CN114867856A - Saraf抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途 - Google Patents

Saraf抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种SARAF抑制剂，其用于治疗HBV感染，特别是慢性HBV感染。本发明特别地涉及SARAF抑制剂用于使cccDNA，诸如HBVcccDNA去稳定的用途。本发明还涉及与SARAF互补并且能够降低SARAFmRNA的水平的核酸分子。本发明还包括一种药物组合物及其在HBV感染的治疗中的用途。

Description

SARAF抑制剂用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途
技术领域
本发明涉及SARAF抑制剂，所述SARAF抑制剂用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染，特别是慢性HBV感染。本发明特别地涉及SARAF抑制剂用于使cccDNA，诸如HBVcccDNA去稳定的用途。本发明还涉及核酸分子，诸如寡核苷酸，包括siRNA、shRNA和反义寡核苷酸，所述核酸分子与SARAF互补，并且能够减少SARAF的表达。本发明还包括一种药物组合物及其在HBV感染的治疗和/或预防中的用途。
背景技术
乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染病，乙型肝炎病毒是一种小型的嗜肝病毒，其可通过逆转录复制。慢性HBV感染是导致严重肝病(例如肝硬化和肝细胞癌)的关键因素。目前对慢性HBV感染的治疗是基于施用聚乙二醇化的1型干扰素或核苷(核苷酸)类似物的，例如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺，它们可靶向病毒聚合酶(一种多功能逆转录酶)。治疗是否成功通常以乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的损失量来衡量。然而，由于感染后乙型肝炎病毒DNA仍然存在于体内，因此很难完全清除HBsAg。HBV持续性是由附加体形式的HBV基因组介导的，该基因组稳定地存在于细胞核中。这种附加体形式被称为″共价闭合环状DNA″(cccDNA)。cccDNA可作为所有HBV转录本的模板，包括前基因组RNA(pgRNA，一种病毒复制中间体)。少量cccDNA拷贝的存在可能足以再次引发全面的HBV感染。目前对HBV的治疗并不针对cccDNA。然而，慢性HBV感染的治愈需要消除cccDNA(由Nassal，Gut.2015年12月；64(12)：1972-84.doi：10.1136/gutjnl-2015-309809综述)。
SARAF(钙库操控性钙内流相关调节因子、SOCE相关调节因子)是参与保护细胞免受Ca2+过度充盈的钙库操控性Ca2+内流(SOCE)的负调节因子。SARAF也被称为″HBV X-反式激活基因3蛋白″、″HBV XAg-反式激活蛋白3″、″FOAP-7″或″跨膜蛋白66″。已知SARAF响应于在内质网Ca2+再充盈后的细胞溶质Ca2+升高而促进SOCE活性的缓慢失活。当内质网腔充满适当的Ca2+水平时，它可能通过促进内质网(ER)单次跨膜蛋白STIM的去寡聚化来有效关闭ORAI。因此，SARAF防止细胞过载有过量Ca2+离子，过量Ca2+离子对细胞是有毒的(Muik等人，J Biol Chem.2008年3月21日；283(12)：8014-22.doi：10.1074/jbc.M708898200.；Palty等人，Cell.2012年4月13日；149(2)：425-38.doi：10.1016/j.cell.2012.01.055；Lunz等人，Cell Calcium.2019年1月；77：29-38.doi：10.1016/j.ceca.2018.11.009)。
SARAF的替代名称是HBV X-反式激活基因3蛋白，来源于Wang等人，Wang等人在2003年利用抑制消减杂交(SSH)技术基于通过乙型肝炎病毒X蛋白反式激活的基因的cDNA消减文库鉴定了这种新基因(Wang等人，Chinese Journal of Gastroenterology andHepatology，2003年第3期，第229-232页)。
Jha等人报道了针对SARAF的siRNA(Jha等人，J Cell Biol.2013年7月8日；202(1)：71-9.doi：10.1083/jcb.201301148)。SARAF的敲低导致了减少的SCDI(缓慢的Ca2+依赖性失活)。
Albarrán等人提出了SARAF与TRPC1(经典瞬时受体电位-1通道)的相互作用。在STIM1缺陷型细胞中使用shRNA使SARAF表达沉默证明了SARAF在TRPC1介导的Ca2+内流中起负调节作用(Albarrán等人，Biochem J.2016年10月15日；473(20)：3581-3595)。在另一篇出版物中，Albarrán等人通过使用基于siRNA的减少和过表达方法表明，SARAF通过花生四烯酸调节的Ca2+(ARC)通道负调节钙库依赖性Ca2+内流(Albarrán等人，Biol Chem 291(13)：6982-6988)。
据我们所知，在cccDNA的稳定性和维持性方面，从未将SARAF识别为cccDNA依赖性因子，也没有有人提出将抑制SARAF的分子用作cccDNA去稳定剂用于治疗HBV感染。
发明目的
本发明表明，靶向SARAF(钙库操控性钙内流相关调节因子)的核酸分子导致了HBV感染细胞中的cccDNA减少，这与HBV感染个体的治疗相关。本发明的目的是识别减少HBV感染细胞中的cccDNA的SARAF抑制剂。此类SARAF抑制剂可用于治疗HBV感染。
本发明进一步识别了新颖的核酸分子，所述新颖的核酸分子能够在体外和体内抑制SARAF的表达。
发明内容
本发明涉及靶向核酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够调节SARAF的表达并治疗或预防与SARAF功能有关的疾病。
因此，在第一方面中，本发明提供了一种SARAF抑制剂，所述SARAF抑制剂用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染。特别地，一种能够减少HBV cccDNA和/或HBV前基因组RNA(pgRNA)的SARAF抑制剂是有用的。此类抑制剂有利地是长度为12至60个核苷酸的核酸分子，所述核酸分子能够减少SARAF mRNA。
在另一方面中，本发明涉及12-60个核苷酸，诸如12-30个核苷酸的核酸分子，所述核酸分子包含至少12个核苷酸，特别是16至20个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与哺乳动物SARAF，例如人SARAF、小鼠SARAF或食蟹猴SARAF至少90％互补。此类核酸分子能够抑制SARAF在表达SARAF的细胞中的表达。对SARAF的抑制使得细胞中存在的cccDNA的量减少。核酸分子可以选自单链反义寡核苷酸、双链siRNA分子或shRNA核酸分子(特别是化学产生的shRNA分子)。
本发明的另一方面涉及抑制SARAF的表达和/或活性的单链反义寡核苷酸或siRNA。特别地，减少SARAF mRNA的包含一个或多个2′糖修饰的核苷和一个或多个硫代磷酸酯键的经修饰的反义寡核苷酸或经修饰的siRNA是有利的。
在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的SARAF抑制剂，诸如本发明的反义寡核苷酸或siRNA和药物赋形剂的药物组合物。
在另一方面中，本发明提供了用于在体内或体外调节表达SARAF的靶细胞中的SARAF表达的方法，该方法通过向所述细胞施用有效量的本发明的SARAF抑制剂，诸如本发明的反义寡核苷酸或组合物来进行。在一些实施例中，与未经任何处理或用对照处理的水平相比，靶细胞中的SARAF表达减少了至少50％、或至少60％。在一些实施例中，靶细胞被HBV感染，并且与未经任何处理或用对照处理的水平相比，在HBV感染靶细胞中，HBV感染细胞中的cccDNA减少了至少50％，或减少了至少60％。在一些实施例中，靶细胞被HBV感染，并且与未经任何处理或用对照处理的水平相比，在HBV感染靶细胞中，HBV感染细胞中的cccDNA减少了至少25％，诸如至少40％。在一些实施例中，靶细胞被HBV感染，并且与未经任何处理或用对照处理的水平相比，在HBV感染靶细胞中，HBV感染细胞中的pgRNA减少了至少50％、或至少60％。
在另一方面中，本发明提供了用于治疗或预防与SARAF的体内活性相关联的疾病、疾患或功能障碍的方法，所述方法包括向患有或易患该疾病、疾患或功能障碍的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的SARAF抑制剂，诸如本发明的反义寡核苷酸或siRNA。
本发明的其他方面是本发明的核酸分子与药物组合物的缀合物，该缀合物包含本发明的分子。特别关注靶向肝脏的缀合物，例如GalNAc簇。
附图简要说明
图1A至图1L：示出了示例性的反义寡核苷酸缀合物，其中该寡核苷酸由术语″寡核苷酸″表示，并且靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺部分。图1A至图1D中的化合物包含二赖氨酸支链分子、PEG3间隔物和三末端GalNAc碳水化合物部分。在图1A(图1A-1和图1A-2示出了同一化合物的两种不同非对映异构体)和图1B(图1B-1和图1B-2示出了同一化合物的两种不同非对映异构体)的化合物中，在没有接头的情况下，寡核苷酸直接连接至靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分。在图1C(图1C-1和图1C-2示出了同一化合物的两种不同非对映异构体)和图1D(图1D-1和图1D-2示出了同一化合物的两种不同非对映异构体)的化合物中，寡核苷酸经由C6接头连接至靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物部分。图1E至图1K中的化合物包含：可商购的三倍体支链分子；和具有不同长度和结构的间隔物；以及三末端GalNAc碳水化合物部分。图1L中的化合物由在仍位于固体支持物上的同时作为合成的一部分添加到寡核苷酸的单体GalNAc亚磷酰胺构成，其中X＝S或O，并且独立地Y＝S或O，并且n＝1-3(参见WO 2017/178656)。图1B和图1D在本文中也被称为GalNAc2或GN2，分别没有和带有C6接头。
在图1A至图1D中的每个图中示出的两种不同非对映异构体是缀合反应的结果。因此，特异性反义寡核苷酸缀合物的池可以仅包含两种不同非对映异构体中的一种，或者特异性反义寡核苷酸缀合物的集合可以包含该两种不同非对映异构体的混合物。
定义
HBV感染
术语″乙型肝炎病毒感染″或″HBV感染″在本领域中是公知的，是指由乙型肝炎病毒(HBV)引起并影响肝脏的传染病。HBV感染可以是急性或慢性感染。慢性乙型肝炎病毒(CHB)感染是一种全球性疾病难题，影响着全球2.48亿人。每年约有686,000例死亡归因于HBV相关的晚期肝病和肝细胞癌(HCC)(GBD 2013；Schweitzer等人，Lancet.2015年10月17日；386(10003)：1546-55)。WHO预测，如果不加大干预措施，未来40至50年内，CHB感染者的人数将保持在目前的高水平，2015年至2030年之间累计死亡人数将达到2000万(WHO2016)。CHB感染不是具有单一临床表现的同质性疾病。感染者在其一生中经历了与CHB相关的肝病的几个阶段，这些疾病阶段也是采用标准护理(SOC)治疗的基础。目前的指南建议根据三个标准(血清ALT水平、HBV DNA水平和肝病严重程度)，仅对选定的CHB感染者进行治疗(EASL，2017)。该建议归因于SOC(即核苷(核苷酸)类似物(NAs)和聚乙二醇化干扰素-α(PEG-IFN))无法治愈，必须长期施用从而增加其安全风险的事实。NAs可以有效抑制HBVDNA复制；然而，它们对其他病毒标记物的作用非常有限/没有影响。HBV感染的两个标志，即乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和共价闭合环状DNA(cccDNA)，是针对治愈HBV的新药的主要目标。在CHB个体的血浆中，HBsAg亚病毒(空)颗粒数超过HBV病毒粒子103到105倍(Ganem&Prince，N Engl J Med.2004年3月11日；350(11)：1118-29)；据信，其过量可能导致该疾病的免疫发病机制，包括个体无法产生中和性抗HBs抗体，这是在急性HBV感染消退后观察到的血清学标记物。
在一些实施例中，术语″HBV感染″是指″慢性HBV感染″。
此外，该术语涵盖任何HBV基因型的感染。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型A。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型B。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型C。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型D。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型E。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型F。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型G。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型H。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型I。
在一些实施例中，待治疗的患者感染了HBV基因型J。
cccDNA(共价闭合环状DNA)
cccDNA是位于感染的肝细胞的细胞核中的HBV的病毒基因模板，其中它会产生增殖性感染所需的所有HBV RNA转录本，并负责慢性HBV感染的自然过程期间的病毒持续性(Locamini&Zoulim，Antivir Ther.2010；15增刊3：3-14.doi：10.3851/IMP1619)。cccDNA作为病毒储库，是停止治疗后病毒反弹的来源，因此需要长期，通常是终生的治疗。由于各种副作用，因此PEG-IFN仅可施用于一小部分CHB。
因此，大多数CHB患者迫切需要新的治疗方法，即通过降解或清除HBV cccDNA来实现完全治愈。
化合物
在本文中，术语″化合物″是指能够抑制SARAF表达或活性的任何分子。本发明的特别化合物是核酸分子，例如根据本发明的RNAi分子或反义寡核苷酸或包含这种核酸分子的任何缀合物。例如，本文中化合物可以是靶向SARAF的核酸分子，特别是反义寡核苷酸或siRNA。
寡核苷酸
如本文所用，术语″寡核苷酸″如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。
说明书和权利要求书中提及的寡核苷酸通常是长度小于70个核苷酸的治疗性寡核苷酸。寡核苷酸可以是或者可以包含单链反义寡核苷酸，或者可以是另一种核酸分子，诸如CRISPR RNA、siRNA、shRNA、适体、或核酶。治疗性寡核苷酸分子通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化和分离来制备。然而，shRNA通常使用慢病毒载体传递至细胞中，然后从慢病毒载体中转录以产生单链RNA，该单链RNA将形成茎环(发夹)RNA结构，该结构能够与RNA干扰机制(包括RNA诱导沉默复合物(RISC))相互作用。在本发明的实施例中，shRNA是通过化学方法产生的shRNA分子(不依赖于来自质粒或病毒的基于细胞的表达)。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。通常，本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。尽管在一些实施例中，本发明的寡核苷酸是在进入靶细胞时从载体转录的shRNA。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸包含或由长度为10至70个核苷酸，诸如长度为12至60个、诸如13至50个、诸如14至40个、诸如15至30个、诸如16至25个、诸如16至22个、诸如16至20个连续核苷酸组成。因此，在一些实施例中，本发明的寡核苷酸的长度可为12至25个核苷酸。另选地，在一些实施例中，本发明的寡核苷酸的长度可为15至22个核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含或由24个或更少的核苷酸组成，例如22个、例如20个或更少、例如18个或更少、例如14个、15个、16个或17个核苷酸。应当理解的是，本文中给出的任何范围均包括范围的端点。因此，如果说核酸分子包含12个至25个核苷酸，则12个和25个核苷酸均包含在内。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含或由长度为12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个连续核苷酸组成
寡核苷酸用于调节靶核酸在哺乳动物中的表达。在一些实施例中，核酸分子，诸如siRNA、shRNA和反义寡核苷酸的核酸分子，通常用于抑制靶核酸的表达。
在本发明的一个实施例中，寡核苷酸选自RNAi剂，诸如siRNA或shRNA。在另一个实施例中，寡核苷酸是单链反义寡核苷酸，诸如与RNase H相互作用的高亲和力修饰的反义寡核苷酸。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸，诸如2′糖修饰的核苷。
在一些实施例中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键。
在一些实施例中，寡核苷酸可以缀合至非核苷部分(缀合物部分)。
寡核苷酸文库应理解为变体寡核苷酸的集合。寡核苷酸文库的目的可以变化。在一些实施例中，寡核苷酸文库由具有重叠核碱基序列的寡核苷酸构成，该序列靶向一个或多个哺乳动物SARAF靶核酸，目的是识别该寡核苷酸文库中最有效的序列。在一些实施例中，寡核苷酸文库是亲代或祖代寡核苷酸的寡核苷酸设计变体(子核酸分子)文库，其中寡核苷酸设计变体保留了亲代核酸分子的核心核碱基序列。
反义寡核苷酸
如本文所用的术语″反义寡核苷酸″或″ASO″被定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不为双链的，因此不为siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸为单链的。应当理解的是，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要其内部或相互间的自身互补程度小于寡核苷酸全长的50％。
优选地，本发明的单链反义寡核苷酸不包含RNA核苷，因为这将降低核酸酶抗性。
优选地，本发明的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如2′糖修饰的核苷。此外，优选的是未修饰的核苷是DNA核苷。
RNAi分子
在本文中，术语″RNA干扰(RNA interference，RNAi)分子″是指含有RNA核苷的短双链寡核苷酸，该短双链寡核苷酸经由RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencingcomplex，RISC)介导RNA转录物的靶向切割，其中它们与催化性RISC组分argonaute相互作用。RNAi分子调节(例如，抑制)靶核酸在细胞，例如受试者(诸如哺乳动物受试者)体内的细胞中的表达。RNAi分子包括单链RNAi分子(Lima等人，2012 Cell 150：883)和双链siRNA，以及短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)。在本发明的一些实施例中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列是RNAi剂，诸如siRNA。
siRNA
术语″小干扰核糖核酸″或″siRNA″是指小干扰核糖核酸RNAi分子。它是一类双链RNA分子，在本领域中也称为短干扰RNA或沉默RNA。siRNA通常包含有义链(也称为过客链)和反义链(也称为引导链)，其中每条链的长度为17至30个核苷酸，通常为19至25个核苷，其中反义链与靶核酸(合适地是成熟的mRNA序列)互补，诸如至少95％互补，诸如完全互补，并且有义链与反义链互补，使得有义链和反义链形成双链体或双链体区域。siRNA链可形成平末端双链体，或者优选地，正义和反义链的3′端可形成3′突出端，例如1个、2个或3个核苷，类似于Dicer生产的产物，可在体内形成RISC底物。Dicer底物的有效扩展形式已在US 8,349,809和US 8,513,207中进行了描述，在此通过引用并入。在一些实施例中，正义链和反义链均具有2nt 3′突出端。因此，双链体区域的长度可以是例如17至25个核苷酸，诸如长度为21至23个核苷酸。
一旦进入细胞内，反义链就被掺入到RISC复合物中，该RISC复合物介导靶核酸的靶降解或靶抑制。siRNA除了RNA核苷外，通常还包含修饰的核苷。在一个实施例中，siRNA分子可以使用修饰的核苷酸间键和2′糖修饰的核苷(诸如2′-4′双环核糖修饰的核苷，包括LNA和cET)或2′取代的修饰(如′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA，2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA)进行化学修饰。特别地，可以将2′氟、2′-O-甲基或2′-O-甲氧基乙基掺入siRNA。
在一些实施例中，可以用2′糖修饰的核苷(诸如LNA)修饰siRNA有义(过客)链的所有核苷酸(例如，参见WO2004/083430、WO2007/085485)。在一些实施例中，siRNA的过客链可以是不连续的(例如，参见WO2007/107162)。已经报道了在siRNA的反义链的种子区域中出现的热不稳定核苷酸的掺入可用于减少siRNA的脱靶活性(例如，参见WO2018/098328)。合适地，siRNA在反义链的5′端包含5′磷酸基团或5′-磷酸模拟物。在一些实施例中，反义链的5′端是RNA核苷。
在一个实施例中，siRNA分子进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷间键可以在一条或两条链(例如，反义链；或正义链)的3′-末端上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷间键可以在一条或两条链(例如，反义链；或正义链)的5′末端上；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷间键可以在一条或两条链(例如反义链；或正义链)的5′-和3′-末端上。在一些实施例中，剩余的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，siRNA分子包含一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。在siRNA分子中，硫代磷酸酯核苷间键可能会减少或在RICS中进行核酸酶切割，因此优选的是，并非反义链中的所有核苷间键都被修饰。
siRNA分子可以进一步包含配体。在一些实施例中，配体缀合至正义链的3′端。
对于生物学分布，可将siRNA缀合至靶向配体，和/或配制成脂质纳米颗粒。
本发明的其他方面涉及包含这些dsRNA的药物组合物，例如适合用于治疗用途的siRNA分子，以及通过施用dsRNA分子(例如本发明的siRNA)来抑制靶基因表达的方法，例如用于治疗如本文所公开的各种疾病。
shRNA
术语″短发夹RNA″或″shRNA″是指这样的分子，所述分子的长度通常介于40个与70个核苷酸之间，诸如长度介于45个与65个核苷酸之间，诸如长度介于50个与60个核苷酸之间，并形成茎环(发夹)RNA结构，该结构与称为Dicer的核酸内切酶相互作用，据信，Dicer将dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3′突出端的19-23个碱基对的短干扰RNA，然后将其掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。在与合适的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶标以诱导沉默。shRNA寡核苷酸可以使用修饰的核苷酸间键和2′糖修饰的核苷(诸如2′-4′双环核糖修饰的核苷，包括LNA和cET)或2′取代的修饰(如2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA，2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA)进行化学修饰。
在一些实施例中，shRNA分子包含一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。在RNAi分子中，硫代磷酸酯核苷间键可减少或在RICS中进行核酸酶切割，因此优选的是，并非shRNA分子茎环中的所有核苷间键都被修饰。硫代磷酸酯核苷间键可以有利地位于shRNA分子的茎环的3′和/或5′端中，特别是在该分子的与靶核酸不互补的部分中。然而，shRNA分子的与靶核酸互补的区域也可以在预计通过Dicer切割后会成为3′和/或5′末端部分的前2个至3个核苷间键中被修饰。
连续核苷酸序列
术语″连续核苷酸序列″是指核酸分子的与靶核酸互补的区域。该术语在本文中与术语″连续核碱基序列″和术语″寡核苷酸基序序列″可互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，连续核苷酸序列被包括在siRNA分子的引导链中。在一些实施例中，连续核苷酸序列是shRNA分子的部分，该部分与靶核酸100％互补。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如F-G-F′缺口聚体区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团(例如用于靶向的缀合物基团)连接至该连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸的核碱基序列是连续核苷酸序列。在一些实施例中，连续核苷酸序列与靶核酸100％互补。
核苷酸和核苷
核苷酸和核苷是寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为″单元″或″单体″。
修饰的核苷
如本文所用，术语″修饰的核苷″或″核苷修饰″是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。有利地，修饰的核苷中的一个或多个修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语″核苷类似物″或修饰的″单元″或修饰的″单体″互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(Watson Crick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。
修饰的核苷间键
如技术人员通常所理解的，术语″修饰的核苷间键″定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键，或一个或多个二硫代磷酸酯核苷间键。
对于本发明的寡核苷酸，使用硫代磷酸酯核苷间键是优选的。
硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％或诸如至少90％的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯。
在一些有利的实施例中，寡核苷酸的连续核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯，或寡核苷酸的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。
应当认识到，如在EP 2 742 135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间键，其根据EP 2 742135可以例如在另外的DNA硫代磷酸酯缺口区中被耐受。
核碱基
术语″核碱基″包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，它们在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中为功能性的。在此上下文中，″核碱基″是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊371.4.1中。
在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2′-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口聚体，可使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语″修饰的寡核苷酸″描述了包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸。术语″嵌合″寡核苷酸是已经在文献中用来描述包含修饰的核苷和DNA核苷的寡核苷酸的术语。本发明的反义寡核苷酸优选地是嵌合寡核苷酸。
互补性
术语″互补性″或″互补的″描述了核苷/核苷酸的沃森克里克碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基和修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊371.4.1)。
如本文所用，术语″互补性百分比″是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5′-3′和3′-5′的寡核苷酸序列比对时)互补(形成Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在此类比较中，未比对(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许***和删除。应当理解的是，在确定互补性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5′-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
术语″完全互补″是指100％互补性。
同一性
如本文所用，术语″同一性″是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以寡核苷酸的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数x 100)/比对区域的长度(例如，连续核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许***和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
杂交
如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常根据解链温度(Tm)来描述，该解链温度被定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm并非确实与亲和力严格成比例(Mergny与Lacroix，2003年，Oligonucleotides 13：515-537)。标准状态的吉布斯自由能ΔG°更精确地表示结合亲和力，并且通过ΔG°＝-RTln(Kd)与反应的解离常数(Kd)相关，其中R为气体常数，T为绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与水浓度为1M、pH为7、温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，而自发反应的ΔG°小于零。ΔG°可经由实验来测量，例如，利用如Hansen等人，1965，Chem.Comm.36-38和Holdgate等人，2005，Drug DiscovToday中所述的等温滴定量热法(ITC)方法测量。技术人员将知道商用设备可用于ΔG°测量。ΔG°还可以使用SantaLucia，1998，Proc Natl Acad Sci USA.95：1460-1465中描述的最近邻居模型，使用由Sugimoto等人，1995，Biochemistry 34：11211-11216和McTigue等人，2004，Biochemistry 43：5388-5405描述的适当推导的热力学参数进行数值评估。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10至30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸与靶核酸以低于-10kcal的估计ΔG°值杂交。在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°测量。对于长度为8至30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal、诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的估计ΔG°值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸与靶核酸以在-10至-60kcal，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal诸如-18至-25kcal范围内的估计ΔG°值杂交。
靶核酸
根据本发明，靶核酸是编码哺乳动物SARAF的核酸，并且可以例如是基因、RNA、mRNA和前体mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。该靶标因此可以称为SARAF靶核酸。
合适地，靶核酸编码SARAF蛋白，特别是哺乳动物SARAF，诸如编码前体mRNA或mRNA序列的人SARAF基因，所述前体mRNA或mRNA序列在本文中提供为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10。.
本发明的治疗性寡核苷酸可以例如靶向哺乳动物SARAF的外显子区域(特别是siRNA和shRNA，但也可以是反义寡核苷酸)，或者可以例如靶向SARAF前体mRNA中的任何内含子区域(特别是反义寡核苷酸)。人SARAF基因编码14个转录物，其中7个是蛋白质编码的，并且因此是潜在的核酸靶标。蛋白质编码转录物是表3中的变体1至7。
表1列出了SEQ ID NO：1，即人SARAF前体mRNA序列的预测外显子和内含子区域。
表1.人SARAF前体mRNA的外显子和内含子区域。
Figure BDA0003697803560000161
Figure BDA0003697803560000171
合适地，靶核酸编码SARAF蛋白，特别是哺乳动物SARAF，诸如人SARAF(参见例如表2和表3)，其提供了人、食蟹猴和小鼠SARAF的基因组序列(表2)和人、猴和小鼠SARAF的前体mRNA序列以及人SARAF的成熟mRNA(表3)的概述。
在一些实施例中，靶核酸选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10或其天然存在的变体(例如，编码哺乳动物SARAF的序列)组成的组。
表2.跨物种的SARAF的基因组和装配信息。
Figure BDA0003697803560000172
Fwd＝正向链。Rv＝反向链。基因组坐标提供了前体mRNA序列(基因组序列)。
如果在研究或诊断中采用本发明的核酸分子，则靶核酸可以是eDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。
对于体内或体外应用，本发明的治疗性核酸分子通常能够抑制SARAF靶核酸在表达SARAF靶核酸的细胞中的表达。在一些实施例中，所述细胞包含HBV cccDNA。本发明的核酸分子的核碱基的连续序列通常与SARAF靶核酸的保守区互补，如在所述核酸分子的长度上测量的，任选地除了一个或两个错配以外，并且任选地排除可以将寡核苷酸连接到任选的官能团(诸如缀合物或其它非互补的末端核苷酸)的基于核苷酸的接头区域。靶核酸是信使RNA，诸如编码哺乳动物SARAF蛋白(诸如人SARAF)的前体mRNA，例如人SARAF前体mRNA序列(诸如公开为SEQ ID NO：1的序列)、猴SARAF前体mRNA序列(诸如公开为SEQ ID NO：2的序列)、或小鼠SARAF前体mRNA序列(诸如公开为SEQ ID NO：3的序列)、或成熟SARAF mRNA(诸如公开为SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9或10的人成熟mRNA)。SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10是DNA序列-应当理解，靶RNA序列具有代替胸苷碱基(T)的尿嘧啶(U)碱基。
表2和表3中提供了有关示例性靶核酸的另外信息。
表3.有关靶核酸的概述。
靶核酸、物种、参考 序列ID
SARAF智人前体mRNA SEQ ID NO：1
SARAF食蟹猴前体mRNA SEQ ID NO：2
SARAF小家鼠前体mRNA SEQ ID NO：3
SARAF智人成熟mRNA，变体1(ENST00000256255.10) SEQ ID NO：4
SARAF智人成熟mRNA，变体2(ENST00000521265.5) SEQ ID NO：5
SARAF智人成熟mRNA，变体3(ENST00000518296.5) SEQ ID NO：6
SARAF智人成熟mRNA，变体4(ENST00000523127.5) SEQ ID NO：7
SARAF智人成熟mRNA，变体5(ENST00000522794.1) SEQ ID NO：8
SARAF智人成熟mRNA，变体6(ENST00000545648.2) SEQ ID NO：9
SARAF智人成熟mRNA，变体7(ENST00000523761.1) SEQ ID NO：10
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：1。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：2。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：3。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：4。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：5。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：6。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：7。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：8。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：9。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：10。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：10。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5。
在一些实施例中，靶核酸是SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4。
靶序列
如本文所用的术语″靶序列″是指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸或核酸分子互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上具有与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施例中，靶序列比本发明的核酸分子的互补序列更长，并且可以例如代表靶核酸的优选区域，该优选区域可以被本发明的几个核酸分子靶向。
在一些实施例中，靶序列是选自由以下项组成的组的序列：人SARAF mRNA外显子，诸如选自由E1、E2、E3、E4、E5和E6组成的组的人SARAF mRNA外显子(参见例如上表1)。
因此，本发明提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1的外显子区域至少90％互补，诸如完全互补的连续序列，所述外显子区域选自由E1至E6组成的组(参见表1)。
在一些实施例中，靶序列是选自由以下项组成的组的序列：人SARAF mRNA内含子，诸如选自由I1、I2、I3、I4和15组成的组的人SARAF mRNA内含子(参见例如上表1)。
因此，本发明提供了一种寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1的内含子区域至少90％互补，诸如完全互补的连续序列，所述内含子区域选自由I1至I5组成的组(参见表1)。
在一些实施例中，靶序列选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组。在一些实施例中，本文所提及的连续核苷酸序列与选自由SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的靶序列至少90％互补，诸如至少95％互补。在一些实施例中，连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的靶序列完全互补。
本发明的寡核苷酸包含与靶核酸(诸如本文所述的靶序列)上的区域互补或杂交的连续核苷酸序列。
与治疗性寡核苷酸互补或杂交的靶核酸序列通常包含一段至少10个核苷酸的连续核碱基。该连续核苷酸序列的长度介于12至70个核苷酸，诸如12至50个、诸如13至30个、诸如14至25个、诸如15至20个、诸如16至18个连续核苷酸。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸靶向表4或5中所示的区域。
表4：示例性靶区域
Figure BDA0003697803560000201
Figure BDA0003697803560000211
Figure BDA0003697803560000221
Figure BDA0003697803560000231
Figure BDA0003697803560000241
在一些实施例中，靶序列选自由如上表4中所示的靶区域1A至541A组成的组。
表5：示例性靶区域
Figure BDA0003697803560000251
在一些实施例中，靶序列选自由如上表5中所示的靶区域1C至91C组成的组。
靶细胞
如本文所用，术语″靶细胞″是指表达靶核酸的细胞。对于本发明的治疗用途，如果靶细胞被HBV感染则是优选的。在一些实施例中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞或土拨鼠细胞；或者灵长类细胞，诸如猴细胞(例如食蟹猴细胞)或人类细胞。
在优选的实施例中，靶细胞表达SARAF mRNA，诸如SARAF前体mRNA或SARAF成熟mRNA。对于反义寡核苷酸靶向作用，通常不考虑SARAF mRNA的聚腺苷(poly A)尾部。
此外，靶细胞可以是肝细胞。在一个实施例中，靶细胞是HBV感染的原代人肝细胞，其来源于HBV感染个体或具有人源化肝脏的HBV感染小鼠(PhoenixBio，PXB-小鼠)。
根据本发明，靶细胞可以被HBV感染。此外，靶细胞可包含HBV cccDNA。因此，靶细胞优选地包含SARAF mRNA，诸如SARAF前体mRNA或SARAF成熟mRNA，以及HBV cccDNA。
天然存在的变体
术语″自然产生变体(naturally occurring variant)″指与该靶核酸源自相同基因座但可有差异的SARAF基因或转录物的变体，所述差异可例如是出于遗传编码的简并性造成多重密码子编码同一个氨基酸，或因前体mRNA的交替性剪接，或多态性的存在，诸如单核苷酸多态性(SNP)及等位基因变体。基于与寡核苷酸足够互补序列的存在，本发明的寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。
在一些实施例中，天然存在的变体与哺乳动物SARAF靶核酸具有至少95％，诸如至少98％或至少99％的同源性，所述靶核酸为诸如SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2的靶核酸。在一些实施例中，天然存在的变体与SEQ ID NO：1的人SARAF靶核酸具有至少99％的同源性。在一些实施例中，天然存在的变体是已知的多态性。
表达的抑制
如本文所用的术语″表达的抑制″应理解为SARAF(钙库操控性钙内流相关调节因子)抑制剂抑制(即降低)靶细胞中SARAF的量或活性的能力的总称。表达或活性的抑制可以通过测量SARAF前体mRNA或SARAF mRNA的水平，或通过测量细胞中SARAF蛋白或活性的水平来确定。可以体外或体内地测定表达的抑制。有利地，相对于施用SARAF抑制剂之前SARAF的量来评定抑制。另选地，通过参考对照来确定抑制。通常应当理解的是，对照物是用盐水组合物处理的个体或靶细胞，或者用非靶向寡核苷酸(模拟物)处理的个体或靶细胞。
术语″抑制(inhibition/inhibit)″也可以指下调、减少、抑制、减轻、减小、降低SARAF的表达或活性。
SARAF表达的抑制可例如通过例如使用RNase H募集寡核苷酸(诸如缺口聚体)，或经由RNA干扰途径起作用的核酸分子(诸如siRNA或shRNA)进行前体mRNA或mRNA的降解而发生。另选地，本发明的抑制剂可与SARAF多肽结合，并抑制SARAF的活性或阻止其与其他分子结合。
在一些实施例中，SARAF靶核酸表达或SARAF蛋白活性的抑制导致靶细胞中HBVcccDNA的量减少。优选地，与对照相比，HBV cccDNA的量减少。在一些实施例中，与对照相比，HBV cccDNA的量减少了至少20％、至少30％。在一些实施例中，当与对照相比时，HBV感染细胞中cccDNA的量减少了至少50％，诸如60％。
在一些实施例中，SARAF靶核酸表达或SARAF蛋白活性的抑制导致靶细胞中HBVpgRNA的量减少。优选地，与对照相比，HBV pgRNA的量减少。在一些实施例中，与对照相比，HBV pgRNA的量减少了至少20％、至少30％。在一些实施例中，当与对照相比时，HBV感染细胞中的pgRNA的量减少了至少50％，诸如60％。
糖修饰
本发明的寡核苷酸可包含一种或多种具有修饰的糖部分的核苷，所述修饰的糖部分即与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时糖部分的修饰。
已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括其中核糖环结构如下被修饰的那些：例如通过用己糖环(HNA)或通常在核糖环上的C2和C4碳之间具有双基桥的双环(LNA)或通常在C2和C3碳之间缺乏键的未连接的核糖环(例如UNA)替换。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2′-OH基团而进行的修饰。例如，可在2′、3′、4′或5′位置引入取代基。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是修饰的核苷酸，其在掺入到寡核苷酸中时，增强了寡核苷酸对其互补靶标的亲和力，例如通过解链温度(Tm)测量。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一个修饰的核苷的解链温度增加在+0.5℃至+12℃的范围内，更优选地在+1.5℃至+10℃的范围内，并且最优选地在+3℃至+8℃的范围内。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2′取代的核苷以及锁定的核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in DrugDevelopment，2000，3(2)，293-213)。
2′糖修饰的核苷
2′糖修饰的核苷为在2′位置具有除H或-OH以外的取代基的核苷(2′取代的核苷)，或包含能够在2′碳和核糖环中的第二个碳之间形成桥的2′连接的双基，诸如LNA(2′-4′双基桥连)核苷。
事实上，人们已花费很多精力开发2′糖取代的核苷，并且发现许多2′取代的核苷掺入寡核苷酸后具有有益的特|生。例如，2′修饰的糖可提供对寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2′取代的修饰的核苷的实例是′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面为一些2′取代的修饰的核苷的示意图。
Figure BDA0003697803560000291
关于本发明，2′取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2′桥连的核苷。
锁定的核酸核苷(LNA核苷)
″LNA核苷″是一种2′-糖修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的C2′和C4′的双基(也称为″2′-4′桥″)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交亲和力的增强(双链体稳定化)相关。这可通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12，73-76、Seth等人.J.Org.Chem.2010，Vol 75(5)pp.1569-81，Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research2009，37(4)，1225-1238以及Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016，59，9645-9667。
本发明的LNA核苷的具体示例在方案1中给出(其中B如上所定义)。
方案1
Figure BDA0003697803560000301
特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6′-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6′-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。
RNase H活性和募集
反义寡核苷酸的RNase H活性是指当其与互补RNA分子形成双链体时募集RNase H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNase H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNase H的能力。如果在向寡核苷酸提供互补靶核酸序列时具有以下初始速率(以pmol/l/min计)，则一般认为其能够募集RNase H，该初始速率是使用WO 01/23613(通过引用在此并入)的实施例91至95提供的方法学，使用具有与所测试的经修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但在寡核苷酸中的所有单体之间仅包含具有硫代磷酸酯键的DNA单体的寡核苷酸确定的初始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％。为了用于确定RNase H活性，可从Creative
Figure BDA0003697803560000311
(与大肠杆菌中表达的His标签融合的重组人RNase H1)获得重组人RNase H1。
缺口聚体
本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是缺口聚体，也称为缺口聚体寡核苷酸或缺口聚体设计。反义缺口聚体一般用于通过RNase H介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚体寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，即′5->3′方向的5′-侧翼、缺口和3′侧翼F-G-F′。″缺口″区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集RNase H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5′侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3′侧翼区域(F′)。区域F和F′中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F′中的一个或多个糖修饰的核苷是2′糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2′糖修饰，诸如独立地选自LNA和2′-MOE。
在缺口聚体设计中，缺口区域的5′和3′最末端核苷是DNA核苷，分别位于5′(F)或3′(F′)区域的糖修饰核苷附近。侧翼可进一步定义为在距缺口区域最远的端，即在5′侧翼的5′端和3′侧翼的3′端，具有至少一个糖修饰的核苷。
区域F-G-F′形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F′的缺口聚体区域。
缺口聚体设计F-G-F′的总长度可以为例如12至32个核苷，诸如13至24个核苷，诸如14至22个核苷，诸如15至20个核苷，诸如16至18个核苷。
举例而言，本发明的缺口聚体寡核苷酸可由下式代表：
F1-8-G5-18-F′1-8，诸如
F1-8-G7-18-F′2-8
前提条件是缺口聚体区域F-G-F′的总长度至少为12，诸如至少14个核苷酸。
在本发明的方面，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由式5′-F-G-F′-3′的缺口聚体组成或包含式5′-F-G-F′-3′的缺口聚体，其中区域F和F′独立地包含1至8个核苷或由1至8个核苷组成，其中1至4个经2′糖修饰且限定F和F′区域的5′和3′端，并且G为能够募集RNase H的介于6个与18个核苷之间的区域。在一些实施例中，G区域由DNA核苷组成。
在一些实施例中，区域F和F′独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包含糖修饰的核苷的连续序列。在一些实施例中，区域F的糖修饰的核苷可独立地选自′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、***糖核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元。
在一些实施例中，区域F和F′独立地包含LNA和2′取代的糖修饰核苷酸两者(混合型翼设计)。在一些实施例中，2′取代的糖修饰的核苷酸独立地选自由以下项组成的组：′-O-烷基-RNA单元、2′-O-甲基-RNA、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、2′-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2′-氟-ANA单元。
在一些实施例中，区域F和F′的所有修饰的核苷都是LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中区域F或F′或者F和F′可以任选地包含DNA核苷。在一些实施例中，区域F和F′的所有修饰核苷均为β-D-氧基LNA核苷，其中区域F或F′或者F和F′可以任选地包含DNA核苷。在此类实施例中，侧翼区域F或F′，或F和F′两者，包含至少三个核苷，其中F和/或F′区域的5′和3′最末端核苷为LNA核苷。
LNA缺口聚体
LNA缺口聚体是其中区域F和F′中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的缺口聚体。β-D-氧基缺口聚体是其中区域F和F′中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚体。
在一些实施例中，LNA缺口聚体具有下式：[LNA]1-5-[区域G]6-18-[LNA]1-5，其中区域G具有如在缺口聚体区域G定义中的定义。
MOE缺口聚体
MOE缺口聚体是其中区域F和F′由MOE核苷所构成的缺口聚体。在一些实施例中，MOE缺口聚体的设计为[MOE]1-8-[区域G]5-16-[MOE]1-8，诸如[MOE]2-7-[区域G]6-14-[MOE]2-7，诸如[MOE]3-6-[区域G]8-12-[MOE]3-6，诸如[MOE]5-[区域G]10-[MOE]5，其中区域G具有如缺口聚体定义中的定义。具有5-10-5设计(MOE-DNA-MOE)的MOE缺口聚体已广泛用于本技术领域中。
寡核苷酸中的区域D′或D″
本发明的寡核苷酸可在一些实施例中包含或由所述寡核苷酸的所述连续核苷酸序列以及其他的5′和/或3′核苷组成，所述连续核苷酸序列与所述靶核酸互补，所述连续核苷酸序列诸如是缺口聚体F-G-F′。所述其他的5′和/或3′核苷可与或不与所述靶核酸为完全互补。此类其他的5′和/或3′核苷本文中可称为区域D′和D″。
出于将连续核苷酸序列(诸如缺口聚体)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D′或D″。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。另选地，其可用于提供核酸外切酶保护或使合成或制备变得容易。
可以将区域D′和D″分别附接于区域F的5′端或区域F′的3′端，以生成下式D′-F-G-F′、F-G-F′-D″或D′-F-G-F′-D″的设计。在这种情况下，F-G-F′是寡核苷酸的缺口聚体部分，而区域D′或D″构成寡核苷酸的单独部分。
区域D′或D″可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F′区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D′或D′′区可用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，附加的5′和/或3′端核苷酸与磷酸二酯键联接，并且是DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作区域D′或D″的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了在聚寡核苷酸构建体中可生物裂解的接头的使用，其中它们被用于在单个寡核苷酸内连接多个反义构建体(例如缺口聚体区域)。
在一个实施例中，本发明的寡核苷酸除包含构成所述缺口聚体的连续核苷酸序列之外，还包含区域D′和/或D″。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可由下式代表：
F-G-F′；特别是F1-8-G5-18-F′2-8
D′-F-G-F′，特别是D′1-3-F1-8-G5-18-F′2-8
F-G-F′-D″，特别是F1-8-G5-18-F′2-8-D″1-3
D′-F-G-F′-D″，特别是D′1-3-F1-8-G5-18-F′2-8-D″1-3
在一些实施例中，区域D′与区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，区域F′与区域D′′之间的核苷间键是磷酸二酯键。
缀合物
如本文所用，术语″缀合物″是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。缀合物部分可以共价连接至反义寡核苷酸，任选地经由连接基团，诸如区域D′或D′。
寡核苷酸缀合物及其合成也由Manoharan于Antisense Drug Technology，Principles，Strategies，and Applications，S.T.Crooke，ed.，Ch.16，Marcel Dekker，Inc.，2001和Manoharan的Antisense and Nucleic Acid Drug Development，2002，12，103，所述各者以引用方式全部并入本文。
在一些实施例中，所述非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物(例如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))、细胞表面受体配体、药品物质、荷尔蒙、亲脂性物质、聚合物、蛋白质(例如抗体)、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或它们的组合组成的组。
示例性的缀合物部分是那些能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的缀合物部分。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合物部分适用于与ASGPR结合，参见例如WO 2014/076196、WO 2014/207232和WO 2014/179620(通过引用并入本文)。此类缀合物用于增强肝脏对寡核苷酸的摄取。
接头
键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过联接部分(例如接头或系链)附接于寡核苷酸。接头可将第三区域，例如缀合物部分(区域C)，共价连接至第一区域，例如与所述靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A)。
在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。
区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物切割的接头对S1核酸酶切割敏感。在优选的实施例中，所述核酸酶易感接头包含介于1个与5个之间的核苷，诸如1个、2个、3个、4个、或5个核苷，更优选地介于2个与4个之间的核苷，最优选地2个或3个连接的核苷，所述连接的核苷包含至少两个连续磷酸二酯键，诸如至少3个或4个或5个连续磷酸二酯键。优选地，该核苷是DNA或RNA。包含生物可切断型接头的磷酸二酯的详细说明请参阅WO 2014/076195(以引用方式并入本文)。
区域Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)与寡核苷酸(区域A或第一区域)共价连接的接头。区域Y接头可以包含链结构或重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基基团的寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域元件构建：A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C。在一些实施例中，接头(区域Y)是氨基烷基，诸如C2-C36氨基烷基基团，其包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头(区域Y)是C6氨基烷基。
治疗
如本文所用的术语″治疗″是指既存疾病(例如如本文所提及的疾病或疾患)的治疗或疾病的阻止即预防。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。预防可理解为阻止HBV感染转变为慢性HBV感染或阻止由慢性HBV感染引起的严重肝病，诸如肝硬化和肝细胞癌。
患者
为了本发明的目的，″受试者″(或″患者″)可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语″受试者″包括人和其他动物，特别是哺乳动物和其他生物。因此，本文提供的手段和方法适用于人类治疗和兽医应用。优选地，受试者是哺乳动物。更优选地，受试者是人。
如本文别处所述，待治疗的患者可能患有HBV感染，诸如慢性HBV感染。在一些实施例中，患有HBV感染的患者可能患有肝细胞癌(HCC)。在一些实施例中，患有HBV感染的患者不患有肝细胞癌。
具体实施方式
感染的肝细胞中的HBV cccDNA负责持续的慢性感染和再激活，是所有病毒亚基因组转录本和前基因组RNA(pgRNA)的模板，以确保新合成的病毒后代和cccDNA池通过细胞内核衣壳回收而得到补充。在本发明的上下文中，第一次显示SARAF与cccDNA稳定性有关。这种认知为HBV感染受试者体内的cccDNA去稳定化提供机会，这反过来又为彻底治愈慢性感染HBV患者创造机会。
本发明的一个方面是一种SARAF抑制剂，其用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染，特别是慢性HBV感染。
SARAF抑制剂可以是例如与SARAF蛋白特异性结合的小分子，其中所述抑制剂防止或减少SARAF蛋白与cccDNA的结合。
本发明的一个实施例是一种SARAF抑制剂，其能够减少感染细胞，诸如HBV感染细胞中的cccDNA和/或pgRNA。
在另一个实施例中，SARAF抑制剂能够在HBV感染个体的体内降低HBsAg和/或HBeAg。
用于治疗HBV的SARAF抑制剂
不受理论的束缚，据信SARAF经由直接或间接与cccDNA结合而参与细胞核中cccDNA的稳定化，并且通过阻止SARAF与cccDNA的结合/缔合，cccDNA被去稳定化并变得易于降解。因此，本发明的一个实施例是一种SARAF抑制剂，其与SARAF蛋白相互作用，并防止或减少其与cccDNA的结合/缔合。
在本发明的一些实施例中，所述抑制剂是抗体、抗体片段或小分子化合物。在一些实施例中，抑制剂可以是特异性结合SARAF蛋白(诸如由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10编码的SARAF蛋白)的抗体、抗体片段或小分子。
本发明的核酸分子
治疗性核酸分子可能是出色的SARAF抑制剂，因为它们可以靶向SARAF转录物并经由RNA干扰途径或经由RNase H切割而促进其降解。另选地，寡核苷酸诸如适体也可以充当SARAF蛋白相互作用的抑制剂。
本发明的一个方面是一种SARAF靶向核酸分子，其用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染。此类核酸分子可以选自由单链反义寡核苷酸siRNA分子；和shRNA分子组成的组。
本章节描述了适用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染的新颖核酸分子。
本发明的核酸分子能够在体外和体内抑制SARAF的表达。抑制是通过将寡核苷酸与编码SARAF或参与SARAF调节的靶核酸杂交来实现的。靶核酸可以是哺乳动物SARAF序列。在一些实施例中，靶核酸可以是人SARAF前体mRNA序列，诸如SEQ ID NO：1的序列或选自SEQID NO：4至SEQ ID NO：10的人SARAF mRNA序列(诸如SEQ ID NO：4)。在一些实施例中，靶核酸可以是食蟹猴SARAF序列，诸如SEQ ID NO：2的序列。
在一些实施例中，本发明的核酸分子能够通过抑制或下调靶标的表达来调节靶标的表达。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节产生至少20％的表达抑制，更优选地与靶标的正常表达水平相比，至少30％、至少40％、至少50％、或至少60％的抑制。在一些实施例中，通过将25nM核酸分子转染到PXB-PHH细胞中，本发明的核酸分子可以能够体外抑制SARAF mRNA的表达水平达至少50％或60％，这种靶标减少的范围在选择与cccDNA减少具有良好相关性的核酸分子方面是有利的。合适地，实施例提供了可用于测量SARAF RNA或蛋白质抑制的测定(例如实施例1和″材料和方法″部分)。靶标抑制由寡核苷酸的连续核苷酸序列(诸如反义寡核苷酸的siRNA或缺口聚体区域的引导链)与靶核酸之间的杂交触发。在一些实施例中，本发明的核酸分子包含寡核苷酸与靶核酸之间的错配。尽管错配，与靶核酸的杂交仍可能足以显示出所需的SARAF表达抑制。由错配导致降低的结合亲和力可以有利地通过寡核苷酸中与靶核酸互补的核苷酸数量的增加和/或能够增加与靶标的结合亲和力的修饰核苷数量的增加来补偿，所述修饰核苷为诸如存在于寡核苷酸序列内的2′糖修饰的核苷，包括LNA。
本发明的一个方面涉及长度为12至60个核苷酸的核酸分子，其包含长度为至少12个核苷酸，诸如长度为至少12至30个核苷酸的连续核苷酸序列，且与哺乳动物SARAF靶核酸，特别是人SARAF核酸至少95％互补，诸如完全互补。这些核酸分子能够抑制SARAF的表达。
本发明的一个方面涉及长度为12至30个核苷酸的核酸分子，其包含长度为至少12个核苷酸，诸如12至30个核苷酸的连续核苷酸序列，且与哺乳动物SARAF靶序列至少90％互补，诸如完全互补。
本发明的另一方面涉及根据本发明的核酸分子，其包含长度为12至20个核苷酸的连续核苷酸序列，其与SEQ ID NO：1的靶序列至少90％互补，诸如完全互补。
在一些实施例中，所述核酸分子包含长度为12至30个核苷酸的连续序列，其与靶核酸的区域或靶序列至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补。
如果所述核酸分子或其连续核苷酸序列与靶序列的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施例中可包含寡核苷酸与靶序列之间的一个或两个错配，则是有利的。
在一些实施例中，寡核苷酸序列与SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO∶9和/或SEQ ID NO：10的靶序列的区域100％互补。
在一些实施例中，本发明的核酸分子或连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的靶核酸至少90％或95％互补，诸如完全(或100％)互补。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10的靶核酸至少90％或95％互补，诸如完全(或100％)互补。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3的靶核酸至少90％或95％互补，诸如完全(或100％)互补。
在一些实施例中，本发明的核酸分子的连续序列与SEQ ID NO：1的区域至少90％互补，诸如完全互补，所述区域选自由如表4所示的靶区域1A至541A组成的组。
在一些实施例中，本发明的核酸分子的连续序列与SEQ ID NO：1的区域至少90％互补，诸如完全互补，所述区域选自由如表5所示的靶区域1C至91C组成的组。
在一些实施例中，本发明的核酸分子包含长度为12至60个核苷酸，诸如长度为13至50个、诸如14至35个、诸如15至30个、诸如16至22个的连续核苷酸，或由其组成。在优选的实施例中，所述核酸分子包含长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、或22个的核苷酸或由其组成。
在一些实施例中，与靶核酸互补的核酸分子的连续核苷酸序列包含长度为12至30个，诸如13至25个、诸如15至23个、诸如16至22个的连续核苷酸，或由其组成。
在一些实施例中，寡核苷酸选自由反义寡核苷酸、siRNA和shRNA组成的组。
在一些实施例中，与靶序列互补的siRNA或shRNA的连续核苷酸序列包含长度为18至28个，诸如19至26个、诸如20至24个、诸如21至23个的连续核苷酸，或由其组成。
在一些实施例中，与靶核酸互补的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列包含长度为12至22个，诸如14至20个、诸如16至20个、诸如15至18个、诸如16至18个、诸如16个、17个、18个、19个、或20个的连续核苷酸，或由其组成。
应当理解的是，可以修饰连续寡核苷酸序列(基序序列)以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。
将修饰的核苷(例如高亲和力修饰的核苷)掺入寡核苷酸序列中的模式通常称为寡核苷酸设计。
本发明的核酸分子可以使用修饰的核苷和RNA核苷(特别是用于siRNA和shRNA分子)或DNA核苷(特别是用于单链反义寡核苷酸)设计。优选地，使用高亲和力修饰的核苷。
在有利的实施例中，所述核酸分子或连续核苷酸序列包含一种或多种糖修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷，诸如包含一种或多种独立地选自由以下项组成的组的2′糖修饰的核苷：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含LNA核苷和DNA核苷。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)核苷。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2′-O-甲氧基乙基(2′MOE)核苷和DNA核苷。
有利地，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的最3′端核苷是2′糖修饰的核苷。
在另一个实施例中，所述核酸分子包含至少一个修饰的核苷间键。合适的核苷间修饰描述于″定义″章节的″修饰的核苷间键″下。
有利地，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键，诸如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。
在一些实施例中，连续核苷酸序列中的至少一个核苷间键是磷酸二酯核苷间键。
如果在寡核苷酸的5′或3′端的至少2个至3个核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，则是优选的。
对于单链反义寡核苷酸，如果连续核苷酸序列内的至少75％(诸如所有)的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键，则是优选的。在一些实施例中，单链反义寡核苷酸的连续序列中的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在本发明的有利实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够募集RNase H，诸如RNaseH1。有利的结构设计是如″定义″章节中，例如在″缺口聚体″、″LNA缺口聚体″和″MOE缺口聚体″下描述的缺口聚体设计。在本发明中，如果本发明的反义寡核苷酸是具有F-G-F′设计的缺口聚体，则是优选的。
在所有情况下，F-G-F′设计还可包括区域D′和/或D″，如″定义″章节中″寡核苷酸中的区域D′或D″″下所述。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，诸如长度为12至24个、诸如长度为12至18个核苷的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 24中的至少14个，诸如至少15个、诸如至少16个连续核苷酸。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，诸如长度为12至24个、诸如长度为12至18个核苷的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 25中的至少14个，诸如至少15个、诸如至少16个连续核苷酸。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，诸如长度为12至24个、诸如长度为12至18个核苷的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含存在于SEQ ID NO 26中的至少14个，诸如至少15个、诸如至少16个连续核苷酸。
本发明提供了根据本发明的LNA缺口聚体，其包含或由SEQ ID NO 24、SEQ ID NO25或SEQ ID NO 26所示的连续核苷酸序列组成。在一些实施例中，LNA缺口聚体是表7中CMPID NO：24_1、CMP ID NO：25_1或CMP ID NO：26_1的LNA缺口聚体。
在本发明的另一方面，本发明的核酸分子，诸如反义寡核苷酸、siRNA或shRNA，可以通过将它们共价连接到能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)结合的缀合物部分(诸如二价或三价GalNAc簇)而直接靶向至肝脏。
缀合
因为HBV感染主要影响肝脏中的肝细胞，所以将SARAF抑制剂缀合至缀合物部分是有利的，与未缀合的抑制剂相比，缀合物部分将增加抑制剂至肝脏的递送。在一个实施例中，肝靶向部分选自包括能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的胆固醇或其他脂质或缀合物部分在内的部分。
在一些实施例中，本发明提供了缀合物，其包含共价附接于缀合物部分的本发明的核酸分子。
脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)缀合物部分包含一种或多种能够以等于或大于半乳糖的亲和力结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASPGR靶向部分)的碳水化合物部分。许多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力已经进行过研究(例如：Jobst，S.T.和Drickamer，K.JB.C.1996，271，6686)或使用本领域典型的方法容易地确定。
在一个实施例中，缀合物部分包含至少一个选自由半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺组成的组的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分。有利地，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
为了生成ASGPR缀合物部分，可以将ASPGR靶向部分(优选地GalNAc)附接于缀合物支架上。通常，ASPGR靶向部分可以在支架的相同端。在一个实施例中，缀合物部分由连接至间隔物的二至四个末端GalNAc部分组成，所述间隔物将每一个GalNAc部分连接至可与反义寡核苷酸缀合的支链分子。
在另一个实施例中，缀合物部分相对于脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分为一价、二价、三价或四价。有利地，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
GalNAc缀合物部分可包括例如那些WO 2014/179620和WO 2016/055601和PCT/EP2017/059080(通过引用并入本文)中所述的缀合物部分，以及附接有GalNAc部分的小肽，例如Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3；与肝细胞上脱唾液酸糖蛋白受体结合的糖三肽，参见，例如，Duff等人，Methods Enzymol，2000，313，297)；基于赖氨酸的半乳糖簇(例如L3G4；Biessen等人，Cardovasc.Med.，1999，214)；和基于胆烷的半乳糖簇(例如，脱唾液酸糖蛋白受体的碳水化合物识别基序)。
可以使用本领域已知的方法将ASGPR缀合物部分，特别是三价GalNAc缀合物部分附接于寡核苷酸的3′端或5′端。在一个实施例中，ASGPR缀合物部分连接至寡核苷酸的5′端。
在一个实施例中，缀合物部分为三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，诸如图1所示的那些。在一个实施例中，缀合物部分是图1A-1或图1A-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图1B-1或图1B-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图1C-1或图1C-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或两者的混合物。在一个实施例中，缀合物部分是图1D-1或图1D-2的三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，或两者的混合物。
制造方法
在另一方面，本发明提供了用于制造本发明的寡核苷酸的方法，该方法包括使核苷酸单元反应并由此形成包含在寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，该方法使用亚磷酰胺化学方法(参见例如Caruthers等人，1987，Methods in Enzymology，第154卷，第287-313页)。在另一个实施例中，该方法进一步包括使连续核苷酸序列与缀合物部分(配体)反应以将缀合物部分共价附接于寡核苷酸。在另一方面中，提供了一种用于制造本发明的组合物的方法，该方法包括将本发明的寡核苷酸或缀合寡核苷酸与药用稀释剂、溶剂、运载体、盐和/或佐剂混合。
药用盐
根据本发明的化合物可以以其药用盐的形式存在。术语″药用盐″是指保留本发明的化合物的生物有效性和特性的常规酸加成盐或碱加成盐。
在另一方面中，本发明提供了核酸分子或其缀合物的药用盐，诸如药用钠盐、铵盐或钾盐。
药物组合物
在另一方面中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物中的任何化合物，特别是前述核酸分子和/或核酸分子缀合物或其盐，以及药用稀释剂、运载体、盐和/或佐剂。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施例中，核酸分子以50至300μM溶液的浓度在药用稀释剂中使用。
用于本发明的合适的制剂可见于《雷明顿药物科学(第十七版)》(Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.，1985)中。对于药物递送方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249：1527-1533，1990)。WO 2007/031091(通过引用并入本文)提供了药用稀释剂、运载体和佐剂的其他合适的和优选的实例。WO2007/031091中也提供了合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂。
在一些实施例中，本发明的核酸分子或核酸分子缀合物或其药用盐为固体形式，诸如粉末，诸如冻干粉末。
可以将本发明的核酸分子或核酸分子缀合物与药用活性或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。
这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的水溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性运载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以灵活的量包装在容器中，诸如在设计用于局部适用的乳膏或软膏的可挤压管中。
在一些实施例中，本发明的核酸分子或核酸分子缀合物是前药。特别地，对于核酸分子缀合物，一旦前药被递送至作用位点例如靶细胞，缀合物部分就被从核酸分子上切割下来。
施用
本发明的化合物、核酸分子或核酸分子缀合物或药物组合物可以局部施用(诸如施用至皮肤、吸入、眼部或耳部)或肠内施用(诸如口服或通过胃肠道施用)或肠胃外施用(诸如静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内或鞘内施用)。
在优选的实施例中，本发明的寡核苷酸或药物组合物通过肠胃外途径施用，所述肠胃外途径包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注。在一个实施例中，活性核酸分子或核酸分子缀合物是静脉内地施用的。在另一个实施例中，活性核酸分子或核酸分子缀合物是皮下施用的。
在一些实施例中，本发明的核酸分子、核酸分子缀合物或药物组合物以0.1-15mg/kg，诸如0.2-10mg/kg、诸如0.25-5mg/kg的剂量施用。施用可以是每周一次、每二周一次、每三周一次或甚至每月一次。
本发明还提供了SARAF抑制剂，诸如所述的本发明的核酸分子或核酸分子缀合物用于药物的制备的用途，其中该药物为用于皮下施用的剂型。
联合疗法
在一些实施例中，本发明的抑制剂，诸如本发明的核酸分子、核酸分子缀合物或药物组合物，用于与另一种治疗剂的联合治疗。治疗剂可以例如是上述疾病或病症的护理标准。
举例来说，SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子或核酸分子缀合物，可以与其他活性物质联合使用，所述其他活性物质为诸如基于寡核苷酸的抗病毒药(诸如基于序列特异性寡核苷酸的抗病毒剂)，其通过反义(包括其他LNA寡聚物)、siRNA(诸如ARC520)、适体、吗啉代物或任何其他抗病毒毒药，核苷酸序列依赖性作用模式作用。
作为进一步的示例，SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子或核酸分子缀合物，可以与其他活性物质，诸如免疫刺激性抗病毒化合物，诸如干扰素(例如聚乙二醇化干扰素α)、TLR7激动剂(例如GS-9620)或治疗性疫苗联合使用。
作为进一步的示例，SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子或核酸分子缀合物，可以与具有抗病毒活性的其他活性物质诸如小分子联合使用。这些其他活性物质可以是例如核苷/核苷酸抑制剂(例如恩替卡韦或富马酸替诺福韦二吡呋酯酯)、衣壳化抑制剂、进入抑制剂(例如Myrcludex B)。
在某些实施例中，附加治疗剂可以是HBV剂、丙型肝炎病毒(HCV)剂、化疗剂、抗生素、镇痛剂、非甾体抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、止吐剂、抗腹泻剂或免疫抑制剂。
在特别相关的实施例中，附加HBV剂可以是干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林；HBV RNA复制抑制剂；第二反义寡聚物；HBV治疗性疫苗；HBV预防性疫苗；拉米夫定(3TC)；恩替卡韦(ETV)；富马酸替诺福韦二吡呋酯酯(TDF)；替比夫定(LdT)；阿德福韦；或HBV抗体疗法(单克隆或多克隆)。
在其他特定的相关实施例中，另外的HCV剂可以是干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)；利巴韦林；Pegasys；HCV RNA复制抑制剂(例如ViroPharma的VP50406系列)；HCV反义剂；HCV治疗性疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解旋酶抑制剂；或HCV单克隆或多克隆抗体疗法。
应用
本发明的核酸分子可作为研究试剂使用，例如用于诊断、治疗和预防。
在研究中，此类核酸分子可用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中SARAF蛋白的合成，从而有助于靶标的功能分析或对其作为治疗干预靶标的可用性的评估。通常，通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA从而防止蛋白质形成，或通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA来实现靶标调节。
如果在研究或诊断中采用本发明的核酸分子，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。
本发明还包括在体内或体外调节表达SARAF的靶细胞中的SARAF表达的方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物。
在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，特别是人细胞。靶细胞可以是形成哺乳动物组织的一部分的体外细胞培养物或体内细胞。在优选的实施例中，靶细胞存在于肝脏中。靶细胞可以是肝细胞。
本发明的一个方面涉及用于用作药物的SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物。
在本发明的一个方面中，SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物，能够降低感染细胞中的cccDNA水平，并因此抑制HBV感染。特别地，所述核酸分子能够影响以下参数中的一者或多者：i)减少cccDNA和/或ii)减少pgRNA和/或iii)减少HBV DNA和/或iv)减少感染细胞中的HBV病毒抗原。
例如，抑制HBV感染的核酸分子可以i)与对照相比，将感染细胞中的cccDNA水平降低至少40％，诸如降低50％或60％；或ii)与对照相比，将pgRNA的水平降低至少40％，诸如降低50％或60％。对照可以是未处理的细胞或动物，或用适当的阴性对照处理的细胞或动物。
HBV感染的抑制作用可以在体外使用HBV感染的原代人肝细胞进行测量，或在体内使用人源化肝细胞PXB小鼠模型(可从PhoenixBio获得，也参见Kakuni等人，2014Int.J.Mol.Sci.15：58-74)进行测量。对HBsAg和/或HBeAg分泌的抑制可以通过ELISA测定，例如使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic)根据制造商的说明进行。细胞内cccDNA或HBV mRNA和pgRNA的减少可通过qPCR测定，例如，如″材料和方法″章节所述。评估测试化合物是否抑制HBV感染的其他方法是通过例如WO 2015/173208中所述的qPCR测量HBV DNA的分泌，或使用Northern印迹杂交、原位杂交或免疫荧光测量。
由于SARAF水平的降低，本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物可用于抑制HBV感染的发展或治疗HBV感染。特别地，与仅减少HBsAg分泌的化合物相比，SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物通过对cccDNA的去稳定化和减少而更有效地抑制了慢性HBV感染的发展或治疗慢性HBV感染。
因此，本发明的一个方面涉及SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物用于减少HBV感染个体中的cccDNA和/或pgRNA的用途。
本发明的另一方面涉及SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物用于抑制慢性HBV感染的发展或治疗慢性HBV感染的用途。
本发明的另一方面涉及SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物用于降低HBV感染的人的传染性的用途。在本发明的一个特定方面中，SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物抑制慢性HBV感染的发展。
用SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物治疗(或预防性地接受本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物)的受试者优选为人，更优选地为HBsAg阳性和/或HBeAg阳性的人类患者，甚至更优选地为HBsAg阳性和HBeAg阳性的人类患者。
因此，本发明涉及一种治疗HBV感染的方法，其中该方法包括施用有效量的SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物。本发明还涉及预防由慢性HBV感染引起的肝硬化和肝细胞癌的方法。在一个实施例中，本发明的SARAF抑制剂并非旨在用于治疗肝细胞癌，仅用于其预防。
本发明还提供了SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物化合物或药物组合物用于药物，特别是用于治疗HBV感染或慢性HBV感染或降低HBV感染的人的传染性的药物的制备的用途。在优选的实施例中，药物被制成用于皮下施用的剂型。
本发明还提供了本发明的核酸分子、缀合物化合物、药物组合物用于制备药物的用途，其中所述药物为用于静脉内施用的剂型。
SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物或药物组合物，可在联合疗法中使用。例如，可以将SARAF抑制剂，诸如本发明的核酸分子、缀合物或药物组合物与其他抗HBV剂诸如干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素αcon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林、拉米夫定(3TC)、恩替卡韦、替诺福韦、替比夫定(LdT)、阿德福韦或其他新兴的抗HBV药物诸如HBV RNA复制抑制剂、HBsAg分泌抑制剂、HBV衣壳抑制剂、反义寡聚物(例如，如WO2012/145697、WO 2014/179629和WO2017/216390中所述)、siRNA(例如，在WO 2005/014806、WO2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520、WO 2013/159109、WO 2017/027350和WO2017/015175中所述)、HBV治疗性疫苗、HBV预防性疫苗、HBV抗体治疗(单克隆或多克隆)或TLR2、3、7、8或9激动剂联合来治疗和/或预防HBV。
本发明的实施例
本发明的以下实施例可以与本文描述的任何其他实施例联合使用。上文所提供的定义和解释，尤其是在″发明内容″、″定义″和″具体实施方式″部分中提供的定义和解释在加以必要的修正后适用于下文。
1.一种SARAF抑制剂，其用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染。
2.根据实施例1所述使用的SARAF抑制剂，其中所述SARAF抑制剂以有效量施用。
3.根据实施例1或2所述使用的SARAF抑制剂，其中所述HBV感染是慢性感染。
4.根据实施例1至3所述使用的SARAF抑制剂，其中所述SARAF抑制剂能够减少感染细胞中的cccDNA和/或pgRNA。
5.根据实施例1至4中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述SARAF抑制剂防止或减少SARAF与cccDNA的缔合。
6.根据实施例5所述使用的SARAF抑制剂，其中所述抑制剂是特异性结合SARAF蛋白的小分子，其中所述抑制剂防止或减少SARAF蛋白与cccDNA的缔合。
7.根据实施例6所述使用的SARAF抑制剂，其中所述SARAF蛋白由SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10编码。
8.根据实施例1至7中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述抑制剂是长度为12-60个核苷酸的核酸分子，其包含长度为至少12个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成，所述连续核苷酸序列与哺乳动物SARAF靶核酸至少90％互补。
9.根据实施例8所述使用的SARAF抑制剂，其能够降低哺乳动物SARAF靶核酸的水平。
10.根据实施例8或9所述使用的SARAF抑制剂，其中所述哺乳动物SARAF靶核酸是RNA。
11.根据实施例10所述使用的SARAF抑制剂，其中所述RNA是前体mRNA。
12.根据实施例8至11中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述核酸分子选自由以下项组成的组：反义寡核苷酸、siRNA和shRNA。
13.根据实施例12所述使用的SARAF抑制剂，其中所述核酸分子是单链反义寡核苷酸或双链siRNA。
14.根据实施例8至13中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述哺乳动物SARAF靶核酸选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9和、SEQ ID NO：10成的组。
15.根据实施例8至13中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述核酸分子的所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的所述靶核酸至少98％互补。
16.根据实施例8至13中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述核酸分子的所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的所述靶核酸至少98％互补。
17.根据实施例1至16中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中当与对照相比时，HBV感染细胞中的所述cccDNA减少了至少50％，诸如60％。
18.根据实施例1至16中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中当与对照相比时，HBV感染细胞中的所述pgRNA减少了至少50％，诸如60％。
19.根据实施例8至18中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中当与对照相比时，所述哺乳动物SARAF靶核酸减少了至少50％，诸如60％。
20.一种长度为12至60个核苷酸的核酸分子，其包含长度为12至30个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成，其中所述连续核苷酸序列与哺乳动物SARAF靶核酸至少90％互补，诸如95％、诸如98％、诸如完全互补。
21.根据实施例20所述的核酸分子，其中所述核酸分子是化学产生的。
22.根据实施例20或21所述的核酸分子，其中所述哺乳动物SARAF靶核酸选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9和、SEQ ID NO：10成的组。
23.根据实施例20或21所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的所述靶核酸至少98％互补。
24.根据实施例20或21所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的所述靶核酸至少98％互补。
25.根据实施例20至23中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子的长度为12至30个核苷酸。
26.根据实施例20至25中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是RNAi分子，诸如双链siRNA或shRNA
27.根据实施例20至25中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是单链反义寡核苷酸。
28.根据实施例20至27中任一项所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列与选自表4或表5的靶核酸序列完全互补。
29.根据实施例20至28中任一项所述的核酸分子，其能够以低于-15kcal的ΔG°与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的靶核酸杂交。
30.根据实施例20至29中任一项所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列包含至少14个连续核苷酸，特别是15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个连续核苷酸或由其组成。
31.根据实施例20至29中任一项所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列包含14个至22个的核苷酸或由其组成。
32.根据实施例31所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列包含16至20个的核苷酸或由其组成。
33.根据实施例20至32中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含长度为14至25个的核苷酸或由其组成。
34.根据实施例33所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含至少一条长度为16至22个核苷酸的寡核苷酸链或由其组成。
35.根据实施例20至34中任一项所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14组成的组的靶序列完全互补。
36.根据实施例20至35中任一项所述的核酸分子，其中较之于与其互补的所述哺乳动物SARAF靶核酸，所述连续核苷酸序列具有零至三个错配。
37.根据实施例36所述的核酸分子，其中与所述哺乳动物SARAF靶核酸相比，所述连续核苷酸序列具有一个错配。
38.根据实施例36所述的核酸分子，其中与所述哺乳动物SARAF靶核酸相比，所述连续核苷酸序列具有两个错配。
39.根据实施例36所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列与所述哺乳动物SARAF靶核酸完全互补。
40.根据实施例20至39中任一项所述的核酸分子，其包含一个或多个修饰的核苷。
41.根据实施例40所述的核酸分子，其中所述一个或多个修饰的核苷是高亲和力修饰的核苷。
42.根据实施例40或41所述的核酸分子，其中所述一个或多个修饰的核苷是2′糖修饰的核苷。
43.根据实施例42所述的核酸分子，其中所述一个或多个2′糖修饰的核苷独立地选自由2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、2′-氟-ANA和LNA核苷组成的组。
44.根据实施例40至43中任一项所述的核酸分子，其中所述一个或多个修饰的核苷是LNA核苷。
45.根据实施例44所述的核酸分子，其中所述修饰的LNA核苷选自由氧基-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA、cET和ENA组成的组。
46.根据实施例44或45所述的核酸分子，其中所述修饰的LNA核苷是具有以下2′-4′桥-O-CH2-的氧基-LNA。
47.根据实施例46所述的核酸分子，其中所述氧基-LNA是β-D-氧基-LNA。
48.根据实施例44或45所述的核酸分子，其中所述修饰的LNA核苷为具有以下2′-4′桥-O-CH(CH3)-的cET。
49.根据实施例48所述的核酸分子，其中所述cET是(S)cET，即6′(S)甲基-β-D-氧基-LNA。
50.根据实施例44或45所述的核酸分子，其中所述LNA是ENA，具有以下2′-4′桥-O-CH2-CH2-。
51.根据实施例20至50中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含至少一个修饰的核苷间键。
52.根据实施例51所述的核酸分子，其中所述至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
53.根据实施例20至52中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是能够募集RNase H的反义寡核苷酸。
54.根据实施例53所述的核酸分子，其中所述反义寡核苷酸或所述连续核苷酸序列是缺口聚体。
55.根据实施例54所述的核酸分子，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含式5′-F-G-F′-3′的缺口聚体或由其组成，其中区域F和F′独立地包括1-4个2′糖修饰的核苷或由其组成，并且G是介于6个与18个核苷之间的能够募集RNase H的区域。
56.根据实施例55所述的核酸分子，其中所述1-4个2′糖修饰的核苷独立地选自由2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷组成的组。
57.根据实施例55或56所述的核酸分子，其中区域F和F′中的所述1-4个2′糖修饰的核苷中的一者或多者是LNA核苷。
58.根据实施例57所述的核酸分子，其中区域F和F′中的所有所述2′糖修饰的核苷均为LNA核苷。
59.根据实施例56至58中任一项所述的核酸分子，其中所述LNA核苷选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA、α-L-氨基-LNA、β-D-硫代-LNA、α-L-硫代-LNA、(S)cET、(R)cET β-D-ENA和α-L-ENA。
60.根据实施例56至59中任一项所述的核酸分子，其中区域F和F′由相同的LNA核苷组成。
61.根据实施例56至60中任一项所述的核酸分子，其中区域F和F′中的所有所述2′糖修饰的核苷均为氧基-LNA核苷。
62.根据实施例55至61中任一项所述的核酸分子，其中区域G中的所述核苷是DNA核苷。
63.根据实施例62所述的核酸分子，其中区域G由至少75％的DNA核苷组成。
64.根据实施例63所述的核酸分子，其中区域G中的所有所述核苷都是DNA核苷。
65.一种缀合物化合物，其包含根据实施例20至64中任一项所述的核酸分子，以及至少一个共价连接至所述核酸分子的缀合物部分。
66.根据实施例65所述的缀合物化合物，其中所述核酸分子是双链siRNA，并且所述缀合物部分共价连接至所述siRNA的所述有义链。
67.根据实施例65或66所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分选自碳水化合物、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素、维生素、病毒蛋白或它们的组合。
68.根据实施例65至67中任一项所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分能够与脱唾液酸糖蛋白受体结合。
69.根据实施例68所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分包含至少一个选自由半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺组成的组的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分。
70.根据实施例69所述的缀合物化合物，其中所述脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
71.根据实施例69或70所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分相对于所述脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分为一价、二价、三价或四价的。
72.根据实施例71所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分由两个至四个末端GalNAc部分和将每个GalNAc部分连接至可与所述反义化合物缀合的支链分子的间隔物组成。
73.根据实施例72所述的缀合物化合物，其中所述间隔物是PEG间隔物。
74.根据实施例68至73中任一项所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
75.根据实施例68至74中任一项所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分选自图1中的三价GalNAc部分中的一者。
76.根据实施例75所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分是图1D-1或图1D-2中的三价GalNAc部分，或两者的混合物。
77.根据实施例65至76中任一项所述的缀合物化合物，其包含位于所述核酸分子与所述缀合物部分之间的接头。
78.根据实施例77所述的缀合物化合物，其中所述接头是生理上不稳定的接头。
79.根据实施例78所述的缀合物化合物，其中所述生理上不稳定的接头是核酸酶敏感的接头。
80.根据实施例78或79所述的缀合物化合物，其中所述生理上不稳定的接头由2至5个连续的磷酸二酯键构成。
81.根据实施例68至80中任一项所述的缀合物化合物，其显示改善了在肝脏对比肾脏之间的细胞分布，或者与未缀合的核酸相比，改善了肝脏对所述缀合物化合物的细胞摄入。
82.一种药物组合物，其包含根据实施例20至64中任一项所述的核酸分子、根据实施例65至81中任一项所述的缀合物化合物或其药用盐以及药用稀释剂、运载体、盐和/或佐剂。
83.一种识别预防、改善和/或抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染的化合物的方法，包括：
a.将测试化合物与
i.SARAF多肽；或
ii.表达SARAF的细胞接触；
b.在存在或不存在所述测试化合物的情况下，测量SARAF的表达和/或活性；以及
c.识别降低SARAF表达和/或活性并减少cccDNA的化合物。
84.一种用于在表达SARAF的靶细胞中调节SARAF表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据实施例20至64中任一项所述的核酸分子、根据实施例65至81中任一项所述的缀合物化合物、或根据实施例82所述的药物组合物。
85.根据实施例84所述的方法，其中与未经任何处理或用对照物处理的水平相比，所述靶细胞中的所述SARAF表达减少了至少50％、或至少60％。
86.根据实施例84所述的方法，其中所述靶细胞被HBV感染，并且与未经任何处理或用对照处理的水平相比，在所述HBV感染靶细胞中，HBV感染细胞中的cccDNA减少了至少50％，或减少了至少60％。
87.一种用于治疗或预防疾病，诸如HBV感染的方法，其包括向患有或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防有效量的根据实施例20至64中任一项所述的核酸分子、根据实施例65至81中任一项所述的缀合物化合物、或根据实施例82所述的药物组合物。
88.根据实施例20至64中任一项所述的核酸分子，或根据实施例65至81中任一项所述的缀合物化合物，或根据实施例82所述的药物组合物，所述核酸分子、所述缀合物化合物、所述药物组合物以用于用作用于治疗或预防受试者中的疾病，诸如HBV感染的药物。
89.根据实施例20至64中任一项所述的核酸分子、或根据实施例65至81中任一项所述的缀合物化合物用于制备用于治疗或预防受试者中的疾病，诸如HBV感染的药物的用途。
90.根据实施例87-89所述的方法、核酸分子、缀合物化合物、或用途，其中所述受试者是哺乳动物。
91.根据实施例90所述的方法、核酸分子、缀合物化合物、或用途，其中所述哺乳动物是人。
92.根据实施例75所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分是图1B-1或图1B-2的三价GalNAc部分，或两者的混合物。
现在将通过以下实例说明本发明，所述实例不具有限制性。
实例
材料和方法
siRNA序列和化合物
表6A：由siRNA池的单个组分所靶向的人SARAF序列
SEQ ID NO： SARAF靶序列 SEQ ID NO：1上的位置 外显子
11 GGUACCAGGAGACGAUAAA 19304-19322 6
12 AGUACUACCUGUUAACAAU 19392-19410 6
13 ACAGAAUGUUGCUGCGGGA 9154-9172 2
14 UGGGAAUGUAAGACGGACU 13150-13168 3
siRNA池(ON-TARGETplus SMART池siRNA产品目录号LU-015281-02-0005，Dharmacon)含有四个单独的siRNA分子，该四个单独的siRNA分子靶向上表中列出的序列。
表6B：对照化合物
Figure BDA0003697803560000581
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成是本领域公知的。以下是可以实施的方案。就设备、载体和所用浓度而言，本发明的寡核苷酸可以通过略有变化的方法来产生。
使用亚磷酰胺方法在Oligomaker 48上以1μmol规模在尿苷通用载体上合成寡核苷酸。合成结束时，使用氨水于60℃将寡核苷酸从固体支持物上切割5-16小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相萃取纯化寡核苷酸，并通过UPLC进行表征，并通过ESI-MS进一步确认分子量。
寡核苷酸的延伸：
通过使用5′-O-DMT保护的亚酰胺在乙腈中的0.1M溶液和DCI(4，5-二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中用作激活剂，进行β-氰基乙基亚磷酰胺的偶联(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)或LNA-T)。对于最后的循环，可以使用具有所需修饰的亚磷酰胺，例如，用于附接缀合物基团或这样的缀合物基团的C6接头。通过使用氢化黄原素(0.01M，在乙腈/吡啶9∶1中)进行硫醇化以引入硫代磷酸酯键。可以使用碘在THF/吡啶/水7∶2∶1中的0.02M溶液引入磷酸二酯键。其余试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。
对于固相合成后的缀合，可以在固相合成的最后一个循环中使用可商购的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在脱保护并从固体支持物上裂解后，分离出氨基连接的脱保护的寡核苷酸。使用标准合成方法通过官能团的活化来引入缀合物。
通过RP-HPLC纯化：
粗制化合物在Phenomenex Jupiter C18 10μm 150x10mm色谱柱上通过制备型RP-HPLC纯化。0.1M醋酸铵pH 8和乙腈以5mL/min的流速用作缓冲液。将收集的级分冻干以给出纯化的化合物，通常为白色固体。
缩写：
DCI：4，5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMT：4，4′-二甲氧基三苯甲基
THF：四氢呋喃
Bz：苯甲酰基
Ibu：异丁酰基
RP-HPLC：反相高效液相色谱
Tm测定：
将寡核苷酸和RNA靶标(磷酸酯连接的，PO)双链体在500ml无RNase的水中稀释至3mM，并与500ml 2x Tm缓冲液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM磷酸钠、pH 7.0)混合。将溶液加热3分钟到95℃，然后在室温下退火30分钟。使用PE Templab软件在配备有Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40UV/VIS分光光度计(Perkin Elmer)上测量双链体解链温度(Tm)。温度从20℃上升到95℃，然后下降到25℃，记录在260nm处的吸收。使用一阶导数以及解链和退火的局部最大值来评估双链体Tm。
克隆生长培养基(dHCGM)。dHCGM是DMEM培养基，其包含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20mM Hepes、44mM NaHCO3、15μg/ml L-脯氨酸、0.25μg/ml胰岛素、50nM***、5ng/ml EGF、0.1mM Asc-2P、2％DMSO和10％FBS(Ishida等人，2015)。将细胞在37℃的培养箱中于具有5％CO2的潮湿气氛中进行培养。接种后24小时更换培养基，并每2天更换一次直至收获。
ASO序列和化合物
表7：本发明的寡核苷酸基序序列(由SEQ ID NO表示)的列表，以及基于基序序列设计的本发明的特定寡核苷酸化合物(由CMP ID NO表示)。
SEQ ID NO CMP ID NO 寡核苷酸化合物
24 24_1 GCAatatctaagtcCG
25 25_1 AGtattccaccagtTC
26 26_1 GGtatgcatgtttgGG
表中的表头″寡核苷酸化合物″代表基序序列的特定设计。大写字母为β-D-氧基LNA核苷，小写字母为DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，所有核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键(CMP ID NO＝化合物ID NO)。
HBV感染的PHH细胞
新鲜的原代人肝细胞(PHH)由PhoenixBio，Higashi-Hiroshima City，Japan以在96孔板中70,000个细胞/孔的形式提供(PXB-细胞也在Ishida等人，2015 Am J Pathol.185(5)：1275-85中描述)。
到达后，使用HepG2 2.2.15衍生的HBV(批次Z12)，通过将PHH细胞与HBV在PHH培养基中的4％(v/v)PEG中孵育16小时，以2GE的MOI感染PHH。然后将细胞用PBS洗涤三次，并在含有5％CO2的湿润气氛中在由DMEM(GIBCO，产品目录号21885)组成的新鲜PHH培养基中培养，该培养基补充有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(GIBCO，产品目录号10082)、2％(v/v)DMSO、1％(v/v)青霉素/链霉素(GIBCO，产品目录号15140-148)、20mM HEPES(GIBCO，产品目录号15630-080)、44mM NaHCO3(Wako，产品目录号195-14515)、15μg/ml的L-脯氨酸(MP-Biomedicals，产品目录号0219472825)、0.25μg/ml的胰岛素(Sigma，产品目录号I1882)、50nM的***(Sigma，产品目录号D8893)、5ng/ml EGF(Sigma，产品目录号E9644)和0.1mM L-抗坏血酸2-磷酸酯(Wako，产品目录号013-12061)。将细胞在37℃的培养箱中于具有5％CO2的潮湿气氛中进行培养。接种后24小时更换培养基，并每周更换三次直至收获。
siRNA转梁
感染后四天，用SARAF siRNA池一式三份地转染细胞。无药物对照(NDC)、阴性对照siRNA和HBx siRNA被包括作为对照(参见表7)。
每孔用2μl的阴性对照siRNA(储备液浓度1uM)、SARAF siRNA池(储备液浓度1μM)、HBx对照siRNA(储备液浓度0.12uM)或H2O(NDC)与18.2μl OptiMEM(Thermo FisherScientific，低血清培养基)和0.6ul
Figure BDA0003697803560000611
RNAiMAX转染试剂(ThermofisherScientific，产品目录号13778)制备转染混合物。在转染前，将转染混合物混合并在室温下孵育5分钟。在转染前，从PHH细胞中去除培养基，并更换为补充有不合P/S的HepaRG补充物(Biopredic International，#ADD711C)的100μl/孔的Williams E培养基+GlutaMAX(Gibco，#32551)。向每个孔中加入20μl转染混合物，对于阴性对照siRNA或SARAF siRNA池产生16nM的终浓度，或者对于HBx对照siRNA产生1.92nM的终浓度，并且在放入培养箱之前轻轻摇动平板。6小时后，用PHH培养基更换培养基。如上所述，在感染后第6天重复siRNA处理。在感染后第8天，收获上清液并储存于-20℃下。如果需要的话，可以从上清液中测定HBsAg和HBeAg。
LNA治疗
制备来自500μM储备液的两个LNA主混合板。对于终浓度为25μM的LNA处理，在第一主混合板中制备200uL的500μM储备LNA。对于终浓度为5μM的LNA处理，制备包含100μM的SARAF LNA的第二主混合板，混合40μL的每种500μM的SARAF LNA和160μL的PBS。
感染后四天，用终浓度为25μM的SARAF LNA(参见表7)一式两份或一式三份地处理细胞，或者用PBS作为无药物对照(NDC)处理细胞。在LNA处理之前，从细胞中去除旧培养基，并用114μl/孔的新鲜PHH培养基更换。每孔将6μL的500uM的SARAF LNA或作为NDC的PBS加入到该114μL的PHH培养基中。在感染后第4天、第11天和第18天重复相同的处理3次。在感染后的第7天、第14天和第21天，每三天更换一次新的细胞培养基。
对于cccDNA的定量，从感染后第7天到第21天，用终浓度为10nM的恩替卡韦(ETV)处理感染细胞。在感染后的第7天、第11天、第14天、第18天和第21天重复5次新鲜ETV处理。这种ETV处理用于抑制新的病毒DNA中间体的合成，并特异性检测HBV cccDNA序列。
HBV抗原表达的测量
如果需要的话，可以在所收集的上清液中测量HBV抗原的表达和分泌。根据制造商的方案，使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic#CL0310-2，#CL0312-2)测量HBV传播参数，HBsAg和HBeAg水平。简而言之，将每孔25μL的上清液转移至由各自抗体包被的微量滴定板，并添加25μL的酶缀合试剂。将该板于室温下在摇床上孵育60分钟，然后使用自动洗濯器用洗涤缓冲液将孔洗涤五次。向每一个孔中添加25μL底物A和B。在使用
Figure BDA0003697803560000621
发光读数器(Perkin Elmer)测量发光之前，将板于室温下在摇床上孵育10分钟。
细胞活力测量
通过细胞计数试剂盒-8(来自Sigma Aldrich的CCK8，#96992)测量无上清液细胞的细胞活力。为了进行该测量，将CCK8试剂在正常培养基中以1∶10稀释，并以100μl/孔加入到细胞中。在培养箱中孵育1小时后，将80μl上清液转移到透明的平底96孔板中，并使用酶标仪(Tecan)读取450nm处的吸光度。吸光度值被归一化为NDC，其被设置为100％以计算相对细胞活力。
使用细胞活力测量值来确认病毒参数的任何降低是否都不是由细胞死亡引起，该值越接近100％则毒性越低。从进一步的分析中排除了给予等于或低于NDC的20％的细胞活力值的LNA处理。
用子测量SARAF mRNA表达和病毒参数pgRNA、cccDNA和HBV DNA定量的实时PCR
在细胞活力测定后，将细胞用PBS洗涤一次。对于siRNA处理，将细胞用来自
Figure BDA0003697803560000631
Gene Expression Cells-to-CTTM试剂盒(Thermo Fisher Scientific，#AM1729)的50μl/孔裂解液裂解，并储存于-80℃下。对于用LNA处理过的细胞，根据制造商的方案，使用MagNA Pure robot和MagNA Pure 96 Cellular RNA Large Volume Kit(Roche，#05467535001)萃取总RNA。为了SARAF RNA和病毒pgRNA水平以归一化对照GUS B的定量，已经使用了
Figure BDA0003697803560000632
RNA-to-CtTM一步法试剂盒(Life Technologies，#4392656)。对于每个反应，使用2或4μl细胞裂解物、0.5μl的20x SARAF引物/探针、0.5μl的20x GUS BTaqman引物/探针、5μl的2x
Figure BDA0003697803560000633
RT-PCR混合物、0.25μl的40x
Figure BDA0003697803560000634
RT酶混合物和1.75μl经DEPC处理的水。表8中列出了用于GUS B RNA和靶标mRNA定量的引物。针对每个样品运行技术重复，并包括减去RT对照，以评估由于DNA的存在而导致的潜在扩增。
用以下方案，使用QuantStudio 12K Flex(Applied Biosystems)，通过RT-qPCR以技术重复来定量靶mRNA表达水平以及病毒pgRNA：48℃15分钟，95℃达10分钟，然后95℃达15秒达40个循环，并且60℃达60秒。
使用比较周期阈值2-ΔΔCt方法分析SARAF mRNA和pgRNA表达，该方法针对参考基因GUS B和未转染的细胞进行了归一化。经siRNA处理的细胞中的表达水平以平均无药物对照样品的％表示(即该值越低，则抑制/降低越大)。在经LNA处理的细胞中，表达水平表示为与未处理的细胞(NDC)(其被设定为100％)相比的抑制效果，并表示为所测量的两个独立生物重复的平均值+SD的百分比。对于cccDNA定量，从用siRNA或用LNA处理的HBV感染的原代人肝细胞中萃取总DNA。在cccDNA qPCR分析之前，用T5酶(10U/500ng DNA；New EnglandBiolabs，#M0363L)消化经siRNA处理的细胞裂解物的一部分，以去除病毒DNA中间体并仅定量cccDNA分子。在37℃下进行T5消化达30分钟。在经LNA处理的细胞裂解物上不施加T5消化以避免测定中的qPCR干扰。为了去除HBV DNA中间体并定量经LNA处理的细胞中的cccDNA水平，将细胞用恩替卡韦(10nM)处理3周，如LNA处理部分中所述。
为了定量经siRNA处理的细胞中的cccDNA，使用每孔含有2μl经T5消化的细胞裂解物、0.5μl 20x cccDNA_DANDRI Taqman引物/探针(Life Technologies，定制号AI1RW7N，FAM染料列于下表中)、5μl
Figure BDA0003697803560000641
快速高级主混合物(Applied Biosystems，#4444557)和2.5μl经DEPC处理的水的反应混合物。对每个样品运行一式三份的技术重复。
Figure BDA0003697803560000642
为了通过qPCR对经LNA处理的细胞中的cccDNA进行定量，制备16uL/孔的主混合物，其中每孔含有10ul 2x Fast SYBRTM绿色主混合物(Applied Biosystems，#4385614)、2ul cccDNA引物混合物(正向和反向各1uM)和4ul无核酸酶的水。还为cccDNA的归一化制备了每孔含10ul 2x Fast SYBRTM绿色主混合物(Applied Biosystems，#4385614)、2ul线粒体基因组引物混合物(正向和反向各1uM)和4ul无核酸酶的水的主混合物。
为了细胞内HBV DNA的定量和归一化对照人血红蛋白β(HBB)，使用含有2μl未消化的细胞裂解物、0.5μl 20x HBV Taqman引物/探针(Life Technologies，#Pa03453406_s1，FAM-染料)、0.5μl 20x HBB Taqman引物/探针(Life Technologies，#Hs00758889_s1，VIC-染料)、5μl
Figure BDA0003697803560000643
快速高级主混合物(Applied Biosystems，#4444557)和2μl经DEPC处理的水的各反应混合物。对每个样品运行一式三份的技术重复。
采用用于快速加热块的标准设置，在QuantStudioTM K12 Flex上运行qPCR(95℃达20秒，然后95℃达1秒进行40次循环，并且60℃达20秒)。
通过排除与每个处理条件的所有三个生物重复的中值Ct差异超过0.9的值，从数据集中去除任何异常值。经由2-ddCT方法从Ct值确定cccDNA(经siRNA和LNA处理的细胞)和总HBV DNA(仅经siRNA处理的细胞)的倍数变化，并归一化为作为管家基因的HBB或线粒体DNA。对于经siRNA处理的细胞，表达水平以平均无药物对照样品的％表示(即值越低，抑制/降低越大)。对于经LNA处理的细胞，对cccDNA的抑制效果表示为与被设定为100％的未处理的细胞(NDC)相比，来自三个独立生物重复的平均值+/-SD的百分比。
表8：GUS B和靶mRNA qPCR引物(Thermo Fisher Scientific)
SARAF(FAM)：Hs00903199_ml
管家基因引物GUS B(VIC)：Hs00939627_ml
pgRNA(FAM)：AILIKX5
实例1：siRNA处理导致的HBV感染的PHH细胞中SARAF mRNA、HBV细胞内DNA和cccDNA减少的测量
在下面的实验中，测试了SARAF敲低对HBV参数HBV DNA和cccDNA的影响。
将HBV感染的PHH细胞用来自Dharmacon的siRNA池(LU-015281-02-0005，参见表6A)处理，如材料和方法部分″siRNA转染″中所述。
在4天处理后，通过qPCR测量SARAF mRNA、cccDNA和细胞内HBV DNA，如材料和方法部分″用于测量SARAF mRNA表达和病毒参数pgRNA、cccDNA和HBV DNA的实时PCR″中所述。
结果在表9中显示为平均无药物对照样品％(即值越低，抑制/降低越大)
表9：用siRNA池敲低SARAF之后对HBV参数的影响。值被给定为生物和技术一式三份重复的平均值。
Figure BDA0003697803560000661
由此可见，SARAF siRNA池能够非常有效地减少cccDNA以及HBV DNA。与阴性对照相比，阳性对照在一定程度上减少了细胞内HBV DNA，但对cccDNA没有影响。
实例2：LNA处理导致的HBV感染的PHH细胞中SARAF mRNA、HBV细胞内pgRNA和cccDNA减少的测量
在下面的实验中，测试了SARAF敲低对HBV参数HBV DNA和cccDNA的影响。
用SARAF裸LNA(参见表7)处理HBV感染的PHH细胞，如在材料和方法部分″LNA处理″中所述。
在21天处理后，通过qPCR测量SARAF mRNA、cccDNA和细胞内HBV pgRNA，如材料和方法部分″用于测量SARAF mRNA表达和病毒参数pgRNA、cccDNA和HBV DNA的实时PCR″中所述。结果在表10中显示为相对于设定为100％的未处理细胞(NDC)的抑制效果，并表示为来自所测量的两个独立生物重复的平均值+SD的百分比。
表10：用裸LNA敲低SARAF之后对HBV参数的影响。值给出为两个或三个生物重复的平均值。数据显示了终浓度为25mM的LNA的效果
Figure BDA0003697803560000662
*未处理的细胞
由此可见，SARAF LNA能够显著降低SARAF mRNA的表达，从而导致pgRNA和cccDNA两者的表达水平的特别有效降低。
Figure IDA0003697803620000011
Figure IDA0003697803620000021
Figure IDA0003697803620000031
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Figure IDA0003697803620000181

Claims (33)

1.一种用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染的SARAF(钙库操控性钙内流相关调节因子)抑制剂。
2.根据权利要求1所述使用的SARAF抑制剂，其中所述HBV感染是慢性感染。
3.根据权利要求1或2所述使用的SARAF抑制剂，其中所述SARAF抑制剂能够减少HBV感染细胞中的cccDNA(共价闭合环状DNA)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述抑制剂是长度为12个至60个核苷酸的核酸分子，所述核酸分子包含与哺乳动物SARAF靶序列，特别是人SARAF靶序列至少95％互补的、长度为至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，并且所述抑制剂能够减少SARAF mRNA。
5.根据权利要求1至4中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述抑制剂选自由单链反义寡核苷酸、siRNA和shRNA分子组成的组。
6.根据权利要求1至5中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述哺乳动物SARAF靶序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
7.根据权利要求4至6中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的靶序列至少98％互补。
8.根据权利要求3至7中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中当与对照相比时，HBV感染细胞中的cccDNA减少至少60％。
9.根据权利要求4至7中任一项所述使用的SARAF抑制剂，其中当与对照相比时，所述SARAF mRNA减少至少60％。
10.一种长度为12个至30个核苷酸的核酸分子，所述核酸分子包含与哺乳动物SARAF靶序列，特别是人SARAF靶序列90％互补的、至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，其中所述核酸分子能够抑制SARAF的表达。
11.根据权利要求10所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10组成的组的序列完全互补。
12.根据权利要求10或11所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含长度为12个至25个，特别是16个至20个核苷酸的连续核苷酸序列。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是RNAi分子，诸如双链siRNA或shRNA。
14.根据权利要求10至12中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是单链反义寡核苷酸。
15.根据权利要求14所述的核酸分子，其中所述单链反义寡核苷酸能够募集RNase H。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含一个或多个2′糖修饰的核苷。
17.根据权利要求Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.，所述的核酸分子，其中所述一个或多个2′糖修饰的核苷独立地选自由以下项组成的组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。
18.根据权利要求Fehler！Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.或17中任一项所述的核酸分子，其中所述一个或多个2′糖修饰的核苷是LNA核苷。
19.根据权利要求10至18中任一项所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。
20.根据权利要求19所述的核酸分子，其中所述连续核苷酸序列内的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。
21.根据权利要求10至20中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子能够募集RNaseH。
22.根据权利要求10至21中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子或其连续核苷酸序列包含式5′-F-G-F′-3′的缺口聚体，其中区域F和F′独立地包含1个至4个2′糖修饰的核苷，并且G是介于6个与18个之间的能够募集RNase H的核苷的区域，诸如包含介于6个与18个之间的DNA核苷的区域。
23.一种缀合物化合物，其包含根据权利要求10至22中任一项所述的核酸分子，以及共价连接至所述核酸分子的至少一个缀合物部分。
24.根据权利要求23所述的缀合物化合物，其中所述缀合物部分选自图1中的三价GalNAc部分中的一个。
25.根据权利要求23或24所述的缀合物化合物，其中所述缀合物化合物包含由2至5个连接的核苷组成的包含至少两个连续的磷酸二酯键的生理上不稳定的接头，其中所述生理上不稳定的接头共价结合在所述核酸分子的5′或3′末端处。
26.一种根据权利要求10至22中任一项所述的核酸分子、根据权利要求23至25中任一项所述的缀合物化合物的药用盐。
27.一种药物组合物，其包含根据权利要求10至22中任一项所述的核酸分子、根据权利要求23至25中任一项所述的缀合物化合物、或根据权利要求26所述的药用盐，以及药用赋形剂。
28.一种用于在表达SARAF的靶细胞中调节SARAF表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求10至22中任一项所述的核酸分子、根据权利要求23至25中任一项所述的缀合物化合物、根据权利要求26所述的药用盐或根据权利要求27所述的药物组合物。
29.一种用于治疗或预防疾病的方法，其包括向患有或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防有效量的根据权利要求10至22中任一项所述的核酸分子、根据权利要求23至25中任一项所述的缀合物化合物、根据权利要求26所述的药用盐或根据权利要求27所述的药物组合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述疾病是乙型肝炎病毒(HBV)感染。
31.根据权利要求10至22中任一项所述的核酸分子、根据权利要求23至25中任一项所述的缀合物化合物、根据权利要求26所述的药用盐或根据权利要求27所述的药物组合物，其用于药物。
32.根据权利要求10至22中任一项所述的核酸分子、根据权利要求23至25中任一项所述的缀合物化合物、根据权利要求26所述的药用盐或根据权利要求27所述的药物组合物，其用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染。
33.根据权利要求10至22中任一项所述的核酸分子、根据权利要求23至25中任一项所述的缀合物化合物、根据权利要求26所述的药用盐或根据权利要求27所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染。
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