDY (서열식별번호:6)
특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호:66을 포함한 경쇄 아미노산 서열 및 서열식별번호:82를 포함한 중쇄 핵산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 하기 CDRs를 갖는다:
HVR-L1: RASQDVDTSLA (서열식별번호:7)
HVR-L2: SASFLYS (서열식별번호:8)
HVR-L3: QQSTGHPQT (서열식별번호: 9)
HVR-H1: GFPFTSTGIS (서열식별번호:10)
HVR-H2: RTHLGDGSTNYADSVKG (서열식별번호:11)
HVR-H3: ARTYGIYDTYDMYTEYVMDY (서열식별번호:12)
특정 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 153-251 이내 영역에 결합한다:
APYWTNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEH
RIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVER.
특정 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 150-248 이내 영역에 결합한다:
APYWTRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPAAGNPTPSISWLKNGREFRGEHRI
GGIKLRHQQWSLVMESVVPSDRGNYTCVVENKFGSIRQTYTLDVLER.
바람직한 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 153-251 이내 영역 및 FGFR3 (서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 150- 248 이내 영역에 결합한다.
특정 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 157-181 (TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA) 이내 영역에 결합한다 (도 9). 특정 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 207-220 (YKVRNQHWSLIMES) 이내 영역에 결합한다 (도 9). 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 52로 정렬하는 FGFR2-IIIb의 영역에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 54로 정렬하는 FGFR2-IIIc의 영역에 결합한다.
특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb (서열식별번호: 52)의 아미노산 157-181 (TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA)에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIc (서열식별번호: 54)의 아미노산 157-181에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 207- 220 (YKVRNQHWSLIMES)에 결합한다 (도 9). 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb (서열식별번호: 52)의 아미노산 207-220에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIc (서열식별번호: 54)의 아미노산 207-220에 결합한다.
특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 157-181(TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA) 이내 영역 및 FGFR2-IIIb (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 207-220 (YKVRNQHWSLIMES) 이내 영역에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 157-181(TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA) 및 FGFR2-IIIb (서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 207-220 (YKVRNQHWSLIMES)에 결합한다.
특정 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIb (서열식별번호: 56)의 아미노산 154-178 (TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA) 이내 영역에 결합한다. 특정 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIc (서열식별번호: 58)의 아미노산 154-178 (TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA) 이내 영역에 결합한다. 특정 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIb (서열식별번호: 56)의 아미노산 204-217 (IKLRHQQWSLVMES) 이내 영역에 결합한다. 특정 구현예에서 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIc (서열식별번호: 58)의 아미노산 204-217 (IKLRHQQWSLVMES) 이내 영역에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 56으로 정렬하는 FGFR3-IIIb의 영역에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 58로 정렬하는 FGFR3-IIIb의 영역에 결합한다.
특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIb (서열식별번호: 56)의 아미노산 154-178 (TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA)에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIc (서열식별번호: 58)의 아미노산 154-178 (TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA)에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIb (서열식별번호: 56)의 아미노산 204-217 (IKLRHQQWSLVMES)에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIc (서열식별번호: 58)의 아미노산 204-217 (IKLRHQQWSLVMES)에 결합한다.
바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2: TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)의 하기 에피토프에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3의 하기 에피토프: TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 하기 에피토프에 결합한다:
FGFR2: TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92), 및
FGFR3: TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및
IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94).
특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91-94에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91 및 92에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91-93에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91, 93, 및 94에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91 및 94에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 92-94에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 92 및 93에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 92 및 94에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 93 및 91에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91, 92, 및 94에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91-94에서 제공된 임의의 2 이상 에피토프의 조합에 결합한다.
특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb (서열식별번호: 52)의 아미노산 153-251 이내 영역에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIc (서열식별번호: 54)의 아미노산 153-251 이내 영역에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb (서열식별번호: 52) 및 FGFR2-IIIc (서열식별번호: 54)의 아미노산 153- 251 이내 영역에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIb (서열식별번호: 56)의 아미노산 150-248 이내 영역에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIb (서열식별번호: 58)의 아미노산 150-248 이내 영역에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3-IIIb (서열식별번호: 56) 및 FGFR3-IIIc (서열식별번호: 58)의 아미노산 150-248 이내 영역에 결합한다.
바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2-IIIb (서열식별번호: 52) 및/또는 FGFR2-IIIc (서열식별번호: 54)의 아미노산 153-251 이내 영역 및 FGFR3-IIIb (서열식별번호: 56) 및/또는 FGFR3-IIIc (서열식별번호: 58)의 아미노산 150-248 이내 영역에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181을 포함한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 하나 이상의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 4 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 4 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 하나 이상의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 3.5 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 3.5 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 하나 이상의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 하나 이상의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 4.0, 3.75, 3.5, 3.25, 또는 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 T157, N158, T159, E160, K161, M162, E163, K164, R165, L166, H167, A168, V169, P170, A171, A172, N173, T174, V175, K176, F177, R178, C179, P180, 및 A181로부터 4.0, 3.75, 3.5, 3.25, 또는 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기는 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및/또는 12개의 아미노산 및/또는 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 에피토프는 결정법 (예를 들면, 실시예에서 기재된 결정법 방법)에 의해 결정된다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 인간 FGFR2 (hFGFR2) (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220을 포함한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 하나 이상의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 4 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 4 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 하나 이상의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 3.5 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 3.5 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 하나 이상의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 하나 이상의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 4.0, 3.75, 3.5, 3.25, 또는 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR2에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)의 아미노산 Y207, K208, V209, R210, N211, Q212, H213, W214, S215, L216, I217, M218, E219, 및 S220으로부터 4.0, 3.75, 3.5, 3.25, 또는 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기는 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및/또는 12개의 아미노산 및/또는 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 에피토프는 결정법 (예를 들면, 실시예에서 기재된 결정법 방법).에 의해 결정된다). 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 인간 FGFR2 (hFGFR2) (예를 들면, 서열식별번호: 52 및 54)에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178을 포함한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 하나 이상의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 4 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 4 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 하나 이상의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 3.5 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 3.5 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 하나 이상의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 하나 이상의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 4.0, 3.75, 3.5, 3.25, 또는 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 T154, R155, P156, E157, R158, M159, D160, K161, K162, L163, L164, A165, V166, P167, A168, A169, N170, T171, V172, R173, F174, R175, C176, P177, 및 A178로부터 4.0, 3.75, 3.5, 3.25, 또는 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기는 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및/또는 12개의 아미노산 및/또는 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 에피토프는 결정법 (예를 들면, 실시예에서 기재된 결정법 방법)에 의해 결정된다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 인간 FGFR3 (hFGFR3) (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)에 결합한다.
일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217을 포함한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 하나 이상의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 4 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 4 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 하나 이상의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 3.5 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 3.5 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 하나 이상의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 하나 이상의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 4.0, 3.75, 3.5, 3.25, 또는 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, FGFR3에 결합된 경우 항-FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)의 아미노산 I204, K205, L206, R207, H208, Q209, Q210, W211, S212, L213, V214, M215, E216, 및 S217로부터 4.0, 3.75, 3.5, 3.25, 또는 3.0 옹스트롬 이하 배치된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기는 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및/또는 12개의 아미노산 및/또는 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 에피토프는 결정법 (예를 들면, 실시예에서 기재된 결정법 방법)에 의해 결정된다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 인간 FGFR3 (hFGFR3) (예를 들면, 서열식별번호: 56 및 58)에 결합한다.
특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91 및 92로부터 선택된 FGFR2에서 1 에피토프 및 서열식별번호: 93 및 94로부터 선택된 FGFR3에서 1 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91 및 92를 포함한 FGFR2에서 2 에피토프 및 서열식별번호: 93 및 94로부터 선택된 FGFR3에서 1 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91 및 92로부터 선택된 FGFR2에서 1 에피토프 및 서열식별번호: 93 및 94를 포함한 FGFR3에서 2 에피토프에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 서열식별번호: 91 및 92를 포함한 FGFR2에서 2 에피토프 및 서열식별번호: 93 및 94를 포함한 FGFR3에서 2 에피토프에 결합한다 (도 9).
하나의 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 상기로 이루어지거나 또는 상기로 이루어지는 폴리펩타이드를 결합시키는 항-FGFR2/3 항체를 제공한다: TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및/또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)
하나의 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 상기로 이루어지거나 또는 상기로 이루어지는 폴리펩타이드를 결합시키는 항-FGFR2/3 항체를 제공한다: TRRERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및/또는 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94).
하나의 측면에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 상기로 이루어지거나 또는 상기로 이루어지는 폴리펩타이드를 결합시키는 항-FGFR2/3 항체를 제공한다: TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92) 및 TRRERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 또는 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94).
하나의 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및/또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 특이적으로 결합시킨다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 서열 TRRERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및/또는 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 특이적으로 결합시킨다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열 및 서열 TRRERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 또는 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 특이적으로 결합시킨다.
당해 분야의 숙련가는 각각의 FGFR3 서열 사이에서 상응하는 잔기를 확인하기 위해 FGFR3 서열의 정렬 방법을 이해한다. 유사하게, 당해 분야의 숙련가는 각각의 FGFR2 서열에서 상응하는 잔기를 확인하기 위해 FGFR2 서열의 정렬 방법을 이해한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 FGFR3 및/또는 FGFR2에 결합을 위하여 임의의 상기-언급된 항체와 경쟁하는 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 임의의 상기-언급된 항체로서 FGFR3 및/또는 FGFR2에서 동일한 또는 유사한 에피토프에 결합하는 항-FGFR2/3 항체를 제공한다.
당해 기술에서 공지된 바와 같이, 그리고 본원에서 더 상세히 기재된 바와 같이, 항체의 초가변 영역을 표시하는 아미노산 위치/경계는, (아래에서 기재된 바와 같이) 당해 기술에서 공지된 맥락 및 다양한 정의에 따라, 다양할 수 있다. 가변 도메인 이내 일부 위치는 이들 위치가 상이한 세트의 기반하에 초가변 영역 외부인 것으로 간주되는 반면 한 세트의 기반 하에 초가변 영역 이내인 것으로 간주될 수 있다는 점에서 하이브리드 초가변성 위치로서 보여질 수 있다. 하나 이상의 이들 위치는 (아래 추가로 정의된 바와 같이) 확장된 초가변 영역에서 또한 발견될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 다른 구현예에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라성 항체, 친화도 성숙된 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 항체는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 또는 scFv이다.
일부 구현예에서, FGFR2/3 항체는 Fc 영역을 포함한 1-아암된 항체이고 (즉, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인은 단일 항원 결합 아암을 형성한다), 여기에서 Fc 영역은 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 여기에서 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드는 복합체에서 존재하고 상기 항원 결합 아암을 포함한 Fab 분자에 비교된 상기 항체 단편의 안정성을 증가시키는 Fc 영역을 형성한다. 참고, 예를 들면, WO2006/015371.
하나의 구현예에서, 항체는 키메라성 항체, 예를 들어, 이종성 비-인간, 인간, 또는 인간화된 서열 (예를 들면, 프레임워크 및/또는 불변 도메인 서열)에 그라프팅된 비-인간 공여체로부터 항원 결합 서열을 포함한 항체이다. 하나의 구현예에서, 비-인간 공여체는 마우스이다. 추가 구현예에서, 항원 결합 서열은 합성이고, 예를 들면, 돌연변이유발 (예를 들면, 파아지 디스플레이 스크리닝, 등)에 의해 수득된다. 특정한 구현예에서, 본 발명의 키메라성 항체는 쥣과 V 영역 및 인간 C 영역을 갖는다. 하나의 구현예에서, 쥣과 경쇄 V 영역은 인간 카파 경쇄에 융합된다. 또 다른 구현예에서, 쥣과 중쇄 V 영역은 인간 IgG1 C 영역에 융합된다.
본 발명의 인간화된 항체는 프레임워크 영역 (FR)에서 아미노산 치환 및 그라프팅된 CDRs에서 변화하면서 친화도 성숙 변이체를 갖는 것을 포함한다. CDR 또는 FR에서 치환된 아미노산은 비제한적으로 공여체 또는 수령체 항체에서 존재하는 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 향상된 CDC 및/또는 ADCC 기능 및 B-세포 사멸을 포함한 개선된 효과기 기능을 초래하는 Fc 영역내 아미노산 잔기에서 변화를 추가로 포함한다. 본 발명의 다른 항체는 안정성을 개선하는 특이적 변화를 갖는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 감소된 효과기 기능, 예를 들면, 감소된 CDC 및/또는 ADCC 기능 및/또는 감소된 B-세포 사멸을 초래하는 Fc 영역내 아미노산 잔기에서 변화를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 자연 살해 (NK) 세포 상에서 인간 보체 인자 C1q 및/또는 인간 Fc 수용체에 감소된 결합 (예컨대 결합의 부재)를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간 FcγRI, FcγRIIA, 및/또는 FcγRIIIA에 감소된 결합 (예컨대 결합의 부재)를 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG 부류 (예를 들면, IgG1 또는 IgG4)이고 E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, 및/또는 P329 (EU 지수에 따른 넘버링)에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 돌연변이 L234A/L235A 또는 D265A/N297A를 포함한다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 거기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 부족한 성숙한 탄수화물 구조는 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108에 기재된다. 참고 또한 US 2004/0093621. 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에서 양분된 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 WO 2003/011878 및 미국 특허 번호 6,602,684에서 참조된다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체는 WO 1997/30087에서 보고된다. 참고 또한, 이의 Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물을 갖는 항체에 관하여 WO 1998/58964 및 WO 1999/22764. 참고 또한 변형된 당화를 갖는 항원-결합 분자에 관하여 US 2005/0123546. 하나의 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공된 임의의 항원 결합 서열을 포함한 FGFR3 결합 폴리펩타이드를 제공하고, 여기에서 FGFR3 결합 폴리펩타이드는 FGFR3, 예를 들면, 인간 및/또는 개 및/또는 마우스 FGFR3에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항체는 FGFR3 (예를 들면 FGFR3-IIIb 및/또는 FGFR3-IIIc) 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2-IIIb 및/또는 FGFR2-IIIc)를 결합시키고 (예컨대 특이적으로 결합시키고), 일부 구현예에서, 하나 이상의 측면의 FGFR3 및/또는 FGFR2 신호전달 (예컨대 FGFR3 포스포릴화) 및/또는 임의의 생물학적으로 관련된 FGFR3 및/또는 FGFR3 리간드 생물학적 경로의 파괴 및/또는 임의의 생물학적으로 관련된 FGFR2 및/또는 FGFR2 리간드 생물학적 경로의 파괴, 및/또는 종양, 세포 증식성 질환 또는 암의 치료 및/또는 예방; 및/또는 FGFR3 및/또는 FGFR2 발현 및/또는 활성 (예컨대 증가된 FGFR3 및/또는 FGFR2 발현 및/또는 활성)과 관련된 질환의 치료 또는 예방을 조절할 수 있다 (예를 들면 저해할 수 있다). 일부 구현예에서, FGFR2/3 항체는 FGFR3 (예를 들면, 인간 또는 마우스 FGFR3) 및/또는 FGFR2 (예를 들면, 인간 또는 마우스 FGFR3)으로 이루어지는 또는 본질적으로 상기로 이루어지는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 1 x 10-7 M 또는 더 높은 친화도의 Kd로 FGFR3을 특이적으로 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 1 x 10-7 M 또는 더 높은 친화도의 Kd로 FGFR2를 특이적으로 결합시킨다. 일부 구현예에서, 항체는 1 x 10-7 M 또는 더 높은 친화도의 Kds로 FGFR3 및 FGF2로 특이적으로 결합시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 미국 특허 공개 번호 2005/0147612에 기재된 항-FGFR3 항체 (예를 들면, 항체 MSPRO2, MSPRO12, MSPRO59, MSPRO11, MSPRO21, MSPRO24, MSPRO26, MSPRO28, MSPRO29, MSPRO43, MSPRO55), Rauchenberger 등, J Biol Chem 278 (40):38194-38205 (2003)에 기재된 항체; PCT 공개 번호 WO2006/048877에 기재된 항체 (예를 들면, 항체 PRO-001), Martinez-Torrecuadrada 등, Mol Cancer Ther (2008) 7(4): 862-873에 기재된 항체 (예를 들면, scFvαFGFR3 3C), Direnzo, R 등 (2007) Proceedings of AACR Annual Meeting, Abstract No. 2080에 기재된 항체 (예를 들면, D11), 또는 WO 2010/002862에 기재된 항체 (예를 들면, 항체 15D8, 27H2, 4E7, 2G4, 20B4)가 아니다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항체 및 캐리어를 포함한 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 캐리어는 약학적으로 허용가능하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 FGFR2/3 항체를 인코딩한 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함한 벡터를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 핵산 및 캐리어를 포함한 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 캐리어는 약학적으로 허용가능하다.
하나의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 벡터를 포함한 숙주 세포를 제공한다. 벡터는 임의의 유형, 예를 들어, 재조합 벡터 예컨대 발현 벡터일 수 있다. 임의의 다양한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어, E. 콜리이다. 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 (본원에서 정의된 바와 같이, 전장 항체 및 이의 단편을 포함하는) 항-FGFR2/3 항체의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 적합한 숙주 세포에서 항체를 인코딩한 본 발명의 재조합 벡터의 발현 단계, 및 항체의 회수 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 핵산이 발현되도록 항체를 인코딩한 핵산을 포함하는 숙주 세포의 배양 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 숙주 세포 배양액에서 항체의 회수 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 숙주 세포 배양 배지에서 회수된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간화된 항체를 포함한 약학적 제형을 제조하기 위해 약학적으로 허용가능한 캐리어, 부형제, 또는 캐리어와 회수된 항체의 조합 단계를 추가로 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 컨테이너; 및 컨테이너내에 함유된 조성물을 포함한 제조 물품을 제공하고, 여기에서 조성물은 본 발명의 하나 이상의 FGFR2/3 항체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 조성물은 본 발명의 핵산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체를 포함한 조성물은, 일부 구현예에서 약학적으로 허용가능한, 캐리어를 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 제조 물품은 개체에 조성물 (예를 들면, 항체) 투여용 사용설명서 (예컨대 본원에서 기재된 임의의 방법용 사용설명서)를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 항-FGFR2/3 항체를 포함한 조성물을 포함하는 제1 컨테이너; 및 버퍼를 포함하는 제2 컨테이너를 포함한 키트를 제공한다. 하나의 구현예에서, 버퍼는 약학적으로 허용가능하다. 하나의 구현예에서, 항체를 포함한 조성물은, 일부 구현예에서 약학적으로 허용가능한, 캐리어를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 개체에 조성물 (예를 들면, 항체) 투여용 사용설명서를 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 약제로서 사용을 위하여 본 발명의 항-FGFR2/3 항체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 FGFR3 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 사용을 위하여 본 발명의 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 FGFR2 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 사용을 위하여 본 발명의 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 FGFR2 및 FGFR3 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료 또는 예방에서 사용을 위하여 본 발명의 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환이다. 일부 구현예에서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환은 다발성 골수종 또는 방광암 (예를 들면, 과도기적 세포 암종), 유방암 또는 간암이다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환 예컨대 골격 질환의 치료 또는 예방에서 사용을 위하여 본 발명의 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군이다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포 증식의 감소에서 사용을 위하여 본 발명의 항-FGFR2/3 항체를 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포의 사멸에서 사용을 위하여 본 발명의 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 ADCC에 의해 사멸된다. 일부 구현예에서, 항체는 노출된 항체이다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR3을 과-발현시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR2를 과-발현시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR2 및 FGFR3을 과-발현시킨다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포, 예컨대 다발성 골수종 세포의 고갈에서 사용을 위하여 본 발명의 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 ADCC에 의해 사멸된다. 일부 구현예에서, 항체는 노출된 항체이다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR3을 과-발현시킨다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 FGFR3, FGFR2, 또는 FGFR2 및 FGFR3 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 항-FGFR2/3 항체의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환이다. 일부 구현예에서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환은 다발성 골수종 또는 방광암 (예를 들면, 과도기적 세포 암종), 유방암 또는 간암이다. 일부 구현예에서, 질환은 골격 질환, 예를 들면, 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 FGFR3, FGFR2, 또는 FGFR2 및 FGFR3 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 핵산의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환이다. 일부 구현예에서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환은 다발성 골수종 또는 방광암 (예를 들면, 과도기적 세포 암종), 유방암 또는 간암이다. 일부 구현예에서, 질환은 골격 질환, 예를 들면, 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 FGFR3, FGFR2, 또는 FGFR2 및 FGFR3 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 발현 벡터의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환이다. 일부 구현예에서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환은 다발성 골수종 또는 방광암 (예를 들면, 과도기적 세포 암종), 유방암 또는 간암이다. 일부 구현예에서, 질환은 골격 질환, 예를 들면, 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 FGFR3, FGFR2, 또는 FGFR2 및 FGFR3 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 숙주 세포의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환이다. 일부 구현예에서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환은 다발성 골수종 또는 방광암 (예를 들면, 과도기적 세포 암종), 유방암 또는 간암이다. 일부 구현예에서, 질환은 골격 질환, 예를 들면, 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군이다.
추가 측면에서, 본 발명은 질환, 예컨대 FGFR3, FGFR2, 또는 FGFR2 및 FGFR3 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 제조 물품의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환이다. 일부 구현예에서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환은 다발성 골수종 또는 방광암 (예를 들면, 과도기적 세포 암종), 유방암 또는 간암이다. 일부 구현예에서, 질환은 골격 질환, 예를 들면, 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 또한 질환, 예컨대 FGFR3, FGFR2, 또는 FGFR2 및 FGFR3 활성화 및/또는 발현 (일부 구현예에서, 과-발현)과 관련된 병태의 치료적 및/또는 예방적 치료를 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 키트의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환이다. 일부 구현예에서, 암, 종양, 및/또는 세포 증식성 질환은 다발성 골수종 또는 방광암 (예를 들면, 과도기적 세포 암종), 유방암 또는 간암이다. 일부 구현예에서, 질환은 골격 질환, 예를 들면, 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군이다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포 증식의 저해를 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 항-FGFR2/3 항체의 용도를 제공한다. 추가 측면에서, 본 발명은 세포 사멸을 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 항-FGFR2/3 항체의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 ADCC에 의해 사멸된다. 일부 구현예에서, 항체는 노출된 항체이다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR3을 과-발현시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR2를 과-발현시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR3 및 FGFR2를 과-발현시킨다.
추가 측면에서, 본 발명은 세포, 예컨대 다발성 골수종 세포의 고갈을 위하여 약제의 제조에서 본 발명의 항-FGFR2/3 항체의 용도를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 ADCC에 의해 사멸된다. 일부 구현예에서, 항체는 노출된 항체이다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR3을 과-발현시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR2를 과-발현시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR3 및 FGFR2를 과-발현시킨다.
본 발명은 FGFR3의 발현 및/또는 신호전달, 예컨대 증가된 발현 및/또는 신호전달 또는 원하지 않는 발현 및/또는 신호전달과 관련된 장애의 조절에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 FGFR2의 발현 및/또는 신호전달, 예컨대 증가된 발현 및/또는 신호전달 또는 원하지 않는 발현 및/또는 신호전달과 관련된 장애의 조절에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 FGFR3 및 FGFR2의 발현 및/또는 신호전달, 예컨대 증가된 발현 및/또는 신호전달 또는 원하지 않는 발현 및/또는 신호전달과 관련된 장애의 조절에 유용한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법은 임의의 적합한 병리적 상태에 영향을 미치도록 사용될 수 있다. 예시적 장애는 본원에서 기재되고, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 포함한다: 비소세포 폐암, 난소암, 갑상선암, 고환암, 자궁내막암, 머리 및 목 암, 뇌암 (예를 들면, 신경교세포종 또는 수막종), 피부암 (예를 들면, 흑색종, 기저 세포 암종, 또는 편평상피 세포 암종), 방광암 (예를 들면, 과도기적 세포 암종), 유방 암종, 위암, 대장암 (CRC), 간세포 암종, 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 및 혈액성 악성종양 (예를 들면, T-세포 급성 림프아구성 백혈병 (T-ALL), B-세포 급성 림프아구성 백혈병 (B-ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), B-세포 악성종양, 호지킨 림프종, 및 다발성 골수종). 일부 구현예에서, 질환은 침습성 과도기적 세포 암종이다. 일부 구현예에서, 질환은 다발성 골수종이다. 추가의 예시적 장애는 골격 장애, 예컨대 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군을 포함한다.
특정 구현예에서, 암은 FGFR3, 증폭된 FGFR3, 전좌된 FGFR3, 및/또는 돌연변이된 FGFR3을 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 활성화된 FGFR3이다. 특정 구현예에서, 암은 전좌된 FGFR3 (예를 들면, t(4;14) 전좌)를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 구성적 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 구성적 FGFR3은 티로신 키나제 도메인 및/또는 근접막 도메인 및/또는 리간드-결합 도메인에서 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 리간드-독립적 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 리간드-의존적 FGFR3을 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbS248C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbS248C 및/또는 FGFR3-IIIcS248C를 발현시켰다.
일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbK652E에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbK652E 및/또는 FGFR3-IIIcK650E를 발현시켰다.
FGFR3-IIIbS249C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbS249C 및/또는 FGFR3-IIIcS249C를 발현시킨다.
하나의 측면에서, 암은 FGFR3-IIIbG372C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbG372C 및/또는 FGFR3-IIIcG370C를 발현시킨다.
하나의 측면에서, 암은 FGFR3-IIIbY375C에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbY375C 및/또는 FGFR3-IIIcY373C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 (a) FGFR3-IIIbK652E 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3IIIbG372C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 (a) FGFR3-IIIbR248C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbG372C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 (a) FGFR3-IIIbG372C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbR248C를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbG372C를 발현시킨다.
특정 구현예에서, 암은 대조 샘플 (예를 들면, 정상 조직의 샘플) 또는 수준에 비하여 포스포-FGFR3, 포스포-FRS2 및/또는 포스포-MAPK의 증가된 수준을 발현시킨다.
특정 구현예에서, 암은 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 활성화된 FGFR2를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 전좌된 FGFR2를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 구성적 FGFR2를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 리간드-독립적 FGFR2를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 리간드-의존적 FGFR2를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 돌연변이를 포함한 FGFR2를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 하기를 발현시킨다: 1) FGFR3, 증폭된 FGFR3, 전좌된 FGFR3, 및/또는 돌연변이된 FGFR3 및 2) FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2. 특정 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 활성화된 FGFR3 및 FGFR2를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 전좌된 FGFR3 (예를 들면, t(4;14) 전좌) 및 FGFR2를 발현시킨다. 특정 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 구성적 FGFR3 및 FGFR2를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 구성적 FGFR3은 티로신 키나제 도메인 및/또는 근접막 도메인 및/또는 리간드-결합 도메인에서 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 리간드-독립적 FGFR3 및 FGFR2를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 리간드-의존적 FGFR3 및 FGFR2를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbS248C 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbS248C 및/또는 FGFR3-IIIcS248C 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbK652E 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbK652E 및/또는 FGFR3-IIIcK650E 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbS249C 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3. 일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbS249C 및/또는 FGFR3-IIIcS249C 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
하나의 측면에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbG372C 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbG372C 및/또는 FGFR3-IIIcG370C 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
하나의 측면에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbY375C 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 FGFR3-IIIbY375C 및/또는 FGFR3-IIIcY373C 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 (a) FGFR3-IIIbK652E 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3IIIbG372C 및 (c) FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 (a) FGFR3-IIIbR248C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbG372C 및 (c) FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 (a) FGFR3-IIIbG372C 및 (b) 하나 이상의 FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbR248C 및 (c) FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 (a) FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbY375C, FGFR3-IIIbS249C, 및 FGFR3-IIIbG372C, 및 (b) FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)를 발현시킨다.
특정 구현예에서, 암은 상기 기재된 바와 같이 대조 샘플 (예를 들면, 정상 조직의 샘플) 또는 수준에 비하여 포스포-FGFR3, 포스포-FRS2 및/또는 포스포-MAPK 및 FGFR2 (예를 들면 FGFR2, 증폭된 FGFR2, 전좌된 FGFR2, 및/또는 돌연변이된 FGFR2)의 증가된 수준을 발현시킨다.
일부 구현예에서, 암은 (예를 들면, 세포 표면 상에서) 약 10,000 FGFR3 분자 / 세포 이상 (예컨대 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000 이상 FGFR3 수용체)를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 13000 FGFR3 분자를 발현시킨다. 다른 구현예에서, 암은 약 5000, 6000, 7000, 8000, 이상 FGFR3 분자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 4000, 3000, 2000, 1000 미만, 또는 더 적은 FGFR3 분자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 1000 미만 FGFR3 분자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 (예를 들면, 세포 표면 상에서) 약 10,000 FGFR2 분자 / 세포 이상 (예컨대 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000 이상 FGFR2 수용체)를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 13000 FGFR2 분자를 발현시킨다. 다른 구현예에서, 암은 약 5000, 6000, 7000, 8000, 이상 FGFR2 분자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 4000, 3000, 2000, 1000 미만, 또는 더 적은 FGFR2 분자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 1000 미만 FGFR2 분자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 (예를 들면, 세포 표면 상에서) 약 10,000 FGFR3 및 10,000 FGFR2 분자 / 세포 이상 (예컨대 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000 이상 FGFR3 수용체 및 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000 이상 FGFR2 수용체)를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 13000 FGFR3 분자 및 13000 FGFR2 분자를 발현시킨다. 다른 구현예에서, 암은 약 5000, 6000, 7000, 8000, 이상 FGFR3 분자 및 약 5000, 6000, 7000, 8000, 이상 FGFR2 분자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 4000, 3000, 2000, 1000 미만, 또는 더 적은 FGFR3 분자 및 약 4000, 3000, 2000, 1000 미만, 또는 더 적은 FGFR2 분자를 발현시킨다. 일부 구현예에서, 암은 약 1000 미만 FGFR3 분자 및 약 1000 미만 FGFR2 분자를 발현시킨다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 암 세포이다. 예를 들어, 암 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 유방암 세포, 대장암 세포, 폐암 세포 (예를 들면, 비소세포 폐암 세포), 갑상선암 세포, 다발성 골수종 세포, 고환암 세포, 유두상 암종 세포, 결장암 세포, 췌장암 세포, 난소암 세포, 자궁경부암 세포, 중추신경계 암 세포, 골육종 세포, 신장 암종 세포, 간세포 암종 세포, 방광암 세포 (예를 들면, 과도기적 세포 암종 세포), 위 암종 세포, 머리 및 목 편평상피 암종 세포, 흑색종 세포, 백혈병 세포, 다발성 골수종 세포 (예를 들면 t(4:14) FGFR3 전좌를 포함한 다발성 골수종 세포) 및 결장 샘종 세포. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 과증식성 및/또는 과형성 세포이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 형성이상 세포이다. 추가의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에서 표적화되는 세포는 전이성 세포이다.
하나의 측면에서, 본 발명은 대상체에서 세포 증식의 저해 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포 증식을 감소시키기 위해 유효량의 항-FGFR2/3 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 대상체에서 세포의 사멸 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 사멸시키기 위해 유효량의 항-FGFR2/3 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 ADCC에 의해 사멸된다. 일부 구현예에서, 항체는 노출된 항체이다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR3을 과-발현시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR2를 과-발현시킨다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR3 및 FGFR2를 과-발현시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명은 대상체에서 세포 (예컨대 다발성 골수종 세포)의 고갈 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 사멸시키기 위해 유효한 양의 항-FGFR2/3 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 ADCC에 의해 사멸된다. 일부 구현예에서, 항체는 노출된 항체이다. 일부 구현예에서, 세포는 FGFR2/3을 과-발현시킨다.
하나의 측면에서, 본 발명은 골격 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질환은 연골무형성, 연골형성저하증, 왜소증, 치사성 이형성증 (TD; 임상 형태 TD1 및 TDII), 또는 두개유합증 증후군이다.
본 발명의 방법은 추가의 치료 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 방법은 표적화된 세포 및/또는 조직 (예를 들면, 암 세포)가 방사선 치료 또는 화학치료제에 노출되는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 유효량의 또 다른 치료제 (예컨대 항-혈관신생 제제, 또 다른 항체, 화학치료제, 세포독성제, 면역억제성 제제, 전구약물, 사이토카인, 세포독성 방사선요법, 코르티코스테로이드, 항-구토제, 암 백신, 진통제, 또는 성장 저해된 제제)와 조합으로 유효량의 항-FGFR2/3 항체의 투여를 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 항-FGFR2/3 항체는 다양한 신생물성 또는 비-신생물성 병태를 치료하기 위해 항-암 제제 또는 항-혈관형성제와 조합으로 사용된다. 특정 예에서, 항-FGFR2/3 항체는 벨케이드, 레블리미드, 타목시펜, 레트로졸, 엑세메스탄, 아나스트로졸, 이리노테칸, 세툭시맙, 풀베스트란트, 비노렐빈, 베바시주맙, 빈크리스틴, 시스플라틴, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 카보플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 페메트렉세드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 보르테조밉, 레날리도마이드, 덱사메타손, 멜팔린, 프레드니손, 빈크리스틴, 및/또는 탈리도마이드와 조합으로 사용된다.
치료받는 특이적 암 적응증에 따라, 본 발명의 조합 요법은 추가의 치료제, 예컨대 화학치료제, 또는 추가의 요법 예컨대 방사선요법 또는 수술과 조합될 수 있다. 많은 공지된 화학치료제는 본 발명의 조합 요법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는 특이적 징후의 치료용 표준인 화학치료제가 사용될 것이다. 조합으로 사용되기 위한 각 치료제의 복용량 또는 빈도는 다른 제제(들) 없이 사용될 때 상응하는 제제의 복용량 또는 빈도와 바람직하게는 동일, 또는 미만이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 기재된 임의의 항-FGFR2/3 항체를 제공하고, 여기에서 항-FGFR2/3 항체는 검출가능한 표지를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 기재된 임의의 항-FGFR2/3 항체 및 FGFR2/3의 복합체를 제공한다. 일부 구현예에서, 복합체는 생체내 또는 시험관내이다. 일부 구현예에서, 복합체는 암 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체는 검출가능하게 표지된다.
본 개시내용은 또한 베타-클로토 (KLB)에 결합하는 항체 및 모든 KLB 및 FGFR2 및/또는 FGFR3 ("FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체")에 결합하는 이중특이적 항체, 그리고 동일한 것의 이용 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 체중 감소 및 글루코오스 및 지질 대사에서의 개선을 포함한 대사성 질환 및 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 간에서 유의미한 영향 없이 및 골량에서 유의미한 손실 없이 대사성 장애 또는 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 비-알코올성 지방간염 (NASH)을 치료하기 위해 사용된다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 단리된 항체이다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 모든 KLB 및 FGFR2, KLB 및 FGFR3, 또는 모든 3개의 KLB, FGFR2, 및 FGFR3에 결합시킬 수 있고, 여기에서 항체는 KLB의 C-말단 도메인에 결합한다. 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 103)을 포함한 KLB의 단편에 결합한다.
특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 아미노산 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)를 포함한 FGFR2의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 아미노산 서열 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)를 포함한 FGFR3의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 아미노산 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)를 포함한 FGFR2의 단편 내의 에피토프에 결합하고 아미노산 서열 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)를 포함한 FGFR3의 단편 내의 에피토프에 결합한다.
특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 아미노산 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및/또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 FGFR2의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 아미노산 서열 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 FGFR3의 단편 내의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 아미노산 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및/또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 FGFR2의 단편 내의 에피토프에 결합하고 또한 아미노산 서열 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 FGFR3의 단편 내의 에피토프에 결합한다.
특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 서열식별번호: 52 또는 54의 157 내지 181의 아미노산 서열 범위 내에서 FGFR2를 결합시킨다. 특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 서열식별번호: 52 또는 54의 207 내지 220의 아미노산 서열 범위 내에서 FGFR2를 결합시킨다. 특정 구현예에서, KLB를 결합시키는 이중특이적 항체는 또한 서열식별번호: 52 또는 54의 157 내지 181 및 207 내지 220의 아미노산 서열 범위 내에서 FGFR2를 결합시킨다.
특정 구현예에서, KLB 및 FGFR2/3을 결합시키는 이중특이적 항체는 구성적 FGFR2 및/또는 FGFR3 활성을 저해시킨다. 특정 구현예에서, 구성적 FGFR2/3 활성은 리간드-의존적 구성적 FGFR2/3 활성이다. 특정 구현예에서, 구성적 FGFR2/3 활성은 리간드-독립적 구성적 FGFR2/3 활성이다. 특정 구현예에서, 구성적 FGFR2/3 활성은 FGFR2 및 FGFR3 활성이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 생체내 혈당 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 골 밀도에 유의미하게 영향을 미치지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 간에서 유의미한 영향을 갖지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 FGF21이 유도하는 것보다 유의미하게 더 낮은 수준으로 간에서 ERK 및 MEK 포스포릴화를 유도한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 10-8 M 내지 10-13 M의 Kd를 갖는 KLB에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 10-8 M 내지 10-13 M의 Kd를 갖는 FGFR2 및/또는 FGFR3 단백질에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 10-8 M 내지 10-13 M의 Kd를 갖는 FGFR2 및 /또는 FGFR3에 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 KLB에서 존재하는 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용은 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 도 11A 및 11B에서 보이는 항체로서 KLB에서 동일한 에피토프를 결합시킬 수 있다는 것을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 12A11 또는 8C5 항체로서 동일한 에피토프를 결합시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 KLB의 C-말단 도메인 내에서 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 103)으로 이루어진 KLB의 단편에 결합할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 임의의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 KLB 아암은 전체적으로 본원에서 편입되는 US20150218276에 기재된 임의의 KLB 항체의 아암이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 임의의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 FGFR2/3 아암은 본원에서 기재된 임의의 FGFR2/3 항체의 아암이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제1 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 여기에서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 104에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기에서 중쇄 가변 영역은 표 1의 컬럼 2에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 표 1의 컬럼 3에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
Figure pct00001
특정 구현예에서, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는, 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하는, 제1 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 여기에서 중쇄 영역은 서열식별번호: 106에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 영역은 서열식별번호: 107에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하고, 여기에서 중쇄 영역은 표 1의 컬럼 2에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 영역은 표 1의 컬럼 3에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 (여기에서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 104에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다)을 포함하는, 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분; 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 (여기에서 중쇄 가변 영역은 서열 세트 서열식별번호: 66과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 82에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다)을 포함하는, 제2 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원 결합 부분.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 (여기에서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 106에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 107에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다)을 포함하는, 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분; 및 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 (여기에서 중쇄 가변 영역은 서열 세트 서열식별번호: 82와 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 66에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다)을 포함하는, 제2 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원 결합 부분.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 (여기에서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 106에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 107에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다)을 포함하는, 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분; 및 중쇄 및 경쇄 (여기에서 중쇄는 서열식별번호: 282에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄는 서열식별번호: 283에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다)을 포함하는, 제2 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원 결합 부분.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 (여기에서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 106에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 107에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다)을 포함하는, 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분; 및 제2 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 여기에서 경쇄 상에서 CDRs는 서열식별번호: 7-9 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 여기에서 중쇄 상에서 CDRs는 서열식별번호: 10-12 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 (여기에서 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 106에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 107에서 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다)을 포함하는, 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분; 및 제2 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 여기에서 경쇄 상에서 CDRs는 서열식별번호: 276-278 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 여기에서 중쇄 상에서 CDRs는 서열식별번호: 279-281 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다: (a) 서열식별번호: 230-232 및 236-247로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 HVR-H3, (b) 서열식별번호: 123-137로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 HVR-L3, 및 (c) 서열식별번호: 142 및 248-262로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 HVR-H2.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다: (a) 서열식별번호: 230-232 및 236-247로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 142 및 248-262로 이루어진 군으로부터 선택되는 HVR-H2, 및 (c) 서열식별번호: 263-278로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 HVR-H3.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다: (a) 서열식별번호: 279-293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 HVR-L1, (b) 서열식별번호: 294-309로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 310-324로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한 HVR-L3.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다: (a) 서열식별번호: 119의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 150의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 166의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 181의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 197의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 212의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L3.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다: (a) 서열식별번호: 122의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 153의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 184의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 200의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 215의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L3.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는, 본원에서 또는 전체적으로 본원에서 편입되는 US20150218276에서 개시된 임의의 항-KLB 항체로부터 선택된, 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 하나의 아암 및 본원에서 개시된 FGFR2/3 항체의 하나의 아암을 포함한다. 특정 구현예에서 이중특이적 FGFR2/3 + KLB의 아암은 하기 조합으로부터 선택된다:
a) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 82 (중쇄) 및 서열식별번호: 66 (경쇄)를 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
b) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 82 (중쇄) 및 서열식별번호: 66 (경쇄)를 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
c) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 7-9 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 10-12 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
d) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 7-9 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 10-12 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
e) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 282 (중쇄) 및 서열식별번호: 283 (경쇄)를 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
f) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 282 (중쇄) 및 서열식별번호: 283 (경쇄)를 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
g) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 276-278 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 279-281 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암; 및
h) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 276-278 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 279-281 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다: (a) 서열식별번호: 104의 아미노산 서열을 포함한 중쇄 가변 영역 및 (b) 서열식별번호: 105의 아미노산 서열을 포함한 경쇄 가변 영역. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다: (a) 서열식별번호: 106의 아미노산 서열을 포함한 중쇄 및 (b) 서열식별번호: 107의 아미노산 서열을 포함한 경쇄.
또 다른 측면에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 제1 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다: (a) 서열식별번호: 104의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; (b) 서열식별번호: 105의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역; 및 (c) (a)에서와 같이 중쇄 가변 영역 및 (b)에서와 같이 경쇄 가변 영역.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 구현예에서, 항체는 인간, 인간화된, 또는 키메라성 항체이다. 특정 구현예에서, 항체는 효과기 기능을 감소시켰다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 인코딩한 단리된 핵산을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 인코딩한 핵산을 포함한 숙주 세포를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 항체가 생산되도록 본 개시내용의 숙주 세포의 배양을 포함한 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 생산 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 추가로 숙주 세포로부터 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 회수를 포함한다.
본 개시내용은 추가로 본 발명의 하나 이상의 항체 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 특이적으로, 본 개시내용은 본원에서 기재된 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 포함하는 약학적 제형을 제공한다. 특정 구현예에서, 약학적 제형은 추가의 치료제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 약제로서 사용을 위하여 본 발명의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 대사성 장애, 예를 들면, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사성 증후군 (MetS), 비만, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재적 자가면역 당뇨병 (LAD), 및 약년발증 성인형 당뇨병 (MODY)의 치료에서 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 제2형 당뇨병의 치료에서 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 비만의 치료에서 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 바데트-비들 증후군, 프라다-윌리 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 알브라이트 유전성 골이영양증 (가성부갑상선기능저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 취약 X 증후군 및 보제슨-포스만-레만 증후군의 치료에서 사용을 위하여 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 NASH 치료에서 사용을 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은, 대사성 장애, 예를 들면, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사성 증후군 (MetS), 비만, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재적 자가면역 당뇨병 (LAD), 및 약년발증 성인형 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련된 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS의 치료용 약제의 제조에서, 본원에서 개시된, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 용도를 제공한다. 특정 구현예에서, 대사성 질환은 제2형 당뇨병이다. 특정 구현예에서, 대사성 질환은 NASH이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사성 증후군 (MetS), 비만, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재적 자가면역 당뇨병 (LAD), 및 약년발증 성인형 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련된 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 갖는 개체의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 질환은 당뇨병, 예를 들면, 제2형 당뇨병이다. 특정 구현예에서, 질환은 비만이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 바데트-비들 증후군, 프라다-윌리 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 알브라이트 유전성 골이영양증 (가성부갑상선기능저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 취약 X 증후군 및 보제슨-포스만-레만 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 및/또는 장애를 갖는 개체의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 추가로 개체에 추가의 치료제 투여를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 하나 이상의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 이용 방법은 개체에서 간 기능에 영향을 끼치지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 하나 이상의 항체의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함하는 체중 감소의 유도 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 약제로서 사용될 수 있고, 본원에서 또는 전체적으로 본원에서 편입되는 US20150218276에서 개시된 임의의 항-KLB 항체로부터 선택된, 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 하나의 아암 및 본원에서 개시된 FGFR2/3 항체의 하나의 아암을 포함한다. 특정 구현예에서 약제로서 사용될 수 있는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기 조합으로부터 선택된다:
a) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 82 (중쇄) 및 서열식별번호: 66 (경쇄)를 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
b) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 함유한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 82 (중쇄) 및 서열식별번호: 66 (경쇄)를 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
c) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 7-9 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 10-12 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
d) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 7-9 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 10-12 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
e) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 282 (중쇄) 및 서열식별번호: 283 (경쇄)를 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
f) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 282 (중쇄) 및 서열식별번호: 283 (경쇄)를 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
g) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 276-278 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 279-281 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암; 및
h) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 276-278 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 279-281 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암.
또 다른 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 대사성 질환 (예를 들면, NASH 또는 관련된 질환)을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 본원에서 또는 전체적으로 본원에서 편입되는 US20150218276에서 개시된 임의의 항-KLB 항체로부터 선택된, 항-KLB 항체, 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 하나의 아암 및 본원에서 개시된 FGFR2/3 항체의 하나의 아암을 포함한다. 특정 구현예에서 대사성 질환 (예를 들면, NASH 또는 관련된 질환)을 치료하기 위해 사용될 수 있는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체의 아암은 하기 조합으로부터 선택된다:
a) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 82 (중쇄) 및 서열식별번호: 66 (경쇄)를 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
b) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 82 (중쇄) 및 서열식별번호: 66 (경쇄)를 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
c) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 7-9 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 10-12 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
d) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 7-9 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 10-12 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.3.12 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
e) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 282 (중쇄) 및 서열식별번호: 283 (경쇄)를 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
f) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 282 (중쇄) 및 서열식별번호: 283 (경쇄)를 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암;
g) (서열식별번호: 104 (HCVR) 및 서열식별번호: 105 (LCVR)을 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 276-278 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 279-281 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암; 및
h) (서열식별번호: 106 (중쇄) 및 서열식별번호: 107 (경쇄)를 포함한) 8C5.K4.M4L.H3.KNV 항-KLB 항체로부터 하나의 아암 및 (서열식별번호: 276-278 (CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3) 및 서열식별번호: 279-281 (CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3)을 포함한) 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로부터 하나의 아암.
도 1은 FGF7-자극된 MCF-7 세포 증식에 대하여 조작된 2B.1 항체의 저해된 효과를 보여준다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 2A-2C는 FGFR2 D2 도메인과 Mab 2B.1.3의 Fab 단편 사이에서 복합체의 결정 구조를 보여준다. 도 2A는 복합체의 전체 구조를 보여준다. FGFR2-D2는 심홍색으로, Fab 2B.1.3의 중쇄는 녹색으로 그리고 경쇄는 청색으로 채색되었다. 도 2B는 FGFR2-D2:2B.1.3 및 FGFR3-D2D3:R3Mab의 구조의 오버레이를 보여준다. 전자 복합체는 도 2A에서와 동일하게 채색되었다. FGFR3-D2D3은 황색으로, 그리고 R3Mab는 회색으로 채색되었다. 도 2C는 2 복합체 사이에서 구조적 차이를 보여주는 도 2B에서 박스내 영역의 줌인 묘사를 보여준다. 색상 반응식은 도 2B에서와 동일하다.
도 3A-3D는 R3Mab 변이체에 의한 FGF 리간드의 차별적인 블록킹을 보여준다. 도 3A는 인간 FGFR2-IIIb에 대한 FGF-7 결합의 블록킹을 보여준다. 도 3B는 인간 FGFR2-IIIc에 대한 FGF-1 결합의 블록킹을 보여준다. 도 3C는 인간 FGFR3-IIIb에 대한 FGF-1 결합의 블록킹을 보여준다. 도 3D는 인간 FGFR3-IIIc에 대한 FGF-1 결합의 블록킹을 보여준다. 도 3E는 인간 FGFR4에 대한 FGF-19 결합의 블록킹을 보여준다.
도 4A-4C는 2B.1 변이체가 시험관내 FGFR2 신호전달을 저해하고 생체내 이종이식 성장을 억압하는 것을 보여준다. 도 4A는 위암 세포주 SNU-16에서 2B.1 변이체에 의한 FGF7-자극된 FGFR2 신호전달의 블록킹을 보여준다. 도 4B는 대조군 항체와 비교된 FGFR2-의존적 SNU-16 이종이식편의 성장에서 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12의 효과를 보여준다. 도 4C는 FGFR3-의존적 RT112 방광암 이종이식편의 성장에서 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12의 효과를 보여준다.
도 5는 R3Mab (PDB 3GRW)에 의해 접촉된 FGFR3-IIIb에서 표면적을 보여준다. FGFR3-IIIb의 D2 및 D3 도메인의 표면은 회색으로 보여진다. R3Mab의 개별 CDR 루프에 의한 접촉 영역은 채색된다. 각 CDR에 의한 접촉 영역 및 전체 접촉 영역의 그의 백분율은 소괄호내 수치로서 표지된다.
도 6은 Weblogo 3을 이용하여 제조된 FGFR2-IIIb에 대한 결합을 위하여 선택된 파아지 라이브러리로부터 CDR H2의 서열 로고를 보여준다 (Crooks, G. E., G. Hon, J. M. Chandonia and S. E. Brenner (2004). "WebLogo: a sequence logo generator." Genome Res 14(6): 1188-1190).
도 7은 FGFR2-D2:2B.1.3 및 FGFR3-D2D3:R3Mab의 복합체의 전체 구조적 정렬을 보여준다.
도 8A는 유방암 세포주 MFM-223x2.2에서 2B.1 변이체에 의한 FGF7-자극된 FGFR2 신호전달의 블록킹을 보여준다. 도 8B는 FGFR2-의존적 MFM-223x2.2 유방암 이종이식편의 성장에서 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12의 효과를 보여준다. 실험중 마우스는 에스트로겐 독성을 보여주었다. n = 10 / 그룹; 오차 막대는 SEM을 나타낸다.
도 9A-9D는 2B.1.3.10 (즉, 1.3.10) 및 2B.1.3.12 (즉, 1.3.12) 항-FGFR2/3 항체의 에피토프를 보여준다. 도 9A는 FGFR2-IIIb 서열을 보여주고 항-FGFR2/3 1.3.10 및 1.3.12 항체의 에피토프는 밑줄쳐지고 볼드체이다. 도 9B는 FGFR2-IIIc 서열을 보여주고 항-FGFR2/3 1.3.10 및 1.3.12 항체의 에피토프는 밑줄쳐지고 볼드체이다. 도 9C는 FGFR3-IIIb 서열을 보여주고 항-FGFR2/3 1.3.10 및 1.3.12 항체의 에피토프는 밑줄쳐지고 볼드체이다. 도 9D는 FGFR3-IIIc 서열을 보여주고 항-FGFR2/3 1.3.10 및 1.3.12 항체의 에피토프는 밑줄쳐지고 볼드체이다. 항체 2B.1.3.10은 서열식별번호: 52 및 54 (참고 또한 에피토프 서열에 대하여 서열식별번호: 91 및 92)에 따라 157-181 및 207-220의 잔기 수를 갖는 2 베타-가닥으로 구성되는 FGFR2에서 에피토프에 결합한다. 항체 2B.1.3.10은 또한 서열식별번호: 56 및 58 (참고 또한 에피토프 서열에 대하여 서열식별번호: 93 및 94)에 따라 154-178 및 204-217의 잔기 수를 갖는 2 베타-가닥으로 구성되는 FGFR3에서 에피토프에 결합한다. 2B.1.3.12는 2B.1.3.10으로서 동일한 에피토프에 결합한다. 특히, 2B.1.3.12는 157-181 및 207-220의 잔기 수를 갖는 2 베타-가닥으로 구성되는 FGFR2에서 에피토프에 결합한다. 2B.1.3.12는 또한 154-178 및 204-217의 잔기 수를 갖는 2 베타-가닥으로 구성되는 FGFR3에서 에피토프에 결합한다.
도 10은 항-FGFR2/3 항체 1.3, 1.95, 1.73, 1.32, 1.88, 1.1, 1.3.10, 및 1.3.12에 상응하는 아미노산 서열식별번호 및 핵산의 차트를 보여준다.
도 11A는 17 항-KLB 항체에 대하여 경쇄 가변 영역 서열을 도시한다. CDR L1 서열은, 순서대로, 서열식별번호: 279-293이고; CDR L2 서열은, 순서대로, 서열식별번호: 294-309이고; CDH L3 서열은, 순서대로, 서열식별번호: 123-137이다. 경쇄 가변 영역 서열은, 순서대로, 서열식별번호: 111-127이다. 도 11B는 17 항-KLB 항체에 대하여 중쇄 가변 영역 서열을 도시한다. 항체에 대하여 CDR H1 서열은 순서대로 (11F1-8C5), 서열식별번호: 230-232 및 236-247이고; CDR H2 서열은, 순서대로, 서열식별번호: 142 및 248-262이고; CDR H3 서열은, 순서대로, 서열식별번호: 263-278이다. 항체에 대하여 중쇄 가변 영역 서열은, 순서대로, 서열식별번호: 216-232이다.
도 12는 다양한 항-KLB 항체 내지 293 세포 발현 hKLB의 결합을 측정하는 0.8 μg/ml으로 FACS 플롯에서 관측된 중앙 시프트를 도시한다.
도 13은 hKLB-ECD-HIS 단백질에 다양한 항-KLB 항체의 상대 결합을 도시한다.
도 14A는 마우스 KLB 단백질 (서열식별번호: 165)dnk N-말단 아미노산 서열을 보여주고, KO 마우스내 Klb 대립유전자에 의해 인코딩된 상응하는 아미노산 서열 (서열식별번호: 166)은 보여진다. Klb 유전자에서 미스센스 돌연변이는, 적색 문자로 보여진 바와 같이, KO 대립유전자에서 제2개의 아미노산 이후 프레임-시프트된다. 도 14B는 야생형 (+/+) 및 KLB 녹아웃 (-/-) 마우스에서 정소상체 백색 지방질 조직에서 KLB 단백질 발현을 보여준다. 도 14C는 KLB가 글루코오스 대사에 영향을 끼치기 위해 BsAb20에 중요하다는 것을 보여준다. 3 mpk로 BsAb20 또는 대조군 IgG의 4 매주 주사를 받았던 DIO 마우스에서 글루코오스 부하 시험 (GTT). GTT는 일 23에서, 마지막 주사 이후 3 일 수행되었다. 마우스는 GTT에 앞서 20 주 동안 HFD이었다. *p<0.05.
도 15A 및 15B는 SNU-16 이종이식 종양에서 인간 FGFR2 (도 15A) 및 FGFR3 (도 15B)의 검출을 보여준다. 종양 샘플은 용해되었고 인간 FGFR2 및 FGFR3 단백질에 대하여 웨스턴 블랏 분석 처리되었다. 현재 연구로부터 수집된 종양은 FGFR3에 대하여 신호를 보여주었다 (도 15B, 레인 5-24). 또한, 이전의 SNU-16 연구로부터 수집된 종양 (도 15B, 레인 3) 및 시험관내-배양된 SNU-16 세포 (도 B, 레인 4)는 또한 검출가능하지만 더 약한 FGFR3 발현을 보여주었다.
도 16A-16C는 작용제 활성 및 FGFR2, FGFR3, 및 FGFR4 결합에 대하여 발현 및 시험되었던 7개의 2B1.1 변이체를 보여준다. 도 16A는 항-FGFR2/3 항체 변이체, 각 변이체의 CDR H1-H3의 서열, 및 Biacor 검정 및 ELISA에 의해 측정된 FGFR3 친화도를 상세히 설명한 차트를 보여준다. 도 16B는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 변이체의 FGFR3에 대하여 결합 친화도를 보여준다. 도 16C는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 변이체의 FGFR4에 대하여 결합 친화도를 보여준다.
도 17A 및 17B는 루시퍼라아제 검정을 이용하여 FGFRs에 대한 항-FGFR2/3 항체 변이체 활성의 비교를 보여준다. 도 17A는 FGFR3 및 FGFR4 활성을 보여준다. 도 17B는 FGFR2 및 FGFR1 활성을 보여준다.
도 18은 항-FGFR2/3 항체가 FGFGR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 위하여 사용될 수 있는 선택에 사용된 항-FGFR2/3 항체 변이체 결정 매트릭스를 보여준다.
도 19A-19C는 선택된 항-FGFR2/3 항체 변이체의 FGFR 활성을 보여준다. 도 19A는 FGFR3 활성을 보여준다. 도 19B는 FGFR2 활성을 보여준다. 도 19C는 FGFR4 활성을 보여준다.
본 발명의 상세한 설명
섬유아세포 성장 인자 (FGFs) 및 그의 티로신 키나제 수용체 (FGFRs)는 배아 발생 동안 특이적 경로, 뿐만 아니라 성체 동물에서 다양한 조직의 항상성, 상처 치유 공정 및 특정 대사성 기능의 조절에서 중요한 역할을 한다. 인간에서 4 고 상동성 FGFRs (FGFR1-4) 및 22 FGFs (FGF1-14 및 FGF16-23)가 있다 (Goetz R & Mohammadi M (2013) Exploring mechanisms of FGF signalling through the lens of structural biology. Nat Rev Mol Cell Biol 14(3):166-180; Turner N & Grose R (2010) Fibroblast growth factor signalling: from development to cancer. Nat Rev Cancer 10(2):116-129; Beenken A & Mohammadi M (2009) The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nat Rev Drug Discov 8(3):235-253; Wesche J, Haglund K, & Haugsten EM (2011) Fibroblast growth factors and their receptors in cancer. Biochem J 437(2):199-213). FGFRs는 3 면역글로불린 도메인 (D1, D2 및 D3)을 갖는 세포외 영역, 단일-패스 막통과 영역 및 갈라진 세포질 키나제 모이어티를 포함한다 (Goetz R & Mohammadi M (2013) Exploring mechanisms of FGF signalling through the lens of structural biology. Nat Rev Mol Cell Biol 14(3):166-180; Mohammadi M, Olsen SK, & Ibrahimi OA (2005) Structural basis for fibroblast growth factor receptor activation. Cytokine Growth Factor Rev 16(2):107-137). 대안적인 스플라이싱은, D3의 제2 절반 및 결과적으로 리간드-결합 특이성에서 상이한, FGFRs 1-3의 2 주요 변이체, 일명 동형체 IIIb 및 IIIc를 초래한다 (Chang, H., Stewart, A.K., Qi, X.Y., Li, Z.H., Yi, Q.L., 및 Trudel, S. 2005. 면역조직화학은 다발성 골수종에서 FGFR3 비정상적인 발현 및 t(4;14)를 정확하게 예측한다. Blood 106:353-355).
FGFRs 1-4에 의한 이상조절된 신호전달은 몇 개의 암 유형에서 발병과 관련된다 (L'Hote, C.G., 및 Knowles, M.A. 2005. Cell responses to FGFR3 signalling: growth, differentiation and apoptosis. Exp Cell Res 304:417-431; Dailey, L., Ambrosetti, D., Mansukhani, A., 및 Basilico, C. 2005. Mechanisms underlying differential responses to FGF signaling. Cytokine Growth Factor Rev 16:233-247). 유전자 증폭, 염색체 전좌 및 활성화 돌연변이를 포함하는, 게놈 FGFR 변경은 FGF 경로의 비정상적인 활성화를 구동시킬 수 있고 정상 세포의 신생물성 전환을 촉진시킬 수 있다. FGFR2 유전자 증폭은 위암의 ~10% 및 삼중-음성 유방암의 ~4%에서 발생하고 (Chesi, M., Nardini, E., Brents, L.A., Schrock, E., Ried, T., Kuehl, W.M., 및 Bergsagel, P.L. 1997. 다발성 골수종에서 빈번한 전좌 t(4;14)(p16.3;q32.3)는 섬유아세포 성장 인자 수용체 3의 증가된 발현 및 활성화 돌연변이와 관련된다. Nat Genet 16:260-264; Fonseca, R., Blood, E., Rue, M., Harrington, D., Oken, M.M., Kyle, R.A., Dewald, G.W., Van Ness, B., Van Wier, S.A., Henderson, K.J., 등 2003. Clinical and biologic implications of recurrent genomic aberrations in myeloma. Blood 101:4569-4575; Moreau, P., Facon, T., Leleu, X., Morineau, N., Huyghe, P., Harousseau, J.L., Bataille, R., 및 Avet-Loiseau, H. 2002. 재발성 14q32 전좌는 특히 집중 화학요법을 받는 환자에서 다발성 골수종의 예측을 결정한다. Blood 100:1579-1583), 반면에 FGFR3 증폭은 방광암의 특이적 서브셋과 관련된다 (Moreau, P., Facon, T., Leleu, X., Morineau, N., Huyghe, P., Harousseau, J.L., Bataille, R., 및 Avet-Loiseau, H. 2002. 재발성 14q32 전좌는 특히 집중 화학요법을 받는 환자에서 다발성 골수종의 예측을 결정한다. Blood 100:1579-1583; Pollett, J.B., Trudel, S., Stern, D., Li, Z.H., 및 Stewart, A.K. 2002. 골수종-관련된 종양유전자 섬유아세포 성장 인자 수용체 3의 과발현은 덱사메타손 내성을 부여한다. Blood 100:3819-3821). 미스센스 FGFR 돌연변이는 또한 다중 유형의 암에서 발견된다 (L'Hote, C.G., 및 Knowles, M.A. 2005. 세포가 FGFR3 신호전달: 성장, 분화 및 세포자멸사에 반응한다. Exp Cell Res 304:417-431; Agazie, Y.M., Movilla, N., Ischenko, I., 및 Hayman, M.J. 2003. 포스포티로신 포스파타제 SHP2는 종양발생 섬유아세포 성장 인자 수용체 3에 의해 유도된 전환의 임계적 매개체이다. Oncogene 22:6909-6918). 특이적으로, D2와 D3 사이, 예를 들면 FGFR2에서 S252W와 FGFR3에서 S249C 사이의 링커 영역에서 아미노-산 치환은, FGF-유도된 신호전달 및 종양-세포 증식을 증대시키고 체세포 돌연변이에 대한 열점을 나타낸다 (Agazie, Y.M., Movilla, N., Ischenko, I., 및 Hayman, M.J. 2003. 포스포티로신 포스파타제 SHP2는 종양발생 섬유아세포 성장 인자 수용체 3에 의해 유도된 전환의 임계적 매개체이다. Oncogene 22:6909-6918; Ronchetti, D., Greco, A., Compasso, S., Colombo, G., Dell'Era, P., Otsuki, T., Lombardi, L., 및 Neri, A. 2001. Deregulated FGFR3 mutants in multiple myeloma cell lines with t(4;14): comparative analysis of Y373C, K650E and the novel G384D mutations. Oncogene 20:3553-3562). 활성화 돌연변이는 또한 FGFRs의 티로신 키나제 영역에서 발생한다 (Chesi, M., Brents, L.A., Ely, S.A., Bais, C., Robbiani, D.F., Mesri, E.A., Kuehl, W.M., 및 Bergsagel, P.L. 2001. 활성화된 섬유아세포 성장 인자 수용체 3은 다발성 골수종에서 종양 진행에 기여하는 종양유전자이다. Blood 97:729-736).
FGF-FGFR 경로의 표적화는 암 약물 개발을 위하여 집중의 주요 영역이었다. 상기 노력은 소-분자 티로신 키나제 저해제 (TKIs), 블록킹 항체, 뿐만 아니라 리간드 트랩을 포함하였다 (Moreau, P., Facon, T., Leleu, X., Morineau, N., Huyghe, P., Harousseau, J.L., Bataille, R., 및 Avet-Loiseau, H. 2002. 재발성 14q32 전좌는 특히 집중 화학요법을 받는 환자에서 다발성 골수종의 예측을 결정한다. Blood 100:1579-1583). 현재의 높은-효력 FGFR TKIs는, 그의 치료적 윈도우에 영향을 끼칠 수 있는, 상이한 FGFRs에 대하여 제한된 선택성을 갖는다 (Moreau, P., Facon, T., Leleu, X., Morineau, N., Huyghe, P., Harousseau, J.L., Bataille, R., 및 Avet-Loiseau, H. 2002. 재발성 14q32 전좌는 특히 집중 화학요법을 받는 환자에서 다발성 골수종의 예측을 결정한다. Blood 100:1579-1583). 예를 들어, FGFR1 및 보조-수용체 클로토β의 헤테로-복합체를 통한 FGF23 신호전달의 파괴는 환자에서 과인산염혈증 및 조직 석회화를 초래할 수 있고 (Plowright, E.E., Li, Z., Bergsagel, P.L., Chesi, M., Barber, D.L., Branch, D.R., Hawley, R.G., 및 Stewart, A.K. 2000. 섬유아세포 성장 인자 수용체 3의 이소성 발현은 골수종 세포 증식을 촉진시키고 세포자멸사를 예방한다. Blood 95:992-998; Chen, J., Williams, I.R., Lee, B.H., Duclos, N., Huntly, B.J., Donoghue, D.J., 및 Gilliland, D.G. 2005. Constitutively activated FGFR3 mutants signal through PLCgamma-dependent and -independent pathways for hematopoietic transformation. Blood 106:328-337), 반면에 클로토β와 FGFR4 헤테로-복합체를 통한 FGF19 신호전달의 봉쇄는 담즙 산 대사를 방해할 수 있다 (Li, Z., Zhu, Y.X., Plowright, E.E., Bergsagel, P.L., Chesi, M., Patterson, B., Hawley, T.S., Hawley, R.G., 및 Stewart, A.K. 2001. 골수종-관련된 종양유전자 섬유아세포 성장 인자 수용체 3은 조혈 세포에서 형질전환되고 있다. Blood 97:2413-2419). 더 많은 선택적 항체가, 하기를 포함하여, 개별 FGFRs를 통해 리간드 신호전달을 길항작용하기 위해 개발되었다: FGFR1 (Trudel, S., Ely, S., Farooqi, Y., Affer, M., Robbiani, D.F., Chesi, M., 및 Bergsagel, P.L. 2004. 섬유아세포 성장 인자 수용체 3의 저해는 t(4;14) 골수종에서 분화 및 세포자멸사를 유도한다. Blood 103:3521-3528), FGFR2 (Trudel, S., Li, Z.H., Wei, E., Wiesmann, M., Chang, H., Chen, C., Reece, D., Heise, C., 및 Stewart, A.K. 2005. CHIR-258, a novel, multitargeted tyrosine kinase inhibitor for the potential treatment of t(4;14) multiple myeloma. Blood 105:2941-2948) 및 FGFR3 (Chen, J., Lee, B.H., Williams, I.R., Kutok, J.L., Mitsiades, C.S., Duclos, N., Cohen, S., Adelsperger, J., Okabe, R., Coburn, A., 등 2005. FGFR3 as a therapeutic target of the small molecule inhibitor PKC412 in hematopoietic malignancies. Oncogene 24:8259-8267). 그러나, 1 초과 FGFR을 인식하는 항체는 아직 보고되지 않았다.
이전에 기재된 단일특이적 항-FGFR3 항체 R3Mab는 야생형 FGFR3의 모든 IIIb 및 IIIc 동형체, 뿐만 아니라 FGFR3의 특정 암-관련된 돌연변이체 형태에 FGF1 및 FGF9의 결합을 효과적으로 블록킹한다 (Chen, J., Lee, B.H., Williams, I.R., Kutok, J.L., Mitsiades, C.S., Duclos, N., Cohen, S., Adelsperger, J., Okabe, R., Coburn, A., 등 2005. FGFR3 as a therapeutic target of the small molecule inhibitor PKC412 in hematopoietic malignancies. Oncogene 24:8259-8267; Paterson, J.L., Li, Z., Wen, X.Y., Masih-Khan, E., Chang, H., Pollett, J.B., Trudel, S., 및 Stewart, A.K. 2004. Preclinical studies of fibroblast growth factor receptor 3 as a therapeutic target in multiple myeloma. Br J Haematol 124:595-603). X-선 구조적 분석은 R3Mab가 리간드 결합에 요구되는 FGFR3에서 특이적 에피토프에 결합한다는 것을 드러냈다. R3Mab는 인간 방광암 및 다발성 골수종 종양 이종이식편에 대하여 마우스에서 강력한 항종양 활성을 표시하였다. 본 연구에서, 구조-유도된 파아지 디스플레이는 FGFR1 및 FGFR4를 아끼면서 FGFR3 및 FGFR2에 이중 특이성을 담지하는 유도체 항체에 R3Mab를 재-조작하기 위해 반복적으로 사용되었다. 상기 연구의 실제적 목적은 부가된 안전성 위험을 피하면서 모 분자의 것을 넘는 포텐셜 치료적 범위를 확장하는 것이었다. 재-조작된 항체는 시험관내 FGF-자극된 종양-세포 성장의 저해 및 생체내 인간 암 이종이식 과발현 FGFR2 또는 FGFR3에 대하여 유의미한 효능을 표시하였다.
본 발명은 본원에서, 예를 들면, FGFR2 및/또는 FGFR3의 발현 및/또는 활성, 예컨대 증가된 발현 및/또는 활성 또는 원하지 않는 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원에서, 예를 들면, FGFR2 및 FGFR3의 발현 및/또는 활성, 예컨대 증가된 발현 및/또는 활성 또는 원하지 않는 발현 및/또는 활성과 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방에 유용한 항-FGFR2/3 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 종양, 암, 및/또는 세포 증식성 질환을 치료하기 위해 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 및/또는 FGFR3의 검출 및/또는 단리, 예컨대 다양한 조직 및 세포 유형에서 FGFR3의 검출용 시약으로서 유용성을 찾는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 FGFR2 및 FGFR3의 검출 및/또는 단리, 예컨대 다양한 조직 및 세포 유형에서 FGFR2 및 FGFR3의 검출용 시약으로서 유용성을 찾는다.
본 발명은 추가로 항-FGFR2/3 항체, 및 항-FGFR2/3 항체를 인코딩한 폴리뉴클레오타이드의 이용 및 제조 방법을 제공한다.
일반적인 기술
본원에서 기재된 또는 참조된 기술 및 절차는 일반적으로 양호하게 이해되고 당해 분야의 숙련가에 의해 종래의 방법론, 예컨대, 예를 들어, 하기에 기재된 널리 이용된 방법론을 이용하여 통상적으로 이용된다: Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, 등 eds., (2003)); the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)).
정의
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 구성요소로부터 확인된 및 분리된 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염물질 구성요소는 항체에 대하여 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 (1) 로우리 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량% 초과 및 가장 바람직하게는 99 중량% 초과까지, (2) 스피닝 컵 서열분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 잔기를 수득하기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마씨 블루 또는, 바람직하게는, 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE (나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)에 의해 균질성까지 정제될 것이다. 항체의 천연 환경의 적어도 하나의 구성요소가 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 항체는 재조합 세포 내의 동소 항체를 포함한다. 통상적으로, 그러나, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
참조 항체와 "결합에 대하여 경쟁하는 항체"는 경쟁 검정에서 그의 항원에 대한 참조 항체의 결합을 50% 이상 만큼 블록킹하는 항체를 지칭하고, 반대로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 그의 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 만큼 블록킹한다. 예시적 경쟁 검정은 하기에 기재된다: "Antibodies", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
항체의 "클래스"는 그의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5 주요 클래스가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 몇 개의 이들은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
용어 "세포독성제"는 본원에서 사용된 바와 같이 세포성 기능을 저해 또는 예방 및/또는 세포 사망 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 방사성 동위원소 (예를 들면, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학치료제 또는 약물 (예를 들면, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알카로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로르암부실, 다우노루비신 또는 다른 개재 약물); 성장 저해된 제제; 효소 및 단편 이의 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 이들의 단편 및/또는 변이체를 포함하는, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 독소 예컨대 소분자 독소 또는 효소적으로 활성 독소; 및 아래 개시된 다양한 항종양 또는 항암 제제.
제제, 예를 들면, 약학적 제형의 "유효량"은, 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해, 필요한 기간 동안 및 복용량에서, 유효한 양을 지칭한다. 예를 들어, 및 비제한으로써, "유효량"은 질환 및/또는 장애의 증상을 완화, 최소화 및/또는 예방할 수 있는, 생존을 연장할 수 있고/있거나 질환 및/또는 장애의 재발까지 기간을 연장할 수 있는, 본원에서 개시된, 항체의 양을 지칭할 수 있다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체의 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 정의된 바와 같이 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 본원에서 사용된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같이 용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양액"은, 상기 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는, 통로의 수는 고려하지 않고 그로부터 유도된 1차 전환 세포 및 자손을 포함하는, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 내용물에서 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 그러나 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 전환 세포에서 스크리닝된 또는 선택된 경우 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에서 포함된다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 경우 "개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은, 비제한적으로, 사육된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 랫트)를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "모노클로날 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 포함한 개별 항체는 동일하고/하거나, 가능한 변이체 항체를 제외하고, 예를 들면, 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유한 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생한 동일한 에피토프를 결합시키고, 상기 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대하여 유도된 상이한 항체를 포함하는, 폴리클로날 항체 제제와 대조로, 모노클로날 항체 제제의 각 모노클로날 항체는 항원에서 단일 결정인자에 대하여 유도된다. 따라서, 조절제 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득됨에 따라 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 생산 요구로서 해석되지 않는다. 예를 들어, 현재 개시된 주제에 따라 사용되는 모노클로날 항체는, 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한 트랜스제닉 동물을 이용한 방법을 포함하여, 다양한 기술로 제조될 수 있고, 모노클로날 항체의 상기 제조 방법 및 다른 예시적 방법은 본원에서 기재된다.
"노출된 항체"는 이종성 모이어티 (예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사선표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 노출된 항체는 약학적 제형에서 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 가변 구조를 갖는 자연적으로 발생하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는, 디설파이드-결합되는 2 동일한 경쇄 및 2 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로사량체 당단백질이다. N- 부터 C-말단까지, 각 중쇄는, 또한 가변 중 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 불리는, 가변 영역 (VH), 그 다음 3 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N- 부터 C-말단까지, 각 경쇄는, 또한 가변 경 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 불리는, 가변 영역 (VL), 그 다음 불변 경 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는, 2 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 징후, 용법, 복용량, 투여, 조합 요법, 사용금지사유 및/또는 상기 치료 제품의 사용에 관한 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 제품의 상업적 패키지에 포함된 관례상 사용설명서를 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에서 통상적으로 관련되는 적어도 하나의 오염물질 핵산 분자로부터 확인된 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에서 발견된 형태 또는 셋팅과 다르다. 천연 세포에서 존재함에 따라 단리된 핵산 분자는 따라서 핵산 분자로부터 식별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는, 예를 들어, 핵산 분자가 천연 세포의 것과 상이한 염색체 위치인 핵산 (예를 들어, 항체 인코딩 핵산)을 통상적으로 발현시키는 세포에서 함유된 핵산 분자를 포함한다.
(특이적 항체, 예를 들면, 항-KLB 항체에 대한 참조를 포함한) "항체를 인코딩한 단리된 핵산"은, 단일 벡터 또는 분리 벡터에서 상기 핵산 분자(들), 및 숙주 세포내 하나 이상의 위치에서 존재한 상기 핵산 분자(들)을 포함하여, 하나 이상의 핵산 분자 인코딩 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)을 지칭한다.
용어 "카밧과 같이 가변 도메인 잔기 넘버링" 또는 "카밧과 같이 아미노산 위치 넘버링", 및 이의 변화는, 하기에서 항체의 편집의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). 상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축, 또는 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후 단일 아미노산 삽입 (카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후 삽입된 잔기 (예를 들면 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c, 등)을 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 "표준" 카밧 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 주어진 항체에 대하여 결정될 수 있다.
어구 "실질적으로 유사한", 또는 "실질적으로 동일한"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 수치 (일반적으로 본 발명의 항체와 관련된 것과 참조/비교측정기 항체와 관련된 다른 것) 사이에서 충분히 고도의 유사성을 나타내어 이로써 당해 분야의 숙련가가 상기 값 (예를 들면, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징의 맥락에서 거의 없는 또는 무 생물학적 및/또는 통계적 유의도인 것으로 2개의 값 사이에서 차이를 고려할 것이다. 상기 2개의 값 사이에서 차이는 참조/비교측정기 항체에 대한 값의 기능으로서 바람직하게는 약 50% 미만, 바람직하게는 약 40% 미만, 바람직하게는 약 30% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만이다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들면, 항체) 및 그의 결합 파트너 (예를 들면, 항원)의 단일 결합 부위에서 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍 (예를 들면, 항체 및 항원)의 구성원 사이에서 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 해리 상수 (Kd)에 의해 일반적으로 나타내질 수 있다. 바람직하게는 Kd는 1 x 10-7, 1 x10-8, 5 x 10-8, 1 x 10-9, 3 x 10-9, 5 x 10-9, 또는 심지어 1 x 10-10 또는 더 높은 친화도이다. 친화도는, 본원에서 기재된 것을 포함하여, 당해 기술에서 공지된 공통의 방법에 의해 측정될 수 있다. 낮은-친화도 항체는 일반적으로 서서히 항원을 결합시키고 쉽게 해리시키는 경향이 있고, 반면에 높은-친화도 항체는 일반적으로 더 빨리 항원을 결합시키고 더 오래 결합되어 있다. 결합 친화도의 다양한 측정 방법은 당해 기술에 공지되어 있고, 이들 중 어떤 것은 본 발명의 목적을 위하여 사용될 수 있다. 특이적 예시적인 구현예는 하기에 기재된다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 "Kd" 또는 "Kd 값"은, 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 (125I)-표지된 항원의 최소 농도로 Fab 평형화, 그 다음 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 결합된 항원의 포착에 의해 항원에 대한 Fabs의 용액 결합 친화도를 측정하는 하기 검정에 의해 기재된 바와 같이 당해 항체 및 그의 항원의 Fab 버전으로 수행된 방사선표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다 (Chen, 등, (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). 검정용 조건을 확립하기 위해, 미세적정 플레이트 (Dynex)는 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)내 포착 항-Fab 항체 (Cappel Labs)의 5 μg/ml으로 밤새 코팅되고, 그 뒤에 실온에서 (대략 23℃) 2 내지 5 시간 동안 PBS내 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 블록킹된다. 비-흡착 플레이트 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원은 당해 Fab의 연속 희석으로 혼합된다 (예를 들면, 하기에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치됨: Presta 등, (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). 당해 Fab는 그 다음 밤새 인큐베이션되지만; 그러나, 인큐베이션은 평형이 달성되는지를 확인하기 위해 더 긴 기간 (예를 들면, 65 시간) 동안 계속할 수 있다. 그 후에, 혼합물은 (예를 들면, 1 시간 동안) 실온에서 인큐베이션용 포착 플레이트에 이동된다. 용액은 그 다음 제거되고 플레이트는 PBS내 0.1% Tween-20으로 8회 세정된다. 플레이트가 건조된 경우, 섬광기 (MicroScint-20; Packard)의 150 μl/웰이 부가되고, 플레이트는 10 분 동안 Topcount 감마 계수기 (Packard)에서 계수된다. 최대 결합의 20% 미만 또는 등등을 제공하는 각 Fab의 농도는 경쟁적 결합 검정에서 사용을 위하여 선택된다. 또 다른 구현예에 따라 Kd 또는 Kd 값은 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 BIAcoreTM-2000 또는 a BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 검정을 이용함으로써 측정된다. 간단히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)은 공급자의 사용설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화된다. 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성하기 위해 5 μl/분의 유량으로 주사 이전 항원은 5 μg/ml (~0.2 μM)에 10mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 희석된다. 항원의 주사 이후, 1M 에탄올아민은 미반응된 그룹을 블록킹하기 위해 주사된다. 동력학 측정을 위하여, Fab의 2-배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)이 대략 25 μl/분의 유량으로 25 ℃에서 0.05% Tween 20 (PBST)으로 PBS에 주사된다. 일부 구현예에서, 하기 변형은 표면 플라즈몬 공명 검정 방법에 사용된다: 항체는 대략 400 RU를 달성하기 위해 CM5 바이오센서 칩에 고정되고, 동력학 측정을 위하여, (67 nM부터 시작하는) 표적 단백질 (예를 들면, FGFR3-IIIb 또는 -IIIc)의 2-배 연속 희석액은 약 30 ul/분의 유량으로 25 ℃에서 PBST 버퍼에 주사된다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 회합 및 해리 센서그램의 동시 적합화에 의해 단순 일대일 랑뮤어 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon로서 계산된다. 참고, 예를 들면, Chen, Y., 등, (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. 만일 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 S- 1를 초과하면, 온-레이트는 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광분석기 (Aviv Instruments) 또는 교반 적색 큐벳을 가진 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광측정기 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS, pH 7.2에서 20nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25 ℃에서 형광 방출 세기 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광성 켄칭 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 "온-레이트" 또는 "회합의 속도" 또는 "회합 속도" 또는 "kon"는 또한 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25 ℃에서 BIAcoreTM-2000 또는 BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하여 상기 기재된 동일한 표면 플라즈몬 공명 기술로 결정될 수 있다. 간단히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)은 공급자의 사용설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시석신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 커플링된 단백질의 대략 10 반응 단위 (RU)를 달성하기 위해 5 μl/분의 유량으로 주사 이전 5 μg/ml (~0.2uM)에 10mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 희석된다. 항원의 주사 이후, 1M 에탄올아민은 미반응된 그룹을 블록킹하기 위해 주사된다. 동력학 측정을 위하여, Fab의 2-배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)은 대략 25 μl/분의 유량으로 25 ℃에서 0.05% Tween 20 (PBST)으로 PBS에 주사된다. 일부 구현예에서, 하기 변형은 표면 플라즈몬 공명 검정 방법에 사용된다: 항체는 대략 400 RU를 달성하기 위해 CM5 바이오센서 칩에 고정되고, 동력학 측정을 위하여, (67 nM부터 시작하는) 표적 단백질 (예를 들면, FGFR3-IIIb 또는 -IIIc)의 2-배 연속 희석액은 약 30 ul/분의 유량으로 25 ℃에서 PBST 버퍼에 주사된다. 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 회합 및 해리 센서그램의 동시 적합화에 의해 단순 일대일 랑뮤어 결합 모델 (BIAcore 평가 소프트웨어 버전 3.2)를 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (Kd)는 비 koff/kon로서 계산된다. 참고, 예를 들면, Chen, Y., 등, (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. 그러나, 만일 온-레이트가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 106 M-1 S- 1를 초과하면, 온-레이트는 분광기, 예컨대 정지-유동 구비된 분광분석기 (Aviv Instruments) 또는 교반 적색 큐벳을 가진 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광측정기 (ThermoSpectronic)에서 측정된 바와 같이 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS, pH 7.2에서 20nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25 ℃에서 형광 방출 세기 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역통과)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광성 켄칭 기술을 이용함으로써 바람직하게는 결정된다.
용어 "벡터"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은, 추가의 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 지칭하는, "플라스미드"이고, 벡터의 또 다른 유형은 파아지 벡터이다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이고, 여기에서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다 (예를 들면, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그렇게 함으로써 숙주 게놈을 따라 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 그와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 단순히, "재조합 벡터")로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용성의 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용된 형태임에 따라 상호교환적으로 사용될 수 있다.
"폴리뉴클레오타이드", 또는 "핵산"은, 본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같이, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해, 또는 합성 반응에 의해 폴리머에 편입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 이전 또는 이후 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 방해될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 합성 이후, 예컨대 표지를 이용한 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 변형의 다른 유형은, 예를 들어, "캡스", 하나 이상의 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드의 유사체로의 치환, 뉴클레오타이드간 변형 예컨대, 예를 들어, 미하전된 연결기 (예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트, 등)을 갖는 것 및 하전된 연결기 (예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등)을 갖는 것, 현수 모이어티, 예컨대, 예를 들어, 단백질 (예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, ply-L-라이신, 등)을 함유하는 것, 삽입제 (예를 들면, 아크리딘, 소랄렌, 등)을 갖는 것, 킬레이터 (예를 들면, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화적 금속, 등)을 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결기 (예를 들면, 알파 아노머성 핵산, 등)을 갖는 것, 뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드(들)의 비변형된 형태를 포함한다. 추가로, 당류에 존재하는 임의의 하이드록실기는 통상적으로, 예를 들어, 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 대체될 수 있거나, 표준 보호기에 의해 보호될 수 있거나, 또는 추가의 뉴클레오타이드에 추가의 연결기를 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고형 또는 반-고형 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 1 내지 20 탄소 원자의 아민 또는 유기 캡핑기 모이어티로 포스포릴화 또는 치환될 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호기에 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한, 예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보오스, 카보사이클릭 당 유사체, 알파-아노머성 당, 에피머 당류 예컨대 아라비노오스, 자일로스 또는 릭소스, 파이라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 염기성 뉴클레오사이드 유사체 예컨대 메틸 리보사이드를 포함하여, 당해 기술에서 일반적으로 공지된 리보오스 또는 데옥시리보스 당류의 비슷한 형태를 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결기는 대안적인 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결기는, 비제한적으로, 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)또는', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기에서 각 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 에테르 (-O-) 연결, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄딜을 임의로 함유하는 치환된 또는 비치환된 알킬 (1-C)이다)에 의해 대체되는 구현예를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드에서 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 이전의 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여 본원에서 참조된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용한다.
"올리고뉴클레오타이드"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로, 비필연적으로, 약 200 뉴클레오타이드 미만 길이인 짧은, 일반적으로 단일가닥, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오타이드를 일반적으로 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오타이드에 대하여 상기 설명은 올리고뉴클레오타이드에 동등하게 및 완전히 적용가능하다.
펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열에 관한 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요하면, 서열의 정렬 및 갭의 도입 이후, 및 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환의 고려 없이, 특이적 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열내 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열내 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성의 결정을 위한 정렬은 당해 기술내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공공연하게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는, 비교된 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 평가를 위하여 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 본원에서 목적으로, 그러나, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성되고, 여기에서 ALIGN-2 프로그램용 완벽한 소스 코드는 아래 차트에서 제공된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 만들어졌고 소스 코드는 미국 저작권국, Washington D.C., 20559에서 사용자 문서로 출원되었고, 여기에서 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되었다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California를 통해 공공연하게 이용가능하거나 또는, 예를 들면, WO2007/001851에서 제공된 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용을 위하여 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 수정하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 이용된 상황에서, (주어진 아미노산 서열 B에, 상기와, 또는 상기에 대해 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖는 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 대안적으로 표현될 수 있는) 주어진 아미노산 서열 B에, 상기와, 또는 상기에 대해 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성은 아래와 같이 계산된다:
100 곱하기 분획 X/Y
(여기에서 X는 A 및 B의 그 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일한 매치로서 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않고, A 대 B의 % 아미노산 서열 동일성이 B 대 A의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 인정될 것이다.
일부 구현예에서, 2 이상 아미노산 서열은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 2 이상 아미노산 서열은 적어도 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 심지어 100% 동일하다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 직전 단락에서 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "FGFR3"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 특이적으로 또는 문맥적으로 달리 지시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연 또는 합성이든) FGFR3 폴리펩타이드 (예를 들면, FGFR3-IIIb 동형체 또는 FGFR3-IIIc 동형체)를 지칭한다. 용어 "천연 서열"은 특이적으로 자연적으로 발생하는 절단된 형태 (예를 들면, 세포외 도메인 서열 또는 막통과 서브유닛 서열), 자연적으로 발생하는 변이체 형태 (예를 들면, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연적으로-발생하는 대립형질 변이체를 포함한다. 용어 "야생형 FGFR3"은 일반적으로 자연적으로 발생하는 FGFR3 단백질의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "야생형 FGFR3 서열"은 일반적으로 자연적으로 발생하는 FGFR3에서 발견된 아미노산 서열을 지칭한다.
용어 "FGFR3 리간드" (상호교환적으로 일명 "FGF")는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특이적으로 또는 문맥적으로 달리 지시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연 또는 합성이든) FGFR3 리간드 (예를 들어, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17, FGF18, FGF23) 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "천연 서열"은 특이적으로 자연적으로 발생하는 절단된 형태 (예를 들면, 세포외 도메인 서열 또는 막통과 서브유닛 서열), 자연적으로 발생하는 변이체 형태 (예를 들면, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연적으로-발생하는 대립형질 변이체를 포함한다. 용어 "야생형 FGFR3 리간드"는 일반적으로 자연적으로 발생하는 FGFR3 리간드 단백질의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "야생형 FGFR3 리간드 서열"은 일반적으로 자연적으로 발생하는 FGFR3 리간드에서 발견된 아미노산 서열을 지칭한다.
용어 "FGFR3 활성화"는 FGFR3 수용체의 활성화, 또는 포스포릴화를 지칭한다. 일반적으로, FGFR3 활성화는 (예를 들면 FGFR3 또는 기질 폴리펩타이드에서 FGFR3 수용체 포스포릴화 티로신 잔기의 세포내 키나제 도메인에 의해 야기된) 신호 전달을 초래한다. FGFR3 활성화는 당해 FGFR3 수용체의 FGFR 리간드 결합에 의해 매개될 수 있다. FGFR3에 FGFR3 리간드 (예를 들면, 예컨대 FGF1 또는 FGF9) 결합은 FGFR3의 키나제 도메인을 활성화시킬 수 있고 그렇게 함으로써 FGFR3에서 티로신 잔기의 포스포릴화 및/또는 추가의 기질 폴리펩타이드(들)에서 티로신 잔기의 포스포릴화를 초래할 수 있다.
용어 "FGFR2"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특이적으로 또는 문맥적으로 달리 지시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연 또는 합성이든) FGFR2 폴리펩타이드 (예를 들면, FGFR2-IIIb 동형체 또는 FGFR2-IIIc 동형체)를 지칭한다. 용어 "천연 서열"은 특이적으로 자연적으로 발생하는 절단된 형태 (예를 들면, 세포외 도메인 서열 또는 막통과 서브유닛 서열), 자연적으로 발생하는 변이체 형태 (예를 들면, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연적으로-발생하는 대립형질 변이체를 포함한다. 용어 "야생형 FGFR2"는 일반적으로 자연적으로 발생하는 FGFR2 단백질의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "야생형 FGFR2 서열"은 일반적으로 자연적으로 발생하는 FGFR2에서 발견된 아미노산 서열을 지칭한다.
용어 "FGFR2 리간드" (상호교환적으로 일명 "FGF2")는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특이적으로 또는 문맥적으로 달리 지시되지 않는 한, 임의의 천연 또는 변이체 (천연 또는 합성이든) FGFR2 리간드를 지칭한다. 용어 "천연 서열"은 특이적으로 자연적으로 발생하는 절단된 형태 (예를 들면, 세포외 도메인 서열 또는 막통과 서브유닛 서열), 자연적으로 발생하는 변이체 형태 (예를 들면, 대안적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연적으로-발생하는 대립형질 변이체를 포함한다. 용어 "야생형 FGFR2 리간드"는 일반적으로 자연적으로 발생하는 FGFR2 리간드 단백질의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩타이드를 지칭한다. 용어 "야생형 FGFR2 리간드 서열"은 일반적으로 자연적으로 발생하는 FGFR2 리간드에서 발견된 아미노산 서열을 지칭한다.
용어 "FGFR2 활성화"는 FGFR2 수용체의 활성화, 또는 포스포릴화를 지칭한다. FGFR2 활성화는 당해 FGFR2 수용체에 FGFR 리간드 결합에 의해 매개될 수 있다. FGFR2에 FGFR2 리간드 결합은 FGFR2의 키나제 도메인을 활성화시킬 수 있고 그렇게 함으로써 FGFR2에서 티로신 잔기의 포스포릴화 및/또는 추가의 기질 폴리펩타이드(들)에서 티로신 잔기의 포스포릴화를 초래할 수 있다.
용어 "FGFR2/3 항체"는 FGFR2 및 FGFR3에 결합하는 이중-특이적 항체를 지칭한다. FGFR2/3 항체의 비제한 예는 본원에서 기재된 바와 같이 이중 특이적 모노클로노알 항체 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12를 포함한다. 용어 FGFR2/3 및 "FGFR 2 및 FGFR3" 및 "FGFR3 및 FGFR2"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "구성적"은 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어 수용체 키나제 활성에 적용된 경우, 리간드 또는 다른 활성화 분자의 존재에 의존적이지 않은 수용체의 계속되는 신호전달 활성을 지칭한다. 수용체의 성질에 따라, 모든 활성은 구성적일 수 있거나 또는 수용체의 활성은 다른 분자 (예를 들면 리간드)의 결합에 의해 추가로 활성화될 수 있다. 수용체의 활성화를 초래하는 세포성 사례는 당해 분야의 숙련가 사이에 잘 알려진다. 예를 들어, 활성화는 고차 수용체 복합체에 올리고머화, 예를 들면, 이량체화, 삼량체화, 등을 포함할 수 있다. 복합체는 단백질의 단일 종, 즉, 동종체성 복합체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 복합체는 적어도 2 상이한 단백질 종, 즉, 헤테로머 복합체를 포함할 수 있다. 복합체 형성은, 예를 들어, 세포의 표면에서 수용체의 정상 또는 돌연변이체 형태의 과발현에 의해 야기될 수 있다. 복합체 형성은 또한 특이적 돌연변이 또는 수용체에서 돌연변이에 의해 야기될 수 있다.
용어 "리간드-독립적"은 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어 수용체 신호전달 활성에 적용된 경우, 리간드의 존재에 의존하지 않는 신호전달 활성을 지칭한다. 리간드-독립적 키나제 활성을 갖는 수용체는 키나제 활성의 추가의 활성화를 생산하기 위해 그 수용체에 리간드의 결합을 필연적으로 배제하지 않을 것이다.
용어 "리간드-의존적"은 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들어 수용체 신호전달 활성에 적용된 경우, 리간드의 존재에 의존하는 신호전달 활성을 지칭한다.
어구 "유전자 증폭"은 유전자 또는 유전자 단편의 다중 복사본이 특정한 세포 또는 세포주에서 형성되는 공정을 지칭한다. 복제된 영역 (증폭된 DNA의 범위)은 종종 "앰플리콘"으로 지칭된다. 보통, 생산된 메신저 RNA (mRNA)의 양, 즉, 유전자 발현의 수준은, 또한 발현된 특정한 유전자로 만들어진 복사본의 수의 분율을 증가시킨다.
"티로신 키나제 저해제"는 티로신 키나제 예컨대 FGFR2 및 FGFR3 수용체의 티로신 키나제 활성을 어느 정도 저해하는 분자이다.
"FGFR3 발현, 증폭, 또는 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR3을 발현하는 (과발현하는 포함), 증폭된 FGFR3 유전자를 갖는, 및/또는 FGFR3의 활성화 또는 포스포릴화를 달리 입증하는 것이다. "FGFR2 발현, 증폭, 또는 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2를 발현하는 (과발현하는 포함), 증폭된 FGFR2 유전자를 갖는, 및/또는 FGFR2의 활성화 또는 포스포릴화를 달리 입증하는 것이다. "FGFR2/3 발현, 증폭, 또는 활성화를 표현하는" 또는 "FGFR2 및 FGFR3 발현, 증폭, 또는 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2 및 FGFR3을 발현하는 (과발현하는 포함), FGFR2 및 FGFR3 유전자를 갖는, 및/또는 FGFR2 및 FGFR3의 활성화 또는 포스포릴화를 달리 입증하는 것이다.
"클로토-베타", "KLB" 및 "베타-클로토"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 마우스 및 랫트)를 포함하여, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 천연 베타-클로토를 지칭한다. 용어는 세포내 가공에서 비롯하는 "전장", 미가공된 KLB 뿐만 아니라 임의의 형태의 KLB를 포함한다. 용어는 또한 KLB의 자연적으로 발생하는 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포함한다. 신호 서열을 제외하고, 본 개시내용의 항체에 의해 표적화된 인간 KLB 아미노산 서열의 비제한 예는 아래와 같다:
FSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDGKG
PSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIV
TVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFN
DYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGH
NLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVS
VLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFK
PLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIY
MMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQK
ERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQ
FSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHY
RFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGL
PEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGN
DTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHW
RAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRL
LKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWG
VRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDK
VRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQT
QENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPL
KKGKRVVS (서열식별번호: 233).
특정 구현예에서, KLB 단백질은 하기 아미노산 서열을 갖는 N-말단 신호 서열을 포함할 수 있다:
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTG (서열식별번호: 234).
용어 "KLB의 C-말단 도메인"은 KLB의 카복시-말단 글리코시다아제-유사 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 서열식별번호: 233에서 보여진 예시적 KLB 단백질의 C-말단 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함한다:
FPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQC
TDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGL
KLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKL
WITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLH
ADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLS
SSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLS
SPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQE
VLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENS
SSR (서열식별번호: 235).
용어 "항-KLB 항체" 및 "KLB에 결합하는 항체"는 충분한 친화도를 갖는 KLB를 결합시킬 수 있는 항체를 지칭하고 이로써 항체는 KLB의 표적화에에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하다. 하나의 구현예에서, 관련없는, 비-KLB 단백질에 항-KLB 항체의 결합의 정도는, 예를 들면, 방사선면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 KLB에 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, KLB에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항-KLB 항체는 상이한 종으로부터 KLB 사이에 보존되는 KLB의 에피토프에 결합한다. 특정 구현예에서, 항-KLB 항체는 단백질의 C-말단 부분에 있는 KLB에서 에피토프에 결합한다.
용어 "약학적 제형"은, 거기에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성을 유효하도록 허용하기 위한 그와 같은 형태인, 및 제형이 투여될 대상체에 허용할 수 없게 독성인 추가의 구성요소를 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용가능한 캐리어"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에 비독성인, 활성 성분 이외의, 약학적 제형내 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 캐리어는, 비제한적으로, 버퍼, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변화 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")은 개체의 자연스러운 과정을 변경하기 위한 시도로 임상 개입을 지칭하고, 예방을 위하여 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는, 비제한적으로, 질환의 발생 또는 재발, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리적 결과의 약화, 전이의 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 완화 또는 일시적 처방, 및 차도 또는 개선된 예측을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 항체는 질환의 발병을 지연시키기 위해 또는 질환의 진행을 저속화하기 위해 사용될 수 있다. "치료"는 모든 치료 처치 및 예방적 또는 예방적 조치를 지칭한다. FGFR2/3 항체에 관련함에 따라, 치료가 필요한 것은 양성, 전-암성, 또는 비-전이성 종양을 이미 갖는 것 뿐만 아니라 암의 발생 또는 재발이 예방되는 것을 포함한다.
"FGFR3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR3의 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 (예를 들면 ELISA에 의한 FGFR3 포스포릴화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "FGFR2 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2의 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "FGFR2 및 FGFR3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2 및 FGFR3의 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"구성적 FGFR3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR3의 구성적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 (예를 들면 ELISA에 의한 c-FGFR3 포스포릴화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "구성적 FGFR2 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2의 구성적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "구성적 FGFR2 및 FGFR3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2 및 FGFR3의 구성적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"FGFR3 증폭을 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, 증폭된 FGFR3 유전자를 갖는 것이다. "FGFR2 증폭을 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, 증폭된 FGFR2 유전자를 갖는 것이다. "FGFR2 및 FGFR3 증폭을 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, 증폭된 FGFR2 및 FGFR3 유전자를 갖는 것이다.
"FGFR3 전좌를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, 전좌된 FGFR3 유전자를 갖는 것이다. FGFR3 전좌의 예는, 일부 다발성 골수종 종양에서 발생하는, t(4;14) 전좌이다. "FGFR2 전좌를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, 전좌된 FGFR2 유전자를 갖는 것이다. "FGFR2 및 FGFR3 전좌를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, 전좌된 FGFR2 및 FGFR3 유전자를 갖는 것이다.
"포스포-ELISA 검정"은 본원에서 하나 이상의 FGFR (예를 들면 FGFR2 및 FGFR3), 기질 또는 다운스트림 신호전달 분자의 포스포릴화가 포스포릴화된 FGFR (예를 들면 FGFR2 및 FGFR3), 기질, 또는 다운스트림 신호전달 분자를 검출하기 위해 시약, 보통 항체를 이용하여 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에서 평가되는 검정이다. 일부 구현예에서, 포스포릴화된 FGFR2, FGFR3, 또는 pMAPK를 검출하는 항체가 사용된다. 특정 구현예에서, 포스포릴화된 FGFR2 및 FGFR3을 검출하는 항체가 사용된다. 검정은 세포 용해물에서, 바람직하게는 신선한 또는 냉동된 생물학적 샘플로부터 수행될 수 있다.
"리간드-독립적 FGFR3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR3의 리간드-독립적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 (예를 들면 ELISA에 의한 FGFR3 포스포릴화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "리간드-독립적 FGFR2 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2의 리간드-독립적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "리간드-독립적 FGFR2/3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2 및 FGFR3의 리간드-독립적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"리간드-의존적 FGFR3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR3의 리간드-의존적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 (예를 들면 ELISA에 의한 FGFR3 포스포릴화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "리간드-의존적 FGFR2 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2의 리간드-의존적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "리간드-의존적 FGFR2/3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2/3의 리간드-의존적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"리간드-독립적 FGFR3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR3의 리간드-독립적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 (예를 들면 ELISA에 의한 FGFR3 포스포릴화를 측정함으로써) 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "리간드-독립적 FGFR2 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2의 리간드-독립적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다. "리간드-독립적 FGFR2/3 활성화를 표현하는" 암 또는 생물학적 샘플은, 진단 시험에서, FGFR2/3의 리간드-독립적 활성화 또는 포스포릴화를 입증하는 것이다. 그와 같은 활성화는 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
"FGFR3 과발현 또는 증폭"을 갖는 암 세포는 동일한 조직 유형의 비암성 세포와 비교된 FGFR3 단백질 또는 유전자의 유의미하게 더 높은 수준을 갖는 것이다. 그와 같은 과발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. FGFR3 과발현 또는 증폭은 (예를 들면 면역조직화학 검정; IHC를 통해) 세포의 표면상에 존재하는 FGFR3 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 검정에서 결정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 예를 들면 형광성 동소 하이브리드화 (FISH; 참고 WO98/45479, 1998년 10월 공개), 서던 블랏팅, 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해, 세포에서 FGFR3-인코딩 핵산의 수준을 평가할 수 있다. 상기 검정 이외에, 다양한 생체내 검정이 당업자에 이용가능하다. 예를 들어, 검출가능한 표지, 예를 들면 방사성 동위원소로 임의로 표지되는 항체에 환자의 신체 내에서 세포를 노출시킬 수 있고, 환자에서 세포에 항체의 결합은, 예를 들면 방사능용 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 이전에 노출된 환자로부터 얻은 생검 분석에 의해 평가될 수 있다.
"FGFR2 과발현 또는 증폭"을 갖는 암 세포는 동일한 조직 유형의 비암성 세포에 비교된 FGFR2 단백질 또는 유전자의 유의미하게 더 높은 수준을 갖는 것이다. 그와 같은 과발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. FGFR2 과발현 또는 증폭은 (예를 들면 면역조직화학 검정; IHC를 통해) 세포의 표면상에 존재하는 FGFR2 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 검정에서 결정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 예를 들면 형광성 동소 하이브리드화 (FISH; 참고 WO98/45479, 1998년 10월 공개), 서던 블랏팅, 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해, 세포에서 FGFR2-인코딩 핵산의 수준을 평가할 수 있다. 상기 검정 이외에, 다양한 생체내 검정이 당업자에 이용가능하다. 예를 들어, 검출가능한 표지, 예를 들면 방사성 동위원소로 임의로 표지되는 항체에 환자의 신체 내에서 세포를 노출시킬 수 있고, 환자에서 세포에 항체의 결합은, 예를 들면 방사능용 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 이전에 노출된 환자로부터 얻은 생검 분석에 의해 평가될 수 있다.
"FGFR2/3 과발현 또는 증폭"을 갖는 암 세포는 동일한 조직 유형의 비암성 세포에 비교된 FGFR2 및 FGFR3 단백질 또는 유전자의 유의미하게 더 높은 수준을 갖는 것이다. 그와 같은 과발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. FGFR2 및 FGFR3 과발현 또는 증폭은 (예를 들면 면역조직화학 검정; IHC를 통해) 세포의 표면상에 존재하는 FGFR2 및 FGFR3 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 검정에서 결정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 예를 들면 형광성 동소 하이브리드화 (FISH; 참고 WO98/45479, 1998년 10월 공개), 서던 블랏팅, 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해, 세포에서 FGFR2 및 FGFR3-인코딩 핵산의 수준을 평가할 수 있다. 상기 검정 이외에, 다양한 생체내 검정이 당업자에 이용가능하다. 예를 들어, 검출가능한 표지, 예를 들면 방사성 동위원소로 임의로 표지되는 항체에 환자의 신체 내에서 세포를 노출시킬 수 있고, 환자에서 세포에 항체의 결합은, 예를 들면 방사능용 외부 스캐닝에 의해 또는 항체에 이전에 노출된 환자로부터 얻은 생검 분석에 의해 평가될 수 있다.
용어 "돌연변이"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 야생형 단백질 또는 핵산, 각각에 비하여 특정한 단백질 또는 핵산 (유전자, RNA)의 아미노산 또는 핵산 서열에서의 차이를 의미한다. 돌연변이된 단백질 또는 핵산은 유전자의 하나의 대립유전자 (이종접합성) 또는 모든 대립유전자 (동종접합성)에서 발견될 수 있거나 또는 상기로부터 발현될 수 있고, 체세포 또는 생식 계열일 수 있다. 본 발명에서, 돌연변이는 일반적으로 체세포이다. 돌연변이는 서열 재배열 예컨대 삽입, 결실, 및 점 돌연변이 (단일 뉴클레오타이드/아미노산 다형성 포함)를 포함한다.
"저해하다"는 참조와 비교된 경우 활성, 기능, 및/또는 양을 감소 또는 축소하는 것이다.
제제가 당해 폴리펩타이드 (예를 들면, FGFR 리간드, 예컨대 FGF1 또는 FGF9)의 기능성 활성의 적어도 하나를 모방하는 경우 제제는 "작용제 활성 또는 기능"을 보유한다.
"작용제 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 당해 폴리펩타이드 (예를 들면, FGFR 리간드, 예컨대 FGF1 또는 FGF9)의 기능성 활성의 적어도 하나를 모방하는 항체이다.
단백질 "발현"은 유전자에서 인코딩된 정보의 메신저 RNA (mRNA)로 및 그 다음 단백질로의 전환을 지칭한다.
본원에서, 당해 단백질을 "발현하는" 샘플 또는 세포 (예컨대 FGF 수용체 또는 FGF 수용체 리간드)는 단백질을 인코딩한 mRNA, 또는 이의 단편을 포함한, 단백질이 샘플 또는 세포에서 제시되는 것으로 결정되는 것이다.
"면역접합체" (상호교환적으로 "항체-약물 콘주게이트", 또는 "ADC"로 지칭됨)는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학치료제, 약물, 성장 저해된 제제, 독소 (예를 들면, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사선접합체)에 접합된 항체를 의미한다.
용어 "Fc 영역"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 면역글로불린 중쇄의 C-말단 폴리펩타이드 서열을 포함한 이량체 복합체를 지칭하고, 여기에서 C-말단 폴리펩타이드 서열은 온전한 항체의 파파인 소화에 의해 수득가능한 것이다. Fc 영역은 천연 또는 변이체 Fc 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 서열의 경계가 다양할 수 있어도, 인간 IgG 중쇄 Fc 서열은 약 위치 Cys226, 또는 약 위치 Pro230에서 아미노산 잔기부터 Fc 서열의 카복실 말단까지 신장하는 것으로 보통 정의된다. 면역글로불린의 Fc 서열은 2 불변 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 일반적으로 포함하고, CH4 도메인을 임의로 포함한다. Fc 영역의 C-말단 라이신 (EU 넘버링 시스템에 따라 잔기 447)은, 예를 들어, 항체의 정제 동안 또는 항체를 인코딩한 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 Fc 영역을 갖는 항체를 포함한 조성물은, K447을 갖는, 모든 K447이 제거된, 또는 K447 잔기를 갖는 항체 및 갖지 않는 항체의 혼합물을 포함할 수 있다.
"Fc 폴리펩타이드"는 본원에서 Fc 영역을 구성하는 폴리펩타이드 중 하나를 의미한다. Fc 폴리펩타이드는 임의의 적합한 면역글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 (일반적으로 그의 N 말단에서) 야생형 힌지 서열의 일부 또는 전부를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 폴리펩타이드는 기능성 또는 야생형 힌지 서열을 포함하지 않는다.
"블록킹" 항체 또는 항체 "길항제"는 결합하는 항원의 생물학적 활성을 저해 또는 축소시키는 것이다. 바람직한 블록킹 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 완전히 저해시킨다.
"노출된 항체"는 이종성 분자, 예컨대 세포독성 모이어티 또는 방사선표지에 접합되지 않는 항체이다.
지정된 항체의 "생물학적 특징"을 갖는 항체는 동일한 항원에 결합하는 다른 항체와 구별하는 그 항체의 생물학적 특징 중 하나 이상을 보유하는 것이다.
당해 항체에 의해 결합된 항원에서 에피토프에 결합하는 항체를 위하여 스크리닝하기 위해, 예컨대 하기에 기재된 일상적인 크로스-블록킹 검정이 수행될 수 있다: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988).
본 발명의 아미노산 서열을 함유한 항체 또는 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들면, 미국 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이, 구제 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히 항체 단편)에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 구제 수용체 결합 에피토프를 인코딩한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩타이드 서열을 인코딩한 핵산에 인프레임 연결될 수 있어서 이로써 조작된 핵산 분자에 의해 발현된 융합 단백질이 본 발명의 구제 수용체 결합 에피토프 및 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자 (예를 들면, Ghetie 등, Ann. Rev. Immunol . 18:739-766 (2000), 표 1)의 생체 내 혈청 반감기를 책임지는 IgG 분자 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다. 이의 Fc 영역에서 치환 및 증가된 혈청 반감기를 갖는 항체는 또한 아래 기재된다: WO00/42072, WO 02/060919; Shields 등, J. Biol. Chem . 276:6591-6604 (2001); Hinton, 20 J. Biol . Chem . 279:6213-6216 (2004)). 또 다른 구현예에서, 혈청 반감기는, 예를 들어, 다른 폴리펩타이드 서열의 부착에 의해 또한 증가될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 유용한 항체 또는 다른 폴리펩타이드는 FcRn 수용체에 결합하는 혈청 알부민 또는 혈청 알부민의 부분 또는 혈청 알부민 결합 펩타이드에 부착될 수 있어서 이로써 혈청 알부민이 항체 또는 폴리펩타이드에 결합하고, 예를 들면, 상기 폴리펩타이드 서열은 WO01/45746에 개시된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 부착된 혈청 알부민 펩타이드는 DICLPRWGCLW (서열식별번호:183)의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fab의 반감기는 이들 방법에 의해 증가된다. 참고 또한, 혈청 알부민 결합 펩타이드 서열에 대하여 Dennis 등 J. Biol . Chem . 277:35035-35043 (2002).
"단편"은, 바람직하게는, 참조 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 전장의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 이상을 함유하는 폴리펩타이드 또는 핵산 분자의 부분을 의미한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 이상 뉴클레오타이드 또는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200 이상 아미노산을 함유할 수 있다.
본 발명의 항체에 관한 어구 "거의 없는 내지 무 작용제 기능"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들면, 대상체에 투여시, 항체가 작용제 활성의 생물학적으로 유의미한 양을 유도하지 않는 것을 의미한다. 당해 기술에서 이해될 바와 같이, 본 발명의 항체와 참조 대응물 사이의 비교가 실시되는 한, 활성의 양은 정량적으로 또는 정성적으로 결정될 수 있다. 활성은, 예를 들면, 본원에서 기재된 것을 포함하여, 당해 기술에서 공지된 임의의 검정 또는 기술에 따라 측정 또는 검출될 수 있다. 본 발명의 항체 및 그의 참조 대응물에 대한 활성의 양은 병렬적으로 또는 분리된 운영으로 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 2가 항체는 실질적인 작용제 기능을 보유하지 않는다.
용어 "세포자멸사" 및 "세포자멸적 활성"은 넓은 의미에서 사용되고, 하나 이상의 특징적인 세포 변화, 세포질의 농축, 원형질막 미세융모의 손실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 손실을 포함하는, 변화에 의해 전형적으로 동반되는 포유동물에서 세포 사망의 정돈된 또는 제어된 형태를 지칭한다. 상기 활성은 당해 기술에서 공지된 기술을 이용하여, 예를 들면, 세포 생존력 검정, FACS 분석 또는 DNA 전기영동에 의해, 및 더 구체적으로 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 소포 (세포자멸체)의 형성에 의해 결정 및 측정될 수 있다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미에서 상호교환적으로 사용되고 모노클로날 항체 (예를 들면, 전장 또는 온전한 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이중특이적 항체)를 포함하고 또한 (본원에서 더 상세히 기재된 바와 같이) 특정 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체는 인간, 인간화, 및/또는 친화도 성숙될 수 있다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중에 서열에서 광범위하게 상이하고 그의 특정한 항원에 대하여 각 특정한 항체의 결합 및 특이성에서 사용되는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전반에 고르게 분포되지 않는다. 경-쇄 및 중-쇄 가변 도메인 모두에서 상보성-결정 영역 (CDRs) 또는 초가변 영역으로 불리는 3 세그먼트에서 농축된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 (FR)로 불리운다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은, β-시트 입체배치를 주로 채택한, 3 CDRs에 의해 연결된, β-시트 구조를 연결하는, 및 일부 사례에서 이의 일부를 형성하는 루프를 형성하는 4개의 FR 영역을 포함한다. 각 쇄에서 CDRs은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄로부터 CDRs와 함께, 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (참고 Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에서 직접적으로 관여되지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체-의존적 세포성 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
항체의 파파인 소화는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 불리는, 2 동일한 항원-결합 단편, 및 잔류 "Fc" 단편을 생산하고, 이의 이름은 쉽게 결정화하기 위해 그의 능력을 반영한다. 펩신 치료는 2 항원-결합 부위를 갖는 F(ab')2 단편을 수득하고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있다.
"Fv"는 완벽한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 2-쇄 Fv 종에서, 상기 영역은 단단한, 비-공유 회합에서 1 중-쇄 및 1 경-쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-쇄 Fv 종에서, 1 중-쇄 및 1 경-쇄 가변 도메인은 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유 결합될 수 있어서 이로써 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서의 것과 비슷한 "이량체성" 구조에서 회합할 수 있다. 각 가변 도메인의 3 CDRs이 VH-VL 이량체의 표면에서 항원-결합 부위를 한정하기 위해 상호작용하는 것이 상기 입체배치내이다. 집합적으로, 6 CDRs는 항체에 항원-결합 특이성을 제공한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3 CDRs를 포함한 Fv의 절반)은, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서라도, 항원을 인식 및 결합할 능력을 갖는다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대하여 본원에서 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 이들 사이에서 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학 커플링이 또한 공지된다.
임의의 척추동물 종으로부터 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는, 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는, 2개의 명확히 상이한 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5개 주요 클래스가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 몇 개의 이들은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중-쇄 불변 도메인은 α, δ, ε, γ, 및 μ, 각각으로 불리운다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3-차원 입체배치는 잘 알려진다. "항체 단편"은 온전한 항체의 단지 부분을 포함하고, 여기에서 부분은 바람직하게는 온전한 항체에서 존재한 경우 그 부분과 정상적으로 관련된 기능의 적어도 하나, 바람직하게는 대부분 또는 모두를 보유한다. 항체 단편의 예는 하기를 포함한다: Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체. 하나의 구현예에서, 항체 단편은 온전한 항체의 항원 결합 부위를 포함하고 따라서 항원을 결합할 능력을 보유한다. 또 다른 구현예에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 것은, 온전한 항체에서 존재한 경우 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합 중 적어도 하나를 보유한다. 하나의 구현예에서, 항체 단편은 온전한 항체에 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 1가 항체이다. 예를 들면, 그와 같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 아암에서 포함할 수 있다.
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는, 본원에서 사용될 때 서열에서 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6 초가변 영역; VH에서 3 (H1, H2, H3), 및 VL에서 3 (L1, L2, L3)을 포함한다. 수많은 초가변 영역 기술은 사용 중이고 본원에서 포함된다. 카밧 상보성 결정 영역 (CDRs)은 서열 가변성에 기반되고 가장 통상적으로 사용된다 (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 초티아는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM 초가변 영역은 카밧 CDRs와 초티아 구조적 루프 사이에서 중간물을 나타내고, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" 초가변 영역은 이용가능한 복합체 결정 구조의 분석에 기반된다. 각각의 이들 초가변 영역으로부터 잔기는 아래 표시된다.
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초가변 영역은 "확장된 초가변 영역"을 아래와 같이 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 이들 정의에 대하여 카밧 등 싱기에 따라 넘버링되었다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
비-인간 (예를 들면, 쥣과) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라성 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수령체의 초가변 영역으로부터 잔기가 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 원하는 특이성, 친화도, 및 수용력을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 실시된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변성 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가 세부사항에 대하여, 참고 Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). 참고 또한 하기 검토 기사 및 본 명세서에서 인용된 참조문헌: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, "키메라성" 항체 (면역글로불린)은 특정한 종으로부터 유도된 또는 특정한 항체 부류 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일한 또는 상동성인 중쇄 및/또는 경쇄의 부분을 갖고, 반면에 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도된 또는 또 다른 항체 부류 또는 서브클래스에 속하는 항체, 뿐만 아니라 상기 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)). 본원에서 사용된 바와 같이 인간화된 항체는 키메라성 항체의 서브셋이다.
"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기에서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄에서 존재한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는 추가로 scFv를 항원 결합을 위하여 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 사이에서 폴리펩타이드 링커를 포함한다. scFv의 검토를 위하여 참고 Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
"항원"은 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 예정된 항원이다. 표적 항원은 폴리펩타이드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 다른 자연적으로 발생하는 또는 합성 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원은 폴리펩타이드이다.
용어 "디아바디"는 2 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하고, 여기에서 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 (VH - VL)에서 경-쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중-쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄에서 2 도메인 사이에 짝짓기를 허용하기에 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 강제로 짝짓기되고 2 항원-결합 부위를 창출한다. 디아바디는, 예를 들어, 하기에 더욱 완전히 기재된다: EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993).
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 및/또는 본원에서 개시된 바와 같이 인간 항체 제조용 임의의 기술을 이용하여 제조되는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함한 인간화된 항체를 특이적으로 제외한다.
"친화도 성숙된" 항체는, 상기 변경(들)을 보유하지 않은 모 항체와 비교된, 항원에 대하여 항체의 친화도에서 개선을 초래하는 이의 하나 이상의 CDRs에서 하나 이상의 변경을 갖는 것이다. 바람직한 친화도 성숙된 항체는 표적 항원에 대하여 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙된 항체는 당해 기술에 공지된 절차에 의해 생산된다. Marks 등 Bio/Technology 10:779-783 (1992)는 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의해 친화도 성숙을 기재한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 랜덤 돌연변이유발은 하기에 의해 기재된다: Barbas 등, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier 등, Gene 169:147-155 (1995); Yelton 등, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson 등, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); and Hawkins 등, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 아이소타입으로 다양하다. 항체 효과기 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
"항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들면, 자연 살해 (NK) 세포, 중성구, 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcRs) 상에 결합된 분비된 Ig가 이들 세포독성 효과기 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합시키고 그 뒤에 표적 세포를 세포독소로 사멸시키는 세포독성의 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "아암하고" 상기 사멸에 절대적으로 요구된다. ADCC 매개용 1차 세포, NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현시킨다. 조혈 세포에서 FcR 발현은 하기에 요약된다: 표 3, 464쪽, Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991). 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 Presta 미국 특허 번호 6,737,056에 기재된 시험관 내 ADCC 검정이 수행될 수 있다. 상기 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 당해 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면, 예컨대 하기에 개시된 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다: Clynes 등, PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현시키고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현시키고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 중성구를 포함하고; PBMCs 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 천연 공급원, 예를 들면, 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)를 결합하는 및, 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함하여, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는, 이의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIIB ("저해 수용체")를 포함한다.활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 저해 모티프 (ITIM)를 함유한다. (참고 검토 M. in Daeron, Annu . Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). FcRs는 하기에서 검토된다: Ravetch and Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel 등, Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas 등, J. Lab. Clin . Med. 126:330-41 (1995). 장래에 확인되는 것을 포함하는, 다른 FcRs는 본원에서 용어 "FcR"에 의해 포함된다. 용어는 또한, 태아에 모계 IgGs의 이동을 책임지는 (Guyer 등, J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim 등, J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성을 조절하는, 신생아 수용체, FcRn을 포함한다. WO 00/42072 (Presta)는 FcRs에 개선된 또는 줄어든 결합을 갖는 항체 변이체를 기재한다. 그 특허 공개의 내용은 본원에서 참고로 특이적으로 편입된다. 참고, 또한, Shields 등, J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001).
FcRn에 결합의 측정 방법은 공지된다 (참고, 예를 들면, Ghetie 1997, Hinton 2004).생체내 인간 FcRn에 결합 및 인간 FcRn 높은 친화도 결합 폴리펩타이드의 혈청 반감기는, 예를 들면, 트랜스제닉 마우스 또는 인간 FcRn을 발현하는 형질감염된 인간 세포주, 또는 Fc 변이체 폴리펩타이드로 투여된 영장류에서 분석될 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 그의 동족 항원에 결합되는 (적절한 서브클래스의) 항체에 보체 시스템의 제1 구성요소 (C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다: Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가된 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩타이드 변이체는 미국 특허 번호 6,194,551B1 및 WO 99/51642에 기재된다. 상기 특허 공개의 내용은 본원에서 참조로 특이적으로 편입된다. 참고, 또한, Idusogie 등, J. Immunol. 164:4178-4184 (2000).
용어 "Fc 영역-포함 폴리펩타이드"는, Fc 영역을 포함하는, 폴리펩타이드, 예컨대 항체 또는 면역부착소를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 라이신 (EU 넘버링 시스템에 따른 잔기 447)은, 예를 들어, 폴리펩타이드의 정제 동안 또는 폴리펩타이드를 인코딩한 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 Fc 영역을 갖는 폴리펩타이드를 포함한 조성물은 K447을 갖는 폴리펩타이드, 모든 K447이 제거된 폴리펩타이드, 또는 K447 잔기를 갖는 폴리펩타이드 및 잔기를 갖지 않는 폴리펩타이드의 혼합물을 포함한다.
본원에서 목적으로 "수용체 인간 프레임워크"는 인간 면역글로불린 프레임워크, 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유도된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함한 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유도된" 수용체 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 기존의 아미노산 변화가 존재한 경우, 바람직하게는 5 이하 및 바람직하게는 4 이하, 또는 3 이하 기존의 아미노산이 존재한다. 기존 아미노산 변화가 VH에서 존재하는 경우, 바람직하게는 상기 변화는 위치 71H, 73H, 및 78H의 단지 3, 2, 또는 1에서이고; 예를 들면, 상기 위치에서 아미노산 잔기는 71A, 73T, 및/또는 78A일 수 있다. 하나의 구현예에서, VL 수용체 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹부터이다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 카밧 등과 같이 하위그룹이다. 하나의 구현예에서, VL에 대하여, 하위그룹은 카밧 등과 같이 하위그룹 카파 I이다. 하나의 구현예에서, VH에 대하여, 하위그룹은 카밧 등과 같이 하위그룹 III이다.
"VH 하위그룹 III 공통 프레임워크"는 카밧 등의 가변 중 하위그룹 III에서 아미노산 서열로부터 수득된 공통 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, VH 하위그룹 III 공통 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열의 적어도 일 부분 또는 모두를 포함한다: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (서열식별번호: 95)-H1-WVRQAPGKGLEWV (서열식별번호: 96)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (서열식별번호: 97)-H3-WGQGTLVTVSS (서열식별번호: 98).
"VL 하위그룹 I 공통 프레임워크"는 카밧 등의 가변 경 카파 하위그룹 I에서 아미노산 서열로부터 수득된 공통 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, VL 하위그룹 I 공통 프레임워크 아미노산 서열은 각각의 하기 서열의 적어도 일 부분 또는 모두를 포함한다: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열식별번호: 99)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (서열식별번호:100)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (서열식별번호:101)-L3-FGQGTKVEIK (서열식별번호:102).
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 돌연변이체" 또는 "항체 변이체"는 항체의 아미노산 서열 변이체를 지칭하고 여기에서 종-의존적 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기는 변형된다. 상기 돌연변이체는 필연적으로 종-의존적 항체와 100% 미만 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 항체 돌연변이체는 종-의존적 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 상기 서열에 관한 동일성 또는 유사성은, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요하면, 서열 정렬 및 갭 도입 이후, 종-의존적 항체 잔기와 동일한 (즉, 동일한 잔기) 또는 유사한 (즉 공통의 측-쇄 특성에 기반된 동일한 기로부터 아미노산 잔기, 아래 참고) 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의된다. 가변 도메인의 밖에서 항체 서열에 N-말단, C-말단, 또는 내부 확대, 결실, 또는 삽입의 어떤 것도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 미치는 것으로 해석되지 않아야 한다
"장애" 또는 "질환"은 본 발명의 물질/분자 또는 방법으로 치료로부터 유익할 임의의 상태이다. 이는 문제의 질환에 포유동물을 취약하게 하는 상기 병태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본원에서 치료받는 장애의 비제한 예는 악성 및 양성 종양; 암종, 모세포종, 및 육종을 포함한다.
용어 "치료적 유효량"은 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 치료제의 양을 지칭한다. 암의 경우에서, 치료제의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고; 1차 종양 크기를 감소시킬 수 있고; 주변 기관에 암 세포 침윤을 저해할 수 있고 (즉, 어느 정도 저속화할 수 있고 바람직하게는 정지시킬 수 있고); 종양 전이를 저해할 수 있고 (즉, 어느 정도 저속화할 수 있고 바람직하게는 정지시킬 수 있고); 어느 정도 종양 성장을 저해할 수 있고; 및/또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있다. 약물이 성장을 예방 및/또는 현존하는 암 세포를 사멸시킬 정도까지, 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법에 대하여, 생체내 효능은, 예를 들어, 생존의 지속시간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 반응 속도 (RR), 반응의 지속시간, 및/또는 삶의 질을 평가함으로써 측정될 수 있다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장에 의해 전형적으로 특성화되는 포유동물에서 생리적 조건을 지칭하거나 또는 기재한다. 양성 및 악성 암이 상기 정의에 포함된다. "초기 단계 암" 또는 "초기 단계 종양"은 침습성 또는 전이성이 아닌 암을 의미하거나 또는 0, I, 또는 II 기 암으로서 분류된다. 암의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 암종, 림프종, 모세포종 (수모세포종 및 망막모세포종 포함), 육종 (지방육종 및 활막 세포 육종 포함), 신경내분비 종양 (카르시노이드 종양, 가스트린종, 및 소도 세포 암 포함), 중피종, 신경집종 (청신경종 포함), 수막종, 선암종, 흑색종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종양. 상기 암의 더욱 특정한 예는 하기를 포함한다: 편평상피 세포 암 (예를 들면 상피성 편평상피 세포 암), 소세포 폐암 (SCLC), 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐의 선암종 및 폐의 편평상피 암종을 포함한 폐암, 복막의 암, 간세포 암, 위장암을 포함한 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암 (전이성 유방암 포함), 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담관의 종양, 뿐만 아니라 머리 및 목 암 및 다발성 골수종.
용어 "전-암성"은 암에 전형적으로 선행하는 또는 발달하는 상태 또는 성장을 지칭한다. "전-암성" 성장은, 세포 사이클 조절, 세포성 증식, 또는 분화의 마커로서 결정될 수 있는, 비정상 세포 사이클 조절, 증식, 또는 분화에 의해 특성화되는 세포를 가질 것이다.
"이형성증"은 조직, 장기, 또는 세포의 임의의 비정상 성장 또는 발달을 의미한다. 바람직하게는, 이형성증은 높은 등급 또는 전암성이다.
"전이"는 신체내 그의 원발 부위부터 다른 위치까지 암의 확산을 의미한다. 암 세포는 1차 종양으로부터 중단할 수 있고, 림프 및 혈관에 침투할 수 있고, 혈류를 통해 순환할 수 있고, 신체내 다른 곳으로 정상 조직에서 원격 병소에서 성장할 수 있다 (전이할 수 있다). 전이는 국부 또는 원격일 수 있다. 전이는 순차적인 진행이고, 1차 종양으로부터 파괴하는 종양 세포에 의존하고, 혈류를 통해 움직이고, 그리고 원격 부위에서 정지한다. 신규 부위에서, 세포는 혈액 공급을 초래하고 생명을 위협하는 크기를 형성하도록 성장할 수 있다.
종양 세포 내의 모든 자극 및 저해 분자 경로는 상기 행동을 조절하고, 원격 부위에서 종양 세포와 숙주 세포 사이의 상호작용은 또한 유의미하다.
"비-전이성"은 양성인 또는 1차 부위에서 남아있고 원발 부위 이외의 조직 또는 림프 또는 혈관 시스템에 침투하지 않는 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 0, I, 또는 II 기 암인 임의의 암, 및 가끔 III 기 암이다.
"1차 종양" 또는 "1차 암"은 최초 암을 의미하고 대상체의 신체에서 또 다른 조직, 장기, 또는 위치에 위치한 전이성 병변을 의미하지 않는다.
"양성 종양" 또는 "양성 암"은 발단의 부위에서 국재화되어 있는 그리고 침투물에 수용력을 갖지 않는, 원격 부위에 침범하는, 또는 전이하는 종양을 의미한다.
"종양 부하"는 암 세포의 수, 종양의 크기, 또는 신체내 암의 양을 의미한다. 종양 부하는 또한 종량 세포양으로 지칭된다.
"종양 수"는 종양의 수를 의미한다.
"대상체"는, 비제한적으로, 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 소, 말, 갯과, 양, 또는 고양이를 포함한, 포유동물을 의미한다. 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
용어 "항-암 요법"은 암의 치료에 유용한 요법을 지칭한다. 항-암 치료제의 예는, 비제한적으로, 예를 들면, 하기를 포함한다: 화학치료제, 성장 저해된 제제, 세포독성제, 방사선 요법에서 사용된 제제, 항-혈관신생 제제, 세포자멸적 제제, 항-튜불린 제제, 및 암을 치료하기 위한 다른 제제, 항-CD20 항체, 혈소판 유도된 성장 인자 저해제 (예를 들면, Gleevec™ (이마티닙 메실레이트)), COX-2 저해제 (예를 들면, 셀레콕십), 인터페론, 사이토카인, 하나 이상의 하기 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들)에 결합하는 길항제 (예를 들면, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성 및 유기 화학 제제, 등. 이들의 조합이 또한 본 발명에 포함된다.
"화학치료제"는 암의 치료에서 유용한 화합물이다. 화학치료제의 예는 암의 치료에서 유용한 화합물이다. 화학치료제의 예는 하기를 포함한다: 알킬화제 예컨대 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로스포스파마이드; 알킬 설포네이트 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에티일렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 나이트로수레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님무스틴; 항생제 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들면, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (참고, 예를 들면, Agnew, Chem Intl . Ed. Engl ., 33: 183-186 (1994)); 다이네마이신 A를 포함한, 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신 (모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레벌린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소크산트론; 포도필린산; 2- 에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK® 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 라이족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면, TAXOL® 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), 파클리탁셀의 ABRAXANETM 크레모포어 없는, 알부민-조작된 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), 및 TAXOTERE® 독세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; GEMZAR® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴; NAVELBINE® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 데다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르, CPT-11) (5-FU 및 류코보린을 갖는 이리노테칸의 치료 레지멘 포함); 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메티일오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; VELCADE 보르테조밉; REVLIMID 레날리도마이드; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 치료 레지멘 (FOLFOX)을 포함한, 옥살리플라틴; 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR (예를 들면, 에를로티닙 (TarcevaTM)) 및 VEGF-A의 저해제 및 상기 중 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
예를 들어, 하기를 포함하는, 종양에서 호르몬 작용을 조절 또는 저해하도록 작용하는 항-호르몬제 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절물질 (SERMs)이 상기 정의에서 또한 포함된다: 타목시펜 (NOLVADEX® 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케녹시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON·토레미펜; 부신에서 에스트로겐 생산을 조절하는, 효소 방향화효소를 저해하는 방향화효소 저해제, 예컨대, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸, 및 ARIMIDEX® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐 예컨대 플루타미드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 류프롤라이드, 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것, 예컨대, 예를 들어, PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임 예컨대 VEGF 발현 저해제 (예를 들면, ANGIOZYME® 리보자임) 및 HER2 발현 저해제; 백신 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신, 및 VAXID® 백신; PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 저해제; ABARELIX® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라마이신 (참고 미국 특허 번호 4,675,187), 및 상기 중 임의의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체.
본 출원에서 사용된 바와 같이 용어 "전구약물"는 모 약물과 비교된 종양 세포보다 세포독성이 덜한 그리고 더욱 활성 모 형태로 효소적으로 활성화 또는 전환될 수 있는 약제학적으로 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 참고, 예를 들면, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) and Stella 등, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 등, (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). 본 발명의 전구약물은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩타이드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 당화된 전구약물, β-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 더욱 활성 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로우리딘 전구약물. 본 발명에서 사용을 위하여 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는, 비제한적으로, 상기 기재된 화학치료제를 포함한다.
"방사선 요법"은 정상적으로 기능하도록 또는 전적으로 세포를 파괴하도록 그의 능력을 제한하기 위해 세포에 충분한 손상을 유도하기 위한 유도된 감마선 또는 베타선의 사용을 의미한다. 치료의 복용량 및 지속시간을 결정하기 위해 당해 기술에서 공지된 많은 방식이 있을 것이 인정될 것이다. 전형적인 치료는 1회 투여 및 10 내지 200 단위 (Grays) / 1일의 전형적인 복용량 범위로서 주어진다.
"생물학적 샘플" (상호교환적으로 일명 "샘플" 또는 "조직 또는 세포 샘플")은 개체로부터 수득된 다양한 샘플 유형을 포함하고 진단 또는 모니터링 검정에서 사용될 수 있다. 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액형 샘플, 고형 조직 샘플 예컨대 생검 시료 또는 조직 배양액 또는 이로부터 유도된 세포, 및 이의 자손을 포함한다. 정의는 또한 그의 입수 이후, 예컨대 시약을 이용한 치료, 가용화, 또는 특정 구성요소, 예컨대 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 농축, 또는 섹션할 목적으로 반-고형 또는 고형 매트릭스에 포매에 의해 어떤 식으로든 조작된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포함하고, 또한 배양액내 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 플라즈마, 생물학적 유체, 및 조직 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플의 공급원은 하기일 수 있다: 신선한, 냉동된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 천자액으로부터 고체 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성요소; 체액 예컨대 뇌 척수액, 양수, 복막 유체, 또는 간질액; 임신 또는 개체의 발달에서 임의의 시간으로부터 세포. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 1차 또는 전이성 종양으로부터 수득된다. 생물학적 샘플은 자연에서 조직과 자연적으로 상호혼합되지 않는 화합물 예컨대 보존제, 항응고제, 버퍼, 정착액, 영양소, 항생제, 등등을 함유할 수 있다.
본원에서 목적으로 조직 샘플의 "섹션"은 조직 샘플의 단일 부 또는 피스, 예를 들면, 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 얇은 조각을 의미한다. 조직 샘플의 다중 섹션이 얻어질 수 있고 본 발명에 따라 분석 처리될 수 있음이 이해된다. 일부 구현예에서, 조직 샘플의 동일한 섹션은 모든 형태적 및 분자 수준에서 분석되거나, 또는 모든 단백질 및 핵산에 관해 분석된다.
단어 "표지"는 본원에서 사용될 때 시약 예컨대 핵산 프로브 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 접합 또는 융합되는 및 접합 또는 융합되는 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체 검출가능할 수 있거나 (예를 들면, 방사선동위원소 표지 또는 형광성 표지) 또는, 효소 표지의 경우에서, 검출가능한기질 화합물 또는 조성물의 화학 변경을 촉매화할 수 있다.
항- FGFR2 /3 항체 조성물 및 항- FGFR2 /3 항체의 이용 방법
본 발명은, 항-FGFR2/3 항체; 및 항-FGFR2/3 항체를 인코딩한 서열을 포함한 폴리뉴클레오타이드를 포함한, 약제학적 조성물을 포함하는, 조성물을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 조성물은 FGFR2 및 FGFR3, 및/또는 FGFR2 및 FGFR3에 결합하는 하나 이상의 항체를 인코딩한 서열을 포함한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 하나 이상의 항체를 포함한다. 이들 조성물은, 당해 기술에 공지되어 있는, 적합한 캐리어, 예컨대 버퍼를 포함한 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 단리된 항체 및 폴리뉴클레오타이드 구현예를 포함한다. 본 발명은 또한 실질적으로 순수한 항체 및 폴리뉴클레오타이드 구현예를 포함한다.
본 발명은 또한 (본원에서 기재된 바와 같이 또는 당해 기술에서 공지된 바와 같이) 항-FGFR2/3 항체를 이용하여 질환, 예를 들면 다발성 골수종 또는 과도기적 단계 암종 (예를 들면, 침습성 과도기적 단계 암종)의 치료 방법을 포함한다.
항- FGFR2 /3 항체 조성물
본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 바람직하게는 모노클로날이다. 본원에서 제공된 항-FGFR2/3 항체의 Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2 단편은 본 발명의 범위 내에 또한 포함된다. 이들 항체 단편은 전통적 수단, 예컨대 효소 소화에 의해 창출될 수 있거나, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 그와 같은 항체 단편은 키메라성 또는 인간화될 수 있다. 이들 단편은 아래에서 제시된 진단적 및 치료적 목적에 유용하다.
모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되고, 즉, 집단을 포함한 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 조절제 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 것으로 항체의 특징을 나타낸다.
본 발명의 항-FGFR2/3 모노클로날 항체는 Kohler 등, Nature, 256:495 (1975)에 의해 최초 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생산하는 또는 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화된다. FGFR2/3에 대한 항체는 FGFR2/3 및 아쥬반트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 상승될 수 있다. FGFR2/3은 당해 기술에서 널리 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 이들 중 일부는 추가로 본원에서 기재된다. 예를 들어, 인간 및 마우스 FGFR2/3의 재조합 생산은 아래 기재된다. 하나의 구현예에서, 동물은 면역글로불린 중쇄의 Fc 부분에 융합된 FGFR2/3으로 면역화된다. 바람직한 구현예에서, 동물은 FGFR2/3-IgG1 융합 단백질로 면역화된다. 동물은 통상적으로 FGFR2/3의 면역원성 콘주게이트 또는 유도체에 대해 모노포스포릴 지질 A (MPL)/트레할로오스 디크리노마이콜레이트 (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)로 면역화되고 용액은 다중 부위에서 진피내로 주사된다. 2 주 후 동물은 활성화된다. 7 내지 14 일 후 동물은 채혈되고 혈청은 항-FGFR2/3 역가를 위하여 분석된다 동물은 역가 안정기까지 활성화된다.
대안적으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다. 림프구는 그 다음 적합한 융합 제제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
그렇게 제조된 하이브리도마 세포는 비융합된, 친계 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 바람직하게는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 씨딩 및 성장된다. 예를 들어, 친계 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 전달효소 (HGPRT 또는 HPRT)가 부족하면, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 상기 물질은 HGPRT-결핍된 세포의 성장을 예방한다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하는, 선택된 항체-생산 세포에 의해 항체의 안정한 높은-수준 생산을 지지하고, 배지 예컨대 HAT 배지에 감수성인 것이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥣과 골수종 계, 예컨대 Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포에서 유도된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산에 대하여 기재되어 있다 (Kozbor, J. Immunol ., 133:3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 FGFR2/3에 대해 유도된 모노클로날 항체의 생산에 대하여 분석된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착제 검정 (ELISA)에 의해 결정된다.
모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어, 하기에 의해 결정될 수 있다: Scatchard analysis of Munson 등, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
원하는 특이성, 친화도, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 확인된 이후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 아클론화될 수 있고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). 적합한 배양 배지는 이러한 목적을 위해, 예를 들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장될 수 있다.
아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 종래의 면역글로불린 정제 절차 예컨대, 예를 들어, 단백질 A-세파로오스, 하이드록실인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체, 또는 혈청에서 적합하게 분리된다.
본 발명의 항-FGFR2/3 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 합성 항체 클론에 대하여 스크리닝하기 위해 조합 라이브러리를 이용함으로써 제조될 수 있다. 원칙적으로, 합성 항체 클론은 파아지 외피 단백질에 융합된 항체 가변 영역 (Fv)의 다양한 단편을 표현하는 파아지를 함유한 파아지 라이브러리의 스크리닝에 의해 선택된다. 그와 같은 파아지 라이브러리는 원하는 항원에 대해 친화도 크로마토그래피에 의해 보여졌다. 원하는 항원에 결합할 수 있는 Fv 단편을 발현한 클론은 항원에 흡착되고 따라서 라이브러리에서 비-결합 클론에서 분리된다. 결합 클론은 그 다음 항원으로부터 용출되고, 항원 흡착/용출의 추가의 사이클에 의해 추가로 농축될 수 있다. 본 발명의 임의의 항-FGFR3 항체는 당해 파아지 클론을 위하여 선택하는 적합한 항원 스크리닝 절차의 설계 그 다음 당해 파아지 클론으로부터 Fv 서열을 이용한 전장 항-FGFR2/3 항체 클론의 작제 및 하기에 기재된 적합한 불변 영역 (Fc) 서열에 의해 수득될 수 있다: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3.
항체의 항원-결합 도메인은, 모두 3 초가변성 루프 또는 상보성-결정 영역 (CDRs)을 나타내는, 경 (VL) 쇄 및 중 (VH) 쇄로부터 각 하나인, 약 110 아미노산의 2 가변 (V) 영역으로부터 형성된다. 가변 도메인은, 아래 기재된 바와 같이, 단일-쇄 Fv (scFv) 단편 (여기에서 VH 및 VL은 짧은, 가요성 펩타이드를 통해 공유 결합된다)으로서, 또는 Fab 단편 (여기에서 이들은 각각 불변 도메인에 융합되고 비-공유적으로 상호작용한다)으로서, 파아지에서 기능적으로 표현될 수 있다: Winter 등, Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994). 본원에서 사용된 바와 같이, scFv 인코딩 파아지 클론 및 Fab 인코딩 파아지 클론은 집합적으로 "Fv 파아지 클론" 또는 "Fv 클론"으로서 지칭된다.
VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 분리하여 클로닝될 수 있고 파아지 라이브러리에서 무작위로 재조합될 수 있으며, 그 다음 아래 기재된 바와 같이 항원-결합 클론에 대하여 검색될 수 있다: Winter 등, Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994). 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마의 작제 요건 없이 면역원에 높은-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 아래 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 비-자가 및 또한 자가 항원의 광범위로 인간 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 클로닝될 수 있다: Griffiths 등, EMBO J, 12: 725-734 (1993). 마지막으로, 나이브 라이브러리는 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트의 클로닝에 의해 합성으로, 그리고 고 가변 CDR3 영역을 인코딩하기 위해 및 아래 기재된 바와 같이 시험관내 재배열을 달성하기 위해 랜덤 서열을 함유한 PCR 프라이머를 이용하여 또한 제조될 수 있다: Hoogenboom 및 Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992).
섬유상 파아지는 소수 외피 단백질 pIII에 융합에 의해 항체 단편을 표현하기 위해 사용된다. 항체 단편은 단일 쇄 Fv 단편 (여기에서 VH 및 VL 도메인은, 예를 들면, Marks 등, J. Mol . Biol., 222: 581-597 (1991)에 기재된 바와 같이, 가요성 폴리펩타이드 스페이서에 의해 동일한 폴리펩타이드 쇄에 연결된다)으로서, 또는 Fab 단편 (여기에서 하나의 쇄는 pIII에 융합되고 다른 것은, 예를 들면, Hoogenboom 등, Nucl . Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)에 기재된 바와 같이, 야생형 외피 단백질의 일부를 대체함으로써 파아지 표면에서 표현되는 Fab-외피 단백질 구조의 어셈블리인 경우 박테리아 숙주 세포에 분비된다)으로서 표현될 수 있다.
일반적으로, 핵산 인코딩 항체 유전자 단편은 인간 또는 동물로부터 수확된 면역 세포로부터 수득된다. 항-FGFR2/3 클론에 유리하게 편향된 라이브러리가 요구되면, 개체는 항체 반응을 생성하기 위해 FGFR2/3으로 면역화되고, 비장 세포 및/또는 순환 B 세포 다른 말초 혈액 림프구 (PBLs)는 라이브러리 작제를 위하여 회수된다. 바람직한 구현예에서, 항-FGFR2/3 클론에 유리하게 편향된 인간 항체 유전자 단편 라이브러리는 기능성 인간 면역글로불린 유전자 배열을 담지하는 (및 기능성 내인성 항체 생산 시스템이 부족한) 트랜스제닉 마우스에서 항-FGFR2/3 항체 반응을 발생시킴으로써 수득되어 이로써 FGFR2/3 면역화는 FGFR2/3에 대해 B 세포 생산 인간 항체를 초래한다.인간 항체-생산 트랜스제닉 마우스의 생성은 아래 기재된다.
항-FGFR2/3 반응성 세포 집단에 대한 추가의 농축은 B 세포 발현 FGFR2/3-특이적 막 결합된 항체를 단리시키기 위해 적합한 스크리닝 절차의 이용에 의해, 예를 들면, FGFR2/3 친화도 크로마토그래피로 세포 분리 또는 형광색소-표지된 FGFR2/3에 세포의 흡착 그 다음 유동-활성화된 세포 분류 (FACS)에 의해 수득될 수 있다.
대안적으로, 비면역화된 공여체로부터 비장 세포 및/또는 B 세포 또는 다른 PBLs의 사용은 가능한 항체 레퍼토리의 더 나은 묘사를 제공하고, 또한 FGFR2/3이 항원성이 아닌 임의의 동물 (인간 또는 비-인간) 종을 이용하여 항체 라이브러리의 작제를 허용한다. 시험관내 항체 유전자 작제를 편입한 라이브러리에 대하여, 줄기 세포는 핵산 인코딩 재배열되지 않은 항체 유전자 세그먼트를 제공하기 위해 개체로부터 수확된다. 당해 면역 세포는 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 토끼목, 이리, 갯과, 고양이, 돼지, 소, 말, 및 조류 종, 등으로부터 수득될 수 있다.
핵산 인코딩 항체 가변 유전자 세그먼트 (VH 및 VL 세그먼트 포함)는 당해 세포로부터 회수되고 증폭된다. 재배열된 VH 및 VL 유전자 라이브러리의 경우에서, 원하는 DNA는 림프구로부터 게놈 DNA 또는 mRNA의 단리 그 다음 Orlandi 등, Proc. Natl . Acad . Sci . (USA), 86: 3833-3837 (1989)에 기재된 바와 같이 재배열된 VH 및 VL 유전자의 5' 및 3' 말단을 일치하는 프라이머로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 수득될 수 있고, 그렇게 함으로써 발현을 위하여 다양한 V 유전자 레퍼토리를 만든다. V 유전자는, Orlandi 등 (1989) 및 Ward 등, Nature, 341: 544-546 (1989)에 기재된 바와 같이 성숙한 V-도메인을 인코딩한 엑손의 5' 말단에서 역 프라이머 및 J-세그먼트 내에 기반된 순방향 프라이머를 갖는, cDNA 및 게놈 DNA로부터 증폭될 수 있다. 그러나, cDNA로부터 증폭을 위하여, 역 프라이머는 Jones 등, Biotechnol ., 9: 88-89 (1991)에 기재된 바와 같이 리더 엑손, 및 Sastry 등, Proc . Natl . Acad . Sci . (USA), 86: 5728-5732 (1989)에 기재된 바와 같이 불변 영역 이내 순방향 프라이머에서 또한 기반될 수 있다. 상보성을 극대화하기 위해, 축중은 Orlandi 등 (1989) 또는 Sastry 등 (1989)에 기재된 바와 같이 프라이머에서 편입될 수 있다. 바람직하게는, 라이브러리 다양성은, 예를 들면 Marks 등, J. Mol . Biol ., 222: 581-597 (1991)의 방법에서 기재된 바와 같이 또는 Orum 등, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)의 방법에서 기재된 바와 같이, 면역 세포 핵산 샘플에 존재하는 모든 이용가능한 VH 및 VL 배열을 증폭시키기 위해 각 V-유전자 계열에 표적화된 PCR 프라이머를 이용함으로써 극대화된다. 발현 벡터에 증폭된 DNA의 클로닝을 위하여, 희귀 제한 부위는 Orlandi 등 (1989)에 기재된 바와 같이 하나의 말단에서 태그로서 PCR 프라이머 내에, 또는 추가로 Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991)에 기재된 바와 같이 태그된 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 도입될 수 있다.
합성으로 재배열된 V 유전자의 레퍼토리는 V 유전자 세그먼트로부터 시험관내 유도될 수 있다. 대부분의 인간 VH-유전자 세그먼트는 클로닝 및 서열분석되었고 (Tomlinson 등, J. Mol . Biol ., 227: 776-798 (1992)에서 보고되었고), 맵핑되었고 (Matsuda 등, Nature Genet., 3: 88-94 (1993)에서 보고되었고; 이들 클로닝된 세그먼트 (H1 및 H2 루프의 모든 주요 형태 포함)는 Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol ., 227: 381-388 (1992)에 기재된 바와 같이 다양한 서열 및 길이의 H3 루프를 인코딩한 PCR 프라이머를 갖는 다양한 VH 유전자 레퍼토리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. VH 레퍼토리는 Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 4457-4461 (1992)에 기재된 바와 같이 단일 길이의 긴 H3 루프에서 집중된 모든 서열 다양성으로 또한 제조될 수 있다. 인간 Vκ 및 Vλ 세그먼트는 클로닝 및 서열분석되었고 (Williams 및 Winter, Eur . J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)에서 보고되었고) 합성 경쇄 레퍼토리를 만들기 위해 사용될 수 있다. VH 및 VL 접힘, 및 L3 및 H3 길이의 범위에 기반하여, 합성 V 유전자 레퍼토리는 상당한 구조적 다양성의 항체를 인코딩할 것이다. DNAs를 인코딩한 V- 유전자의 증폭 이후, 생식계열 V-유전자 세그먼트는 Hoogenboom 및 Winter, J. Mol . Biol ., 227: 381-388 (1992)의 방법에 따라 시험관내 재배열될 수 있다.
항체 단편의 레퍼토리는 몇 개의 방식으로 VH 및 VL 유전자 레퍼토리를 함께 조합시킴으로써 작제될 수 있다. 각 레퍼토리는 상이한 벡터, 및, 예를 들면, Hogrefe 등, Gene, 128:119-126 (1993)에 기재된 바와 같이, 시험관내, 또는 조합 감염, 예를 들면, Waterhouse 등, Nucl . Acids Res., 21:2265-2266 (1993)에 기재된 loxP 시스템에 의한 생체내 재조합된 벡터에서 창출될 수 있다. 생체내 재조합 접근법은 E. 콜리 전환 효율에 의해 부과된 라이브러리 크기에 관한 제한을 극복하기 위해 Fab 단편의 2-쇄 성질을 활용한다. 나이브 VH 및 VL 레퍼토리는 분리하여, 하나는 파아지미드로 다른 것은 파아지 벡터로 클로닝된다. 2 라이브러리는 그 다음 파아지중간-함유 박테리아의 파아지 감염에 의해 조합되어 각 세포가 상이한 조합을 함유하고 라이브러리 크기는 단지 존재한 세포의 수 (약 1012 클론)에 의해 제한된다. 모든 벡터는 생체내 재조합 신호를 함유하여 VH 및 VL 유전자가 단일 레플리콘에 재조합되고 파아지 비리온에 공동-포장된다. 이들 거대 라이브러리는 양호한 친화도 (약 10-8 M의 Kd -1)의 다양한 항체의 다수를 제공한다.
대안적으로, 레퍼토리는, 예를 들면, Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 88:7978-7982 (1991)에 기재된 바와 같이 동일한 벡터에 순차적으로 클로닝될 수 있거나, 또는 PCR에 의해 함께 조립 및 그 다음, 예를 들면 Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991)에 기재된 바와 같이 클로닝될 수 있다. PCR 어셈블리는 단일 쇄 Fv (scFv) 레퍼토리를 형성하기 위해 가요성 펩타이드 스페이서를 인코딩한 DNA와 VH 및 VL DNAs를 연합하도록 또한 사용될 수 있다. 추가의 또 다른 기술에서, "세포 PCR 어셈블리에서"는 PCR에 의해 림프구 내의 VH 및 VL 유전자 및 그 다음 Embleton 등, Nucl . Acids Res., 20:3831-3837 (1992)에 기재된 바와 같이 연결된 유전자의 클론 레퍼토리를 조합하기 위해 사용된다.
나이브 라이브러리 (천연 또는 합성)에 의해 생산된 항체는 중간 친화도 (약 106 내지 107 M-1의 Kd - 1)일 수 있지만, 친화도 성숙은 Winter 등 (1994), 상기에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리로부터 작제 및 재선택에 의해 또한 시험관내 모방될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 Hawkins 등, J. Mol . Biol., 226: 889-896 (1992)의 방법에서 또는 Gram 등, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)의 방법에서 (Leung 등, Technique, 1:1230-232 and 236-247 (1989)에서 보고된) 실수-유발 폴리머라제의 이용에 의해 시험관내 랜덤하게 도입될 수 있다. 추가로, 친화도 성숙은 하나 이상의 CDRs의 무작위 돌연변이에 의해, 예를 들면 선택된 개별 Fv 클론 및 더 높은 친화도 클론용 스크리닝에서 당해 CDR의 랜덤 서열 범위를 담지하는 프라이머를 갖는 PCR의 이용에 의해 수행될 수 있다. (1996년 3월 14일 공개된) WO 96/07754는 경쇄 유전자의 라이브러리를 창출하기 위해 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발의 유도 방법을 기재하였다. 또 다른 유효한 접근법은 비면역화된 공여체로부터 수득된 자연적으로 발생하는 V 도메인 변이체의 레퍼토리와 파아지 디스플레이에 의해 선택된 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고 Marks 등, Biotechnol ., 10:779-783 (1992)에 기재된 바와 같이 쇄 재셔플링의 몇 개의 라운드에서 더 높은 친화도를 위하여 스크리닝하는 것이다. 상기 기술은 10-9 M 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 허용한다.
FGFR2 및 FGFR3 핵산 및 아미노산 서열은 당해 기술에 공지되어 있다. FGFR2 및 FGFR3을 인코딩한 핵산 서열은 FGFR2 및 FGFR3의 원하는 영역의 아미노산 서열을 이용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, FGFR3은 R3Mab의 아미노산 서열을 이용하여 설계될 수 있다 당해 기술에서 공지된 바와 같이, FGFR3, FGFR3 IIIb 및 FGFR3 IIIc의 2개 주요 스플라이스 동형체가 있다. FGFR3 서열은 당해 기술에서 널리 공지되고 UniProKB/Swiss-Prot 수탁 번호 P22607 (FGFR3 IIIc) 또는 P22607_2 (FGFR3 IIIb)의 서열을 포함할 수 있다. FGFR2 및 FGFR3 돌연변이는 확인되었고 당해 기술에서 공지되고 (UniProKB/Swiss-Prot 수탁 번호 P22607 (FGFR3 IIIc) 또는 P22607_2 (FGFR3 IIIb)에서 보여진 서열을 참조로 하기 돌연변이를 포함한다:
FGFR3-IIIb FGFR3 IIIc
R248C R248C
S249C S249C
G372C G370C
Y375C Y373C
G382R G380R
K652E K650E
핵산 인코딩 FGFR2 및/또는 FGFR3은 당해 기술에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들 방법은, 비제한적으로, Engels 등, Agnew. Chem . Int. Ed. Engl ., 28: 716-734 (1989)에 기재된 임의의 방법, 예컨대 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스포네이트 방법에 의해 화학 합성을 포함한다. 하나의 구현예에서, 발현 숙주 세포에 의해 바람직한 코돈은 FGFR2 및/또는 FGFR3 인코딩 DNA의 설계에서 사용된다. 대안적으로, FGFR2 및/또는 FGFR3을 인코딩한 DNA는 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
FGFR2 및/또는 FGFR3을 인코딩한 DNA 분자의 작제 이후, DNA 분자는 발현 벡터, 예컨대 플라스미드내 발현 대조 서열에 작동가능하게 연결되고, 여기에서 대조 서열은 벡터를 이용한 숙주 세포 전환에 의해 기술적으로 인식된다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 숙주 세포와 양립가능한 종으로부터 유도되는 복제 및 대조 서열을 함유한다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 뿐만 아니라 전환 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 단백질을 인코딩하는 서열을 담지한다. 원핵 및 진핵 숙주 세포에서 발현에 적합한 벡터는 당해 기술에 공지되어 있고 일부는 추가로 본원에서 기재된다. 진핵 유기체, 예컨대 다중세포 유기체, 예컨대 포유동물로부터 유도된 효모, 또는 세포가 사용될 수 있다.
임의로, FGFR2 및/또는 FGFR3을 인코딩한 DNA는 배양 배지에 숙주 세포에 의한 발현 생성물의 분비를 초래하는 분비성 리더 서열에 작동가능하게 연결된다. 분비성 리더 서열의 예는 stII, 에코틴, lamB, 헤르페스 GD, lpp, 알칼리성 포스파타제, 인버타제, 및 알파 인자를 포함한다. 단백질 A의 36 아미노산 리더 서열이 또한 본원에서 사용에 적합하다 (Abrahmsen 등, EMBO J., 4: 3901 (1985)).
숙주 세포는 형질감염되고 바람직하게는 본 발명의 클로닝 벡터 또는 상기-기재된 발현으로 형질전환되고 프로모터 유발, 형질전환체 선택, 또는 원하는 서열을 인코딩한 유전자 증폭을 위하여 적절하게 변형된 종래의 영양소 배지에서 배양된다.
형질감염은 임의의 코딩 서열이 사실상 발현되는지 숙주 세포에 의한 발현 벡터의 시작을 지칭한다. 형질감염의 수많은 방법, 예를 들어, CaPO4 침전 및 전기천공이 당업자에 공지된다. 성공적인 형질감염은 상기 벡터의 작동의 임의의 적응증이 숙주 세포 내에서 발생하는 경우 일반적으로 기술적으로 인식된다. 형질감염 방법은 당해 기술에서 잘 알려지고, 일부는 추가로 본원에서 기재된다.
형질전환은 유기체에 DNA의 도입을 의미하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 구성요소에 의해 복제가능하다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 실시된다. 형질전환 방법은 당해 기술에서 잘 알려지고, 일부는 추가로 본원에서 기재된다.
FGFR2 및/또는 FGFR3을 생산하기 위해 사용된 원핵 숙주 세포는 일반적으로 Sambrook 등, 상기에 기재된 바와 같이 배양될 수 있다.
FGFR2 및/또는 FGFR3을 생산하기 위해 사용된 포유동물 숙주 세포는, 당해 기술에서 잘 알려지고 이의 일부가 본원에서 기재된, 다양한 배지에서 배양될 수 있다.
본 개시내용에서 지칭되는 숙주 세포는 시험관내 배양액내 세포 뿐만 아니라 숙주 동물 내인 세포를 포함한다.
FGFR2 및/또는 FGFR3의 정제는 기술적으로 인식된 방법을 이용하여 달성될 수 있고, 이의 일부는 본원에서 기재된다.
정제된 FGFR2 및/또는 FGFR3은, 파아지 디스플레이 클론의 친화도 크로마토그래피 분리에서 사용을 위하여, 적합한 매트릭스 예컨대 아가로스 비드, 아크릴아미드 비드, 유리 구슬, 셀룰로오스, 다양한 아크릴 코폴리머, 하이드록실 메타크릴레이트 겔, 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산 코폴리머, 나일론, 중성 및 이온성 캐리어, 등등에 부착될 수 있다. 매트릭스에 FGFR2 및/또는 FGFR3 단백질의 부착은 Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)에 기재된 방법에 의해 달성될 수 있다. 다당류 매트릭스, 예를 들면 아가로스, 덱스트란 또는 셀룰로오스에 단백질 리간드를 위하여 통상적으로 이용된 기술은 시아노겐 할라이드를 이용한 캐리어의 활성화 및 펩타이드 리간드의 1차 지방족 또는 방향족 아민의 활성화된 매트릭스에의 후속의 커플링을 포함한다.
대안적으로, FGFR2 및/또는 FGFR3은, 흡착 플레이트에 부착된 또는 세포 분류에 사용된 숙주 세포에서 발현된, 또는 스트렙타비딘-코팅된 비드를 이용한 포착용 바이오틴에 접합된, 흡착 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 파아지 디스플레이 라이브러리를 보이기 위하여 임의의 다른 기술적으로 공지된 방법에서 사용될 수 있다.
파아지 라이브러리 샘플은 흡착제와 파아지 입자의 적어도 일 부분의 결합에 적합한 조건 하에 고정된 FGFR2 및/또는 FGFR3과 접촉된다. 정상적으로, pH, 이온 강도, 온도 등등을 포함한, 조건은 생리적 조건을 모방하기 위해 선택된다. 고상에 결합된 파아지는 세정되고 그 다음, 예를 들면 Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)에 기재된 바와 같이 산에 의해, 또는 예를 들면 Marks 등, J. Mol . Biol ., 222: 581-597 (1991)에 기재된 바와 같이 알칼리에 의해, 또는 예를 들면 Clackson 등, Nature, 352: 624-628 (1991)의 항원 경쟁 방법과 유사한 절차에서 FGFR3 항원 경쟁에 의해 용출된다. 파아지는 선택의 단일 라운드에서 20-1,000-배 농축될 수 있다. 또한, 농축된 파아지는 박테리아 배양액에서 성장될 수 있고 선택의 추가 라운드 처리될 수 있다.
선택의 효율은, 세정 동안 해리의 동력학, 및 단일 파아지 상의 다중 항체 단편이 항원에 동시에 관여할 수 있는지를 포함하는, 많은 인자에 좌우된다. 빠른 해리 동력학 (및 약한 결합 친화도)를 갖는 항체는 짧은 세정, 다가 파아지 디스플레이 및 고상에서 항원의 높은 코팅 밀도의 사용에 의해 유지될 수 있다. 높은 밀도는 다가 상호작용을 통해 파아지를 안정화하고, 뿐만 아니라 해리되는 파아지의 재결합을 선호한다. 느린 해리 동력학 (및 양호한 결합 친화도)를 갖는 항체의 선택은 오랜 세정 및 Bass 등, Proteins, 8: 309-314 (1990) 및 WO 92/09690에 기재된 바와 같이 1가 파아지 디스플레이, 및 Marks 등, Biotechnol ., 10: 779-783 (1992)에 기재된 항원의 낮은 코팅 밀도의 사용에 의해 촉진될 수 있다.
FGFR2 및/또는 FGFR3에 대하여, 상이한 친화도의, 심지어 약간 상이한 친화도를 갖는, 파아지 항체 사이에서 선택하는 것이 가능하다. 그러나, (예를 들면 상기 기재된 친화도 성숙 기술의 일부에서 수행된 바와 같이) 선택된 항체의 랜덤 돌연변이는 많은 돌연변이체, 항원에 대한 최상 결합, 및 더 높은 친화도를 갖는 몇몇을 생기게 할 것 같다. FGFR2 및/또는 FGFR3을 제한함으로써, 희귀 높은 친화도 파아지는 경쟁될 수 있다. 모든 더 높은 친화도 돌연변이체를 보유하기 위해, 파아지는 과잉의 바이오티닐화된 FGFR2 및/또는 FGFR3으로, 그러나 FGFR2 및/또는 FGFR3에 대하여 표적 몰 친화도 상수보다 더 낮은 몰농도의 농도에서 바이오티닐화된 FGFR2 및/또는 FGFR3으로 인큐베이션될 수 있다. 높은 친화도-결합 파아지는 그 다음 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드에 의해 포착될 수 있다. 그와 같은 "평형 포착"은, 더 낮은 친화도를 갖는 대 과잉의 파아지로부터 2-배 더 높은 친화도만큼 적게 돌연변이체 클론의 단리를 허용하는 감수성으로, 결합의 그의 친화도에 따라 항체가 선택되도록 한다. 고상에 결합된 파아지 세정에서 사용된 조건은 또한 해리 동력학을 기반으로 하여 분간하기 위해 조종될 수 있다.
FGFR2/3 클론은 활성 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 FGFR3 수용체 및 그의 리간드 (예컨대 FGF1 및/또는 FGF9)와 FGFR2 및 그의 리간드 사이에서 결합을 블록킹하는 FGFR2/3 항체를 제공한다. 상기 FGFR2/3 항체에 상응하는 Fv 클론은 하기에 의해 선택될 수 있다: (1) 상기 기재된 바와 같이 파아지 라이브러리로부터 FGFR2/3 클론의 단리, 및 임의로 적합한 박테리아 숙주에서 집단의 성장에 의한 파아지 클론의 단리된 집단의 증폭; (2) 블록킹 및 비-블록킹 활성, 각각이 요구되는 제2 단백질 및 FGFR2/3 선택; (3) 고정된 FGFR2/3에 항-FGFR2/3 파아지 클론의 흡착; (4) 제2 단백질의 결합 결정인자와 공유되거나 또는 중첩하는 FGFR2/3-결합 결정인자를 인식하는 임의의 원하지 않는 클론을 용출하기 위해 과잉의 제2 단백질의 이용; 및 (5) 단계 (4) 이후 흡착되어 있는 클론의 용출. 임의로, 원하는 블록킹/비-블록킹 특성을 갖는 클론은 본원에서 기재된 선택 절차를 1회 이상 반복함으로써 추가로 농축될 수 있다.
본 발명의 하이브리도마-유도된 모노클로날 항체 또는 파아지 디스플레이 Fv 클론을 인코딩한 DNA는 종래의 절차를 이용하여 (예를 들면, 하이브리도마 또는 파아지 DNA 템플레이트로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키기 위해 설계된 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 이용에 의해) 쉽게 단리 및 서열분석된다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 배치될 수 있고, 그 다음 재조합 숙주 세포에서 원하는 모노클로날 항체의 합성을 수득하기 위해, 면역글로불린 단백질을 달리 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 E. 콜리 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포에 형질감염된다. 항체-인코딩 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 관한 검토 논문은 하기를 포함한다: Skerra 등, Curr. Opinion in Immunol ., 5: 256 (1993) and Pluckthun, Immunol . Revs, 130:151 (1992).
본 발명의 Fv 클론을 인코딩한 DNA는 전체 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩한 클론을 형성하기 위해 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 인코딩한 공지된 DNA 서열과 조합될 수 있다 (예를 들면, 적절한 DNA 서열은 카밧 등으로부터 수득될 수 있다, 상기). IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함한, 임의의 아이소타입의 불변 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다는 것, 및 상기 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있다는 것이 인정될 것이다. "하이브리드", 전장 중쇄 및/또는 경쇄용 코딩 서열(들)을 형성하기 위해 하나의 동물 (예컨대 인간) 종의 가변 도메인 DNA로부터 유도된 및 그 다음 또 다른 동물 종의 불변 영역 DNA에 융합된 Fv 클론은 본원에서 사용된 바와 같이 "키메라성" 및 "하이브리드" 항체의 정의에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 인간 가변 DNA로부터 유도된 Fv 클론은 모든 인간, 전체 또는 부분 길이 중쇄 및/또는 경쇄용 코딩 서열(들)을 형성하기 위해 인간 불변 영역 DNA에 융합된다.
본 발명의 하이브리도마로부터 유도된 DNA 인코딩 항-FGFR2/3 항체는 또한 (예를 들면, Morrison 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)의 방법에서와 같이) 하이브리도마 클론으로부터 유도된 상동성 쥣과 서열 대신, 예를 들어, 인간 중-쇄 및 경-쇄 불변 도메인용 코딩 서열의 치환에 의해 변형될 수 있다. 하이브리도마 또는 Fv 클론-유도된 항체 또는 단편을 인코딩한 DNA는 비-면역글로불린 폴리펩타이드용 코딩 서열의 면역글로불린 코딩 서열 모두 또는 일부에 공유적으로 연합함으로써 추가로 변형될 수 있다. 이런 식으로, 본 발명의 Fv 클론 또는 하이브리도마 클론-유도된 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라성" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.
이중특이적 항체
하나의 측면에서, 본 발명은, 부분적으로, 모든 KLB 및 FGFR2/3 ("FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체")에 결합하는 이중특이적 항체의 발견에 기반된다. 특정 측면에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 대사성 질환 및 장애의 치료에서 사용될 수 있고, 상기 치료는 간에 유의미한 영향 없이 및 골량에서 유의미한 손실 없이 글루코오스 및 지질 대사에서 개선 및/또는 체중 감소를 초래한다. 특정 측면에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 NASH의 치료에서 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 개시된 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 본원에서 개시된 임의의 항-FGFR2/3 항체의 제1 아암 및 본원에서 개시된 또는 그의 전체가 본원에서 편입되는 US20150218276에 개시된 임의의 항-KLB 항체의 제2 아암을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 간, 예를 들면, 간 기능에 유의미한 영향을 갖지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 FGF21 단백질에 의해 간에서 FGFR/KLB 수용체 복합체의 조절과 비교된 경우 간에서 FGFR/KLB 수용체 복합체의 활성을 조절하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 FGFR4/KLB 복합체의 저해를 초래하지 않고/않거나 간 효소 예컨대, 비제한적으로, ALT, AST, ALP 및 GLDH의 상승을 초래하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 간에서 FGFR2c/KLB 복합체 및/또는 FGFR3c/KLB 복합체의 작용제로서 기능하지 않고, 이는 간에서 Spry4 및 Dusp6의 활성화된 MAPK 신호전달 및/또는 변경된 발현을 초래할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 FGF21 단백질에 의해 MAPK 신호전달의 활성화와 비교된 경우 간에서 MAPK 신호전달의 활성화를 초래하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 간에서 FGFR4/KLB 복합체의 작용제로서 기능하지 않는다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 인간화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 수용체 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는, 키메라성, 인간화된 또는 인간 항체를 포함하여, 모노클로날 항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 본원에서 정의된 바와 같이 전장 항체, 예를 들면, 온전한 IgG1 항체, 또는 다른 항체 부류 또는 아이소타입이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는, 아래 상세히 기재된 바와 같이, 단독으로 또는 조합으로, 임의의 특징을 편입시킬 수 있다.
본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는, 예를 들면, 대사성 장애의 진단 또는 치료에 유용하다. 대사성 장애의 비제한 예는 하기를 포함한다: 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사성 증후군 (MetS), 비만, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재적 자가면역 당뇨병 (LAD), 약년발증 성인형 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련된 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS. 바람직한 측면에서, 대사성 질환은 NASH이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는, 예를 들면, 대사성 장애의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다. 대사성 장애의 비제한 예는 하기를 포함한다: 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사성 증후군 (MetS), 비만, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재적 자가면역 당뇨병 (LAD), 약년발증 성인형 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련된 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨 질환 및 ALS. 바람직한 측면에서, 대사성 질환은 NASH이다.
예시적 항- KLB 항체
하나의 측면에서, 본 개시내용은 KLB 단백질에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 항-KLB 항체는 KLB의 C-말단 도메인에 결합한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 항-KLB 항체는 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 103)을 포함하는 KLB의 단편에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체는 본원에서 기재된 항-KLB 항체, 예를 들면, 8C5로서 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 항-KLB 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 HVRs를 포함한다: (a) 임의의 하나의 서열식별번호: 230-232 및 236-247, 예를 들면, 244 또는 247의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H1; (b) 임의의 하나의 서열식별번호: 142 및 248-262, 예를 들면, 259 또는 262의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H2; (c) 임의의 하나의 서열식별번호: 263-278, 예를 들면, 166 또는 169의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H3; (d) 임의의 하나의 서열식별번호: 279-293, 예를 들면, 171 또는 184의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L1; (e) 임의의 하나의 서열식별번호: 294-309, 예를 들면, 197 또는 200의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L2; 및 (f) 임의의 하나의 서열식별번호: 310-324, 예를 들면, 212 또는 215의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L3.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 HVRs를 포함한 항-KLB 항체를 제공한다: (a) 서열식별번호: 119를 포함한 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 150을 포함한 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 166을 포함한 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 171을 포함한 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 197을 포함한 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 212를 포함한 HVR-L3. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 HVRs를 포함한 항-KLB 항체를 제공한다: (a) 서열식별번호: 122를 포함한 HVR-H1; (b) 서열식별번호 153을 포함한 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 169를 포함한 HVR-H3; (d) 서열식별번호 184를 포함한 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 200을 포함한 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 215를 포함한 HVR-L3.
본 개시내용은 추가로 서열식별번호: 104의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 항-KLB 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 아래 개시된 바와 같이 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함한 항-KLB 항체는 KLB에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 아미노산은 서열식별번호: 104에서 치환된, 삽입된 및/또는 결실된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVRs 외부 영역에서 (즉, FRs에서) 발생한다. 대안적으로 또는 추가로, 항-KLB 항체는, 아래 기재된 바와 같이 그 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열식별번호: 104에서 VH 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VH는 하기로부터 선택된 1, 2 또는 3 HVRs를 포함한다: (a) 서열식별번호: 122의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 153의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H2, 및 (c) 서열식별번호: 169의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H3.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 항-KLB 항체를 제공하고, 여기에서 항체는 서열식별번호: 105의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. 특정 구현예에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함한 항-KLB 항체는 KLB에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 구현예에서, 총 1 내지 10 아미노산은 서열식별번호: 105에서 치환된, 삽입된 및/또는 결실된다. 특정 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVRs 외부 영역에서 (즉, FRs에서) 발생한다. 대안적으로 또는 추가로, 항-KLB 항체는, 그 서열의 번역후 변형을 포함하여, 서열식별번호: 105에서 VL 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VL은 하기로부터 선택된 1, 2 또는 3 HVRs를 포함한다: (a) 서열식별번호: 184의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L1; (b) 서열식별번호: 200의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L2; 및 (c) 서열식별번호: 215의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L3.
본 개시내용은 추가로 항-KLB 항체를 제공하고, 여기에서 항체는 상기 제공된 임의의 구현예에서와 같이 VH, 및 상기 제공된 임의의 구현예에서와 같이 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는, 상기 서열의 후-번역 변형을 포함하여, 서열식별번호: 104 및 서열식별번호: 105, 각각에서 VH 및 VL 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-KLB 항체는 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 103)으로 이루어진 KLB의 단편에 결합한다.
이중특이적 항- FGFR2 /3 항체
본 개시내용은 추가로 모든 KLB 및 FGFR2/3 (즉, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체)에 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 결합 특이성을 갖는다, 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,922,845 및 5,837,243; Zeilder (1999) J. Immunol. 163:1246-1252; Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47-54; Keler (1997) Cancer Res. 57:4008-4014. 예를 들어, 및 비제한으로써, 현재 개시된 주제는 KLB에서 존재한 제1 에피토프에 대한 하나의 결합 부위 (예를 들면, 항원 결합 부위) 및 FGFR2/3에 존재한 제2 에피토프에 대한 제2 결합 부위를 갖는 이중특이적 항체를 제공한다. 예를 들어, 및 비제한으로써, 본 개시내용은 하나의 아암이 KLB를 결합시키고 본원에서 기재된 임의의 항-KLB 항체 서열을 포함하고 제2 아암이 FGFR2/3에 결합하고 본원에서 기재된 임의의 항-FGFR2/3 항체 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 KLB에서 존재한 제1 에피토프에 대한 하나의 결합 부위 및 FGFR2/3에서 존재한 제2 에피토프에 대한 제2 결합 부위를 갖는다.
특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 및 경쇄 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 전장 중쇄는 서열식별번호: 106에서 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 전장 경쇄는 서열식별번호: 107에서 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 전장 중쇄는 서열식별번호: 106에서 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 전장 경쇄는 서열식별번호: 107에서 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 104에서 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105에서 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 104에서 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105에서 제시된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 HVRs를 포함한다: (a) 서열식별번호: 230-232 및 236-247, 예를 들면, 244 또는 247의 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 142 및 248-262, 예를 들면, 259 또는 262의 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 263-278, 예를 들면, 275 또는 278의 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 279-293, 예를 들면, 280 또는 293의 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 294-309, 예를 들면, 306 또는 309의 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 310-324, 예를 들면, 321 또는 324의 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한 HVR-L3.
특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 HVRs를 포함한다: (a) 서열식별번호: 119를 포함한 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 150을 포함한 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 166을 포함한 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 171을 포함한 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 197을 포함한 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 212를 포함한 HVR-L3. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 하기로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 HVRs를 포함한 항-KLB 항체를 제공한다: (a) 서열식별번호: 122를 포함한 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 153을 포함한 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 169를 포함한 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 184를 포함한 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 200을 포함한 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 215를 포함한 HVR-L3.
특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 도메인은 서열식별번호: 230-232 및 236-247에서 제시된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 도메인은 서열식별번호: 142 및 248-262에서 제시된 서열 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역 CDR3 도메인은 서열식별번호: 263-278과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역 CDR1 도메인은 서열식별번호: 279-293과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역 CDR2 도메인은 서열식별번호: 294-309와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역 CDR3 도메인은 서열식별번호: 310-324와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 도메인은 서열식별번호: 230-232 및 236-247에서 제시된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 도메인은 서열식별번호: 103 및 248-262에서 제시된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 중쇄 가변 영역 CDR3 도메인은 서열식별번호: 263-278에서 제시된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역 CDR1 도메인은 서열식별번호: 279-293에서 제시된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역 CDR2 도메인은 서열식별번호: 294-309에서 제시된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역 CDR3 도메인은 서열식별번호: 310-324에서 제시된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 하기를 포함한다: 서열식별번호: 122에서 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 153에서 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 169에서 제시된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 184에서 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 200에서 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 215에서 제시된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3.
특정 구현예에서, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 제1 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 제2 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하며, 여기에서 제1 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 KLB에서 존재한 에피토프에 결합하고, 제2 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 FGFR2/3에서 존재한 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 및 비제한으로써, 제1 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고; 제2 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 항체, 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 104에서 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 항체, 또는 이의 항원 결합 부분의 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 105에서 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 항체 (항-FGFR2/3 항체) 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄는 서열식별번호: 282에서 제시된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 항체 (항-FGFR2/3 항체), 또는 이의 항원 결합 부분의 경쇄는 서열식별번호: 283에서 제시된 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-KLB 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 본원에서 제공된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 서열식별번호: 104의 VH 서열 및 서열식별번호: 105의 VL 서열을 포함한 항-KLB 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 103)으로 이루어진 KLB의 단편에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 구현예에서, 서열식별번호: 103에서 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 KLB의 단편에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 구현예에서, 항-KLB 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 본원에서 제공된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 서열식별번호: 106의 전장 중쇄 서열 및 서열식별번호: 107의 전장 경쇄 서열을 포함한 항-KLB 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항-FGFR2/3 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 서열식별번호: 82의 VH 서열 및 서열식별번호: 66의 VL 서열을 포함한 항-FGFR2/3 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 아미노산 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및/또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)를 포함한 FGFR2에서 에피토프에 결합하는 및/또는 또한 아미노산 서열 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및/또는 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)를 포함한 FGFR3에서 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항-FGFR2/3 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본원에서 개시된 2B.1.3.12, 2B.1.3.10, 또는 2B.1.1.6 항-FGFR2/3 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 구현예에서, 항-FGFR2/3 항체 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12로서 동일한 에피토프에 결합하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다 (즉, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12로서 아미노산 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및/또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)를 포함한 FGFR2에서 동일한 에피토프(들)에 결합하고 및/또는 또한 아미노산 서열 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및/또는 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)를 포함한 FGFR3에서 동일한 에피토프(들)에 결합한다).
특정 구현예에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12 항체와 FGFR2/3에 결합에 대하여 경쟁하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 서열식별번호: 103에서 제시된 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 KLB의 단편에 결합하는, 및 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)로부터 선택된 FGFR2 에피토프에 결합하는 또는 에피토프에 결합에 대하여 경쟁하는 및 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)로부터 선택된 FGFR3 에피토프에 결합하는 또는 에피토프에 결합에 대하여 경쟁하는 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 구현예에서, 서열식별번호: 103에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 KLB의 단편에 결합하는 및 서열식별번호: 91 및 92에서 제공된 FGFR2 에피토프에 결합하는 또는 에피토프에 결합에 대하여 경쟁하는 및 서열식별번호: 93 및 94에서 제공된 FGFR3 에피토프에 결합하는 또는 에피토프에 결합에 대하여 경쟁하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특정 상황에서 전체의 항체 보다는 항체 단편 이용의 이점이 있다. 단편의 더 작은 크기는 급속 청소능을 허용하고, 고형 종양에 개선된 접근을 초래할 수 있다.
다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위하여 개발되었다.
전통적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백분해 소화를 통해 유도되었다 (참고, 예를 들면, Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); and Brennan 등, Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 이제 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두 E. 콜리에서 발현될 수 있고 이로부터 분비될 수 있고, 따라서 다량의 이들 단편의 손쉬운 생산을 허용한다. 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜리로부터 직접적으로 회수될 수 있고 F(ab')2 단편을 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있다 (Carter 등, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또 다른 접근법에 있어서, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함한 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편은 미국 특허 번호 5,869,046에 기재된다. 항체 단편의 생산용 다른 기술은 당업자에 명백해질 것이다. 다른 구현예에서, 선택되는 항체는 단일 쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (참고, 예를 들면, WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458). Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 온전한 결합 부위를 갖는 유일한 종이고; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합하다. sFv 융합 단백질은 sFv의 아미노 또는 카복시 말단에서 효과기 단백질의 융합을 수득하기 위해 작제될 수 있다. 참고 Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기. 항체 단편은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870에, 예를 들면, 기재된 바와 같이 또한 "선형 항체"일 수 있다. 그와 같은 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화된 항체
본 발명은 인간화된 항체를 포함한다. 비-인간 항체의 다양한 인간화 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 거기에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는, 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취득되는, 종종 "도입" 잔기로서 지칭된다. 인간화는, 인간 항체의 상응하는 서열로 초가변 영역 서열을 치환시킴으로써, 윈터 및 공동-작업자의 방법에 따라 본질적으로 수행될 수 있다 (Jones 등 (1986) Nature 321:522-525; Riechmann 등 (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen 등 (1988) Science 239:1534-1536). 따라서, 상기 "인간화된" 항체는 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적게 비-인간 종으로부터 상응하는 서열에 의해 치환되는 키메라성 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화된 항체는 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 비슷한 부위로부터 잔기에 의해 치환되는 전형적으로 인간 항체이다.
인간화된 항체 제조에서 사용되는, 양쪽 경 및 중, 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키기 위해 매우 중요하다. 소위 "최고-적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류의 것에 가장 근접한 인간 서열은 그 다음 인간화된 항체용 인간 프레임워크로서 허용된다 (Sims 등 (1993) J. Immunol . 151:2296; Chothia 등 (1987) J. Mol . Biol . 196:901. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정한 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유도된 특정한 프레임워크를 사용한다. 동일한 프레임워크는 몇 개의 상이한 인간화된 항체에 사용될 수 있다 (Carter 등 (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89:4285; Presta 등 (1993) J. Immunol ., 151:2623.
항체가 항원에 대하여 높은 친화도 및 다른 호의적인 생물학적 특성의 체류로 인간화되는 것이 추가로 중요하다. 상기 목표를 달성하기 위해, 하나의 방법에 있어서, 인간화된 항체는 친계 및 인간화된 서열의 3-차원 모델을 이용하여 친계 서열 및 다양한 개념의 인간화된 생성물의 분석의 공정으로 제조된다. 3-차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고 당해 분야의 숙련가에 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 정황적 3-차원 형태적 구조를 실증하는 및 표현하는 컴퓨터 프로그램은 이용가능하다. 이들 표현의 점검은 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기의 유사한 역할의 분석, 즉, 그의 항원을 결합시키기 위한 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이런 식으로, FR 잔기는 수령체 및 도입 서열로부터 선택 및 조합될 수 있어서 표적 항원(들)에 대한 원하는 항체 특징, 예컨대 증가된 친화도가 달성된다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합의 영향에 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여된다.
인간 항체
본 발명의 인간 항-FGFR2/3 항체는 상기 기재된 바와 같이 공지된 인간 불변 도메인 서열(들)과 인간-유도된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 조합시킴으로써 작제될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 모노클로날 항-FGFR2/3 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산용 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는, 예를 들어, 하기에 의해 기재되었다: Kozbor J. Immunol ., 133:3001 (1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner 등, J. Immunol., 147:86 (1991).
면역화시, 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들면, 마우스)를 생산하는 것이 이제 가능하다. 예를 들어, 키메라성 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중-쇄 연합 영역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생산의 완벽한 저해를 초래하는 것이 기재되었다. 상기 생식계열 돌연변이체 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 이동은 항원 공격시 인간 항체의 생산을 초래할 것이다. 참고, 예를 들면, Jakobovits 등, Proc . Natl . Acad . Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits 등, Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann 등, Year in Immunol ., 7:33 (1993).
유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들면, 설치류, 항체로부터 인간 항체를 유도하기 위해 사용될 수 있고, 여기에서 인간 항체는 개시 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. 또한 "에피토프 임프린팅"으로 불리우는, 상기 방법에 있어서, 상기 기재된 바와 같이 파아지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은, 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라의 집단을 창출하는, 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체된다. 항원을 이용한 선택은 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라성 scFv 또는 Fab의 단리를 초래하고 여기에서 인간 쇄는 1차 파아지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거시 파괴된 항원 결합 부위를 복원한다, 즉 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 지배한다 (임프린트한다). 잔여 비-인간 쇄를 대체하기 위해 과정이 반복되는 경우, 인간 항체는 수득된다 (참고 PCT WO 93/06213, 1993년 4월 1일 공개됨). CDR 이식에 의한 비- 인간 항체의 전통적 인간화와 달리, 상기 기술은, 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는, 완전히 인간 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대하여 결합 특이성을 갖는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된, 항체이다. 본 경우에서, 결합 특이성 중 하나는 FGFR3에 대한 것이고 다른 것은 FGFR2에 대한 것이다. 이중특이적 항체는 또한 FGFR3, FGFR2, 또는 FGFR2/3을 발현시키는 세포에 세포독성제를 국재화시키기 위해 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')2 이중특이적 항체)로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기반되고, 여기에서 2 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 조합 때문에, 이들 하이브리도마 (quadromas)는 10개의 상이한 항체 분자의 포텐셜 혼합물을 생산하고, 이들 중 단 하나는 정확한 이중특정 구조를 갖는다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 실시되는, 정확한 분자의 정제는 다소 다루기 힘들고, 생성물 수율은 낮다. 유사한 절차는 1993년 5월 13일 공개된 WO 93/08829에 및 Traunecker 등, EMBO J., 10: 3655 (1991)에 개시된다.
상이한 및 더 바람직한 접근법에 있어서, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 융합의 적어도 하나에 존재한, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유한, 제1 중-쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합을 인코딩한 DNAs 및, 원한다면, 면역글로불린 경쇄는 분리된 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 공동-형질감염된다. 이는 작제에서 사용된 3 폴리펩타이드 사슬의 불평등 비가 최적의 수율을 제공하는 경우 구현예에서 3 폴리펩타이드 단편의 상호 분율의 조정에서 대단한 가요성을 제공한다. 그러나, 평등 비로 적어도 2 폴리펩타이드 사슬의 발현이 고수율을 초래하는 경우 또는 상기 비가 특정한 유의성이 없는 경우 하나의 발현 벡터에서 2 또는 모든 3 폴리펩타이드 사슬을 위하여 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
상기 접근법의 바람직한 구현예에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암에서 (제2 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성된다. 이중특이적 분자의 단지 이분의 일로 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 손쉬운 방식을 제공함에 따라, 상기 비대칭 구조가 원치않는 면역글로불린 쇄 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것이 발견되었다. 상기 접근법은 WO 94/04690에 개시된다. 이중특이적 항체 생성의 추가 세부사항에 대하여 참고, 예를 들어, Suresh 등, Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
또 다른 접근법에 있어서, 한 쌍의 항체 분자 사이의 인터페이스는 재조합 세포 배양액으로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 극대화하기 위해 조작될 수 있다. 바람직한 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄 (예를 들면, 티로신 또는 트립토판)으로 대체된다. 큰 측쇄(들)에 대한 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 인터페이스에서 창출된다. 이는 다른 원치않는 말단-생성물 예컨대 동형이량체에 대하여 이종이량체의 수율 증가용 기전을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "헤테로콘주게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로콘주게이트에서 항체의 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고, 다른 것은 바이오틴에 커플링될 수 있다. 그와 같은 항체는, 예를 들어, 원치않는 세포에 면역 시스템 세포를 표적하기 위해 (미국 특허 번호 4,676,980), 그리고 HIV 감염의 치료를 위하여 (WO 91/00360, WO 92/00373, 및 EP 03089) 제안되었다. 헤테로콘주게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 종래기술에서 잘 알려지고, 수많은 가교결합 기술과 함께, 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된다.
항체 단편으로부터 이중특이적 항체의 생성 기술은 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학 연결을 사용하여 제조될 수 있다. Brennan 등, Science, 229: 81 (1985)는 온전한 항체가 F(ab')2 단편을 생성하기 위해 단백분해적으로 절단되는 절차를 기재한다. 이들 단편은 근접 디티올을 안정화시키기 위해 및 분자간 디설파이드 형성을 예방하기 위해 디티올 착화제 나트륨 아르세나이트의 존재하에 감소된다. 생성된 Fab' 단편은 그 다음 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 그 다음 머캅토에틸아민을 이용한 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 이중특이적 항체를 형성하기 위해 다른 Fab'-TNB 유도체의 등몰 양과 혼합된다. 생산된 이중특이적 항체는 효소의 선택적 고정화용 제제로서 사용될 수 있다.
최근 진행은 이중특이적 항체를 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있는, E. 콜리로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 용이하게 하였다. Shalaby 등, J. Exp . Med ., 175: 217-225 (1992)는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산을 기재한다. 각 Fab' 단편은 E. 콜리로부터 분리하여 분비되었고 이중특이적 항체를 형성하기 위해 시험관내 유도된 화학 커플링 처리되었다. 따라서 형성된 이중특이적 항체는 HER2 수용체 및 정상 인간 T 세포를 과발현한 세포에 결합할 수 있었고, 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대해 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 유발시킬 수 있었다.
재조합 세포 배양액으로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편의 제조 및 단리용 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 류신 지퍼를 이용하여 생산되었다. Kostelny 등, J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질로부터 류신 지퍼 펩타이드는 유전자 융합에 의해 2 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결되었다. 항체 동형이량체는 단량체를 형성하기 위해 힌지 영역에서 환원되었고 그 다음 항체 이종이량체를 형성하기 위해 재-산화되었다. 상기 방법은 또한 항체 동형이량체의 생산에 이용될 수 있다. Hollinger 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 90:6444-6448 (1993)에 의해 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조용 대안적인 기전으로서 제공되었다. 단편은 동일한 쇄상의 2 도메인 사이에서 짝짓기를 허용하기에 너무 짧은 링커에 의해 경-쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중-쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 강제로 짝짓기하고, 그렇게 함으로써 2 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-쇄 Fv (sFv) 이량체의 사용에 의한 이중특이적 항체 단편의 제조용 또 다른 전략은 또한 보고되었다. 참고 Gruber 등, J. Immunol ., 152:5368 (1994).
2 초과 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tutt 등 J. Immunol. 147: 60 (1991).
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 빨리 내재화될 수 있다 (및/또는 이화될 수 있다). 본 발명의 항체는, 항체의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩한 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생산될 수 있는, 3 이상 항원 결합 부위 (예를 들면 4가 항체)를 갖는 (IgM 부류 이외인) 다가 항체일 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3 이상 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 바람직한 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 상기로 이루어진다). 상기 시나리오에서, 항체는 Fe 영역에 Fc 영역 및 3 이상 항원 결합 부위 아미노-말단을 포함할 것이다. 본원에서 바람직한 다가 항체는 3 내지 약 8, 그러나 바람직하게는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 상기로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 하나의 폴리펩타이드 쇄 (및 바람직하게는 2 폴리펩타이드 사슬)을 포함하고, 여기에서 폴리펩타이드 쇄(들)은 2 이상 가변 도메인을 포함한다. 예를 들면, 폴리펩타이드 쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기에서 VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1 폴리펩타이드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내고, 그리고 n은 0 또는 1이다)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드 쇄(들)은 하기를 포함할 수 있다: VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄; 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄. 본원에서 다가 항체는 바람직하게는 추가로 적어도 2 (및 바람직하게는 4) 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함한다. 본원에서 다가 항체는, 예를 들면, 약 2 내지 약 8 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려된 경쇄 가변 도메인 폴리펩타이드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로, CL 도메인을 추가로 포함한다.
항체 변이체
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 항체의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체 핵산에 적절한 뉴클레오타이드 변화의 도입, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조된다. 그와 같은 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 도달하기 위해 만들어지고, 단, 최종 작제물은 원하는 특징을 소유한다. 아미노산 변경은 서열이 작성되는 시간에 대상체 항체 아미노산 서열에서 도입될 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 유용한 확인 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불리운다. 잔기 또는 표적 잔기의 그룹 (예를 들면, 충전된 잔기 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)은 확인되고 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미치기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 치환에 기능성 감수성을 증명하는 상기 아미노산 위치는 그 다음 치환의 부위에서, 또는 이를 위하여, 추가 또는 다른 변이체의 도입에 의해 개선된다. 따라서, 아미노산 서열 변화의 도입용 부위가 예정된 반면, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, ala 스캐닝 또는 랜덤 돌연변이유발은 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고 발현된 면역글로불린은 원하는 활성을 위하여 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 1 잔기 내지 100 이상 잔기를 함유한 폴리펩타이드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 세포독성 폴리펩타이드에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드 또는 효소에 대해 (예를 들면, ADEPT에 대하여) 항체의 N- 또는 C-말단에 융합을 포함한다.
폴리펩타이드의 당화는 전형적으로 N-연결된 또는 O-연결된다. N-연결된은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 트리펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소 부착용 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드내 이들 트리펩타이드 서열의 존재는 포텐셜 당화 부위를 창출한다. 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록실라이신이 또한 사용될 수 있어도, O-연결된 당화는 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌에 당류 N-아세일갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로스의 부착을 지칭한다.
항체에 당화 부위의 부가는 아미노산 서열의 변경에 의해 편리하게 달성되어 이로써 (N-연결된 당화 부위에 대하여) 하나 이상의 상기-기재된 트리펩타이드 서열을 함유한다. 변경은 또한 (O-연결된 당화 부위에 대하여) 최초 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환으로 실시될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 거기에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스가 부족한 성숙한 탄수화물 구조를 갖는 항체는 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.)에 기재된다. 참고 또한 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물에서 양분한 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)을 갖는 항체는 WO 2003/011878, Jean-Mairet 등 및 미국 특허 번호 6,602,684, Umana 등에서 참조된다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토오스 잔기를 갖는 항체가 WO 1997/30087, Patel 등에 보고된다. 참고, 또한, 이의 Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물을 갖는 항체에 관한 WO 1998/58964 (Raju, S.) 및 WO 1999/22764 (Raju, S.). 참고 또한 변형된 당화를 갖는 항원-결합 분자에 관한 US 2005/0123546 (Umana 등).
본원에서 바람직한 당화 변이체는 Fc 영역을 포함하고, 여기에서 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조는 푸코스가 부족하다. 그와 같은 변이체는 개선된 ADCC 기능을 갖는다. 임의로, Fc 영역은 ADCC를 추가로 개선하는 거기에서 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 Eu 넘버링)에서 치환을 추가로 포함한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍된" 항체에 관련된 공보의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki 등 J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki 등 Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004). 세포주 생산 탈푸코실화된 항체의 예는 하기를 포함한다: 단백질 푸코실화에서 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 등 Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams 등, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8,녹아웃 CHO 세포 (Yamane-Ohnuki 등 Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004)).
변이체의 또 다른 유형은 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 대체된 항체 분자에서 적어도 하나의 아미노산 (적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 이상) 잔기를 갖는다. 치환성 돌연변이유발에 가장 관심있는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경은 또한 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 제목으로 아래 차트에서 보여진다. 상기 치환이 생물학적 활성에서 변화를 초래하면, 아래 차트에서 "예시적 치환"을 증명한, 또는 아미노산 클래스를 참조로 아래 추가로 기재된 바와 같이, 더욱 실질적인 변화는 도입될 수 있고 생성물은 스크리닝될 수 있다.
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항체의 생물학적 특성에서 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서, 치환의 영역에서 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크 유지에 관한 그의 효과에서 유의미하게 상이한 치환의 선택에 의해 달성된다. 자연적으로 발생하는 잔기는 공통의 측-쇄 특성에 기반하여 그룹으로 분할된다:
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스의 구성원을 또 다른 부류로 교환을 수반할 것이다.
치환성 변이체의 하나의 유형은 모 항체 (예를 들면, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변성 영역 잔기의 치환을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위하여 선택된 생성 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비하여 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 상기 치환성 변이체 생성을 위한 편리한 방식은 파아지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙을 포함한다. 간단히, 몇 개의 초가변 영역 부위 (예를 들면, 6-7 부위)는 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성하기 위해 돌연변이된다. 따라서 생성된 항체는 각 입자 내에 포장된 M13의 유전자 III 생성물에 융합으로서 섬유상 파아지 입자로부터 표현된다. 파아지-디스플레이된 변이체는 그 다음 본원에서 개시된 바와 같이 그의 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화도)을 위하여 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 항원 결합에 유의미하게 기여하는 초가변성 영역 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항체와 항원 사이에서 접점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 인접하는 잔기는 본원에서 설명한 기술에 따른 치환용 후보이다. 상기 변이체가 생성되면, 변이체의 패널은 본원에서 기재된 바와 같이 스크리닝 처리되고 하나 이상의 관련된 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체는 추가 개발을 위하여 선택될 수 있다.
항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩한 핵산 분자는 당해 기술에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은, 비제한적으로, (자연적으로 발생하는 아미노산 서열 변이체의 경우에서) 천연 공급원으로부터 단리 또는 항체의 조기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 올리고뉴클레오타이드-매개된 (또는 부위 지향적) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함한다.
본 발명의 면역글로불린 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하는 것이 바람직할 수 있고, 그렇게 함으로써 Fc 영역 변이체를 생성한다. Fc 영역 변이체는 힌지 시스테인의 것을 포함한 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들면, 치환)을 포함한 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
선행기술의 상기 설명 및 교시에 따라, 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 항체가, 예를 들면, Fc 영역에서 야생형 대응물 항체와 비교된 경우 1 이상의 변경을 포함할 수 있는 것이 고려된다. 이들 항체는 그럼에도 불구하고 그의 야생형 대응물에 비교된 경우 치료적 유용성에 요구된 실질적으로 동일한 특징을 보유할 것이다. 예를 들어, 특정 변경이, 예를 들면, WO99/51642에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 줄어든) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래할 Fc 영역에서 실시될 수 있음이 고려된다. 참고 또한 Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 WO94/29351. WO00/42072 (Presta) 및 WO 2004/056312 (Lowman)은 FcRs에 개선된 또는 줄어든 결합을 갖는 항체 변이체를 기재한다. 이들 특허 공개의 내용은 특이적으로 본원에서 참고로 편입된다. 참고, 또한, Shields 등 J. Biol . Chem . 9(2): 6591-6604 (2001). 태아에 모계 IgGs의 이동을 책임지는, 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 개선된 결합 및 증가된 반감기를 갖는 항체 (Guyer 등, J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim 등, J. Immunol. 24:249 (1994))는, US2005/0014934A1 (Hinton 등)에 기재된다. 이들 항체는 FcRn에 Fc 영역의 결합을 개선하는 거기에 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열 및 증가된 또는 감소된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩타이드 변이체는 미국 특허 번호 6,194,551B1, WO99/51642에 기재된다. 상기 특허 공개의 내용은 특이적으로 본원에서 참고로 편입된다. 참고, 또한, Idusogie 등, J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
항체 유도체
본 발명의 항체는 당해 기술에 공지되어 있고 및 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 폴리머이다. 수용성 폴리머의 비제한 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 코폴리머, 폴리아미노산 (호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 호모폴리머, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코-폴리머, 폴리옥시에틸레이트화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서 그의 안정성 때문에 제조시 이점을 가질 수 있다. 폴리머는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 폴리머의 수는 다양할 수 있고, 1 초과 폴리머가 부착되면, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 폴리머의 수 및/또는 유형은, 비제한적으로, 개선되는 항체의 기능 또는 특정한 특성, 항체 유도체가 정의된 조건 하에 요법에서 사용될지, 등을 포함한 고려사항들에 기반하여 결정될 수 있다.
원하는 특성을 갖는 항체용 스크리닝
본 발명의 항체는 당해 기술 (이들의 일부는 본원에서 개시된다)에서 공지된 다양한 검정에 의해 그의 물리적/화학 특성 및 생물학적 기능을 특징으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 임의의 하나 이상의 하기를 특징으로 한다: FGF (예컨대 FGF1 및/또는 FGF9) 결합의 감소 또는 블록킹, FGFR3 활성화의 감소 또는 블록킹, FGFR3 다운스트림 분자 신호전달의 감소 또는 블록킹, 리간드 (예를 들면, FGF1, FGF9)에 FGFR3 결합의 파괴 또는 블록킹, FGFR3 이량체화의 감소 또는 블록킹, 단량체성 FGFR3의 형성의 촉진, 단량체성 FGFR3에 결합, 및/또는 종양, 세포 증식성 질환 또는 암의 치료 및/또는 예방; 및/또는 FGFR3 발현 및/또는 활성 (예컨대 증가된 FGFR3 발현 및/또는 활성)과 관련된 질환의 치료 또는 예방. 일부 구현예에서, 항체는 증가된 FGFR3 활성화, 증가된 FGFR3 다운스트림 분자 신호전달, 세포자멸적 활성, FGFR3 하향-조절, 및 효과기 기능 (예를 들면, ADCC 활성)에 대하여 스크리닝된다. 특정 구현예에서, 항체는 임의의 하나 이상의 하기를 특징으로 한다: FGFR2 활성화의 감소 또는 블록킹, FGFR2 다운스트림 분자 신호전달의 감소 또는 블록킹, 리간드에 FGFR2 결합의 파괴 또는 블록킹, FGFR2 이량체화의 감소 또는 블록킹, 단량체성 FGFR2의 형성의 촉진, 단량체성 FGFR2에 결합, 및/또는 종양, 세포 증식성 질환 또는 암의 치료 및/또는 예방; 및/또는 FGFR2 발현 및/또는 활성 (예컨대 증가된 FGFR2 발현 및/또는 활성)과 관련된 질환의 치료 또는 예방. 일부 구현예에서, 항체는 증가된 FGFR2 활성화, 증가된 FGFR2 다운스트림 분자 신호전달, FGFR2 하향-조절, 및 효과기 기능 (예를 들면, ADCC 활성)에 대하여 스크리닝된다. 특정 구현예에서, 항체는 임의의 하나 이상의 하기를 특징으로 한다: FGFR2 및 FGFR3 활성화의 감소 또는 블록킹, FGFR2 및 FGFR3 다운스트림 분자 신호전달의 감소 또는 블록킹, 리간드 (예를 들면, FGF1, FGF9)에 FGFR2 및 FGFR3 결합의 파괴 또는 블록킹, FGFR2 및 FGFR3 이량체화의 감소 또는 블록킹, 단량체성 FGFR2 및 FGFR3의 형성의 촉진, 단량체성 FGFR2 및 단량체성 FGFR3에 결합, 및/또는 종양, 세포 증식성 질환 또는 암의 치료 및/또는 예방; 및/또는 FGFR2 및 FGFR3 발현 및/또는 활성 (예컨대 증가된 FGFR2 및/또는 FGFR3 발현 및/또는 활성)과 관련된 질환의 치료 또는 예방. 일부 구현예에서, 항체는 증가된 FGFR2 및 FGFR3 활성화, 증가된 FGFR2 및 FGFR3 다운스트림 분자 신호전달, 세포자멸적 활성, FGFR2 및 FGFR3 하향-조절, 및 효과기 기능 (예를 들면, ADCC 활성)에 대하여 스크리닝된다.
정제된 항체는, 비제한적으로, N-말단 서열분석, 아미노산 분석, 비-변성 크기 배제 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC), 질량 분광분석법, 이온 교환 크로마토그래피 및 파파인 소화를 포함한 일련의 검정을 추가로 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본원에서 생산된 항체는 그의 생물학적 활성에 대하여 분석된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 그의 항원 결합 활성에 대하여 시험된다. 당해 기술에 공지되어 있고 본원에서 사용될 수 있는 항원 결합 검정은 비제한적으로 기술 예컨대 웨스턴 블랏, 방사선면역검정, ELISA (효소 연결된 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침강 검정, 형광성 면역검정, 및 단백질 A 면역검정을 이용한 임의의 직접적인 또는 경쟁적 결합 검정을 포함한다. 예시적인 항원 결합 및 다른 검정은 실시예 섹션에서 아래 제공된다.
세포 성장을 저해하는 항-FGFR2/3 항체가 요구되면, 후보 항체는 세포 성장의 저해를 측정하는 시험관내 및/또는 생체내 검정에서 시험될 수 있다. 세포자멸사를 촉진시키거나 또는 촉진시키지 않는 항-FGFR2/3 항체가 요구되면, 후보 항체는 세포자멸사를 측정하는 검정에서 시험될 수 있다. 암 세포의 성장 및/또는 증식 시험용 방법, 또는 암 세포의 세포자멸사 결정 방법은 당해 기술에서 잘 알려지고 일부는 본원에서 기재되고 예시된다. 세포 성장 및/또는 증식 및/또는 세포자멸사의 예시적 결정 방법은, 예를 들어, 하기를 포함한다: BrdU 편입 검정, MTT, [3H]-티미딘 편입 (예를 들면, TopCount 검정 (PerkinElmer)), 세포 생존력 검정 (예를 들면, CellTiter-Glo (Promega)), DNA 단편화 검정, 카스파제 활성화 검정, 트립탄 청색 배제, 염색질 형태학 검정 등등.
하나의 구현예에서, 본 발명은 효과기 기능을 보유하는 항체를 고려한다. 특정 구현예에서, 항체의 Fc 활성은 측정된다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 부족 (따라서 유사하게 ADCC 활성이 부족)하지만, FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 보장하기 위해 수행될 수 있다. ADCC 매개용 1차 세포, NK 세포는, FcγRIII만을 발현시키고, 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현시킨다. 조혈 세포상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 464쪽 표 3에서 요약된다. 당해 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 예는 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된다. ADCC 활성을 검출하기 위한 검정은 또한 본원에서 예시된다. 상기 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 분자의 ADCC 활성은, 예를 들면, 예컨대 Clynes 등 PNAS (USA) 95:652-656 (1998)에서 개시된 동물 모델에서 생체내 평가될 수 있다. C1q 결합 검정은 항체가 C1q를 결합시킬 수 없고 따라서 CDC 활성이 부족한 것을 확인하기 위해 또한 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들면, Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)에 기재된 바와 같이, CDC 검정은 수행될 수 있다. FcRn 결합 및 생체내 청소능/반감기 결정은 당해 기술에 공지된 방법, 예를 들면, 실시예 섹션에서 기재된 것을 이용하여 또한 수행될 수 있다.
단량체성 FGFR2 및/또는 FGFR3을 결합시키는 항-FGFR2/3 항체가 요구되면, 후보 항체는 단량체성 FGFR2 및/또는 FGFR3에 결합 및 단량체성 FGFR2 및/또는 FGFR3의 형성의 촉진을 측정하는 검정 (예컨대 시험관내 검정)에서 시험될 수 있다. 상기 검정은 당해 기술에 공지되어 있고 일부 검정은 본원에서 기재되고 예시된다.
FGFR2 및/또는 FGFR3 이량체화를 저해하는 항-FGFR2/3 항체가 요구되면, 후보 항체는, 예를 들면, 본원에서 기재된 바와 같이, 이량체화 검정에서 시험될 수 있다.
일부 구현예에서, 후보 항체의 FGFR2 및/또는 FGFR3 작용제 기능이 결정된다. FGFR2 및/또는 FGFR3 항체의 작용제 기능 또는 활성의 평가 방법은 당해 기술에 공지되어 있고 일부가 또한 본원에서 기재된다.
일부 구현예에서, FGFR2 및/또는 FGFR3 수용체 하향-조절을 촉진시키기 위한 FGFR2/3 항체의 능력은, 예를 들면, 본원에서 기재된 및 예시된 방법을 이용하여, 결정된다. 하나의 구현예에서, FGFR2/3 항체는 적합한 시험 세포, 예를 들면, 방광암 세포주 (예를 들면, RT112)로 인큐베이션되고, 적합한 기간 이후, 세포 용해물은 수확되고 총 FGFR2 및 FGFR3 수준에 대하여 조사된다. FACS 분석은 후보 FGFR2/3 항체를 이용한 인큐베이션 이후 표면 FGFR2 및 FGFR3 수용체 수준을 조사하기 위해 또한 사용될 수 있다.
벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법
본 발명의 항체의 재조합 생산을 위하여, 이것을 인코딩한 핵산은 추가 클로닝 (DNA의 증폭)용 또는 발현용 복제가능 벡터에 단리된 및 삽입된다. 항체를 인코딩한 DNA는 종래의 절차를 이용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩한 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리된 및 서열분석된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터의 선택은 사용되는 숙주 세포에 부분적으로 좌우된다. 일반적으로, 바람직한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 (일반적으로 포유동물) 기원이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함한, 임의의 아이소타입의 불변 영역이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있음, 및 상기 불변 영역이 임의의 인간 또는 동물 종으로부터 수득될 수 있음이 인정될 것이다.
a. 원핵 숙주 세포를 이용한 항체의 생성:
i. 벡터 작제
본 발명의 항체의 폴리펩타이드 구성요소를 인코딩한 폴리뉴클레오타이드 서열은 표준 재조합 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체 생산 세포 예컨대 하이브리도마 세포로부터 단리 및 서열분석될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 일단 수득되면, 폴리펩타이드를 인코딩한 서열은 원핵 숙주에서 이종성 폴리뉴클레오타이드를 복제 및 발현시킬 수 있는 재조합 벡터에 삽입된다. 이용가능하고 당해 기술에서 공지된 많은 벡터는 본 발명의 목적을 위하여 사용 될 수 있다. 적절한 벡터의 선택은 벡터에 삽입되는 핵산의 크기 및 벡터를 이용하여 전환되는 특정한 숙주 세포에 주로 좌우될 것이다. 각 벡터는, 거주하는 특정한 숙주 세포를 이용한 그의 혼용성 및 그의 기능 (이종성 폴리뉴클레오타이드의 증폭 또는 발현, 또는 모두)에 의존하여, 다양한 구성요소를 함유한다. 벡터 구성요소는 일반적으로, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 복제 기점, 선택 마커 유전자, 프로모터, 리보솜 결합 부위 (RBS), 신호 서열, 이종성 핵산 삽입 및 전사 종료 서열.
일반적으로, 숙주 세포와 양립가능한 종으로부터 유도되는 레플리콘 및 대조 서열을 함유한 플라스미드 벡터는 이들 숙주와 함께 사용된다. 벡터는 통상적으로 복제 부위, 뿐만 아니라 전환 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 담지한다. 예를 들어, E. 콜리는 pBR322를 이용하여 전형적으로 형질전환되고, 플라스미드는 E. 콜리 종으로부터 유도된다. pBR322는 유전자 인코딩 암피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 함유하고 따라서 형질전환된 세포의 확인을 위하여 용이한 수단을 제공한다. pBR322, 그의 유도체, 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 박테리오파아지는 또한 내인성 단백질의 발현용 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유할 수 있거나, 또는 변형될 수 있다. 특정한 항체의 발현에 사용된 pBR322 유도체의 예는 Carter 등, 미국 특허 번호 5,648,237에 상세히 기재된다.
또한, 숙주 미생물과 양립가능한 레플리콘 및 대조 서열을 함유한 파아지 벡터는 이들 숙주와 함께 형질전환한 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리오파아지 예컨대 λGEM.TM.-11은 민감한 숙주 세포 예컨대 E. 콜리 LE392를 형질전환하기 위해 사용될 수 있는 재조합 벡터의 제조에 이용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 각각의 폴리펩타이드 구성요소를 인코딩한, 2 이상 프로모터-시스트론 쌍을 포함할 수 있다. 프로모터는 그의 발현을 조절하는 시스트론에 업스트림 (5') 위치한 미번역된 조절 서열이다. 원핵 프로모터는 전형적으로 2 클래스, 유도성 및 구성성에 해당한다. 유도성 프로모터는, 배양 조건, 예를 들면, 영양소의 존재 또는 부재 하에 변화 또는 온도 변화에 반응으로 그의 대조하에 시스트론의 전사의 증가된 수준을 시작하는 프로모터이다.
다양한 포텐셜 숙주 세포에 의해 기술적으로 인식된 다수의 프로모터는 잘 알려진다. 선택된 프로모터는 제한 효소 소화를 통해 공급원 DNA로부터 프로모터의 제거 및 본 발명의 벡터에 단리된 프로모터 서열의 삽입에 의해 경쇄 또는 중쇄를 인코딩한 시스트론 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있다. 모든 천연 프로모터 서열 및 많은 이종성 프로모터는 표적 유전자의 직접적인 증폭 및/또는 발현에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이들이 천연 표적 폴리펩타이드 프로모터와 비교된 경우 발현된 표적 유전자의 더 큰 전사 및 고수율을 일반적으로 허용함에 따라 이종성 프로모터가 이용된다.
원핵 숙주에 적합한 프로모터는 하기를 포함한다: PhoA 프로모터, β-갈락타마제 및 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 또는 trc 프로모터. 그러나, 박테리아 (예컨대 다른 공지된 박테리아 또는 파아지 프로모터)에서 기능성인 다른 프로모터는 또한 적합하다. 그의 뉴클레오타이드 서열은 공개되었고, 그렇게 함으로써 임의의 요구된 제한 부위를 공급하기 위한 링커 또는 어댑터를 이용하여 표적 경쇄 및 중쇄 (Siebenlist 등, (1980) Cell 20: 269)를 인코딩한 시스트론에 숙련된 작업자가 이들을 작동가능하게 결찰하도록 할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에서, 재조합 벡터 내의 각 시스트론은 막을 통해 발현된 폴리펩타이드의 전좌를 유도하는 분비 신호 서열 구성요소를 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 구성요소일 수 있거나, 또는 벡터에 삽입되는 표적 폴리펩타이드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여 선택된 신호 서열은 숙주 세포에 의해 기술적으로 인식된 및 가공된 (즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단된) 것이어야 한다. 이종성 폴리펩타이드에 고유한 신호 서열을 인식 및 가공하지 않는 원핵 숙주 세포에 대하여, 신호 서열은, 예를 들어, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환된다: 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, Ipp, 또는 열안정성 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA, 및 MBP. 본 발명의 하나의 구현예에서, 발현 시스템의 모든 시스트론에 사용된 신호 서열은 STII 신호 서열 또는 이의 변이체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 면역글로불린의 생산은 숙주 세포의 세포질에서 발생할 수 있고, 따라서 각 시스트론 내에 분비 신호 서열의 존재를 요구하지 않는다. 그에 관하여, 면역글로불린 경쇄 및 중쇄는 세포질 내에 기능성 면역글로불린을 형성하기 위해 발현된, 폴딩된 및 조립된다. 특정 숙주 균주 (예를 들면, E. 콜리 trxB-균주)는 디설파이드 결합 형성에 호의적인 세포질 조건을 제공하고, 그렇게 함으로써 발현된 단백질 서브유닛의 적절한 폴딩 및 어셈블리를 허용한다. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
본 발명의 항체 발현에 적합한 원핵 숙주 세포는 원시박테리아 및 진정박테리아, 예컨대 그램-음성 또는 그램-양성 유기체를 포함한다. 유용한 박테리아의 예는 하기를 포함한다: 에스케리치아 (예를 들면, E. 콜리), 바실러스 (예를 들면, B. 서브틸리스), 엔테로박테리아, 슈도모나스 종 (예를 들면, P. 에어루기노사), 살모넬라 타이피뮤리움, 세라티아 마르체칸스, 클렙시엘라, 프로테우스, 시겔라, 리조비아, 비트레오스실라, 또는 파라코쿠스. 하나의 구현예에서, 그램-음성 세포가 사용된다. 하나의 구현예에서, E. 콜리 세포가 본 발명을 위한 숙주로서 사용된다. E. 콜리 균주의 예는, 유전자형 W3110 △fhuA (△tonA) ptr3 lac Iq lacL8 △ompT△(nmpc-fepE) degP41 kanR을 갖는 균주 33D3 (미국 특허 번호 5,639,635)을 포함한, 균주 W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) 및 이의 유도체를 포함한다. 다른 균주 및 이의 유도체, 예컨대 E. 콜리 294 (ATCC 31,446), E. 콜리 B, E. 콜리λ 1776 (ΑTCC 31,537) 및 E. 콜리 RV308 (ATCC 31,608)이 또한 적합하다. 이들 예는 제한 보다는 예시적이다. 정의된 유전자형을 갖는 임의의 상기-언급된 박테리아의 유도체의 작제 방법은 당해 기술에 공지되어 있고, 예를 들어, Bass 등, Proteins, 8:309-314 (1990)에 기재된다. 박테리의 세포에서 레플리콘의 복제가능성을 고려하여 적절한 박테리아를 선택하는 것이 일반적으로 필요하다. 예를 들어, 잘 알려진 플라스미드 예컨대 pBR322, pBR325, pACYC177, 또는 pKN410이 레플리콘을 공급하기 위해 사용되는 경우 E. 콜리, 세라티아, 또는 살모넬라 종은 적합하게 사용될 수 있다. 전형적으로 숙주 세포는 단백분해 효소의 최소 양을 분비시켜야 하고, 추가의 프로테아제 저해제는 세포 배양액에 바람직하게는 편입될 수 있다.
ii. 항체 생산
숙주 세포는 상기-기재된 발현 벡터로 형질전환되고 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 원하는 서열을 인코딩한 유전자 증폭에 적절한 경우 변형된 종래의 영양소 배지에서 배양된다.
형질전환은 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 인자에 의해 복제가능하도록 원핵 숙주에 DNA의 도입을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 이용하여 실시된다. 염화칼슘을 사용한 칼슘 치료는 실질적인 세포-벽 장벽을 함유하는 박테리아 세포에 일반적으로 사용된다. 또 다른 형질전환 방법은 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 사용한다. 사용된 추가의 또 다른 기술은 전기천공이다.
본 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 사용된 원핵 세포는 당해 기술에서 공지된 및 선택된 숙주 세포의 배양에 적합한 배지에서 성장된다. 적합한 배지의 예는 Luria 액체배지 (LB) 플러스 필요한 영양소 보충물을 포함한다. 일부 구현예에서, 배지는 또한, 발현 벡터를 함유한 원핵 세포의 성장을 선택적으로 허용하기 위해, 발현 벡터의 작제에 기반하여 선택된, 선택 제제를 함유한다. 예를 들어, 암피실린은 암피실린 내성 유전자를 발현한 세포의 성장을 위하여 배지에 부가된다.
탄소, 질소, 및 무기 포스페이트 공급원 이외에 임의의 필요한 보충물은 또한 단독 또는 또 다른 보충물 또는 배지 예컨대 복합체 질소 공급원과 혼합물로서 도입된 적절한 농도에서 포함될 수 있다. 임의로 배양 배지는 글루타티온, 시스테인, 시스타민, 티오글라이콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵 숙주 세포는 적합한 온도에서 배양된다. E. 콜리 성장을 위하여, 예를 들어, 바람직한 온도는 약 20 ℃ 내지 약 39 ℃, 바람직하게는 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃, 더욱더 바람직하게는 약 30 ℃ 범위이다. 배지의 pH는, 주로 숙주 유기체에 의존하여, 약 5 내지 약 9 범위의 임의의 pH일 수 있다. E. 콜리를 위하여, pH는 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 및 더 바람직하게는 약 7.0이다.
유도성 프로모터가 본 발명의 발현 벡터에서 사용되면, 단백질 발현은 프로모터의 활성화에 적합한 조건하에 유도된다. 본 발명의 하나의 측면에서, PhoA 프로모터는 폴리펩타이드의 전사 제어에 사용된다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포는 유도용 포스페이트-제한 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 포스페이트-제한 배지는 C.R.A.P 배지이다 (참고, 예를 들면, Simmons 등, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). 다양한 다른 유발제는, 당해 기술에서 공지되어 있는 바와 같이, 이용된 벡터 작제물에 따라, 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 발현된 폴리펩타이드는 숙주 세포의 주변세포질에 분비되고 상기로부터 회수된다. 단백질 회수는, 일반적으로 삼투 쇼크, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의한, 미생물의 파괴를 전형적으로 포함한다. 일단 세포가 파괴되면, 세포 잔해 또는 전체의 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 단백질은, 예를 들어, 친화도 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다. 대안적으로, 단백질은 배양 배지에 수송될 수 있고 거기에서 단리될 수 있다. 세포는 배양액으로부터 제거될 수 있고 배양 상청액은 생산된 단백질의 추가 정제를 위하여 여과 및 농축된다. 발현된 폴리펩타이드는 통상적으로 공지된 방법 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블랏 검정을 이용하여 추가로 단리 및 확인될 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에서, 항체 생산은 발효 공정에 의해 대량으로 수행된다. 다양한 대규모 유가식 발효 절차는 재조합 단백질의 생산에 이용가능하다. 대규모 발효는 적어도 1000 리터의 용량, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터의 용량을 갖는다. 이들 발효조는 산소 및 영양소, 특히 글루코오스 (바람직한 탄소/에너지 공급원)을 분산시키기 위해 진탕기 임펠러를 사용한다. 소규모 발효는 일반적으로 용적측정 용량으로 대략 100 리터 이하인 발효조에서 발효를 지칭하고, 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서 단백질 발현의 유도는 세포가 원하는 밀도, 예를 들면, 약 180-220의 OD550으로 적당한 조건 하에 성장된 후 전형적으로 개시되고, 이 단계에서 세포는 초기 고정상이다. 다양한 유발제는, 당해 기술에서 공지된 및 상기 기재된 바와 같이, 이용된 벡터 작제물에 따라, 사용될 수 있다. 세포는 유도에 앞서 더 짧은 기간 동안 성장될 수 있다. 더 긴 또는 더 짧은 유도 시간이 사용될 수 있어도, 세포는 보통 약 12-50 시간 동안 유도된다.
본 발명의 폴리펩타이드의 생산 수율 및 품질을 개선하기 위해, 다양한 발효 조건이 변형될 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체 폴리펩타이드의 적절한 어셈블리 및 폴딩을 개선하기 위해, 추가의 벡터 과발현 샤페론 단백질, 예컨대 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD, 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤페론 활성을 갖는 펩티딜프롤릴 시스,트랜스-이소머라제)는 숙주 원핵 세포를 공동-형질전환하기 위해 사용될 수 있다. 샤페론 단백질은 박테리아 숙주 세포에서 생산된 이종성 단백질의 적절한 폴딩 및 용해도를 용이하게 하기 위해 입증하였다. Chen 등, (1999) J. Biol. Chem. 274:19601-19605; Georgiou 등, 미국 특허 번호 6,083,715; Georgiou 등, 미국 특허 번호 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105; Ramm and Pluckthun, (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie 등, (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.
발현된 이종성 단백질 (특히 단백분해적으로 감수성인 것)의 단백질분해를 극소화하기 위해, 단백분해 효소가 결핍된 특정 숙주 균주는 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포 균주는 공지된 박테리아 프로테아제 예컨대 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI, 및 이들의 조합을 인코딩한 유전자에서 유전적 돌연변이(들)에 영향을 미치기 위해 변형될 수 있다.
일부 E. 콜리 프로테아제-결핍된 균주는 이용가능하고, 예를 들어, Joly 등, (1998), supra; Georgiou 등, 미국 특허 번호 5,264,365; Georgiou 등, 미국 특허 번호 5,508,192; Hara 등, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996)에 기재된다.
하나의 구현예에서, 단백분해 효소가 결핍된 및 하나 이상의 샤페론 단백질을 과발현한 플라스미드로 형질전환된 E. 콜리 균주는 본 발명의 발현 시스템에서 숙주 세포로서 사용된다.
iii. 항체 정제
당해 기술에서 공지된 표준 단백질 정제 방법은 이용될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예시적이다: 면역친화성 또는 이온교환 컬럼 상의 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온교환 수지 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 암모늄 설페이트 침전, 및, 예를 들어, Sephadex G-75를 이용한, 겔 여과.
하나의 측면에서, 고상에서 고정된 단백질 A는 본 발명의 전장 항체 생성물의 면역친화성 정제에 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 높은 친화도로 결합시키는 스타필로코쿠스 아우레아로부터 41kD 세포 벽 단백질이다. Lindmark 등, (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. 단백질 A가 고정되는 고상은 바람직하게는 유리 또는 실리카 표면을 포함한 컬럼, 더 바람직하게는 제어된 기공 유리 컬럼 또는 규산 컬럼이다. 일부 적용에서, 컬럼은 오염물질의 비특이적 부착을 예방하기 위한 시도로, 시약, 예컨대 글리세롤로 코팅되었다.
정제의 제1 단계로서, 상기 기재된 바와 같이 세포 배양액으로부터 유도된 제제는 단백질 A에 당해 항체의 특이적 결합을 허용하기 위해 단백질 A 고정된 고상에 적용된다. 고상은 그 다음 세정되어 고상에 비-특이적으로 결합된 오염물질을 제거한다. 마지막으로 당해 항체는 용출에 의해 고상에서 회수된다.
b. 진핵 숙주 세포를 이용한 항체의 생성:
벡터 구성요소는 비제한적으로, 하나 이상의 하기를 일반적으로 포함한다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 인자, 프로모터, 및 전사 종료 서열.
(i) 신호 서열 구성요소
진핵 숙주 세포에서 사용을 위한 벡터는 또한 당해 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 선택된 이종성 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 기술적으로 인식된 및 가공된 (즉, 신호 펩티다아제에 의해 절단된) 것이다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비성 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 이용가능하다.
상기 전구체 영역을 위한 DNA는 항체를 인코딩한 DNA에 대해 해독틀에서 결찰된다.
(ii) 복제 기점
일반적으로, 복제 기점 구성요소는 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다. 예를 들어, SV40 기원이 전형적으로 사용 될 수 있는 것은 단지 초기 프로모터를 함유하기 때문이다.
(iii) 선택 유전자 구성요소
발현 및 클로닝 벡터는 선택 유전자, 또한 일명 선별 마커를 함유할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 내성을 부여하는, (b) 관련된 경우, 영양요구성 결핍을 보충하는, 또는 (c) 복합체 배지로부터 이용불가능한 임계적 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다.
선택 반응식의 하나의 예는 숙주 세포의 성장을 저지하기 위해 약물을 사용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환되는 상기 세포는 약물 내성을 부여한 단백질을 생산하고 따라서 선택 레지멘을 견뎌낸다. 상기 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선별 마커의 또 다른 예는 항체 핵산, 예컨대 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 탈탄산효소, 등을 차지하는데 능숙한 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 메토트렉세이트 (Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 함유하는 배양 배지에서 모든 형질전환체의 배양에 의해 최초로 확인된다. 야생형 DHFR이 이용된 경우 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성에서 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (예를 들면, ATCC CRL-9096)이다.
대안적으로, 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 또 다른 선별 마커 예컨대 아미노글리코시드 3'-인산전달효소 (APH)를 인코딩한 DNA 서열로 형질전환된 또는 공동-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별 마커 예컨대 아미노글리코시드성 항생제, 예를 들면, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418에 대하여 선택 제제를 함유한 배지에서 세포 성장에 의해 선택될 수 있다. 참고 미국 특허 번호 4,965,199.
(iv) 프로모터 구성요소
발현 및 클로닝 벡터는 보통 숙주 유기체에 의해 기술적으로 인식된 및 항체 폴리펩타이드 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터 서열은 진핵생물로 공지된다. 사실상 모든 진핵 유전자는 전사가 개시되는 부위로부터 대략 25 내지 30 염기 업스트림 위치한 AT-풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시로부터 70 내지 80 염기 업스트림 발견된 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단에서 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리의 부가용 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 모든 이들 서열은 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
포유동물 숙주 세포내 벡터로부터 항체 폴리펩타이드 전사는, 예를 들어, 바이러스 예컨대 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 및 유인원 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 수득된 프로모터에 의해, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들면, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열-충격 프로모터로부터 제어되고, 단 상기 프로모터는 숙주 세포 시스템과 양립가능하다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 SV40 제약 단편으로서 편리하게 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 즉각적인 초기 프로모터는 HindIII E 제약 단편으로서 편리하게 수득된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 이용한 포유동물 숙주에서 DNA 발현용 시스템은 미국 특허 번호 4,419,446에서 개시된다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 번호 4,601,978에 기재된다. 대안적으로, 루 육종 바이러스 긴 말단 반복은 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 인자 구성요소
더 높은 진핵생물에 의한 본 발명의 항체 폴리펩타이드를 인코딩한 DNA의 전사는 벡터에 인핸서 서열의 삽입에 의해 종종 증가된다. 많은 인핸서 서열은 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백, 및 인슐린)으로부터 공지된다. 전형적으로, 그러나, 진핵 세포 바이러스로부터 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 기원 (bp 100- 270)의 말기쪽에서 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 말기쪽에서 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 참고 또한 진핵 프로모터의 활성화를 위한 향상 인자에 관하여 Yaniv, Nature 297:17-18 (1982). 인핸서는 항체 폴리펩타이드-인코딩 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에서 위치한다.
(vi) 전사 종료 구성요소
진핵 숙주 세포에서 사용된 발현 벡터는 전사의 종료 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 또한 전형적으로 함유할 것이다. 그와 같은 서열은 진핵 또는 바이러스 DNAs 또는 cDNAs의 미번역된 영역인, 5' 및, 가끔 3'로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 항체를 인코딩한 mRNA의 미번역된 부분에서 폴리아데닐레이트화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 세그먼트를 함유한다. 하나의 유용한 전사 종료 구성요소는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. 참고 WO94/11026 및 거기에 개시된 발현 벡터.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 전환
본원에서 벡터내 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는, 척추동물 숙주 세포를 포함한, 본원에서 기재된 더 높은 진핵생물 세포를 포함한다. 배양액 (조직 배양액)에서 척추동물 세포의 번식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 하기이다: SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계; 인간 배아 신장 계 (현탁 배양액에서 성장을 위하여 아클론화된 293 또는 293 세포, Graham 등, J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 갯과 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather 등, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 계 (Hep G2).
숙주 세포는 항체 생산을 위하여 상기-기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고 프로모터 도입, 형질전환체 선택, 또는 원하는 서열을 인코딩한 유전자 증폭에 적절한 경우 변형된 종래의 영양소 배지에서 배양된다.
(viii) 숙주 세포 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지 예컨대 Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형된 이글 배지 ((DMEM), Sigma)는 숙주 세포 배양에 적합하다. 또한, Ham 등, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes 등, Anal. Biochem.102:255 (1980), 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지는 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 임의의 이들 배지는 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 버퍼 (예컨대 HEPES), 뉴클레오타이드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대 GENTAMYCIN™ 약물), (마이크로몰 범위에서 최종 농도로 보통 존재한 무기 화합물로서 정의된) 미량 원소, 및 글루코오스 또는 등가 에너지 공급원으로 필요에 따라 보강될 수 있다.
임의의 다른 필요한 보충물은 당해 분야의 숙련가에 공지될 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH, 등등은 발현을 위하여 선택된 숙주 세포를 이용하여 이전에 사용된 것이고 당업자에 명백할 것이다.
(ix) 항체의 정제
재조합 기술을 이용한 경우, 항체는 세포내로 생산될 수 있거나, 또는 배지에 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내로 생산되면, 제1 단계로서, 미립자 잔해, 숙주 세포 또는 용해된 단편은, 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지에 분비된 경우, 상기 발현 시스템으로부터 상청액은 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 단위를 이용하여 일반적으로 먼저 농축된다. 프로테아제 저해제 예컨대 PMSF는 단백질분해를 저해하기 위해 임의의 전술한 단계에서 포함될 수 있고 항생제는 우발적인 오염물질의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어, 하이드록실인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있고, 친화도 크로마토그래피는 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 아이소타입에 의존한다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄에 기반된 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark 등, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 아이소타입에 대하여 및 인간 γ3에 대하여 권고된다 (Guss 등, EMBO J. 5:15671575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스는 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스 예컨대 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유량 및 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 다른 단백질 정제 기술 예컨대 이온교환 컬럼상 분별화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™상 크로마토그래피 음이온 또는 양이온 교환 수지상 크로마토그래피 (예컨대 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전이 회수되는 항체에 의존하여 또한 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들), 당해 항체 및 오염물질을 포함한 혼합물은 낮은 염 농도 (예를 들면, 약 0-0.25M 염)에서 바람직하게는 수행된, 약 2.5-4.5의 pH에서 용출 버퍼를 이용하여 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피 처리될 수 있다.
면역접합체
본 발명은 또한, 세포독성제 예컨대 화학치료제, 약물, 성장 저해된 제제, 독소 (예를 들면, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원, 또는 이들의 단편의 효소적으로 활성 독소), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사선접합체)에 접합된 본원에서 기재된 임의의 항-FGFR2/3 항체를 포함한, 면역접합체 (상호교환적으로 일명 "항체-약물 콘주게이트" 또는 "ADC")를 제공한다.
세포독성 또는 세포증식억제성 제제, 즉, 암의 치료에서 종양 세포를 사멸 또는 저해하기 위한 약물의 국부 전달용 항체-약물 콘주게이트의 사용 (Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172; 미국 특허 번호 4,975,278)은 종양에 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 거기에 세포내 축적을 허용하고, 여기에서 이들 비접합된 약물 제제의 전신 투여는 정상 세포 뿐만 아니라 제거되기 바라는 종양 세포에 독성의 허용될 수 없는 수준을 초래할 수 있다 (Baldwin 등, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera 등 (ed.s), pp. 475-506). 최소 독성을 갖는 최대 효능은 그렇게 함으로써 추구된다. 모든 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체는 이들 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland 등, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). 이들 방법에서 사용된 약물은 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다 (Rowland 등, (1986) 상기). 항체-독소 콘주게이트에서 사용된 독소는 하기를 포함한다: 박테리아 독소 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소 예컨대 리신, 작은 분자 독소 예컨대 젤다나마이신 (Mandler 등 (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler 등, (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler 등, (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), 메이탄시노이드 (EP 1391213; Liu 등, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), 및 칼리키아마이신 (Lode 등, (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman 등, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342). 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포이소머라제 저해를 포함한 기전에 의해 그의 세포독성 및 세포증식억제성 효과를 가져올 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합된 경우 불활성 또는 덜 활성인 경향이 있다.
ZEVALIN® (이브리투모맙 티욱세탄, Biogen/Idec)은 티오우레아 링커-킬레이터에 의해 결합된 정상 및 악성 B 림프구 및 111In 또는 90Y 방사선동위원소의 표면에서 발견된 CD20 항원에 대해 유도된 쥣과 IgG1 카파 모노클로날 항체로 구성된 항체-방사선동위원소 콘주게이트이다 (Wiseman 등, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman 등, (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig 등, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig 등, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). ZEVALIN이 B-세포 비-호지킨 림프종 (NHL)에 대해 활성을 가져도, 투여는 대부분의 환자에서 중증 및 장기적인 혈구감소증을 초래한다. MYLOTARG™ (젬투주맙 오조가마이신, Wyeth Pharmaceuticals), 칼리키아마이신에 연결된 hu CD33 항체로 구성된 항체 약물 콘주게이트는 주사로 급성 골수 백혈병의 치료를 위하여 2000년에 승인되었다 (Drugs of the Future (2000) 25(7):686; 미국 특허 번호 4,970,198; 5,079,233; 5,585,089; 5,606,040; 5,6937,62; 5,739,116; 5,767,285; 5,773,001). 칸투주맙 메르탄신 (Immunogen, Inc.), 메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 디설파이드 링커 SPP를 통해 연결된 huC242 항체로 구성된 항체 약물 콘주게이트는 CanAg를 발현시키는 암, 예컨대 결장, 췌장, 위, 및 다른 암의 치료를 위하여 II 기 시험에서 진전중이다. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), 메이탄시노이드 약물 모이어티, DM1에 연결된 항-전립선 특이적 막 항원 (PSMA) 모노클로날 항체로 구성된 항체 약물 콘주게이트는 전립선 종양의 포텐셜 치료를 위하여 개발중이다. 아우리스타틴 펩타이드, 아우리스타틴 E (AE) 및 모노메틸아우리스타틴 (MMAE), 돌라스타틴의 합성 유사체는 키메라성 모노클로날 항체 cBR96 (암종에 관해 루이스 Y에 특이적) 및 cAC10 (혈액 악성종양에 관해 CD30에 특이적)에 접합되었고 (Doronina 등, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) 치료 개발 중이다.
면역접합체의 생성에서 유용한 화학치료제는 본원에서 (예를 들면, 상기) 기재된다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성 독소 및 이의 단편은 하기를 포함한다: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 에어루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라 이테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 젤로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센. 참고, 예를 들면, WO 93/21232, 1993년 10월 28일 공개. 다양한 방사선핵종은 방사선접합된 항체의 생산에 이용가능하다. 예는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re를 포함한다. 항체 및 세포독성제의 콘주게이트는 하기를 이용하여 작성된다: 다양한 이중작용성 단백질-커플링제 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중작용성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디석신이미딜 우베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디나이트로벤젠). 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta 등, Science, 238: 1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 항체에 방사선뉴클레오타이드의 접합용 예시적 킬레이트제이다. 참고 WO94/11026.
하나 이상의 작은 분자 독소, 예컨대 칼리키아마이신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우로스타틴, 트리코테센, CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체와 항체의 콘주게이트가 또한 본원에서 고려된다.
i. 메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 구현예에서, 면역접합체는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 본 발명의 항체 (전장 또는 단편)를 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합의 억제에 의해 작용하는 유사분열 저해제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목 메이테너스 세라타로부터 최초로 단리되었다 (미국 특허 번호 3,896,111). 그 뒤에, 특정 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하는 것이 발견되었다 (미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체는, 예를 들어, 하기에 개시된다: 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533.
메이탄시노이드 약물 모이어티가 항체 약물 콘주게이트에서 매력적인 약물 모이어티인 것은 이들이 하기이기 때문이다: (i) 발효 생성물의 발효 또는 화학 변형, 유도체화에 의해 상대적으로 접근가능함, (ii) 항체에 비-디설파이드 링커를 통해 접합에 적합한 작용기로 유도체화에 잘 받아들여짐, (iii) 플라즈마에서 안정함, 및 (iv) 다양한 종양 세포주에 대해 유효함.
메이탄시노이드를 함유한 면역접합체, 그의 제조 방법, 및 그의 치료 용도는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 개시되고, 그의 개시내용은 참고로 이로써 명확히 편입된다. Liu 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)은 인간 대장암에 대해 관한 모노클로날 항체 C242에 연결된 메이탄시노이드 지정된 DM1을 포함한 면역접합체를 기재하였다. 콘주게이트는 배양된 결장 암 세포에 대하여 매우 세포독성인 것으로 발견되었고, 생체내 종양 성장 검정에서 항종양 활성을 보여주었다. Chari 등, Cancer Research 52:127-131 (1992)는 메이탄시노이드가 인간 결장 암 세포주에서 항원에 결합한 쥣과 항체 A7, 또는 HER-2/neu 종양유전자를 결합시키는 또 다른 쥣과 모노클로날 항체 TA.1에 디설파이드 링커를 통해 접합된 면역접합체를 기재한다. TA.1-메이탄시노이드 콘주게이트의 세포독성은, 3 x 105 HER-2 표면 항원 / 세포를 발현시키는, 인간 유방암 세포주 SK- BR-3에서 시험관내 시험되었다. 약물 콘주게이트는, 항체 분자 당 메이탄시노이드 분자의 수를 증가시킴으로써 증가될 수 있는, 유리 메이탄시노이드 약물과 유사한 세포독성의 정도를 달성하였다. A7-메이탄시노이드 콘주게이트는 마우스에서 낮은 전신 세포독성을 보여주었다.
항체-메이탄시노이드 콘주게이트는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성의 유의미하게 감소 없이 메이탄시노이드 분자에 항체의 화학적으로 연결에 의해 제조된다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,208,020 (이의 개시내용은 참고로 이로써 명확히 편입된다). 독소/항체의 하나의 분자가 노출된 항체의 사용에 대하여 세포독성을 향상시킨다고 예상되어도, 항체 분자 당 접합된 3-4 메이탄시노이드 분자의 평균은 항체의 기능 또는 용해도에 부정적으로 영향 없이 표적 세포의 세포독성 향상에서 효늘을 보여주었다. 메이탄시노이드는 당해 기술에서 잘 알려지고 공지된 기술에 의해 합성될 수 있거나 또는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020에 그리고 위에서 참조된 다른 특허 및 비특허 공개에 개시된다. 바람직한 메이탄시노이드는 방향족 고리에서 또는 메이탄시놀 분자, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르의 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체이다.
예를 들어, 하기에 개시된 것을 포함하는, 항체-메이탄시노이드 콘주게이트 제조를 위한 많은 연결기가 당해 기술에서 공지된다: 미국 특허 번호 5,208,020 또는 유럽 특허 0 425 235 B1, Chari 등, Cancer Research 52:127-131 (1992), 및 미국 특허 출원 번호 10/960,602 (2004년 10월 8일 출원) (이들의 개시내용은 이로써 명확히 참고로 편입된다). 링커 구성요소 SMCC를 포함한 항체-메이탄시노이드 콘주게이트는 2004년 10월 8일 출원된 미국 특허 출원 번호 10/960,602에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 연결기는, 상기-확인된 특허에서 개시된 바와 같이, 디설파이드기, 티오에테르기, 산 불안정기, 광불안정기, 펩티다아제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기를 포함하고, 디설파이드 및 티오에테르기가 바람직하다. 추가의 연결기가 본원에서 기재 및 예시된다.
항체 및 메이탄시노이드의 콘주게이트는 하기를 이용하여 제조될 수 있다: 다양한 이중작용성 단백질 커플링제 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중작용성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디석신이미딜 우베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디나이트로벤젠). 특히 바람직한 커플링제는 디설파이드 연결을 제공하기 위해 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) (Carlsson 등, Biochem. J. 173:723-737 (1978)) 및 N-석신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP)를 포함한다.
링커는, 연결의 유형에 따라, 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 연결은 종래의 커플링 기술을 이용하여 하이드록실기와 반응에 의해 형성될 수 있다. 반응은 하이드록실기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실기로 변형된 C-15 위치, 및 하이드록실기를 갖는 C-20 위치에서 발생할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
ii. 아우리스타틴 및 돌라스타틴
일부 구현예에서, 면역접합체는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩타이드 유사체 및 유도체, 아우리스타틴에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 동력학, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포성 분할을 방해하는 것으로 보여지고 (Woyke 등 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) 항암 (미국 특허 번호 5,663,149) 및 항진균 활성 (Pettit 등, (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)을 갖는다. 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩타이드 약물 모이어티의 N (아미노) 말단 또는 C (카복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다 (WO 02/088172).
예시적 아우리스타틴 구현예는 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 미국 시리즈 번호 10/983,340 (2004년 11월 5일 출원) (이의 개시내용은 전체적으로 참고로 명확히 편입된다)에 개시된, N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함한다.
전형적으로, 펩타이드-기반 약물 모이어티는 2 이상 아미노산 및/또는 펩타이드 단편 사이에서 펩타이드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 그와 같은 펩타이드 결합은, 예를 들어, 펩타이드 화학의 분야에서 잘 알려진 액상 합성 방법 (참고 E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", Volume 1, pp. 76-136, 1965, Academic Press)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 하기의 방법에 따라 제조될 수 있다: 미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588; Pettit 등, (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465; Pettit 등, (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., 등, Synthesis, 1996, 719-725; and Pettit 등, (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863. 참고 또한 Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 미국 시리즈 번호 10/983,340 (2004년 11월 5일 출원, 이로써 전체적으로 참고로 편입됨 (예를 들면, 링커에 접합된 모노메틸발린 화합물 예컨대 MMAE 및 MMAF의 제조 방법 및 링커 개시).
iii. 칼리키아마이신
다른 구현예에서, 면역접합체는 하나 이상의 칼리키아마이신 분자에 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 항생제의 칼리키아마이신 계열은 하위-피코몰 농도에서 이중-가닥 DNA 절단을 생산할 수 있다. 칼리키아마이신 계열의 콘주게이트의 제조에 대하여, 참고 미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296 (모두 American Cyanamid Company 소유). 사용될 수 있는 칼리키아마이신의 구조적 유사체는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1(Hinman 등, Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode 등, Cancer Research 58:2925-2928 (1998) 및 American Cyanamid 소유의 상기 언급된 미국 특허). 항체가 접합될 수 있는 또 다른 항-종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 모든 칼리키아마이신 및 QFA는 작용의 세포내 부위를 갖고 원형질막을 쉽게 통과하지 않는다. 따라서, 항체 매개된 내재화를 통한 이들 제제의 세포성 흡수는 그의 세포독성 효과를 크게 향상시킨다.
iv. 다른 세포독성제
본 발명의 항체에 접합될 수 있는 다른 항종양 제제는 하기를 포함한다: BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 번호 5,053,394 및 5,770,710에 기재된 제제 공지된 집합적으로 LL-E33288 복합체의 계열, 뿐만 아니라 에스페라마이신 (미국 특허 번호 5,877,296).
사용될 수 있는 효소적으로 활성 독소 및 이의 단편은 하기를 포함한다: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 에어루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 젤로닌, 마이토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센. 참고, 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개).
본 발명은 추가로 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들면, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역접합체를 고려한다.
종양의 선택적 파괴를 위하여, 항체는 고 방사성 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소는 방사선접합된 항체의 생산에 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 그리고 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 콘주게이트가 검출에 사용된 경우, 섬광계수법 연구용 방사선 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 (또한 자기 공명 영상, mri로서 공지된) 핵 자기 공명 (NMR) 영상화용 스핀 표지, 예컨대 요오드-123 어게인, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
방사선- 또는 다른 표지는 콘주게이트에서 공지된 방식으로 편입될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 생합성될 수 있거나 또는, 예를 들어, 수소 대신 불소-19를 포함한 적합한 아미노산 전구체를 이용한 화학 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 표지 예컨대 tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111은 펩타이드에서 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. IODOGEN 방법 (Fraker 등 (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57은 요오드-123을 편입시키기 위해 사용될 수 있다. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)는 다른 방법을 상세히 기재한다.
항체 및 세포독성제의 콘주게이트는 하기를 이용하여 제조될 수 있다: 다양한 이중작용성 단백질 커플링제 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중작용성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디석신이미딜 우베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디나이트로벤젠). 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta 등, Science 238:1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사선뉴클레오타이드의 접합용 예시적 킬레이트제이다. 참고 WO94/11026. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정한 링커, 펩티다아제-감수성 링커, 광불안정한 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커 (Chari 등, Cancer Research 52:127-131 (1992); 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 비제한적으로, 하기 가교결합제 시약으로 제조된 ADC를 명확히 고려한다: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 그리고 상업적으로 이용가능한 SVSB (석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트) (예를 들면, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A 제). 참고 페이지 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
v. 항체 약물 콘주게이트의 제조
본 발명의 항체 약물 콘주게이트 (ADC)에서, 항체 (Ab)는, 링커 (L)를 통해, 하나 이상의 약물 모이어티 (D), 예를 들면 약 1 내지 약 20 약물 모이어티 / 항체에 접합된다. 식 I의 ADC는, 하기를 포함한, 당해 분야의 숙련가에 공지된 유기 화학 반응, 조건, 및 시약을 사용하여, 몇 개의 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 공유 결합을 통해, Ab-L을 형성하기 위해, 2가 링커 시약과 항체의 친핵성 기의 반응, 그 다음 약물 모이어티 D와 반응; 및 (2) 공유 결합을 통해, D-L을 형성하기 위해, 2가 링커 시약과 약물 모이어티의 친핵성 기의 반응, 그 다음 항체의 친핵성 기와 반응. ADC의 추가의 제조 방법은 본원에서 기재된다.
Ab-(L-D)p I
링커는 하나 이상의 링커 구성요소로 구성될 수 있다. 예시적 링커 구성요소는 하기를 포함한다: 6-말레이미도카프로일 ("MC"), 말레이미도프로파노일 ("MP"), 발린-시트룰린 ("val-cit"), 알라닌-페닐알라닌 ("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카보닐 ("PAB"), N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트 ("SPP"), N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트 ("SMCC'), 및 N-석신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트 ("SIAB"). 추가의 링커 구성요소는 당해 기술에 공지되어 있고 일부는 본원에서 기재된다. 참고 또한 "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", 미국 시리즈 번호 10/983,340 (2004년 11월 5일 출원, 이들의 내용은 전체적으로 참고로 이로써 편입된다).
일부 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적 아미노산 링커 구성요소는 디펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 또는 펜타펩타이드를 포함한다. 예시적 디펩타이드는 하기를 포함한다: 발린-시트룰린 (vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (af 또는 ala-phe). 예시적 트리펩타이드는 하기를 포함한다: 글리신-발린-시트룰린 (gly- val-cit) 및 글리신-글리신-글리신 (gly-gly-gly). 아미노산 링커 구성요소를 포함하는 아미노산 잔기는 자연적으로 발생하는 것, 뿐만 아니라 소수의 아미노산 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 유사체, 예컨대 시트룰린을 포함한다. 아미노산 링커 구성요소는 특정한 효소, 예를 들어, 종양-관련된 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소 절단을 위한 그의 선택성에서 설계 및 최적화될 수 있다.
항체상의 친핵성 기는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: (i) N-말단 아민기, (ii) 측쇄 아민기, 예를 들면 라이신, (iii) 측쇄 티올기, 예를 들면 시스테인, 및 (iv) 항체가 당화되는 당 하이드록실기 또는 아미노기. 아민기, 티올기, 및 하이드록실기는 친핵성이고 하기를 포함한 링커 시약 및 링커 모이어티 상에서 친전자성 기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있다: (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 기. 특정 항체는 환원성 사슬간 디설파이드, 즉 시스테인 브릿지를 갖는다. 항체는 환원제 예컨대 DTT (디티오트레이톨)로 치료에 의해 링커 시약과 접합에 대하여 반응성으로 제조될 수 있다. 각 시스테인 브릿지는 따라서, 이론적으로, 2 반응성 티올 친핵체를 형성할 것이다. 추가의 친핵성 기는 아민의 티올로의 전환을 초래하는 2-이미노티올란 (트라우트 시약)과 라이신의 반응을 통해 항체에 도입될 수 있다. 반응성 티올기는 1, 2, 3, 4, 이상 시스테인 잔기의 도입 (예를 들면, 하나 이상의 비-천연 시스테인 아미노산 잔기를 포함한 돌연변이체 항체의 제조)에 의해 항체에 도입될 수 있다.
본 발명의 항체 약물 콘주게이트는, 링커 시약 또는 약물에서 친핵성 치환체와 반응할 수 있는, 친전자성 모이어티를 도입하는 항체의 변형에 의해 또한 생산될 수 있다. 당화된 항체의 당류는, 예를 들면, 링커 시약 또는 약물 모이어티의 아민기와 반응할 수 있는 알데하이드기 또는 케톤기를 형성하기 위해, 퍼아이오데이트 산화 시약으로 산화될 수 있다. 수득한 이민 쉬프 염기 기는 안정한 연결을 형성할 수 있거나, 또는, 예를 들면, 안정한 아민 연결기를 형성하기 위해 보로하이드라이드 시약에 의해 환원될 수 있다. 하나의 구현예에서, 글락토오스 옥시다제 또는 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 당화된 항체의 탄수화물 부분의 반응은 약물상의 적절한 기와 반응할 수 있는 단백질내 카보닐 (알데하이드 및 케톤) 기를 수득할 수 있다(Hermanson, Bioconjugate Techniques). 또 다른 구현예에서, N-말단 세린 또는 트레오닌 잔기를 함유한 단백질은 나트륨 메타-퍼아이오데이트와 반응할 수 있어서, 제1 아미노산 대신 알데하이드의 생산을 초래한다 (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; 미국 특허 번호 5,362,852). 그와 같은 알데하이드는 약물 모이어티 또는 링커 친핵체와 반응될 수 있다.
마찬가지로, 약물 모이어티상의 친핵성 기는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라자이드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 하기를 포함한 링커 모이어티 및 링커 시약상의 친전자성 기와 공유 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는 아릴하이드라자이드기: (i) 활성 에스테르 예컨대 NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드 예컨대 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드 기.
대안적으로, 항체 및 세포독성제를 포함한 융합 단백질은, 예를 들면, 재조합 기술 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 콘주게이트의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩타이드를 인코딩한 영역에 의해 분리된 또는 서로 인접한 콘주게이트의 2 부분을 인코딩한 각각의 영역을 포함할 수 있다.
추가의 또 다른 구현예에서, 항체는 종양 사전-표적화에서 이용을 위한 "수용체" (상기 스트렙타비딘)에 접합될 수 있고 (여기에서 항체-수용체 콘주게이트는 개체에 투여된다), 그 후 투명제를 이용한 순환으로부터 미결합된 콘주게이트를 제거한 다음 세포독성제 (예를 들면, 방사선뉴클레오타이드)에 접합되는 "리간드" (예를 들면, 아비딘)을 투여한다.
항- FGFR2 /3 항체의 이용 방법
본 발명은 상기 치료제의 활성으로부터 유익한 효과를 제공하기 위해 의도된 특이적 치료 레지멘의 일부로서 FGFR2/3 항체의 사용을 특징으로 한다. 본 발명은 다양한 병기에서 다양한 유형의 암 치료에 특히 유용하다.
용어 암은, 비제한적으로 전-암성 성장, 양성 종양, 및 악성 종양을 포함한, 증식성 질환의 집합을 포용한다. 양성 종양은 기원의 부위에서 국재화되어 있고 침투물에 대한 수용력을 갖지 않거나, 원격 부위에 침입하지 않거나, 또는 전이하지 않는다. 악성 종양은 침입하고 이들 주위에서 다른 조직을 손상시킬 것이다. 이들은 또한 최초 부위로부터 떨어져 나가는 능력을 얻을 수 있고, 보통 림프절이 위치한 림프 시스템을 통해 또는 혈류를 통해 신체의 다른 부위에 확산 (전이)할 수 있다. 1차 종양은 이들이 발생하는 조직의 유형에 의해 분류되고; 전이성 종양은 암 세포가 유도되는 조직 유형에 의해 분류된다. 경시적으로, 악성 종양의 세포는 더욱 비정상이 되고 덜 비슷한 정상 세포처럼 보인다. 암 세포의 외관에서 상기 변화는 종양 등급으로 불리우고, 암 세포는 고-분화된 (저 등급), 중간-분화된, 저-분화된, 또는 미분화된 (고 등급) 것으로 기재된다. 고-분화된 세포는 상당히 정상 외관이고 이들이 유래한 정상 세포를 닮는다. 미분화된 세포는 매우 비정상이 되어 세포의 기원을 결정하는 것이 더 이상 가능하지 않은 세포이다.
암 병기화 시스템은 암이 해부상으로 얼마나 멀리 확산하였는지 및 동일한 병기화 그룹에서 유사한 예후 및 치료를 가진 환자를 두기 위한 시도를 기재한다. 몇 개의 시험은 생검 및 특정 영상화 시험 예컨대 가슴 x-선, 유방조영술, 골 스캔, CT 스캔, 및 MRI 스캔. 혈액 검사를 포함한 암의 병기화를 돕기 위해 수행될 수 있고 임상 평가는 암이 특정 기관까지 확산하였는지를 검출하기 위해 그리고 환자의 전체 건강을 평가하기 위해 또한 사용된다.
암을 병기화하기 위해, 미국 암 연합 위원회는 TNM 분류 시스템을 이용하여 문자 카테고리로 암, 특히 고체 종양을 최초로 등급을 정한다. 암은 문자 T (종양 크기), N (촉지가능한 결절), 및/또는 M (전이)으로 지정된다. T1, T2, T3, 및 T4는 원발 병변의 크기 증가를 기재하고; N0, N1, N2, N3은 점진적으로 진전하는 결절 관여를 지시하고; 그리고 M0 및 M1은 원격 전이의 부재 또는 존재를 반영한다.
전체 병기 그룹화 또는 로마식 숫자 병기화로서 또한 공지된, 제2 병기화 방법에서, 암은, 원발 병변의 크기 뿐만 아니라 확산된 결절 및 원격 전이의 존재를 편입시키는, 0 내지 IV 기로 분할된다. 상기 시스템에서, 사례는 로마식 숫자 I 내지 IV로 나타낸 4개의 병기로 그룹화되거나, 또는 "재발성"으로 분류된다. 일부 암에 대하여, 0 기는 "동소" 또는 "Tis", 예컨대 유방암에 대하여 유관상피내암종 또는 소엽상피내암종으로서 지칭된다. 높은 등급 샘종은 0 기로서 또한 분류될 수 있다. 일반적으로, I 기 암은 보통 경화성인 작게 국재화된 암이고, 반면에 IV 기는 보통 수술불가능한 또는 전이성 암을 나타낸다. II 및 III 기 암은 보통 국소로 진전되고/되거나 국부 림프절의 포함을 나타낸다. 일반적으로, 더 높은 병기 숫자는, 더 큰 종양 크기 및/또는 1차 종양에 인접한 인근 림프절 및/또는 기관에 암의 확산을 포함한, 더욱 광범위한 질환을 나타낸다. 이들 병기는 정확하게 정의되지만, 정의는 암의 각 종류에 대하여 상이하고 숙련가에 공지된다.
많은 암 등록체계, 예컨대 NCI's Surveillance, Epidemiology, 및 End Results Program (SEER)은 요약 병기를 사용한다. 상기 시스템은 모든 유형의 암에 대하여 사용된다. 암 사례를 아래 5개의 주요 카테고리로 그룹화한다:
동소는 시작된 세포의 층에서만 존재하는 초기 암이다.
국재화된은, 확산의 증거 없이. 시작된 장기에 제한되는 암이다.
국부적은 인근 림프절 또는 기관 및 조직에 최초 (1차) 부위를 넘어 확산하는 암이다.
원격은 원발 부위부터 원격 기관 또는 원격 림프절까지 확산한 암이다.
미공지된은 병기를 나타내기 위한 충분한 정보가 없는 사례를 기재하기 위해 사용된다.
또한, 암이 1차 종양이 제거된 수개월 또는 수년 이후 재발하는 것이 공통이다. 모든 가시적인 종양이 박멸된 이후 재발하는 암은 재발성 질환으로 불리운다. 1차 종양의 영역에서 재발하는 질환은 국소로 재발성이고, 전이로서 재발하는 질환은 원격 재발로 지칭된다.
종양은 고형 종양 또는 비-고형 또는 연 조직 종양일 수 있다. 연 조직 종양의 예는 하기를 포함한다: 백혈병 (예를 들면, 만성적 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성숙한 B-세포 급성 림프아구성 백혈병, 만성적 림프구성 백혈병, 포림프구 백혈병, 또는 모세포 백혈병) 또는 림프종 (예를 들면, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종, 또는 호지킨 질환). 고형 종양은 혈액, 골수, 또는 림프계 이외의 신체 조직의 임의의 암을 포함한다. 고형 종양은 상피성 세포 기원의 것 및 비-상피성 세포 기원의 것으로 추가로 분할될 수 있다. 상피성 세포 고형 종양의 예는 위장관, 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 머리 및 목, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식기 장기, 비뇨기, 방광, 및 피부의 종양을 포함한다. 비-상피성 기원의 고형 종양은 육종, 뇌 종양, 및 골 종양을 포함한다. 종양의 다른 예는 정의 섹션에서 기재된다.
일부 구현예에서, 본원에서 환자는 예를 들면, 요법 이전 및/또는 동안 및/또는 이후 진단 시험 처리된다. 일반적으로, 진단 시험이 수행되면, 샘플은 요법이 필요한 환자로부터 수득될 수 있다. 대상체가 암을 가진 경우, 샘플은, 비제한적으로, 혈액, 소변, 타액, 복수 유체, 또는 유도체 예컨대 혈청 및 혈당, 등등을 포함하여, 종양 샘플, 또는 다른 생물학적 샘플, 예컨대 생물학적 유체일 수 있다.
본원에서 생물학적 샘플은 고정된 샘플, 예를 들면 포르말린 고정된, 파라핀-포매된 (FFPE) 샘플, 또는 냉동된 샘플일 수 있다.
mRNA 또는 단백질의 발현의 다양한 결정 방법은, 비제한적으로, 유전자 발현 프로파일링, 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 포함한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 마이크로어레이 분석, 유전자 발현 (SAGE)의 시리즈 분석, MassARRAY, Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)에 의한 유전자 발현 분석, 프로테오믹스, 면역조직화학 (IHC), 등을 포함한다. 바람직하게는 mRNA가 정량화된다. 상기 mRNA 분석은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 기술을 이용하여, 또는 마이크로어레이 분석에 의해 바람직하게는 수행된다. PCR이 이용된 경우, PCR의 바람직한 형태는 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)이다. 하나의 구현예에서, 중앙 또는 상위에 있으면, 예를 들면 동일한 종양-유형의 다른 샘플과 비교되면, 상기 언급된 유전자의 하나 이상의 발현은 양성 발현으로 간주된다. 중앙 발현 수준은 유전자 발현의 측정과 본질적으로 동시발생으로 결정될 수 있거나, 또는 이전에 결정될 수 있다.
mRNA 단리, 정제, 프라이머 확대 및 증폭을 포함한, RNA 공급원으로서 고정된, 파라핀-포매된 조직을 이용하여 프로파일링 유전자 발현을 위한 대표적인 프로토콜의 단계는 다양한 공개된 간행물 기사 (예를 들어: Godfrey 등 J. Molec . Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht 등, Am. J. Pathol . 158: 419-29 (2001))에서 주어진다. 간단히, 대표적인 공정은 파라핀-포매된 종양 조직 샘플의 약 10 마이크로그램 두께 섹션 절단으로 시작한다. RNA는 그 다음 추출되고, 단백질 및 DNA는 제거된다. RNA 농도의 분석 이후, RNA 치유 및/또는 증폭 단계는 포함될 수 있고, 필요하면, RNA는 유전자 특이적 프로모터 그 다음 PCR을 이용하여 역으로 전사된다. 마지막으로, 데이터는 조사된 종양 샘플에서 확인된 특징적인 유전자 발현 패턴을 기반으로 환자에 이용가능한 최상의 치료 옵션(들)을 확인하기 위해 분석된다.
유전자 또는 단백질 발현의 검출은 직접적으로 또는 간접적으로 결정될 수 있다.
(직접적으로 또는 간접적으로) 암에서 FGFR2 및/또는 FGFR3의 발현 또는 전좌 또는 증폭을 결정할 수 있다. 다양한 진단/예후 검정은 여기에 이용가능하다. 하나의 구현예에서, FGFR3 과발현은 IHC에 의해 분석될 수 있다. 종양 생검으로부터 파라핀 포매된 조직 섹션은 IHC 검정 처리될 수 있고 아래와 같이 FGFR2 및/또는 FGFR3 단백질 염색 세기 기준에 일치될 수 있다:
스코어 0 무 염색이 관측되거나 또는 막 염색이 종양 세포의 10% 미만에서 관측된다.
스코어 1+ 희미한/간신히 인지가능한 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 검출된다. 세포는 그의 막의 부분적으로 단지 염색된다.
스코어 2+ 약 내지 중간의 완벽한 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 관측된다.
스코어 3+ 중간 내지 강한 완벽한 막 염색이 종양 세포의 10% 초과에서 관측된다.
일부 구현예에서, 각각의 FGFR2 및 FGFR3 과발현 평가에 대하여 0 또는 1+ 스코어를 갖는 종양은 FGFR2 및 FGFR3을 과발현하지 않는 것으로 특성화될 수 있고, 반면에 2+ 또는 3+ 스코어를 갖는 종양은 각각의 FGFR2 및 FGFR3을 과발현하는 것으로 특성화될 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 FGFR2 및 FGFR3의 종양 과발현은 발현된 각각의 FGFR2 및 FGFR3 분자의 복사본의 수 / 세포에 상응하는 면역조직화학 스코어에 의해 평가될 수 있고, 생화학적으로 결정될 수 있다:
0 = 0-90 복사본/세포,
1+ = 적어도 약 100 복사본/세포,
2+ = 적어도 약 1000 복사본/세포,
3+ = 적어도 약 10,000 복사본/세포.
대안적으로, 또는 추가로, FISH 검정은 종양에서 FGFR2 및/또는 FGFR3 증폭 또는 전좌의 존재 및/또는 정도 (만일 있다면)를 결정하기 위해 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 종양 조직에서 수행될 수 있다.
FGFR2 및 FGFR3 활성화는 직접적으로 (예를 들면, 포스포-ELISA 시험, 또는 포스포릴화된 수용체의 다른 검출 수단에 의해) 또는 간접적으로 (예를 들면, 활성화된 다운스트림 신호전달 경로 구성요소의 검출, 수용체 이량체 (예를 들면, 동형이량체, 이종이량체)의 검출, 유전자 발현 프로파일의 검출 등등에 의해 결정될 수 있다.
유사하게, 구성적 FGFR2 및 FGFR3 및/또는 리간드-독립적 또는 리간드-의존적 FGFR2 및 FGFR3은 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들면, 구성적 활성과 상관된 수용체 돌연변이의 검출, 구성적 활성과 상관된 수용체 증폭의 검출 등등에 의해) 검출될 수 있다.
핵산 돌연변이의 검출 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 종종, 비필연적으로, 샘플내 표적 핵산은 돌연변이가 존재하는지의 결정을 위하여 물질의 원하는 양을 제공하도록 증폭된다. 증폭 기술은 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 증폭된 생성물이 돌연변이가 되는 것으로 의심되는 특정한 아미노산/핵산 서열 위치를 포함하는 한, 증폭된 생성물은 당해 단백질을 인코딩한 모든 핵산 서열을 포함할 수 있거나 또는 포함할 수 없다.
하나의 예에서, 돌연변이의 존재는 돌연변이된 핵산을 인코딩한 핵산에 특이적으로 하이브리드화, 및 상기 하이브리드화의 검출이 가능한 핵산 프로브와 샘플로부터 핵산의 접촉에 의해 결정될 수 있다. 하나의 구현예에서, 프로브는, 예를 들어 방사선동위원소 (3H, 32P, 33P 등), 형광성 제제 (로다민, 형광 등) 또는 발색 제제로 검출가능하게 표지된다. 일부 구현예에서, 프로브는 안티센스 올리고머, 예를 들어 PNA, 모폴리노- 포스포르아미데이트, LNA 또는 2'-알콕시알콕시이다. 프로브는 약 8 뉴클레오타이드 내지 약 100 뉴클레오타이드, 또는 약 10 내지 약 75, 또는 약 15 내지 약 50, 또는 약 20 내지 약 30일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 핵산 프로브는 샘플내 FGFR2 및/또는 FGFR3 돌연변이 확인용 키트로 제공되고, 상기 키트는 핵산 인코딩 FGFR2 및/또는 FGFR3에서 돌연변이의 부위에 또는 부위에 인접하여 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 본 키트는 키트를 이용한 하이브리드화 시험의 결과에 기반하여 FGFR2 및/또는 FGFR3 길항제를 갖는 FGFR2 및/또는 FGFR3 돌연변이를 함유하는 종양을 가진 환자의 치료용 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다.
돌연변이는 상응하는 핵산 인코딩 야생형 FGFR2 및/또는 FGFR3의 전기영동 이동도와 증폭된 핵산의 전기영동 이동도를 비교함으로써 또한 검출될 수 있다. 이동도의 차이는 증폭된 핵산 서열에서 돌연변이의 존재를 나타낸다. 전기영동 이동도는 임의의 적절한 분자 분리 기술에 의해, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔상에서 결정될 수 있다.
핵산은 효소 돌연변이 검출 (EMD) (Del Tito 등, Clinical Chemistry 44:731-739, 1998)을 이용하여 돌연변이의 검출에 대해 또한 분석될 수 있다. EMD는, 핵산 변경 예컨대 점 돌연변이, 삽입 및 결실에서 비롯된 염기쌍 미스매치에 의해 야기된 구조적 뒤틀림을 검출 및 절단하기까지 이중-가닥 DNA를 따라 스캔하는, 박테리오파아지 리졸바제 T4 엔도뉴클레아제 VII을 이용한다. 리졸바제 절단, 예를 들어 겔 전기영동에 의해 형성된 2개의 짧은 단편의 검출은 돌연변이의 존재를 나타낸다. EMD 방법의 이점은 증폭 반응, 샘플 정제에 대한 필요성 제거, 하이브리드화 시간의 단축, 및 신호-대-잡음 비 증가로부터 직접적으로 분석된 점 돌연변이, 결실, 및 삽입을 확인하기 위한 단일 프로토콜이다. 최대 4 kb 크기로 최대 20-배 과잉의 정상 핵산 및 단편을 함유한 혼합된 샘플이 분석될 수 있다. 그러나, EMD 스캐닝은 돌연변이 양성 샘플에서 발생하는 특정한 염기 변화를 확인하지 않고, 따라서 종종 필요하면 특이적 돌연변이를 확인하기 위해 추가의 서열분석 절차를 필요로 한다. CEL I 효소는, 미국 특허 번호 5,869,245에 입증된 바와 같이, 리졸바제 T4 엔도뉴클레아제 VII에 유사하게 사용될 수 있다.
돌연변이 검출용 또 다른 단순 키트는 혈색소증을 유발한 HFE, TFR2 및 FPN1 유전자에서 다중 돌연변이의 검출을 위하여 혈색소증 StripAssayTM (Viennalabs http://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)에 유사한 역 하이브리드화 시험지이다. 그와 같은 검정은 PCR에 의한 증폭 이후 서열 특이적 하이브리드화에 기반된다. 단일 돌연변이 검정에 대하여, 마이크로플레이트-기반 검출 시스템은 적용될 수 있고, 반면에 다중-돌연변이 검정에 대하여, 시험지는 "매크로-어레이"로서 사용될 수 있다. 키트는 샘플 제조, 증폭 및 돌연변이 검출용 사용준비된 시약을 포함할 수 있다. 멀티플렉스 증폭 프로토콜은 편리를 제공하고 매우 제한된 용적을 갖는 샘플의 시험을 허용한다. 간단한 StripAssay 형식을 이용하여, 20 이상의 돌연변이 시험은 고비용의 장비 없이 5 시간 미만에서 완료될 수 있다. DNA는 샘플로부터 단리되고 표적 핵산은 (예를 들면, PCR에 의해) 시험관내 증폭되고 일반적으로 단일 ("멀티플렉스") 증폭 반응에서 바이오틴-표지된다. 증폭 생성물은 그 다음 고형 지지체 예컨대 프로브가 평행선 또는 밴드로서 고정된 시험지상에 고정된 (야생형 및 돌연변이체 특이적) 올리고뉴클레오타이드 프로브에 선택적으로 하이브리드화된다. 결합된 바이오티닐화된 앰플리콘은 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 및 색상 기질을 이용하여 검출된다. 그와 같은 검정은 본 발명의 돌연변이의 모든 또는 임의의 서브셋을 검출할 수 있다. 특정한 돌연변이체 프로브 밴드에 관하여, 3 신호전달 패턴 중 하나가 가능하다: (i) 정상 핵산 서열을 나타내는 야생형 프로브만을 위한 밴드, (ii) 이종접합성 유전자형을 나타내는 모든 야생형 및 돌연변이체 프로브를 위한 밴드, 및 (iii) 동종접합성 돌연변이체 유전자형을 나타내는 돌연변이체 프로브만을 위한 밴드. 따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 샘플로부터 표적 FGFR2 및/또는 FGFR3 핵산 서열의 단리 및/또는 증폭 (이로써 증폭 생성물은, 리간드에 검출가능한 결합 파트너를 포함하는 프로브와 증폭 생성물을 접촉하는, 리간드를 포함하고 프로브는 본 발명의 돌연변이를 특이적으로 하이브리드화할 수 있다), 및 그 다음 상기 증폭 생성물에 상기 프로브의 하이브리드화 검출을 포함하는 본 발명의 돌연변이 검출 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 리간드는 바이오틴이고 결합 파트너는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함한다. 하나의 구현예에서, 결합 파트너는 색상 기질로 검출가능한 스트렙타비딘-알칼리성을 포함한다. 하나의 구현예에서, 프로브는 예를 들어 시험지에 고정되고 여기에서 상이한 돌연변이에 상보적인 프로브는 서로 분리된다. 대안적으로, 증폭된 핵산은 방사선동위원소로 표지되고 이 경우에 프로브는 검출가능한 표지를 포함할 필요가 없다.
야생형 유전자의 변경은 모든 형태의 돌연변이 예컨대 삽입, 역전, 결실, 및/또는 점 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 돌연변이는 체세포이다. 체세포 돌연변이는 특정 조직, 예를 들면, 종양 조직에서만 발생하는 것이고, 생식 계열에서 선천적이지 않다. 생식 계열 돌연변이는 임의의 신체 조직에서 발견될 수 있다.
표적 핵산을 포함한 샘플은 당해 기술에서 잘 알려진, 및 종양의 특정한 유형 및 위치에 적절한 방법에 의해 수득될 수 있다. 조직 생검은 종양 조직의 대표적인 조각을 수득하기 위해 종종 사용된다. 대안적으로, 종양 세포는 당해 종양 세포를 함유한다고 공지된 또는 여겨진 조직/유체의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들면, 폐암 병변의 샘플은 절제, 기관지경검사, 미세 침상 흡인, 기관지 찰과법에 의해, 또는 가래, 늑막 유체 또는 혈액으로부터 수득될 수 있다. 돌연변이체 유전자 또는 유전자 생성물은 종양 또는 다른 신체 샘플 예컨대 소변, 가래 또는 혈청으로부터 검출될 수 있다. 종양 샘플에서 돌연변이체 표적 유전자 또는 유전자 생성물의 검출을 위하여 상기 논의된 동일한 기술은 다른 신체 샘플에 적용될 수 있다. 암 세포는 종양에서 제거되고 상기 신체 샘플에서 나타난다. 상기 신체 샘플의 스크리닝에 의해, 단순 초기 진단은 질환 예컨대 암에 대하여 달성될 수 있다. 또한, 요법의 진행은 돌연변이체 표적 유전자 또는 유전자 생성물에 대하여 상기 신체 샘플의 시험에 의해 더욱 쉽게 모니터링될 수 있다.
종양 세포를 위한 조직 제조의 농축 수단은 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 조직은 파라핀 또는 크라이오스탯 섹션으로부터 단리될 수 있다. 암 세포는 유세포측정 또는 레이저 포착 현미해부에 의해 정상 세포로부터 또한 분리될 수 있다. 정상 세포로부터 종양 분리를 위한 이들, 뿐만 아니라 다른 기술은 당해 기술에 공지되어 있다. 종양 조직이 정상 세포로 매우 오염되면, 오염 및/또는 위 양성/음성 결과의 극소화 기술이 공지되고, 이의 일부가 본원에서 아래기재되어도, 돌연변이의 검출은 더욱 어려울 수 있다. 예를 들어, 샘플은 당해 종양 세포와 관련되는 것으로 공지된 그러나 상응하는 정상 세포가 아닌, 또는 그 반대인 (돌연변이를 포함한) 바이오마커의 존재에 대하여 또한 평가될 수 있다.
표적 핵산에서 점 돌연변이의 검출은 당해 기술에서 잘 알려진 기술을 이용하여 표적 핵산의 분자 클로닝 및 핵산의 서열분석에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 증폭 기술 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)은 종양 조직으로부터 게놈 DNA 제제에서 직접적으로 표적 핵산 서열을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 증폭된 서열의 핵산 서열은 그 다음 결정될 수 있고 돌연변이는 그로부터 확인될 수 있다. 증폭 기술, 예를 들면, Saiki 등, Science 239:487, 1988; 미국 특허 번호 4,683,203 및 4,683,195에 기재된 바와 같이 폴리머라제 연쇄 반응은 당해 기술에서 잘 알려진다.
적절한 프라이머의 설계 및 선택이 당해 기술에서 잘 확립된 기술인 것을 유의해야 한다.
당해 기술에서 공지된, 리가제 연쇄 반응은 표적 핵산 서열을 증폭시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 참고, 예를 들면, Wu 등, Genomics, Vol. 4, pp. 560-569 (1989). 또한, 대립유전자 특이적 PCR로서 공지된 기술은 또한 사용될 수 있다. 참고, 예를 들면, Ruano and Kidd, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p. 8392, 1989. 상기 기술에 있어서, 그의 3' 말단에서 특정한 표적 핵산 돌연변이에 하이브리드화하는 프라이머가 사용된다. 특정한 돌연변이가 존재하지 않으면, 증폭 생성물은 관측되지 않는다. 증폭 불응 돌연변이계 (ARMS)는, 유럽 특허 출원 공개 번호 0332435, 및 Newton 등, Nucleic Acids Research, Vol. 17, p.7, 1989에 개시된 바와 같이, 또한 사용될 수 있다. 유전자의 삽입 및 결실은 클로닝, 서열분석 및 증폭에 의해 또한 검출될 수 있다. 또한, 유전자 또는 주위의 마커 유전자를 위한 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 프로브는 대립유전자의 스코어 변경 또는 다형성 단편의 삽입에 사용될 수 있다. 단일가닥 형태 다형성 (SSCP) 분석은 대립유전자의 염기 변화 변이체를 검출하기 위해 또한 사용될 수 있다. 참고, 예를 들면 Orita 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 86, pp. 2766-2770, 1989, 및 Genomics, Vol. 5, pp. 874-879, 1989. 당해 기술에서 공지된 바와 같이 삽입 및 결실 검출용 다른 기술은 또한 사용될 수 있다.
야생형 유전자의 변경은 유전자의 야생형 발현 생성물의 변경을 기반으로 또한 검출될 수 있다. 그와 같은 발현 생성물은 모든 mRNA 뿐만 아니라 단백질 생성물을 포함한다. 점 돌연변이는 mRNA의 증폭 및 서열분석에 의해 또는 mRNA로부터 제조된 cDNA의 분자 클로닝을 통해 검출될 수 있다. 클로닝된 cDNA의 서열은 당해 기술에 공지되어 있는 DNA 서열분석 기술을 이용하여 결정될 수 있다. cDNA는 또한 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 서열분석될 수 있다.
미스매치는 100% 상보적이지 않은 하이브리드화된 핵산 듀플렉스이다. 총 상보성의 부족은 결실, 삽입, 역전, 치환 또는 프레임 이동 돌연변이에 기인될 수 있다. 미스매치 검출은 표적 핵산에서 점 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이들 기술이 서열분석보다 덜 감수성일 수 있는 반면, 이들은 다수의 조직 샘플에서 수행하기에 더 단순하다. 미스매치 절단 기술의 예는 Winter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 7575, 1985, 및 Meyers 등, Science, Vol. 230, p. 1242, 1985에 상세히 기재되는, RNase 보호 방법이다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 인간 야생형 표적 핵산에 상보적인 표지화된 리보프로브의 사용을 포함할 수 있다. 리보프로브 및 조직 샘플로부터 유도된 표적 핵산은 함께 어닐링 (하이브리드화)되고 그 뒤에 듀플렉스 RNA 구조에서 일부 미스매치를 검출할 수 있는 효소 RNase A로 소화된다. 미스매치가 RNase A에 의해 검출되면, 미스매치의 부위에서 절단한다. 따라서, 어닐링된 RNA 제제가 전기영동 겔 매트릭스에서 분리되는 경우, 미스매치가 RNase A에 의해 검출 및 절단되면, 리보프로브 및 mRNA 또는 DNA용 전장 듀플렉스 RNA보다 더 작은 RNA 생성물이 보여질 것이다. 리보프로브는 표적 핵산 mRNA 또는 유전자의 전장일 필요는 없지만, 표적 핵산의 부분일 수 있고, 단 돌연변이됨을 의심하는 위치를 포함한다. 리보프로브가 표적 핵산 mRNA 또는 유전자의 세그먼트만을 포함하면, 원한다면 미스매치용 전체의 표적 핵산 서열을 스크리닝하기 위해 수많은 이들 프로브를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
유사한 방식으로, DNA 프로브는, 예를 들어 효소 또는 화학 절단을 통해 미스매치를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 참고, 예를 들면, Cotton 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85, 4397, 1988; and Shenk 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 989, 1975.
대안적으로, 미스매치는 매치된 듀플렉스에 비하여 미스매치된 듀플렉스의 전기영동 이동도에서 쉬프트에 의해 검출될 수 있다. 참고, 예를 들면, Cariello, Human Genetics, Vol. 42, p. 726, 1988. 리보프로브 또는 DNA 프로브로, 돌연변이를 함유할 수 있는 표적 핵산 mRNA 또는 DNA는 하이브리드화 이전 증폭될 수 있다. 특히 변화가 전체 재배열, 예컨대 결실 및 삽입이면, 표적 핵산 DNA에서 변화는 서던 하이브리드화를 이용하여 또한 검출될 수 있다.
증폭된 표적 핵산 DNA 서열은 또한 대립유전자-특이적 프로브를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 이들 프로브는 핵산 올리고머이고, 각각의 이들은 공지된 돌연변이를 잠복한 표적 핵산 유전자의 영역을 함유한다. 예를 들어, 하나의 올리고머는, 표적 유전자 서열의 부분에 상응하는, 길이 약 30 뉴클레오타이드일 수 있다. 수많은 상기 대립유전자-특이적 프로브의 이용에 의해, 표적 핵산 증폭 생성물은 표적 유전자에서 이전에 확인된 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 증폭된 표적 핵산 서열을 갖는 대립유전자-특이적 프로브의 하이브리드화는, 예를 들어, 나일론 필터상에서 수행될 수 있다. 엄격한 하이브리드화 조건하에서 특정한 프로브에 대한 하이브리드화는 대립유전자-특이적 프로브에서와 같이 종양 조직에서 동일한 돌연변이의 존재를 나타낸다.
야생형 표적 유전자의 변경은 또한 상응하는 야생형 단백질의 변경을 위한 스크리닝에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자 생성물을 갖는 모노클로날 항체 면역반응성은 조직, 예를 들어 유전자 생성물 (단백질)의 특정한 돌연변이된 위치에 결합하기 위해 공지된 항체를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 항체는 결실된 엑손에 결합하는 또는 표적 단백질의 결실된 부분을 포함한 형태적 에피토프에 결합하는 것일 수 있다. 동족 항원의 부족은 돌연변이를 나타낼 것이다. 변이 대립유전자의 생성물에 특이적인 항체는 또한 돌연변이체 유전자 생성물을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 그와 같은 면역학적 검정은 당해 기술에서 공지된 임의의 편리한 형식으로 실시될 수 있다. 이들은 웨스턴 블랏, 면역조직화학 검정 및 ELISA 검정을 포함한다. 변경된 단백질을 검출하기 위한 임의의 수단은 야생형 표적 유전자의 변경을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
프라이머 쌍은 핵산 증폭 기술 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열의 결정에 유용하다. 단일가닥 DNA 프라이머의 쌍은 표적 서열의 증폭을 준비하기 위해 표적 핵산 서열 이내 또는 주위의 서열에 어닐링될 수 있다. 대립유전자-특이적 프라이머는 또한 사용될 수 있다. 그와 같은 프라이머는 단지 특정한 돌연변이체 표적 서열에 어닐링하고, 따라서 템플레이트로서 돌연변이체 표적 서열의 존재하에 생성물을 증폭시킬 뿐이다. 증폭된 서열의 후속의 클로닝을 용이하게 하기 위해, 프라이머는 그의 말단에 첨부된 제한 효소 부위 서열을 가질 수 있다. 그와 같은 효소 및 부위는 당해 기술에 공지되어 있다. 프라이머 자체는 당해 기술에 공지되어 있는 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 프라이머는 상업적으로 이용가능한올리고뉴클레오타이드 합성기를 이용하여 제조될 수 있다. 특정한 프라이머의 설계는 당해분야의 기술 내에서 양호하다.
핵산 프로브는 수많은 목적에 유용하다. 이들은 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리드화에서 및 이미 상기 논의된 점 돌연변이 검출용 RNase 보호 방법에서 사용될 수 있다. 프로브는 표적 핵산 증폭 생성물을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 또한 다른 기술을 이용하여 야생형 유전자 또는 mRNA와 미스매치를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 미스매치는 효소 (예를 들면, S1 뉴클레아제), 화학물질 (예를 들면, 하이드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드 및 피페리딘), 또는 완전히 매칭된 하이브리드와 비교된 경우 미스매치된 하이브리드의 전기영동 이동도에서 변화를 이용하여 검출될 수 있다. 이들 기술은 당해 기술에 공지되어 있다. 참고 Novack 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, p. 586, 1986. 일반적으로, 프로브는 키나제 도메인 외부의 서열에 상보적이다. 핵산 프로브의 전체 배터리는 표적 핵산에서 돌연변이 검출용 키트를 포함하기 위해 사용될 수 있다. 키트는 당해 표적 서열의 넓은 영역에 하이브리드화를 허용한다.
만일 리보프로브가 mRNA와 미스매치를 검출하기 위해 사용되면, 표적 유전자의 mRNA에 일반적으로 상보적이다. 센스 가닥에 상보적이기 때문에 리보프로브는 따라서 상응하는 유전자 생성물에 대하여 코딩한다는 점에서 안티센스 프로브이다. 리보프로브는 일반적으로, 당해 기술에서 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있는, 방사성, 비색, 또는 형광 물질로 표지될 것이다. 만일 리보프로브가 DNA와 미스매치를 검출하기 위해 사용되면 극성, 센스 또는 안티-센스일 수 있다. 유사하게, DNA 프로브는 또한 미스매치를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 사례에서, 암은 FGFR2 및/또는 FGFR3을 과발현하거나 또는 과발현하지 않는다. 수용체 과발현은 (예를 들면 면역조직화학 검정을 통해; IHC) 세포의 표면에서 존재한 수용체 단백질의 증가된 수준을 평가함으로써 진단 또는 예후 검정에서 결정될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 예를 들면 형광성 동소 하이브리드화를 통해, 세포에서 수용체-인코딩 핵산의 수준을 평가할 수 있다 (FISH; 참고 1998년 10월 공개된 WO98/45479), 서던 블랏팅, 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술, 예컨대 실시간 정량적 PCR (RT-PCR). 상기 검정 이외에, 다양한 생체내 검정은 당업자에 이용가능하다. 예를 들어, 검출가능한 표지, 예를 들면 방사성 동위원소로 임의로 표지된 항체에 환자의 신체내 세포를 노출시킬 수 있고, 환자내 세포에 항체의 결합은 예를 들면 방사능용 외부 스캐닝 또는 항체에 이전에 노출된 환자로부터 얻어진 생검의 분석에 의해 평가될 수 있다.
화학치료제
본 발명의 조합 요법은 하나 이상의 화학치료제(들)을 추가로 포함할 수 있다. 조합된 투여는, 분리된 제형 또는 단일 약학적 제형을 이용한 공동투여 또는 동시 투여, 및 한쪽 순서로 연속 투여를 포함하고, 여기에서 바람직하게는 양쪽 (또는 모든) 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 동안의 기간이 있다.
화학치료제는, 투여되면, 이를 위해 공지된, 또는 항대사물질 화학치료제의 투여에 기인하는 약물 또는 음성 부작용의 조합된 작용 때문에 임의로 낮아진 복용량으로 보통 투여된다. 상기 화학치료제에 대한 제조 및 복용 계획은 제조자 사용설명서에 따라 또는 당업자에 의해 실험적으로 결정된 바와 같이 사용될 수 있다.
조합될 수 있는 다양한 화학치료제는 본원에서 개시된다.
일부 구현예에서, 조합되는 화학치료제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 레날리도마이드 (REVLIMID), 프로테오좀 저해제 (예컨대 보르테조밉 (VELCADE) 및 PS342), 보라 탁소이드 (도세탁셀 및 파클리탁셀 포함), 빈카 (예컨대 비노렐빈 또는 빈블라스틴), 백금 화합물 (예컨대 카보플라틴 또는 시스플라틴), 방향화효소 저해제 (예컨대 레트로졸, 아나스트라졸, 또는 엑세메스탄), 항-에스트로겐 (예를 들면 풀베스트란트 또는 타목시펜), 에토포시드, 티오테파, 사이클로포스파마이드, 페메트렉세드, 메토트렉세이트, 리포좀 독소루비신, 페길화된 리포좀 독소루비신, 카페시타빈, 젬시타빈, 멜탈린, 독소루비신, 빈크리스틴, COX-2 저해제 (예를 들면, 셀레콕십), 또는 스테로이드 (예를 들면, 덱사메타손 및 프레드니손). 일부 구현예 (예를 들면, t(4;14)+ 다발성 골수종의 치료를 포함한 구현예에서, 덱사메타손 및 레날리도마이드, 또는 덱사메타손, 또는 보르테조밉, 또는 빈크리스틴, 독소루비신 및 덱사메타손, 또는 탈리도마이드 및 덱사메타손, 또는 리포좀 독소루비신, 빈크리스틴 및 덱사메타손, 또는 레날리도마이드 및 덱사메타손, 또는 보르테조밉 및 덱사메타손, 또는 보르테조밉, 독소루비신, 및 덱사메타손은 조합된다. 일부 구현예 (예를 들면, 방광암을 포함한 구현예)에서, 5-플루오로우라실, 또는 시스플라틴, 또는 시스플라틴 및 5-플루오로우라실과 조합으로 젬시타빈 및 시스플라틴, 또는 탁산 (예를 들면, 파클리탁셀, 도세탁셀), 또는 페메트렉세드, 또는 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 독소루비신 및 시스플라틴, 또는 카보플라틴, 또는 미토마이신 C는 조합된다.
제형, 복용량 및 투여
본 발명에서 사용된 치료제는 양호한 의료 실시와 일치된 방식으로 제형화, 복용, 및 투여될 것이다. 상기 맥락에서 고려 인자는 치료받는 특정한 질환, 치료받는 특정한 대상체, 개별 환자의 임상 조건, 질환의 원인, 제제의 전달 부위, 투여의 방법, 투여의 일정, 조합되는 제제의 약물-약물 상호작용, 및 개업의에 공지된 다른 인자를 포함한다.
치료적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 활성 성분을 임의의 생리적으로 허용가능한 캐리어, 부형제 또는 안정제와 혼합시킴으로써 당해 기술에서 공지된 표준 방법을 이용하여 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). 허용가능한 캐리어는, 하기를 포함한다: 염수, 또는 버퍼 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 아스코르브산을 포함한 항산화제; 저분자량 (약 10 미만 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™, 또는 PEG.
임의로, 그러나 바람직하게는, 제형은 약학적으로 허용가능한 염, 바람직하게는 염화나트륨을, 그리고 바람직하게는 대략 생리적 농도에서 함유한다. 임의로, 본 발명의 제형은 약학적으로 허용가능한 보존제를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서 보존제 농도는 0.1 내지 2.0%, 전형적으로 v/v 범위이다. 적합한 보존제는 약제학적 기술에서 공지된 것을 포함한다. 벤질 알코올, 페놀, m-크레졸, 메틸파라벤, 및 프로필파라벤이 바람직한 보존제이다. 임의로, 본 발명의 제형은 약학적으로 허용가능한 계면활성제를 0.005 내지 0.02%의 농도에서 포함할 수 있다.
본원에서 제형은 또한 치료받는 특정한 적응증을 위하여 필요에 따라 1 초과 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 그와 같은 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로구형체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스의 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐, 각각에 갇힐 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기에 개시된다.
서방성 제제는 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유한 고형 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 하기를 포함한다: 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글라이콜산 코폴리머 예컨대 LUPRON DEPOT™ (락트산-글라이콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능 마이크로구형체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산. 폴리머 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글라이콜산이 100 일 넘는 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 특정 하이드로겔은 단기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 신체에 장기간 잔류하는 동안, 이들은 37 ℃에서 수분에 노출 결과로서 변성 또는 응집할 수 있고, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성에서 가능한 변화를 초래한다. 합리적인 전략은 관여된 기전에 의존하여 안정화를 위하여 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설파이드 교환을 통해 분자간 S-S 결합 형성이 되는 것으로 발견되면, 안정화는 설프하이드릴 잔기의 변경, 산성 용액으로부터 동결건조, 수분 함량 제어, 적절한 첨가제 이용, 및 특이적 폴리머 매트릭스 조성물 개발에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 치료제는, 공지된 방법, 예컨대 볼러스로서 정맥내 투여에 따라 또는 일정 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척추강내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로에 의해, 인간 환자에 투여된다. 생체외 전략은 치료적 적용에 또한 사용될 수 있다. 생체외 전략은 FGFR2, FGFR3, 또는 FGFR2/3 길항제를 인코딩한 폴리뉴클레오타이드를 갖는 대상체로부터 수득된 형질감염 또는 형질도입 세포를 포함한다. 형질감염된 또는 형질도입된 세포는 그 다음 대상체로 되돌아온다. 세포는, 비제한적으로, 조혈 세포 (예를 들면, 골수 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, T 세포, 또는 B 세포), 섬유아세포, 상피성 세포, 내피 세포, 케라틴생성세포, 또는 근육 세포를 포함한 임의의 광범위의 유형일 수 있다.
예를 들어, FGFR2/3 길항제가 항체이면, 항체는, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 및 비강내, 및, 원한다면 국부 면역억제성 치료를 위하여, 병소내 투여를 포함한, 임의의 적당한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 항체는, 특히 항체의 감소 용량으로 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 바람직하게는 투약은, 투여가 단기 또는 만성적인지를 부분적으로 의존하여, 주사로, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사로 주어진다.
또 다른 예에서, 질환 또는 종양의 위치가 허용하는 경우, 그리고 주사가 주기적으로 반복될 수 있는 경우, FGFR2/3 길항제 화합물은, 예를 들면, 직접적인 주사에 의해 국소로 투여된다. FGFR2/3 길항제는, 국부 재발 또는 전이를 예방 또는 감소시키기 위해, 대상체에 또는 직접적으로 종양 세포에, 예를 들면, 종양 또는 종양의 외과 절개후 종양상에 전신으로 또한 전달될 수 있다.
조합으로 치료제의 투여는 전형적으로 정의된 기간 (선택된 조합에 의존하여 보통 분, 시간, 일 또는 주)에 걸쳐 수행된다. 조합 요법은 순차적인 방식으로 이들 치료제의 투여 (즉, 여기에서 각 치료제는 상이한 시간에서 투여된다), 뿐만 아니라 실질적으로 동시 방식으로 이들 치료제, 또는 치료제의 적어도 2개의 투여를 포괄하는 의도이다.
치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합으로 항-FGFR2/3 항체는 정맥내 주사로 투여될 수 있고 반면에 조합으로 화학치료제는 경구로 투여될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 특이적 치료제에 따라, 모든 치료제는 경구로 투여될 수 있거나, 또는 모든 치료제는 정맥내 주사로 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 서열은 또한 특이적 제제에 따라 다양하다.
유형 및 질환의 중증도에 의존하여, 각 치료제의 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg은, 예를 들어, 하나 이상의 개별의 투여, 또는 연속 주입으로 이든 어떻든, 환자에 투여용 초기 후보 복용량이다. 전형적인 1일 복용량은 상기 언급된 인자에 의존하여, 약 1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 초과 범위일 수 있다. 며칠 또는 더 오래 동안 반복된 투여를 위하여, 상태에 의존하여, 치료는 암이 치료되는 때까지 상기 기재된 방법에 의해 측정된 바와 같이 지속된다. 그러나, 다른 복용량 요법이 유용할 수 있다.
본원은 유전자 요법에 의한 FGFR2/3 항체의 투여를 고려한다. 참고, 예를 들어, 세포내 항체를 생성하기 위해 유전자 요법의 사용에 관하여 1996년 3월 14일 공개된 WO96/07321.
제조 물품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유한 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 컨테이너 및 컨테이너상의 또는 이와 관련된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 컨테이너는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 등을 포함한다. 컨테이너는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물(들)과 조합한 경우 또는 그만으로인 조성물을 수용하고, 멸균된 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 컨테이너는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼를 가진 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 병태, 예컨대 암의 치료에 사용되는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 하기를 포함할 수 있다: (a) 거기에 함유된 조성물을 갖는 제1 컨테이너 (여기에서 조성물은 본 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 거기에 함유된 조성물을 갖는 제2 컨테이너 (여기에서 조성물은 추가 세포독성제를 포함한다). 본 발명의 상기 구현예에서 제조 물품은 제1 및 제2 항체 조성물이 특정한 병태, 예를 들면, 암을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제조의 물품은 약제학적으로-허용가능한 버퍼, 예컨대 정균 주사용 물 (BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액을 포함한 제2 (또는 제3) 컨테이너를 추가로 포함할 수 있다. 다른 버퍼, 희석제, 필터, 니들, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명이 주어지면, 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있음이 이해된다.
실시예
실시예 1. 항- FGFR3 항체의 특이성 확대. 실험은 항-FGFR2/3 항체의 결합 특이성을 확대하기 위해 수행되었다. 특이적으로, 실험은 크게 관련된 수용체 FGFR1 및 FGFR4를 결합시키지 않는 FGFR3 및 FGFR2에 대한 이중 특이성을 갖는 암 요법에 대한 항체를 개발하기 위해 수행되었다. 개시점은, 하위-나노몰 친화도를 갖는 FGFR3 IIIb 및 IIIc 동형체에 결합하는, 단일특이적 항체 R3Mab이었다 (Qing, J., X. Du, Y. Chen, P. Chan, H. Li, P. Wu, S. Marsters, S. Stawicki, J. Tien, K. Totpal, S. Ross, S. Stinson, D. Dornan, D. French, Q. R. Wang, J. P. Stephan, Y. Wu, C. Wiesmann and A. Ashkenazi (2009). "Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice". The Journal of clinical investigation 119(5): 1216-1229). R3Mab는 생체내 FGFR3 신호전달 및 종양 성장의 강력한 저해를 보여주고 (Qing, J., X. Du, Y. Chen, P. Chan, H. Li, P. Wu, S. Marsters, S. Stawicki, J. Tien, K. Totpal, S. Ross, S. Stinson, D. Dornan, D. French, Q. R. Wang, J. P. Stephan, Y. Wu, C. Wiesmann and A. Ashkenazi (2009). "Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice". The Journal of clinical investigation 119(5): 1216-1229) I 기 임상시험에서 연구되었다.
항체 재설계 전략은 FGFR3-IIIb (PDB 3GRW)와 복합체로 R3Mab Fab 단편의 이전에 결정된 결정 구조에 의해 유도되었다 (Qing, J., X. Du, Y. Chen, P. Chan, H. Li, P. Wu, S. Marsters, S. Stawicki, J. Tien, K. Totpal, S. Ross, S. Stinson, D. Dornan, D. French, Q. R. Wang, J. P. Stephan, Y. Wu, C. Wiesmann and A. Ashkenazi (2009). "Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice". The Journal of clinical investigation 119(5): 1216-1229). 상기 구조는 R3Mab가 FGFR3-IIIb의 모든 D2 및 D3 도메인과 상호작용한다는 것을 나타낸다. D2가 그 뒤에 R3Mab 결합에 충분하다는 것이 여기에서 발견되었어도, 초기 분석은 상기 최초 구조상의 접촉에 기반되었다. FGFR3-IIIb 항원상에서 대부분의 접촉 표면은, CDR H2 및 프레임워크 영역 (FR) 잔기로부터 작은 기여와 함께, 항체 상보성-결정 영역 (CDRs) H3 (46%), H1 (23%) 및 L2 (22%)에 의해 기여되었다 (Qing, J., X. Du, Y. Chen, P. Chan, H. Li, P. Wu, S. Marsters, S. Stawicki, J. Tien, K. Totpal, S. Ross, S. Stinson, D. Dornan, D. French, Q. R. Wang, J. P. Stephan, Y. Wu, C. Wiesmann and A. Ashkenazi (2009). "Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice". The Journal of clinical investigation 119(5): 1216-1229). (도 5). FGFR3-IIIb와 의도된 추가의 FGFR2-IIIb 항원 사이의 유사성은 비교되었다. 이들 2 동족체의 D2D3 영역은 68% 단백질-서열 동일성을 공유하고, 반면에 그의 D2 도메인은 76% 동일성을 공유한다 (표 2). 표 2 는 동일한 FGFR (볼드체)의 2 동형체 사이에서 백분율 동일성을 보여주고, D2D3 도메인의 완벽한 서열은 D3 (밑줄 친)에서 동형체-의존적 영역을 포함하고, D2D3 도메인은 동형체-의존적 영역 (볼드체 및 밑줄 친)이 부족하다. R3Mab-결합된 FGFR3-IIIb의 D3이 모든 다른 FGFR 구조와 비교된 경우 상이한 기하학을 가졌기 때문에 (Qing, J., X. Du, Y. Chen, P. Chan, H. Li, P. Wu, S. Marsters, S. Stawicki, J. Tien, K. Totpal, S. Ross, S. Stinson, D. Dornan, D. French, Q. R. Wang, J. P. Stephan, Y. Wu, C. Wiesmann and A. Ashkenazi (2009). "Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice". The Journal of clinical investigation 119(5): 1216-1229), FGFR2-IIIb 및 FGFR3-IIIb의 구조는 그의 D2 영역에서 겹쳐졌고, 이는 0.78 Å의 α-탄소의 계산된 평균 평방근 편차 (RMSD)를 수득하였다. 상기 분석에 기반하여, 실험은 FGFR2를 또한 결합 및 저해하기 위해 R3Mab를 재조작하도록 설계되었다.
Figure pct00004
파아지 디스플레이 라이브러리를 작제하기 위해, 각각의 개별 중-쇄 CDRs에서 대부분의 잔기 및 모든 CDRs상에서 접촉 잔기를 포함하는 돌연변이가 설계되었다 (표 3). 표 3에서, N = G, A, T 또는 C; K = G 또는 T. 파아지 입자 상에서 Fab 단편으로서 표현된 R3Mab 변이체는 FGFR2-IIIb에 결합으로 선택되었다. 신규 FGFR2 특이성을 도입하는 경우 선택 엄격성을 낮게 유지하기를 원했음에 따라 상기 단계에서 FGFR3 상에서 선택을 수행하지 않았다. 패닝의 제1 라운드 이후, 개별 라이브러리로부터 파아지 출력은 조합되었고 선택의 3 추가 라운드 처리되었다. 2B.1 시리즈로서 지정된, 95 클론은 ELISA에 의해 스크리닝되었다. 이들 중에서, 32 고유 서열을 나타내는, 81 클론은 FGFR2-IIIb에 결합하였다. 모든 결합 클론은 H2 라이브러리로부터 명백하게 유도되었던 것은, 이들이 다른 곳에서가 아닌 CDR H2에서 돌연변이를 함유하였기 때문이다 (표 4). 표 4는 밑줄 친 R3Mab에서의 것과 동일한 잔기를 확인한다. 표 4는 이탤릭체인 R3Mab에서의 것과 상이한 잔기를 확인한다. 표 4에서 사용된 바와 같이, "ND"는 검출불가능을 지칭하고 "NA"는 단백질 응집으로 인한 이용불가능을 지칭한다. 모든 선택된 항체는, 0.3 내지 17 nM 범위의 K D 값으로, R3Mab에 비하여 FGFR2-IIIb에 실질적으로 개선된 결합을 보여주었다 (표 4). 현저하게, 돌연변이된 H2 서열은 유의미한 변화를 함유하였고, 명백한 공통이 부족하였고 4 또는 5 위치에서 R3Mab와 상이하였다 (표 4, 도 6). 따라서, R3Mab에 FGFR2-IIIb의 높은-친화도 결합 부여에 대한 다중 가능한 해결책이 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
다음의 6 변이체는 FGFR2에 대한 그의 친화도 (< 3 nM)에 기반된 FGFR3에 대한 결합 및 서열 다양성 측정을 위하여 선택되었다. 모든 변이체는 FGFR3-IIIb에 대한 개선된 친화도를 보여주었다 (표 5). 수용체-의존적 세포 성장을 저해하기 위한 그의 능력을 추가로 평가하기 위해, MCF7 유방 암종 세포의 증식은 FGFR2-IIIb에 대한 FGF7-a 특이적 리간드 있거나 없이 분석되었다 (Goetz, R. and M. Mohammadi (2013). "Exploring mechanisms of FGF signalling through the lens of structural biology". Nat Rev Mol Cell Biol 14(3): 166-180;Bai, A., K. Meetze, N. Y. Vo, S. Kollipara, E. K. Mazsa, W. M. Winston, S. Weiler, L. L. Poling, T. Chen, N. S. Ismail, J. Jiang, L. Lerner, J. Gyuris and Z. Weng (2010). "GP369, an FGFR2-IIIb-specific antibody, exhibits potent antitumor activity against human cancers driven by activated FGFR2 signaling". Cancer research 70(19): 7630-7639). 변이체 2B.1.3은, 다른 변이체와 비교된 경우, 최대 길항제 활성을 나타내었고, 이는 덜한 또는 무 저해를 보여주었거나, 또는 심지어 자극 효과를 표현하였다 (도 2). 그러므로, 2B.1.3은 추가 특성규명을 위한 기능성 항체로서 담지되었다.
Figure pct00007
모든 FGFR 동족체가 서로 거의 70% 서열 동일성을 공유하기 때문에 (표 2), 다른 FGFRs에 재-조작된 변이체 2B.1.3의 결합은 평가되었다. Mab 2B.1.3은 FGFR2-IIIb로서 유사한 친화도로 FGFR2-IIIc를 결합시켰다 (표 6). 심지어 사용된 선택 전략이 FGFR2-IIIb에 결합에 기반하였어도, Mab 2B.1.3은 또한 R3Mab를 한 것보다 FGFR3-IIIb 및 FGFR3-IIIc에 대하여 수-배 더 높은 친화도를 보여주었다. FGFR3에 대하여 증가된 친화도는 시험된 모든 다른 선택된 변이체에 의해 일관되게 나타내어졌다 (데이터는 보이지 않았음). 또한, Mab 2B.1.3은 또한 32 nM의 KD 값으로 FGFR4에 결합하였고, FGFR1에 검출가능한 결합이 없음을 보여주었다 (표 6). 따라서, 변이체 2B.1.3은, FGFR1을 제외한, FGFR2, FGFR3 및 FGFR4에 삼중특이적, 결합이다.
Figure pct00008
실시예 2. 구조 Mab2B.1 및 FGFR2-IIIb 복합체는 결정되었다. 특이적으로, 재-조작된 변이체 2B.1.3이 FGFR2에 대하여 특이성을 얼마나 획득하였는지를 직접적으로 이해하기 위해, FGFR2와 그의 복합체의 결정 구조는 결정되었다 (도 2A, 표 7). FGFR2-IIIb D2D3은 E. 콜리에서 발현 및 봉입체로부터 리폴딩에 의해 먼저 생성되었고 SDS-PAGE 및 질량 분광분석법에 의해 온전한지를 판단되었다. 그러나, 결정에서 상기 단백질은 단지 동형체-독립적 D2 도메인을 함유하였고, 결정화 공정 동안 D2와 D3 사이에서 단백질분해를 시사한다. 이전에 결정된 FGFR3-IIIb:R3Mab 복합체 구조는 FGFR3-IIIb의 모든 D2 및 D3 도메인을 함유하였다. FGFR2-D2:Mab 2B.1.3의 전체의 복합체는, 1.4 Å의 전체 α-탄소 RMSD로, FGFR3-IIIb:R3Mab 구조 상에서 밀접하게 겹쳐졌고 (도 7), 재-조작이 최초 항체 R3Mab와 동일한 결합 기하학을 유지하였음을 나타내었다. FGFR3:R3Mab 결정 구조는 FGFR3 D3과 CDR H1 루프 사이에서 상당한 상호작용을 시사한다. 따라서, 결합에서 D3의 관여를 조사하기 위해, FGFR2 및 FGFR3의 D2 도메인의 단백질은 제조되었고 R3Mab 및 Mab 2B.1.3에 대한 그의 결합 친화도는 측정되었다. D2 단독과 D2D3 도메인 사이의 결합 친화도에서 매우 작은 차이만이 모든 수용체에 대하여 관측되었다 (표 8). 따라서, D2는 주로 R3Mab 및 그의 유도체의 결합을 책임지고, 반면에 D3은 최소 역할을 한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Mab 2B.1.3에서 CDR H2 서열, THLGD는 R3Mab에서 친계 H2 서열, IYPTN과 완전히 상이하다. 예상대로, 2 Mabs에서 CDR H2 루프의 형태는 실질적으로 상이하다 (도 2C). R3Mab의 것에 Mab 2B.1.3의 가변 도메인의 정렬시 (도 2B), H3 루프는 또한 몇도만큼 비틀린 것으로 보이고, 모든 구조에서 H3 tip 잔기 Y100b의 Cα 원자 사이에서 2.6 Å의 거리를 초래한다 (도 2C). 따라서, FGFR2 D2 도메인 전체의 위치는 FGFR3 D2 도메인의 것으로부터 ~3 Å 만큼 이동된다. 변이체와 FGFR 항원 사이에서 인터페이스의 비교는 Mab 2B.1.3에서 H2 및 H3 CDR 루프의 상기 재편이 FGFR2 표면에 대한 팩킹을 유의미하게 개선하였음을 드러냈다. 친계 구조에서, R3Mab와 FGFR3-D2 사이의 형상 상보성 (sc) 스코어는 0.731이다. FGFR2의 D2 도메인이 FGFR3 D2상에 정렬되고 이를 대체하면, R3Mab와 FGFR2 D2 사이의 sc는 0.685까지 떨어진다. 이는 FGFR2에 대한 R3Mab 결합의 부족을 설명할 수 있다 (표 6). 그러나, 신규 결정 구조에서, 2B.1.3과 FGFR2-D2 사이의 sc 스코어는 0.768까지 극적으로 증가하였고, 이는 R3Mab의 재-조작을 통해 FGFR2에 높은-친화도 결합의 이득과 일치된다.
FGFRs 중에서 현저한 유사성 때문에, 2B.1.3은 계열내 다중 동족체와 교차-반응한다. FGFR1 결합이 FGFR2 결합과 함께 획득되지 않았어도, FGFR4 상호작용은 있었다. FGFR4 저해가 독성의 증가된 위험을 전달한다는 것을 고려하여 (Pai, R., D. French, N. Ma, K. Hotzel, E. Plise, L. Salphati, K. D. Setchell, J. Ware, V. Lauriault, L. Schutt, D. Hartley and D. Dambach (2012). "Antibody-mediated inhibition of fibroblast growth factor 19 results in increased bile acids synthesis and ileal malabsorption of bile acids in cynomolgus monkeys". Toxicol Sci 126(2): 446-456), 재-조작의 제2 라운드는 FGFR4 결합을 제거하기 위해 착수되었다.
실시예 3. FGFR3 항체의 추가 재-조작은 FGFR4 결합을 제거하기 위해 수행되었다.
FGFR4를 제외한 FGFR2 및 FGFR3을 결합시키는 Mab 2B.1.3 유도체를 생성하기 위해, Mab 2B.1.3이 FGFR2와 그의 상호작용과 비슷한 방식으로 모든 FGFRs를 인식한다면, 항체와 유사하게 상호작용한 그러나 다양한 FGFRs (표 9)에서 상이한 그 항원 잔기는 확인되었다. 3 파아지 디스플레이 라이브러리는, 접촉된 CDRs H1, H3 및 L2 (표 10)상의 선택된 위치에서 랜덤 돌연변이유발과 함께, 2B.1.3 템플레이트에 기반하여 작제되었다. 조작 동안, 이전의 조작에서 했던 바와 같이, 모든 FGFR2 및 FGFR3의 유지 대신 FGFR2에 결합에 집중하기 위해 노력하였다. 따라서, 선택은 패닝 동안 고정된 FGFR2-IIIb 단독으로 착수되었다. FGFR4 결합제를 대항-선택하기 위해, 파아지 입자는 과도한 양의 가용성 FGFR4-Fc 단백질로 인큐베이션되었다. FGFR4-Fc의 농도는 선택의 연속 라운드 동안 최대 0.46 μM 증가되었다 (참고 방법). 라운드 4 (n = 96)로부터 개별 클론은 FGFR2-IIIb 및 FGFR4를 이용하여 ELISA에 의해 분석되었고, FGFR2 대 FGFR4 결합-ELISA 값의 비로 등급화되었다. 최고 FGFR2/FGFR4 결합 비를 갖는 6 클론은 서열분석되었고, IgG로서 표현되었고 FGFR2-IIIb 및 FGFR4에 대한 결합을 특징으로 하였다 (표 11). H3/L2 라이브러리 2B.1.3.2, 2B.1.3.4 및 2B.1.3.6으로부터 특성화된 클론은 CDR L2가 아닌 CDR H3에서만 돌연변이를 함유하였고, 반면에 H1/H3 라이브러리 2B.1.3.8, 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12로부터 특성화된 클론은 모든 CDR H1 및 H3에서 돌연변이를 함유하였다. L100a 부터 D100d 까지 H3 에서 4 잔기가 완전히 무작위화되었어도, Y100b는 변함없이 남아있었고, FGFR2와 Y100b의 상호작용이 결합에 결정적임을 시사한다. 또한, L100a는 Thr 또는 Ile로 보존적으로 돌연변이되었고, V100c는 주로 Asp로 돌연변이되었다. T28P의 추가의 H1 돌연변이를 함유한 H1/H3 돌연변이체는 FGFR2에 대하여 약간 더 높은 친화도를 표현하였다. 이들 항체는 1.4 내지 6.6 nM의 K D 값으로 FGFR2를 결헙시키지만, 측정을 위하여 1 μM 만큼 높은 농도를 이용한 경우 FGFR4에 최소 결합을 보여주었고, 단, 클론 2B.1.3.8은 FGFR4에 대하여 검출가능한 추가의 약한 친화도를 여전히 유지하였다 (표 11). R3Mab에서의 것과 동일한 잔기는 밑줄치고 R3Mab에서의 것과 상이한 잔기는 볼드체이다 (표 11). 2B.1.3 변이체의 모든 서열 및 친화도에서 수렴은 파아지 선택의 마지막 라운드가 원하는 기능, 즉, 줄어든 FGFR4 결합 및 팽팽한 FGFR2 결합의 체류를 갖는 결합제의 농축의 한계에 도달하였음을 나타냈다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
FGFR2 및 FGFR4에 대한 결합에서 더 큰 분화 뿐만 아니라 더 적은 돌연변이가 바람직하다는 것을 고려하여, Mab 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 추가 특성규명을 위하여 선택되었다. 모든 항체는 FGFR1에 대한 무 결합을 보여주었고 2B.1.3보다 약간 더 약한 친화도로 FGFR3에 강한 결합을 유지하였다 (표 6). 따라서, 제2-단계 조작 이후, 2B.1.3 유도체 Mab 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 FGFR2 및 FGFR3과 교차-반응하지만, FGFR4를 인식하지 못한다.
다음으로 특이적 FGFRs에 FGF 리간드 결합을 블록킹하기 위한 R3Mab 변이체의 능력을 체크하였다. R3Mab는 모든 FGFR3-IIIb 및 -IIIc 동형체에 FGF 리간드 결합을 블록킹한다. 상이한 FGFRs에 대한 그의 상이한 특이성 때문에, 신규 항체 각각의 블록킹 범위는 다양하였다 (도 3). 모든 조작된 항체는 모든 FGFR2 및 FGFR3에 대하여 블록킹 활성을 보여주었고, 반면에 R3Mab는 FGFR2-IIIb에 FGF7 결합 또는 FGFR2-IIIc에 FGF1 결합을 저해하지 않았다. 2B.1.3이 FGFR4에 FGF19 결합을 강력하게 저해하였던 반면에, 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 실질적으로 줄어든 FGFR4 친화도 때문에 후자 상호작용을 블록킹하지 않았다.
실시예 4. 재-조작된 Mab 변이체는 FGFR2 - 또는 FGFR3 -의존적 종양-세포 성장을 저해한다.
새로 조작된 변이체 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 FGFR2 및 FGFR3에 대하여 이중 특이성을 표현한다. 그의 생물학적 활성을 조사하기 위해, 종양 세포의 상이한 유형에서 수용체-의존적 신호전달 및 증식에 관한 그의 효과를 조사하였다. 제1 신규 변이체는 시험관내 FGFR2-과발현 종양 세포의 성장의 저해를 위하여 평가되었다. 모든 SNU-16 위 암종 및 MFM-223x2.2 삼중-음성 유방 암종 세포주는, 증가된 FGFR2 유전자-복사본 수 및 단백질 과-발현에 의해 분명한, FGFR2의 증폭을 갖는다 (Kunii, K., L. Davis, J. Gorenstein, H. Hatch, M. Yashiro, A. Di Bacco, C. Elbi and B. Lutterbach (2008). "FGFR2-amplified gastric cancer cell lines require FGFR2 and Erbb3 signaling for growth and survival." Cancer research 68(7): 2340-2348.). SNU-16 세포에서, 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 FGF7-유도된 FGFR2 포스포릴화를 실질적으로 억제하였다. 또한, 2개의 2B.1.3 변이체는 다운스트림 신호전달 분자 FRS2α, MAPK, PLCγ1 및 AKT의 포스포릴화를 현저하게 감소시켰다 (도 4A). 유사하게, 모든 변이체는 FGF7-치료된 MFM-223x2.2 세포에서 FGFR2, FRS2α, MAPK 및 Her3의 포스포릴화를 감소시켰다 (도 8).
다음으로, 종양 이종이식편의 생체내 FGFR2-의존적 또는 FGFR3-의존적 성장을 저해하기 위한 이중-특이적 Mab 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12의 능력은 조사되었다. FGFR2-특이적 치료를 위하여, 인간 위암 세포 SNU-16으로 주사된 마우스는 비-특이적 IgG 대조 항체 및 이중-특이적 Mabs, 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12로 복용되었다. 대조 항체와 비교로, 이중-특이적 항체는 종양 성장 저해의 약 67% 및 57%를 표현하였다 (도 4B). 또 다른 실험에서, 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 또한 마우스내 MFM-223x2.2 종양 이종이식편의 성장을 지연시켰다 (도 8). 따라서, 이들 2개의 조작된 항체는 FGFR2-의존적 종양 성장의 저해에서 효력을 보여주었다. 이들이 조작 이후 FGFR3에 대하여 친계 특이성을 보유하기 때문에, FGFR3-의존적 종양 성장의 저해는 조사되었다. 기대된 바와 같이, 모든 Mab 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 RT112 종양 이종이식편의 성장을 억제시켰다 (도 4C). 집합적으로, 조작된 항체는 모든 FGFR2- 및 FGFR3-의존적 암 세포 성장을 효과적으로 저해하기 위한 이중 제제로서 작용할 수 있다. 그러나, RT112 모델에서 조작된 변이체의 효력은 친계 R3Mab와 비교로, 가능하게는 변형된 약동학 때문에 감소되었다.
RT112 세포주는 FGFR2가 아닌 FGFR3을 발현시킨다. 기대된 바와 같이, 조작 이후 FGFR3, 뿐만 아니라 친계 항체 R3Mab에 대하여 친계 특이성을 유지한, 모든 Mab 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 FGFR3-과발현 RT112 종양 이종이식편의 성장을 억제시켰다 (도 4B). 48% 및 64%의 종양 성장 저해 (TGI) 값을 갖는, 연구에서 조작된 변이체 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는, 변형된 약동학으로 인해 가능할 수 있는, 친계 R3Mab (TGI 82%)보다 더 약한 효력을 표현하였다. FGFR2-기반 효능에 대하여, SNU-16 세포주에 의존하였고, 이는 아주 낮은 FGFR3 수준을 따라 쉽게 검출가능한 FGFR2를 발현시킨다. SNU-16 이종이식편을 보유한 마우스는 비-특이적 IgG 대조 항체, 친계 R3Mab, 또는 조작된 변이체 2B.1.3.10 또는 2B.1.3.12로 복용되었다. 조작된 변이체는 63% 및 61%, 각각의 유사한 TGI 값을 표현하였다 (도 4C). 놀랍게도, FGFR2에 대한 결합은 아니어도, R3Mab는 또한 44%의 측정가능한 TGI를 보여주었다. 종양 샘플은 그 다음 수집되었고 FGFR2 및 FGFR3 발현에 대하여 분석되었다 (도 15). FGFR3은 생체내 SNU-16 종양 이종이식편에서 상향조절되었고, 이는 상기 모델에서 R3Mab의 관측된 저해된 효과를 설명할 수 있다. 무관하게, 조작된 변이체는 R3Mab (p<0.001, 일 31)과 비교된 경우 유의미하게 더 강력한 활성을 보여주었다. 또 다른 실험에서, 2B.1.3.10 및 2B.1.3.12는 또한 마우스에서 MFM-223x2.2 종양 이종이식편의 성장을 지연시켰다 (도 8A 및 도 8B). 집합적으로, 조작된 항체는 모든 FGFR2- 및 FGFR3-의존적 암 세포 성장을 효과적으로 저해하기 위한 이중 제제로서 작용할 수 있다.
실시예 5. FGFR2 -결합 R3Mab 변이체는 파아지 라이브러리 선택에 의해 생성되었다.
R3Mab Fab 단편을 표현하는 파아지미드는 이전에 기재되었다 (Qing, J., X. Du, Y. Chen, P. Chan, H. Li, P. Wu, S. Marsters, S. Stawicki, J. Tien, K. Totpal, S. Ross, S. Stinson, D. Dornan, D. French, Q. R. Wang, J. P. Stephan, Y. Wu, C. Wiesmann and A. Ashkenazi (2009). "Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice" The Journal of clinical investigation 119(5): 1216-1229.). 3개의 연속 정지 코돈은, 파아지 디스플레이 라이브러리 작제용 템플레이트로서 작용한, R3Mab의 각각의 H1, H2, H3 또는 L2 CDR 루프에서 3개의 잔기를 대체하기 위해 도입되었다. 랜덤 돌연변이는 그 다음 하기의 방법을 이용하여 각각의 상기 CDR 루프 (표 3)에 편입되었다: Kunkel 등 (Kunkel TA, Bebenek K, & McClary J (1991) Efficient site-directed mutagenesis using uracil-containing DNA. Methods Enzymol 204:125-139.). 정제된 라이브러리 DNA는 그 다음 전기천공 (BTX ECM 630)에 의해 SS320 컴피턴트 세포로 형질전환되었다 (Clackson T & Lowman HB (2004) Phage display: A practical approach (Oxford University Press). 형질전환된 라이브러리 세포는 37 ℃에서 2YT 배지에 밤새 성장되어 파아지 입자를 번식시켰다 (Clackson T & Lowman HB (2004) Phage display: A practical approach (Oxford University Press). FGFR2 결합제에 대하여 분류하기 위해, 2 μg/mL의 His-태그된 FGFR2-IIIb는 96-웰 MaxiSorp 플레이트상에 코팅되었다. 각 라이브러리로부터 정제된 파아지 현탁액의 1 OD는 패닝의 제1 라운드 동안 고정된 항원으로 분리하여 인큐베이션되었다. 포스페이트 버퍼 염수 플러스 0.05% Tween 20 (PBST)으로 간단 세정 이후, 결합된 파아지 입자는 낮은 pH로 용출되었다. 개별 라이브러리로부터 수집된 파아지는 함께 풀링되었고 후속 라운드의 패닝을 위하여 XL1-청색 세포에서 번식되었다. 패닝의 제4 라운드 동안, 세정 단계는 팽팽한 결합제를 농축시키기 위해 30-분 PBST 인큐베이션의 간격으로 15분 세정까지 확장되었다. XL1-청색 세포는 라운드 4 로부터 회수된 파아지 입자로 감염되었고 2YT 한천상에 플레이팅되었다. 96개의 무작위로 채집된 콜로니는 파아지 생산을 위하여 개별적으로 배양되었다. 상청액은 파아지 ELISA에 의한 FGFR2-IIIb 결합을 증명하기 위해 분석되었다. 그 동안에, 파아지미드 DNA는 각 클론으로부터 추출되었고 서열분석되었다.
실시예 6. 라이브러리는 작제이었고 FGFR4를 결합시키지 않았던 FGFR2 결합제가 선택되었다.
파아지 디스플레이 라이브러리는 항체 2B.1.3의 Fab 단편을 표현하는 파아지미드에 기반하여 작제되었다. Kunkel 돌연변이유발에 대한 정지 템플레이트는 CDR H1 또는 H3 루프 또는 모두에서 3개의 정지 코돈을 포함하였다. CDR H1, H3 또는 L2 루프에서 선택된 위치는 랜덤 돌연변이유발 처리되었다 (표 10). 라이브러리 제조 절차는 상기 기재된 바와 같이 동일하였다. 제1 라운드에서, FGFR2 특이성을 보유하면서 감소된 FGFR4 결합을 갖는 클론의 선택을 위하여, 파아지 라이브러리의 1.5 OD는 0.5 nM FGFR4-Fc 단백질과 혼합되었다. 혼합물은 2 μg/mL FGFR2-IIIb로 사전-코팅되었던 MaxiSorp 플레이트에 4 ℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 결합된 파아지 입자는 간단히 세정되었고, 용출되었고 그리고 선택의 다음의 라운드에 대하여 번식되었다. 제2 라운드에서, 파아지 제제의 1.5 OD는 10 nM FGFR4-Fc와 혼합되었고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 제3 및 제4 라운드 동안, 파아지 제제의 0.5 OD는 460 nM FGFR4-Fc 단백질과 혼합되었고, 실온에서 (RT) 20분 동안 진탕된 다음 코팅된 FGFR2-IIIb로 인큐베이션되었다. 30분 동안 RT에서 FGFR2-IIIb로 인큐베이션된 이후, MaxiSorp 플레이트는 PBST 인큐베이션의 10-분 간격으로 3회 세정되었다. 용출된 파아지 입자는 XL1-청색 세포를 감염시키기 위해 사용되었고 2YT 한천상에 플레이팅되었다. 무작위로 채집된 클론은 상기 기재된 바와 같이 파아지 ELISA 검정 및 DNA 서열분석을 위하여 배양되었다.
실시예 7. 파아지 ELISA 결합 검정이 수행되었다. 384-웰 MaxiSorp 플레이트는 4 ℃에서 각 사분면내 30 μL 1 μg/mL E25 (대조 항체), FGFR2-IIIb-His, FGFR2-IIIc-His 또는 FGFR4-His로 밤새 코팅되었다. RT에서 1시간 동안 PBS내 2% BSA로 블록킹 이후, 30 μL의 10-배 희석된 파아지 상청액은 사분면에 부가되었다. 플레이트는 RT에서 2시간 동안 진탕되었다. 결합된 파아지 입자를 검출하기 위해, HRP-접합된 항-M13 모노클로날 항체 (GE Healthcare)는 1:3000 희석되었고 플레이트에서 15 분 동안 인큐베이션되었다. TMB 페록시다아제 기질은 각 웰에 부가되어 발색시켰다. 반응은 100 μL 1M 인산의 부가에 의해 정지된 다음 플레이트는 450 nM의 흡광도에서 판독되었다.
실시예 8. 표면 플라즈몬 공명 ( SPR ) 검정이 수행되었다.
FGFR 항원에 대한 R3Mab 변이체의 결합 친화도는 Biacore T100 (GE Healthcare)를 이용하여 결정되었다. 항-인간 Fc 모노클로날 항체의 포화된 양은 제품 사용설명서에 따라 CM5 바이오센서 칩상에 고정되었다. R3Mab-유도된 항체 분자의 약 500 공명 단위는 각 유동 세포에서 포착되었다. 다양한 농도의 FGFR 항원은 유량 30 μL/분으로 주사되었다. 각 결합 사이클 이후, 유동 세포는 3M MgCl2를 이용하여 재생되었다. 동력학 분석은 동력학 및 친화도 상수를 수득하기 위해 T100 평가 소프트웨어를 이용하여 수행되었다.
실시예 9. 단백질 발현, 정제 및 구조 결정.
인간 FGFR2-IIIb ECD (잔기 140-369)는 PCR에 의해 증폭되었고 pET-21b(+) 벡터 (Novagen)에 아클론화되었다. 단백질은 E. 콜리 BL21(DE3)pLysS 세포내 봉입체로서 표현되었다. 봉입체는 20 mM Tris pH7.5, 5% 글리세롤, 1 mM EDTA 및 2% 트리톤 X-100으로 세정된 다음, 6 M 구아니딘-HCl, 20 mM Tris pH8, 10 mM TCEP에서 용해되었다. 시험관내 폴딩을 위하여, 봉입체는 100 mM Tris pH 8.0, 0.4 M L-아르기닌 HCl, 2 mM EDTA, 3.7 mM 시스타민 및 6.6 mM 시스테아민을 함유한 재폴딩 버퍼에 50 mg/L까지 빠르게 희석되었다. 4 ℃에서 72 시간 후, 폴딩 혼합물은 농축되었고 5 mL 헤파린 HP 컬럼 (GE Healthcare)에 통과되었다. 샘플은 MonoS 컬럼 및 Superdex 200 컬럼으로 추가로 정제되었다. 2B.1.3 Fab는 기재된 바와 같이 발현 및 정제되었다 (Qing, J., X. Du, Y. Chen, P. Chan, H. Li, P. Wu, S. Marsters, S. Stawicki, J. Tien, K. Totpal, S. Ross, S. Stinson, D. Dornan, D. French, Q. R. Wang, J. P. Stephan, Y. Wu, C. Wiesmann and A. Ashkenazi (2009). "Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice". The Journal of clinical investigation 119(5): 1216-1229). FGFR2 및 Fab 단백질은 10 mM Tris pH 7.0, 5 mM NaCl에 대하여 분리하여 투석된 다음 1:1의 몰비로 함께 혼합되었다. 단백질 혼합물은 결정화를 위하여 2 mg/mL까지 희석되었다. 결정은 증기 확산 방법을 이용하여 20 % (w/v) PEG3350, 0.1 M 나트륨 시트레이트 pH 5.5, 0.2 M 암모늄 설페이트에서 성장되었다. 결정이 동결보호 용액에 감수성이고 일단 모액 밖으로 이동되면 크래킹됨에 따라, 분해가능한 결정은 동결보호 작용하기에 충분히 높은 PEG3350의 농도로 4개월 동안 미접촉된 채로 남아있던 트레이로부터 결국 수확되었다. 따라서 결정은 직접적으로 방울에서 꺼내졌고 액체 질소에서 급속 냉동되었다. 회절 데이터는 Advanced Light Source of the Lawrence Berkeley National Laboratory에서 1 Å의 빔 파장으로 수집되었다. 데이터 가공은 진동 방식으로 수집된 X-선 회절 데이터의 HKL2000 and Scalepack (Otwinowski Z & Minor W (1997) Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in enzymology 276:307-326.). 구조는 CCP4 스위트에서 프로그램 Phaser를 이용하여 분자 대체로 해결되었다 (McCoy AJ, 등 (2007) Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr 40(Pt 4):658-674. Winn MD, 등 (2011) Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67(Pt 4):235-242). Fab 및 FGFR2-D2를 위한 조사 모델은 PDB 3GRW 및 3CU1, 각각이었다. 2개의 복합체는 비대칭 단위 세포로 발견되었다. 강체 및 모사 어닐링 개량은 Phenix를 이용하여 수행되었다 (Adams PD, 등 (2010) PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt 2):213-221). 매뉴얼 모델 구축은 프로그램 Coot로 수행되었다 (Emsley P, Lohkamp B, Scott WG, & Cowtan K (2010) Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt 4):486-501). 위치 및 원자 변위 파라미터의 후속의 개량은 Phenix를 이용하여 수행되었다. 물 분자는 3.4 Å의 거리 컷오프로 부가되었다. 최종 모델은 프로그램 MolProbity에 의해 입증되었다 (Chen VB, 등 (2010) MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66(Pt 1):12-21). 라마차드란 (Ramachandran) 특이점은 미검출이었다.
실시예 10. FGF 리간드- 블록킹 ELISA.
96-웰 MaxiSorp 플레이트는 4 ℃에서 1.5 μg/mL 항-인간 Fc 항체로 밤새 코팅되었다 (Jackson ImmunoResearch Lab). RT에서 1시간 동안 PBS내 2% BSA로 블록킹 이후, 0.25 μg/mL FGFR-Fc 융합 단백질은 RT에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 49 μL 100 ng/mL FGF 리간드, 1 μL 25 mg/mL 헤파린 (Sigma-Aldrich) 및 50 μL 항체 희석으로서 제조되었던, 항체 및 FGF 리간드 혼합물로 부가되기 전에 플레이트는 5회 세정되었다. RT에서 2시간 동안 교반 이후, 플레이트는 5회 세정되었다. 결합된 리간드는 0.5시간 동안 0.5 μg/mL 바이오티닐화된 항-FGF 항체 (R&D Biosystems), 0.5시간 동안 1:2,500-희석된 스트렙타비딘-HRP (Invitrogen) 및 충분한 발색까지 TMB 기질로 RT에서 후속의 인큐베이션에 의해 검출되었다.
실시예 11. 세포주.
SNU16 및 MFM-223x2.2 세포주는 내부 세포 은행으로부터 수득되었다. 세포주 RT112는 ATCC로부터 수득되었다. 세포는 10% FBS로 보충된 RPMI 배지에서 배양되었다. 모든 세포주는 마이코플라스마, 상호 오염에 대하여 시험되고 새로운 스톡이 품질을 보장하기 위해 및 혈통을 확인하기 위해 생성된 경우 유전자 상으로 지문처리된다. Cell line fingerprinting: SNP fingerprinting. SNP 유전자형은 매번 수행되고 새로운 스톡은 동결보존을 위하여 팽창된다. 세포주 동일성은 Fluidigm 다중화된 검정을 이용하여 고-처리량 SNP 유전형분석으로 확인된다. SNPs는 상업적 유전형분석 플랫폼 상에서 소수 대립유전자 빈도 및 존재에 기반하여 선택되었다. SNP 프로파일은 혈통을 결정 또는 확인하기 위해 (이용가능한 경우) 이용가능한 내부 및 외부 데이터로부터 SNP 콜과 비교된다. 데이터가 이용할 수 없는 또는 세포주가 의심스러운 사례에서, DNA 또는 세포주는 세포주 혈통을 확인하기 위해 프로파일링을 수행하도록 재-구매된다. SNPs . rs11746396, rs16928965, rs2172614, rs10050093, rs10828176, rs16888998, rs16999576, rs1912640, rs2355988, rs3125842, rs10018359, rs10410468, rs10834627, rs11083145, rs11100847, rs11638893, rs12537, rs1956898, rs2069492, rs10740186, rs12486048, rs13032222, rs1635191, rs17174920, rs2590442, rs2714679, rs2928432, rs2999156, rs10461909, rs11180435, rs1784232, rs3783412, rs10885378, rs1726254, rs2391691, rs3739422, rs10108245, rs1425916, rs1325922, rs1709795, rs1934395, rs2280916, rs2563263, rs10755578, rs1529192, rs2927899, rs2848745, rs10977980. Short Tandem Repeat ( STR ) Profiling. STR 프로파일은 Promega PowerPlex 16 System을 이용하여 각 주에 대해 결정된다. 이는 1회 수행되고 세포주 혈통을 측정하기 위해 (이용가능한 경우) 세포주의 외부 STR 프로파일과 비교된다. 분석된 유전자좌 . D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, 펜타 D, AMEL, vWA, D8S1179 및 TPOX를 포함한, 16 유전자좌 (15 STR 유전자좌 및 성별 확인용 아멜로게닌)의 검출.
실시예 12. 면역블롯팅 .
세포는 24 시간 동안 조직 배양판상에 씨딩되었고, 10 μg/ml FGFR 블록킹 또는 대조 항-gD 항체로 전처리되었고, 그 다음 15 분 동안 20 μg/ml 헤파린 (Sigma)의 존재하에 25 ng/ml FGF-7 (R&D Systems)로 자극되었다. 세포는 얼음상에 배치되었고 단백질은 IP 용해 버퍼 (Thermo Scientific)로 즉시 수확되었다. 단백질 용해물은 주사기를 통해 통과되었고, 원심분리에 의해 청소되었고, 그 다음 BCA 단백질 검정 (Thermo Scientific)을 이용하여 정량화되었다. 단백질은 4-12% 비스-트리스 겔 (Life Technologies)상에서 분리되었고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동되었고, 30 분 동안 TBST내 5% BSA 또는 밀크로 블록킹되었고, 그 다음 4 C에서 밤새 1차 항체로 블롯팅되었다. 사용된 항체: 포스포-FGFR (Y653/654), 포스포-FRS2 (Y196), 포스포-ERK1/2 (T202/Y204), ERK1/2, 포스포-AKT (S473), AKT, 포스포-HER3 (Y1289), HER3, 포스포-PLC감마1 (Y783), PLC감마1 (세포 신호전달); FGFR2, FRS2 (Santa Cruz Biotechnology); 베타-액틴 (Sigma). 막은 세정되었고 1 시간 동안 적절한 HRP 접합된 2차 항체로 인큐베이션되었고, 그 다음 SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)로 검출되었다. 발광 신호는 FluorChem Q (Alpha Innotech)으로 획득되었다.
실시예 13. 이종이식 실험.
모든 절차는 Institutional Animal Care and Use Committee of Genentech에 의해 설정된 지침 및 원리에 의해 승인되었고 이와 일치되었고 Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC)-공인된 시설에서 수행되었다. 0.36 mg 에스트로겐 펠렛은 세포 접종에 1 일 먼저 피하로 (s.c.) 이식되었다. 매트리겔로 HBSS에서 현탁된 천만 MFM-223 x2.2 유방암 세포는 6-8-주령 암컷 NCR 누드 마우스 (TaconicTM)의 유선 지방 패드 #4에서 예방접종되었다. 약 15-30 mm3의 SNU-16 종양 단편은 6-8-주령 암컷 Balb/c 누드 마우스 (Shanghai Laboratory Animal)의 우측 옆구리에 s.c. 이식되었다. 매트리겔로 HBSS에서 현탁된 7 백만 RT-112 방광 암종 세포는 6-8-주령 암컷 C.B-17 SCID 마우스 (Charles River Lab)에서 s.c. 예방접종되었다. 평균 종양 용적이 100-200 mm3 (0 일째)에 도달한 경우, 마우스는 6 (SNU-16, RT112) 또는 7 (MFM-223 x2.2)의 그룹으로 무작위 추출되었고 2B1.3.10 또는 2B1.3.12 (10, 30 또는 50 mg/kg)의 매주 2회 복강내 (i.p.) 주사로 일 1에서 시작하여 치료받았다. 대조 그룹은 PBS (30 mg/kg)에서 희석된 대조 인간 IgG1 항체로 치료받았다. 종양 용적은 Ultra Cal IV 캘리퍼스 (모델 54 10 111, Fred V. Fowler Company)를 이용하여 2개 치수 (길이 및 폭)으로 측정되었다. 종양 용적은 하기 식을 이용하여 계산되었다: 종양 용적 (mm3) = (길이 × 폭2) × 0.5. 동물 체중은 Adventurer Pro AV812 저울 (Ohaus)을 이용하여 측정되었다. 퍼센트 체중 변화는 하기 식을 이용하여 계산되었다: 체중 변화 (%) = [(체중 최근일째 - 체중 0 일째)/체중 0 일째] x 100%. 퍼센트 체중은 연구 동안 각 동물에 대하여 추적되었고 각 그룹에 대한 퍼센트 체중 변화는 계산 및 작도되었다.
실시예 14. 확인 FGFR2 /3 + KLB 이중특이적 항체
본원에서 기재된 항-FGFR2/3 항체의 항-종양 활성을 따라, FGFR2/3 및 KLB에 관한 이중특이적 항체 ("FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체")는 증식성 질환 및 FGFR2 및/또는 FGFR3 발현과 관련된 질환의 치료에서 및 더 구체적으로 대사성 질환에 대해 사용을 위하여 제조될 수 있다. FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체에 의해 치료될 수 있는 대사성 질환은 하기를 비제한적으로 포함한다: 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사성 증후군 (MetS), 비만, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재적 자가면역 당뇨병 (LAD), 약년발증 성인형 당뇨병 (MODY), 제2형 당뇨병, 비만, 바데트-비들 증후군, 프라다-윌리 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 알브라이트 유전성 골이영양증 (가성부갑상선기능저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 취약 X 증후군 및 보제슨-포스만-레만 증후군. 더 구체적으로, FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 NASH의 치료에 사용될 수 있다.
초기에, 실험은 항-FGFR2/3 항체 변이체의 활성을 비교하기 위해 수행되었다 (도 17A 및 17B). 특이적으로, 239T FGFR1 결실 세포는 일 1째에 96 웰 플레이트에 0.9 x 106의 밀도에서 씨딩되었다. 일 2째에, 세포는 FGFR, FF 루시퍼라아제, 레닐라 루시퍼라아제 (형질감염 효율 대조군), 및 Elk1을 포함한 작제물로 형질감염되었다. 일 3째에, 세포는 항-FGFR2/3 항체 변이체 2B1.3, 2B1.3.12, 2B1.1.2, 2B1.1.4, 2B1.1.6, 2B1.1.8, 2B1.1.10, 2B1.1, 및 2B1.1.12를 갖는 무혈청 배지에서 자극되었다. 초기 농도는 10 μg/mL이었고 일련의 희석물은 1/5 수행되었다. 반응은 7.5 시간 동안 수행되었고 플레이트로부터 배지의 제거 및 1x 수동 용해 버퍼의 부가에 의해 정지되었다. 플레이트는 그 다음 루시퍼라아제 기질의 부가 이후 Wallace Envision 플레이트 판독기를 이용하여 분석되었고 레닐라 발현에 대해 정규화되었다.
수행된 그러나 본원에서 기재되지 않은 다른 검정에 더하여 루시퍼라아제 검정에 부분적으로 기반하여, 항-FGFR2/3 항체 변이체 결정 매트릭스는 조립되었다 (도 18). 2B1.3은 MCF-7/FGF7 검정에서 성장을 블록킹하기 위해 보여졌었고 FGF19 블록킹을 보여주었다. 2B1.3.12는 종양 진행을 블록킹하였다.
결정 매트릭스에 기반하여, 변이체 2B1.3.12, 2B1.1.6, 및 2B1.1은 추가로 조사되었고 (도 19A-19C) 각각의 활성은 시험되었다. 더욱이, FGFR 결합은 2B1.1, 2B1.3, 및 2B1.3.12에 대하여 조사되었다 (표 12). 표 12에서, NB는 무 결합을 지칭하고 ND는 결정되지 않음을 지칭한다. FGFR4에 대한 2B.1.1은 IgG의 포착 및 FGFR4-6xHis의 유동에 의해 측정되었다 (실험은 표 12에서 * 로 확인하였다). 나중에, 2B.1.3 변이체에 대한 KD는 FGFR4-Fc의 포착 및 항체 Fab 단편의 유동에 의해 결정되었다 (표 12).
Figure pct00014
그 후에, 7개의 2B1.1 변이체는 발현되었고 FGFR2, FGFR3, 및 FGFR4 결합에 대한 작용제 활성은 시험되었다 (도16A -16C). 모든 2B1.1 변이체는 Biacore 검정을 이용하여 FGFR3에 대해 하위-nM 내지 낮은-pM 친화도 범위를 보여주었다. FGFR4 단백질 점착성 때문에, 결합 친화도는 분석물로서 Fabs를 이용한 Biacore에 의해 최상으로 결정된다. 대부분의 변이체는 2B1.1 및 2B1.1.4를 제외하고 ELISA에 의해 FGFR4에 대해 약한 결합을 보여주었다.
본 실시예 14에서 기재된 실험에 기반하여, 변이체 2B1.3.12 및 2B1.1.6은 항-KLB 항체와 이중특이적 어셈블리로 선택되었다.
실시예 14. FGFR2 /3 + KLB 이중특이적 항체의 생성
FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 임의의 이중특이적 항체 생산 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 특이적 예에서, 본 발명의 FGFR2/3 + KLB 이중특이적 항체는 크놉 및 홀 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
HEK293 세포는 항-FGFR2/3 항체 변이체 2B1.3.12 또는 2B1.1.6의 중쇄 및 경쇄 그리고 본원에서 기재된 항-KLB 항체 중 하나의 중쇄 및 경쇄를 인코딩한 4개의 발현 벡터의 혼합물로 공동-형질감염될 수 있다 (참고 예를 들면, 표 13 및 14).
Figure pct00015
Figure pct00016
이종이량체 IgG가 조건화된 배지로부터 순차적인 친화도 정제에 의해 정제될 수 있도록 항-FGFR2/3 및 항-KLB의 중쇄는 Flag 펩타이드 및 Oct-히스티딘으로 각각 태그될 수 있다. 부분적으로 정제된 이종이량체 IgG는 그 다음 KLB-의존적 효능제를 확인하기 위해 GAL-ELK1 기반 루시퍼라아제 검정에서 분석될 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 짝짓기오류를 극소화하기 위해, 항-FGFR2/3은 인간 Fab 불변 영역으로 발현될 수 있고, 항-KLB는 마우스 Fab 불변 영역으로 발현될 수 있다. 태그된-이중특이적 IgGs는 그 다음 FGFR2/3 항체 변이체 2B1.3.12 또는 2B1.1.6으로부터 하나의 아암 및 본원에서 기재된 임의의 KLB 항체의 하나의 아암의 조합을 이용하여 조물질 형태로 초기에 시험될 수 있다. 특이적으로, KLB 아암이 기원하는 항-KLB 항체는 하기를 포함할 수 있다:
8C5.K4.M4L.H3.KNV 중쇄 가변 영역
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWLGVI
WSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYGSTYVDAI
DYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 104)
8C5.K4.M4L . H3.KNV 전체 중쇄
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWLGVI
WSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYGSTYVDAI DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS CDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (서열식별번호: 106)
8C5.K4.M4L.H3.KNV 경쇄 가변 영역
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVESYGNRYMTWYQQKPGQPPKLLIY RAANLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPWTFGQGTKVEI K (서열식별번호: 105)
8C5.K4.M4L . H3.KNV 전체 경쇄
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVESYGNRYMTWYQQKPGQPPKLLIY RAANLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPWTFGQGTKVEI KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열식별번호: 107)
더욱이, 이중특이적 항체는 인간 IgG1 불변 영역 (야생형, 효과기 기능을 가짐) 및 효과기 기능을 제거하기 위해 N297G 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 불변 영역, 또는 효과기 기능을 제거하기 위해 이중 [D265G/N297G] 돌연변이 (DANG)를 갖는 마우스 불변 영역으로 생산될 수 있다.
실시예 15: 이중특이적 항체의 시험.
8C5.K4H3.M4L.KNV (참고 상기 실시예 14) 및 상이한 항-FGFR2/3 아암의 다양한 이중특이적 항체 조합이 제조될 수 있고 KLB 있거나 없이 HEK293 세포내 GAL-ELK1-기반 루시퍼라아제 검정에서 시험될 수 있다. 각 이중특이적 항체 조합은, KLB 발현 없는 세포가 아닌, 재조합 FGFR2 또는 3 및 KLB를 발현하는 세포에서 용량-의존적 방식으로 루시퍼라아제 활성을 유도할 수 있다. 상기 데이터는 FGFR2/3 +KLB 이중특이성이 모 항체, 예를 들면, 2B1.3.12 또는 2B1.1.6의 이점을 보유한다는 것을 확인할 수 있다. 더욱이, 인간화된 8C5 아암 (8C5.K4.M4L.H3.KNV) 및 2B1.3.12 또는 2B1.1.6 변이체의 아암을 갖는 FGFR2/3 +KLB 이중특이적 항체의 결합 친화도는 KLB 결합, FGFR2 결합, 및 FGFR3 결합에 대하여 결정될 수 있다.
묘사된 및 청구된 다양한 구현예에 더하여, 개시된 주제는 본원에서 개시된 및 청구된 특징의 다른 조합을 갖는 다른 구현예에 또한 관한 것이다. 이와 같이, 본원에서 나타난 특정한 특징은 개시된 주제의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있어서 이로써 개시된 주제는 본원에서 개시된 특징의 임의의 적합한 조합을 포함한다. 개시된 주제의 특정 구현예의 이전의 설명은 실례 및 설명의 목적으로 나타내었다. 소모적이거나 또는 개시된 주제를 개시된 상기 구현예로 제한하는 것이 의도되지 않는다.
다양한 변형 및 변화가 개시된 주제의 취지 또는 범위에서 이탈 없이 개시된 주제의 조성물 및 방법에서 할 수 있음이 당해 분야의 숙련가에 명백해질 것이다. 따라서, 개시된 주제가 첨부된 청구범위 및 그의 등가물의 범위내인 변형 및 변화를 포함하는 것이 의도된다.
다양한 공개, 특허 및 특허 출원은 본원에서 인용되고, 이들의 내용은 이로써 그의 전체로 참고로 편입된다.
서열
서열식별번호:1
2B.1.3.10 HVR-L1 RASQDVDTSLA
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FGFR2-IIIb 핵산 서열
ATGGTCAGCTGGGGTCGTTTCATCTGCCTGGTCGTGGTCACCATGGCAACCTTGT CCCTGGCCCGGCCCTCCTTCAGTTTAGTTGAGGATACCACATTAGAGCCAGAAGA GCCACCAACCAAATACCAAATCTCTCAACCAGAAGTGTACGTGGCTGCGCCAGG
GGAGTCGCTAGAGGTGCGCTGCCTGTTGAAAGATGCCGCCGTGATCAGTTGGACT AAGGATGGGGTGCACTTGGGGCCCAACAATAGGACAGTGCTTATTGGGGAGTAC TTGCAGATAAAGGGCGCCACGCCTAGAGACTCCGGCCTCTATGCTTGTACTGCCA GTAGGACTGTAGACAGTGAAACTTGGTACTTCATGGTGAATGTCACAGATGCCAT CTCATCCGGAGATGATGAGGATGACACCGATGGTGCGGAAGATTTTGTCAGTGA
GAACAGTAACAACAAGAGAGCACCATACTGGACCAACACAGAAAAGATGGAAA AGCGGCTCCATGCTGTGCCTGCGGCCAACACTGTCAAGTTTCGCTGCCCAGCCGG GGGGAACCCAATGCCAACCATGCGGTGGCTGAAAAACGGGAAGGAGTTTAAGCA GGAGCATCGCATTGGAGGCTACAAGGTACGAAACCAGCACTGGAGCCTCATTAT GGAAAGTGTGGTCCCATCTGACAAGGGAAATTATACCTGTGTAGTGGAGAATGA
ATACGGGTCCATCAATCACACGTACCACCTGGATGTTGTGGAGCGATCGCCTCAC CGGCCCATCCTCCAAGCCGGACTGCCGGCAAATGCCTCCACAGTGGTCGGAGGA GACGTAGAGTTTGTCTGCAAGGTTTACAGTGATGCCCAGCCCCACATCCAGTGGA TCAAGCACGTGGAAAAGAACGGCAGTAAATACGGGCCCGACGGGCTGCCCTACC TCAAGGTTCTCAAGCACTCGGGGATAAATAGTTCCAATGCAGAAGTGCTGGCTCT
GTTCAATGTGACCGAGGCGGATGCTGGGGAATATATATGTAAGGTCTCCAATTAT ATAGGGCAGGCCAACCAGTCTGCCTGGCTCACTGTCCTGCCAAAACAGCAAGCG CCTGGAAGAGAAAAGGAGATTACAGCTTCCCCAGACTACCTGGAGATAGCCATT TACTGCATAGGGGTCTTCTTAATCGCCTGTATGGTGGTAACAGTCATCCTGTGCC GAATGAAGAACACGACCAAGAAGCCAGACTTCAGCAGCCAGCCGGCTGTGCACA
AGCTGACCAAACGTATCCCCCTGCGGAGACAGGTAACAGTTTCGGCTGAGTCCA GCTCCTCCATGAACTCCAACACCCCGCTGGTGAGGATAACAACACGCCTCTCTTC AACGGCAGACACCCCCATGCTGGCAGGGGTCTCCGAGTATGAACTTCCAGAGGA CCCAAAATGGGAGTTTCCAAGAGATAAGCTGACACTGGGCAAGCCCCTGGGAGA AGGTTGCTTTGGGCAAGTGGTCATGGCGGAAGCAGTGGGAATTGACAAAGACAA
GCCCAAGGAGGCGGTCACCGTGGCCGTGAAGATGTTGAAAGATGATGCCACAGA GAAAGACCTTTCTGATCTGGTGTCAGAGATGGAGATGATGAAGATGATTGGGAA ACACAAGAATATCATAAATCTTCTTGGAGCCTGCACACAGGATGGGCCTCTCTAT GTCATAGTTGAGTATGCCTCTAAAGGCAACCTCCGAGAATACCTCCGAGCCCGGA GGCCACCCGGGATGGAGTACTCCTATGACATTAACCGTGTTCCTGAGGAGCAGAT
GACCTTCAAGGACTTGGTGTCATGCACCTACCAGCTGGCCAGAGGCATGGAGTA
CTTGGCTTCCCAAAAATGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTA ACAGAAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAAC AATATAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATG GCTCCAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCT
TCGGGGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGAT TCCCGTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCC AGCCAACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGT GCCCTCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTC ACTCTCACAACCAATGAGGAATACTTGGACCTCAGCCAACCTCTCGAACAGTATT
CACCTAGTTACCCTGACACAAGAAGTTCTTGTTCTTCAGGAGATGATTCTGTTTTT TCTCCAGACCCCATGCCTTACGAACCATGCCTTCCTCAGTATCCACACATAAACG
GCAGTGTTAAAACATGA
서열식별번호: 52
FGFR2-IIIb 아미노산 서열
MVSWGRFICLVVVTMATLSLARPSFSLVEDTTLEPEEPPTKYQISQPEVYVAAPGESL EVRCLLKDAAVISWTKDGVHLGPNNRTVLIGEYLQIKGATPRDSGLYACTASRTVDS ETWYFMVNVTDAISSGDDEDDTDGAEDFVSENSNNKRAPYWTNTEKMEKRLHAVP AANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSD
KGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVY SDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKHSGINSSNAEVLALFNVTEADAGEY ICKVSNYIGQANQSAWLTVLPKQQAPGREKEITASPDYLEIAIYCIGVFLIACMVVTVI LCRMKNTTKKPDFSSQPAVHKLTKRIPLRRQVTVSAESSSSMNSNTPLVRITTRLSST ADTPMLAGVSEYELPEDPKWEFPRDKLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAVGIDKDKPKE
AVTVAVKMLKDDATEKDLSDLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVE YASKGNLREYLRARRPPGMEYSYDINRVPEEQMTFKDLVSCTYQLARGMEYLASQK CIHRDLAARNVLVTENNVMKIADFGLARDINNIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFD RVYTHQSDVWSFGVLMWEIFTLGGSPYPGIPVEELFKLLKEGHRMDKPANCTNELY MMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRILTLTTNEEYLDLSQPLEQYSPSYPDTRSSC
SSGDDSVFSPDPMPYEPCLPQYPHINGSVKT
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FGFR2-IIIc 핵산 서열
ATGGTCAGCTGGGGTCGTTTCATCTGCCTGGTCGTGGTCACCATGGCAACCTTGT
CCCTGGCCCGGCCCTCCTTCAGTTTAGTTGAGGATACCACATTAGAGCCAGAAGA GCCACCAACCAAATACCAAATCTCTCAACCAGAAGTGTACGTGGCTGCGCCAGG GGAGTCGCTAGAGGTGCGCTGCCTGTTGAAAGATGCCGCCGTGATCAGTTGGACT AAGGATGGGGTGCACTTGGGGCCCAACAATAGGACAGTGCTTATTGGGGAGTAC TTGCAGATAAAGGGCGCCACGCCTAGAGACTCCGGCCTCTATGCTTGTACTGCCA
GTAGGACTGTAGACAGTGAAACTTGGTACTTCATGGTGAATGTCACAGATGCCAT CTCATCCGGAGATGATGAGGATGACACCGATGGTGCGGAAGATTTTGTCAGTGA GAACAGTAACAACAAGAGAGCACCATACTGGACCAACACAGAAAAGATGGAAA AGCGGCTCCATGCTGTGCCTGCGGCCAACACTGTCAAGTTTCGCTGCCCAGCCGG GGGGAACCCAATGCCAACCATGCGGTGGCTGAAAAACGGGAAGGAGTTTAAGCA
GGAGCATCGCATTGGAGGCTACAAGGTACGAAACCAGCACTGGAGCCTCATTAT GGAAAGTGTGGTCCCATCTGACAAGGGAAATTATACCTGTGTAGTGGAGAATGA ATACGGGTCCATCAATCACACGTACCACCTGGATGTTGTGGAGCGATCGCCTCAC CGGCCCATCCTCCAAGCCGGACTGCCGGCAAATGCCTCCACAGTGGTCGGAGGA GACGTAGAGTTTGTCTGCAAGGTTTACAGTGATGCCCAGCCCCACATCCAGTGGA
TCAAGCACGTGGAAAAGAACGGCAGTAAATACGGGCCCGACGGGCTGCCCTACC
TCAAGGTTCTCAAGGCCGCCGGTGTTAACACCACGGACAAAGAGATTGAGGTTC TCTATATTCGGAATGTAACTTTTGAGGACGCTGGGGAATATACGTGCTTGGCGGG TAATTCTATTGGGATATCCTTTCACTCTGCATGGTTGACAGTTCTGCCAGCGCCTG GAAGAGAAAAGGAGATTACAGCTTCCCCAGACTACCTGGAGATAGCCATTTACT
GCATAGGGGTCTTCTTAATCGCCTGTATGGTGGTAACAGTCATCCTGTGCCGAAT GAAGAACACGACCAAGAAGCCAGACTTCAGCAGCCAGCCGGCTGTGCACAAGCT GACCAAACGTATCCCCCTGCGGAGACAGGTAACAGTTTCGGCTGAGTCCAGCTC CTCCATGAACTCCAACACCCCGCTGGTGAGGATAACAACACGCCTCTCTTCAACG GCAGACACCCCCATGCTGGCAGGGGTCTCCGAGTATGAACTTCCAGAGGACCCA
AAATGGGAGTTTCCAAGAGATAAGCTGACACTGGGCAAGCCCCTGGGAGAAGGT TGCTTTGGGCAAGTGGTCATGGCGGAAGCAGTGGGAATTGACAAAGACAAGCCC AAGGAGGCGGTCACCGTGGCCGTGAAGATGTTGAAAGATGATGCCACAGAGAAA GACCTTTCTGATCTGGTGTCAGAGATGGAGATGATGAAGATGATTGGGAAACAC AAGAATATCATAAATCTTCTTGGAGCCTGCACACAGGATGGGCCTCTCTATGTCA
TAGTTGAGTATGCCTCTAAAGGCAACCTCCGAGAATACCTCCGAGCCCGGAGGC CACCCGGGATGGAGTACTCCTATGACATTAACCGTGTTCCTGAGGAGCAGATGAC CTTCAAGGACTTGGTGTCATGCACCTACCAGCTGGCCAGAGGCATGGAGTACTTG GCTTCCCAAAAATGTATTCATCGAGATTTAGCAGCCAGAAATGTTTTGGTAACAG AAAACAATGTGATGAAAATAGCAGACTTTGGACTCGCCAGAGATATCAACAATA
TAGACTATTACAAAAAGACCACCAATGGGCGGCTTCCAGTCAAGTGGATGGCTC CAGAAGCCCTGTTTGATAGAGTATACACTCATCAGAGTGATGTCTGGTCCTTCGG GGTGTTAATGTGGGAGATCTTCACTTTAGGGGGCTCGCCCTACCCAGGGATTCCC GTGGAGGAACTTTTTAAGCTGCTGAAGGAAGGACACAGAATGGATAAGCCAGCC AACTGCACCAACGAACTGTACATGATGATGAGGGACTGTTGGCATGCAGTGCCC
TCCCAGAGACCAACGTTCAAGCAGTTGGTAGAAGACTTGGATCGAATTCTCACTC TCACAACCAATGAGGAATACTTGGACCTCAGCCAACCTCTCGAACAGTATTCACC TAGTTACCCTGACACAAGAAGTTCTTGTTCTTCAGGAGATGATTCTGTTTTTTCTC CAGACCCCATGCCTTACGAACCATGCCTTCCTCAGTATCCACACATAAACGGCAG
TGTTAAAACATGA
서열식별번호: 54
FGFR2-IIIc 아미노산 서열
MVSWGRFICLVVVTMATLSLARPSFSLVEDTTLEPEEPPTKYQISQPEVYVAAPGESL EVRCLLKDAAVISWTKDGVHLGPNNRTVLIGEYLQIKGATPRDSGLYACTASRTVDS
ETWYFMVNVTDAISSGDDEDDTDGAEDFVSENSNNKRAPYWTNTEKMEKRLHAVP AANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIMESVVPSD KGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVGGDVEFVCKVY SDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRNVTFEDAG EYTCLAGNSIGISFHSAWLTVLPAPGREKEITASPDYLEIAIYCIGVFLIACMVVTVILC
RMKNTTKKPDFSSQPAVHKLTKRIPLRRQVTVSAESSSSMNSNTPLVRITTRLSSTAD TPMLAGVSEYELPEDPKWEFPRDKLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAVGIDKDKPKEAV TVAVKMLKDDATEKDLSDLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYAS KGNLREYLRARRPPGMEYSYDINRVPEEQMTFKDLVSCTYQLARGMEYLASQKCIH RDLAARNVLVTENNVMKIADFGLARDINNIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRV
YTHQSDVWSFGVLMWEIFTLGGSPYPGIPVEELFKLLKEGHRMDKPANCTNELYMM MRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRILTLTTNEEYLDLSQPLEQYSPSYPDTRSSCSSG DDSVFSPDPMPYEPCLPQYPHINGSVKT
서열식별번호: 55
FGFR3-IIIb 핵산 서열
ATGGGCGCCCCTGCCTGCGCCCTCGCGCTCTGCGTGGCCGTGGCCATCGTGGCCG GCGCCTCCTCGGAGTCCTTGGGGACGGAGCAGCGCGTCGTGGGGCGAGCGGCAG AAGTCCCGGGCCCAGAGCCCGGCCAGCAGGAGCAGTTGGTCTTCGGCAGCGGGG ATGCTGTGGAGCTGAGCTGTCCCCCGCCCGGGGGTGGTCCCATGGGGCCCACTGT
CTGGGTCAAGGATGGCACAGGGCTGGTGCCCTCGGAGCGTGTCCTGGTGGGGCC CCAGCGGCTGCAGGTGCTGAATGCCTCCCACGAGGACTCCGGGGCCTACAGCTG CCGGCAGCGGCTCACGCAGCGCGTACTGTGCCACTTCAGTGTGCGGGTGACAGA CGCTCCATCCTCGGGAGATGACGAAGACGGGGAGGACGAGGCTGAGGACACAG GTGTGGACACAGGGGCCCCTTACTGGACACGGCCCGAGCGGATGGACAAGAAGC
TGCTGGCCGTGCCGGCCGCCAACACCGTCCGCTTCCGCTGCCCAGCCGCTGGCAA CCCCACTCCCTCCATCTCCTGGCTGAAGAACGGCAGGGAGTTCCGCGGCGAGCA CCGCATTGGAGGCATCAAGCTGCGGCATCAGCAGTGGAGCCTGGTCATGGAAAG CGTGGTGCCCTCGGACCGCGGCAACTACACCTGCGTCGTGGAGAACAAGTTTGG CAGCATCCGGCAGACGTACACGCTGGACGTGCTGGAGCGCTCCCCGCACCGGCC
CATCCTGCAGGCGGGGCTGCCGGCCAACCAGACGGCGGTGCTGGGCAGCGACGT GGAGTTCCACTGCAAGGTGTACAGTGACGCACAGCCCCACATCCAGTGGCTCAA GCACGTGGAGGTGAATGGCAGCAAGGTGGGCCCGGACGGCACACCCTACGTTAC CGTGCTCAAGTCCTGGATCAGTGAGAGTGTGGAGGCCGACGTGCGCCTCCGCCTG GCCAATGTGTCGGAGCGGGACGGGGGCGAGTACCTCTGTCGAGCCACCAATTTC
ATAGGCGTGGCCGAGAAGGCCTTTTGGCTGAGCGTTCACGGGCCCCGAGCAGCC GAGGAGGAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTC AGCTACGGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCT GCCGCCTGCGCAGCCCCCCCAAGAAAGGCCTGGGCTCCCCCACCGTGCACAAGA TCTCCCGCTTCCCGCTCAAGCGACAGGTGTCCCTGGAGTCCAACGCGTCCATGAG
CTCCAACACACCACTGGTGCGCATCGCAAGGCTGTCCTCAGGGGAGGGCCCCAC GCTGGCCAATGTCTCCGAGCTCGAGCTGCCTGCCGACCCCAAATGGGAGCTGTCT CGGGCCCGGCTGACCCTGGGCAAGCCCCTTGGGGAGGGCTGCTTCGGCCAGGTG GTCATGGCGGAGGCCATCGGCATTGACAAGGACCGGGCCGCCAAGCCTGTCACC GTAGCCGTGAAGATGCTGAAAGACGATGCCACTGACAAGGACCTGTCGGACCTG
GTGTCTGAGATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAACACAAAAACATCATCAAC CTGCTGGGCGCCTGCACGCAGGGCGGGCCCCTGTACGTGCTGGTGGAGTACGCG GCCAAGGGTAACCTGCGGGAGTTTCTGCGGGCGCGGCGGCCCCCGGGCCTGGAC TACTCCTTCGACACCTGCAAGCCGCCCGAGGAGCAGCTCACCTTCAAGGACCTGG TGTCCTGTGCCTACCAGGTGGCCCGGGGCATGGAGTACTTGGCCTCCCAGAAGTG
CATCCACAGGGACCTGGCTGCCCGCAATGTGCTGGTGACCGAGGACAACGTGAT GAAGATCGCAGACTTCGGGCTGGCCCGGGACGTGCACAACCTCGACTACTACAA GAAGACAACCAACGGCCGGCTGCCCGTGAAGTGGATGGCGCCTGAGGCCTTGTT TGACCGAGTCTACACTCACCAGAGTGACGTCTGGTCCTTTGGGGTCCTGCTCTGG GAGATCTTCACGCTGGGGGGCTCCCCGTACCCCGGCATCCCTGTGGAGGAGCTCT
TCAAGCTGCTGAAGGAGGGCCACCGCATGGACAAGCCCGCCAACTGCACACACG ACCTGTACATGATCATGCGGGAGTGCTGGCATGCCGCGCCCTCCCAGAGGCCCA CCTTCAAGCAGCTGGTGGAGGACCTGGACCGTGTCCTTACCGTGACGTCCACCGA CGAGTACCTGGACCTGTCGGCGCCTTTCGAGCAGTACTCCCCGGGTGGCCAGGAC ACCCCCAGCTCCAGCTCCTCAGGGGACGACTCCGTGTTTGCCCACGACCTGCTGC
CCCCGGCCCCACCCAGCAGTGGGGGCTCGCGGACGTGA
서열식별번호: 56
FGFR3-IIIb 아미노산 서열
MGAPACALALCVAVAIVAGASSESLGTEQRVVGRAAEVPGPEPGQQEQLVFGSGDA
VELSCPPPGGGPMGPTVWVKDGTGLVPSERVLVGPQRLQVLNASHEDSGAYSCRQR
LTQRVLCHFSVRVTDAPSSGDDEDGEDEAEDTGVDTGAPYWTRPERMDKKLLAVP AANTVRFRCPAAGNPTPSISWLKNGREFRGEHRIGGIKLRHQQWSLVMESVVPSDRG NYTCVVENKFGSIRQTYTLDVLERSPHRPILQAGLPANQTAVLGSDVEFHCKVYSDA QPHIQWLKHVEVNGSKVGPDGTPYVTVLKSWISESVEADVRLRLANVSERDGGEYL
CRATNFIGVAEKAFWLSVHGPRAAEEELVEADEAGSVYAGILSYGVGFFLFILVVAA VTLCRLRSPPKKGLGSPTVHKISRFPLKRQVSLESNASMSSNTPLVRIARLSSGEGPTL ANVSELELPADPKWELSRARLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAIGIDKDRAAKPVTVAV KMLKDDATDKDLSDLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQGGPLYVLVEYAAKGN LREFLRARRPPGLDYSFDTCKPPEEQLTFKDLVSCAYQVARGMEYLASQKCIHRDLA
ARNVLVTEDNVMKIADFGLARDVHNLDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRVYTH QSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGIPVEELFKLLKEGHRMDKPANCTHDLYMIMREC WHAAPSQRPTFKQLVEDLDRVLTVTSTDEYLDLSAPFEQYSPGGQDTPSSSSSGDDS
VFAHDLLPPAPPSSGGSRT
서열식별번호: 57
FGFR3-IIIc 핵산 서열
ATGGGCGCCCCTGCCTGCGCCCTCGCGCTCTGCGTGGCCGTGGCCATCGTGGCCG GCGCCTCCTCGGAGTCCTTGGGGACGGAGCAGCGCGTCGTGGGGCGAGCGGCAG AAGTCCCGGGCCCAGAGCCCGGCCAGCAGGAGCAGTTGGTCTTCGGCAGCGGGG
ATGCTGTGGAGCTGAGCTGTCCCCCGCCCGGGGGTGGTCCCATGGGGCCCACTGT CTGGGTCAAGGATGGCACAGGGCTGGTGCCCTCGGAGCGTGTCCTGGTGGGGCC CCAGCGGCTGCAGGTGCTGAATGCCTCCCACGAGGACTCCGGGGCCTACAGCTG CCGGCAGCGGCTCACGCAGCGCGTACTGTGCCACTTCAGTGTGCGGGTGACAGA CGCTCCATCCTCGGGAGATGACGAAGACGGGGAGGACGAGGCTGAGGACACAG
GTGTGGACACAGGGGCCCCTTACTGGACACGGCCCGAGCGGATGGACAAGAAGC TGCTGGCCGTGCCGGCCGCCAACACCGTCCGCTTCCGCTGCCCAGCCGCTGGCAA CCCCACTCCCTCCATCTCCTGGCTGAAGAACGGCAGGGAGTTCCGCGGCGAGCA CCGCATTGGAGGCATCAAGCTGCGGCATCAGCAGTGGAGCCTGGTCATGGAAAG CGTGGTGCCCTCGGACCGCGGCAACTACACCTGCGTCGTGGAGAACAAGTTTGG
CAGCATCCGGCAGACGTACACGCTGGACGTGCTGGAGCGCTCCCCGCACCGGCC CATCCTGCAGGCGGGGCTGCCGGCCAACCAGACGGCGGTGCTGGGCAGCGACGT GGAGTTCCACTGCAAGGTGTACAGTGACGCACAGCCCCACATCCAGTGGCTCAA GCACGTGGAGGTGAATGGCAGCAAGGTGGGCCCGGACGGCACACCCTACGTTAC CGTGCTCAAGACGGCGGGCGCTAACACCACCGACAAGGAGCTAGAGGTTCTCTC
CTTGCACAACGTCACCTTTGAGGACGCCGGGGAGTACACCTGCCTGGCGGGCAA TTCTATTGGGTTTTCTCATCACTCTGCGTGGCTGGTGGTGCTGCCAGCCGAGGAG GAGCTGGTGGAGGCTGACGAGGCGGGCAGTGTGTATGCAGGCATCCTCAGCTAC GGGGTGGGCTTCTTCCTGTTCATCCTGGTGGTGGCGGCTGTGACGCTCTGCCGCC TGCGCAGCCCCCCCAAGAAAGGCCTGGGCTCCCCCACCGTGCACAAGATCTCCC
GCTTCCCGCTCAAGCGACAGGTGTCCCTGGAGTCCAACGCGTCCATGAGCTCCAA CACACCACTGGTGCGCATCGCAAGGCTGTCCTCAGGGGAGGGCCCCACGCTGGC CAATGTCTCCGAGCTCGAGCTGCCTGCCGACCCCAAATGGGAGCTGTCTCGGGCC CGGCTGACCCTGGGCAAGCCCCTTGGGGAGGGCTGCTTCGGCCAGGTGGTCATG GCGGAGGCCATCGGCATTGACAAGGACCGGGCCGCCAAGCCTGTCACCGTAGCC
GTGAAGATGCTGAAAGACGATGCCACTGACAAGGACCTGTCGGACCTGGTGTCT GAGATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAACACAAAAACATCATCAACCTGCTG GGCGCCTGCACGCAGGGCGGGCCCCTGTACGTGCTGGTGGAGTACGCGGCCAAG GGTAACCTGCGGGAGTTTCTGCGGGCGCGGCGGCCCCCGGGCCTGGACTACTCCT TCGACACCTGCAAGCCGCCCGAGGAGCAGCTCACCTTCAAGGACCTGGTGTCCT
GTGCCTACCAGGTGGCCCGGGGCATGGAGTACTTGGCCTCCCAGAAGTGCATCC
ACAGGGACCTGGCTGCCCGCAATGTGCTGGTGACCGAGGACAACGTGATGAAGA TCGCAGACTTCGGGCTGGCCCGGGACGTGCACAACCTCGACTACTACAAGAAGA CAACCAACGGCCGGCTGCCCGTGAAGTGGATGGCGCCTGAGGCCTTGTTTGACC GAGTCTACACTCACCAGAGTGACGTCTGGTCCTTTGGGGTCCTGCTCTGGGAGAT
CTTCACGCTGGGGGGCTCCCCGTACCCCGGCATCCCTGTGGAGGAGCTCTTCAAG CTGCTGAAGGAGGGCCACCGCATGGACAAGCCCGCCAACTGCACACACGACCTG TACATGATCATGCGGGAGTGCTGGCATGCCGCGCCCTCCCAGAGGCCCACCTTCA AGCAGCTGGTGGAGGACCTGGACCGTGTCCTTACCGTGACGTCCACCGACGAGT ACCTGGACCTGTCGGCGCCTTTCGAGCAGTACTCCCCGGGTGGCCAGGACACCCC
CAGCTCCAGCTCCTCAGGGGACGACTCCGTGTTTGCCCACGACCTGCTGCCCCCG GCCCCACCCAGCAGTGGGGGCTCGCGGACGTGA
서열식별번호: 58
FGFR3-IIIc 아미노산 서열
MGAPACALALCVAVAIVAGASSESLGTEQRVVGRAAEVPGPEPGQQEQLVFGSGDA VELSCPPPGGGPMGPTVWVKDGTGLVPSERVLVGPQRLQVLNASHEDSGAYSCRQR LTQRVLCHFSVRVTDAPSSGDDEDGEDEAEDTGVDTGAPYWTRPERMDKKLLAVP AANTVRFRCPAAGNPTPSISWLKNGREFRGEHRIGGIKLRHQQWSLVMESVVPSDRG NYTCVVENKFGSIRQTYTLDVLERSPHRPILQAGLPANQTAVLGSDVEFHCKVYSDA
QPHIQWLKHVEVNGSKVGPDGTPYVTVLKTAGANTTDKELEVLSLHNVTFEDAGEY TCLAGNSIGFSHHSAWLVVLPAEEELVEADEAGSVYAGILSYGVGFFLFILVVAAVTL CRLRSPPKKGLGSPTVHKISRFPLKRQVSLESNASMSSNTPLVRIARLSSGEGPTLANV SELELPADPKWELSRARLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAIGIDKDRAAKPVTVAVKML KDDATDKDLSDLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQGGPLYVLVEYAAKGNLRE
FLRARRPPGLDYSFDTCKPPEEQLTFKDLVSCAYQVARGMEYLASQKCIHRDLAARN VLVTEDNVMKIADFGLARDVHNLDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRVYTHQSD VWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGIPVEELFKLLKEGHRMDKPANCTHDLYMIMRECWH AAPSQRPTFKQLVEDLDRVLTVTSTDEYLDLSAPFEQYSPGGQDTPSSSSSGDDSVFA
HDLLPPAPPSSGGSRT
서열식별번호: 59
2B.1.3 경쇄, 아미노산
Figure pct00017
서열식별번호:60
2B.1.95 경쇄, 아미노산
Figure pct00018
서열식별번호:61
2B.1.73 경쇄, 아미노산
Figure pct00019
서열식별번호:62
2B.1.32 경쇄, 아미노산
Figure pct00020
서열식별번호:63
2B.1.88 경쇄, 아미노산
Figure pct00021
서열식별번호:64
2B.1.1 경쇄, 아미노산
Figure pct00022
서열식별번호:65
2B.1.3.10 경쇄, 아미노산
Figure pct00023
서열식별번호:66
2B.1.3.12 경쇄, 아미노산
Figure pct00024
서열식별번호:67
2B.1.3 경쇄, 핵산
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGG
TCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTTGATACTTCTCTGGCCTGGTATAA ACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTAC TCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGAC CATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAATCTACC GGTCATCCTCAGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG
GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT
GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열식별번호:68
2B.1.95 경쇄, 핵산
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGG
TCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTTGATACTTCTCTGGCCTGGTATAA ACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTAC TCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGAC CATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAATCTACC GGTCATCCTCAGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG
GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT
GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열식별번호:69
2B.1.73 경쇄, 핵산
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGG
TCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTTGATACTTCTCTGGCCTGGTATAA ACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTAC TCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGAC CATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAATCTACC GGTCATCCTCAGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG
GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT
GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열식별번호:70
2B.1.32 경쇄, 핵산
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGG
TCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTTGATACTTCTCTGGCCTGGTATAA ACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTAC TCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGAC CATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAATCTACC GGTCATCCTCAGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG
GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT
GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열식별번호:71
2B.1.88 경쇄, 핵산
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGG
TCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTTGATACTTCTCTGGCCTGGTATAA
ACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTAC TCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGAC CATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAATCTACC GGTCATCCTCAGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG
GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT
GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열식별번호:72
2B.1.1 경쇄, 핵산
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGG
TCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTTGATACTTCTCTGGCCTGGTATAA ACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTAC TCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGAC CATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAATCTACC GGTCATCCTCAGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG
GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT
GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열식별번호:73
2B.1.3.10 경쇄, 핵산
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGG
TCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTTGATACTTCTCTGGCCTGGTATAA ACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTAC TCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGAC CATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAATCTACC GGTCATCCTCAGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG
GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT
GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열식별번호:74
2B.1.3.12 경쇄, 핵산
GATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGG
TCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTTGATACTTCTCTGGCCTGGTATAA ACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAGCTTCTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTAC TCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGTAGCGGTTCCGGGACGGATTTCACTCTGAC CATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAATCTACC GGTCATCCTCAGACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG
GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA
CTGCTTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACA GTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT
GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
서열식별번호:75
2B.1.3 중쇄, 아미노산
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSTGISWVRQAPGKGLEWVGRTHLGDG
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LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
서열식별번호:76
2B.1.95 중쇄, 아미노산
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KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
서열식별번호:77
2B.1.73 중쇄, 아미노산
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MDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK
서열식별번호:78
2B.1.32 중쇄, 아미노산
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SLSPGK
서열식별번호:79
2B.1.88 중쇄, 아미노산
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSTGISWVRQAPGKGLEWVGRIWMFTG STNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYGIYDLYVDYTEY VMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW
NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
서열식별번호:80
2B.1.1 중쇄, 아미노산
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSTGISWVRQAPGKGLEWVGRYWAWD
GSTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYGIYDLYVDYTE YVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPGK
서열식별번호:81
2B.1.3.10 중쇄, 아미노산
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFTSQGISWVRQAPGKGLEWVGRTHLGDG STNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYGIYDTYDKYTEY VMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
DPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
서열식별번호:82
2B.1.3.12 중쇄, 아미노산
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFPFTSTGISWVRQAPGKGLEWVGRTHLGDG STNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYGIYDTYDMYTEY
VMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
서열식별번호:83
2B.1.3 중쇄, 핵산
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTC CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCTTCACTAGTACTGGGATTAGCTGGGT GCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGACGCATTTGGGTGA TGGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGAC
ACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACT GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTACGGCATCTACGACCTGTACGTGGACTACA CGGAGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG
ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC
AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA
CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG
CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAA
서열식별번호:84
2B.1.95 중쇄, 핵산
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTC CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCTTCACTAGTACTGGGATTAGCTGGGT GCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGTTAATTTTTTTTACA GGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACA CATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTG
CCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTACGGCATCTACGACCTGTACGTGGACTACAC GGAGTACGTTATGGACTACTGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCT CCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGG GGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTC
CTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCA GCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCA AGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAC CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG
GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG
GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTA CCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGA GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC
CCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAA CTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC
CGGGTAAA
서열식별번호:85
2B.1.73 중쇄, 핵산
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTC
CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCTTCACTAGTACTGGGATTAGCTGGGT GCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGATGATTTTTTATAAT GGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACA CATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACTG CCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTACGGCATCTACGACCTGTACGTGGACTACAC
GGAGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGA CGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGT CCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGC
AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCA CCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAA AACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT
GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGT ACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGG AGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT
TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA ACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT
CCGGGTAAA
서열식별번호:86
2B.1.32 중쇄, 핵산
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTC CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCTTCACTAGTACTGGGATTAGCTGGGT
GCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGTGGGTCGGATTTAC AGGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGAC ACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACT GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTACGGCATCTACGACCTGTACGTGGACTACA CGGAGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGC
CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT
GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA
CCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA
ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAA
서열식별번호:87
2B.1.88 중쇄, 핵산
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTC CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCACCTTCACTAGTACTGGGATTAGCTGGGT GCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGATTTGGATGTTTAC
AGGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGAC ACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACT GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTACGGCATCTACGACCTGTACGTGGACTACA CGGAGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT
GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC
CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA
AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA
CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAA
서열식별번호:88
2B.1.1 중쇄, 핵산
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTC CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCCCGTTCACTAGTCAGGGGATTAGCTGGGT
GCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGACGCATTTGGGTGA TGGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGAC ACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACT GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTACGGCATCTACGACACGTATGATAAGTACA CGGAGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGC
CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA
CCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA
CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA
ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAA
서열식별번호:89
2B.1.3.10 중쇄, 핵산
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTC CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCCCGTTCACTAGTCAGGGGATTAGCTGGGT GCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGACGCATTTGGGTGA
TGGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGAC ACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACT GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTACGGCATCTACGACACGTATGATAAGTACA CGGAGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT
GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC
CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA
AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA
CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCC CATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA
CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAA
서열식별번호: 90
2B.1.3.12 중쇄, 핵산
GAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTC CGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCCCGTTCACTAGTACGGGGATTAGCTGGGT GCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGGTAGGACGCATTTGGGTGA TGGTTCTACTAACTATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGAC
ACATCCAAAAACACAGCCTACCTACAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAGGACACT GCCGTCTATTATTGTGCTCGTACCTACGGCATCTACGACACGTATGATATGTACA CGGAGTACGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGC CTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG
ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCT GTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCC CACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCC
AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA
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CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAA
서열식별번호: 91
2B.1.3.10 FGFR2-IIIb 및 FGFR2-IIIc 에피토프 1
TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA
서열식별번호: 92
2B.1.3.10 FGFR2-IIIb 및 FGFR2-IIIc 에피토프 2
YKVRNQHWSLIMES
서열식별번호: 93
2B.1.3.10 FGFR3-IIIb 및 FGFR3-IIIc 에피토프 1
TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA
서열식별번호: 94
2B.1.3.10 FGFR3-IIIb 및 FGFR3-IIIc 에피토프 2
IKLRHQQWSLVMES
서열식별번호: 95
VH 하위그룹 III 공통 프레임워크
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
서열식별번호: 96
VH 하위그룹 III 공통 프레임워크
WVRQAPGKGLEWV
서열식별번호: 97
VH 하위그룹 III 공통 프레임워크
RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
서열식별번호: 98
VH 하위그룹 III 공통 프레임워크
WGQGTLVTVSS
서열식별번호: 99
VL 하위그룹 I 공통 프레임워크
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
서열식별번호:100
VL 하위그룹 I 공통 프레임워크
WYQQKPGKAPKLLIY
서열식별번호:101
VL 하위그룹 I 공통 프레임워크
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
서열식별번호:102
VL 하위그룹 I 공통 프레임워크
FGQGTKVEIK
서열식별번호:103
Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr Ala Ser
서열식별번호:104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Val Asp Ala Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
서열식별번호:105
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr Gly Asn Arg Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ala Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
서열식별번호:106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Val Asp Ala Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
서열식별번호:107
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr Gly Asn Arg Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ala Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
서열식별번호:108
Ser Tyr Gly Ile Ser
서열식별번호:109
Asp Tyr Tyr Met Asn
서열식별번호:110
Asn Tyr Gly Val Ser
서열식별번호:111
Asp Thr Tyr Met Asn
서열식별번호:112
Asp Thr Tyr Ile His
서열식별번호:113
Ser Tyr Trp Ile His
서열식별번호:114
Asp Thr Phe Thr His
서열식별번호:115
Glu Tyr Thr Met Asn
서열식별번호:116
Ser Tyr Trp Ile Glu
서열식별번호:117
Asp Tyr Glu Met His
서열식별번호:118
Asp Thr Tyr Ile His
서열식별번호:119
Arg Tyr Trp Met Ser
서열식별번호:120
Asn Tyr Gly Met Asn
서열식별번호:121
Thr Ser Ala Met Gly Ile Gly
서열식별번호:122
Thr Tyr Gly Val His
서열식별번호:123
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr
서열식별번호:124
Phe Gln Gly Thr Gly Tyr Pro Leu Thr
서열식별번호:125
His Gln Val Arg Thr Leu Pro Trp Thr
서열식별번호:126
Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Pro Phe Thr
서열식별번호:127
Phe Gln Gly Ser His Val Leu Thr
서열식별번호:128
Gln Gln His Tyr Ile Val Pro Tyr Thr
서열식별번호:129
Leu Gln Tyr Gly Ser Tyr Pro Trp Thr
서열식별번호:130
His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
서열식별번호:131
Gln Gln His His Ser Thr Pro Tyr Thr
서열식별번호:132
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서열식별번호:133
Gln Gln Tyr Asn Ile Ser Pro Tyr Thr
서열식별번호:134
Gln Asn Gly His Asn Phe Pro Tyr Thr
서열식별번호:135
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서열식별번호:136
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Tyr Thr
서열식별번호:137
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr
서열식별번호:138
Thr Val Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
서열식별번호:139
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Asp Asp Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
서열식별번호:140
Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Ile Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser
서열식별번호:141
Arg Ile Asp Pro Ser Asn Gly Asn Ala Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
서열식별번호:142
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Asp
서열식별번호:143
Glu Ile Asp Pro Ser Val Ser Asn Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly
서열식별번호:144
Arg Ile Asp Pro Ser Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
서열식별번호:145
Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly
서열식별번호:146
Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Glu Asn Phe Arg Asp
서열식별번호:147
Ala Ile Trp Pro Glu Asn Ala Asp Ser Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly
서열식별번호:148
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
서열식별번호:149
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Lys Tyr Val Glu Lys Phe Lys Val
서열식별번호:150
Glu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Asp
서열식별번호:151
Trp Ile Asp Thr Asp Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys Gly
서열식별번호:152
서열식별번호:152
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Synthetic polynucleotide" <400> 70 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca ggatgttgat acttctctgg cctggtataa acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gtagcggttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa tctaccggtc atcctcagac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgct tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 71 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 71 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca ggatgttgat acttctctgg cctggtataa acagaaacca 120 ggaaaagctc cgaagcttct gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180 cgcttctctg gtagcggttc cgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240 gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa tctaccggtc atcctcagac gttcggacag 300 ggtaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgct tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642 <210> 72 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 72 gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60 atcacctgcc gtgccagtca ggatgttgat acttctctgg cctggtataa acagaaacca 120 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Claims (84)

  1. FGFR1 및 FGFR4의 상기 결합이 표면 플라즈몬 공명에 의해 검출되지 않는, FGFR2 및 FGFR3에 결합하는, 단리된 항체.
  2. 상기 항체가 FGFR2 및/또는 FGFR3을 결합시키는, 단리된 항체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항체가 FGFR2-IIIb, FGFR2-IIIc, FGFR3-IIIb, 및/또는 FGFR3-IIIc를 결합시키는, 단리된 항체.
  4. 청구항 1 내지 3 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 인간 FGFR2 및/또는 FGFR3을 결합시키는, 단리된 항체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 거의 없는 또는 무 작용제 기능을 보유하는, 단리된 항체.
  6. 청구항 1 내지 5 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 효과기 기능을 보유하는, 단리된 항체.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 효과기 기능이 항체-의존적 세포-매개된 세포독성을 포함하는, 단리된 항체.
  8. 청구항 1 내지 7 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 세포의 상기 기능을 저해 또는 예방 및/또는 세포의 파괴를 유발하는 세포독성제인, 단리된 항체.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 세포가 암 세포인, 단리된 항체.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 암 세포가 t(4;14) 전좌, 유방암 세포, 삼중 음성 유방암 세포, 골수종 세포, 및 방광암 세포를 포함한 다발성 골수종 세포인, 단리된 항체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프가 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)로부터 선택된 적어도 하나의 상기 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  12. 청구항 1 내지 11 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프가 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  13. 청구항 1 내지 12 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프가 서열식별번호: 91 및 92의 상기 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  14. 청구항 1 내지 13 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프가 서열식별번호: 93 및 94의 상기 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  15. 청구항 1 내지 12 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 제1 및 제2 에피토프에 결합하고, 상기 제1 에피토프가 서열식별번호: 91 및 92의 상기 아미노산 서열을 포함하고, 상기 에피토프가 서열식별번호: 93 및 94의 상기 아미노산 서열을 포함하는 제2 에피토프에 결합하는, 단리된 항체.
  16. 청구항 1 내지 15 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 에피토프에 결합하고 상기 에피토프가 아미노산 서열 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및/또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  17. 청구항 1 내지 16 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 에피토프에 결합하고 상기 에피토프가 아미노산 서열 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  18. 청구항 1 내지 17 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 아미노산 서열 (a) TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및/또는 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92), 및 (b) TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)와 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 결합시키는, 단리된 항체.
  19. 청구항 1 내지 18 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 에피토프에 결합하고 상기 에피토프가 서열식별번호: 91, 92, 93, 및 94의 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  20. 청구항 1 내지 19 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 52 및/또는 54의 157 내지 181의 상기 아미노산 서열 범위 내에서 결합시키는, 단리된 항체.
  21. 청구항 1 내지 20 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 52 및/또는 54의 207 내지 220의 상기 아미노산 서열 범위 내에서 결합시키는, 단리된 항체.
  22. 청구항 1 내지 21 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 52 및 54의 157 내지 181 및 207 내지 220의 상기 아미노산 서열 범위 내에서 결합시키는, 단리된 항체.
  23. 청구항 1 내지 22 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 구성적 FGFR2 및/또는 FGFR3 활성을 저해하는, 단리된 항체.
  24. 청구항 23에 있어서, 구성적 FGFR2 및/또는 FGFR3 활성이 리간드-의존적 구성적 FGFR2 및/또는 FGFR3 활성인, 단리된 항체.
  25. 청구항 23에 있어서, 구성적 FGFR2 및/또는 FGFR3 활성이 리간드-독립적 구성적 FGFR2 및/또는 FGFR3 활성인, 단리된 항체.
  26. 청구항 23-25 중 임의의 하나에 있어서, 상기 구성적 활성이 FGFR2 및 FGFR3 활성인, 단리된 항체.
  27. 청구항 1 내지 26 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 FGFR3-IIIbR248C, FGFR3-IIIbK652E, FGFR3-IIIbS249C, FGFR3-IIIbG372C, 및 FGFR3-IIIbY375C로부터 선택된 상기 돌연변이들 중 임의의 하나에 상응하는 돌연변이를 포함한 FGFR3을 포함하는, 단리된 항체.
  28. 청구항 1 내지 27 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 FGFR3 및 FGFR2 활성을 저해하는, 단리된 항체.
  29. 청구항 1 내지 28 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 및 16으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한 중쇄를 포함하는, 단리된 항체.
  30. 청구항 1 내지 29 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한 경쇄를 포함하는, 단리된 항체.
  31. 청구항 1 내지 30 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 하기를 포함한 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 단리된 항체:
    a. 서열식별번호:1의 경쇄 및 서열식별번호:2의 중쇄,
    b. 서열식별번호:3의 경쇄 및 서열식별번호:4의 중쇄,
    c. 서열식별번호: 5의 경쇄 및 서열식별번호:6의 중쇄,
    d. 서열식별번호:7의 경쇄 및 서열식별번호:8의 중쇄,
    e. 서열식별번호: 9의 경쇄 및 서열식별번호:10의 중쇄,
    f. 서열식별번호:11의 경쇄 및 서열식별번호:12의 중쇄,
    g. 서열식별번호:13의 경쇄 및 서열식별번호:14의 중쇄, 및
    h. 서열식별번호:15의 경쇄 및 서열식별번호:16의 중쇄.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호:13의 경쇄 및 서열식별번호:14의 중쇄를 포함하는, 단리된 항체.
  33. 청구항 31에 있어서, 상기 항체가 서열식별번호:15의 경쇄 및 서열식별번호:16의 중쇄를 포함하는, 단리된 항체.
  34. 청구항 1 내지 33 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3)을 포함하고 하기인, 단리된 항체:
    (a) HVR-L1이 서열식별번호:1의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) HVR-L2가 서열식별번호:2의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (c) HVR-L3이 서열식별번호:3의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (d) HVR-H1이 서열식별번호:4의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (e) HVR-H2가 서열식별번호: 5의 상기 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
    (f) HVR-H3이 서열식별번호:6의 상기 아미노산 서열을 포함함.
  35. 청구항 1 내지 33 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3) 및 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3)을 포함하고 하기인, 단리된 항체:
    (a) HVR-L1이 서열식별번호:7의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) HVR-L2가 서열식별번호:8의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (c) HVR-L3이 서열식별번호: 9의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (d) HVR-H1이 서열식별번호:10의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (e) HVR-H2가 서열식별번호:11의 상기 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
    (f) HVR-H3이 서열식별번호:12의 상기 아미노산 서열을 포함함.
  36. 청구항 1 내지 35 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인, 단리된 모노클로날 항체.
  37. 청구항 1 내지 36 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 키메라성 항체, 인간화된 항체, 친화도 성숙된 항체, 인간 항체, 및 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항체.
  38. 청구항 1 내지 37 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항체가 항체 단편인, 단리된 모노클로날 항체.
  39. 청구항 1 내지 38 중 임의의 하나에 따른 항체를 인코딩한, 폴리뉴클레오타이드.
  40. 청구항 39의 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함한, 벡터.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인, 벡터.
  42. 청구항 40 또는 41에 따른 벡터를 포함한, 숙주 세포.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵인, 숙주 세포.
  44. 청구항 42에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵인, 숙주 세포.
  45. 청구항 42에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물인, 숙주 세포.
  46. 항-FGFR2/3 항체의 제조 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 발현되도록 청구항 1 내지 38 중 임의의 하나에 따른 상기 항체를 인코딩한 폴리뉴클레오타이드를 포함한 숙주 세포의 배양, 및 임의로, 상기 배양액으로부터 상기 항체의 회수를 포함하는, 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵인, 방법.
  48. 청구항 46에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵인, 방법.
  49. 종양, 암, 또는 세포 증식성 질환의 치료 방법으로서, 청구항 1 내지 38 중 임의의 하나에 따른 항-FGFR3 길항제 항체의 유효량을 종양, 암, 또는 세포 증식성 질환을 가진 대상체에 투여하여, 이로써 상기 종양, 암 또는 세포 증식성 질환이 치료되는 것을 포함하는, 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 암, 종양 또는 세포 증식성 질환이 다발성 골수종, 방광 암종, 비소세포 폐암, 난소암, 갑상선암, 머리 및 목 암, 간암, 유방 암종, 위암, 또는 대장암인, 방법.
  51. 청구항 49에 있어서, 상기 암, 종양 또는 세포 증식성 질환이 과도기적 세포 암종인, 방법.
  52. 청구항 49에 있어서, 상기 암, 종양 또는 세포 증식성 질환이 침습성 과도기적 세포 암종인, 방법.
  53. 청구항 49에 있어서, 상기 암, 종양 또는 세포 증식성 질환이 다발성 골수종인, 방법.
  54. 청구항 49-53 중 임의의 하나에 있어서, 상기 암, 종양 또는 세포 증식성 질환이 FGFR3 전좌를 발현시키는, 방법.
  55. 청구항 49-54 중 임의의 하나에 있어서, 상기 암, 종양 또는 세포 증식성 질환이 돌연변이된 FGFR3을 발현시키는, 방법.
  56. 청구항 49-55 중 임의의 하나에 있어서, 상기 암, 종양 또는 세포 증식성 질환이 돌연변이된 FGFR2를 발현시키는, 방법.
  57. 청구항 49-56 중 임의의 하나에 있어서, 상기 암, 종양 또는 세포 증식성 질환이 상기 종양 또는 세포가 FGFR2 및/또는 FGFR3을 과발현시키는, 방법.
  58. 청구항 55 또는 56에 있어서, 상기 돌연변이가 구성적 돌연변이인, 방법.
  59. 청구항 50에 있어서, 상기 유방 암종이 삼중 음성 유방암인, 방법.
  60. 청구항 50에 있어서, 상기 암이 위암인, 방법.
  61. 청구항 49-60 중 임의의 하나에 있어서, 상기 대상체에 또 다른 치료제의 유효량의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
  62. 세포 증식의 저해 방법으로서, 청구항 1 내지 38 중 임의의 하나에 따른 항-FGFR2/3 항체의 유효량을 대상체에 투여하여, 이로써 상기 세포 증식이 저해되는 것을 포함하는, 방법.
  63. 다발성 골수종 세포의 고갈 방법으로서, 청구항 1 내지 38 중 임의의 하나에 따른 항-FGFR2/3 항체의 유효량을 대상체에 투여하여, 이로써 상기 다발성 골수종 세포가 고갈되는, 방법.
  64. 하기를 포함하는, 조성물:
    (a) 베타-클로토 (KLB), FGFR2, 및 FGFR3에 결합하는, 단리된 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분;
    (b) KLB, FGFR2, 및 FGFR3에 결합하는, 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩한 핵산;
    (c) KLB, FGFR2, 및 FGFR3에 결합하는, 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩한 핵산을 포함한 숙주 세포;
    (d) KLB, FGFR2, 및 FGFR3에 결합하는, 단리된 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한 약학적 제형.
  65. 청구항 64에 있어서, 상기 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 FGFR2/3 에피토프에 결합하고/하거나 FGFR2/3 에피토프에 결합에 대하여 경쟁하는, 조성물.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 FGFR2/3 에피토프가 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)로부터 선택된 FGFR2 에피토프인, 조성물.
  67. 청구항 65에 있어서, 상기 FGFR2/3 에피토프가 모든 TNTEKMEKRLHAVPAANTVKFRCPA (서열식별번호: 91) 및 YKVRNQHWSLIMES (서열식별번호: 92)를 포함한 FGFR2 에피토프인, 조성물.
  68. 청구항 65에 있어서, 상기 FGFR2/3 에피토프가 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)로부터 선택된 FGFR3 에피토프인, 조성물.
  69. 청구항 65에 있어서, 상기 FGFR2/3 에피토프가 모든 TRPERMDKKLLAVPAANTVRFRCPA (서열식별번호: 93) 및 IKLRHQQWSLVMES (서열식별번호: 94)를 포함한 FGFR2 에피토프인, 조성물.
  70. 청구항 64-69 중 임의의 하나에 있어서, 상기 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 상기 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 103)으로 이루어진 KLB의 단편 내의 KLB 에피토프에 결합하는, 조성물.
  71. 청구항 64-70 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-KLB 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 하기를 포함하는, 조성물:
    (a) 서열식별번호: 108-122로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 치환을 포함한 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열식별번호: 138-153으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 치환을 포함한 중쇄 가변 영역 CDR2 도메인; 및
    (c) 서열식별번호: 154-169로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 치환을 포함한 중쇄 가변 영역 CDR3 도메인.
  72. 청구항 64-71 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-KLB 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 하기를 포함하는, 조성물:
    (a) 서열식별번호: 170-184로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 치환을 포함한 경쇄 가변 영역 CDR1 도메인;
    (b) 서열식별번호: 185-200으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 치환을 포함한 경쇄 가변 영역 CDR2 도메인; 및
    (c) 서열식별번호: 201-215로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 치환을 포함한 경쇄 가변 영역 CDR3 도메인.
  73. 청구항 64-72 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3)을 포함하고 하기인, 조성물:
    (a) HVR-L1이 서열식별번호:7의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) HVR-L2가 서열식별번호:8의 상기 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
    (c) HVR-L3이 서열식별번호: 9의 상기 아미노산 서열을 포함함.
  74. 청구항 64-73 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3)을 포함하고 하기인, 조성물:
    (a) HVR-H1이 서열식별번호:10의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) HVR-H2가 서열식별번호:11의 상기 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
    (c) HVR-H3이 서열식별번호:12의 상기 아미노산 서열을 포함함.
  75. 청구항 64-72 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 3개의 경쇄 초가변 영역 (HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3)을 포함하고 하기인, 조성물:
    (a) HVR-L1이 서열식별번호:276의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) HVR-L2가 서열식별번호:277의 상기 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
    (c) HVR-L3이 서열식별번호:278의 상기 아미노산 서열을 포함함.
  76. 청구항 64-72 및 75 중 임의의 하나에 있어서, 상기 항-FGFR2/3 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 3개의 중쇄 초가변 영역 (HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3)을 포함하고 하기인, 조성물:
    (a) HVR-H1이 서열식별번호:279의 상기 아미노산 서열을 포함하고,
    (b) HVR-H2가 서열식별번호:280의 상기 아미노산 서열을 포함하고, 그리고
    (c) HVR-H3이 서열식별번호:281의 상기 아미노산 서열을 포함함.
  77. 청구항 64-76 중 임의의 하나에 있어서, 상기 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분이 섬유아세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4)에 추가로 결합하는, 조성물.
  78. 청구항 64-77 중 임의의 하나에 있어서, 상기 조성물이 약학적으로 허용가능한 캐리어를 추가로 포함하는, 조성물.
  79. 상기 개체에 청구항 64-78 중 임의의 하나에 따른 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분 유효량의 투여를 포함하는, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사성 증후군 (MetS), 비만, 비- 알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재적 자가면역 당뇨병 (LAD), 약년발증 성인형 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련된 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS, 바데트-비들 증후군, 프라다-윌리 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 알브라이트 유전성 골이영양증 (가성부갑상선기능저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 취약 X 증후군 및 보제슨-포스만-레만 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 갖는 개체의 치료 방법.
  80. 청구항 79에 있어서, 상기 질환이 NASH인, 방법.
  81. 청구항 79에 있어서, 상기 이중특이적 항체가 생체내 혈당 수준을 감소시키는, 방법.
  82. KLB, FGFR2, 및 FGFR3에 결합하는, 상기 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩한 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 세포의 배양을 포함한 청구항 64-78 중 임의의 하나에 따른 이중특이적 항체의, 생산 방법.
  83. 대사성 질환을 치료하는 약제에서 사용하기 위한 청구항 64-78 중 임의의 하나에 따른 임의의 상기 이중특이적 항체의 용도로서, 상기 질환이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도: 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사성 증후군 (MetS), 비만, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지혈증, 고혈압, 제2형 당뇨병, 비-제2형 당뇨병, 제1형 당뇨병, 잠재적 자가면역 당뇨병 (LAD), 약년발증 성인형 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련된 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS, 바데트-비들 증후군, 프라다-윌리 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 알브라이트 유전성 골이영양증 (가성부갑상선기능저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 취약 X 증후군 및 보제슨-포스만-레만 증후군.
  84. 대사성 질환을 치료하는 약제에서 사용하기 위한 청구항 64-78 중 임의의 하나에 따른 임의의 상기 이중특이적 항체의 용도로서, 상기 대사성 질환이 NASH인, 용도.
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