KR20170068469A - ＧａｌＮＡｃ 포스포라미다이트, 그의 핵산 컨쥬게이트 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 포스포라미다이트 유도체의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 N-아세틸갈락토사민 포스포라미다이트 분자 및 핵산 분자와 N-아세틸갈락토사민 함유 분자의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 또한 제공되는 것은 이들 분자의 제조 방법 및, 특히 의약에서의, 그의 가능한 용도이다.
Description
본 발명은 일반적으로 포스포라미다이트 유도체의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 N-아세틸갈락토사민 포스포라미다이트 분자 및 핵산 분자와 N-아세틸갈락토사민 함유 분자의 컨쥬게이트 (conjugate) 에 관한 것이다. 또한 제공되는 것은 이들 분자의 제조 방법 및, 특히 의약에서의, 그의 가능한 용도이다.
최근에, 핵산 분자를 치료법에서 사용하는 접근법이 개발되었다. 약학적으로 관련 있는 특성에 유리하게 영향을 미치기 위해서, 핵산 분자는 특정 리간드 예컨대 펩티드, 지질, 스테롤, 및 탄수화물에 컨쥬게이트되었다. 핵산 컨쥬게이트는 siRNA 에서의 사용에 관해 심도 있게 평가되었으며, 여기에서 그것은 충분한 생체내 효능을 얻기 위해서 본질적으로 여겨진다. 예를 들어, 말단 갈락토스 또는 그의 유도체를 함유하는 컨쥬게이트 모이어티를 핵산에 부착하여, 그에 의해 핵산 분자를 아시알로당단백질 수용체 (asialoglycoprotein receptor) (ASGPR) 에 대한 결합을 통해 간세포로 표적화하는 것에 관해, 예를 들어 WO2009/073809, WO2011/104169 및 WO2012/083046 을 참조한다.
EP2796150 은 siRNA 또는 올리고뉴클레오티드의 양쪽 말단에 결합된 친수성 재료 및 소수성 재료를 포함하는 하이브리드 컨쥬게이트를 기재한다. 하나의 예에서 친수성 재료는 peg 화된 (pegylated) siRNA 분자에 커플링되는 특이적 GalNAc 포스포라미다이트이다.
US 6,057,431 은 단당류 또는 그의 유도체를 그것의 말단에 갖는 포스포아미다이트 유도체, 특히 올리고뉴클레오티드가 상기 포스포아미다이트 유도체 내로 도입되어 있는 올리고뉴클레오티드 유도체에 관한 것이다.
Dubber 및 Frechet 2003 Bioconjugate Chem. Vol. 14 페이지 239 는 포스포라미다이트 유도체를 커플링하기 위해 DNA 합성기를 사용하는 그러나 올리고뉴클레오티드를 생산하지 않는 삼가 갈락토스 클러스터의 합성을 기재한다. WO2002/094185 는 세포 전달을 위한 다양한 컨쥬게이트 및 조성물에 관한 것이다.
WO2014/118267 및 WO2014/179620 은, 특히 안티센스 올리고머 및 아시알로당단백질 수용체 표적화 컨쥬게이트 모이어티, 예컨대 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오티드 탄수화물 컨쥬게이트에 관한 것이다.
그러나, 현재 입수가능한 탄수화물 컨쥬게이트의 하나의 큰 결점은 10 개 초과의 개별 합성 단계를 포함하는 그것의 복잡한 합성이다. 각각의 요망되는 컨쥬게이트에 관해, 복잡하고 특이적인 합성 프로토콜이 수립되었다.
본 발명의 목적은 생산하기 용이한 신규한 컨쥬게이트 분자를 제공하는 것이었다.
놀랍게도, 본 발명자들은 이제 탄수화물 핵산 컨쥬게이트의 합성이 신규한 GalNAc 포스포라미다이트를 사용함으로써 크게 용이하게 된다는 것을 발견했다. 특히, 그것의 사용은 컨쥬게이트의 제조에 있어서 현재 입수가능한 프로토콜에 비해 상당히 더 적은 작업을 초래한다.
더욱이, 본 발명의 GalNAc 포스포라미다이트와 상업적으로 입수가능한 분지 분자 (branching molecule) 뿐만 아니라 상업적으로 입수가능한 스페이서 (spacer) 와의 호환성으로 인해, 본 발명은 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 합성에 있어서 큰 유연성을 제공한다. 적합한 GalNAc 포스포라미다이트 (요망되는 링커 (linker) 를 가짐), 핵산 및, 요망되는 경우에, 브랜처 (brancher) 분자 및/또는 스페이서 분자가 구체적 필요에 따라 조합될 수 있다. 예를 들어, 최종 컨쥬게이트의 결합이, 예를 들어 GalNAc 분자 사이의 간격에 관하여, 특정 세포 수용체, 예를 들어 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 대한 결합에 관해 이상적으로 적합하도록 개별 빌딩 블록이 선택될 수 있다.
게다가, 신규한 GalNAc 포스포라미다이트는 고체 상 합성에서 예를 들어 LNA 및 DNA 포스포라미다이트와 함께 사용될 수 있다. 이는 핵산 분자 합성 직후에, 핵산이 여전히 고체 지지체에 부착되어 있는 동안에 핵산 탄수화물 컨쥬게이트의 조립을 허용한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 N-아세틸갈락토사민 (N-acetylgalactosamine) (GalNAc) 포스포라미다이트에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 GalNAc-핵산 컨쥬게이트, 즉 핵산 분자에 링커 및 포스포라미다이트 화학 (phosphoramidite chemistry) 을 사용하여 공유 결합된 하나 이상의 (예를 들어 복수의) GalNAc 모이어티를 포함하는 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, GalNAc 모이어티는 분지 분자에, 임의로 스페이서 분자를 통해, 공유 결합되어, 그에 의해 2, 3 개 이상의 GalNAc 모이어티를 포함하는 클러스터를 생성했다.
추가의 양상에서, 본 발명은 GalNAc 포스포라미다이트의 제조 방법에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 것이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 기재된 신규한 GalNAc 포스포라미다이트 및 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 다양한 용도에 관한 것이다.
추가의 양상에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물, 특히 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 의학적 용도를 제공한다.
또한 제공되는 것은 본 발명에 따른 화합물, 특히 GalNAc-핵산 컨쥬게이트를 치료 또는 진단 유효량으로, 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다.
도 1: 본 발명에 따른 올리고머의 고체 상 합성의 개관.
도 1a) GalNAc 포스포라미다이트를 단독으로 (a) 또는 더블러 (doubler) (b) 또는 트레블러 (trebler) 분지 분자 (c) 와의 조합으로 사용하는 일가, 이가 및 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 합성의 흐름도.
도 1b) GalNAc 포스포라미다이트 및 스페이서 및 이가 및 삼가 분자의 경우에 더블러 또는 트레블러 분지 분자를 사용하는 일가 (a), 이가 (b) 및 삼가 (c) GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 합성의 흐름도.
도 2: GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 합성예.
도 2a) 고체 지지체 위에서의 순차적 합성의 일부로서 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 직접 GalNAc 포스포라미다이트의 커플링의 예.
도 2b) 트레블러 위로 직접 GalNAc 포스포라미다이트의 커플링 및 후속적 절단 및 탈보호에 의한 올리고뉴클레오티드 GalNAc 클러스터 구축물의 제공의 예.
도 2c) 트레블러 위로 순차적으로 스페이서 및 GalNAc 포스포라미다이트의 커플링 및 후속적 절단 및 탈보호에 의한 올리고뉴클레오티드 GalNAc 클러스터 구축물의 제공의 예.
도 3: GalNAc 포스포라미다이트에 대한 NMR 데이타.
도 3a) 31P-NMR
도 3b) 1H-NMR
도 3c) 13C-NMR
도 3d) 31P-NMR TEG 베타-GalNAc 포스포라미다이트
도 3e) 1H-NMR TEG 베타-GalNAc 포스포라미다이트
도 4: 일가 GalNAc-올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트에 대한 데이타.
도 4a) 체류 시간 (UPLC)
도 4b) ESI-MS 에 의해 확인되는 분자량
도 5: 예시적 GalNAc 포스포라미다이트
(A) 내지 (D) 는 상이한 링커를 갖는 GalNAc 포스포라미다이트를 나타낸다.
도 6: 예시적 GalNAc-핵산 컨쥬게이트
(A) 및 (B) 는 8 개 원자의 링커 길이를 갖는 일가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다.
(C) 및 (D) 는 5 개 원자의 링커 길이를 갖는 이가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬 (contiguous chain) 의 길이는 15 개 원자이다.
(E) 는 GalNAc 포스포라미다이트, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이며, 링커 길이는 2 개 원자이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 10 개 원자이다.
(F) 내지 (I) 는 GalNAc 포스포라미다이트, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이며, 링커 길이는 8 개 원자이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 16 개 원자이다.
(J), (K) 및 (M) 은 GalNAc 포스포라미다이트, 스페이서, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다. 링커 길이는 2 이고 스페이서 길이는 3 이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 16 개 원자이다.
(L) 은 GalNAc 포스포라미다이트, 스페이서, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다. 링커 길이는 3 이고 스페이서 길이는 8 이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 22 개 원자이다.
(N) 은 GalNAc 포스포라미다이트, 스페이서, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다. 링커 길이는 2 이고 스페이서 길이는 17 이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 30 개 원자이다.
도 7 ApoB mRNA 녹 다운 (knock down)
A) 는 25 ㎎/kg 의 단일 주입 후 10 days 에 간에서의 시험 화합물에 의한 mRNA 녹 다운을 보여준다.
B) 는 25 ㎎/kg 의 단일 주입 후 10 days 에 신장에서의 시험 화합물에 의한 mRNA 녹 다운을 보여준다.
도 8 혈청 중 총 콜레스테롤의 하향 조절
도면은 25 ㎎/kg 의 화합물의 단일 주입 후 day 3, 7 및 10 에 측정된 혈청 콜레스테롤의 하향 조절을 보여준다.
도 1a) GalNAc 포스포라미다이트를 단독으로 (a) 또는 더블러 (doubler) (b) 또는 트레블러 (trebler) 분지 분자 (c) 와의 조합으로 사용하는 일가, 이가 및 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 합성의 흐름도.
도 1b) GalNAc 포스포라미다이트 및 스페이서 및 이가 및 삼가 분자의 경우에 더블러 또는 트레블러 분지 분자를 사용하는 일가 (a), 이가 (b) 및 삼가 (c) GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 합성의 흐름도.
도 2: GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 합성예.
도 2a) 고체 지지체 위에서의 순차적 합성의 일부로서 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 직접 GalNAc 포스포라미다이트의 커플링의 예.
도 2b) 트레블러 위로 직접 GalNAc 포스포라미다이트의 커플링 및 후속적 절단 및 탈보호에 의한 올리고뉴클레오티드 GalNAc 클러스터 구축물의 제공의 예.
도 2c) 트레블러 위로 순차적으로 스페이서 및 GalNAc 포스포라미다이트의 커플링 및 후속적 절단 및 탈보호에 의한 올리고뉴클레오티드 GalNAc 클러스터 구축물의 제공의 예.
도 3: GalNAc 포스포라미다이트에 대한 NMR 데이타.
도 3a) 31P-NMR
도 3b) 1H-NMR
도 3c) 13C-NMR
도 3d) 31P-NMR TEG 베타-GalNAc 포스포라미다이트
도 3e) 1H-NMR TEG 베타-GalNAc 포스포라미다이트
도 4: 일가 GalNAc-올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트에 대한 데이타.
도 4a) 체류 시간 (UPLC)
도 4b) ESI-MS 에 의해 확인되는 분자량
도 5: 예시적 GalNAc 포스포라미다이트
(A) 내지 (D) 는 상이한 링커를 갖는 GalNAc 포스포라미다이트를 나타낸다.
도 6: 예시적 GalNAc-핵산 컨쥬게이트
(A) 및 (B) 는 8 개 원자의 링커 길이를 갖는 일가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다.
(C) 및 (D) 는 5 개 원자의 링커 길이를 갖는 이가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬 (contiguous chain) 의 길이는 15 개 원자이다.
(E) 는 GalNAc 포스포라미다이트, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이며, 링커 길이는 2 개 원자이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 10 개 원자이다.
(F) 내지 (I) 는 GalNAc 포스포라미다이트, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이며, 링커 길이는 8 개 원자이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 16 개 원자이다.
(J), (K) 및 (M) 은 GalNAc 포스포라미다이트, 스페이서, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다. 링커 길이는 2 이고 스페이서 길이는 3 이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 16 개 원자이다.
(L) 은 GalNAc 포스포라미다이트, 스페이서, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다. 링커 길이는 3 이고 스페이서 길이는 8 이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 22 개 원자이다.
(N) 은 GalNAc 포스포라미다이트, 스페이서, 브랜처 및 올리고뉴클레오티드로 구성되는 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트이다. 링커 길이는 2 이고 스페이서 길이는 17 이다. R1, 2 또는 3 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 30 개 원자이다.
도 7 ApoB mRNA 녹 다운 (knock down)
A) 는 25 ㎎/kg 의 단일 주입 후 10 days 에 간에서의 시험 화합물에 의한 mRNA 녹 다운을 보여준다.
B) 는 25 ㎎/kg 의 단일 주입 후 10 days 에 신장에서의 시험 화합물에 의한 mRNA 녹 다운을 보여준다.
도 8 혈청 중 총 콜레스테롤의 하향 조절
도면은 25 ㎎/kg 의 화합물의 단일 주입 후 day 3, 7 및 10 에 측정된 혈청 콜레스테롤의 하향 조절을 보여준다.
본 발명의 상세한 설명
GalNAc 포스포라미다이트
하나의 양상에서, 본 발명은 신규한 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 포스포라미다이트에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 일반식 (I) 을 갖는 화합물을 제공한다
식에서
NR'R" 는 이차 아미노 기이며, 여기에서 R' 및 R" 는 독립적으로 C1-C6-알킬로부터 선택되거나 또는 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고 이는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성하고;
A 는 C1-C6-알킬 기 또는 보호된 히드록시- 또는 티오-기이고;
G 는 일반식 (II) 로 표시되고
식에서 A1 은 적합한 히드록실 보호기이고, 이는 각각의 존재에서 동일 또는 상이할 수 있고;
L 은 2-30 개 탄소 원자의 사슬 길이를 갖는 링커 기이며, 여기에서 사슬에서의 탄소 원자 중 하나 이상은 각각 독립적으로 -NHCO-, -CONH- 및/또는 헤테로원자, 특히 O 로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서 링커 기 L 은 C2-C30-알케닐렌, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터, 더욱 바람직하게는 -(CH2)2-, -(CH2)3-, 및 -(CH2)8- 로부터 선택된다.
GalNAc 모이어티는 화학식 II 에서 물결선에 의해 표시되는 바와 같이 알파 또는 베타 입체배치로 존재할 수 있다. 바람직한 구현예에서 GalNAc 모이어티는 베타 입체배치로 존재한다.
본원에서 사용되는 용어 "GalNAc 모이어티" 는 GalNAc 을 포함하는 구조의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 부분이다. 예를 들어 화학식 (II) 에서 GalNAc 모이어티는 L 을 구성하지 않는 분자의 부분이다.
본원에서 사용되는 용어 "GalNAc 컨쥬게이트 모이어티" 는 적어도 하나의 GalNAc 모이어티를 포함하고 약물 특히 핵산에 컨쥬게이트될 수 있는 분자를 언급한다. 바람직하게는 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티는 아시알로당단백질 수용체를 향한 친화성을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "포스포라미다이트" 는 적어도 하나의 질소 원자에 공유 결합되어 있는 산화 상태 III 에서의 포스포르 원자를 함유하는 임의의 화합물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 포스포라미다이트는 적어도 하나의 질소 원자 및 2 개의 산소 원자에 공유 결합되어 있는 산화 상태 III 에서의 포스포르 원자를 함유하는 화합물이다. 본 발명의 대안적인 포스포라미다이트는 제 2 산소가 황 원자 또는 C1-C6-알킬 기를 갖는 대신에 적어도 하나의 질소 원자 및 하나의 산소 원자에 공유 결합되어 있는 산화 상태 III 에서의 포스포르 원자를 함유하는 화합물이다.
특정 구현예에서, 화학식 (I) 에서 이차 아미노 기 -NR'R" 의 R' 및 R" 는 독립적으로 C1-C6-알킬로부터, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸 및 n-헥실로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R' 는 R" 와 동일하고, -NR'R" 는 그 때 바람직하게는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디이소프로필아미노, 및 디부틸아미노로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R' 및 R" 는 각각 이소프로필이다.
기타 구현예에서, R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하며, 이 고리는 치환될 수 있고 이 고리는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, R' 및 R" 는 미치환된 5-원 고리를 형성하며, 기타 구현예에서, 그들은 미치환된 6-원 고리를 형성한다. 추가의 구현예에서, 5-원 또는 6-원 고리는 하나 이상의 탄소 원자에서 치환되어 있다. 예를 들어, 고리는 1, 2, 3 또는 4 개의 탄소 원자에서, 바람직하게는 1 또는 2 개의 탄소 원자에서 치환될 수 있다. 바람직한 치환기는 메틸 및 에틸이다. 특히, 고리는 피롤리디노, 피페리디노, 2,6-디메틸피페리디노, 모르폴리노, 이미다졸릴 및 4-메틸이미다졸릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
화학식 (I) 에서 모이어티 A 는, 일부 구현예에 따르면, C1-C6-알킬로부터, 특히 메틸 및 에틸로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, A 는 보호된 히드록시 기 (-OH) 또는 보호된 티오 기 (-SH) 이다. 예시적 비-제한적 보호된 히드록시 기는 에테르 기이고, 예시적 비-제한적 보호된 티오 기는 티오에테르 기이다. 특히, A 로 표시되는 보호된 -OH 또는 -SH 기는 2-시아노에톡시, 2-시아노에틸티오, 메톡시, 에톡시, S-이소부타노일-2-(2-메르캅토-에톡시)에톡시, S-피발로일-2-(2-메르캅토-에톡시)에톡시, 및 S-피발로일-2-메르캅토에톡시로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 A 는 2-시아노에톡시 기이다.
링커 기 L 은 GalNAc 포스포라미다이트의 요망되는 응용물에 따라 선택된다. 일부 구현예에서, 사슬에서의 탄소 원자 중 하나 이상은 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH- 및/또는 헤테로원자, 특히 O 로 대체될 수 있다. 링커의 총 길이가 대체 후에 30 개 원자를 초과하지 않고 -NH-CO-, -CO-NH 의 경우에 대체에 대한 적어도 하나의 이웃 원자를 탄소 원자로서 및 헤테로원자 대체의 경우에 적어도 2 개의 이웃 탄소 원자를 유지하도록 대체의 수를 적합화할 것이다. 일부 구현예에서 대체의 수는 5 미만이고 대체에 대한 이웃 원자는 탄소 원자이다. 일부 구현예에서 1 또는 2 개 이하의 대체가 사슬에서 실시되고 대체에 대한 이웃 원자는 탄소 원자이다. 예를 들어, GalNAc 및 포스포라미다이트 사이의 링커는 단순 디올로부터 유래할 수 있다. 원칙적으로, 임의의 대칭적 또는 비대칭적 디올이 링커로서 본 발명의 GalNAc 포스포라미다이트에서 사용될 수 있을 것이며, 다만 그것은 기타 친핵성 기를 함유하지 않을 것이다. 일부 구현예에서, -(OCH2CH2)-기의 배열을 형성하기 위해서 사슬에서의 탄소 원자는 산소 원자로 대체된다.
특정 구현예에서, L 은 C2-C30-알킬렌, C2-C30-알케닐렌, 및 -CH2CH2-(OCH2CH2)0-8-OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 구체적으로, 링커 기 L 은 C2-C20-알킬렌, C2-C20-알케닐렌, -CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2-, CH2CH2-(OCH2CH2)0-3-OCH2CH2-, CH2CH2-(OCH2CH2)0-4-OCH2CH2-, 및 CH2CH2-(OCH2CH2)6-8-OCH2CH2 로부터 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로 알킬렌은 C3-C19-알킬렌 (C6 알킬렌은 아님) 으로부터 또는 C7-C19-알킬렌으로부터 선택된다. 더더욱 구체적으로, 링커 기 L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 이다. 기타 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -(CH2)8- 또는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -(CH2)5 또는 -CH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 또는 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 이다.
A1 에 관하여, 많은 상이한 보호기가 입수가능하다. 통상의 기술자는 포스포라미다이트의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드 합성 과정의 커플링 및 산화 단계에서 사용되는 반응 조건에 대해 안정적인 보호기를 선택하는 방법을 알 것이다. 화학식 (II) 에 따른 적합한 히드록실 보호기 A1 의 예로서, 아실 기 및 실릴 기가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 보호기 A1 은 아세틸, 벤조일, 페녹시-아세틸, 디메톡시트리틸 (DMT), 피발로일, 이소부티릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 및 이소프로필디메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 A1 은 아세틸이다.
일부 구현예에서, 아세틸이 보호기 A1 로서 사용된다. 화학식 (I) 에 따른 GalNAc 포스포라미다이트가 핵산 컨쥬게이트의 합성에서 사용될 때, 아세틸 기는, 예를 들어 LNA 합성에서 통상적으로 사용되는 절단 및 탈보호 단계에서 핵산, 예를 들어 LNA 또는 DNA 의 보호기와 함께 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 디메톡시트리틸 (DMT) 이 GalNAc 의 탄소 원자 6 에서 보호기 A1 로서 사용된다. 이 위치에서 DMT 을 사용하는 이점은 그것이 정제 동안 실패 서열 (예를 들어 합성에서의 실패가 첨가되지 않는 GalNAc 모이어티를 초래한 비-완전 구축물) 의 용이한 분리를 허용한다는 점이다.
본 발명에 따른 구체적 구현예에서, 화합물은 일반식 (I) 을 가지며, 식에서
A 은 -O-CH2CH2CN 이고, R' 및 R" 는 각각 이소프로필이고, G 는 화학식 (II) 로 표시되고, 식에서 A1 은 아세틸이고 L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 특정 바람직한 구현예에서, A 은 -O-CH2CH2CN 이고, R' 및 R" 는 각각 이소프로필이고, A1 은 아세틸이고 L 은 -(CH2)2- 이다. 기타 바람직한 구현예에서, A 은 -O-CH2CH2CN 이고, R' 및 R" 는 각각 이소프로필이고, A1 은 아세틸이고 L 은 -(CH2)3- 이다. 기타 바람직한 구현예에서 A 은 -O-CH2CH2CN 이고, R' 및 R" 는 각각 이소프로필이고, A1 은 아세틸이고 L 은 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이다. 기타 바람직한 구현예에서, A 은 -O-CH2CH2CN 이고, R' 및 R" 는 각각 이소프로필이고, A1 은 아세틸이고 L 은 -(CH2)8- 이다. 임의로, 상기 바람직한 구현예에서 당의 위치 6 에서의 A1 은 DMT 이다.
예시적 GalNAc 포스포라미다이트가 도 5 에서 화학식 (A) 내지 (D) 로 표시되어 있다.
GalNAc-핵산 컨쥬게이트
추가의 양상에서, 본 발명은 신규한 GalNAc-핵산 컨쥬게이트, 특히 GalNAc 클러스터 컨쥬게이트에 관한 것이다. GalNAc 컨쥬게이트 모이어티는 부착된 핵산의 약동학적 및 약역학적 특성을 변경하거나 향상시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 일반식 (III) 을 갖는 화합물을 제공한다
식에서
Z 는 핵산 분자이고;
T 는 일반식 (IV) 로 표시되고
식에서
R2 는 H 또는 -(CH2)q-R1 을 나타내고,
R1 및 R3 은 각각의 존재에서 일반식 (V) 로 표시되고
식에서 각각의 존재에서 독립적으로
V 는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
W 는 -(CH2)2-15- 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
Y 는 O 또는 S 이고;
m 은 1 내지 3 의 정수이고;
n 은 0 내지 5 의 정수이고;
p 는 0 내지 3 의 정수이고;
q 는 1 내지 2 의 정수이고;
r 은 1 내지 5 의 정수이고;
s 는 0 또는 1 이고
G 는 일반식 (II)' 로 표시되고
식에서 A1 은 H 또는 적합한 히드록실 보호기이고, 이는 각각의 존재에서 동일 또는 상이할 수 있고; L 은 2-23 개 탄소 원자의 사슬 길이를 갖는 링커 기이고, 여기에서 사슬에서의 탄소 원자 중 하나 이상은 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH- 및/또는 헤테로원자, 특히 O 로 대체될 수 있고;
각각의 존재에서 독립적으로
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 -O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고,
여기에서 R1, R3 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐.
대안적으로, 본 발명은 일반식 (III) 을 갖는 화합물을 제공한다
식에서
Z 는 핵산 분자이고;
T 는 일반식 (VI) 로 표시되고
식에서 각각의 존재에서 독립적으로
W 는 -(CH2)2-15- 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
s 는 0 또는 1 이고
G 는 일반식 (II)' 로 표시되고
식에서 A1 은 H 또는 적합한 히드록실 보호기이고, 이는 각각의 존재에서 동일 또는 상이할 수 있고; L 은 2-23 개 탄소 원자의 사슬 길이를 갖는 링커 기이고, 여기에서 사슬에서의 탄소 원자 중 하나 이상은 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH- 및/또는 헤테로원자, 특히 O 로 대체될 수 있고;
각각의 존재에서 독립적으로
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 -O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고,
여기에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 핵산 분자에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐.
링커 L 의 제 1 원자는 링커가 화학식 II 및 II' 에서의 GalNAc 모이어티에 부착되어 있는 위치의 원자이다.
화학식 (III) 에서 변수 Z 는 핵산 분자를 나타낸다. 본 발명의 맥락에서 언급되는 핵산 분자는 아래에서 더욱 심도 있게 기술될 것이고 일반적으로 DNA, RNA 일 수 있거나 또는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 둘다를 포함하거나 또는 완전히 뉴클레오티드 유사체로 이루어지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. GalNAc 컨쥬게이트 모이어티는 핵산의 5'- 또는 3'-말단 위로 구축될 수 있다. 바람직하게는, GalNAc 컨쥬게이트 모이어티는 핵산 분자의 5'- 말단 위로 구축된다.
특히, 핵산 분자 Z 는 하나 이상의 잠금 (locked) 핵산 뉴클레오시드를 함유할 수 있다.
특히, 핵산 분자는 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결을 함유할 수 있다. 바람직하게는, DNA 및 RNA 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자에서 모든 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 유사체는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결되어 있다. 바람직한 구현예에서 PO 링커는 핵산 및 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티 사이에 위치해 있다. 대안적으로 기타 링커는 핵산 및 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티 사이에 위치할 수 있다.
일반식 (III) 에서 변수 T 는 일반식 (IV) 로 표시된다. 일반식 (IV) 는 GalNAc 클러스터 핵산 컨쥬게이트의 분지 영역을 보여준다. R2 가 H 일 때, 분지 분자는 더블러이며, 즉 합성 동안, 2 개의 GalNAc 포스포라미다이트가 분지 분자의 반응성 말단에 첨가된다. R2 가 -(CH2)q-R1 일 때, 분지 분자는 트레블러이며, 즉 합성 동안, 3 개의 GalNAc 포스포라미다이트가 분지 분자의 반응성 말단에 첨가된다.
대안적으로, 일반식 (III) 에서 변수 T 는 일반식 (VI) 로 표시된다. 이는 일가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트를 초래할 것이며 화학식 (VI) 에서 W 또는 G 는 핵산 또는 링커 (예를 들어 PO 링커) 에 컨쥬게이트되어 있다. 바람직한 구현예에서 화학식 (III) 에서 T 가 화학식 (VI) 로 표시될 때 s 는 0 이다.
화학식 (III) 에서 이차 아미노 기 -NR'R" 의 R' 및 R" 는 C1-C6 알킬로부터 선택되거나 또는 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고 이는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성하고, 여기에서 구체적 C1-C6 알킬 기 및 고리는 화학식 (I) 에 관해 위에 정의된 것들로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R' 는 R" 와 동일하고, -NR'R" 는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디이소프로필아미노, 및 디부틸아미노로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 R' 및 R" 는 각각 이소프로필이다.
기타 구현예에서, R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하며 이는 화학식 (I) 에 관해 위에 제시된 바와 같다. 특히, 고리는 피롤리디노, 피페리디노, 2,6-디메틸피페리디노, 모르폴리노, 이미다졸릴 및 4-메틸이미다졸릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
화학식 (III) 에서 변수 T 는 일반식 (IV) 로 표시되고, 이는, R1, R3 및, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 를 통해, 화학식 (V) 를 언급하고, 이는 결국, G 를 통해, 화학식 (II)' 를 언급한다. 화학식 (IV), (V) 및 (II)' 에 존재하는 변수는 다음과 같이 추가로 정의된다.
화학식 (IV) 에서 변수 m 은 1 내지 3 의 정수이고, 즉 그것은 1, 2 또는 3, 바람직하게는 2 또는 3 을 나타낸다.
화학식 (IV) 에서 변수 n 은 0 내지 5 의 정수이고, 즉 그것은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, n 은 0 이다.
화학식 (IV) 에서 변수 p 는 0 내지 3 의 정수이며, 즉 그것은 0, 1, 2 또는 3, 바람직하게는 0 또는 1 을 나타낸다. 특정 바람직한 구현예에서, p 는 1 이다. 기타 바람직한 구현예에서, p 는 0 이다.
화학식 (IV) 에서 변수 q 는, 각각의 존재에서 독립적으로, 1 내지 2 의 정수이며, 즉 그것은 1, 또는 2 을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, q 는 각각의 존재에서 동일한 정수이다. 특히 바람직한 구현예에서, q 는 각각의 존재에서 1 이다.
본 발명의 특정 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고 q 는 1 이고; 기타 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 0 이고 q 는 1 이고; 기타 구현예에서, n 은 1, m 은 1, 2 또는 3, 바람직하게는 3 이고, p 는 1 이고 q 는 1 이다.
본 발명의 목적을 위해, 클러스터에서 2 또는 3 개의 GalNAc 모이어티의 위상적 위치결정은 기능에 중요할 것으로 예상된다. 예를 들어, 이러한 위치결정은 본원에 기재된 신규한 화합물의 하나의 예시적 응용인 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합하는 그것의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, GalNAc-클러스터의 백본이 특정 길이를 초과하지 않는 것이 중요하다. 용어 "백본" 에 의해, 원자의 연속 사슬이 의미된다. 예를 들어, 에탄의 백본은 C-C (2 개 원자의 연속 사슬) 이고, 디에틸에테르의 백본은 C-C-O-C-C (5 개 원자의 연속 사슬) 이다. 일반식 (III) 의 화합물에 관해, R1 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는, 또는 R3 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는, 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 30 개 원자의 최대 길이를 갖는다고 정의된다.
개별 연속 사슬은 그들의 길이에서 다를 수 있으나, 이들 연속 사슬 중 단 하나도 30 개 원자보다 길지 않다고 이해될 것이다. 예를 들어, 연속 사슬의 각각의 길이는 독립적으로 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 또는 30 개 원자의 길이일 수 있다. 특정 구현예에서, R1, R3, 및, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 각각은 동일한 길이를 갖는다. 기타 구현예에서 R1, R3, 및, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 각각은 상이한 길이를 가지며, 예를 들어, 3 개의 연속 사슬의 각각은 서로 독립적인 16 개 원자 또는 22 개 원자의 길이를 가질 수 있다.
원자의 수에 의해 길이를 정의하는 것에 대한 대안으로서, 백본의 길이는 또한 길이의 단위, 예를 들어 옹스트롬 (Ångstrom) (1 Å=10-10 미터) 에 의해 정의될 수 있다. 일반식 (III) 의 화합물에 관하여, R1 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는, 또는 R3 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는, 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 10 내지 25 Å, 더욱 바람직하게는 12 내지 22 Å, 가장 바람직하게는 14 내지 20 Å 인 것으로 정의된다. 하나의 구현예에서 R1 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 14 내지 20 Å, 더욱 바람직하게는 16 내지 18 Å 이고, R3 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 각각은 10 내지 18 Å, 더욱 바람직하게는 14 내지 16 Å 이고, R1, R3, 및, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 16 내지 25 Å, 더욱 바람직하게는 18 내지 20 Å 의 동일한 길이를 갖는다.
"부착점" 은 화학식 (IV) 에 존재하는 분지의 각각에서 분지점 탄소 원자에 직접 결합된 -(CH2)q- 에서의 -CH2-기의 탄소 원자이다.
특정 바람직한 구현예에서, GalNAc 포스포라미다이트가 직접 커플링을 통해 트레블러 위로 부착되어 있는 경우에, 링커 기 L 의 백본의 길이는 대략 8 개 원자, 즉 6, 7, 8, 9 또는 10 개 원자이다.
특정 구현예에서, R1, R3 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 길이는 주로 적당한 링커 기 L 를 선택함으로써 조정된다. 이들 구현예에서, 화학식 (V) 에서 변수 s 는 0 이다.
그러나, 본 발명의 기타 구현예에 따르면, GalNAc 포스포라미다이트에서 짧은 링커를 사용하여, 그것을 스페이서 포스포라미다이트와 조합하여 유사한 구축물이 조립될 수 있다. 이는 상이한 링커를 갖는 별개의 GalNAc 포스포라미다이트를 만들 필요 없이 브랜처 (또는 브랜처가 존재하지 않는 경우에 핵산) 및 GalNAc 모이어티 사이의 링커의 길이를 다르게 하는 편리한 방식이다. 이들 구현예에서, 화학식 (V) 에서 변수 s 는 1 이다.
특정 바람직한 구현예에서, R1, R3 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서 분지점 탄소 원자로 끝나는 연속 사슬
은 9 내지 23 개 원자의 길이를 갖는다. 추가의 바람직한 구현예에서, R1, R3 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서 분지점 탄소 원자로 끝나는 연속 사슬은 9 내지 21 원자, 예컨대 12 내지 18 개 원자, 예를 들어 16 개 원자의 길이를 갖는다. "분지점 탄소 원자" 는 -(CH2)q-R1, -(CH2)q-R3 및 R2 가 결합되어 있는 탄소 원자이다 (도 1 참조).
화학식 (V) 또는 (VI) 에서 s 가 1 인 구현예에서, 화학식 (V) 에서 변수 W 는 -(CH2)2-15-, 즉 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -(CH2)13-, -(CH2)14-, -(CH2)15-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-, 즉 -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)3OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, W 는 -(CH2)8- 또는 CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서 W 는 -(CH2)5- 또는 -CH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서 W 는 -(CH2)2- 또는 -CH2CH2CH2 이다.
화학식 (V) 에서 변수 r 은, 각각의 존재에서 독립적으로, 1 내지 5 의 정수이며, 즉 그것은 1, 2, 3, 4 또는 5 을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, r 은 각각의 존재에서 동일한 정수이다. 특히 바람직한 구현예에서, r 은 각각의 존재에서 3 이다. 기타 바람직한 구현예에서, r 은 각각의 존재에서 4 이다.
화학식 (V) 에서 변수 V 는, 각각의 존재에서 독립적으로, -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택된다. 특정 바람직한 구현예에서, V 는 각각의 존재에서 -NH-CO- 이다. 기타 바람직한 구현예에서, V 는 각각의 존재에서 -O- 이다.
화학식 (V) 에서 변수 Y 는, 각각의 존재에서 독립적으로, O 및 S 로부터 선택된다. 특정 바람직한 구현예에서, Y 는 각각의 존재에서 O 이다.
화학식 (III), (V) 및 (VI) 에서 변수 X1 및 X2 는, 각각의 존재에서 독립적으로, 다수의 상이한 조합으로부터 선택된다:
일부 구현예에서 X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 이고;
기타 구현예에서, X1 은 -OH 이고 X2 는 =S 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 O- 이고 X2 는 =O 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 O- 이고 X2 는 =S 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -SH 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -OR 이며, 여기에서 R 은 C1-C6 알킬 기, 바람직하게는 메틸 또는 에틸이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -NHR 이며, 여기에서 R 은 C1-C6 알킬 기, 바람직하게는 메틸 또는 에틸이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -BH3 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =S 이고 X2 는 -SH 이다.
바람직한 구현예에서, 화학식 (III), (V) 및 (VI) 에서 변수 X1 및 X2 는, 각각의 존재에서 독립적으로, 하기 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 임;
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 임;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =S 임;
X1 은 O- 이고 X2 는 =S 임; 및
X1 은 =S 이고 X2 는 -SH 임.
특정 바람직한 구현예에서, Y, X1 및 X2 는, 화학식 (V) 에서 기 -O-P(X1X2)-Y- 가, 각각의 존재에서 독립적으로, 포스포디에스테르 기 (X1= -OH 또는 -O-, X2 = =O, Y = O), 메틸 포스포네이트 기 (X1= =O, X2 = -CH3, Y = O), 포스포로티오에이트 기 (X1= -OH, X2 = =S, Y = O), 포스포로디티오에이트 기 (X1= =S, X2 = -SH, Y = O), 알킬포스포트리에스테르 기 (X1= =O, X2 = -OC1-C6-알킬, Y = O), 메틸포스포노티오에이트 기 (X1= =S, X2 = -CH3, Y = O), 알킬포스포라미다이트 기 (X1= =O, X2 = -NHC1-C6-알킬, Y = O), 또는 보라노포스페이트 기 (X1= =O, X2 = -BH3, Y = O) 를 나타내도록 선택된다.
추가의 바람직한 구현예에서, Y, X1 및 X2 는, 화학식 (V) 에서 기 -O-P(X1X2)-Y- 가, 각각의 존재에서 독립적으로, 포스포디에스테르 기, 포스포로티오에이트 기 또는 포스포로디티오에이트 기를 나타내도록 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서, Y, X1 및 X2 는, 화학식 (V) 에서 기 -O-P(X1X2)-Y- 가, 각각의 존재에서 독립적으로, 포스포디에스테르 기 또는 포스포로티오에이트 기를 나타내도록 선택된다.
일부 구현예에서, Y, X1 및 X2 는, 그들이 각각의 존재에서 동일한 기, 바람직하게는 포스포디에스테르 기 또는 포스포로티오에이트 기를 나타내도록 선택된다.
화학식 (V) 또는 (VI) 에서 변수 G 는 화학식 (II)' 로 표시된다. 화학식 (II)' 에서, A1 은 보호기이며, 이 보호기는 그것이 노출될 반응 조건, 예컨대 포스포라미다이트의 제조 방법, 및 클러스터 및 올리고뉴클레오티드 합성 과정의 커플링 및 산화 단계에서 사용되는 조건에 대해 그것이 안정적이도록 선택된다. 화학식 (II)' 에 따른 적합한 히드록실 보호기 A1 의 예로서, 아실 기 및 실릴 기가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 보호기 A1 은 아세틸, 벤조일, 페녹시-아세틸, 피발로일, 디메톡시트리틸 (DMT), 이소부티릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 및 이소프로필디메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 A1 은 아세틸이다. 일부 구현예에서, 디메톡시트리틸 (DMT) 이 당의 위치 6 에서 보호기 A1 로서 사용된다. 이러한 위치에서 DMT 을 사용하는 것의 이점은 그것이 정제 동안 실패 서열 (예를 들어 예를 들어 합성에서의 실패가 첨가되지 않는 GalNAc 모이어티를 초래한 비-완전 구축물) 의 용이한 분리를 허용하는 점이다.
화학식 (II)' 에서 링커 기 L 은 GalNAc 핵산 컨쥬게이트의 요망되는 응용에 따라 선택된다. 일부 구현예에서, 사슬에서의 탄소 원자 중 하나 이상은 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH- 및/또는 헤테로원자, 특히 O 로 대체될 수 있다. 링커의 총 길이가 대체 후에 30 개 원자를 초과하지 않고 -NH-CO-, -CO-NH 의 경우에 대체에 대한 적어도 하나의 이웃 원자를 탄소 원자로서 및 헤테로원자 대체의 경우에 적어도 2 개의 이웃 탄소 원자를 유지하도록 대체의 수를 적합화할 것이다. 일부 구현예에서 대체의 수는 5 미만이고 대체에 대한 이웃 원자는 탄소 원자이다. 일부 구현예에서 1 또는 2 개 이하의 대체가 사슬에서 실시되고 대체에 대한 이웃 원자는 탄소 원자이다. 예를 들어, GalNAc 및 포스포라미다이트 사이의 링커는 단순 디올로부터 유래할 수 있다. 원칙적으로, 임의의 대칭적 또는 비대칭적 디올이 링커로서 본 발명의 GalNAc 포스포라미다이트에서 사용될 수 있을 것이며, 다만 그것은 기타 친핵성 기를 함유하지 않을 것이다. 일부 구현예에서, -(OCH2CH2)-기의 배열을 형성하기 위해서 사슬에서의 탄소 원자는 산소 원자로 대체된다.
특정 구현예에서, L 은 C2-C20-알킬렌, C2-C20-알케닐렌, 및 -CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2-, CH2CH2-(OCH2CH2)0-3-OCH2CH2-, 및 CH2CH2-(OCH2CH2)0-4-OCH2CH2 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 구체적으로 알킬렌은 C3-C19-알킬렌 (C6 알킬렌은 아님) 으로부터 또는 C7-C19-알킬렌으로부터 선택된다. 더욱 구체적으로, 링커 기 L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 이다. 기타 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -(CH2)8- 또는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -(CH2)5 또는 -CH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 또는 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 이다.
특정 구현예에서 본 발명에 따른, 더블러 또는 트레블러는 비대칭적이며, 즉 화학식 (IV) 및 (V) 에서 변수 q, r, s, X1 및 X2 중 적어도 하나는 그것의 제 1 존재에서 (예를 들어 R1 에서) 하나의 특정 의미 및 제 2 및/또는 추가의 존재(들)에서 (예를 들어 R3 및/또는 R2 에서) 상이한 특정 의미를 갖는다. 일부 구현예에서, 비대칭성은 특히 R1, R3 및 임의로 R2 에 의해 정의되는 분지의 길이를, 변수 q, r 및 s 중 적어도 하나가 그것의 제 1 존재에서 그것의 제 2 및/또는 제 3 존재와 비교할 때 상이한 값을 갖는다는 것을 의미한다고 여긴다.
바람직한 구현예에서, 더블러 또는 트레블러는 적어도 R1, R3 및 임의로 R2 에 의해 정의되는 분지의 길이에 관해 대칭적이며, 즉 변수 q, r 및 s 는 각각의 존재에서 동일한 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 부가적으로 변수 X1 및 X2 및/또는 A1 은 각각의 존재에서 동일한 기를 나타낸다.
화학식 (III) 에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 특정 구체적 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 0 이고, R2 는 H 이고, q 는 1 이고, V 는 -NH-CO- 이고, r 은 4 이다. 기타 구체적 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이다. 기타 구체적 구현예에서, n 은 1, m 은 3 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이다.
더더욱 구체적으로, 화학식 (III) 에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 일부 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 =O 이고, X2 는 -SH 이고, W 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
화학식 (III) 에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 이고, X2 는 =S 이고, W 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
화학식 (III) 에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 이고, X2 는 =S 이고, W 는 -CH2CH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
화학식 (III) 에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 =O 이고, X2 는 -SH 이고, W 는 -CH2CH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
화학식 (III) 에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 =O 이고, X2 는 -SH 이고, W 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
화학식 (III) 에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 이고, X2 는 =S 이고, W 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
화학식 (III) 에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 또는 =O 이고, X2 는 =S 또는 -SH 이고, W 는 -CH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 0 이고, X1 은 -O- 이고, X2 는 =S 이고, Y 는 O 이고, L 은 -(CH2)8- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 0 이고, X1 은 =O 이고, X2 는 SH 이고, Y 는 O 이고, L 은 -(CH2)8- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 0 이고, X1 은 -O- 이고, X2 는 =S 이고, Y 는 O 이고, L 은 CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 0 이고, X1 은 =O 이고, X2 는 -SH 이고, Y 는 O 이고, L 은 CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 이고, X2 는 =S 이고, W 는 -CH2CH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 =O 이고, X2 는 -SH 이고, W 는 -CH2CH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 이고, X2 는 =S 이고, W 는 -CH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 =O 이고, X2 는 -SH 이고, W 는 -CH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 =O 이고, X2 는 -SH 이고, W 는 -CH2CH2OCH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 이고, X2 는 =S 이고, W 는 -CH2CH2OCH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -(CH2)q-R1 이고, q 는 1 이고, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 또는 =O 이고, X2 는 =S 또는 -SH 이고, W 는 -CH2CH2CH2- 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2OCH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
기타 바람직한 구현예에서, n 은 0 이고, p 는 1 이고, R2 는 -H 이고, q 는 0, V 는 -O- 이고, r 은 3 이고, s 는 1 이고, X1 은 -O- 또는 =O 이고, X2 는 =S 또는 -SH 이고, Y 는 O 이고, L 은 -CH2CH2OCH2CH2- 이고, A1 은 아세틸이다.
위에 제시된 모든 바람직한 구현예에서 화학식 (III) 의 X1 및 X2 는 화학식 (V) 및 (VI) 에서의 X1 및 X2 와 독립적으로 선택될 수 있다. 바람직하게는 위에 제시된 바람직한 구현예에서 화학식 (III) 의 X1 및 X2 는 X1 은 -S- 또는 -O- 또는 =O 이고 X2 는 =O 또는 =S 또는 -OH 또는 -SH 이다.
GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 예시적 구현예가 도 6 에서 화학식 (A) - (N) 에 의해 나타나 있다.
화학식 (A)-(N) 에서 용어 올리고뉴클레오티드는 핵산의 넓은 맥락에서 이해될 것이다.
본 발명에 따른 GalNAc 클러스터 핵산 컨쥬게이트는 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 대한 결합에 관해 특이적으로 디자인될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 일가, 이가 또는, 바람직하게는, 삼가 GalNAc 핵산 컨쥬게이트는 ASGPR 에 대한 강한 친화성을 갖는다. 본 발명에 관하여 "강한 친화성" 은 50 nM 미만, 바람직하게는 25 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 5 nM 이하의 IC50 값에 의해 특징지어지는 친화성을 의미한다.
특히 바람직한 구현예에서, 일가 GalNAc 클러스터를 갖는 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 ASGPR 에 관한 IC50 은 50 nM, 바람직하게는 25 nM 이하, 더욱 바람직하게는 15 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 5 nM 이하이다.
특히 바람직한 구현예에서, 이가 GalNAc 클러스터를 갖는 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 ASGPR 에 관한 IC50 은 50 nM, 바람직하게는 25 nM 이하, 더욱 바람직하게는 15 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 5 nM 이하이다.
추가의 특히 바람직한 구현예에서, 삼가 GalNAc 포스포라미다이트 클러스터를 갖는 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 ASGPR 에 관한 IC50 은 25 nM 이하, 바람직하게는 15 nM 이하, 더욱 바람직하게는 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 5 nM 이하, 더욱 바람직하게는 1 nM 내지 5 nM, 예를 들어 약 3 nM 이다. IC50 은 ASPGR 에 대한 라벨링된 리간드 결합을 50% 만큼 저해하는 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 농도이다. IC50 은 Rensen et al 2001 Journal of Biological Chemistry Vol 276 pp 37577 에 기재된 방법에 의해 확인될 수 있다. 간략히 간세포 (일차 또는 배양물 중) 는 하나의 농도 (예를 들어 5 nM) 의 리간드 125I-라벨링된 아시알릴화된 오로소뮤코이드 (ASOR) 와 함께 2h 동안 4 ℃ 에서 증가하는 양의 연구될 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 존재 하에 인큐베이션된다. 일가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 경우에 농도는 2 내지 200 mM 일 수 있고; 이가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 경우에 농도는 1 내지 1000 nM 일 수 있고; 삼가 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 경우에 농도는 0.2 내지 200 nM 일 수 있다 (증가하는 농도에서). 연구될 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 존재 하에 라벨링된 ASOR 의 결합이 뒤따른다. 비특이적 결합은 100 mM GalNAc 의 존재 하에 확인될 수 있다. 변위 (displacement) 결합 데이타는 단일 자리 결합 모델을 사용하여 분석될 수 있고 IC50 은 계산된다.
GalNAc 포스포라미다이트의 제조
추가의 양상에서, 본 발명은 GalNAc 포스포라미다이트의 제조 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 화학식 (I) 의 화합물의 제조 방법을 제공한다:
(i) N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 의 탄소 원자 1 및 2 사이에 내부 옥사졸린 고리를 입체선택적으로 형성하는 단계;
(ii) 단계 (i) 의 산물을 일반식 HO-L-O-A3 을 갖는 화합물과 반응시키는 단계로서, 식에서
A3 은 적합한 보호기이고
L 은 2-30 개 탄소 원자의 사슬 길이를 갖는 링커 기이며, 여기에서 사슬에서의 탄소 원자 중 하나 이상은 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH- 및/또는 헤테로원자, 특히 O 로 대체될 수 있고,
여기에서 L 은 바람직하게는
-(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되며,
그에 의해 GalNAc 고리의 탄소 원자 1 에서 에테르 결합을 형성하는 단계;
(iii) 단계 (ii) 의 산물에서 -O-A3 기를 탈보호하여, 그에 의해 탈보호된 -OH 기를 제공하는 단계,
(iv) 단계 (iii) 의 산물을 포스포르디아미다이트, 또는 클로로포스포라미다이트와 반응시켜 그에 의해 화학식 (I) 에 따른 화합물을 제공하는 단계.
보호기 A3 은 일반식 HO-L-OH 의 디올의 히드록시 기 중 하나를 보호하는데 적합해야 한다. 그러한 보호기는 유기 합성 분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 아실 기 및 실릴 기가 사용될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 보호기 A3 은 아세틸, 벤조일, 페녹시-아세틸, 피발로일, 이소부티릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 및 이소프로필디메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서 A3 은 t-부틸디페닐실릴 기이다.
HO-L-O-A3 에서 링커 기 L 은 GalNAc 포스포라미다이트의 요망되는 응용에 따라 선택된다. 일부 구현예에서, 사슬에서의 탄소 원자 중 하나 이상은 각각 독립적으로 -NH-CO-, -CO-NH- 및/또는 헤테로원자, 특히 O 로 대체될 수 있다. 링커의 총 길이가 대체 후에 30 개 원자를 초과하지 않고 -NH-CO-, -CO-NH 의 경우에 대체에 대한 적어도 하나의 이웃 원자를 탄소 원자로서 및 헤테로원자 대체의 경우에 적어도 2 개의 이웃 탄소 원자를 유지하도록 대체의 수를 적합화할 것이다. 일부 구현예에서 대체의 수는 5 미만이고 대체에 대한 이웃 원자는 탄소 원자이다. 일부 구현예에서 1 또는 2 개 이하의 대체가 사슬에서 실시되고 대체에 대한 이웃 원자는 탄소 원자이다.
특정 구현예에서, L 은 C2-C30-알킬렌, C2-C30-알케닐렌, 및 -CH2CH2-(OCH2CH2)0-8-OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 더욱 구체적으로, 링커 기 L 은 C2-C20-알킬렌, C2-C20-알케닐렌, 및 -CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2- 로부터 선택될 수 있다. 더더욱 구체적으로, 링커 기 L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 이다. 기타 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -(CH2)8- 또는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 링커 L -CH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 링커 L 은 -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 또는 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 이다.
유기 합성 분야에서의 통상의 기술자는 보호된 히드록시 기의 탈보호에 관한 여러 표준 프로토콜을 알고 있다. 사용되는 보호 기에 따라, 탈보호는 예를 들어 약산 또는 약염기 또는 촉매 등을 첨가함으로써 수행될 수 있다.
GalNAc 핵산 컨쥬게이트의 제조
추가의 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 GalNAc 포스포라미다이트를 사용하는 핵산 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다:
(i) 핵산 분자를 고체 지지체 위에 제공하는 단계;
(ii) 임의로 브랜처 분자를 핵산 분자에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하는 단계;
(iii) 임의로 스페이서 포스포라미다이트 분자를 브랜처 분자의 분지의 각각에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하는 단계;
(iv) 브랜처 분자가 존재하지 않는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물을 핵산 분자의 반응성 말단과 반응시키거나, 또는, 브랜처 분자가 존재하고 스페이서가 존재하지 않는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물을 분지의 각각의 반응성 말단과 반응시키거나, 또는, 스페이서가 존재하는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물을 스페이서의 각각의 반응성 말단과 반응시키는 단계; 및
(v) 단계 (iv) 의 산물을 고체 지지체로부터 절단하는 단계;
여기에서 화학식 (I) 에 따른 화합물에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 컨쥬게이트 모이어티를 핵산에 연결하는 인 원자로 끝나는 연속 사슬은 10 개 원자의 최소 길이 및 34 개 원자의 최대 길이를 갖는다.
더욱 특히, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 핵산 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다:
(i) 핵산 분자를 고체 지지체 위에 제공하는 단계;
(ii) 임의로 브랜처 분자를 핵산 분자에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하며, 여기에서 부가 후에 상기 브랜처 분자는 바람직하게는 일반식 (IV a) 로 표시되는 구조를 초래하는 단계
식에서
A4 는 적합한 보호기이고;
V1 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V2 는 부재하거나 또는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V3 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고;
m 은 1 내지 3 의 정수이고;
n 은 0 내지 5 의 정수이고;
p 는 0 내지 3 의 정수이고; 각각의 존재에서 독립적으로
q 는 1 내지 2 의 정수이고;
q' 는 0 내지 2 의 정수이고;
r 은 1 내지 5 의 정수이고;
단, V2 가 부재할 때, q' 는 0 이고 화학식 (IV a) 에서 V2 에 부착된 -(CH2)r-OA4 는 또한 부재하고;
(iii) 임의로 스페이서 포스포라미다이트 분자를 브랜처 분자의 분지의 각각에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하며, 부가 후에 상기 스페이서 분자는 바람직하게는 일반식 (V a) 로 표시되는 구조를 초래하는 단계
식에서 각각의 존재에서 독립적으로
A5 는 적합한 보호기이고;
W 는 -(CH2)2-15- 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택됨;
(iv) 브랜처 분자가 존재하지 않는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물을 핵산 분자의 반응성 말단과 반응시키거나, 또는, 브랜처 분자가 존재하고 스페이서 분자가 존재하지 않는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물을 분지의 각각의 반응성 말단과 반응시키거나, 또는, 스페이서가 존재하는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물을 스페이서의 각각의 반응성 말단과 반응시키는 단계; 및
(v) 단계 (iv) 의 산물을 고체 지지체로부터 절단하는 단계;
여기에서 화학식 (I) 에 따른 화합물에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IVa) 에서의 부착점 또는 핵산 분자에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐.
더욱 특히, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 핵산 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다:
(i) 핵산 분자를 고체 지지체 위에 제공하는 단계;
(ii) 브랜처 분자를 핵산 분자에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하며, 여기에서 부가 후에 상기 브랜처 분자는 바람직하게는 일반식 (IV a) 로 표시되는 구조를 초래하는 단계
식에서
A4 는 적합한 보호기이고;
V1 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V2 는 부재하거나 또는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V3 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고;
m 은 1 내지 3 의 정수이고;
n 은 0 내지 5 의 정수이고;
p 는 0 내지 3 의 정수이고; 각각의 존재에서 독립적으로
q 는 1 내지 2 의 정수이고;
q' 는 0 내지 2 의 정수이고;
r 은 1 내지 5 의 정수이고;
단, V2 가 부재할 때, q' 는 0 이고 화학식 (IV a) 에서 V2 에 부착된 -(CH2)r-OA4 는 또한 부재함;
(iii) 화학식 (I) 에 따른 화합물을 분지의 각각의 반응성 말단과 반응시키는 단계; 및
(v) 단계 (iv) 의 산물을 고체 지지체로부터 절단하는 단계;
여기에서 화학식 (I) 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IVa) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐.
바람직한 구현예에서 화학식 (I) 에서 링커 L 은, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2 로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
더욱 특히 GalNAc-핵산 컨쥬게이트에서 컨쥬게이트 모이어티가 브랜처 및 화학식 (I) 에 따른 화합물로부터, 즉 스페이서 없이 생산되는 경우에, 그 때 q 는 1 이고; q' 는 1 이고; r 은 3 이고 L 은 -(CH2)8- 또는 CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 또는 -(CH2)5 또는 CH2CH2OCH2CH2- 이다.
더욱 특히 GalNAc-핵산 컨쥬게이트에서 컨쥬게이트 모이어티가 더블러 및 화학식 (I) 에 따른 화합물로부터, 즉 스페이서 없이 생산되는 경우에, 그 때 q 는 1 이고; q' 는 1 이고; r 은 3 이고 L 은 -(CH2)5- 또는 CH2CH2OCH2CH2- 이다.
더욱 특히 GalNAc-핵산 컨쥬게이트에서 컨쥬게이트 모이어티가 트레블러 및 화학식 (I) 에 따른 화합물로부터, 즉 스페이서 없이 생산되는 경우에, 그 때 q 는 1 이고; q' 는 1 이고; r 은 3 이고 L 은 -(CH2)8- 또는 CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이다.
대안적으로, 방법은 브랜처, 스페이서, 및 화학식 (I) 의 화합물에 적용된다. 더욱 특히, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 핵산 컨쥬게이트의 제조 방법을 제공한다:
(i) 핵산 분자를 고체 지지체 위에 제공하는 단계;
(ii) 브랜처 분자를 핵산 분자에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하며, 여기에서 부가 후에 상기 브랜처 분자는 바람직하게는 일반식 (IV a) 로 표시되는 구조를 초래하는 단계
식에서
A4 는 적합한 보호기이고;
V1 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V2 는 부재하거나 또는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V3 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고;
m 은 1 내지 3 의 정수이고;
n 은 0 내지 5 의 정수이고;
p 는 0 내지 3 의 정수이고; 각각의 존재에서 독립적으로
q 는 1 내지 2 의 정수이고;
q' 는 0 내지 2 의 정수이고;
r 은 1 내지 5 의 정수이고;
단, V2 가 부재할 때, q' 는 0 이고 화학식 (IV a) 에서 V2 에 부착된 -(CH2)r-OA4 는 또한 부재하고;
(iii) 스페이서 포스포라미다이트 분자를 브랜처 분자의 분지의 각각에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하며, 여기에서 부가 후에 상기 스페이서 분자는 바람직하게는 일반식 (V a) 로 표시되는 구조를 초래하는 단계
식에서 각각의 존재에서 독립적으로
A5 는 적합한 보호기이고;
W 는 -(CH2)2-15- 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택됨;
(iv) 화학식 (I) 에 따른 화합물을 스페이서의 각각의 반응성 말단과 반응시키는 단계; 및
(v) 단계 (iv) 의 산물을 고체 지지체로부터 절단하는 단계;
여기에서 화학식 (I) 에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IVa) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐.
더욱 특히 핵산 컨쥬게이트에서 컨쥬게이트 부분이 q 는 1 이고; q' 는 1 이고; r 은 3 인 브랜처로부터 생산되는 경우에, 스페이서에서 W 는 -(CH2)2-5- 또는 -CH2CH2OCH2CH2- 또는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 로부터 선택되고 화학식 (I) 에 따른 화합물에서 L 은 -(CH2)2-5- 또는 CH2CH2OCH2CH2- 이다. 바람직한 구현예에서 W 는 -(CH2)3 이고 L 은 CH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서 W 는 -(CH2)3 또는 -(CH2)2 이고 L 은 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서 W 는 CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2 이고 L 은 -(CH2)3- 또는 -(CH2)2 이다. 또다른 바람직한 구현예에서 W 는 -(CH2)3- 이고 L 은 -(CH2)2 이다.
GalNAc 핵산 컨쥬게이트의 생성에서 사용되는 핵산 분자는 아래에서 더욱 심도 있게 기재될 것이다. 일반적으로 핵산 분자는 DNA, RNA 일 수 있거나 또는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 둘다를 포함하거나 또는 완전히 뉴클레오티드 유사체로 이루어지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. GalNAc 컨쥬게이트 모이어티는 핵산의 5'- 또는 3'-말단 위로 구축될 수 있다. 바람직하게는, GalNAc 컨쥬게이트 모이어티는 핵산 분자의 5'- 말단 위로 구축된다. 일부 구현예에서 PO 링커는 핵산 및 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티 사이에 위치해 있다.
특히, 핵산 분자는 하나 이상의 잠금 핵산 뉴클레오시드를 함유할 수 있다.
특히, 핵산 분자는 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결을 함유할 수 있다. 바람직하게는, DNA 및 RNA 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결되어 있다. 더욱 바람직하게는 핵산 분자에서 모든 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 유사체는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 고체 지지체 위에서의 순차적 합성의 일부로서, 핵산 분자, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 직접, 본 발명의 화학식 (I) 에 따른 GalNAc 포스포라미다이트를 포스포라미다이트 화학을 사용하여 커플링함으로써 GalNAc-핵산 컨쥬게이트가 만들어 질 수 있다. 이들 구현예에서, 브랜처 또는 스페이서 분자가 핵산 분자에 부가되지 않는다.
"포스포라미다이트 화학" 에 의해, 적어도 하기 단계를 수반하는 일련의 반응이 의미된다:
(a) 보호된 히드록시 기, 예를 들어 뉴클레오시드, 또는 링커 모이어티의 5'-OH 기를 탈보호하거나 또는 화학식 (IV a) 및 (V a) 에서의 A4-O 또는 A5-O 에서의 옥시 기를 탈보호하는 단계;
(b) 포스포라미다이트-함유 화합물, 예를 들어 본 발명에 따른 GalNAc 아미다이트 또는 브랜처 분자 또는 스페이서 분자를, 미보호된 히드록시 기 (이는 또한 각각의 분자의 "반응성 말단" 으로 언급될 수 있다) 에 커플링하는 단계, 및
(c) 중간체의 산화 단계.
따라서, GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조 방법의 단계 (ii), (iii) 및 (iv) 를 수행할 때, 각각, 핵산 (단계 (ii)), 브랜처 분자 (단계 (iii); 예를 들어 A4O-), 및 스페이서 분자(들) (단계 (iv); 예를 들어 A5O-) 의 보호된 히드록시 기 또는 히드록시 기는, 추가로 반응되기 전에, 즉 단계 (ii) 에서 브랜처 분자가 부가되거나, 단계 (iii) 에서 스페이서 분자가 부가되거나 또는 화학식 (I) 에 따른 화합물 또는 화학식 (III) 이 부가되기 전에 탈보호된다.
적합한 탈보호 반응은 유기 합성 분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있다.
GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조 방법의 일부 구현예에서, 브랜처 분자는 핵산 분자에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가된다. 부가 후에, 브랜처 분자는 바람직하게는 일반식 (IV a) 로 표시된다
화학식 (IV a) 내에서, A4 는 적합한 보호기이다. 그러한 보호기는 유기 합성 분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들어, 자유 OH 기와 함께 에테르를 형성하는 기가 언급될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 보호기 A4 는 디메톡시트리틸 (DMT) 이다.
화학식 (IV a) 에서 변수 V1 및 V3 은 독립적으로 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택된다; 특정 구현예에서, 그들은 둘다 -O- 이다; 기타 구현예에서, 그들은 둘다 -NH-CO- 이다.
화학식 (IV a) 에서 변수 V2 는 부재하거나 또는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택된다. V2 가 부재할 때, q' 는 0 이고 화학식 (IV a) 에서 V2 에 부착된 -(CH2)r-OA4 는 또한 부재한다. 특정 구현예에서, V2 는 -O- 이고; 기타 구현예에서, V2 는 -NH-CO- 이다.
특정 구체적 구현예에서, V1, V2 및 V3 의 모두는 -O- 이다.
화학식 (IV a) 에서 변수 X1 및 X2 는 하기 다수의 상이한 조합으로부터 선택된다:
일부 구현예에서 X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 이고;
기타 구현예에서, X1 은 -OH 이고 X2 는 =S 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 O- 이고 X2 는 =O 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 O- 이고 X2 는 =S 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -SH 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -OR 이며, 여기에서 R 은 C1-C6 알킬 기, 바람직하게는 메틸 또는 에틸이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -NHR 이며, 여기에서 R 은 C1-C6 알킬 기, 바람직하게는 메틸 또는 에틸이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =O 이고 X2 는 -BH3 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 이고;
추가의 구현예에서, X1 은 =S 이고 X2 는 -SH 이다.
바람직한 구현예에서, 화학식 (IV a) 에서 변수 X1 및 X2 는 하기 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 이고;
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 이고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =S 이고;
X1 은 O- 이고 X2 는 =S 이고; 및
X1 은 =S 이고 X2 는 -SH 이다.
특정 바람직한 구현예에서, 화학식 (IV a) 에서 기 -O-P(X1X2)- 가, 그것이 부착되어 있는 히드록시 기와 함께, 포스포디에스테르 기, 포스포로티오에이트 기 또는 포스포로디티오에이트 기를 나타내도록 X1 및 X2 가 선택된다.
변수 q' 는 0 내지 2 의 정수이고, 즉 그것은 0, 1 또는 2 을 나타낸다. 특정 바람직한 구현예에서, q' = q 이다.
화학식 (IV a) 의 변수 m, n, p, q 및 r 은 위에서 화학식 (IV) 에 관해 개시된 바와 같이 정의된다.
본 발명의 일부 바람직한 구체적 구현예에서, 브랜처 분자는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미도]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)] 포스포라미다이트 (Glen Research Catalogue Number: 10-1920-xx);
트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트 (Glen Research Catalogue Number: 10-1922-xx); 및
트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]메틸렌옥시프로필-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트.
또다른 구현예에서, 브랜처는 1-[5-(4,4'-디메톡시-트리틸옥시)펜틸아미도]-3-[5-플루오레노메톡시-카르보닐-옥시-펜틸아미도]-프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트 (Glen Research Catalogue Number: 10-1925-xx) 일 수 있다.
일부 구현예에서, 스페이서 분자는 브랜처 분자의 분지의 각각에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가된다. 부가 후에, 스페이서 분자는 바람직하게는 일반식 (V a) 로 표시된다
화학식 (V a) 내에서, A5 은 적합한 보호기이다. 그러한 보호기는 유기 합성 분야에서 통상의 기술자에게 알려져 있다.
보호기 A5 는 각각의 존재에서 독립적으로 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 그러나, 동일한 보호기가 모든 스페이서에 사용된다.
예를 들어, 자유 OH 기와 함께 에테르를 형성하는 기가 적합한 보호기 A5 로서 언급될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 보호기 A5 는 디메톡시트리틸 (DMT) 이다.
화학식 (V a) 에서 변수 W 는 -(CH2)2-15-, 즉 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -(CH2)13-, -(CH2)14-, -(CH2)15-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2-, 즉 -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)3OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, W 는 -(CH2)8- 또는 CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서 W 는 -(CH2)5- 또는 -CH2CH2OCH2CH2- 이다. 또다른 바람직한 구현예에서 W 는 -(CH2)2- 또는 -CH2CH2CH2 이다.
화학식 (V a) 에서 변수 X1 및 X2 는 독립적으로 위에서 화학식 (IV a) 에서 X1 및 X2 에 관해 정의된 조합으로부터 선택된다.
특정 바람직한 구현예에서, 화학식 (V a) 에서 기 -O-P(X1X2)- 가, 그것이 부착되어 있는 히드록시 기와 함께, 포스포디에스테르 기, 포스포로티오에이트 기 또는 포스포로디티오에이트 기를 나타내도록, X1 및 X2 가 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 스페이서 포스포라미다이트 분자는 일반식 (VII) 로 표시된다
화학식 (VII) 에서 이차 아미노 기 -NR'R" 의 R' 및 R" 는 C1-C6 알킬로부터 선택되거나 또는 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고 이는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성하고, 여기에서 구체적 C1-C6 알킬 기 및 고리는 위에서 화학식 (I) 에 관해 정의된 것들로부터 선택된다. 특정 구현예에서, R' 는 R" 와 동일하고, -NR'R" 는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디이소프로필아미노, 및 디부틸아미노로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 디이소프로필아미노이다. 기타 구현예에서, 위에서 화학식 (I) 에 관해 제시된 바와 같이 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성한다. 특히, 고리는 피롤리디노, 피페리디노, 2,6-디메틸피페리디노, 모르폴리노, 이미다졸릴 및 4-메틸이미다졸릴로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
화학식 (VII) 에서 적합한 보호기 A2 는 보호된 히드록시 기 (-OH) 또는 보호된 티오 기 (-SH) 이다. 예시적 비-제한적 보호된 히드록시 기는 에테르 기이고, 예시적 비-제한적 보호된 티오 기는 티오에테르 기이다. 특히, A2 로 표시되는 보호된 -OH 또는 -SH 기는 2-시아노에톡시, 2-시아노에틸티오, 메톡시, 에톡시, S-이소부타노일-2-(2-메르캅토-에톡시)에톡시, S-피발로일-2-(2-메르캅토-에톡시)에톡시, 및 S-피발로일-2-메르캅토에톡시로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
화학식 (VII) 에서 보호기 A6 은 각각의 존재에서 독립적으로 선택될 수 있다: 바람직한 구현예에서, 그러나, 동일한 보호기가 모든 스페이서에 사용된다. 예를 들어, 자유 OH 기와 함께 에테르를 형성하는 기가 적합한 보호기 A6 로서 언급될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 보호기 A6 은 디메톡시트리틸 (DMT) 이다.
특정 바람직한 구현예에서, A2 는 -CH2CH2CN 이고, A6 은 4',4'-디메톡시트리틸이고, R4 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-, -CH2CH2CH2-, 및 -(CH2)12- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; NR'R" 는 이차 아미노 기이며, 여기에서 R' 및 R" 는 독립적으로 C1-C6-알킬로부터 선택되거나 또는 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고 이는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성한다.
바람직한 구체적 구현예에서, A2 는 -CH2CH2CN 이고, A6 은 4',4'-디메톡시트리틸이고, R4 는 -CH2CH2CH2- 이고 R' 및 R" 는 각각 이소프로필이다. 추가의 바람직한 구체적 구현예에서, A2 는 -CH2CH2CN 이고, A6 은 4',4'-디메톡시트리틸이고, R4 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2- 이고 R' 및 R" 는 각각 이소프로필이다.
위에서 이미 언급된 바와 같이, GalNAc-포스포라미다이트의 백본의 길이는 특정 길이를 초과하지 않아야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조 방법에서 사용되는 화합물에서, 브랜처 및/또는 스페이서 분자가 사용되지 않는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 컨쥬게이트 모이어티를 핵산에 연결하는 인 원자로 끝나는, 연속 사슬은 10 개 원자의 최소 길이 및 34 개 원자의 최대 길이를 갖는다고 정의된다.
유사하게, 브랜처 및/또는 스페이서 분자가 부가되는 경우에, R1, R3 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 갖는다.
개별 연속 사슬은 그들의 길이에서 다를 수 있으나, 이들 연속 사슬 중 단 하나도 34 개 원자보다 길지 않다. 예를 들어, 연속 사슬의 각각의 길이는 독립적으로 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 31, 32, 33 또는 34 개 원자의 길이일 수 있으며, 브랜처 및/또는 스페이서 분자가 사용되지 않는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 컨쥬게이트 모이어티를 핵산에 연결하는 인 원자로 끝난다. 브랜처 및/또는 스페이서 분자가 존재하지 않는 경우에, 화학식 (I) 에 따른 화합물에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하는 연속 사슬의 최대 길이는 바람직하게는 10, 12 개 원자 또는 14 개 원자이다. 바람직하게는 길이는 10 내지 34 개 원자, 더욱 바람직하게는 10 내지 30 개 원자, 더욱 바람직하게는 14 내지 26 개 원자, 더더욱 바람직하게는 16 내지 20 개 원자이다.
브랜처 및/또는 스페이서 분자가 사용되는 구현예에서, R1, R3, 및, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬의 각각은, 독립적으로 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30 개 원자의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 3 개의 연속 사슬의 각각은 14 개 원자, 16 개 원자 또는 18 개 원자의 길이를 가질 수 있다. 바람직하게는 길이는 8 내지 30 개 원자, 더욱 바람직하게는 14 내지 22 개 원자, 더더욱 바람직하게는 16 내지 20 개 원자이다.
본원에 기재된 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조 방법의 일부 구현예에서, 분지된 컨쥬게이트 모이어티는 단계 (ii) 를 통해 핵산 분자에 부가된다. 이들 구현예에서, 화학식 (I) 에 따른 화합물에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 화학식 (IV a) 에서 분지점 탄소 원자로 끝나는 연속 사슬은
바람직하게는 9 내지 23 개 원자의 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, GalNAc-핵산 컨쥬게이트는 (고체 지지체 위에 포스포라미다이트 화학을 사용하여) 핵산의 순차적 합성에 뒤이은 임의로 브랜처 및, 임의로 스페이서, 및 GalNAc 포스포라미다이트의 부가 및 지지체로부터의 절단에 의해 합성될 수 있다 (개관 도식에 대해 도 1 참조).
예시적 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 합성이 도 2 에 나타나 있다.
GalNAc 포스포라미다이트 및 그로부터 유래하는 화합물의 용도
추가의 양상에서, 본 발명은 기재된 신규한 GalNAc 포스포라미다이트의 다양한 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조를 위한 화학식 (I) 에 따른 화합물의 용도를 제공한다. 컨쥬게이트 모이어티는 일가 또는 클러스터일 수 있다. 바람직하게는 클러스터는 GalNAc 모이어티에 대해 이가 또는 삼가이다. 본 발명의 GalNAc-핵산 컨쥬게이트, 즉 브랜처 및/또는 스페이서 분자(들)을 갖는 또는 갖지 않는, 바람직하게는 브랜처 및/또는 스페이서 분자를 갖는, 화학식 (III) 에 따른 화합물은 본 발명의 GalNAc 포스포라미다이트를 사용하여 생산될 수 있다. 특히, 화학식 (I) 에 따른 화합물이 위에 기재된 GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 컨쥬게이트된 GalNAc 클러스터는 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티에 컨쥬게이트된 약물 모이어티의 약물 전달을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, GalNAc 컨쥬게이트 모이어티에 컨쥬게이트된 약물은 미컨쥬게이트된 약물 모이어티와 비교할 때 간 흡수가 개선될 수 있다. 적합한 약물은 예를 들어 세포 또는 포유류에서의 표적 유전자 또는 RNA 를 조절하는 능력이 있는 핵산, 예를 들어 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA 일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물의 의학적 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 의약을 간에, 특히 간세포에 전달하는데 사용하기 위한 화학식 (I) 에 따른 화합물의 용도를 제공한다. 추가로, 본 발명은 의약, 특히 인간 의약에서 사용하기 위한 화학식 (III) 에 따른 화합물의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명은 약제로서의 화학식 (III) 에 따른 화합물의 용도를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 GalNAc-핵산 컨쥬게이트, 예를 들어 삼가 (즉 이는 3 개의 분지가 존재하는 브랜처를 가짐) GalNAc 클러스터에 컨쥬게이트된 핵산은 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합하여, 그에 의해 본 발명의 GalNAc-핵산 화합물의 세포 흡수를 허용할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 GalNAc 핵산 컨쥬게이트, 예를 들어 LNA 함유 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트는, 간-발현되는 RNA 를 하향조절하는데 사용하기 위한 것이다. 특히 대사 질환 또는 장애, 또는 간 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한 것이다. 특히 질환 예컨대 간염 (바이러스 간염, 예컨대 HBV 또는 HCV 을 포함), 간 지방증 (대사 기능부전을 포함), 죽상동맥경화증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증 예를 들어 아포지질단백질 B 에서 기능 돌연변이의 획득, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 고지질혈증 (FCHL), 후천 고지질혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상동맥 심장 질환 (CHD), 급성 관상동맥 증후군 (ACS), 간-섬유증 (또는 간-섬유증과 연관된 질환), 간경변 및 암의 치료를 위한 것이다.
추가의, 본 발명은 간 질환 예컨대 간염 (바이러스 간염, 예컨대 HBV 또는 HCV 을 포함), 간 지방증 (대사 기능부전을 포함), 죽상동맥경화증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증 예를 들어 아포지질단백질 B 에서 기능 돌연변이의 획득, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 고지질혈증 (FCHL), 후천 고지질혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상동맥 심장 질환 (CHD), 간경변 및 암의 치료 방법을 제공한다.
핵산 분자
본 발명의 맥락에서 용어 "핵산 분자" 는 2 개 이상의 뉴클레오시드 (즉 올리고뉴클레오티드) 의 공유 연결에 의해 형성된 분자를 언급한다. 본원에서, 단일 뉴클레오시드 (단위체) 는 또한 단량체 또는 단위체로 언급될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "뉴클레오시드", "뉴클레오티드", "단위체" 및 "단량체" 는 호환되게 사용된다. 뉴클레오티드 또는 단량체의 서열을 언급할 때, 언급되는 것은 염기, 예컨대 A, T, G, C 또는 U 또는 그의 유사체의 서열이라는 것이 인식될 것이다.
핵산 분자는 DNA, RNA 일 수 있거나 또는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 둘다를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특히 세포 내에서 RNA 를 조정하는 핵산 유사체 분자가 요망된다. 조정은 예를 들어 mRNA 의 분해의 촉진, mRNA 전사의 차단, 스플라이스 자리의 복구, 스플라이싱의 방지 또는 마이크로 RNA 의 차단일 수 있다.
핵산 분자는 표적 핵산의 역 상보체 (reverse complement) 에 해당하는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그것으로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 표적 핵산 서열에 하이브리드화될 때 1, 2, 3, 또는 4 개의 (또는 그 이상의) 미스매치를 관용하고, 표적에 여전히 충분히 결합하여 요망되는 효과, 즉 표적의 하향-조절을 보일 수 있다. 미스매치는, 예를 들어, 올리고머 뉴클레오티드 서열의 증가된 길이 및/또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 뉴클레오티드 서열 내에 존재하는 LNA 의 증가된 수에 의해 보상될 수 있다.
일부 구현예에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에, 예컨대 포유류 표적 단백질을 인코딩하는 핵산의 상응하는 영역에 하이브리드화될 때 3 개 이하, 예컨대 2 개 이하의 미스매치를 포함한다.
일부 구현예에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에, 예컨대 포유류 표적 단백질을 인코딩하는 핵산의 상응하는 영역에 하이브리드화될 때 1 개 이하의 미스매치를 포함한다.
핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 표적 핵산에 존재하는 상응하는 서열의 역 상보체와 적어도 80% 동일, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일, 적어도 99% 동일, 예컨대 100% 동일하다.
용어 "상보적" 은 각각의 서열의 3'-말단이 다른 서열의 5'-말단에 결합하고 그 때 하나의 서열의 각각의 A, T(U), G, 및 C 가 다른 서열의, 각각, T(U), A, C, 및 G 와 정렬되는 역평행 센스 (anti-parallel sense) 로 하나의 서열이 다른 서열에 결합할 수 있을 때 2 개의 서열이 상보적임을 의미한다. 통상적으로, 핵산 분자의 상보적 서열은 표적 핵산 분자에 존재하는 하위서열에 적어도 80% 상보적, 예컨대 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96% 상보적, 적어도 97% 상보적, 적어도 98% 상보적, 적어도 99% 상보적, 예컨대 100% 상보적 (완벽히 상보적) 이다.
핵산 분자 및 표적 핵산 서열 사이의 상보성의 정도를 확인할 때, 상보성의 정도는 핵산 분자의 서열 및 그와 최상으로 정렬하는 표적 영역의 서열 사이의 백분율 상보성으로서 표현된다. 백분율은 2 개의 서열 사이에 쌍을 형성하는 정렬된 염기의 수를 계수하고, 핵산 분자 (안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA) 내의 단량체의 총수로 나누고, 100 을 곱하여 계산된다. 그러한 비교에서 정렬하지 않는 핵염기/뉴클레오티드는 미스매치로 칭한다.
mRNA 조정은 RNAi-유도되는 침묵 복합체 (RISC) 를 수반하는 세포의 RNA 간섭 경로 기구와의 상호작용을 통해 촉진될 수 있다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 하기를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다: siRNA, 마이크로RNA, 2중가닥 RNA (dsRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 RNA 간섭을 유도할 수 있는 RNA 를 인코딩하는 발현 카세트.
siRNA 는 전형적으로 15-50 개의 염기쌍, 바람직하게는 21-25 개의 염기쌍을 함유하고 세포 내에서 발현되는 표적 유전자 또는 RNA 내의 코딩 서열과 동일한 (완벽히 상보적인) 또는 거의 동일한 (부분적으로 상보적인) 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중 가닥 구조를 포함한다. siRNA 는 2 개의 어닐링된 폴리뉴클레오티드 또는 헤어핀 구조를 형성하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함한다. 하나의 구현예에서, 컨쥬게이트의 siRNA 는 2 개의 올리고뉴클레오티드 조각으로부터 조립되며, 2 개의 올리고뉴클레오티드 조각 중 하나의 조각은 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 제 2 조각은 siRNA 분자의 센스 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또다른 구현예에서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 링커 분자, 예컨대 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된다. 바람직하게는 본 발명의 컨쥬게이트는 siRNA 의 센스 가닥에 커플링된다. 절단가능한 링커가 siRNA 및 컨쥬게이트 사이에 존재하는 경우에 컨쥬게이트는 센스 또는 안티센스 가닥에 연결될 수 있다.
마이크로RNA (miRNA) 는 그들의 mRNA 표적의 직접 파괴 또는 번역 억제를 유도하는 약 22 개 뉴클레오티드 길이의 작은 비코딩 RNA 유전자 산물이다. miRNA 및 표적 mRNA 사이의 상보성이 부분적인 경우에, 표적 mRNA 의 번역은 억제된다. 상보성이 큰 경우에, 표적 mRNA 은 절단된다. miRNA 의 경우에, 복합체는 통상적으로 전형적으로 miRNA 와 오직 부분적 상동성을 공유하는 mRNA 의 3' UTR 에 위치하는 표적 자리에 결합한다. "시드 (seed) 영역" - 그것의 표적과 완벽한 염기쌍을 형성하는 miRNA 의 5' 말단의 약 일곱 (7) 개의 연속 뉴클레오티드의 스트레치 (stretch) - 은 miRNA 특이성에서 핵심 역할을 수행한다. 올리고머에 의한 miRNA 의 시드 영역의 차단 또는 mRNA 에 대한 RISC/miRNA 복합체의 결합의 촉진은 단백질 번역의 억제 또는 mRNA 의 절단 및 분해를 초래할 수 있다.
RNAi 폴리뉴클레오티드 발현 카세트는 세포에서 전사되어 siRNA, 별개의 센스 및 안티-센스 가닥 선형 siRNA, 또는 miRNA 로서 기능할 수 있는 작은 헤어핀 RNA 를 생산할 수 있다. RNA 폴리머라제 III 전사된 DNA 는 U6 프로모터, HI 프로모터, 및 tRNA 프로모터를 포함하는 목록으로부터 선택되는 프로모터를 함유한다. RNA 폴리머라제 II 프로모터는 UI, U2, U4, 및 U5 프로모터, snRNA 프로모터, 마이크로RNA 프로모터, 및 mRNA 프로모터를 포함한다.
대안적으로, RNA 조정은 표적 mRNA 또는 miRNA 에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 에 의해 촉진될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 mRNA 의 비 RNase 매개되는 분해를 통해, 예컨대 번역의 입체 장애, 또는 기타 방법에 의해 기능할 수 있으나, 본 발명의 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엔도리보뉴클레아제 (RNase), 예컨대 RNase H 를 동원할 수 있다고 인식된다.
EP 1 222 309 는 RNase H 를 동원하는 능력을 확인하는데 사용될 수 있는, RNase H 활성을 확인하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 상보적 RNA 표적이 제공되었을 때, EP 1 222 309 의 실시예 91-95 에 의해 제공되는 방법론을 사용하여, 올리고뉴클레오티드에서의 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖고 2' 치환이 없는 동일한 염기 서열을 갖지만 DNA 단량체만을 함유하는 DNA 유일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 확인된 초기 속도의 적어도 1%, 예컨대 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 20% 초과의 pmol/l/분으로 측정되는 초기 속도를 갖는 경우에, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase H 를 동원할 수 있다고 여겨진다.
일부 구현예에서, 상보적 RNA 표적, 및 RNase H 가 제공되었을 때, EP 1 222 309 의 실시예 91-95 에 의해 제공되는 방법론을 사용하여, 올리고뉴클레오티드에서의 모든 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖고 2' 치환이 없는 동등한 DNA 유일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 확인된 초기 속도의 1% 미만, 예컨대 5% 미만, 예컨대 10% 미만 또는 20% 미만의 pmol/l/분으로 측정되는 RNase H 의 초기 속도를 갖는 경우에, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 RNase H 를 동원할 수 없다고 여겨진다.
다른 구현예에서, 상보적 RNA 표적, 및 RNase H 가 제공되었을 때, EP 1 222 309 의 실시예 91-95 에 의해 제공되는 방법론을 사용하여, 올리고뉴클레오티드에서의 모든 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖고 2' 치환이 없는 동등한 DNA 유일한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 측정되는 초기 속도의 적어도 20%, 예컨대 적어도 40%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 80% 의 pmol/l/분으로 측정되는 RNase H 의 초기 속도를 갖는 경우에, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNase H 를 동원할 수 있다고 여겨진다.
전형적으로, 상보적 표적 RNA 와의 듀플렉스로 형성되었을 때, RNase 를 동원할 수 있는 연속적 뉴클레오티드 단위체를 형성하는 올리고머의 영역은 RNA 표적과 DNA/RNA 유사 듀플렉스를 형성하고 DNA 단위체 및 LNA 단위체 (이는 알파-L 입체배치로 존재하고, 특히 바람직하게는 알파-L-옥시 LNA 임) 둘다를 포함하는 뉴클레오티드 단위체로 이루어진다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 분자이고, 바람직하게는 동일한 안티센스 올리고뉴클레오티드 (즉 듀플렉스) 내의 동등한 영역에 상보적인, 예를 들어, 적어도 3, 4 또는 5 개의, 인접 뉴클레오티드의 짧은 영역을 포함하지 않는다 - 이와 관련하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 (본질적으로) 이중 가닥이 아니다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중 가닥이 아니며, 예컨대 siRNA 가 아니다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인접 뉴클레오티드 영역으로 전적으로 이루어질 수 있다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 자기-상보적이 아니다. 다양한 구현예에서, 본 발명의 화합물은 RNA (단위체) 를 포함하지 않는다. 바람직하게는 본 발명에 따른 화합물은 선형 분자이거나 또는 선형 분자로서 합성된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 10 - 50, 예컨대 10 - 30 개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나 그것을 포함한다.
일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 10 - 22, 예컨대 10 - 16, 예컨대 10 - 14, 예컨대 11 - 20, 예컨대 12 - 18, 예컨대 12 - 16, 예컨대 13 - 17, 또는 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개 인접 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 그것으로 이루어진다.
RNase H 를 동원하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 갭머 (gapmer), 헤드머 (headmer) 또는 믹스머 (mixmer) 의 형태일 수 있다.
"헤드머" 는 영역 X 의 3'-가장 끝 단량체에 영역 Y 의 5'-가장 끝 단량체가 연결되어 있는, 영역 X 및 그에 인접한 영역 Y 를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 정의된다. 영역 X 는 비-RNase 동원 뉴클레오시드 유사체의 인접 스트레치를 포함하고, 영역 Y 는 RNase 에 의해 인지가능하고 절단가능한 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체의 인접 스트레치 (예컨대 적어도 7 개의 인접 단량체) 를 포함한다.
"테일머 (tailmer)" 는 영역 X 의 3'-가장 끝 단량체에 영역 Y 의 5'-가장 끝 단량체가 연결되어 있는, 영역 X 및 그에 인접한 영역 Y 를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 정의된다. 영역 X 는 RNase 에 의해 인지가능하고 절단가능한 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체의 인접 스트레치 (예컨대 적어도 7 개의 인접 단량체) 를 포함하고, 영역 X 는 비-RNase 동원 뉴클레오시드 유사체의 인접 스트레치를 포함한다.
"믹스머" 는 (i) RNase 에 의해 인지가능하고 절단가능한 DNA 단량체 또는 뉴클레오시드 유사체 단량체, 및 (ii) 비-RNase 동원 뉴클레오시드 유사체 단량체의 교호 조성물로 이루어진다. 믹스머의 예는 본원에 참조로 포함되는 WO2005/023995 에서 찾을 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머이다. 갭머 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNAse, 예컨대 RNase H 를 동원할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치, 예컨대 본원에서 영역 B 로서 언급되는 적어도 6 또는 7 개 DNA 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 여기에서 영역 B 는 5' 및 3' 둘다에서 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체의 영역에 의해 플랭크되며, 예컨대 RNAse 를 동원할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 스트레치의 5' 및 3' 에 1-6 개 뉴클레오티드 유사체가 있으며 - 이들 영역은 각각 영역 A 및 A' 로 언급된다. A 및 A' 영역은 또한 갭머의 윙 (wing) 으로 호칭될 수 있다.
바람직하게는, 갭머는 식 (5' → 3'), A-B-A', 또는 임의로 A-B-A'-PO 또는 PO-A-B-A' 의 (폴리)뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기에서; 영역 A (5' 영역 윙) 는 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 적어도 하나의 LNA 단위체, 예컨대 1-6 개 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA 단위체로 이루어지거나 그것을 포함하고; 영역 B 는 RNAse 를 동원할 수 있는 (상보적 RNA 분자, 예컨대 mRNA 표적와의 듀플렉스로 형성될 때) 적어도 5 개 연속 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 뉴클레오시드로 이루어지거나 그것을 포함하고; 영역 A' (3' 영역 윙) 는 적어도 하나의 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 적어도 하나의 LNA 단위체, 예컨대 1-6 개 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA 단위체로 이루어지거나 그것을 포함하고; 영역 PO 는 존재할 때 1-10 개 뉴클레오시드 단위체, 바람직하게는 1-4 개 뉴클레오시드 단위체, 예컨대 DNA 뉴클레오티드로 이루어지거나 그것을 포함한다.
일부 구현예에서, 영역 A 및 A' 는 서로 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA 단위체, 예컨대 2-5 개 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 2-5 LNA 단위체, 예컨대 2-4 개 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 2-4 개 LNA, 예컨대 3 또는 4 개 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 3 또는 4 개 LNA 단위체로 이루어진다.
일부 구현예에서 B 는 RNAse 를 동원할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개 연속 뉴클레오티드, 또는 RNAse 를 동원할 수 있는 5-12, 또는 6-10, 또는 7-9, 예컨대 8 개 연속 뉴클레오티드로 이루어지거나 그것을 포함한다. 일부 구현예에서 영역 B 는 적어도 하나의 DNA 뉴클레오시드 단위체, 예컨대 1-12 개 DNA 단위체, 바람직하게는 4-12 개 DNA 단위체, 더욱 바람직하게는 6-10 개 DNA 단위체, 예컨대 7-10 개 DNA 단위체, 가장 바람직하게는 8, 9 또는 10 개 DNA 단위체로 이루어지거나 그것을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAse 를 동원할 수 있는 단량체는 DNA 단량체, 알파-L-LNA 단량체, C4' 알킬화된 DNA 단량체 (본원에 참조로 포함되는 PCT/EP2009/050349 및 Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300 참고), 및 UNA (미연결된 핵산) 뉴클레오티드 (본원에 참조로 포함되는 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 참고) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서 갭머 영역 B 에서의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및 보라노포스페이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 뉴클레오시드 연결을 포함한다. 바람직하게는 영역 B 의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트이다.
일부 구현예에서 갭머는 하기 A-B-A' 모티프 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, 4-7-3 또는 1-8-1, 1-8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, 또는 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-4, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 또는; 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 중 하나로 디자인된다. 추가의 갭머 디자인이 본원에 참조로 포함되는 WO2004/046160 및 WO2005/023825 에 공개되어 있다. 본원에 참조로 포함되는 WO2007/146511 및 WO2008/113832 는 '쇼트머 (shortmer)' 갭머 안티센스 올리고뉴클레오티드를 언급한다. 일부 구현예에서, 본원에 제시된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그러한 쇼트머 갭머일 수 있다.
일부 구현예에서 영역 PO 은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 포스포디에스테르 연결을 통해 연결된 적어도 하나의 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드를 포함하거나 그것으로 이루어지는 생물절단가능한 링커이다. 일부 양상에서, 제 1 및 제 2 영역 사이의 뉴클레오시드간 연결은 영역 PO 의 일부로 여겨진다. 일부 구현예에서 영역 PO 에서의 모든 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
일부 구현예에서, 영역 PO 에서의 염기의 서열은 표적 조직 또는 세포 또는 준세포 구획에 존재하는 우세한 엔도뉴클레아제 절단 효소에 기반하여 최적 엔도뉴클레아제 절단 자리를 제공하도록 선택된다.
일부 구현예에서 영역 PO 은 서열 AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC, 또는 GG 의 디뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 C 는 5-메틸시토신 (또한 mC 로 언급됨) 일 수 있고/거나, T 는 U 로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서 영역 B 는 서열 AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC, 및 GGG 의 트리뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 C 는 5-메틸시토신일 수 있고/거나 T 는 U 로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서 영역 L' 는 서열 AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX, 및 GGGX 의 트리뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 X 은 A, T, U, G, C 로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기에서 C 는 5-메틸시토신일 수 있고/거나 T 는 U 로 대체될 수 있다. (자연 발생적) 핵염기 A, T, U, G, C 를 언급할 때, 이들은 동등한 자연적 핵염기 (예를 들어 상보적 뉴클레오시드와의 염기쌍) 로서 기능하는 핵염기 유사체로 치환될 수 있다고 이해될 것이다.
본 발명에 따른 컨쥬게이트 내로 통합될 수 있는 예시적 핵산 분자는 5'-GmCattggtatTmCA-3' (대문자 = LNA 단량체; 소문자 = DNA 단량체) 이다.
표적
본 발명의 맥락에서 용어 "표적" 은 자연적으로 존재하는 세포 또는 세포 내의 분자 구조를 언급하며, 여기에서 표적은 약학적 활성 분자가 작용해야 하는 관심의 병리에 수반된다. 바람직한 구현예에서 표적은 조정시 관심의 병리를 변화시키는 핵산 서열 (표적 핵산) 이다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 핵산" 은 포유류 표적 폴리펩티드, 예컨대 인간 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 또는 RNA 또는 세포 내 메카니즘, 예컨대 바이러스 감염 메카니즘, RNA 침묵 또는 유전자 발현의 전사후 조절에 조절 효과를 발휘하는 비-코딩 DNA 또는 RNA 분자를 언급한다. 비-코딩 RNA 분자는 예를 들어 마이크로 RNA 일 수 있다. 바람직한 구현예에서 표적 핵산은 시험관내 또는 생체내 세포, 예컨대 포유류 세포 특히 인간 세포에 존재하는 유전자, 메신저 RNA (mRNA) 또는 마이크로 RNA (miRNA) 이다. 바람직한 구현예에서 세포는 표면에 아시알로당단백질 수용체 (ASPGR) 를 포함하는 세포, 예컨대 간 세포 및 고환 세포, 특히 간세포 및 라이디히 (Leydig) 세포이다. 추가의 바람직한 구현예에서 표적 핵산은 mRNA, 예컨대 pre-mRNA 이지만, 바람직하게는 성숙 mRNA 이다. 바람직하게는 표적 mRNA 또는 pre-mRNA 은 간 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 연구 또는 진단에서 사용될 때 "표적 핵산" 은 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래하는 cDNA 또는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 핵산 분자 (예를 들어 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드) 는 바람직하게는 표적 핵산에 하이브리드화할 수 있다.
적합하게는 약학적 활성 분자, 바람직하게는 핵산 분자는 표적 핵산의 발현을 하향-조절 (예를 들어 감소 또는 제거) 조정할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 약학적 활성 분자는, 전형적으로 포유류 예컨대 인간 세포에서, 표적의 저해에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 표적 핵산에 결합하고 정상적 발현 수준에 비해 적어도 10% 또는 20% 의 발현의 저해, 더욱 바람직하게는 정상적 발현 수준 (예컨대 핵산 분자 또는 핵산 분자 컨쥬게이트의 부재 하의 발현 수준) 에 비해 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 저해에 영향을 미친다. 발현 수준의 조정은, 예를 들어 SDS-PAGE 에 뒤이은 표적 단백질에 대항해 발생된 적합한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅과 같은 방법에 의해, 단백질 수준을 측정함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 발현 수준의 조정은, 예를 들어 노던 블롯팅 또는 정량적 RT-PCR 에 의해, mRNA 수준을 측정함으로써 확인될 수 있다.
본 발명은 그러므로 세포에서의 단백질 및/또는 mRNA 및/또는 마이크로RNA 의 발현 또는 기능을 조정, 예를 들어 하향-조절 또는 저해하는 방법으로서, 본 발명에 따른 핵산 분자 컨쥬게이트를 상기 세포에 투여하여 상기 세포에서의 표적 단백질 및/또는 mRNA 및/또는 마이크로RNA 의 발현 또는 기능을 하향-조절 또는 저해하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 적합하게는 세포는 포유류 세포 예컨대 인간 세포이고, 바람직하게는 그것은 간 세포이다. 투여는, 일부 구현예에서, 시험관내에서 실시될 수 있다. 투여는, 일부 구현예에서, 생체내에서 실시될 수 있다. 조성물의 투여는 장애를 치료 또는 예방함에 있어서 또는 인간에서의 생리적 상태를 조절함에 있어서 효과적인 충분한 양으로 실시된다.
용어 "그의 자연 발생적 변이체" 는 정의된 분류군, 예컨대 포유류, 예컨대 마우스, 원숭이, 및 바람직하게는 인간 내에 자연적으로 존재하는 핵산 서열의 표적 폴리펩티드의 변이체를 언급한다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드의 "자연 발생적 변이체" 를 언급할 때 그 용어는 또한 염색체 변위 또는 중복에 의해 염색체에서 발견되는 표적 인코딩 게놈 DNA 의 임의의 대립형질 변이체, 및 RNA, 예컨대 그로부터 유래된 mRNA 를 망라할 수 있다. "자연 발생적 변이체" 는 또한 표적 mRNA 의 대안적 스플라이싱으로부터 유래된 변이체를 포함한다. 구체적 폴리펩티드 서열을 언급할 때, 예를 들어, 그 용어는 또한 그러므로, 예를 들어 번역동시 또는 번역후 수식, 예컨대 신호 펩티드 절단, 단백질가수분해 절단, 글리코실화 등에 의해, 가공될 수 있는 단백질의 자연 발생적 형태를 포함한다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체
일부 구현예에서, 용어 "뉴클레오시드 유사체" 및 "뉴클레오티드 유사체" 는 호환되게 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드" 는 당 모이어티, 염기 모이어티 및 공유 연결된 기 (연결 기), 예컨대 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 기를 포함하는 글리코시드를 언급하고, 자연 발생적 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 및 수식된 당 및/또는 염기 모이어티를 포함하는 비-자연 발생적 뉴클레오티드 (이는 본원에서 또한 "뉴클레오티드 유사체" 로서 언급됨) 둘다를 포괄한다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드 (단위체) 는 또한 단량체 또는 핵산 단위체로서 언급될 수 있다.
생화학 분야에서, 용어 "뉴클레오시드" 는 통상적으로 당 모이어티 및 염기 모이어티를 포함하는 글리코시드를 언급할 때 사용되고, 그러므로 올리고머의 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드간 연결에 의해 공유 연결되어 있는 뉴클레오티드 단위체를 언급할 때 사용될 수 있다. 생화학 분야에서, 용어 "뉴클레오티드" 는 종종 핵산 단량체 또는 단위체를 언급할 때 사용되고, 그것은 올리고뉴클레오티드의 문맥에서 염기를 언급할 수 있으며 - 예컨대 "뉴클레오티드 서열" 은, 전형적으로 핵염기 서열을 언급한다 (즉 당 백본 및 뉴클레오시드간 연결이 내포됨). 마찬가지로, 특히 뉴클레오시드간 연결 기 중 하나 이상이 수식되어 있는 올리고뉴클레오티드의 경우에, 용어 "뉴클레오티드" 는 "뉴클레오시드" 를 언급할 수 있으며 예를 들어 뉴클레오시드 사이의 연결의 존재 또는 본질을 명시할 때에도 용어 "뉴클레오티드" 가 사용될 수 있다.
당업자는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드가 5' 뉴클레오티드간 연결 기를 포함하지 않는다고 인식할 것이지만, 5' 말단 기를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
비-자연 발생적 뉴클레오티드는 수식된 당 모이어티를 갖는 뉴클레오티드, 예컨대 바이시클릭 뉴클레오티드 또는 2' 수식된 뉴클레오티드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.
"뉴클레오시드 유사체" 는 당 및/또는 염기 모이어티에서의 수식에 의한 자연적 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 또는 RNA 뉴클레오시드의 변이체이다. 유사체는 원칙적으로 핵산 분자의 맥락에서 자연적 뉴클레오시드에 단지 "침묵" 하거나 또는 "동등" 할 수 있으며, 즉 핵산 분자가 표적 유전자 발현을 저해하기 위해 작용하는 방식에 기능적 효과를 갖지 않는다. 그러한 "동등한" 유사체는, 예를 들어, 그것이 제조하기가 더 용이 또는 저렴하거나, 또는 저장 또는 제조 조건에 더욱 안정적이거나, 또는 태그 (tag) 또는 라벨 (label) 에 해당하는 경우에 유용할 수 있다. 바람직하게는, 그러나, 예를 들어 표적에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 세포내 뉴클레아제에 대한 증가된 저항성 및/또는 세포 내로의 수송의 증가된 용이성을 제공함으로써, 유사체는 핵산 분자가 발현을 저해하기 위해 작용하는 방식에 기능적 효과를 가질 것이다. 표적에 대한 증가된 결합 친화도는 핵산 분자와 상보적 RNA 의 향상된 듀플렉스 안정성을 초래하며 듀플렉스의 용융 온도의 양의 변화 (ΔTm) 의 면에서 적어도 +0.5 ℃ / 수식 만큼, 바람직하게는 적어도 +1 ℃, 1.5 ℃, +2 ℃, +2.5℃, +3 ℃ / 수식 만큼, 더욱 바람직하게는 적어도 +4 ℃ / 수식 만큼, 가장 바람직하게는 적어도 +4.5 ℃ / 수식 만큼 그러하다. 그러한 친화도 증가를 제공하는 유사체는 또한 친화도-향상 유사체로 호칭된다. 핵산 분자가 작용하는 방식에 기능적 효과를 갖는 뉴클레오시드 유사체의 구체적 예는 예를 들어 Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 에 의해 기재되고, 아래 제시되어 있다:
핵산 분자는 따라서 자연 발생적 뉴클레오시드 - 바람직하게는 2'-데옥시뉴클레오티드 (본원에서 일반적으로 "DNA" 로서 언급됨), 뿐만 아니라 가능하게는 리보뉴클레오티드 (본원에서 일반적으로 "RNA" 로서 언급됨) 의 단순 서열, 또는 그러한 자연 발생적 뉴클레오시드 및 하나 이상의 비-자연 발생적 뉴클레오티드, 즉 뉴클레오티드 유사체의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 자연 발생적 뉴클레오시드는 자연적 뉴클레오시드간 연결 예컨대 포스포디에스테르 또는 안정화 연결 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 또는 이들 연결의 혼합을 함유할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 적합하게는 표적 서열에 대한 핵산 분자의 친화도를 향상시킬 수 있다.
적합한 및 바람직한 뉴클레오티드 유사체의 예는 WO2007/031091 에 의해 제공되거나 또는 거기에서 언급된다.
용어 "LNA" 는 "잠금 핵산 (Locked Nucleic Acid)" 으로 알려진 바이시클릭 뉴클레오시드 유사체를 언급한다. 그것은 LNA 단량체를 언급할 수 있거나, 또는, "LNA 올리고뉴클레오티드" 의 맥락에서 사용될 때, LNA 는 하나 이상의 그러한 바이시클릭 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 언급한다. LNA 뉴클레오티드는 리보스 당 고리의 C2' 및 C4' 사이의 링커 기 (예컨대 브릿지) - 예를 들어 아래 기재된 바와 같은 바이라디칼 R4* - R2* 로서 제시된 것의 존재에 의해 특징지어진다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 화합물에서 사용되는 LNA 는 바람직하게는 화학식 (VIII) 의 구조를 갖는다
식에서 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다;
여기에서 X 는 -O-, -S-, -N(RN*)-, -C(R6R6*)- 로부터 선택되며, 예컨대, 일부 구현예에서 -O- 이고;
B 는 수소, 임의로 치환된 C1-4-알콕시, 임의로 치환된 C1-4-알킬, 임의로 치환된 C1-4-아실옥시, 자연 발생적 및 핵염기 유사체를 포함하는 핵염기, DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성 기, 열화학적 활성 기, 킬레이팅 기, 리포터 기, 및 리간드로부터 선택되고; 바람직하게는, B 는 핵염기 또는 핵염기 유사체이고;
P 는 인접 단량체로의 뉴클레오티드간 연결, 또는 5'-말단 기를 나타내고, 그러한 뉴클레오티드간 연결 또는 5'-말단 기는 임의로 치환기 R5 또는 동등하게 적용가능한 치환기 R5* 를 포함하고;
P* 는 인접 단량체로의 뉴클레오티드간 연결, 또는 3'-말단 기를 나타내고;
R4* 및 R2* 는 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-, -SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z 로부터 선택되는 1 - 4 개의 기/원자로 이루어지는 이가 링커 기를 나타내며, 여기에서 Z 는 -O-, -S-, 및 -N(Ra)- 로부터 선택되고, Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 히드록시, 임의로 치환된 C1-12-알콕시, C2-12-알콕시알킬, C2-12-알케닐옥시, 카르복시, C1-12-알콕시카르보닐, C1-12-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴-옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로-아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성 기, 열화학적 활성 기, 킬레이팅 기, 리포터 기, 및 리간드로부터 선택되며, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고 여기에서 2 개의 제미날 (geminal) 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있으며, 여기에서 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있고, 및;
존재하는 치환기 R1*, R2, R3, R5, R5*, R6 및 R6* 의 각각은 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 히드록시, C1-12-알콕시, C2-12-알콕시알킬, C2-12-알케닐옥시, 카르복시, C1-12-알콕시카르보닐, C1-12-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴-옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로-아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴-옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성 기, 열화학적 활성 기, 킬레이팅 기, 리포터 기, 및 리간드로부터 선택되며, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고, 여기에서 2 개의 제미날 치환기는 함께 옥소, 티옥소, 이미노, 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있으며;
여기에서 RN 은 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, 여기에서 2 개의 인접 (비-제미날) 치환기는 이중 결합을 초래하는 부가적 결합을 나타낼 수 있고; 및 RN* 은, 존재하고 바이라디칼에 수반되지 않을 때, 수소 및 C1-4-알킬; 및 염기성 염 및 그의 산 부가 염으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 C(RaRb)-C(RaRb)-, C(RaRb)-O-, C(RaRb)-NRa-, C(RaRb)-S-, 및 C(RaRb)-C(RaRb)-O- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 기로 이루어지는 바이라디칼을 나타내고, 여기에서 각각의 Ra 및 Rb 는 임의로 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, Ra 및 Rb 는, 임의로 독립적으로 수소 및 C1-6알킬, 예컨대 메틸, 예컨대 수소로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 R- 또는 S- 입체배치로 존재하는 바이라디칼 -O-CH(CH2OCH3)- (2'O-메톡시에틸 바이시클릭 핵산 - Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 을 나타낸다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 R- 또는 S- 입체배치로 존재하는 바이라디칼 -O-CH(CH2CH3)- (2'O-에틸 바이시클릭 핵산 - Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 을 나타낸다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 R- 또는 S- 입체배치로 존재하는 바이라디칼 -O-CH(CH3)- 을 나타낸다. 일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 바이라디칼 -O-CH2-O-CH2- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 을 나타낸다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 바이라디칼 -O-NR-CH3- - (Seth at al., 2010, J. Org. Chem) 을 나타낸다.
일부 구현예에서, LNA 단위체는 하기 군으로부터 선택되는 구조를 갖는다:
일부 구현예에서, R1*, R2, R3, R5, R5* 는 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 알콕실, 치환된 C1-6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-6 아미노알킬 또는 치환된 C1-6 아미노알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, R1*, R2, R3, R5, R5* 는 수소이다.
일부 구현예에서, R1*, R2, R3 은 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 알콕실, 치환된 C1-6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-6 아미노알킬 또는 치환된 C1-6 아미노알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, R1*, R2, R3 은 수소이다.
일부 구현예에서, R5 및 R5* 는 각각 독립적으로 H, -CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3, 및 -CH=CH2 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 적합하게는 일부 구현예에서, R5 또는 R5* 는 수소이지만, 기타 기 (R5 또는 R5* 각각) 는 C1-5 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 치환된 C1-6 알킬, 치환된 C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알키닐 또는 치환된 아실 (-C(=O)-) 로 이루어지는 군으로부터 선택되며; 여기에서 각각의 치환된 기는 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 치환된 C2-6 알키닐, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ,J2 또는 N(H)C(=X)N(H)J2 로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 단일 또는 다중 치환되며 여기에서 X 는 O 또는 S 이고; 각각의 J1 및 J2 는, 독립적으로, H, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 아미노알킬, 치환된 C1-6 아미노알킬 또는 보호기이다. 일부 구현예에서 R5 또는 R5* 는 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서 R5 또는 R5* 는 치환된 메틸렌이며 여기에서 바람직한 치환기는 F, NJ1J2, N3, CN, OJ1, SJ1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ, J2 또는 N(H)C(O)N(H)J2 로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 기를 포함한다. 일부 구현예에서 각각의 J1 및 J2 는, 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서 R5 또는 R5* 는 메틸, 에틸 또는 메톡시메틸이다. 일부 구현예에서 R5 또는 R5* 는 메틸이다. 추가의 구현예에서 R5 또는 R5* 는 에틸레닐이다. 일부 구현예에서 R5 또는 R5* 는 치환된 아실이다. 일부 구현예에서 R5 또는 R5* 는 C(=O)NJ1J2 이다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다. 그러한 5' 수식된 바이시클릭 뉴클레오티드는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO 2007/134181 에 공개되어 있다.
일부 구현예에서 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 및 그의 유사체에 관하여 B 는 핵염기 유사체 및 자연 발생적 핵염기를 포함하는 핵염기, 예컨대 퓨린 또는 피리미딘, 또는 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 본원에서 언급되는 핵염기, 예컨대 아데닌, 시토신, 티민, 아데닌, 우라실, 및/또는 수식된 또는 치환된 핵염기, 예컨대 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 5-프로피닐-우라실, 2'티오-티민, 5-메틸 시토신, 5-티오졸로-시토신, 5-프로피닐-시토신, 및 2,6-디아미노퓨린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵염기이다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 -C(RaRb)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-, -C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-, -C(RaRb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-, -C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-, -C(RaRb)-N(Rc)-, -C(RaRb)-C(RcRd)- N(Re)-, -C(RaRb)-N(Rc)-O-, 및 -C(RaRb)-S-, -C(RaRb)-C(RcRd)-S- 로부터 선택되는 바이라디칼을 나타내며, 여기에서 Ra, Rb, Rc, Rd, Re, 및 Rf 각각은 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 히드록시, C1-12-알콕시, C2-12-알콕시알킬, C2-12-알케닐옥시, 카르복시, C1-12-알콕시카르보닐, C1-12-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴-옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로-아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성 기, 열화학적 활성 기, 킬레이팅 기, 리포터 기, 및 리간드로부터 독립적으로 선택되며, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고 여기에서 2 개의 제미날 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다.
추가의 구현예에서 R4* 및 R2* 는 함께 -CH2-O-, -CH2-S-, -CH2-NH-, -CH2-N(CH3)-, -CH2-CH2-O-, -CH2-CH(CH3)-, -CH2-CH2-S-, -CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -CH2-CH2-CH(CH3)-, -CH=CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N(CH3)-O-, -CH2-O-CH2-, -CH(CH3)-O-, 및 -CH(CH2-O-CH3)-O-, 및/또는, -CH2-CH2-, 및 -CH=CH- 로부터 선택되는 바이라디칼 (이가 기) 을 나타낸다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 바이라디칼 C(RaRb)-N(Rc)-O- 을 나타내며, 여기에서 Ra 및 Rb 은 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 알콕실, 치환된 C1-6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-6 아미노알킬 또는 치환된 C1-6 아미노알킬, 예컨대 수소로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 및; 여기에서 Rc 는 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 알콕실, 치환된 C1-6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-6 아미노알킬 또는 치환된 C1-6 아미노알킬, 예컨대 수소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 바이라디칼 C(RaRb)-O-C(RcRd)-O- 을 나타내며, 여기에서 Ra, Rb, Rc, 및 Rd 은 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 알콕실, 치환된 C1-6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-6 아미노알킬 또는 치환된 C1-6 아미노알킬, 예컨대 수소로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 바이라디칼 -CH(Z)-O- 을 형성하며, 여기에서 Z 는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 치환된 C1-6 알킬, 치환된 C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티오로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 여기에서 각각의 치환된 기는, 독립적으로, 할로겐, 옥소, 히드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN 로부터 독립적으로 선택되는 임의로 보호된 치환기로 단일 또는 다중 치환되며, 여기에서 각각의 J1, J2 및 J3 은, 독립적으로, H 또는 C1-6 알킬이고, X 는 O, S 또는 NJ1 이다. 일부 구현예에서 Z 는 C1-6 알킬 또는 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서 Z 는 메틸이다. 일부 구현예에서 Z 는 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구현예에서 상기 치환기 기는 C1-6 알콕시이다. 일부 구현예에서 Z 는 CH3OCH2- 이다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다. 그러한 바이시클릭 뉴클레오티드는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 US 7,399,845 에 공개되어 있다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3, R5, R5* 는 수소이다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3* 은 수소이고, R5, R5* 중 하나 또는 둘다는 위에서 및 WO 2007/134181 에 언급된 바와 같이 수소 이외의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 함께 브릿지에 치환된 아미노 기를 포함하는 바이라디칼을 나타내며 예컨대 바이라디칼 -CH2-N(Rc)- 로 이루어지거나 이를 포함하며, 여기에서 Rc 는 C1 - 12 알킬옥시이다. 일부 구현예에서 R4* 및 R2* 는 함께 바이라디칼 -Cq3q4-NOR- 을 나타내며, 여기에서 q3 및 q4 는 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 알콕실, 치환된 C1-6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-6 아미노알킬 또는 치환된 C1-6 아미노알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되며; 여기에서 각각의 치환된 기는, 독립적으로, 할로겐, OJ1, SJ1, NJ1J2, COOJ1, CN, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)N J1J2 또는 N(H)C(=X=N(H)J2 로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 단일- 또는 다중-치환되며 여기에서 X 는 O 또는 S 이고; J1 및 J2 의 각각은, 독립적으로, H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 아미노알킬 또는 보호기이다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다. 그러한 바이시클릭 뉴클레오티드는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2008/150729 에 공개되어 있다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3, R5, R5* 은 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 알콕실, 치환된 C1-6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-6 아미노알킬 또는 치환된 C1-6 아미노알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3, R5, R5* 는 수소이다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3 은 수소이고 R5, R5* 중 하나 또는 둘다는 위에서 및 WO 2007/134181 에 언급된 바와 같이 수소 이외의 것일 수 있다. 일부 구현예에서 R4* 및 R2* 는 함께 바이라디칼 (이가 기) C(RaRb)-O- 을 나타내며, 여기에서 Ra 및 Rb 는 각각 독립적으로 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJ1 SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 또는 N(H)C(=S)NJ1J2 이거나; 또는 Ra 및 Rb 는 함께 =C(q3)(q4) 이고; q3 및 q4 는 각각, 독립적으로, H, 할로겐, C1-C12알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이고; 각각의 치환된 기는, 독립적으로, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐, OJ1, SJ1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)NJ1J2, C(=O)J1, O-C(=O)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 또는 N(H)C(=S)NJ1J2 로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 단일 또는 다중 치환되고; 각각의 J1 및 J2 는, 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 아미노알킬, 치환된 C1-C6 아미노알킬 또는 보호기이다. 그러한 화합물은 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2009006478A 에 공개되어 있다.
일부 구현예에서, R4* 및 R2* 는 바이라디칼 - Q - 을 형성하며, 여기에서 Q 는 C(q1)(q2)C(q3)(q4), C(q1)=C(q3), C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4) 또는 C(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)] 이고; q1, q2, q3, q4 는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-12 알킬, 치환된 C1-12 알킬, C2-12 알케닐, 치환된 C1-12 알콕시, OJ1, SJ1, SOJ1, SO2J1, NJ1J2, N3, CN, C(=O)OJ1, C(=O)-NJ1J2, C(=O) J1, -C(=O)NJ1J2, N(H)C(=NH)NJ1J2, N(H)C(=O)NJ1J2 또는 N(H)C(=S)NJ1J2 이고; 각각의 J1 및 J2 는, 독립적으로, H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C1-6 아미노알킬 또는 보호기이고; 및, 임의로 여기에서 Q 가 C(q1)(q2)(q3)(q4) 이고 q3 또는 q4 중 하나가 CH3 일 때 적어도 q3 또는 q4 중 다른 하나 또는 q1 및 q2 중 하나는 H 이외의 것이다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3, R5, R5* 는 수소이다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있다. 그러한 바이시클릭 뉴클레오티드는 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 WO2008/154401 에 공개되어 있다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3, R5, R5* 은 독립적으로 수소, 할로겐, C1-6 알킬, 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, 치환된 C2-6 알케닐, C2-6 알키닐 또는 치환된 C2-6 알키닐, C1-6 알콕실, 치환된 C1-6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-6 아미노알킬 또는 치환된 C1-6 아미노알킬로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3, R5, R5* 는 수소이다. 일부 구현예에서, R1*, R2, R3 은 수소이고 R5, R5* 중 하나 또는 둘다는 위에서 및 WO 2007/134181 또는 WO2009/067647 에 언급된 바와 같이 수소 이외의 것일 수 있다 (알파-L-바이시클릭 핵산 유사체).
추가의 바이시클릭 뉴클레오시드 유사체 및 안티센스 올리고뉴클레오티드에 있어서의 그의 용도는 WO2011/115818, WO2011/085102, WO2011/017521, WO2009/100320, WO2010/036698, WO2009/124295 및 WO2009/006478 에 공개되어 있다. 그러한 뉴클레오시드 유사체는 일부 양상에서 본 발명의 핵산 분자에서 유용할 수 있다.
일부 구현예에서 핵산 분자에서 사용되는 LNA 는 바람직하게는 일반식 (IX) 의 구조를 갖는다:
식에서 Y 는 -O-, -CH2O-, -S-, -NH-, N(Re) 및/또는 -CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Z 및 Z* 는 독립적으로 뉴클레오티드간 연결, RH, 말단 기 또는 보호기로부터 선택되고; B 는 자연적 또는 비-자연적 뉴클레오티드 염기 모이어티 (핵염기) 를 구성하고, RH 는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고; Ra, Rb Rc, Rd 및 Re 는, 임의로 독립적으로, 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 히드록시, C1-12-알콕시, C2-12-알콕시알킬, C2-12-알케닐옥시, 카르복시, C1-12-알콕시카르보닐, C1-12-알킬카르보닐, 포르밀, 아릴, 아릴-옥시-카르보닐, 아릴옥시, 아릴카르보닐, 헤테로아릴, 헤테로-아릴옥시-카르보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카르보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카르바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카르보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카르보닐, C1-6-알킬-카르보닐아미노, 카르바미도, C1-6-알카노일옥시, 술포노, C1-6-알킬술포닐옥시, 니트로, 아지도, 술파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 인터칼레이터, 광화학적 활성 기, 열화학적 활성 기, 킬레이팅 기, 리포터 기, 및 리간드로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기에서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환될 수 있고 여기에서 2 개의 제미날 치환기 Ra 및 Rb 는 함께 임의로 치환된 메틸렌 (=CH2) 을 나타낼 수 있고; RH 는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다. 일부 구현예에서 Ra, Rb Rc, Rd 및 Re 는, 임의로 독립적으로, 수소 및 C1-6 알킬, 예컨대 메틸로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 모든 키랄 중심에 관해, 비대칭적 기는 R 또는 S 배향으로 존재할 수 있으며, 예를 들어, 2 개의 예시적 입체화학적 이성질체는 베타-D 및 알파-L 아형을 포함하며, 이들은 다음과 같이 도시될 수 있다:
구체적 예시적 LNA 단위체는 아래 제시되어 있다:
용어 "티오-LNA" 는 상기 일반식에서 Y 가 S 또는 -CH2-S- 로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 티오-LNA 는 베타-D 및 알파-L-입체배치 둘다로 존재할 수 있다.
용어 "아미노-LNA" 는 상기 일반식에서 Y 가 -N(H)-, N(R)-, CH2-N(H)-, 및 -CH2-N(R)- 로부터 선택되며 여기에서 R 는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 아미노-LNA 는 베타-D 및 알파-L-입체배치 둘다로 존재할 수 있다.
용어 "옥시-LNA" 는 상기 일반식에서 Y 가 -O- 을 나타내는 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 옥시-LNA 는 베타-D 및 알파-L-입체배치 둘다로 존재할 수 있다.
용어 "ENA" 는 상기 일반식에서 Y 가 -CH2-O- (여기에서 -CH2-O- 의 산소 원자는 염기 B 에 대해 2'-위치에 부착되어 있음) 인 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. Re 는 수소 또는 메틸이다.
일부 예시적 구현예에서 LNA 는 베타-D-옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-아미노-LNA 및 베타-D-티오-LNA, 특히 베타-D-옥시-LNA 로부터 선택된다.
핵산 분자에의 친화도-향상 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 또는 2'-치환된 당의 통합은 특이적으로 결합하는 핵산 분자의 크기가 감소되는 것을 허용할 수 있고, 또한 비-특이적 또는 이상 결합이 일어나기 전의 핵산 분자의 크기의 상한을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 적어도 1 개의 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서 핵산 분자는 적어도 2 개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 3-8 개의 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 6 또는 7 개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이제까지 가장 바람직한 구현예에서, 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 잠금 핵산 (LNA) 이다; 예를 들어 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 3 또는 적어도 4, 또는 적어도 5, 또는 적어도 6, 또는 적어도 7, 또는 8 개는 LNA 일 수 있다. 일부 구현예에서 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA 일 수 있다.
오직 뉴클레오티드로 이루어지는, 바람직한 뉴클레오티드 서열 모티프 또는 뉴클레오티드 서열을 언급할 때, 그 서열에 의해 정의되는 본 발명의 핵산 분자는 상기 서열에 존재하는 뉴클레오티드 중 하나 이상 대신에 상응하는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위체 또는 핵산 분자/표적 듀플렉스의 듀플렉스 안정성/Tm 을 증가시키는 기타 뉴클레오티드 유사체 (즉 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체) 를 포함할 수 있다고 인식될 것이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및 표적 서열 사이의 임의의 미스매치는 바람직하게는 친화도 향상 뉴클레오티드 유사체 밖의 영역, 예컨대 본원에서 언급되는 영역 B, 및/또는 본원에서 언급되는 영역 L 에서, 및/또는 올리고뉴클레오티드에서 DNA 뉴클레오티드와 같은 비-수식된 자리에서, 및/또는 인접 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 에 있는 영역에서 발견된다.
뉴클레오티드의 그러한 수식의 예는 당 모이어티의 수식으로 2'-치환기를 제공하거나 또는 가교된(잠금 핵산) 구조를 제공하여 결합 친화도를 향상시키고 또한 증가된 뉴클레아제 저항성을 제공할 수 있는 것을 포함한다.
바람직한 뉴클레오티드 유사체는 LNA, 예컨대 옥시-LNA (예컨대 베타-D-옥시-LNA, 및 알파-L-옥시-LNA), 및/또는 아미노-LNA (예컨대 베타-D-아미노-LNA 및 알파-L-아미노-LNA) 및/또는 티오-LNA (예컨대 베타-D-티오-LNA 및 알파-L-티오-LNA) 및/또는 ENA (예컨대 베타-D-ENA 및 알파-L-ENA) 이다. 가장 바람직한 것은 베타-D-옥시-LNA 이다.
일부 구현예에서 본 발명의 핵산 분자 내에 (예컨대 본원에서 언급된 영역 A 및 C 에) 존재하는 뉴클레오티드 유사체는 독립적으로, 예를 들어 하기로부터 선택된다: 2'-O-알킬-RNA 단위체, 2'-아미노-DNA 단위체, 2'-플루오로-DNA 단위체, LNA 단위체, 아라비노 핵산 (ANA) 단위체, 2'-플루오로-ANA 단위체, HNA 단위체, INA (인터칼레이팅 (intercalating) 핵산 -Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925, 본원에 참조로 포함됨) 단위체 및 2'MOE 단위체. 일부 구현예에서 뉴클레오티드 유사체 중 상기 유형 중 오직 하나가 본 발명의 핵산 분자, 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열에 존재한다.
일부 구현예에서 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-메톡시에틸-RNA (2'MOE), 2'-플루오로-DNA 단량체 또는 LNA 뉴클레오티드 유사체이고, 따라서 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이들 3 가지 유형의 유사체로부터 독립적으로 선택되는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있거나, 또는 3 가지 유형의 유사체로부터 선택되는 오직 하나의 유형의 유사체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 2'-MOE-RNA 이며, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개는 2'-MOE-RNA 뉴클레오티드 단위체이다. 일부 구현예에서 상기 뉴클레오티드 유사체 중 적어도 하나는 2'-플루오로 DNA 이며, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개는 2'-플루오로-DNA 뉴클레오티드 단위체이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 적어도 하나의 잠금 핵산 (LNA) 단위체, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 개의 LNA 단위체, 예컨대 3 - 7 또는 4 - 8 개의 LNA 단위체, 또는 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 LNA 단위체를 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 뉴클레오티드 유사체는 LNA 이다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 베타-D-옥시-LNA, 및 하기 LNA 단위체 중 하나 이상을 둘다 포함할 수 있다: 베타-D 또는 알파-L 입체배치 또는 그들의 조합으로 존재하는 티오-LNA, 아미노-LNA, 옥시-LNA, 및/또는 ENA. 일부 구현예에서 모든 LNA 시토신 단위체는 5'메틸-시토신이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 핵산 분자는 LNA 및 DNA 단위체 둘다를 포함할 수 있다. 바람직하게는 LNA 및 DNA 단위체의 총 합계는 10-25, 예컨대 10-24, 바람직하게는 10-20, 예컨대 10-18, 더더욱 바람직하게는 12-16 개이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 인접 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 LNA 로 이루어지고 나머지 뉴클레오티드 단위체는 DNA 단위체이다. 일부 구현예에서 핵산 분자는, 임의로 수식된 뉴클레오티드간 연결 예컨대 포스포로티오에이트를 갖는, 오직 LNA 뉴클레오티드 유사체 및 자연 발생적 뉴클레오티드 (예컨대 RNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 뉴클레오티드) 를 포함한다.
용어 "핵염기" 는 뉴클레오티드의 염기 모이어티를 언급하고 자연 발생적, 뿐만 아니라 비-자연 발생적 변이체를 포괄한다. 따라서, "핵염기" 는 알려진 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클 뿐만 아니라 헤테로시클릭 유사체 및 그의 호변체를 포괄한다.
핵염기의 예는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 크산틴, 하이포크산틴, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린을 포함하나 그에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 핵산 분자에 존재하는 핵염기 중 적어도 하나는 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 수식된 핵염기이다.
뉴클레오티드간 연결
본원에 기재된 핵산 분자의 단량체는 연결 기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게는, 각각의 단량체는 연결 기를 통해 3' 인접 단량체에 연결되어 있다.
통상의 기술자는, 본 발명의 맥락에서, 핵산 분자의 말단의 5' 단량체가 5' 연결 기를 포함하지 않는다고 이해할 것이지만, 그것은 5' 말단 기를 포함할 수도 있고 또는 포함하지 않을 수도 있다.
용어 "연결 기" 또는 "뉴클레오티드간 연결" 은 2 개의 뉴클레오시드를 함께 공유적으로 커플링할 수 있는 기를 의미하는 것으로 의도된다. 구체적이고 바람직한 예는 포스페이트 기 및 포스포로티오에이트 기를 포함한다.
본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오시드 또는 그의 인접 뉴클레오티드 서열은 연결 기를 통해 함께 커플링된다. 적합하게는 각각의 뉴클레오시드는 연결 기를 통해 3' 인접 뉴클레오시드에 연결된다.
적합한 뉴클레오티드간 연결은 WO2007/031091 에 열거된 것들, 예를 들어 WO2007/031091 (본원에 참조로 포함됨) 의 페이지 34 의 첫번째 단락에 열거된 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
일부 구현예에서, 바람직하게는 뉴클레오티드간 연결을 그것의 정상적 포스포디에스테르로부터 뉴클레아제 공격에 더욱 저항성인 것, 예컨대 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트로 수식한다 - 이들 둘은 RNase H 에 의해 절단가능하며, 또한 표적 유전자의 발현을 감소시킴에 있어서 안티센스 저해의 경로를 허용한다.
본원에서 제공되는 적합한 황 (S) 함유 뉴클레오티드간 연결이 바람직할 수 있다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결은 또한, 특히 갭머의 갭 영역 (B) 에서, 바람직하다. 포스포로티오에이트 연결은 또한 플랭킹 (flanking) 영역 (A 및 A', 및 A 또는 A' 를 L 에 연결시키기 위해, 및 영역 L 내에, 적당한 경우에) 에 사용될 수 있다.
그러나 특히, 예를 들어 뉴클레오티드 유사체의 사용이 영역 A 및 A' 내의 뉴클레오티드간 연결을 엔도-뉴클레아제 분해로부터 보호할 때 - 예컨대 영역 A 및 A' 가 LNA 뉴클레오티드를 포함할 때, 영역 A, B 및 A' 는 포스포로티오에이트 이외의 뉴클레오티드간 연결, 예컨대 포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다.
핵산 분자에서의 뉴클레오티드간 연결은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트이어서 표적화된 RNA 의 RNase H 절단을 허용할 수 있다. 포스포로티오에이트는 개선된 뉴클레아제 저항성 및 기타 이유, 예컨대 제조 용이성 때문에 바람직하다.
본 발명의 핵산 분자의 하나의 양상에서, 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 유사체는 서로 포스포로티오에이트 기에 의해 연결되어 있다.
포스포디에스테르 연결, 예컨대 1 또는 2 개의 연결을, 그렇지 않으면 포스포로티오에이트 핵산 분자 내로, 특히 뉴클레오시드 유사체 단위체 사이에 또는 그에 인접하여 (전형적으로 영역 A 및 또는 A' 에) 포함시키는 것은 핵산 분자의 생체이용률 및/또는 생물학적분배를 수식할 수 있다고 인식될 것이다 - 본원에 참조로 포함되는 WO2008/113832 참고.
일부 구현예, 예컨대 적합한 및 구체적으로 명시되지 않은 위에 언급된 구현예에서, 모든 나머지 연결 기는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트, 또는 그들의 혼합이다.
일부 구현예에서 모든 뉴클레오티드간 연결 기는 포스포로티오에이트이다.
구체적 갭머 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에서 제공된 것들을 언급할 때, 다양한 구현예에서, 연결이 포스포로티오에이트 연결일 때, 대안적 연결, 예컨대 본원에서 공개된 것들이 사용될 수 있으며, 예를 들어 포스페이트 (포스포디에스테르) 연결이 사용될 수 있으며, 특히 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA, 단위체 사이의 연결에 사용될 수 있다고 이해될 것이다. 마찬가지로, 구체적 갭머 올리고뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에서 제공된 것들을 언급할 때, C 잔기가 5'메틸 수식된 시토신으로 주석달아질 때, 다양한 구현예에서, 핵산 분자에 존재하는 C 중 하나 이상이 미수식된 C 잔기일 수 있다.
WO2009/124238 은 중성 뉴클레오시드간 연결에 의해 3' 또는 5' 말단에 부착된 적어도 하나의 바이시클릭 뉴클레오시드를 갖는 올리고머 화합물을 언급한다. 본 발명의 핵산 분자는 그러므로 중성 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 하나 이상의 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI, 아미드-3, 포름아세탈 또는 티오포름아세탈에 의해 3' 또는 5' 말단에 부착된 적어도 하나의 바이시클릭 뉴클레오시드를 가질 수 있다. 나머지 연결은 포스포로티오에이트일 수 있다.
조성물
본 발명의 화합물은 약학적 제형 및 조성물에 사용될 수 있다. 적합하게는, 그러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염 또는 아주반트를 포함한다. WO2007/031091 은 적합한 및 바람직한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 아주반트를 제공한다 - 이는 본원에 참조로 포함된다. 적합한 투여물, 제형, 투여 경로, 조성물, 투여 형태, 기타 치료제와의 조합, 전구약물 제형은 또한 WO2007/031091 에서 제공된다 - 이는 또한 본원에 참조로 포함된다.
응용
본 발명의 화합물은, 예를 들어, 진단, 치료 및 예방을 위한, 연구 시약으로서 이용될 수 있다.
치료법에서 본 발명의 화합물을 사용하여 세포에서의 표적 단백질의 합성을 특이적으로 조정할 수 있다 (전형적으로 mRNA 를 분해 또는 저해하고 그에 의해 단백질 형성을 방지함으로써).
대안적으로, 치료법에서 본 발명의 화합물을 사용하여 세포 및 실험 동물의 세포 내 메카니즘에 조절 효과를 발휘하는 비-코딩 DNA 또는 RNA 분자를 조정함으로써 표적의 기능적 분석 또는 치료적 개입의 표적으로서의 그것의 유용성의 평가를 용이하게 할 수 있다.
바람직한 구현예에서 세포는 표면에 아시알로당단백질 수용체 (ASPGR) 를 포함하는 세포, 예컨대 간 세포 및 고환 세포, 특히 간세포 및 라이디히 세포이다.
치료의 경우에, 동물 또는 인간은 포유류 표적 폴리펩티드, 예컨대 인간 표적 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 또는 RNA 를 조정함으로써 또는 세포 메카니즘, 예컨대 바이러스 감염 메카니즘, RNA 침묵 또는 유전자 발현의 전사후 조절에 조절 효과를 발휘하는 비-코딩 DNA 또는 RNA 분자를 조정함으로써 경감 또는 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심된다. 비-코딩 RNA 분자는 예를 들어 마이크로 RNA 일 수 있다. 바람직한 구현예에서 표적 핵산은 유전자, 메신저 RNA (mRNA) 또는 마이크로 RNA (miRNA) 이다.
추가로 제공되는 것은 본 발명의 화합물 또는 조성물 중 하나 이상의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여함으로써, 질환 또는 상태를 갖는 또는 갖기 쉬운 것으로 의심되는 포유류, 예컨대 인간을 치료하는 방법이다. 본 발명에 따른 핵산 컨쥬게이트 또는 약학적 조성물은 전형적으로 유효량으로 투여된다.
특히 화학식 (III) 의 화합물이 본 발명의 응용에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 장애의 치료용 약제의 제조를 위한 또는 표적 핵산의 조정에 의해 영향을 받는 장애의 치료 방법을 위한 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 컨쥬게이트의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 장애의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 화합물 및/또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
치료될 장애의 예는 간 질환 예컨대 간염 (바이러스 간염, 예컨대 HBV 또는 HCV 을 포함), 간 지방증, 죽상동맥경화증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증 예를 들어 아포지질단백질 B 에서 기능 돌연변이의 획득, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 고지질혈증 (FCHL), 후천 고지질혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상동맥 심장 질환 (CHD), 간경변 및 암이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: GalNAc 포스포라미다이트의 합성:
베타-GalNAc 포스포라미다이트의 합성
단계 1
tert-부틸디페닐실릴클로라이드 (TBDPSCl) (2.6 mL, 10 mmol) 를 실온에서 에틸렌글리콜 (3.4 mL, 60.7 mmol) 및 피리딘 (3.4 mL, 42.2 mmol) 의 혼합물에 드롭방식으로 (dropwise) 첨가했다. 3.5 시간 동안 교반 후에, 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL) 로 희석했다. 유기 상을 물 (30 mL), 20 % NaHCO3 (30 mL), 브라인 (30 ml) 으로 추출하고, Na2SO4 위에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 DCVC 크로마토그래피 (용리액 10% 내지 25% 의 헥산 중 EtOAc) 에 의해 정제했다. 생성물 (TBDPS 글리콜) 이 백색 고체, 2.54 g, 수율 84 % 로서 단리되었다.
단계 2
30 mL DCM 중 퍼아세틸화된 갈락토사민 (1.63 g, 4.17 mmol) 의 현탁액에 TMSOTf (1.90 mL, 10.4 mmol) 를 첨가하고 반응 혼합물을 40-45℃ 에서 5 h 동안 교반했다. TMSOTf (0.30 mL 2.8 mmol) 의 부가적 부분을 첨가하고 반응 혼합물을 부가적 16 h 동안 교반했다. 그 후 반응을 0 ℃ 에서 NEt3 (0.90 mL) 로 켄칭하고 DCM 로 희석하고, 차가운 포화 NaHCO3 (2×100 mL), 브라인 (50 mL) 으로 추출하고, Na2SO4 위에서 건조시키고 증발시켰다. 생성물 1 이 황색 오일, 1.40 g 미정제 수율로서 단리되었다.
단계 3
1 (1.40 g, 4.17 mmol) 및 TBDPS 글리콜 (1.08g, 1.60 mmol) 을 20 mL DCE 에 용해시켰다. 캄포르-술폰산 (CSA) (84㎎, 0.36 mmol) 을 첨가하고 반응 혼합물을 70-75℃ 에서 2 시간 동안 교반했다. 부가적 CSA (84㎎, 0.36 mmol) 을 첨가하고 반응 혼합물을 70-75℃ 에서 부가적 2 시간 동안 교반했다. NEt3 (80 mL) 을 실온에서 반응 혼합물에 첨가하고 그것을 DCM (20 mL) 로 희석했다. 혼합물을 포화 NaHCO3 (100 mL), 물 (100 ml), 브라인 (50 mL) 으로 세정하고, 유기 상을 Na2SO4 위에서 건조시키고 증발시켰다. 결과적인 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (용리액: 30% 내지 50% 의 헥산 중 EtOAc) 에 의해 정제했다. 생성물이 백색 거품 (1.59 g, 수율 70%), 1H-NMR 및 MS, HPLC 99 % 로서 단리되었다.
단계 4
NEt3*3HF (1.2 mL, 7.4 mmol) 을 12 mL THF 중 2 (776 ㎎, 1.23 mmol) 및 NEt3 (0.44 mL, 3.07 mmol) 의 용액에 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반하고, 증발시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (용리액 DCM 중 MeOH 4% 내지 10%) 에 의해 정제했다. 3 이 백색 고체 416 ㎎, 수율 86%, 1H-NMR 로서 단리되었다.
단계 5
DCM (60 mL) 및 MeCN (4 mL) 중 3 (1.51 g, 3.87 mmol) 의 용액에 MeCN (2 mL) 중 DCI (320 g, 2.71 mmol) 의 용액을 첨가하고 그에 뒤이어 DCM (2.5 mL) 중 PN2 (1.42 g, 4.47 mmol) 의 용액을 첨가했다. 반응 혼합물 실온에서 4 h 동안 교반했다. DCM (30 mL) 을 첨가하고 반응 혼합물을 NaHCO3 (2×100 mL), 물/브라인 1/1 (50 mL) 로 세정하고, Na2SO4 위에서 건조시키고, 증발시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (용리액 DCM + 3 % NEt3) 에 의해 정제하고 제 2 칼럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산) 에 의해 정제했다.
생성물이 황색 오일 (1.02 g, 수율 44 %) 로서 단리되었다. 31P-NMR (160MHz): (DMSO-d6) δ: 147.5, 147,1. 1H-NMR (400MHz): (DMSO-d6) δ: 7.80 (1H, d, J=9.0Hz), 5.22 (1H, d, J=3.1Hz), 4.97 (1H, dd, J=11.3, 3.1Hz), 4.57 (1H, dd, J=9.0, 1.6Hz), 4-08-3.99 (3H, m), 3.98 (1H, m), 3.83-3.50 (8H, m), 2.81-2.71 (2H, m), 2.10 (3H, s), 1.99 (3H, s), 1.89 (3H, s), 1.77 (3H, d, J=1.6Hz), 1.17-1.09 (12H, m). 13C-NMR (100MHz): (DMSO-d6) δ: 170.41, 170.33, 170.04, 169.64, 119.44, 101.37, 70.92, 70.33, 69.13, 67.14, 62.34, 62.17, 61.89, 58.86, 58.69, 49.70, 42.94, 42.92, 42.82, 42.80, 24.84, 24.78, 24.76, 24.70, 23.26, 23.23, 20.94, 20.87, 20.84, 20.29, 20.22.
또한 도 3 a-c 를 참고한다.
TEG 베타-GalNAc 포스포라미다이트의 합성:
단계 6
TBDPSCl (9.1 mL, 35 mmol) 를 실온에서 에틸렌글리콜 (28.4 mL, 210 mmol) 및 피리딘 (11.3 mL) 의 혼합물에 드롭방식으로 첨가했다. 2 h 동안 교반 후에 반응 혼합물을 EtOAc (150 mL) 로 희석하고, 물 (100 mL), 브라인 (100 mL) 으로 추출하고, Na2SO4 위에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 DCVC 크로마토그래피 (용리액 헥산 중 EtOAc 10 % 내지 30 %) 에 의해 정제했다. TBDPS 트리에틸렌글리콜이 점성 오일, 10.7 g, 수율 79 % 로서 단리되었다.
단계 7
DCE (130 mL) 중 1 (app 7.4 g, 20.6 mmol) 및 TBDPS 트리에틸렌글리콜 (6.68 g, 17.2 mmol) 의 혼합물에, 캄포르-술폰산 (CSA, 0.40, 1.72 mmol) 을 첨가하고 반응 혼합물을 70-75 ℃ 에서 18 h 동안 교반했다. NEt3 (0.48 mL) 을 실온에서 반응 혼합물에 첨가하고, 그 후 DCM (80 mL) 로 희석하고, 포화 NaHCO3 (2×100 mL), 물 (100 mL), 브라인 (100 mL) 으로 추출하고, Na2SO4 위에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 크로마토그래피 (용리액 헥산 중 EtOAc 66% 내지 80%) 에 의해 정제했다. 2 가 약간 황색 오일 8.90 g, 1H-NMR, MS [M+1]+ 718, HPLC 순도 95 %, 수율 69 % 로서 단리되었다,
단계 8
THF (125 mL) 중 2 (8.90 g, 12.4 mmol) 의 용액에, NEt3 (4.3 mL, 31 mmol) 및 NEt3 3HF (12 mL, 74 mmol) 를 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 24 h 동안 교반하고, 그 후 증발시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (용리액 4% 내지 9% 의 DCM 중 MeOH) 에 의해 정제했다. 3 이 약간 황색 오일 (4.40 g, 1H-NMR, 수율 71 %) 로서 단리되었다.
단계 9
DCM (100 mL) 및 MeCN (3.5 mL) 중 3 (4.4 g, 9.18 mmol) 의 용액에 MeCN (6 mL) 중 DCI 의 용액을 첨가하고 그에 뒤이어 DCM (5 mL) 중 PN2 (3.18, 10.6 mmol) 의 용액을 첨가했다. 반응 혼합물을 실온에서 22 h 동안 교반했다 (완전한 전환이 아님). DCM (45 mL) 을 첨가하고 반응 혼합물을 NaHCO3 (2×100 mL), 물/브라인 1/1 (50 mL) 로 추출하고, Na2SO4 위에서 건조시키고 증발시켰다. 잔류물을 칼럼 크로마토그래피 (용리액 EtOAc/헥산 1/4 + 9 % NEt3) 에 의해 정제했다. 1.52 g 의 3 을 재생하고, 동일한 방법 (PN2 1.09 g 3.64.6 mmol, 0.26 g 2.22 mmol, DCM 35 mL, MeCN 3.5 mL, 반응 시간 24 h) 에 의해 4 로 전환시키고 불순물 분획과 함께 제 1 크로마토그래피로부터 정제했다. 4 가 약간 황색 오일 (2.45 g 수율 38 %) 로서 단리되었다, 31P-NMR (160MHz): (DMSO-d6) δ: 147.3; 1H-NMR (400MHz): (DMSO-d6) δ: 7.79 (1H, d, J = 9.0Mz), 5.21 (1H, d, J = 3.5Hz),4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.5Hz), 4.55 (1H, d, J = 8.6Hz), 4.11-3.97 (3H, m), 3.88 (1H, m), 3.81-3.47 (16H, m), 2.78-2.74 (2H, m), 2.11 (3H, s), 2.00 (3H, s), 1.89 (3H, s), 1.77 (3H, s), 1.16-1.10 (12H, m). MS [M+1]+ 680.5.
또한 도 3 d-e 를 참고한다
GalNAc 포스포라미다이트의 아노머 혼합물의 대안적 합성
아세틸 클로라이드를 0℃ 에서 DMF 중 NAcGal 및 TBDPS 글리콜의 용액에 드롭방식으로 첨가했다. 반응 혼합물을 70℃ 에서 완료될 때까지 교반했다. 반응 혼합물을 0℃ 로 냉각시키고 과잉량의 무수 피리딘으로 켄칭했다. 반응 혼합물을 실온이 되게 놔두고 과잉량의 아세트산 무수물을 첨가했다. 혼합물을 완료될 때까지 교반했다. Medina et al, Biomaterials 32 (2011), 4118-4129 (본원에 참조로 포함됨) 에 기초한다.
이 조성물을 상기 반응 단계 4 및 5 에 적용하여 GalNAc 포스포라미다이트의 아노머 혼합물, 즉 알파- 및 베타-GalNAc 둘다를 함유하는 혼합물을 얻을 수 있다. 알파-GalNAc 포스포라미다이트가 요망되는 경우에 이것을 아노머 혼합물로부터 정제할 수 있다.
실시예 2: GalNAc 포스포라미다이트 통합을 사용하는 올리고뉴클레오티드의 합성
올리고뉴클레오티드를 NittoPhase Unylinker 200 지지체 위에서 포스포라미다이트 접근법을 사용하여 20 μmol 스케일로 합성했다. 합성의 마지막에, 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 농축된 암모늄 하이드록사이드를 사용하여 16 시간 동안 60℃ 에서 절단했다. 올리고뉴클레오티드를 역상 HPLC 에 의해 정제하고 UPLC 에 의해 특성분석하고, 분자 질량을 ESI-MS 에 의해 추가로 확인했다.
올리고뉴클레오티드의 신장:
β-시아노에틸-포스포라미다이트 (DNA-A(Bz), DNA-G(ibu), DNA-C(Bz), DNA-T, LNA-5-메틸-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf), LNA-T, GalNAc 포스포라미다이트 X 및 Y 및 스페이서 포스포라미다이트 C3 및 스페이서 18 (Glen Research, Sterling, VA) 의 커플링을 아세토니트릴 중 포스포라미다이트 (0.1 M) 및 활성화제로서의 아세토니트릴 중 DCI (4,5-디시아노이미다졸) (0.25 M) 의 용액을 사용하여 수행했다. 포스포르티오에이트 연결의 도입을 위한 티올화 (thiolation) 를 크산탄 하이드라이드 (아세토니트릴/피리딘 9:1 중 0.01 M) 를 사용하여 수행했다. 포스포르디에스테르 연결을 THF/피리딘/물 7:2:1 중 0.02 M 요오드를 사용하여 도입했다. 시약의 나머지는 올리고뉴클레오티드 합성에 전형적으로 사용되는 것이었다.
RP-HPLC 에 의한 정제:
미정제 화합물을 제조용 역상 HPLC 에 의해 Phenomenex Jupiter C18 10μ 150x10 mm 칼럼 위에서 정제했다. 0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 8 및 아세토니트릴을 완충액으로서 5 mL/min 의 유속으로 사용했다. 수집된 분획을 동결건조시켜 정제된 화합물을 전형적으로 백색 고체로서 얻었다.
표 1 의 GalNac-핵산 화합물을 다음 올리고뉴클레오티드 서열 5'GmCattggtatTmCA-3' (SEQ ID NO: 1) 또는 5' caGmCattggtatTmCA-3' (SEQ ID NO: 2) 을 사용하여 합성했다. SEQ ID NO: 1 에서의 모든 연결은 포스포티오에이트 연결이다. SEQ ID NO: 2 에서 처음 2 개의 뉴클레오시드 (ca) 는 포스포디에스테르 연결에 의해 연결되어 있고, 나머지 연결은 포스포티오에이트 연결이다. 대문자는 LNA 단량체를 나타내고 (mC 는 5-메틸시토신 LNA 단량체이다), 소문자는 DNA 단량체이다.
표 1:
컨트롤 화합물은 SEQ ID NO: 1 의 미컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드이다 (즉 어떠한 GalNAc 모이어티도 부착되어 있지 않음). GalNAc2 화합물은 아래 제시된 GalNAc2 클러스터에 부착된 SEQ ID NO: 1 이고, 올리고뉴클레오티드는 물결선으로 표시되어 있고 GalNAc2 구축물에 포스포티오에이트 기로 연결되어 있다. GalNAc2 클러스터에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드는 WO 2014/118267 에 기재되어 있고 화합물은 WO 2014/076196 (본원에 참조로 포함됨) 에서의 SEQ ID NO: 20 에 상응한다.
실시예 3: 생체내에서 GalNAc-컨쥬게이트를 이용하는 ApoB mRNA 의 녹 다운 및 총 콜레스테롤.
상이한 GalNAc 구축물의 효과를 비교하기 위해 C57BL6/J 마우스에 단일 투여물 염분 (saline) 또는 0.25 ㎎/kg GalNAc2 클러스터 컨쥬게이트된 LNA-안티센스 올리고뉴클레오티드 (GalNAc2) 또는 등몰 양의 본 발명의 GalNAc 구축물에 컨쥬게이트된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (도 6 E, I, M 및 N) 또는 미컨쥬게이트된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (세부사항에 관해 실시예 2, 표 1 참고) 를 sc 주입하고 days 10 에 희생시키고 여기에서 간 및 신장을 단리했다.
각각의 화합물을 체중이 대략 20 g 인 5 마리의 마우스를 포함하는 동물 그룹에서 시험했다. 혈청 샘플을 day 3 및 7 에 수집하고 (50 ㎕/마우스), 희생 시에 총 혈청을 수집하여 아래 프로토콜에 기재된 바와 같이 총 혈청 콜레스테롤을 확인했다. 결과가 도 8 에 제시되어 있다.
희생 시에 RNA 를 간 및 신장으로부터 단리하고 ApoB 특이적 프라이머 및 프로브를 사용하는 qPCR 에 적용하여 아래 프로토콜에 기재된 바와 같이 ApoB mRNA 녹다운을 분석했다. 결과가 도 7 에 제시되어 있다.
결론:
모든 GalNAc 컨쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드는 미컨쥬게이트된 ApoB 표적화 LNA 올리고뉴클레오티드와 비교할 때 간에서 ApoB mRNA 의 개선된 녹 다운을 보였다 (도 7). GalNAc 포스포라미다이트를 갖는 구축된 새로운 화합물 (도 6 E, I, M 및 N) 은 모두 표적 mRNA (ApoB mRNA) 에 대해 GalNAc2 클러스터 (GalNAc2) 와 비슷한 효과를 나타냈으며, 이는 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티의 상이한 링커 길이 및 디자인이 ASGP 수용체에 의해 관용된다는 것을 보여준다. 신장에서의 ApoB mRNA 의 하향 조절 (도 7B) 은 미컨쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드 (컨트롤) 의 경우가 GalNAc 컨쥬게이트된 화합물 (도 6 E, I, M 및 N 및 GalNAc2) 의 경우보다 더 높으며, 이는 예상되는 GalNAc 모이어티가 LNA 올리고뉴클레오티드의 간 흡수를 개선하고 신장 흡수를 저하시킨다는 것을 시사한다. 총 콜레스테롤 수준에 대한 저하 효과 (도 8) 는 미컨쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드와 비교할 때 모든 GalNAc 컨쥬게이트된 LNA 올리고뉴클레오티드에서 개선된다.
재료 및 방법:
ApoB mRNA 녹다운에 관한 분석. 동물을 70% CO2-30% O2 로 마취시키고 경추 탈골에 의해 희생시켰다. 큰 간엽의 이분의 일 및 하나의 신장을 갈고 RNAlater 에 담그었다.
총 RNA 를 최대 30 ㎎ 의 조직/샘플로부터 추출하고, 용해 완충액 (MagnaPure LC RNA Isolation Tissue buffer (#03604721001; Roche)) 의 존재 하에 제조사의 지침에 따라 비드-밀링 (bead-milling) 하여 균질화했다. RNA 를 MagnaPure 96 System; Roche 에서 Cellular RNA Large Volume Kit (#05467535001; Roche) 를 제조사의 표준 프로토콜에 따라 사용하여 정제했다. 제 1 가닥 합성을 Ambion 으로부터의 Reverse Transcriptase 시약을 제조사의 지침에 따라 사용하여 수행했다.
각각의 샘플에 대해 0.5 ㎍ 총 RNA 를 RNase 없는 H2O 를 사용하여 (10.8 ㎕) 로 조정하고 2 ㎕ 랜덤 데카머 (decamer) (50 μM) 및 4 ㎕ dNTP 믹스 (mix) (2.5 mM 각각의 dNTP) 와 혼합하고 70 ℃ 로 3 min 동안 가열하고 그 후 샘플을 얼음 위에서 신속히 냉각시켰다. 2 ㎕ 10x Buffer RT, 1 ㎕ MMLV Reverse Transcriptase (100 U/㎕) 및 0.25 ㎕ RNase 저해인자 (10 U/㎕) 를 각각의 샘플에 첨가하고, 그에 뒤이어 42 ℃ 에서 60 min 동안 인큐베이션하고, 95℃ 에서 10 min 동안 효소를 열 불활성화시키고 샘플을 4 ℃ 로 냉각시켰다. cDNA 샘플을 1: 5 로 희석하고 Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems Cat #4364103) 및 Taqman 유전자 발현 어세이 (mApoB, Mn01545150_m1 및 mGAPDH #4352339E) 를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하는 RT-QPCR 에 적용하고 Applied Biosystems RT-qPCR 기구 (7500/7900 또는 ViiA7) 에서 고속 모드 (fast mode) 에서 가공했다.
혈청 콜레스테롤 분석: 혈청 제조를 위해 희생 직전에 S-모노벳 혈청-겔 바이알 (S-monovette Serum-Gel vial) (Sarstedt, Numbrecht, Germany) 을 사용하여 안구뒤 부비강 혈액을 수집했다 ABX Pentra 콜레스테롤 CP (Triolab, Brondby, Denmark) 를 제조사의 지침에 따라 사용하여 혈청을 총 콜레스테롤에 관해 분석했다.
항목
본 발명은 추가로 하기 항목에 의해 특징지어진다.
항목 1: 일반식 (I) 을 갖는 화합물
식에서
NR'R" 는 이차 아미노 기이며, 여기에서 R' 및 R" 는 독립적으로 C1-C6-알킬로부터 선택되거나 또는 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고 이는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성하고;
A 는 C1-C6-알킬 기 또는 보호된 히드록시- 또는 티오-기이고;
G 는 일반식 (II) 로 표시되고
식에서 A1 은 적합한 히드록실 보호기이고, 이는 각각의 존재에서 동일 또는 상이할 수 있고;
L 은 C3-C19-알킬렌 (C6 알킬렌은 아님), C2-C30-알케닐렌, -CH2CH2-(OCH2CH2)0-4-OCH2CH2- 및 CH2CH2-(OCH2CH2)6-8-OCH2CH2 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커 기임.
항목 2: 링커 기 L 은 C7-C19-알킬렌, C2-C20-알케닐렌, 및 -CH2CH2-(OCH2CH2)0-3-OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 1 에 따른 화합물.
항목 3: 링커 기 L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, , -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 1 또는 2 에 따른 화합물.
항목 4: 링커 기 L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, 및 -(CH2)8- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 5: 링커 기 L 은 CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2-로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 6: GalNAc 모이어티는 베타 입체배치로 존재하는, 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 7: 이차 아미노 기 -NR'R" 는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디이소프로필아미노, 디부틸아미노, 피롤리디노, 피페리디노, 2,6-디메틸피페리디노, 모르폴리노, 이미다졸릴 및 4-메틸이미다졸릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 8: A 는 2-시아노에톡시, 2-시아노에틸티오, 메톡시, 에톡시, S-이소부타노일-2-(2-메르캅토에톡시)에톡시, S-피발로일-2-(2-메르캅토에톡시)에톡시, S-피발로일-2-메르캅토에톡시, 메틸 및 에틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 9: 히드록실 보호기 A1 은 아실 기 및 실릴 기로부터, 바람직하게는 아세틸, 벤조일, 페녹시-아세틸, 피발로일, 디메톡시트리틸 (DMT), 이소부티릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 및 이소프로필디메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 9a: 당의 위치 6 에서의 히드록실 보호기 A1 은 디메톡시트리틸 (DMT) 인, 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 10: A 은 -O-CH2CH2CN 이고, A1 은 아세틸이고, R' 및 R" 는 각각 이소프로필이고, L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터, 바람직하게는 -(CH2)2- 및 -(CH2)3- 로부터 선택되는, 항목 1 내지 9a 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 11: 일반식 (III) 을 갖는 화합물
식에서
Z 는 핵산 분자이고;
T 는 일반식 (IV) 로 또는 대안적으로 일반식 (VI) 로 표시되고
여기에서
R2 는 H 또는 -(CH2)q-R1 을 나타내고,
R1 및 R3 은 각각의 존재에서 일반식 (V) 로 표시되고,
식에서 각각의 존재에서 독립적으로
V 는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
W 는 -(CH2)2-15- 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
Y 는 O 또는 S 이고;
m 은 1 내지 3 의 정수이고;
n 은 0 내지 5 의 정수이고;
p 는 0 내지 3 의 정수이고;
q 는 1 내지 2 의 정수이고;
r 은 1 내지 5 의 정수이고;
화학식 (V) 및 (VI) 에서 각각의 존재에서 독립적으로
s 는 0 또는 1 이고
G 는 일반식 (II)' 로 표시되고
식에서 A1 은 H 또는 적합한 히드록실 보호기이고, 이는 각각의 존재에서 동일 또는 상이할 수 있고; L 은 C2-C20-알케닐렌, -CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
화학식 (III), (V) 및 (VI) 에서 각각의 존재에서 독립적으로
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 -O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고,
여기에서 R1, R3 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 또는 화학식 (VI) 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서 또는 T 가 화학식 (VI) 로 표시되는 경우에 핵산 분자에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐.
항목 12: s 는 1 인, 항목 11 에 따른 화합물.
항목 13: s 는 0 인, 항목 11 에 따른 화합물.
항목 14: T 는 화학식 (VI) 로 표시되고 s 는 0 인, 항목 11 에 따른 화합물.
항목 15: 화학식 (II') 에서 GalNac 모이어티는 베타 입체구조로 존재하는, 항목 11 내지 14 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 16: W 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-, -CH2CH2CH2-, 및 -(CH2)12- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 11 내지 15 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 17: 각각의 존재에서 독립적으로
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 이거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 이거나, 또는
X1 은 -OH 이고 X2 는 =S 이거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =S 이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -SH 인, 항목 11 내지 16 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 18: R1, R3 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서 분지점 탄소 원자로 끝나는 연속 사슬은
9 내지 23 개 원자의 길이를 갖는, 항목 11 내지 17 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 19: 핵산 분자는 DNA, RNA 및 핵산 유사체 분자로부터, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드, 소 간섭 RNA, 및 마이크로RNA 로부터 선택되는, 항목 11 내지 18 에 따른 화합물.
항목 20: 핵산 분자는 잠금 핵산 뉴클레오티드를 함유하는, 항목 11 내지 19 에 따른 화합물.
항목 21: 핵산 분자는 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결을 함유하는, 항목 11 내지 20 에 따른 화합물.
항목 22: 모든 DNA 및 RNA 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결되어 있는, 항목 11 내지 21 에 따른 화합물.
항목 23: 핵산 분자에서 모든 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 유사체는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결되어 있는, 항목 11 내지 22 에 따른 화합물.
항목 24: 핵산 분자의 5' 말단은 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티에 부착되어 있는, 항목 11 내지 23 중 어느 하나에 따른 화합물.
항목 25: PO 링커는 핵산 및 GalNAc 컨쥬게이트 모이어티 사이에 위치해 있는, 항목 11 내지 24 에 따른 화합물.
항목 26: 화합물은 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합할 수 있는, 항목 11 내지 25 에 따른 화합물.
항목 27: 하기 단계를 포함하는, 항목 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 화합물의 제조 방법:
(i) N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 의 탄소 원자 1 및 2 사이에 내부 옥사졸린 고리를 입체선택적으로 형성하는 단계;
(ii) 단계 (i) 의 산물을 일반식 HO-L-O-A3 을 갖는 화합물과 반응시키는 단계로서, 식에서
A3 은 적합한 보호기이고
L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커 기이며,
그에 의해 GalNAc 고리의 탄소 원자 1 에서 에테르 결합을 형성하는 단계;
(iii) 단계 (ii) 의 산물에서 -O-A3 기를 탈보호하여, 그에 의해 탈보호된 -OH 기를 제공하는 단계,
(iv) 단계 (iii) 의 산물을 포스포르디아미다이트와 반응시켜, 그에 의해 항목 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 화합물을 제공하는 단계.
항목 28: 하기 단계를 포함하는, 핵산 컨쥬게이트의 제조 방법:
(i) 핵산 분자를 고체 지지체 위에 제공하는 단계;
(ii) 임의로 브랜처 분자를 핵산 분자에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하며, 여기에서 부가 후에 상기 브랜처 분자는 바람직하게는 일반식 (IV a) 로 표시되는 구조를 초래하는 단계
식에서
A4 는 적합한 보호기이고;
V1 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V2 는 부재하거나 또는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V3 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고;
m 은 1 내지 3 의 정수이고;
n 은 0 내지 5 의 정수이고;
p 는 0 내지 3 의 정수이고; 각각의 존재에서 독립적으로
q 는 1 내지 2 의 정수이고;
q' 는 0 내지 2 의 정수이고;
r 은 1 내지 5 의 정수이고;
단, V2 가 부재할 때, q' 는 0 이고 화학식 (IV a) 에서 V2 에 부착된 -(CH2)r-OA4 는 또한 부재하고;
(iii) 임의로 스페이서 포스포라미다이트 분자를 브랜처 분자의 분지의 각각에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하며, 부가 후에 상기 스페이서 분자는 바람직하게는 일반식 (V a) 로 표시되는 구조를 초래하는 단계
식에서 각각의 존재에서 독립적으로
A5 는 적합한 보호기이고;
W 는 -(CH2)2-15- 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택됨;
(iv) 브랜처 분자가 존재하지 않는 경우에, 항목 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 화합물을 핵산 분자의 반응성 말단과 반응시키거나, 또는, 브랜처 분자가 존재하고 스페이서가 존재하지 않는 경우에, 항목 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 화합물을 분지의 각각의 반응성 말단과 반응시키거나, 또는, 스페이서가 존재하는 경우에, 항목 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 화합물을 스페이서의 각각의 반응성 말단과 반응시키는 단계; 및
(v) 단계 (iv) 의 산물을 고체 지지체로부터 절단하는 단계;
여기에서 항목 1-9 중 임의의 하나에 따른 화합물에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IVa) 에서의 부착점 또는 핵산 분자에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐.
항목 29: 핵산 분자는 DNA, RNA 및 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 분자로부터 선택되고, 특히 핵산 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 갭머, 소 간섭 RNA, 및 마이크로RNA 로부터 선택되는, 항목 28 에 따른 방법.
항목 30: 핵산 분자는 잠금 핵산 뉴클레오티드를 함유하는, 항목 28 또는 29 에 따른 방법.
항목 31: 핵산 분자는 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트 뉴클레오시드간 연결을 함유하는, 항목 28 내지 30 중 임의의 하나에 따른 방법.
항목 32: 모든 DNA 및 RNA 뉴클레오시드는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결되어 있는, 항목 28 내지 31 중 임의의 하나에 따른 방법.
항목 33: 핵산 분자에서 모든 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오시드 유사체는 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트와 연결되어 있는, 항목 28 내지 32 중 임의의 하나에 따른 방법.
항목 34: 브랜처 분자, 스페이서 분자 또는 항목 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 화합물은 핵산 분자의 5' 말단과 반응되는, 항목 28 내지 33 중 임의의 하나에 따른 방법.
항목 35: PO 링커는 핵산 분자 및 브랜처 분자, 스페이서 분자 또는 항목 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 화합물 사이에 위치해 있는, 항목 28 내지 34 중 임의의 하나에 따른 방법.
항목 36: 브랜처 분자는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항목 28 내지 35 중 임의의 하나에 따른 방법:
1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미도]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)] 포스포라미다이트;
트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트; 및
트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]메틸렌옥시프로필-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트.
항목 37: 스페이서 포스포라미다이트 분자는 일반식 (VII) 로 표시되는, 항목 28 내지 36 중 임의의 하나에 따른 방법
식에서 A2 는 적합한 보호기, 바람직하게는 -CH2CH2CN 이고, A6 은 적합한 보호기 예컨대 4',4'-디메톡시트리틸이고 R4 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-, -CH2CH2CH2-, 및 -(CH2)12- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고; 및
NR'R" 는 이차 아미노 기이며, 여기에서 R' 및 R" 는 독립적으로 C1-C6-알킬로부터 선택되거나 또는 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하며, 이는 치환될 수 있고 이는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있음.
항목 38: 항목 10 내지 26 중 임의의 하나에 따른 화합물의 제조를 위한 항목 1 내지 9 중 임의의 하나에 따른 화합물의 용도.
항목 39: 약제로서의 항목 10 내지 26 중 임의의 하나에 따른 화합물의 용도.
항목 40: 간 mRNA 표적의 감소에서 사용하기 위한 항목 10 내지 26 중 임의의 하나에 따른 화합물.
항목 41: 간 질환의 치료에서 사용하기 위한 항목 10 내지 26 중 임의의 하나에 따른 화합물.
항목 42: 대사 질환 또는 장애, 또는 간 질환 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한, 특히 질환 예컨대 간염 (바이러스 간염, 예컨대 HBV 또는 HCV 을 포함), 간 지방증 (대사 기능부전을 포함), 죽상동맥경화증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 가족성 고콜레스테롤혈증 예를 들어 아포지질단백질 B 에서 기능 돌연변이의 획득, HDL/LDL 콜레스테롤 불균형, 이상지질혈증, 예를 들어, 가족성 고지질혈증 (FCHL), 후천 고지질혈증, 스타틴-저항성 고콜레스테롤혈증, 관상 동맥 질환 (CAD), 및 관상동맥 심장 질환 (CHD), 급성 관상동맥 증후군 (ACS), 간-섬유증 (또는 간-섬유증과 연관된 질환), 간경변 및 암의 치료를 위한 항목 10 내지 26 중 임의의 하나에 따른 화합물.
항목 43: 인간 또는 동물에게 항목 10 내지 26 중 임의의 하나에 따른 화합물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
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<110> Roche Innovation Center Copenhagen A/S
<120> GalNAc PHOSPHORAMIDITES AND THEIR USE
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<223> oligonucleotide
<220>
<221> phosphorothiate Internucleoside linkages
<222> (1)..(13)
<220>
<221> LNA nucleosides, LNA C is 5-methyl C
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<220>
<221> LNA nucleosides, LNA C is 5-methyl C
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<400> 1
gcattggtat tca 13
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide
<220>
<221> phosphodiester lnternucleoside linkages
<222> (1)..(3)
<220>
<221> LNA nucleosides, LNA C is 5-methyl C
<222> (3)..(5)
<220>
<221> phosphorothiate Internucleoside linkages
<222> (4)..(15)
<220>
<221> LNA nucleosides, LNA C is 5-methyl C
<222> (13)..(15)
<400> 2
cagcattggt attca 15
Claims (17)
- 일반식 (I) 을 갖는 화합물
식에서
NR'R" 는 이차 아미노 기이며, 여기에서 R' 및 R" 는 독립적으로 C1-C6-알킬로부터 선택되거나 또는 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리 (이는 치환될 수 있고 이는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있음) 를 형성하고;
A 는 C1-C6-알킬 기 또는 보호된 히드록시- 또는 티오-기이고;
G 는 일반식 (II) 로 표시되고
식에서 A1 은 적합한 히드록실 보호기이고, 이는 각각의 존재에서 동일 또는 상이할 수 있고;
L 은 C2-C30-알케닐렌, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터, 더욱 바람직하게는 -(CH2)2-, -(CH2)3-, 및 -(CH2)8- 로부터 선택되는 링커 기임. - 제 1 항에 있어서, 링커 기는 CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로부터 선택되는 화합물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
이차 아미노 기 -NR'R" 는 디메틸아미노, 디에틸아미노, 디이소프로필아미노, 디부틸아미노, 피롤리디노, 피페리디노, 2,6-디메틸피페리디노, 모르폴리노, 이미다졸릴 및 4-메틸이미다졸릴로 이루어지는 군으로부터 선택되고/거나
A 는 2-시아노에톡시, 2-시아노에틸티오, 메톡시, 에톡시, S-이소부타노일-2-(2-메르캅토에톡시)에톡시, S-피발로일-2-(2-메르캅토에톡시)에톡시, S-피발로일-2-메르캅토에톡시, 메틸 및 에틸로 이루어지는 군으로부터 선택되고/거나,
히드록실 보호기 A1 은 아실 기 및 실릴 기로부터, 바람직하게는 아세틸, 벤조일, 페녹시-아세틸, 피발로일, 이소부티릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴 및 이소프로필디메틸실릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
A 는 -O-CH2CH2CN 이고, A1 은 아세틸이고, R' 및 R" 는 각각 이소프로필이고, L 은 -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터, 바람직하게는 -(CH2)2- 및 -(CH2)3- 로부터 선택되는 화합물. - 일반식 (III) 을 갖는 화합물
식에서
Z 는 핵산 분자이고;
T 는 일반식 (IV) 로 또는 대안적으로 일반식 (VI) 로 표시되고
화학식 (IV) 에서
R2 는 H 또는 -(CH2)q-R1 을 나타내고,
R1 및 R3 은 각각의 존재에서 일반식 (V) 로 표시되고
,
식에서 각각의 존재에서 독립적으로
V 는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
W 는 -(CH2)2-15- 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
Y 는 O 또는 S 이고;
m 은 1 내지 3 의 정수이고;
n 은 0 내지 5 의 정수이고;
p 는 0 내지 3 의 정수이고;
q 는 1 내지 2 의 정수이고;
r 은 1 내지 5 의 정수이고;
,
화학식 (V) 및 (VI) 에서 각각의 존재에서 독립적으로
s 는 0 또는 1 이고
G 는 일반식 (II)' 로 표시되고
식에서 A1 은 H 또는 적합한 히드록실 보호기이고, 이는 각각의 존재에서 동일 또는 상이할 수 있고; L 은 C2-C20-알케닐렌, -CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
화학식 (III), (V) 및 (VI) 에서 각각의 존재에서 독립적으로
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 -O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고,
여기에서 R1, R3 또는, R2 가 H 이 아닌 경우에, R2 에서 또는 화학식 (VI) 에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IV) 에서 또는 T 가 화학식 (VI) 로 표시되는 경우에 핵산 분자에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐. - 제 5 항에 있어서, s 는 1 이고, W 는 바람직하게는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-, -CH2CH2CH2-, 및 -(CH2)12- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물.
- 제 5 항에 있어서, s 는 0 인 화합물.
- 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 존재에서 독립적으로
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 이거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 이거나, 또는
X1 은 -OH 이고 X2 는 =S 이거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =S 이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -SH 인 화합물. - 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 아시알로당단백질 수용체 (ASGPR) 에 결합할 수 있는 화합물.
- 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조 방법:
(i) N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 의 탄소 원자 1 및 2 사이에 내부 옥사졸린 고리를 입체선택적으로 형성하는 단계;
(ii) 단계 (i) 의 산물을 일반식 HO-L-O-A3 을 갖는 화합물과 반응시키는 단계로서, 식에서
A3 은 적합한 보호기이고,
L 은 C2-C20-알케닐렌, -CH2CH2-(OCH2CH2)0-6-OCH2CH2, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)7-, -(CH2)8-, -(CH2)9-, -(CH2)10-, -(CH2)11-, -(CH2)12-, -CH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, 및 -CH2CH2(OCH2CH2)2OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 링커 기이며,
그에 의해 GalNAc 고리의 탄소 원자 1 에서 에테르 결합을 형성하는 단계;
(iii) 단계 (ii) 의 산물에서 -O-A3 기를 탈보호하여, 그에 의해 탈보호된 -OH 기를 제공하는 단계,
(iv) 단계 (iii) 의 산물을 포스포르디아미다이트와 반응시켜, 그에 의해 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 제공하는 단계. - 하기 단계를 포함하는, GalNAc-핵산 컨쥬게이트의 제조 방법:
(i) 핵산 분자를 고체 지지체 위에 제공하는 단계;
(ii) 임의로 브랜처 분자 (brancher) 를 핵산 분자에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하는 단계;
(iii) 임의로 스페이서 포스포라미다이트 분자를 브랜처 분자의 분지의 각각에 포스포라미다이트 화학을 사용하여 부가하는 단계;
(iv) 브랜처 분자가 존재하지 않는 경우에, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 핵산 분자의 반응성 말단과 반응시키거나, 또는, 브랜처 분자가 존재하는 경우에, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 분지의 각각의 반응성 말단과 반응시키거나, 또는, 스페이서가 존재하는 경우에, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 스페이서의 각각의 반응성 말단과 반응시키는 단계; 및
(v) 단계 (iv) 의 산물을 고체 지지체로부터 절단하는 단계;
여기에서 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고 컨쥬게이트 모이어티를 핵산에 연결하는 인 원자로 끝나는 연속 사슬은 10 개 원자의 최소 길이 및 34 개 원자의 최대 길이를 가짐. - 제 11 항에 있어서, 부가 후에 상기 브랜처 분자는 바람직하게는 일반식 (IV a) 로 표시되는 구조를 초래하는 방법
식에서
A4 는 적합한 보호기이고;
V1 는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V2 는 부재하거나 또는 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
V3 은 -O-, -NH-CO- 및 -CO-NH- 로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고;
m 은 1 내지 3 의 정수이고;
n 은 0 내지 5 의 정수이고;
p 는 0 내지 3 의 정수이고; 각각의 존재에서 독립적으로
q 는 1 내지 2 의 정수이고;
q' 는 0 내지 2 의 정수이고;
r 은 1 내지 5 의 정수이고;
단, V2 가 부재할 때, q' 는 0 이고 화학식 (IV a) 에서 V2 에 부착된 -(CH2)r-OA4 는 또한 부재하고;
부가 후에 상기 스페이서 포스포라미다이트 분자는 바람직하게는 일반식 (V a) 로 표시되는 구조를 초래하고
,
식에서 각각의 존재에서 독립적으로
A5 는 적합한 보호기이고;
W 는 -(CH2)2-15- 및 -CH2CH2(OCH2CH2)0-4OCH2CH2- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
X1 은 -OH 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 O- 이고 X2 는 =O 및 =S 로부터 선택되거나, 또는
X1 은 =O 이고 X2 는 -CH3, -SH, -OR, -NHR, 및 -BH3 로부터 선택되며, 여기에서 R 은 각각의 존재에서 독립적으로 C1-C6 알킬 기이거나, 또는
X1 은 =S 이고 X2 는 -CH3 및 -SH 로부터 선택되고;
여기에서 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물에서의 링커 L 의 제 1 원자로부터 시작하고, 화학식 (IVa) 에서의 부착점 또는 핵산 분자에서의 부착점으로 끝나는 연속 사슬은 8 개 원자의 최소 길이 및 30 개 원자의 최대 길이를 가짐. - 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 브랜처 분자는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법: 1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)펜틸아미도]프로필-2-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)] 포스포라미다이트; 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]에틸-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트; 및 트리스-2,2,2-[3-(4,4'-디메톡시트리틸옥시)프로필옥시메틸]메틸렌옥시프로필-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미다이트.
- 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 포스포라미다이트 분자는 일반식 (VII) 로 표시되는 방법:
,
식에서 A2 는 적합한 보호기, 바람직하게는 -CH2CH2CN 이고, A6 은 적합한 보호기 예컨대 4',4'-디메톡시트리틸이고 R4 는 -CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-, -CH2CH2(OCH2CH2)4OCH2CH2-, -CH2CH2CH2-, 및 -(CH2)12- 로 이루어지는 군으로부터 선택되고;
NR'R" 는 이차 아미노 기이며, 여기에서 R' 및 R" 는 독립적으로 C1-C6-알킬로부터 선택되거나 또는 R' 및 R" 는 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하며, 이는 치환될 수 있고 이는 N 및 O 로부터 선택되는 하나 추가의 헤테로원자를 함유할 수 있음. - 제 11 항에 있어서, 핵산 분자는 DNA, RNA 및 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 분자로부터 선택되고, 특히 핵산 분자는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 갭머 (gapmer), 소 간섭 RNA, 및 마이크로RNA 로부터 선택되고, 핵산 분자는 바람직하게는 하나 이상의 잠금 (locked) 핵산 뉴클레오시드를 함유하는 방법.
- 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
- 약제로서의, 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
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