MX2012009178A - Composiciones para liberacion dirigida de arnsi. - Google Patents

Composiciones para liberacion dirigida de arnsi.

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David L Lewis
Torsten Hoffmann
Eric A Kitas
David B Rozema
Darren H Wakefield
Peter Mohr
Philipp Hadwiger
Wilma Thuer
Linda Christine Valis
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Abstract

La presente invención está dirigida a composiciones para liberación dirigida de polinucleótidos de ARN de interferencia (ARNi) a hepatocitos in vivo. Los polinucleótidos de ARNi dirigidos son administrados juntos con polímeros de liberación co-dirigidos. Los polímeros de liberación proporcionan función de penetración de membrana para movimiento de los polinucleótidos de ARNi del exterior de la célula al interior de la célula. La modificación reversible proporciona sensibilidad fisiológica a los polímeros de liberación.

Description

COMPOSICIONES PARA LIBERACION DIRIGIDA DE ARNsi Descripción de la Invención La liberación de polinucleótido y otros compuestos sustancialmente impermeables a membranas celulares en una célula viva es altamente restringida por el sistema de membrana compleja de la célula. Fármacos utilizados en antisentido, ARNi, y terapias génicas son polímeros hidrofílicos relativamente grandes y con frecuencia son altamente cargados negativamente. Ambas de estas características físicas impiden su difusión directa a través de la membrana celular. Por esta razón la mayor barrera a la liberación del polinucleótido es la liberación de polinucleótido a través de la membrana celular al citoplasma o núcleo celular.
Un medio que ha sido utilizado para liberar ácidos nucleicos pequeños in vivo ha sido unir el ácido . nucleico . a ya sea una molécula pequeña dirigida o un lípido o esterol. Aún cuando han sido observados algo de liberación y actividad con esos conjugados, la dosis de ácido nucleico requerida con esos métodos ha sido prohibitivamente grande.
Numerosos reactivos ' de transfección han sido desarrollados para lograr la liberación razonablemente eficiente de polinucleótidos a células in vitro. Sin embargo, la liberación in vivo de polinucleótidos que utilizan los Ref . : 233407 mismos reactivos de transfección es complicada y se vuelve ineficaz por la toxicidad in vivo, interacciones de suero, y dirección ineficiente. Los agentes de transfección que trabajan bien in vitro, polímeros catiónicos y lípidos, generalmente forman grandes partículas electrostáticas y desestabilizan las membranas celulares . La carga positiva de los reactivos de transfección in vitro facilita la asociación con ácido nucleico mediante interacciones carga-carga (electrostática) de este modo formando el complejo del reactivo de ácido nucleico/trans ección. La carga positiva también es benéfica para la unión no específica del vehículo a la célula y para la fusión de membrana, desestabilización, o alteración. La desestabilización de membranas facilita la liberación de polinucleótido de membrana sustancialmente impermeable a través de una membrana celular. Mientras esas propiedades facilitan la transferencia de ácido nucleico in vitro, causan toxicidad y direccionamiento ineficaz in vivo. La carga catiónica resulta en interacción con componentes de suero, que causan desestabilización de la interacción del reactivo de transfección del polinucleótido y una biodisponibilidad y direccionamiento pobre. La actividad de la membrana de los reactivos de transfección que puede ser eficaz in vitro, con frecuencia conduce a toxicidad in vivo.
Para la liberación in vivo, el vehículo (ácido nucleico y agente de liberación asociado) deberá ser pequeño, menor a 100 nm de diámetro, y preferiblemente menor a 500 nm. Incluso los complejos más pequeños, menores a 20 nm o menores a 10 nm serían incluso más útiles. Los vehículos de liberación mayores a 100 nm tienen muy poco acceso a otras células que no sean células de vasos sanguíneos in vivo. Los complejos formados por interacciones electrostáticas tienden a agregarse o a caerse cuando son expuestos a concentraciones de sal fisiológica o componentes de suero. Además, la carga catiónica de los vehículos de liberación in vivo conduce a las interacciones de suero adversas y por tanto a una pobre biodisponibilidad. De manera interesante, la alta carga negativa también puede inhibir la liberación in vivo al interferir con las interacciones necesarias para direccionamiento . De este modo, los vehículos neutrales cercanos son deseables para la distribución y direccionamiento in vivo. Sin una regulación cuidadosa, la ruptura de membrana o actividades de desestabilización son tóxicas cuando son utilizadas in vivo. Al equilibrar la toxicidad del vehículo con la liberación de ácido nucleico es más fácilmente de lograr in vitro que in vivo.
Rozema et al., en la publicación de Patente U.S. 20040162260 demostraron un medio para regular reversiblemente la actividad de ruptura de membrana de una poliamina de membrana activa. La poliamina de membrana activa proporciona un medio para romper membranas celulares. La regulación reversible dependiente de pH proporciona un medio para limitar la actividad a los endosomas de células dirigidas, de este modo limitando la toxicidad. Su método se basa en la modificación de aminas en una poliamina con anhídrido 2-propiónico-3-metilmaleico.
Esta modificación convirtió el policatión a un polianión mediante la conversión de aminas primarias a pares de grupos carboxilo (carboxilo ß y carboxilo ?) y la actividad de la membrana inhibida reversiblemente de la poliamida. Rozema et al., (Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57) reportó que el carboxilo ß no exhibió una completa carga aparentemente negativa y por sí mismo no fue capaz de inhibir la actividad de la membrana. La adición del grupo carboxilo ? fue reportado que es necesario para la efectiva inhibición de la actividad de la membrana. Para permitir la co-liberación del ácido nucleico con el vehículo de liberación, el ácido nucleico fue ligado covalentemente al polímero de liberación. Estos fueron capaces de mostrar la liberación de polinucleótidos a las células in vítro utilizando su sistema de liberación conjugado biológicamente lábil. Sin embargo, debido a que el vehículo fue altamente cargado negativamente, con el ácido nucleico y el polímero modificado teniendo una alta densidad de carga negativa, este sistema no fue eficiente para la liberación in vivo. La carga negativa probablemente inhibió el direccionamiento específico de las células dirigidas y mejoró la absorción no específica mediante el sistema reticuloendotelial (RES, por sus siglas en inglés) . También al utilizar los polímeros modificados con anhídrido 2 -propiónico-3 -metilmaleico, Rozema et l. demostraron la formación de pequeños complejos electrostáticos ternarios de ácidos nucleicos, policationes , y polímeros modificados con anhídrido 2-propiónico-3-metilmaleico .
Rozema et al., en la Publicación de patente U.S. 20080152661, mejoraron el método de la Publicación de Patente U.S. 20040162260 mediante la eliminación de la densidad de carga alta negativa del polímero activo de membrana modificada. Mediante la sustitución del direccionamiento hidrofílico neutral (galactosa) y grupos de estabilización estéricos (PEG) para el carboxilo ? del anhídrido 2-propiónico-3 -metilmaleico, Rozema et al. fueron capaces de retener en su totalidad la solubilidad al agua y la inhibición reversible de la actividad de membrana mientras incorporan eficazmente el direccionamiento de células de hepatocito in vivo. Como antes, el polinucleótido fue ligado covalentemente al polímero de transíección. La unión covalente del polinucleótido al polímero de transfeccion se mantuvo para asegurar la co-liberación del polinucleótido con el polímero de transfeccion a la célula dirigida durante la administración in vivo para prevenir la disociación del polinucleótido del polímero de transfeccion. La co- liberación del polinucleótido y el polímero de transfeccion fue requerida debido a que el polímero de transfeccion proporcionado para el transporte del nucleótido a través de una membrana celular, ya sea desde el exterior de la célula o desde el interior de un compartimiento endocítico, al citoplasma celular. La publicación de patente U.S. 20080152661 demostró una liberación altamente eficiente de polinucleótidos , específicamente oligonucleótidos AR i, a células hepáticas in vivo utilizando este nuevo policonjugado y mejorado fisiológicamente receptivo.
Sin embargo, la unión covalente del ácido nucleico a la poliamina conlleva limitaciones inherentes. La modificación de los polímeros de transfeccion, para unirse tanto al ácido nucleico como a los agentes de enmascaramiento es complicada debido a interacciones de carga. La unión de un ácido nucleico cargado negativamente a un polímero positivamente cargado es propenso a la agregación de este modo limitando la concentración de la mezcla. La agregación puede ser superada por la presencia de un exceso de policatión o polianión. Sin embargo, esta solución limita las proporciones que el ácido nucleico y el polímero pueden ser formulados. Además, la unión del ácido nucleico negativamente cargado en el polímero catiónico no modificado ocasiona la condensación y agregación del complejo e inhibe la modificación del polímero. La modificación del polímero, forma un polímero negativo, afecta la unión del ácido nucleico.
En una modalidad preferida, la invención presenta una composición para liberar un polinucleótido de interferencia de ARN a una célula hepática in vivo que comprende: una poliamina de membrana activa reversiblemente enmascarada dirigida al receptor de asialoglicoproteína (ASGPr, por sus siglas en inglés) (polímero de liberación) y un polinucleótido de ARN de interferencia conjugado a un grupo hidrofóbico que contiene por lo menos 20 átomos de carbono (conjugado de ARN) . El polímero de liberación y el conjugado de ARNsi son sintetizados de manera separada y pueden ser proporcionados en contenedores separados o en un solo contenedor. El polinucleótido de ARN de interferencia no es conjugado al polímero.
En una modalidad preferida, la invención presenta una composición para la liberación de un polinucleótido de ARN de interferencia no es conjugado al polímero.
En una modalidad preferida, la invención presenta una composición para liberar un polinucleótido de ARN de interferencia a una célula hepática in vivo que comprende: una poliamina de membrana activa reversiblemente enmascarada dirigida a ASGPr (polímero de liberación) y un polinucleótido de AR de interferencia conjugado a . una galactosamina trivalente (conjugado de ARN) . El polímero de liberación y el conjugado de ARNsi son sintetizados por separado y pueden ser proporcionados en contenedores separados o en un solo recipiente. El polinucleótido de ARN de interferencia no es conjugado al polímero.
En una modalidad, la poliamina de membrana activa incluye: un polímero amfipático formado por la polimerización aleatoria de monómeros que contienen amina y monómeros que contienen grupos hidrofóbicos menores. Los monómeros que contienen amina contienen grupos amino pendientes seleccionados de un grupo que consiste de: amina primaria y amina secundaria. Los monómeros hidrofóbicos menores contienen grupos hidrofóbicos pendientes que tienen de 1-6 átomos de carbono. La proporción de grupos amina con respecto a grupos hidrofóbicos es seleccionada para formar un polímero soluble en agua con una actividad interrumpida de membrana, preferiblemente =1 monómero de amina por monómero hidrofóbico. En una modalidad el polímero tendrá de 60-80% de monómeros de amina. Los grupos hidrofóbicos pueden ser seleccionados de un grupo que consiste de: grupo alquilo, grupo alquenilo, grupo alquinilo, grupo arilo, grupo aralquilo, grupo aralquenilo, y grupo aralquinilo, cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado, o cíclico. Los grupos hidrofóbicos son preferiblemente hidrocarburos, que contienen únicamente átomos de carbono e hidrógeno. Sin embargo, sustituciones o he eroátomos que mantienen la hidrofobicidad, e incluyen, por ejemplo fluoruro, pueden ser permitidos. Particularmente poliaminas de membrana activa apropiadas incluyen copolímeros aleatorios de poli (vinil éter) o copolímeros aleatorios de poli (acrilato) .
En una modalidad, la poliamina de membrana activa comprende: un polímero amfipático formado por polimerización aleatoria de monómeros que contienen amina, monómeros hidrofóbicos menores, y monómeros hidrofóbicos mayores. Los monómeros que contienen amina contienen grupos amino pendientes seleccionados del grupo que consiste de: amina primaria y amina secundaria. Los monómeros hidrofóbicos menores contienen grupos hidrofóbicos pendientes que tienen de 1-6 átomos de carbono Los monómeros hidrofóbicos mayores contienen grupos hidrofóbicos pendientes que tienen de 12-36 o más átomos de carbono. La proporción de grupos amina con respecto a grupos hidrofóbicos es seleccionada para formar un polímero' soluble en agua con una actividad de ruptura de membrana preferiblemente =1 de monómero de amina por monómero hidrofóbico. En una modalidad el polímero tendrá de 60-80% de monómeros de amina. Los grupos hidrofóbicos pueden ser seleccionados del grupo que consiste de: grupo alquilo, grupo alquenilo, grupo alquinilo, grupo arilo, grupo aralquilo, grupo aralquenilo, y grupo aralquinilo, cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado, o cíclico, esterol, esteroide, y derivado de esteroide. Los grupos hidrofóbicos son preferiblemente hidrocarburos, que contienen únicamente átomos de carbono e hidrógeno. Sin embargo, sustituciones o heteroátomos que mantienen la hidrofobicidad, e incluyen, por ejemplo fluoruro, pueden ser permitidos. Particularmente poliaminas de membrana activa apropiadas incluyen terpolímeros aleatorios de poli(vinil éter) o terpolímeros aleatorios de poli (acrilato) .
En una modalidad preferida, una poliamina de membrana activa enmascarada reversiblemente comprende una poliamina de membrana activa de la invención reversiblemente modificada mediante reacción de aminas en el polímero con agentes de enmascaramiento. La modificación reversible de la poliamina de membrana activa. reversiblemente inhibe la actividad de la membrana de la poliamina de membrana activa. Preferiblemente, un agente de enmascaramiento también proporciona una función de direccionamiento y/o función que evita la interacción de suero. La modificación de la amina de polímero con el agente de enmascaramiento también neutraliza preferiblemente la carga de la amina. Un agente de enmascaramiento preferible comprende una galactosamina o derivado de galactosamina o un polietilenglicol que tiene un grupo reactivo con amina de anhídrido maleico disustituido. La reacción del anhídrido con una amina reversiblemente modifica la amina para formar un maleamato o ácido maleámico. En el estado enmascarado, la poliamina de membrana activa reversiblemente a enmascarada no exhibe actividad de ruptura de membrana. La modificación reversible de más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, o más de 80% de las aminas en la poliamina con agentes de enmascaramiento puede ser requerida para inhibir la actividad de membrana y proporcionar una función de direccionamiento celular, en este caso formar un polímero de membrana activa reversiblemente enmascarado. La inhibición de la actividad * de la membrana y/o direccionamiento in vivo de las poliaminas de membrana activa descritas requiere una modificación de >50% de las aminas de polímero.
Un agente de enmascaramiento preferido comprende un anhídrido alquilmaleico hidrofílico neutral sustituido: en donde Rl comprende una fracción dirigida o un estabilizador estérico. Un ejemplo de un anhídrido alquilmaleico sustituido consiste de un derivado de anhídrido 2 -propiónico-3 -alquilmaleico . Un derivado de anhídrido 2- propiónico-3 -alquilmaleico hidrofílico neutral es formado por la unión de un grupo hidrofílico neutral a un anhídrido 2- propiónico-3-alquilmaleico mediante el grupo ?-carboxil anhídrido 2-propiónico-3-alquilmaleico. En una modalidad, el grupo alquilo consiste de un grupo metilo.
Un agente de enmascaramiento preferido proporciona función de direccionamiento mediante la afinidad por los • receptores de superficie celular, en este caso el agente de enmascaramiento contiene un ligando para un receptor de superficie celular. Los agentes de enmascaramiento preferidos contienen sacáridos que tienen afinidad por el ASGPr, incluyendo pero no limitándose a: galactosa, N-Acetil- galactosamina y derivados de galactosa. Los derivados de galactosa que tienen afinidad por el ASGPr son bien conocidos en el arte previo Una característica esencial de la poliamina de membrana activa modificada reversiblemente es que al menos algunos, o la mayoría de los agentes de enmascaramiento unidos al polímero proporcionan una función de direccionamiento de la célula. Otro agente de enmascaramiento preferido proporciona una bio-distribución mejorada mediante la inhibición de interacciones no específicas entre el polímero modificado por reversibilidad y componentes de suero o células no dirigidas y por la reducción de la agregación del polímero. Agentes de enmascaramiento preferidos que tienen una función estabilizadora estérica incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicoles . En una modalidad, una combinación de agentes de enmascaramiento de estabilizador estérico y direccionamiento y son utilizados.
El conjugado de polinucleótido de ARNi y polímero de liberación son suministrados a un mamífero en portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En una modalidad, el polímero de liberación y el conjugado de polinucleótido de ARNi pueden ser combinados en una solución antes de a la adnibistración al mamífero. En otra modalidad, el polímero, de liberación y el conjugado de polinucleótido de ARNi pueden ser co-suministrados al mamífero en soluciones separadas. En todavía otra modalidad, el polímero de liberación y el conjugado de polinucleótido de ARNi pueden ser suministrados al mamífero secuencialmente . Para la administración secuencial, el polímero de liberación puede ser suministrado antes del conjugado de polinucleótido de ARNi. Alternativamente, para la administración secuencial, el conjugado de polinucleótido de ARNi puede ser suministrado antes del suministro del polímero de liberación.
Objetos, características, y ventajas adicionales de la invención serán evidented a partir de la siguiente descripción detallada cuando son tomados en conjunto con las Figuras anexas .
FIG. 1. Esquema de reacción para la polimerización de terpolímeros aleatorios de poli (vinil éter) amfipáticos.
FIG. 2. Ilustración gráfica del efecto de la dosis de conjugado de AR si-colesterol en la reducción del gen.
FIG. 3. Ilustración gráfica del efecto del tamaño de hidrófobo en el direccionamiento del conjugado de ' ARNsi-hidrófobo al hígado.
FIG. 4. Ilustración gráfica del efecto de la dosis del conjugado de ARNsi-hidrófobo en la reducción del gen para varios grupos hidrofóbicos .
FIG. 5. Ilustración gráfica del efecto de la dosis de polímero de liberación en liberación del conjugado de ARNsi-hidrófobo al hígado.
Lo descrito es aquí un método mejorado para liberación de polinucleótidos de ARN de interferencia (ARNi) , a células hepáticas en mamífero in vivo. El método también proporciona métodos mejorados de producción de vehículos de liberación del polinucleótido de ARNi. Previamente, la liberación in vivo de polinucleótidos, requirió asociación física del polinucleótido con el vehículo de liberación. El polinucleótido fue electrostáticamente asociado con el vehículo de liberación, como en complejos de policatión/ácido nucleico, encapsulados por el vehículo de liberación, como en liposomas y partículas de lípido-ácido nucleico estables (SNALPs) , o unidas covalentemente a un vehículo de liberación, como en Dynamic PolyConjugates (Rozema et al. 2007) . Sorprendentemente, hemos encontrado que al utilizar las moléculas de conjugado de polinucleótido de AR i apropiadas y polímeros de liberación apropiadamente dirigidos, el polinucleótido de ARNi puede ser separado del polímero de liberación y aún llevar a cabo la liberación eficiente de hepatocitos del polinucleótido.
La capacidad para separar el polinucleótido del polímero de liberación proporciona ventajas en formulación, síntesis y fabricación. a) Al retirar el requerimiento de que el polinucleótido y el polímero están asociados, ya sea por unión covalente o por interacción carga-carga, la concentración de los polímeros y polinucleótidos y el intervalo entre ellos está limitado únicamente por la solubilidad de los componentes más bien que la solubilidad del complejo asociado o la capacidad para fabricar el complejo. La solubilidad incrementada permite la concentración de polímero de liberación o polinucleótido incrementada y por lo tanto dosis incrementada . b) El polinucleótido y el polímero de liberación pueden ser mezclados en cualquier momento antes de la administración, o incluso suministrarlos por separado. De este modo, la separación permite que los componentes sean almacenados por separado, ya sea en solución o secos. c) Una formulación más estable, menor es posible comparada con los sistemas de liberación no covalentes, inherentemente inestables grandes. d) La fabricación del polímero de liberación de es más fácil en la ausencia de un polinucleótido cargado negativamente unido covalentemente o la necesidad de unir covalentemente un polinucleótido cargado negativamente. e) La fabricación es simplificada y requiere de menos pasos en ausencia de una asociación física del polinucleótido con el polímero de liberación. f) Son observadas mejoras en el direccionamiento de ARNsi y polímero.
La invención incluye sistemas de liberación conjugados de la estructura general : (M^LJx-P- (L-M2)y más N-T, en donde N es un polinucleótido de ARNi, T es una fracción de direccionamiento de un polinucleótido (ya sea un grupo hidrofóbico que tiene 20 o más átomos de carbono o un agrupamiento de galactosa) , P es una poliamina de membrana activa, y el agente de enmascaramiento M1 contiene una fracción dirigida, una galactosa o derivado de galactosa que tiene afinidad por el receptor de asialoglicoproteína, ligado covalentemente a P mediante una unión fisiológicamente reversible L, como un enlace de maleamato . El rompimiento de L restaura una amina no modificada en poliamina P. El agente de enmascaramiento M2 es opcional. Si está presente, M2 es un estabilizador estérico hidrofílico unido covalentemente a P mediante un enlace fisiológicamente reversible L, como un enlace de maleamato . x y y son cada uno números enteros . En este estado no modificado, P es una poliamina de membrana activa. El polímero de liberación (Mx-L) X-P- (L-M2) y no es una membrana activa. La modificación reversible de aminas P, mediante la unión de 1 y opcionalmente M2, inhibe reversiblemente o inactiva la actividad de la membrana de P y reduce la carga positiva neta de P. Suficientes agentes de enmascaramiento son unidos a P para inhibir la actividad de la membrana del polímero, x + y tiene un valor mayor del 50%, más preferiblemente mayor del 60%, y más preferiblemente mayor del 70% de las aminas en poliamina P, como se determinó por la cantidad de aminas en P en la ausencia de cualquier agente de enmascaramiento. Una vez ocurrido el rompimiento de enlaces reversibles L, las aminas no modificadas son restablecidas de este modo revirtiendo P a su estado de membrana activa no modificada. La unión reversible del enlace reversible L es seleccionada de manera que ese rompimiento ocurre en una condición fisiológica deseada, de manera que esté presente en un tejido, órgano o ubicación sub-celular deseado. Un enlace reversible preferido es un enlace de pH lábil. (M1-L) X-P- (L-M2) y, un polímero de membrana activa reversiblemente enmascarado dirigido a ASGPr (polímero enmascarado) , y T-N, un conjugado de polinucleótido, son sintetizados o fabricados por searado. Ni t ni N están ligados covalentemente directa o indirectamente a P, L, M1 o M2. La asociación electrostática o hidrofóbica del polinucleótido o el conjugado de polinucleótido con el polímero enmascarado o no enmascarado no se requiere para la liberación al hígado in vivo del polinucleótido. El polímero enmascarado y el conjugado de polinucleótido pueden ser suministrados en el mismo recipiente o en recipientes separados. Pueden ser combinados antes de la administración, co- suministrados , o suministrados secuencraímente .
Polímero Los polímeros de la invención son poliaminas de membrana activa amfipáticas. Un polímero es una molécula construida mediante la unión repetitiva junto a unidades menores llamadas monomeros. Un polímero puede ser un homopolímero en el que un solo monómero es utilizado o un polímero puede ser un copolímero o heteropolimero en el cual dos o más monomeros diferentes son utilizados. La cadena principal de un polímero está compuesta de átomos cuyos enlaces son requeridos para la propagación de la longitud de un polímero. Una cadena lateral de un polímero está compuesta de átomos cuyos enlaces no son requeridos para propagación de la longitud de un polímero.
Más específicamente, los polímeros de la invención son copolímeros aleatorios de membrana activa amfipática. Los monomeros . en copolímeros aleatorios no tienen un arreglo definido a lo largo de la cadena principal, y están escritos, por ejemplo, como: -Ax-By- o -Ax-By-Cz- . Las composiciones generales de tales polímeros son un reflejo de la proporción de monómeros de entrada. Sin embargo, la proporción exacta de un monómero a otro puede diferir entre cadenas . La distribución de monómeros puede incluso diferir a lo largo de la longitud de un solo polímero. También, las propiedades químicas de un monómero pueden afectar su velocidad de incorporación en un copolímero aleatorio y su distribución en el polímero. Mientras la proporción de monómeros en un polímero aleatorio depende de la proporción de entrada del monómero, la proporción de entrada puede no coincidir exactamente con la proporción de los monómeros incorporados . Amfipático Los polímeros amfipáticos o amfifílicos, son bien conocidos y reconocidos en el arte previo y tienen ambos grupos o partes hidrofílicas (polares, solubles en agua) e hidrofóbicas (no polares, lipofílicas, insolubles en agua) .
Los grupos hidrofílicos indican en términos cualitativos que la fracción química prefiere el agua. Por lo general, tales grupos químicos son solubles en agua, y son donadores de enlaces de hidrógeno o aceptores con agua. Un grupo hidrofílico puede ser cargado o descargado. Los grupos cargados pueden ser cargados positivamente (aniónicos) o cargados negativamente (catiónicos) o ambos ( zwitteriónico) . Ejemplos de grupos hidrofílicos incluyen las siguientes fracciones químicas: carbohidratos, polioxietileno, ciertos péptidos, oligonucleótidos , aminas, amidas, alcoxi amidas, ácidos carboxílieos , sulfuros e hidroxilos.
Los grupos hidrofóbicos indican en términos cualitativos que la fracción química evita el agua. Normalmente, tales grupos químicos no son solubles en agua, y tienden a no formar enlaces hidrógeno. Los grupos lipofílieos se disuelven en grasas, aceites,' lípidos, y solventes no polares y tienen poca a nada de capacidad para formar enlaces de hidrógeno. Los hidrocarburos contienen dos (2) o más átomos de carbono, ciertos hidrocarburos sustituidos, colesterol y derivados de colesterol son ejemplos de grupos y compuestos hidrofóbicos.
Como se ha utilizado aquí, con respecto a polímeros amfipáticos, una parte es definida como una molécula derivada cuando se rompe un enlace covalente y reemplazado por hidrógeno. Por ejemplo, en amina de butilo, un rompimiento entre los enlaces de carbono y nitrógeno, y reemplazo con hidrógenos, resulta en amoniaco (hidrofílico) y butano (hidrofóbico) . Si, 1 , 4 -diaminobutano es dividido en enlaces de carbono-nitrógeno, y reemplazado con hidrógenos, las moléculas resultantes son nuevamente amoniaco (2x) y butano. Sin embargo, 1 , 4-diaminobutano no es considerado amfipático debido a la formación de una parte hidrofóbica que requiere del rompimiento de dos enlaces .
Como se ha utilizado aquí, un polímero de superficie activa baja la tensión superficial de agua y/o la tensión interfacial con otras fases, y por lo tanto, es adsorbido positivamente en la interface de vapor líquido. La propiedad de actividad superficial es usualmente debido al hecho que las moléculas de la sustancia son amfipática y amfifílica. Membrana activa Como se ha usado aquí, los polímeros de membrana activa tienen una superficie activa, loa polímeros amfipáticos que son capaces de inducir uno o más de los siguientes efectos sobre una membrana biológica: una alteración o ruptura de la membrana que permita a las moléculas de membrana no permeable entrar a una célula o a través de la membrana, formación de poro en la membrana, fisión de membranas, o ruptura o disolución de la membrana. Como se ha utilizado aquí, una membrana, o membrana celular, comprende una bicapa lipídica. La alteración o ruptura de la membrana puede ser funcionalmente definida por la actividad del polímero en al menos uno de los siguientes ensayos: lisis de glóbulos rojos (hemolisis), fuga de liposomas, fusión de liposomas, fusión celular, lisis celular, y liberación endosomal . Los polímeros de membrana activa que pueden causar lisis de las membranas celulares son también denominados polímeros de membrana lítica. Los polímeros que preferentemente causan ruptura de endosomas o liposomas. sobre la membrana plasmática son considerados endosomolíticos . El efecto de los polímeros de membrana activa en una membrana celular puede ser transitorio. Los polímeros de membrana activa poseen afinidad por la membrana y causan una desnaturalización o deformación de las estructuras bicapa. Los polímeros de membrana activa pueden ser polímeros sintéticos o amfipáticos no naturales.
Como se ha utilizado aquí, los polímeros de membrana activa son distintos de una clase de polímeros denominados péptidos de penetración celular o polímeros representados por compuestos tales como el péptido rico en arginina derivado de la proteína HIV TAT, el péptido antenapedia, el péptido VP22, transportan, péptidos artificiales ricos en arginina, pequeños polímeros artificiales ricos en guanidinio y similares. Mientras que los compuestos de penetración celular parecen -transportar algunas células a través de una membrana, desde un lado de una bicapa de lípido a otro lado de la bicapa del lípido, aparentemente sin requerir endocitosis y sin perturbar la integridad de la membrana, su mecanismo no es comprendido.
La liberación de un polinucleótido a una célula es mediado por la ruptura del polímero de membrana activa o desestabilizando la membrana plasmática o membrana de vesícula interna (tal como un endosoma o un lisosoma) , incluyendo la formación de un poro en la membrana, o ruptura de vesículas endosomales o lisosómales permitiendo de este modo la liberación de los contenidos de la vesícula en el citoplasma celular.
Endosomolítico Los polímeros endosomolíticos son polímeros que, en respuesta a un cambio en el pH, son capaces de provocar ruptura o lisis de un endosoma o facilitar la liberación de un normalmente compuesto impermeable de membrana celular, tal como un polinucleótido o proteína, de una vesícula de membrana celular interna cerrada, tal como un endosoma o lisosoma. Los polímeros endosomolíticos experimentan un cambio en sus propiedades físico-químicas sobre un intervalo de pH fisiológicamente relevante (por lo general pH 5.5 - 8). Este cambio puede ser un cambio en la solubilidad del polímero o capacidad para interactuar con otros compuestos o membranas como resultado de un cambio en la carga, hidrofobicidad, o hidrofilicidad. Polímeros endosomolíticos ejemplares tienen grupos o enlaces lábiles a pH. Un polímero de membrana activa reversiblemente enmascarada, en donde los agentes de enmascaramiento son unidos al polímero mediante enlaces lábiles a pH, entonces puede ser considerado que es un polímero endosomolítico.
Copolímeros aleatorios de membrana amfipática activa Las poliaminas de membrana amfipática activa de la invención comprenden: poliaminas de membrana activa amfipáticas (heteropolímeros aleatorios) .
Para los copolímeros de la invención, las dos o más especies monoraéricas consisten mínimamente de: un monómero que contiene un grupo amino primario o secundario pendiente y un monómero que contiene un grupo hidrofóbico pendiente . En una modalidad más preferida, las dos especies de monómeros consisten mínimamente de: un monómero que contiene un grupo amino primario o secundario pendiente y un monómero que contienen un grupo menor hidrofóbico pendiente. Como se ha utilizado aquí, un grupo pendiente es un grupo compuesto de los átomos ligados al polímero pero cuyos enlaces no se requieren para la propagación de la longitud del polímero, en este caso, ni los átomos ni los enlaces de un grupo pendiente son parte de la cadena principal o estructura de un polímero al cual es unido el grupo.
Los copolímeros de poliamina amfipáticos de membrana activa de la invención son el producto de la copolimerización de dos o más especies de monómeros. En una modalidad, los heteropolímeros de membrana activa amfipáticos de la invención tienen la estructura general: -(A)a-(B)b- en donde, A contiene un grupo amino funcional primario o secundario pendiente y B contiene un grupo hidrofóbico menor pendiente (que contiene de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono) . a y b son números enteros >0. Para ayudar en la síntesis, la amina protegida que contiene monómeros, tal como monómeros de amina protegidos con BOC o protegidos con ftalimido pueden ser utilizados durante la polimerización. Los grupos de protección amina son retirados después de la polimerización para' producir aminas. La incorporación de monómeros, arriba del 10%, que contiene medios pendientes o grupos hidrofóbicos mayores (7 o más átomos de carbono) es permitida. La incorporación de especies monoméricas adicionales en cantidades menores (<5%) también es permitida. Por ejemplo, los polímeros también pueden tener monómeros que contienen grupos reactivos adicionales. Los monómeros que contienen grupos reactivos pueden ser utilizados para unir componentes al polímero después de la síntesis del polímero. Un monómero puede tener un grupo reactivo que no participe en la reacción de polimerización. Un monómero también puede tener un grupo reactivo que esté protegido. El grupo de protección previene la reacción del grupo reactivo durante la polimerización. Después de la polimerización, el grupo de protección es retirado.
En otra modalidad un terpolímero, un polímero que tiene al menos tres diferentes especies monoméricas, es utilizado como el polímero de liberación. Para los terpolímeros de la invención, las tres especies monoméricas consisten mínimamente de: un monómero que contiene un grupo amino primario o secundario pendiente, un monómero que contiene un primer grupo hidrofóbico pendiente, y un monómero que contiene un segundo grupo hidrofóbico pendiente en donde el primer y segundo grupos hidrofóbicos pendientes son diferentes. En una modalidad más preferida, las tres o más especies de monómeros consisten mínimamente de: un monómero que contiene un grupo amino primario o secundario, un monómero que contiene un grupo hidrofóbico menor pendiente, y un monómero que contienen un grupo hidrofóbico medio o mayor pendiente.
En una modalidad, los terpolímeros de membrana activa amfipáticos de la invención tienen la estructura general: - (A) a- (B)b- (C)c- en donde, A contiene un grupo amino funcional primario o secundario pendiente, B contiene un grupo hidrofóbico menor pendiente (que contiene de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono) , y C contiene un grupo hidrofóbico mayor pendiente (que contiene 12 o más átomos de carbono) . a, b y c son números enteros >0. Para ayudar en la síntesis, los monómeros protegidos que contienen amina, tales como monómeros de amina protegidos con BOC o protegidos con ftalimido pueden ser utilizados durante la polimerización. Los grupos de protección amina son retirados después de la polimerización para producir aminas. La incorporación de especies monoméricas adicionales en cantidades menores (<5%) , es posible. Por ejemplo, los polímeros también pueden tener monómeros hidrofóbicos adicionales o monómeros que contienen grupos reactivos. Los monómeros que contienen grupos reactivos pueden ser utilizados para unir componentes al polímero después de la síntesis del polímero. Un monómero puede tener un grupo reactivo que no participe en la reacción de polimerización. Un monómero puede también tener un grupo reactivo que esté protegido. El grupo protector previene la reacción del grupo reactivo durante la polimerización. Después de la polimerización, el grupo protector es retirado.
Los grupos hidrofóbicos son preferiblemente hidrocarburos, que contienen únicamente átomos de carbono e hidrógeno. Sin embargo, las sustituciones no polares o heteroátomos no polares que mantienen su hidrofobicidad, e incluyen, por ejemplo fluoruro, pueden ser permitidos. El término incluye grupos alifáticos, grupos aromáticos, grupos acilo, grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos arilo, grupos aralquilo, grupos aralquenilo, y grupos aralquinilo, cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado o cíclico. El término grupo hidrofóbico también incluye: esteróles, esteroides, colesterol, y derivados de esteroides y colesterol. Como se ha utilizado aquí, los monómeros hidrofóbicos menores o grupos que comprenden grupos hidrofóbicos tienen de dos (2) a seis (6) átomos de carbono. Como se ha utilizado aquí, los monómeros hidrofóbicos medios o grupos · que comprenden grupos hidrofóbicos tienen de siete (7) a 11 (11) átomos de carbono. Como se ha utilizado aquí, los monómeros hidrofóbicos mayores o grupos que comprenden grupos hidrofóbicos tienen de doce (12) a treinta y seis (36) o más átomos de carbono.
Las propiedades biofísicas de los polímeros amfipáticos están determinadas por las clases de especies monoméricas polimerizadas , la proporción a la cual son incorporados en el polímero, y el tamaño del polímero. Diferentes polímeros pueden hacerse mediante la alteración de la proporción de alimentación de los monómeros en la reacción de polimerización o alterando los grupos utilizados para modificar una estructura del polímero. Mientras la proporción incorporada de monómeros en un polímero puede ser la misma que la proporción de alimentación de los monómeros, las proporciones pueden ser diferentes . Mientras los monómeros son incorporados a la proporción de alimentación o a una proporción diferente, es posible alterar la proporción de alimentación de los monómeros para lograr una proporción de incorporación del monómero deseada.
La proporción de grupos amino con respecto a grupos hidrofóbicos es seleccionada para formar un polímero soluble en agua con una actividad de ' ruptura de membrana. Los polímeros de membrana activa preferidos de la invención son solubles en agua a =1 mg/ml, =5 mg/ml, =10 mg/ml, =15 mg/ml, =20 mg/ml, =25 mg/ml, y =30 mg/m. Los polímeros de membrana activa preferidos de la invención son tensioactivos . Los polímeros de membrana activa de la invención son preferiblemente en el intervalo de tamaño de aproximadamente 3kDa a aproximadamente 300kDa. Debido a que los polímeros son amfipáticos, ellos se auto asocian en solución acuosa, con una concentración de asociación crítica de =1 mg/ml.
En una modalidad, la proporción de incorporación del monómero para los copolímeros de membrana activa de poliamina es de aproximadamente 4-8 monómeros de amina : 3-5 monómeros hidrofóbicos menores. En otra modalidad, la proporción de incorporación del monómero para las poliaminas de membrana activa es de aproximadamente 5.4-7.5 monómeros de amina: 3-3.5 monómeros hidrofóbicos menores. En otra modalidad, la proporción de incorporación del monómero para las poliaminas de membrana activa es de aproximadamente 2 monómeros de amina a aproximadamente 1 monómero hidrofóbico menor. En una modalidad los grupos hidrofóbicos de los monómeros hidrofóbicos consisten de grupos alquilo.
En una . modalidad, la proporción de incorporación del monómero para los terpolímeros de poliamina de membrana activa es de aproximadamente 4-8 monómeros de amina: 3-5 monómeros hidrofóbicos menores: 1 monómero hidrofóbico mayor. En otra modalidad, la proporción de incorporación del monómero para las poliaminas de membrana activa es de aproximadamente 5.4-7.5 monómeros de amina: 3-3.5 monómeros hidrofóbicos menores: 1 monómero hidrofóbico mayor. En otra modalidad, la proporción de incorporación del monómero para las poliaminas de membrana activa es de aproximadamente 6 monómeros de amina a aproximadamente 3 monómeros hidrofóbicos menores a aproximadamente 1 monómero hidrofóbico mayor. En una modalidad los grupos hidrofóbicos de los monómeros hidrofóbicos consisten de grupos alquilo.
En una modalidad, los copolímeros del grupo hidrofóbico/menor amina son sintetizados utilizando monómeros a una proporción de alimentación de aproximadamente 4-8 monómeros de amina : aproximadamente 3-5 monómeros de alquilo menores. En otra modalidad, los copolímeros del grupo hidrofóbico/menor amina pueden ser sintetizados utilizando monómeros a una proporción de alimentación de aproximadamente 15 monómeros de amina : 4 monómeros de grupo hidrofóbico menor .
En una modalidad, el grupo de terpolímeros de amina/grupo hidrofóbica menor/grupo hidrofóbico mayor son sintetizados utilizando monómeros a una proporción de alimentación de aproximadamente 4-8 monómeros de amina : aproximadamente 3-5 monómero de alquilo menor : 1 monómero de alquilo mayor. En otra modalidad, los terpolímeros de amina/grupo hidrofóbico menor /grupo hidrofóbico mayor pueden ser sintetizados utilizando monómeros en una proporción de alimentación de aproximadamente 15 monómeros de amina : 4 monómeros de grupo hidrofóbico menor : 1 monómero de grupo hidrofóbico mayor.
En una modalidad, las poliaminas de membrana activa particularmente apropiadas incluyen copolímeros que tienen monomeros que contienen aminas, monómeros que contienen butilo y monómeros que contienen grupos hidrofóbicos mayores en donde el grupo hidrofóbico mayor contiene de 12-18 átomos de carbono. Particularmente las poliaminas de membrana activa apropiadas incluyen terpolímeros aleatorios de poli (vinil éter) o terpolímeros aleatorios de poli (acrilato) .
En otra modalidad, poliaminas de membrana activa particularmente apropiadas incluyen copolímeros que tienen monómeros que contienen aminas, monómeros que contienen grupos hidrofóbicos menores. Poliaminas de membrana activa particularmente apropiadas incluyen copolímeros aleatorios de poli (vinil éter) o copolímeros aleatorios de poli (acrilato) .
Poliaminas de membrana activa particularmente apropiadas incluyen copolímeros que tienen monómeros que contienen amina y monómeros que contienen butilo. Poliaminas de membrana activa particularmente apropiadas incluyen copolímeros aleatorios de poli (vinil éter) o copolímeros aleatorios de poli (acrilato) .
Polímeros Biodegradables Un polímero puede tener uno o más sitios de rompimiento. Si los enlaces de rompimiento son naturalmente escindidos bajo condiciones fisiológicas o condiciones fisiológicas celulares, el polímero es biodegradable . El enlace biodegradable puede ya sea estar en la cadena principal o en la cadena lateral. Si el enlace de ruptura resulta en la cadena lateral, entonces el rompimiento del enlace resulta en la pérdida de los átomos de la cadena lateral del polímero. Para los polímeros de membrana activa, la biodegradación del polímero resultará en el decremento de la actividad de membrana del polímero. Como se ha utilizado aquí, el término biodegradable significa que el polímero con el tiempo se degradará por la acción de las enzimas, por acción hidrolítica y/o por otros mecanismos similares en el cuerpo. Los enlaces biodegradables son aquellos enlaces que son escindidos por procesos biológicos e incluyen, pero no están limitados a: ásteres, fosfodiésteres , ciertos enlaces peptídicos y combinaciones de los mismos . Los ásteres sufren de hidrólisis y también son catalíticamente escindidos por esterasas. Los fosfodiésteres son escindidos por nucleasas. Los enlaces peptídicos son escindidos por peptidasas. En particular, la estructura del polímero es degradada o escindida, o las cadenas laterales (grupos pendientes) son degradadas o escindidas, del polímero. Los enlaces biodegradables en los polímeros biodegradables pueden ser escindidos, bajo condiciones fisiológicas con una vida media de menos de 45 minutos, más de 45 minutos, más de 2 horas, más de 8 horas, más de 24 horas, o más de 48 horas. Mientras los polímeros biodegradables son útiles para la liberación in vivo, el polímero debe ser lo suficientemente estable para formar un polímero de tamaño suficiente en solución acuosa. Además, la velocidad de ruptura de un enlace biodegradable debe ser más lenta que el enlace lábil utilizado para unir a un agente de enmascaramiento al polímero. En una modalidad preferida, la degradación de un polímero biodegradable ocurre a una velocidad más lenta que el rompimiento de los agentes de enmascaramiento .
Enmascaramiento Los polímeros de liberación de la invención incluyen poliaminas de membrana activa amfipáticas reversiblemente modificadas en donde la modificación reversible inhibe la actividad de la membrana, neutraliza la poliamina para reducir la carga positiva y formar un polímero de carga casi neutra, proporciona un direccionamiento específico tipo celular, e inhibe las interacciones no específicas del polímero. La poliamina es reversiblemente modificada a través de la modificación reversible de aminas en la poliamina.
Las poliaminas de membrana activa de la invención son capaces de la ruptura de membranas plasmáticas o membranas lisosomales/endocíticas . Esta actividad de membrana es una característica esencial de la liberación celular del polinucleótido. La actividad de membrana, sin embargo, permite la toxicidad cuando el polímero es suministrado in vivo. Las poliaminas incluso interactúan fácilmente con muchos componentes aniónicos in vivo, dando lugar a una bio-distribución no deseada. Entonces, el enmascaramiento reversible de la actividad de membrana de la poliamina es necesaria para uso in vivo. Este enmascaramiento se logra mediante la unión reversible de agentes de enmascaramiento a la poliamina de membrana activa para formar un polímero de membrana activa enmascarada reversiblemente, en este caso un polímero de liberación. Además de la inhibición de la actividad de membrana, los agentes de enmascaramiento protegen al polímero de interacciones no específicas, reducen las interacciones de suero, incrementan el tiempo de circulación, y proporcionan interacciones específicas a la célula, en este caso direccionamiento.
Es una característica esencial de los agentes de enmascaramiento que, en conjunto, inhiben la actividad de la membrana del polímero, protegen al polímero de interacciones no específicas (reducen las interacciones de suero, incrementan el tiempo de circulación) , y proporcionan el direccionamiento de hepatocito in vivo. La poliamina de membrana activa es membrana activa en el estado no modificado (no enmascarado) y no membrana activa (inactivada) en el estado modificado (enmascarado) . Un número suficiente de agentes de enmascaramiento son ligados al polímero, para lograr el nivel deseado de inactivación. El nivel deseado de modificación de un polímero mediante la unión de agente (s) de enmascaramiento (s) es rápidamente determinado utilizando ensayos de actividad del polímero apropiado. Por ejemplo, si el polímero posee actividad de membrana en un ensayo dado, un nivel suficiente de agente de enmascaramiento es ligado al polímero para lograr el nivel deseado de inhibición de la actividad de membrana en ese ensayo. El enmascaramiento requiere modificación del =50%, =60%, =70%, u >80% de los grupos amina en el polímero, como se determinó mediante la cuantificación de aminas en el polímero en la ausencia de cualquiera de los agentes de enmascaramiento. Es también una característica preferida de los agentes de enmascaramiento que su unión al polímero reduce la carga positiva del polímero, entonces forma un polímero de liberación más neutral. Es deseable que el polímero de enmascaramiento retenga solubilidad acuosa.
Como se ha utilizado aquí, una poliamina de membrana activa es enmascarada si el polímero modificado no exhibe una actividad de membrana y exhibe direccionamiento de la célula específica (en este caso hepatocito) in vivo. Una poliamina de membrana activa es reversiblemente enmascarada si la ruptura de enlaces ligados a los agentes de enmascaramiento al polímero resultan en la restauración de aminas en el polímero de este modo restaurando la actividad de la membrana .
Es otra característica esencial que los agentes de enmascaramiento son covalentemente unidos a la poliamina de membrana activa a través de enlaces fisiológicamente reversibles. · Mediante el uso de uniones o enlaces fisiológicamente reversibles, los agentes de enmascaramiento pueden ser escindidos de un polímero in vivo, de este modo desenmascarando al polímero y restaurando la actividad del polímero desenmascarado. Mediante la elección de un enlace reversible apropiado, es posible formar un conjugado que restaure la actividad del polímero de membrana activa después de que ha sido liberado o dirigido a un tipo de célula deseado o a una ubicación celular. La reversibilidad de las uniones proporciona la activación selectiva de un polímero de membrana activa. Los enlaces covalentes reversibles contienen enlaces reversibles o lábiles que pueden ser seleccionados de un grupo que incluya: enlaces fisiológicamente lábiles, enlaces celulares fisiológicamente lábiles, enlaces lábiles ál pH, enlaces muy lábiles al pH, y enlaces extremadamente lábiles al pH.
Como se ha utilÍ2ado aquí, un agente de enmascaramiento incluye un compuesto que tiene una fracción ASGPr dirigida o un estabilizador estérico y un grupo reactivo de amina en donde la reacción del grupo reactivo de amina con una amina en un polímero resulta en el enlace a la fracción ASGPr dirigida o estabilizador estérico al polímero mediante un enlace covalente fisiológicamente lábil. Una fracción ASGPr dirigida es un grupo, típicamente ún sacárido, que tiene afinidad por el receptor asialoglicoproteína . Un estabilizador estérico preferido es un polietilenglicol (PEG) . Los agentes de enmascaramiento preferidos de la invención están dispuestos para modificar el polímero (formar un enlace reversible con el polímero) en solución acuosa. Un grupo reactivo de amina preferido incluye un anhídrido maleico disustituido. Un agente de enmascaramiento preferido es representado por la estructura: en donde en el. cual R1 es un grupo alquilo como un grupo metilo (-CH3), grupo etilo (-CH2CH3), o grupo propilo (-CH2CH2CH3) (para formar un anhídrido alquilmaleico sustituido) , y R2 comprende una fracción del receptor asialoglicoproteína (ASGPr) dirigida o un estabilizador estérico.
La poliamina de membrana activa puede ser conjugada para los agentes de enmascaramiento en la presencia de un exceso de agentes de enmascaramiento. El exceso de agentes de enmascaramiento puede ser retirado del polímero de liberación conjugado previo al suministro del polímero de liberación. Estabilizador estérico Como esa utilizado aquí, un estabilizador estérico es un polímero hidrofílico no iónico (ya sea natural, sintético, o no natural) que previene o inhibe las interacciones intramoleculares o intermoleculares de un polímero al cual este es unido en relación al polímero que contiene un estabilizador no estérico. Un estabilizador estérico obstaculiza un polímero al cual este es unido a partir del acoplamiento en interacciones electrostáticas. La interacción i electrostática es la asociación no covalente de dos o más sustancias debido a las fuerzas de atracción entre cargas positivas y negativas. Los estabilizadores estéricos pueden inhibir la interacción con componentes de la sangre y por tanto opsonización, fagocitosis, y aceptación por el sistema reticuloendotelial . Los estabilizadores estéricos pueden entonces incrementar el tiempo de circulación de las moléculas a las cuales están unidos. Los estabilizadores estéricos también pueden inhibir la agregación de un polímero. Un estabilizador estérico preferido es un polietilenglicol (PEG) o derivado de PEG. Como se ha utilizado aquí, un PEG preferido puede tener aproximadamente de 1-500 monómeros de etilenglicol . Como se ha utilizado aquí, un PEG preferido puede también tener un peso molecular promedio de aproximadamente 85-20,000 Daltones (Da), aproximadamente 200-1000 Da, aproximadamente 200-750 Da, o aproximadamente 550 Da. Como se ha utilizado aquí, los estabilizadores estéricos previenen o inhiben las interacciones intramoleculares o intermoleculares de un polímero al cual es unido en relación al polímero que contiene un estabilizador no estérico en solución acuosa.
Fracción ASGPr dirigida Las fracciones dirigidas o grupos mejoran las propiedades farmacocinéticas o de biodistribución de un conjugado al cual están unidos para mejorar la distribución específica de la célula y la captación específica de la célula del conjugado. Galactosa y derivados de galactosa han sido utilizados para dirigir moléculas a hepatocitos in vivo a través de su unión a un receptor de asialoglicoproteína (ASGPr) expresado en la superficie de los hepatocitos. Como se ha utilizado aquí, una fracción ASGPr dirigida incluye una galactosa y derivado de galactosa que tiene afinidad por el ASGPr igual a o mayor que aquella de galactosa. La unión de fracciones dirigidas de galactosa al ASGPr (s) facilita el direccionamiento específico a la célula del polímero de liberación a los hepatocitos y la endocitosis del polímero de liberación en hepatocitos.
Las fracciones ASGPr dirigidas pueden ser seleccionadas del grupo que comprende: lactosa, galactosa, N-acetilgalactosamina (GalNAc) , galactosamina, N-formilgalactosamina, N-acetil-galactosamina, N-propionilgalactosamina, N-n-butanoilgalactosamina, y N-iso-butanoil-galactosamina (Iobst, S.T. y Drickamer, . J.B.C. 1996, 271, 6686) . Las fracciones ASGPr dirigidas pueden ser raonoméricas (por ejemplo, tener una sola galactosamina) o multiméricas (por ejemplo, tener múltiples galactosaminas) .
En algunas modalidades, la fracción dirigida de galactosa está ligada al grupo reactivo de amina mediante un conector de PEG como es ilustrado por la estructura: en donde n es un número entero entre 1 y 19.
En una modalidad, la poliamina de membrana activa es reversiblemente enmascarada mediante la unión de los agentes de enmascaramiento de la fracción ASGPr dirigida a =50%, =60%, =70%, u =80% de aminas en la poliamina. En otra modalidad, la poliamina de membrana activa es reversiblemente enmascarada por la µ???? de los agentes de enmascaramiento de la fracción ASGPr dirigida a =50%, =60%, =70%, u =80% de aminas en la poliamina. En otra modalidad, los agentes de enmascaramiento de la fracción ASPGr dirigida comprenden una fracción ASPGr unida a un grupo de amina reactivo mediante el conector de PEG. Para el enmascaramiento de poliamina de membrana activa con ambos los agentes de enmascaramiento de la fracción ASPGr dirigida y agentes de enmascaramiento de PEG, una proporción de PEG con respecto a la fracción ASPGr dirigida es de aproximadamente 0-4:1, más preferiblemente de aproximadamente 0.5-2:1. En otra modalidad, hay aproximadamente 1.3-2 agentes de enmascaramiento de PEG hasta aproximadamente 1 agente de enmascaramiento derivado de galactosa.
Carga superficial El potencial zeta es una propiedad física que es exhibida por una partícula en suspensión y está cercanamente relacionada a la carga superficial. En medio acuoso, el pH de la muestra es uno de los factores más importantes que afectan el potencial zeta. Cuando la carga está basada en la protonación/desprotonación de bases/ácidos, la carga es dependiente del pH. Por lo tanto, un valor de potencial zeta debe incluir las condiciones de la solución, especialmente pH, para ser comprensible. Para partículas típicas, la magnitud del potencial zeta da una indicación de la estabilidad potencial del sistema coloidal. Si todas las partículas en suspensión tienen un gran potencial zeta positivo o negativo, tenderán a repelerse una a otra y no habrá tendencia para que las partículas estén juntas. Sin embargo, si las partículas tienen valores de un bajo potencial zeta, no habrá fuerza para prevenir que las partículas vengan juntas y floculen. La línea divisoria general entre suspensiones estables e inestables para partículas típicas es generalmente tomada en ya sea +30 o -30 mV. Las partículas con potenciales zeta más positivos que +30 mV o más negativos que -30 mV son considerados normalmente estables. Los polímeros de liberación de la invención descrita exhiben un potencial zeta de 20 mV a -20 mV en sal fisiológica y pH 8, pero son coloidalmente estables en solución acuosa y no floculan.
La carga positiva, o potencial zeta, de una poliamina activa de membrana es reducida por la modificación con los agentes de enmascaramiento. La carga de polímero, especialmente la carga positiva, puede resultar en interacciones no deseadas con componentes de suero o células no dirigidas. La carga superficial positiva también juega un papel en la actividad de membrana al mejorar la interacción del polímero con membranas celulares cargadas negativamente. Por lo tanto, los polímeros de liberación con carga neta casi neutra o potencial zeta son preferidos para la liberación de polinucleótidos in vivo. Los polímeros de liberación de la invención, poliaminas de membrana activa enmascaradas por la unión reversible de agentes de enmascaramiento de la fracción ASGPr dirigida y agentes de enmascaramiento de estabilizador estérico, tienen una carga superficial aparente casi neutra y son estables en suero. Más específicamente, los polímeros de liberación de la invención tienen un potencial zeta, medido a pH 8, entre +30 y -30 mV, entre +20 y -20 mV, entre +10 y -10 mV, o entre +5 y -5 mV. A pH 7, la carga neta del conjugado se espera sea más positiva que a pH 8. La carga neta, o superficie de carga, es un factor , significante para aplicaciones in vivo.
Enlace lábil Un enlace o conector es una conexión entre dos átomos que unen un grupo químico o segmento de interés a otro grupo químico o segmento de interés mediante uno o más enlaces covalentes. Por ejemplo, una unión puede conectar un agente de enmascaramiento a un polímero. La formación de un enlace puede conectar dos moléculas separadas en una sola molécula o puede conectar dos átomos en la misma molécula. El enlace puede ser carga neutral o puede soportar una carga positiva o negativa. Un enlace reversible o lábil contiene un enlace reversible o lábil. Un enlace puede incluir opcionalmente un separador que incremente la distancia entre los dos átomos unidos. Un separador puede además agregar flexibilidad y/o longitud a la unión. Los separadores pueden incluir, pero no están limitados a, grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos arilo, grupos aralquilo, grupos aralquenilo, grupos aralquinilo; cada uno de los cuales puede contener uno o más heteroátomos , heterociclos , aminoácidos, nucleótidos, y sacáridos. Los grupos espaciadores son bien conocidos en el arte previo y la lista anterior no significa que limite el alcance de la invención. un enlace reversible o lábil es un enlace covalente que no hace más que unir un enlace covalente a un átomo de hidrógeno que es capaz de ser roto selectivamente o escindido bajo condiciones que no romperá o escindirá otros enlaces covalentes en la misma molécula. Más específicamente, un enlace reversible o lábil es un enlace covalente que es menos estable (termodinámicamente) o más rápidamente roto (cinéticamente) bajo condiciones apropiadas que otros enlaces covalentes no lábiles en la misma molécula. La escisión de un enlace lábil en una molécula puede resultar en la formación de dos moléculas . Para las personas experimentadas en el arte previo, la escisión o labilidad de un enlace es generalmente discutido en términos de vida media (t¾) de ,1a escisión del enlace (el tiempo requerido para que la mitad de los enlaces sean escindidos) . Entonces, los enlaces lábiles o reversibles abarcan enlaces que pueden ser selectivamente escindidos más rápidamente que otros enlaces a una molécula.
Las condiciones apropiadas son determinadas por el tipo de enlace lábil y son bien conocidas en la química orgánica. Un enlace lábil puede ser sensible al pH, condiciones oxidativas o reductivas o agentes, temperatura, concentración de sal, la presencia de una enzima (como estearasas, incluyendo nucleasas, y proteasas) , o la presencia de un agente agregado. Por ejemplo, el incremento o decremento de pH son las condiciones apropiadas para un enlace lábil al pH.
La velocidad a la cual un grupo lábil sufrirá una transformación puede ser controlada por alteración de los constituyentes químicos de la molécula que contiene el grupo lábil. Por ejemplo, la adición de fracciones químicas particulares (por ejemplo, aceptores o donadores de electrones) cercana al grupo lábil puede afectar las condiciones particulares (por ejemplo, pH) bajo las que ocurrirá la transformación química.
Como se ha utilizado aquí, un enlace fisiológicamente lábil es un enlace lábil que es escindido bajo condiciones que normalmente se encuentran o son análogas a aquellos que se encuentran en un cuerpo de mamífero. Los grupos de enlace fisiológicamente lábiles son seleccionados de manera que sufren una transformación química (por ejemplo, escisión) cuando se presenten en ciertas condiciones fisiológicas.
Como se ha utilizado aquí, un enlace celular fisiológicamente lábil es un enlace lábil que es escindido bajo condiciones intracelulares del mamífero. Las condiciones intracelulares del mamífero incluyen condiciones químicas como pH, temperatura, condiciones o agentes oxidativos o reductivos, y concentración de sal encontrada o análogos a aquellas encontradas en células de mamífero. Las condiciones intracelulares de mamífero también incluyen la presencia de actividad enzimática normalmente presente en una célula de mamífero como aquella proveniente de enzimas proteolíticas o hidrolíticas . Un enlace celular fisiológicamente lábil puede también ser escindido en respuesta al suministro de un agente exógeno farmacéuticamente aceptable. Los enlaces fisiológicamente lábiles que son escindidos bajo condiciones apropiadas con una vida media de menos de 45 min son considerados muy lábiles. Los enlaces fisiológicamente lábiles que son escindidos bajo condiciones apropiadas con una vida media de menos de 15 min son considerados extremadamente lábiles .
La transformación química (escisión del enlace lábil) puede ser iniciada por la adición de un agente farmacéuticamente estable a la célula o puede ocurrir espontáneamente cuando una molécula que contiene el enlace lábil alcanza un ambiente apropiado intra y/o extra-celular . Por ejemplo, un enlace lábil al pH puede ser escindido cuando la molécula entra a un endosoma ácido. Así, un enlace lábil al pH puede ser considerado que es un enlace endosomal escindido. Los enlaces escindidos por enzimas pueden ser escindidos cuando son expuestos a enzimas como aquellas presentes en un endosoma o lisosoma o en el citoplasma. Un enlace de disulfuro puede ser escindido cuando la molécula entra al ambiente más reductor del citoplasma celular. Así, un disulfuro puede ser considerado que es un enlace escindido citoplásmico .
Como se ha utilizado aquí, un enlace lábil al pH es un enlace lábil que es selectivamente roto bajo condiciones ácidas (pH<7) . Tales enlaces pueden también ser llamados enlaces endosómicamente lábiles, puesto que los endosomas y lisosomas de la célula tienen un pH menor a 7. El término lábil al pH incluye enlaces que son lábiles al pH, muy lábiles al pH, y extremadamente lábiles al pH.
La reacción de un anhídrido con una amina forma una amida y un ácido.. Para muchos anhídridos, la reacción inversa (formación de un anhídrido y amina) es muy lenta y energéticamente desfavorable. Sin embargo, si el anhídrido es un anhídrido cíclico, la reacción con una amina produce una amida ácida, una molécula en la que la amida y el ácido están en la misma molécula. La presencia de ambos grupos reactivos (la amida y el ácido carboxílico) en la misma molécula acelera la reacción inversa. En particular, el producto de aminas primarias con anhídrido maleico y derivados de anhídrido maleico, ácidos maleámicos, .regresan a la amina y anhídrido lxlO9 a lxlO13 veces más rápido que sus análogos no cíclicos (Kirby 1980) .
Reacción de una amina con un anhídrido para formar una amida y un ácido Reacción de una amina con un anhídrido cíclico para formar una amida ácida.
La escisión de la amida acida para formar una amina y un anhídrido es dependiente del pH y es enormemente acelerada a pH ácido. Esta reactividad dependiente del pH puede ser explotada para formar enlaces y conectores reversibles lábiles al pH. El ácido cis-aconítico ha sido utilizado como un ligando molecular sensible al pH. El ?-carboxilato es primero acoplado a una molécula. En un segundo paso, ya sea, el carboxilato a o ß es acoplado a una segunda molécula para formar un acoplamiento sensible al pH de las dos moléculas. La vida media para la escisión de este conector a pH 5 está entre 8 y 24 h.
Estructuras de anhídrido cis-aconítico y anhídrido maleico. ácido aconítico anhídrido maleico El pH al que ocurre el rompimiento es controlado por la adición de constituyentes químicos a la fracción lábil. La velocidad de conversión de ácidos maleámicos a aminas y anhídridos maleicos es fuertemente dependiente de la sustitución (R2 y R3) del sistema de anhídrido maleico. Cuando R2 es metilo, la velocidad de conversión es 50 veces mayor que cuando R2 y R3 son hidrógeno. Cuando hay sustituciones alquilo a ambos R2 y R3 (por ejemplo, anhídrido de 2 , 3 -dimetilmaleico) la velocidad incrementada es dramática: 10,000 veces más rápida que el anhídrido maleico no sustituido. El enlace maleamato formado de la modificación de una amina con anhídrido de 2, 3 -dimetilmaleico es escindido para restaurar el anhídrido y la amina con una vida media entre 4 y 10 minutos a pH 5. Es anticipando que si R2 y R3 son grupos más grandes que hidrógeno, la velocidad de la conversión amida acida a aniima y anhídrido será más rápida que si R2 y/o R3 son hidrógeno.
Enlace muy lábil al pH: Un enlace muy lábil al pH tiene una vida media para escisión a pH 5 de menos de 45 min. La construcción de enlaces muy lábiles al pH es bien conocida en el arte previo de química.
Enlaces extremadamente lábiles al pH: Un enlace extremadamente lábil al pH tiene una vida media para escisión a pH 5 de menos de 15 min. La construcción de enlaces extremadamente lábiles al pH es bien conocida en el arte químico .
Los anhídridos cíclicos disustituidos son particularmente útiles para la unión de agentes de enmascaramiento a poliaminas de membrana activa de la invención. Ellas proporcionan conectores fisiológicamente lábiles al pH, aminas rápidamente modificadas, y restauran a aquellas aminas durante la escisión en el pH reducido encontrado en endosomas celulares y lisosoma. Segundo, el grupo carboxílico a o ß creado después de la reacción con una amina, parece contribuir solamente a aproximadamente 1/20a de la carga negativa esperada al polímero (Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003) . De este modo, la modificación de la poliamina con los anhídridos maleicos disustituidos efectivamente neutraliza la carga positiva de la poliamina además que crea un polímero con carga altamente negativa. Los polímeros casi neutrales son preferidos para liberación in vivo.
Paso de Polimerización En el paso de polimerización, la polimerización ocurre de manera gradual. El crecimiento del polímero ocurre mediante la reacción entre monómeros, oligómeros, y polímeros. Ningún iniciador es necesario puesto que la misma reacción ocurre completamente, y no hay un paso de terminación de manera que los grupos finales son aún reactivos. La velocidad de polimerización decrece conforme los grupos funcionales son consumidos . un polímero puede ser creado utilizando el paso de polimerización mediante el uso de monómeros que tienen dos grupos reactivos (A y B) en el mismo monómero (heterobifuncional) , en donde A incluye un grupo reactivo y B incluye un grupo reactivo A (un grupo reactivo que forma un enlace covalente con A) . La polimerización de A-B produce - [A-B]n-. Los grupos reactivos A y B pueden unirse mediante un enlace covalente o una pluralidad de enlaces covalentes, para de este modo formar el polímero monómero. Un polímero puede también ser creado utilizando el paso de polimerización mediante el uso de monómeros homobifuncionales de forma que A-A + B-B dé - [A-A—B-B] n- . Generalmente, esas reacciones pueden involucrar acilación o alquilación. Los dos grupos reactivos de un monómero pueden ser unidos mediante un solo enlace covalente o una pluralidad de enlaces covalentes .
Si un grupo reactivo A es una amina entonces B es un grupo amino reactivo, que puede ser seleccionado del grupo que comprende: isotiocianato, isocianato, azida de acilo, N-hidroxi-succinimida, cloruro de sulfonilo, aldehido (incluyendo formaldehído y glutaraldehído) , cetona, epóxido, carbonato, imidoéster, carboxilato activado con carbodiimida, alquilofosfato, arilhaluros (difluoro-dinitrobenceno) , anhídrido, haluro ácido, p-nitrofenil éster, o-nitrofenil éster, pentaclorofenil éster, pentafluorofenil éster, carbonilo imidazol, carbonilo piridinio, y carbonil dimetilaminopiridinio . En otros términos, cuando un grupo reactivo A es una amina entonces B puede ser un agente de acilación o alquilación o agente de aminación.
Si un grupo reactivo A es un sulfhidrilo (tiol) entonces B es un grupo tiol reactivo, que puede ser seleccionado de un grupo que comprende: derivado yodoacetilo, maleimida, derivado de aziridina, derivado acriloilo, derivado fluorobenceno, y derivado de disulfuro (como un disulfuro de piridilo o derivado 5-tio-2-ácido nitrobenzoico (TNB) ) .
Si un grupo reactivo A es carboxilado entonces un grupo reactivo B es un grupo reactivo carboxilado, que- puede ser seleccionado del grupo que comprende: diazoacetato y una amina en la que una carbodiimida es utilizada. Otros aditivos pueden ser utilizados como carbonildiimidazol , dimetilamino piridina (DMAP), N-hidroxisuccinitnida o alcohol que utiliza carbodiimida, y DMAP.
Si un grupo reactivo A es un hidroxilo entonces un grupo reactivo B es un grupo reactivo hidroxilo, que puede ser seleccionado del grupo que comprende: epóxido, oxirano, carbamato activado, éster activado, y haluro de alquilo.
Si un grupo reactivo A es un aldehido o cetona entonces el grupo reactivo B es un aldehido- o grupo reactivo cetona, que puede ser seleccionado del grupo que comprende: hidrazina, derivado de hidrazina, amina (para formar una Base Schiff que puede o no ser reducida por agentes reductores como NaCNBH3) , y compuesto hidroxilo.
. Un polímero puede ser creado utilizando un paso de polimerización mediante el uso de monómeros bifuncionales y otro agente de manera que A-A más otro agente da - [A-A] n- .
Si un grupo reactivo A es un grupo sulfhidrilo (tiol) entonces puede ser convertido a enlaces bisulfuro mediante agentes oxidantes como yoduro (I2) , peryodato de sodio (NaI04) , u oxígeno (02) . Si el grupo reactivo A puede ser una amina, puede ser convertido a tiol mediante la reacción con 2-iminotiolato (reactivo de Traut) que sufre una oxidación y formación de disulfuro. Los derivados disulfuro (como un disulfuro de piridilo o derivados TNB) , pueden también ser utilizados para catalizar la formación de enlace de disulfuro .
Los grupos reactivos A o B en cualquiera de los ejemplos de arriba también pueden ser un grupo fotorreactivo como una azida de arilo (incluyendo azida de arilo halogenada) , diazo, benzofenona, alquino, o derivado de diazirina.
Reacciones de la amina, hidroxilo, sulfhidrilo, o grupos carboxilados producen enlaces químicos que' son descritos como amidas, amidinas, disulfuros, éteres, ésteres, enaminas, iminas, ureas, isotioureas, isoureas, sulfonamidas, carbamatos, enlaces alquilamina (aminas secundarias) , y enlaces solos carbono-nitrógeno en que el carbono está ligado al grupo hidroxilo, tioéter, diol, hidrazona, diazo, o sulfona.
Polimerización de la Cadena En la polimerización de cadena de reacción, el crecimiento del polímero ocurre por la adición sucesiva' de unidades de monómero a un número limitado de cadenas de crecimiento. La iniciación y mecanismos de propagación son diferentes, y generalmente hay un paso de terminación de cadena. Las reacciones de polimerización de cadena pueden ser radicales, aniónicas, o catiónicas. Los monómeros para la polimerización de la cadena puede ser seleccionada de los grupos que incluyen: vinilo, éter de vinilo, acrilato, métacrilato, acrilamida, y grupos metacrilamida. La polimerización de la cadena puede también ser · lograda mediante la polimerización de apertura de ciclo o anillo. Varios diferentes tipos de iniciadores de radicales libres pueden utilizarse incluyendo, pero sin limitarse a, peróxidos, hidroxi peróxidos, y compuestos azo como dihidrocloruro de 2 , 2 ' -Azobis ( -amidinopropano) (AAP) .
Un polímero natural es un polímero que puede encontrarse en la naturaleza. Ejemplos incluyen polinucleótidos, proteínas, colágeno, y polisacáridos (almidones, celulosa, glicosaminoglicanos , quitina, agar, agarosa) . Un polímero natural puede ser aislado de una fuente biológica o puede ser sintético. Un polímero sintético es formulado o fabricado mediante un proceso químico "por medio del hombre" y no es creado por procesos biológicos naturales. Un polímero no natural es un polímero sintético que no está hecho de materiales naturales (plantas o animales) materiales o monómeros (como aminoácidos, nucleótidos, y sacáridos) . Un polímero puede ser total o parcialmente natural, sintético, o no natural .
Conjugado de oolinúcleotido de ARNi Hemos encontrado que la conjugación de un polinucleótido de ARNi a una fracción dirigida del polinucleótido, ya sea a un grupo hidrofóbico o a un agrupamiento de galactosa, y co-administración del conjugado de polinucleótido de ARNi con el polímero de liberación descrito arriba proporciona liberación funcional eficiente de polinucleótido de ARNi a células hepáticas, particularmente hepatocitos, in vivo. Mediante la liberación funcional, esto significa que el polinucleótido ARNi es liberado a la célula y tiene una actividad biológica esperada, inhibición específica de secuencia de la expresión del gen. Muchas moléculas, incluyendo polinucleótidos, administrados al sistema vascular de un mamífero son normalmente purificadas del cuerpo mediante el hígado. La purificación de un polinucleótido mediante el hígado en donde el polinucleótido es degradado o de otra manera procesado para retirarlo del cuerpo y en donde el polinucleótido no causa inhibición específico de secuencia de la expresión del gen no es considerado liberación funcional .
El conjugado de polinucleótido de ARNi es formado por la unión covalentemente del polinucleótido ÁRNi a la fracción dirigida del polinucleótido. El polinucleótido es sintetizado o modificado de tal manera que contiene un grupo reactivo A. La fracción dirigida es también sintetizada o modificada de manera que contiene un grupo reactivo B. Los grupos reactivos A y B son seleccionados de manera que puedan ser ligados mediante un enlace covalente utilizando métodos conocidos en el arte previo.
La fracción dirigida puede ser ligada al extremo 3' o 5' del polinucleótido de ARNi. Para polinucleótidos de ARNsi, la fracción dirigida puede ser ligada ya sea a la cadena sentido o cadena antisentido, pensando que la cadena sentido es preferida.
En una modalidad, la fracción dirigida del polinucleótido consiste de un grupo hidrofóbico. Más específicamente, la fracción dirigida del polinucleótido consiste de un grupo hidrofóbico que tiene al menos 20 átomos de carbono. Los grupos hidrofóbicos utilizados como fracciones dirigidas de polinucleótido son aquí referidas como fracciones dirigidas hidrofóbicas . Grupos hidrofóbicos apropiados ejemplares pueden ser seleccionados de un grupo que comprende: colesterol, dicolesterol , tocoferol, ditocoferol, didecilo, didodecilo, dioctadecilo, didodecilo, dioctadecilo, isoprenoide, y coleamida. Grupos hidrofóbicos que tienen 6 o menos átomos de carbono no son eficaces como fracciones dirigida de polinucleótido, mientras grupos hidrofóbicos que tienen de 8 a 18 átomos de carbono proporcionan la liberación incrementada de polinucleótido con incremento del tamaño del grupo hidrofóbico (en este caso incrementando el número de átomos de carbono) . La unión de una fracción dirigida hidrofóbica a un polinucleótido de ARNi no proporciona una liberación in vivo funcional eficiente del polinucleótido de ARNi en la ausencia del co-suministro del polímero de liberación. Mientras los conjugados de ARNsi-colesterol han sido reportados por otros para liberación de ARNsi (ARNsi-colesterol) a células hepáticas in vivo, en la ausencia de cualquier vehículo adicional de liberación, son requeridas altas concentraciones de ARNsi y la eficacia de liberación es pobre. Cuando se combina con los polímeros de liberación aquí descritos, la liberación del polinucleótido es enormemente mejorada. Al proporcionar ARNsi-colesterol junto con un polímero de liberación de la invención, la eficacia de ARNsi-colesterol es incrementada aproximadamente 100 veces.
Los grupos hidrofóbicos útiles como fracciones dirigidas de polinucleótido pueden ser seleccionadas del grupo que consiste de: grupo alquilo, grupo alquenilo, grupo alquinilo, grupo arilo, grupo aralquilo, grupo aralquenilo, y grupo aralquinilo, cada uno de los cuales puede ser lineal, ramificado o cíclico, colesterol, derivado de colesterol, esterol, esteroide, y derivado de esteroide. Las fracciones dirigidas hidrofóbicas son preferiblemente hidrocarburos, que contiene solamente átomos de carbono e hidrógeno. Sin embargo, sustituciones o heteroátomos que mantienen la hidrofobicidad, por ejemplo fluoruro, pueden ser permitidas. La fracción dirigida hidrofóbica puede ser unida al extremo 3' o 5' del polinucleótido de ARNi utilizando métodos conocidos en el arte previo. Para polinucleótidos de ARNi que tienen 2 cadenas, como AR si, el grupo hidrofóbico puede ser unido a otra cadena .
En otra modalidad, la fracción dirigida del polinucleótido comprende un agrupamiento de galactosa (fracción dirigida de agrupamiento de galactosa) . Como se ha utilizado aquí, una agrupación de galactosa incluye una molécula que tiene de dos a cuatro derivados terminados en galactosa. Como se ha utilizado aquí, el término derivados de galactosa incluye ambos galactosa y derivados de galactosa que tiene afinidad por el receptor de asialoglicoproteína igual o mayor que aquel de galactosa. Un derivado de galactosa terminal es unido a una molécula a través su carbono C-l. El receptor de asialoglicoproteína (ASGPr) es único a los hepatocitos y une glicoproteínas terminales de galactosa ramificadas. Un agrupamiento de galactosa preferida tiene tres galactosaminas terminales o derivados de galactosamina cada uno tiene afinidad por el receptor de asialoglicoproteína. Un agrupamiento de galactosa más preferido tiene tres N-acetilo-galactosaminas terminales.
Otros términos comunes en el arte previo incluyen galactosa tri-antenaria, galactosa trivalente y galactosa trímero. Es conocido que los agrupamientos tri-antenarios son unidos al ASGPr con mayor afinidad que las estructuras derivadas bi- antenarias o mono-antenarias (Baenziger y Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol . Chem. 257, 939- 945) . La multivalencia es requerida para lograr la afinidad nM. La unión de un derivado solo de galactosa que tiene afinidad por el receptor de asialoglicoproteína no permite la liberación funcional del polinucleótido de ARNi a hepatocitos in vivo cuando son co-administrados con el polímero de liberación.
Un agrupamiento de galactosa contiene tres derivados de galactosa cada uno ligado al _ punto central de la ramificación. Los derivados de galactosa son unidos al punto central de la ramificación a través de los carbonos Cl de los sacáridos . El derivado de galactosa es preferiblemente al punto de ramificación mediante ligandos o espaciadores. Un espaciador preferido es un espaciador flexible hidrofílico (patente Estadounidense 5885968; Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). Un espaciador hidrofílico flexible preferido es un espaciador de PEG. Un espaciador preferido es un espaciador de PEG3. El punto de ramificación puede ser cualquier molécula pequeña que permite la unión de los tres derivados de galactosa y además permite la unión del punto de ramificación al polinucleótido de AR i . Un grupo ejemplar de punto de ramificación es una di-lisina. Una molécula de di-lisina contiene tres grupos de amina mediante los cuales los tres derivados de galactosa pueden ser unidos y un grupo reactivo carboxilo mediante el cual la di-lisina puede ser unida al polinucleótido de ARNi. La unión del punto de ramificación al polinucleótido de ARNi . puede ocurrir mediante un ligando o espaciador. Un espaciador preferido es un espaciador hidrofílico flexible. Un espaciador hidrofílico flexible preferido es un espaciador de PEG. Un espaciador preferido de PEG es un espaciador de PEG3 (tres unidades de etileno) . El agrupamiento de galactosa puede ser unido al extremo 3' o 5' del polinucleótido de ARNi utilizando métodos conocidos en el arte previo. Para polinucleótidos de ARNi que tienen 2 cadenas, tales como ARNsi, el agrupamiento de galactosa puede ser unido a otra cadena.
Un derivado preferido de galactosa es una N-acetil-galactosamina (GalNAc) . Otros sacáridos que tienen afinidad por el receptor de asialoglicoproteína pueden ser seleccionados de la lista que comprende: galactosa, galactosamina, N-formilgalactosamina, N-acetilgalactosamina, N-propionil-galactosamina, N-n-butanoilgalactosamina, y N-iso-butanoilgalactosamina. Las afinidades de numerosos derivados de galactosa para el receptor de asialoglicoproteína han sido estudiados (ver por ejemplo: Iobst, S.T. y Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686) o son rápidamente determinados utilizando métodos típicos en el arte previo.
Una modalidad de un agrupamiento de Galactosa Agrupamiento de galactosa con espaciador de PEG entre el punto de ramificación y ácido nucleico El término polinucleótido, o ácido nucleico o ácido polinucleico, es un término del arte previo que se refiere a un polímero que contiene por lo menos dos nucleótidos. Los nucleótidos son las unidades monoméricas de polímeros polinucleótidos . Los polinucleótidos con menos de 120 unidades monoméricas son con frecuencia llamados oligonucleótidos . Los ácidos nucleicos naturales tienen una estructura de deoxiribosa o ribosa-fosfato . Un polinucleótido no natural o polinucleótido sintético es un polinucleótido que es polimerizado in vitro o en un sistema libre de células y contiene las mismas bases o similares pero puede contener uña estructura de otro tipo que la ribosa natural o estructura de deoxirribosa-fosfato . Los polinucleótidos pueden ser sintetizados utilizando cualquier técnica conocida en el arte previo. Las estructuras de polinucleótido conocidas en el arte previo incluyen: PNAs (péptido ácidos nucleicos), fósforotioatos, fósforodiamidatos , morfolinos, y otras variantes de estructura de fosfato de ácidos nucleicos nativos . Las bases incluyen purinas y pirimidinas , que además incluyen los compuestos naturales adenina, timina, guanidina, citosina, uracilo, inosina, y análogos naturales. Los derivados sintéticos de purinas y pirimidinas incluyen, pero no están limitados a, modificaciones que colocan nuevos grupos reactivos en el nucleótido tal como, pero no se limitan a, aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos , y alquilhaluros . El término base abarca cualquiera de las bases análogas conocidas de ADN y ARN. Un polinucleótido puede contener ribonucleótidos, desoxiribonucleótidos, nucleótidos sintéticos, o cualquier . combinación adecuada. Los polinucleótidos pueden ser polimerizados in vivo, pueden ser recombinantes , contener secuencias quiméricas, o derivados de esos grupos. Un polinucleótido puede incluir una mitad encapsulada terminal al extremo 5 ' , el extremo 3 ' , o ambos extremos 5' y 3' . La fracción encapsulada puede ser, pero no se limita a, una fracción básica deoxi invertida, una fracción timidina deoxi invertida, una fracción timidina, o una modificación gliceril 3'.
Un polinucleótido de ARN de interferencia (ARNi) es una molécula capaz de inducir ARN de interferencia mediante la interacción con el ARN de interferencia de la maquinaria del mecanismo de interferencia de células de mamífero para degradar o inhibir la traducción del ARN mensajero (ARNm) transcribe de un transgen en una secuencia de manera específica. Los dos polinucleótidos primarios ARNi son pequeños (o cortos) interfiriendo los ARNs (ARNsis) y los micro ARNs (miARNs) . Los polinucleótidos de ARNi pueden ser seleccionados de un grupo que comprende: ARNsi, microARN, ARN de hebra doble (ARNds) , ARN de horquilla corta (shARN) , y casetes de expresión que codifican para ARN capaz de inducir ARN de interferencia. ARNsi incluye una estructura de doble cadena que generalmente contiene de 15-50 pares de bases y preferiblemente de 21-25 pares de bases y tienen una secuencia de nucleótidos idéntica (perfectamente complementaria) o cercanamente idéntica (parcialmente complementaria) para una secuencia codificada en un gen blanco expresado o ARN en la célula. Un ARNsi puede tener proyecciones de dinucleótidos 3' . Un ARNsi puede ser compuesto de dos polinucleótidos anillados o ún polinucleótido solo que forma una estructura de horquilla corta. Una molécula de ARNsi de la invención incluye una región sentido y una región antisentido. En una modalidad, el ARNsi del conjugado es ensamblado a partir de dos fragmentos de oligonucleótido en donde un fragmento comprende la secuencia de nucleótido de la cadena antisentido de la molécula de ARNsi y un segundo fragmento comprende secuencia de nucleótido de la región sentido de la molécula de ARNsi. En otra modalidad la cadena de sentido está conectada a la cadena antisentido mediante una molécula de enlace, tal como un enlace de polinucleótido o un enlace de no nucleótido. MicroARNs (miARNs) son pequeños productos del gen que no codifican ARN de aproximadamente 22 nucleótidos de largo que dirigen la destrucción o represión traduccional de su ARNm dirigido. Si la complementariedad entre el miARN y el ARNm dirigido es parcial, la traducción del ARNm dirigido es reprimida. Si la complementariedad es extensiva, el ARNm dirigido es escindido. Para miARNs, el complejo se une a sitios dirigidos que normalmente se localizan en la 3'UTR de AR ms que . generalmente comparten solamente homología parcial con el miARN. Una "región semilla" -un estrecho de aproximadamente siete (7) nucleótidos consecutivos en el extremo 5' de miARN que forma perfectos pares de bases con su objetivo -juega una pieza clave en la especificidad de miARN. La unión del complejo RISC/miARN al ARNm puede conducir a la represión de la traducción de proteína o rompimiento y degradación del ARNm. Datos recientes indican que la escisión de ARNm ocurre preferencialmente si hay perfecta homología a lo largo de la longitud completa del miARN y su objetivo en lugar de mostrar perfectos pares de bases solamente en la región semilla (Pillai et al. 2007) .
La expresión de los casetes de expresión de polinucleótido de ARNi puede ser transcrito en la célula para producir una pequeña horquilla corta de ARNs que puede funcionar como ARNsi, ARNsis lineales de cadena sentido y anti sentido separada, o miARN. La polimerasa ARN III que transcribe ADNs contiene promotores seleccionados de una lista que comprende: promotores U6, promotores Hl, y promotores tARN. Los promotores de ARN polimerasa II incluyen promotores Ul, U2, U4 y U5, promotores de snARN, promotores de microARN, y promotores de ARNm.
Listas de secuencias conocidas de miARN pueden encontrarse en bases de datos mantenidas por organizaciones de investigación tales como Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cáncer Center, y el European Molecule Biology Laboratory, junto con otros. Secuencias de ARNsi conocidas eficaces y sitios de unión cognados son también bien presentados en literatura relevante. Las moléculas de ARNi son rápidamente diseñadas y producidas por tecnologías conocidas en el arte previo. Además, hay herramientas computacionales que incrementan la oportunidad de encontrar motivos de secuencia eficaces y específicos (Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Shwarz et al., 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al . 2004) .
Los polinucleótidos de la invención pueden ser químicamente modificados. Ejemplos no limitantes de cada una de las modificaciones químicas incluyen: enlaces de internucleótido fósforotioato, 2'-0-metilo ribonucleótidos, 2 ' -deoxi-2 ' -fluoro ribonucleótidos, 2'-deoxi ribonucleótidos, nucleótidos "base universal", 5-C-metilo nucleótidos, e incorporación de residuo deoxibásico invertido. Esas modificaciones químicas, cuando son utilizadas en varias construcciones de polinucleótidos, son mostradas para preservar la actividad de polinucleótido en células mientras al mismo tiempo se incrementa la estabilidad del suero de esos compuestos. ARNsi químicamente modificado también puede minimizar la posibilidad de activar la actividad de interferón en humanos .
En una modalidad, un polinucleótido químicamente modificado de ARNi de la invención incluye un dúplex que tiene dos cadenas, una o ambas de las cuales pueden ser químicamente modificadas, en donde cada cadena es de aproximadamente 19 a aproximadamente 29 nucleótidos. En una modalidad, un polinucleótido de ARNi de la invención incluye uno o más nucleótidos modificados mientras que mantiene la capacidad de mediar ARNi dentro de una célula o sistema reconstituido in vitro. Un polinucleótido de ARNi puede ser modificado en el que la modificación química incluye uno o más (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más) de los nucleótidos. Un polinucleótido de ARNi de la invención puede incluir nucleótidos modificados como un porcentaje del número total de nucleótidos presentes en el polinucleótido de AR i. Como tal, un polinucleótido de ARNi de la invención puede generalmente incluir nucleótidos modificados de aproximadamente 5 a aproximadamente 100% de las posiciones del nucleótido (por ejemplo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las posiciones del nucleótido) . El porcentaje real de nucleótidos modificados presentes en un polinucleótido dado ARNi depende del número total de nucleótidos presentes en el polinucleótido de ARNi. Si el polinucleótido de ARNi es de cadena sencilla, el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleósidos presentes en la cadena sencilla del polinucleótido de ARNi. Asimismo, si el polinucleótido de ARNi es de doble cadenas, el porcentaje de modificación puede ser basado en el número total de nucleótidos presentes en la cadena sentido, cadena antisentido, o ambas cadenas sentido y antisentido. Además, el porcentaje real de nucleótidos modificados presente en un polinucleótido de ARNi dado también puede depender del número total de nucleótidos de purina y pirimidina presentes en el polinucleótido de ARNi. Por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina y/o todos los nucleótidos de purina presentes en el polinucleótido de ARNi son modificados.
Un polinucleótido de ARNi modula la expresión de ARN codificado por un gen. Debido a que múltiples genes pueden compartir un cierto grado de homología de secuencia uno con otro, un polinucleótido de ARNi puede ser diseñado para dirigir una clase de genes con suficiente homología de secuencia. Así, un polinucleótido de ARNi puede contener una secuencia que tiene complementariedad a secuencias que son compartidas junto con diferentes genes dirigidos o son únicos para un gen dirigido específico. Por lo tanto, el polinucleótido de ARNi puede ser diseñado para dirigir regiones conservadas de una secuencia de ARN que tienen homología entre varios genes para de este modo dirigir varios genes en una familia de genes (por ejemplo, diferentes isoformas de genes, variantes, variantes de empalme, genes mutantes, etc.). En otra modalidad, el polinucleótido de ARNi puede ser diseñado para dirigir una secuencia que es única a una secuencia específica de ARN de un solo gen.
El término complementariedad se refiere a la capacidad de un polinucleótido para formar enlace (s) de hidrógeno con otra secuencia de polinucleótido ya sea. mediante Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. En referencia a las moléculas de polinucleótido de la presente invención, la energía de unión libre para una molécula de polinucleótido con su objetivo (sitio de unión efector) o secuencia complementaria es suficiente para permitir la función relevante del polinucleótido para proceder, por ejemplo, a la escisión de ARNm enzimática o inhibición de traducción. La determinación de energías de unión libres para moléculas de ácido nucleico es bien conocida en el arte previo (Frier et al. 1986, Turner et al. 1987). Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de bases, en una cadena contigua, en una primera molécula de polinucleótido que puede formar enlaces hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick pares de bases) con una segunda secuencia de polinucleótido (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 fuera de 10 siendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 100% complementario) . Perfectamente complementario significa que todas las bases en una cadena contigua de una secuencia de polinucleótido unirá al hidrógeno con el mismo número de bases contiguas en una segunda secuencia de polinucleótido.
Por inhibir, regulado bajo, o reducción de la expresión del gen, significa que la expresión del gen, como es medida por el nivel de ARN transcrito del gen o nivel de polipéptido, proteína o subunidad de proteína traducida de ARN, es reducida por debajo de la observada en la ausencia de los conjugados de polinucleótido bloqueados de la invención. Inhibición, regulación baja, o reducción de la expresión del gen, con un polinucleótido liberado por las composiciones de la invención es preferiblemente debajo del nivel observado en la presencia de un control de ácido nucleico inactivo, un ácido nucleico con secuencia codificada o con inactivación de desajustes, o en ausencia de la conjugación del polinucleótido al polímero enmascarado.
Administración in vivo En farmacología y toxicología, una ruta de administración es el camino mediante el cual un fármaco, fluido, veneno, u otra sustancia es llevada en contacto con el cuerpo. En general, los métodos de administración de fármacos y ácidos nucleicos para el tratamiento de un mamífero son bien conocidos en el arte previo y pueden ser aplicados al suministro de composiciones de la invención. Los compuestos de la presente invención pueden ser suministrados mediante cualquier vía apropiada, más preferiblemente vía parenteral, en una preparación apropiadamente a la medida de esa ruta. Así, los compuestos de la presente invención pueden ser suministrados por inyección, por ejemplo, intravenosamente, intramuscularmente , intracutáneamente, subcutáneamente, o intraperitonealmente . En consecuencia, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las rutas de administración parenteral incluyen inyecciones intravascular (intravenosa, intraarterial) , intramuscular, intraparenquimal , intradérmica, subdérmica, subcutánea, intratumoral , intraperitoneal, intratecal, subdural, epidural, e intralinf tico que utilizan una jeringa y una aguja o catéter. Aquí intravascular significa en una estructura tubular llamada capilar que es conectada al tejido u órgano dentro del cuerpo . Dentro de la cavidad de la estructura tubular, un fluido corporal fluye a o de una parte del cuerpo. Ejemplos de fluido corporal incluyen sangre, fluido cerebroespinal (CSF, por sus siglas en inglés) , fluido linfático, o bilis. Ejemplos de vasos incluyen arterias, arteriales, capilares, ¦ vénulas, sinusoides, venas, linfáticos, ductos biliares, y ductos salivales u otras glándulas exocrinas . La ruta intravascular incluye la liberación a través de vasos sanguíneos tales como una arteria o vena El sistema circulatorio sanguíneo proporciona la diseminación sistémica del medicamento.
Las composiciones descritas son inyectadas en soluciones portadoras farmacéuticamente aceptables . Con farmacéuticamente aceptables se refiere a aquellas propiedades y/o sustancias que son aceptables a los mamíferos desde un punto de vista farmacológico/toxicológico . La frase f rmacéuticamente aceptable se refiere a entidades moleculares, composiciones, y propiedades que son fisiológicamente tolerables y no producen generalmente una alergia u otra reacción adversa o tóxica cuando son suministrados a un mamífero. Preferiblemente, como se ha utilizado aquí, el término farmacéuticamente aceptable significa aprobado por la agencia regulatoria federal o un estado gubernamental o enlistado en la Farmacopea de Estados Unidos u otras generalmente reconocidas farmacopeas para uso en animales y más particularmente en humanos .
El conjugado de la fracción dirigida del polinucleótido de AR i es co- dministrado con el polímero de liberación. Por co-administrado significa que el polinucleótido de ARNi y el polímero de liberación son suministrados al mamífero de forma que ambos están presentes en el mamífero al mismo tiempo. El conjugado de la fracción dirigida del polinucleótido de ARNi y el polímero de liberación pueden ser suministrados simultáneamente o pueden ser liberados secuencialmente . Para administración secuencial, pueden ser mezclados antes de la administración. Para administración secuencial, ya sea el conjugado de la fracción dirigida del polinucleótido de ARNi o el polímero de liberación pueden ser suministrados primero.
Para los conjugados de la fracción dirigida hidrofóbica del polinucleótido de ARNi, el conjugado de ARNi puede ser administrado arriba de 30 minutos antes del suministro del polímero de liberación. También para los conjugados de la fracción dirigida hidrofóbica del polinucleótido de ARNi, el polímero de liberación puede ser suministrado arriba de dos horas antes de la administración del conjugado de AR i.
Para los conjugados de la fracción dirigida del agrupamiento del polinucleótido de ARNi-galactosa, el conjugado de ARNi puede ser suministrado arriba de 15 minutos antes de la administración del polímero de liberación. También para los conjugados de la fracción dirigida del agrupamiento de polinucleótido de ARNi-galactosa, el polímero de liberación puede ser suministrado arriba de 15 minutos antes de la administración del conjugado de ARNi.
Efecto terapéutico Los polinucleótidos de ARNi pueden ser liberados para propósitos de investigación o para producir un cambio en una célula que es terapéutica. La liberación in vivo de polinucleótidos de ARNi es útil para la investigación de reactivos y para una variedad de aplicaciones terapéuticas, diagnóstico, validación de objetivo, descubrimiento genómico, ingeniería genética, y farmacogenómicas . Hemos descrito que la liberación del polinucleótido de ARNi resulta en la inhibición de la expresión endógena de genes en hepatocitos. Los niveles de la expresión del gen reportero (marcador) medido después de la liberación de un polinucleótido indica una expectación razonable de niveles similares de expresión del gen después de la liberación de otros polinucleótidos. Los niveles de tratamiento considerados benéficos por una persona experimentada en la técnica difiere de enfermedad a enfermedad. Por ejemplo, Hemofilia A y B son causadas por deficiencias de factores de coagulación VIII y IX ligados a X, respectivamente. Su curso clínico es enormemente influenciado por el porcentaje de niveles de suero normales del factor VIII o IX: <2%, severo; 2-5%, moderado; y 5-30% ligero. Así, un incremento del 1% al 2% del nivel normal del factor de circulación en pacientes severos puede considerarse benéfico. Niveles mayores que el 6% previenen sangrados espontáneos pero no aquellos secundarios a una cirugía o herida. De manera similar, la inhibición de un gen necesita no ser 100% para proporcionar un beneficio terapéutico. Una persona experimentada en la técnica de la terapia de genes anticiparía razonablemente niveles benéficos de expresión de un gen especifico para una enfermedad basada en niveles suficientes de resultados del gen marcador. En el ejemplo de hemofilia, si los genes del marcador fueron expresados para producir una proteína en un nivel comparable en volumen a 2% del nivel normal de factor VII, se puede esperar razonablemente que el gen que codifica para el factor VIII también sería expresado en niveles similares. De este modo los genes reporteros o marcadores sirven como paradigmas útiles para la expresión de proteínas' intracelulares en general .
El hígado es uno de los tejidos dirigidos más importantes para la terapia de genes dado su papel central en metabolismo (por ejemplo, metabolismo de lipoproteína en varias hipercoleserolemias) y la secreción de proteínas de circulación (por ejemplo factores de coagulación en hemofilia). Además, los trastornos adquiridos tales como hepatitis y cirrosis crónicos son comunes y también potencialmente son tratados por terapias del hígado basadas en polinucleótido . Un ' número de enfermedades o condiciones que afectan o son afectadas por el hígado potencialmente se tratan con la reducción (inhibición) de la expresión del gen en el hígado. Tales enfermedades y condiciones del hígado pueden ser seleccionadas de la lista que comprende: cánceres de hígado (incluyendo carcinoma hepatocelular, HCC) , infecciones virales (incluyendo hepatitis) , trastornos metabólicos, (incluyendo hiperlipidemia y diabetes) , fibrosis, y lesión del hígado aguda.
La cantidad (dosis) de polímero de liberación y conjugado del polinucleotido de ARNi que debe ser administrado puede ser determinado empíricamente. Hemos mostrado que la reducción eficaz de la expresión del gen que utiliza 0.1-10 mg/kg del peso del animal del conjugado de ARNsi y 5-60 mg/kg de polímero de liberación del peso del animal. Una cantidad preferida en ratones es 0.25-2.5 mg/kg de conjugado de ARNsi y 10-40 mg/kg del polímero de liberación. Más preferiblemente, se administran aproximadamente 12.5-20 mg/kg del polímero de liberación. La cantidad del conjugado de polinucleotido de ARNi se incrementa fácilmente porque no es típicamente tóxica en dosis más grandes.
Como se utiliza aquí, in vivo significa que ocurre dentro de un organismo y más específicamente a un proceso realizado o en el tejido vivo de uno completo, organismo multicelular vivo (animal) , tal como un mamífero, en comparación con uno parcial o muerto.
Ejemplos Síntesis de polímero Ejemplo 1. Copolímeros aleatorios de poli (vinil éter) A. Monómeros de vinil éter para la incorporación de monómeroos que contienen amina. 2-Viniloxi etil ftalimida fue preparado por medio de reaccionar 2-cloroetil vinil éter (25 g, 0.24 mol; CAS #110-75-8) y ftalamida de potasio (25 g, 0.135 mol; CAS #1074-82-4) en N, N-Dimetilformamida a 100°C (DMF, 75 mi) usando bromuro de tetra n-butil amonio (0.5 g; CAS #1643-19-2) como el catalizador de transferencia de fase. Esta solución fue calentada por 6 horas y después vaciada en agua y filtrada. Este sólido después fue recristalizado dos veces del metanol para dar cristales blancos.
B.. Síntesis de terpolímeros de poli (vinil éter) poliamina de membrana activa, amfipáticos, solubles en agua. X mol% de vinileter protegido con amina (por ejemplo, 2-Viniloxi Etil Ftalamida) se agregan a un matraz de fondo redondo secado en el horno bajo de una manta de nitrógeno en diclorometano anhidro. A esta solución se agregaron Y mol% de vinileter del grupo hidrofóbico inferior (por ejemplo, propilo, butilo) y opcionalmente se agregan Z mol% de vinileter del grupo hidrofóbico superior (por ejemplo, dodecil, octadecil) (Fig. 1) . La' solución se coloca en un baño a -50 hasta -78 °C, y el 2-viniloxi etil ftalamida se permite precipitarse. A esta solución se agregan 10 mol % de BF3 (OCH2CH3)2 y la reacción se permite proceder por 2-3 horas a -50 a -78°C. La polimerización es terminada por la adición de hidróxido de amonio en solución de metanol. El polímero se lleva al estado seco bajo presión reducida y después se recoge en 1 , -dioxano/metanol (2/1). 20 mol eq. de hidracina por ftalamida se agrega para remover al grupo de protección de la amina. La solución se refluja por 3 horas y después se lleva a sequedad bajo presión reducida. El sólido resultante se disuelve en 0.5 mol/L de HCl y se refluja por 15 minutos para formar la sal de hidrlocloruro del polímero, diluido con agua destilada, y reflujado por una hora adicional. La solución después se neutraliza con NaOH, se enfría a temperatura ambiente (RT) , se transfiere al tubo de celulosa molecular, se dializa contra agua destilada, y se liofiliza. El polímero se puede purificar adicionalmente usando exclusión de tamaño u otra cromatografía. El peso molecular de los polímeros se estima usando columnas de acuerdo con procedimientos estándares, incluyendo cromatografía de exclusión de tamaño analítica y cromatografía de exclusión de tamaño con dispersión de luz de múltiples ángulos (SEC-MALS) .
C. Síntesis de DW1360. Un terpolímero de amina/butil/octadecil poli (vinil éter), fue sintetizado a partir de 2-viniloxi etil ftalamida (5 g, 23.02 mmol) , butil vinileter (0.665 g, 6.58 mmol), y mónómeros de octadecil vinileter (0.488 g, 1.64 mmol). 2-Viniloxi etil ftalamida fue agregado a un matraz de fondo de 200 mi secado en el horno que contenía una barra de agitación magnética bajo una manta de argón en 36 mi de diclorometano anhidro. A esta solución se agregó butil vinil éter y vinil n-octadecil éter. Los mónómeros fueron disueltos completamente a temperatura ambiente (RT) para obtener una solución clara, homogénea. El recipiente de reacción que contenía la solución clara después fue colocado en un baño de -50°C generado por la adición de hielo seco a una solución 1:1 de alcohol desnaturalizado grado ACS y etilen glicol y una precipitación visible de monómero de ftalamida fueron permitidos formarse. Después de enfriarse por aproximadamente 1.5' minutos, BF3 · (pCH2CH3) 2 (0.058 g, 0.411 mmol) fue agregado para iniciar la reacción de polimerización. El monómero de ftalamida se disolvió durante la iniciación de polimerización. A la reacción se le permitió proceder por 3 horas a -50°C. La polimerización fue parada por la adición de 5 mi de hidróxido de amonio al 1% en metanol. Los solventes después fueron removidos por evaporación rotatoria.
El polímero entonces fue disüelto en .30 mi de 1,4-dioxano/metanol (2/1) . A esta solución se agregó hidracina (0.147 g, 46 mmol) y la mezcla fue calentada a reflujo por 3 horas. Los solventes después fueron extraídos por evaporación rotatoria y el sólido resultante después fue recogido en 20 mi de 0.5 mol/L HCl y reflujado por 15 minutos, diluido con 20 mi de agua destilada, y refl jado por una hora adicional. Esta solución después fue neutralizada con NaOH, enfriada a RT, transferida a un tubo de celulosa de 3,500 de peso molecular, dializada por 24 horas (2x20L) contra agua destilada, y liofilizada.
Aun cuando se describen polímeros que contienen los monómeros indicados de vinil éter, la invención no se limita a estos monómeros particulares.
D. Síntesis de terpolímeros de poli (acrilato) poliamina de membrana activa, amfipáticos, solubles en agua, heteropolímeros de poli (acrilato) y poli (metilacrilato) se pueden sintetizar usando el esquema de .reacción del radical libre general (Como es utilizado aquí una poli (metacrilato) poliamina es un subgénero del género poli (acrilato) poliamina) : en donde R es independientemente un hidrógeno o un grupo metilo y X representa los grupos pendientes del monómero deseado presentes en el polímero en proporciones deseados.
Para las síntesis del polímero, los monómeros apropiados incluyen, pero no se limitan a: Monómeros que contienen amina BOC-protegidos en donde n = 1-4 y la eliminación del grupo de protección BOC produce una amina primaria Monómeros del grupo hidrofóbico inferior en donde n = 1-5 y uno o más carbonos pueden insaturados . en donde n = 8-24 y unos o más carbonos pueden ser insaturados .
Usando los monómeros anteriores, los heteropolímeros activos de la membrana se pueden sintetizar con las siguientes composiciones: M puede ser 50-90 mol%; N puede ser 10-50 mol %; O puede ser 0-10 mol%.
E. Síntesis de terpolímeros poli (acrilato)poliamina de membrana activa solubles en agua, a fipáticos .
R, R' , y R" son independientemente hidrógeno o metilo x = 2, 3, o 4 y = 0, 1, 2, 3, 4, o 5 [metilo (Cl) - hexilo (C6)] z = entero > 8 [decilo (CIO) o mayor] a, b, y d, son enteros seleccionados de manera que el polímero tiene la proporción deseada de monómeros como se describió anteriormente.
X mol% de monómero de acrilato protegido con amina, Y mol% de monómero de acrilato del grupo hidrofóbico inferior, y opcionalmente Z % mol del monómero de acrilato del grupo hidrofóbico superior se agrega a un tubo de reacción equipado con una barra de agitación. Se agrega un solvente apropiado (por ejemplo, acetonitrilo o dioxano) , seguido por un catalizador apropiado (por ejemplo, AIBN) , y la mezcla de reacción se purga con N2. Los tubos de reacción después se tapan y se transfieren a un baño de aceite y se calientan (por ejemplo, 60°C) por suficiente tiempo para permitir la polimerización (por ejemplo, 3 horas) . El polímero crudo se puede purificar por los medios apropiados, incluyendo pero no limitado a diálisis, cromatografía de columna, y precipitación, antes de la eliminación de los grupos de protección BOC. Los grupos de protección BOC se eliminan mediante la reacción con HC1 2 en ácido acético glacial. La eliminación de los grupos de protección BOC produce aminas primarias de polímero y una poli (acrilato) poliamina de membrana activa soluble en agua. El polímero entonces se puede purificar por medios apropiados, incluyendo diálisis, cromatografía de columna, y precipitación.
Síntesis de (Ant 40911-3 23-28, Ánt 40911-35-2) . 2,2'-Azobis (2-metilpropionitrilo) (AIBN, iniciador radical), acetonitrilo, y dioxano fueron adquiridos de sigma Aldrich. Los monómeros de acrilato y metacrilato fueron filtrados para eliminar los inhibidores. 3 - (BOC-amino) -1-propanol (TCI) fue reaccionado con cloruro de acriloilp (CAS 814-68-6) para producir BOC-amino propil acrilato (BAPA) .
En un matraz de fondo redondo de 2L equipado con una barra de agitación, (2-aminoetoxi) -2-etanol (21.1 g, 202.9mmol) fue disuelto en 350 mi de diclorometano . En un matraz separado de 1L, el anhídrido BOC (36.6g, 169.1 mmol) fue disuelto en 660 mi de diclorometano. El matraz de fondo redondo de 2L fue ajustado con un embudo de adición y la solución del anhídrido BOC fue agregada al matraz durante 6 horas. La reacción se dejó que se agitara durante la noche. En un embudo de separación de 2L, el producto fue lavado con 300 mi por cada uno de ácido cítrico al 10%, K2CO3 al 10%, NaHCOj sat., y NaCl sat. El producto, (2-aminoetoxi) etanol BOC protegido, fue secado con Na2S04, filtrado por gravedad, y el DCM fue evaporado utilizando evaporación rotatoria y alto vacío .
En un matraz de fondo redondo de 500 mi equipado con una barra de agitación y purgado con argón, se agregó 2- (2-aminoetoxi) etanol BOC protegido (27.836g, 135.8 mmol), seguido por 240 mi de diclorometano anhidro. La diisopropiletil amina (3^.5 mi, 203.7 mmol) fue agregada, y el sistema fue colocado en un baño de hielo seco/acetona. El cloruro de acriloilo (12.1 mi, 149.4 mmol) fue diluido usando 5 10 mi de diclorometano, y agregado gota a gota al sistema purgado con argón. El sistema fue mantenido bajo argón y se dejó llegar a temperatura ambiente y agitado durante la noche. El producto fue lavado con 100 mi de cada uno de dH20, ácido cítrico al 10%, K2C03 al 10%, NaHC03 sat., y NaCl saturado. El producto, BOC-amino etil etoxi acrilato (BAEEA) , fue secado con Na2S04, filtrado por gravedad, y el DCM fue evaporado utilizando evaporación rotatoria. El producto fue purificado a través de cromatografía de columna en 29 cm de sílice utilizado una columna de 7.5 cm de diámetro. El sistema de solvente usado fue acetato de etilo al 30% en hexano. Rf: 0.30. Las fracciones fueron recogidas y el solvente fue extraído usando evaporación rotatoria y alto vacío. BAEEA, fue obtenido con rendimiento de 74%. BAEEA fue almacenado en el congelador.
BAEEA Polímero 40911-3 23-28: 70% de BAPA, 25% de butil metacrilato (CAS 97-88-1) , 5% de octadecil metacrilato (CAS 4813-57-4), proporción de alimentación por mol (catalizador AIBN al 3%) (0.0139 moles totales). BAPA (9.739 mmol) (A), butil metacrilato (3.478 mmol) (B) , y metacrilato de octadecilo (0.6957 mmol) (D) fueron agregados a un tubo de reacción de 20 mi equipado con una barra de agitación. Se agregó acetonitrilo (16 mi), seguido por AIBN (0.4174 mmol) . Los pasos anteriores fueron repetidos con el fin de tener dos reacciones corridas en tándem. La mezcla de reacción fue purgada con N2 por 30 min. Los tubos de reacción después fueron tapados y transferidos a un baño de aceite y calentados a 60°C por 3 horas. Los tubos fueron retirados y el contenido fue combinado. El polímero crudo fue precipitado dentro de agua desionizada, y reaccionó con ácido trifluoroacético solo (40 mi) por 1.5 h para remover los grupos de protección BOC y producir las aminas primarias y poli (acrilato) poliamina de membrana activa soluble en agua. 200 mi de H20 desionizada (dH20) fueron agregados a la reacción, la solución fue transferida a la tubería de celulosa de peso molecular 3500, dializada contra sal elevada por 24 horas, después contra dH20 por 18 horas. El contenido fue evaporado hasta sequedad, disuelto en 100 mi de dH20 y liofilizado. El polímero secado fue disuelto en la solución de 50% de eOH/100 m de formato de amonio/0.2% de ácido fórmico en 25 mg/ml. Tres inyecciones de la solución de polímero crudo (250 mg, 10 mi) fueron purificadas en medio de sephacryl S-200 usando una columna XK50/30 cm utilizada en un caudal de 5.0 ml/min. La columna fue empaquetada y utilizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. (GE Healthcare, instrucciones 56-1130-82 Al, 52-2086-00 A) . La elución del polímero fue detectada utilizando de un colector de índice de refracción Shimadzu RID-10A. Las fracciones desde 23 minutos hasta 28 minutos fueron recogidas y combinadas para cada corrida. El solvente fue evaporado y el polímero purificado fue liofilizado dos veces.
Polímero Ant. 40911-35-2: 80% de BAEEA, 15% de metacrilato butílico, 5% de octadecil acrilato, (catalizador AIBN al 3%) proporción de alimentación por mol (0.013913 moles totales). BAEEA (A) (11.13 mmol) , metacrilato de butilo (B) (2.086 mmol), y acrilato de octadecilo (D) (0.6957 mmol) fueron agregados a un tubo de reacción de 20 mi equipado con una barra de agitación. Se agregó dioxano (16 mi) , seguido por AIBN (0.4174 mmol). Los pasos anteriores fueron repetidos para tener dos reacciones corridas en tándem. La mezcla de reacción fue purgada con N2 por 30 min. Los tubos de reacción después fueron tapados y transferidos a un baño de aceite y calentados a 60 °C por 3 horas. Los tubos fueron retirados y el contenido fue combinado . El Dioxano fue evaporado con evaporación rotatoria y alto vacío y el polímero crudo fue disuelto en la solución de 89.8% diclorometano/10% de tetrahidrofurano/0.2% de trietilamina en 70 mg/ml. Tres inyecciones de la solución de polímero cruda (700 mm, 10 mi) fueron purificadas en una columna de divinil benceno gel Jordi de 104 Á (diámetro interno: 22 mm, longitud: 500 mm) usadas en un caudal de 5.0 ml/min. La elución del polímero fue detectada utilizando un colector de índice de refracción Shimadzu RID-10A. Las fracciones desde 15.07 minutos-17.13 minutos fueron recogidas y combinadas . El solvente fue evaporado con evaporación rotatoria.
Aproximadamente 10 mg del polímero fue disuelto en 0.5 mi de diclorometano al 89.8%, tetrahidrofurano al 10%, trietilamina al 0.2%. El peso molecular y la dispersibilidad (PDI) fueron medidos utilizando un detector de dispersión de luz de múltiples ángulos de Wyatt Helos II unido a una HPLC Shimadzu prominence utilizando una columna LS DVB de Lecho Mezclado 7.8x300 de 5µ Jordi. Un peso molecular de 172,000 y un PDI de 1.26 fueron obtenidos.
El polímero BOC-protegido purificado fue reaccionado con ácido trifluoroacético solo (7 mi) por 1.5 horas (o HC1 2 M en ácido acético glacial por 0.5 horas) para remover los grupos de protección BOC y para producir las aminas. 40 mi de dH20 fueron agregados a la reacción, la solución fue transferida a la tubería de celulosa de peso molecular 3500, dializada contra sal elevada por 24 horas, después contra dH20 por 18 horas. El contenido fue evaporado hasta sequedad, después disuelto en 20-30 mi de dH20 y liofilizado dos veces. La solución del polímero fue almacenada a 2-8°C.
El número de átomos de carbono que ligan la amina a la estructura del polímero y si el conector o no está ramificado, afecta el pKa de la amina y efectos estéricos cerca de la amina. Por ejemplo, para los polímeros anteriores, la etil amina tiene un pKa de aproximadamente 8.1, la propil amina tiene un pKa de aproximadamente 9.3, y la pentil amina tiene un pKa de aproximadamente 10.2. El pKa de la amina o los efectos estéricos cerca de la amina afecta la labilidad de los grupos de enmascaramiento unidos a la amina. Para la unión reversible de un anhídrido maleico a una amina, un pKa más alto de la amina resulta en un índice más lento de liberación de un anhídrido de la amina. También, el impedimento estérico incrementado cerca de la amina, por ejemplo con un conector de isopropilo, puede aumentar el pKa de la amina .
Polímero Lau 41305-38-17-19: 80% de BAPA, 20% de metacrilato de etilo (CAS 97-63-2) , proporción de alimentación por mol (3% de catalizador AIBN) (0.0105 moles totales). BAPA (A) (8.40 mmol) , metacrilato de Etilo (B) (2.10 mmol), fueron agregados a un tubo de reacción de 15 mi equipado con una barra de agitación. Se agregó acetonitrilo (11.5 mi), seguido por AIBN (0.315 mmol). Los pasos anteriores fueron repetidos para tener dos reacciones corridas en tándem. La mezcla de reacción fue purgada con N2 por 30 min. Los tubos de reacción después fueron tapados y transferidos a un baño de aceite y calentados a 60°C por 3 horas . Los tubos fueron retirados y el contenido fue combinado. El acetinitrilo fue evaporado con evaporación rotatoria y alto vacío y el polímero crudo fue disuelto en la solución de 74.8% diclorometano/25% de tetrahidrofurano/O .2% de trietilamina en 50 mg/ml. Tres inyecciones de la solución de polímero cruda (500 mg, 10 mi) fueron purificadas en una columna de divinil benceno gel Jordi de 104 Á (diámetro interno: 22 mm, longitud: 500 mm) usadas en un caudal de 5.0 ml/min. La elución del polímero fue detectada utilizando un colector de índice de refracción Shimadzu RID-10A. Las fracciones desde 17.16 minutos-19.18 minutos fueron recogidas y combinadas. El solvente fue evaporado con evaporación rotatoria. El polímero BOC-protegido purificado fue reaccionado con HCl 2 en ácido acético glacial (7 mi) por 1.5 h para remover los grupos de protección BOC y producir las aminas. 40 mi de dH20 fueron agregados a la reacción, la solución fue transferida a la tubería de celulosa de peso molecular cortado de 3500, dializada contra sal elevada por 24 horas, después contra dH20 por 18 horas. El contenido fue evaporado a sequedad, después disuelto en 30 mi de dH20 y liofilizado dos veces.
F. Polímeros similares, sintetizados de los monómeros de amina (protegidos) , monómeros del grupo hidrofóbico inferior, y grupos octadecilo del grupo hidrofóbico superior sería predicho que es eficaz en la práctica de la invención descrita.
Caracterización del polímero Ejemplo 2. Caracterización de DW1360.
A. Análisis amfipático. La fluorescencia de 1,6-difenil-1, 3 , 5-hexatrieno (DPH, Invitrogen) (?ß? = 350 nm; Aem = 452 nm) es mejorada en un ambiente hidrofóbico. Este fluoroforo fue utilizado para analizar el polímero D 1360. 0.5 µ? de DPH (concentración final) fueron agregados a 10 ug de D 1360 en 0.5 mi de solución amortiguadora de 50 Mm HEPES, pH 8.0. La solución deespués fue probada para la acumulación de DPH en un ambiente hidrofóbico midiendo la fluorescencia de DPH. La fluorescencia incrementada de DPH en la presencia de los conjugados indica la formación de un ambiente hidrofóbico por el polímero.
B. Peso molecular. Los pesos moleculares del polímero (masa) (MW) fueron determinados en una corrida de yatt Dawn Heleos II junto con optilab rEX en modo de lote. Los polímeros fueron presentados en concentraciones que varían en solvente apropiado y cada uno fue cargado sobre el sistema de Wyatt. El software Astra entonces calculado cambia en el índice de refracción como una función de la concentración (dn/dc) que fue utilizada en una gráfica de Zimm para calcular el MW. El peso molecular promedio determinado para DW1360 purificado fue 4000-6000 Da. El peso molecular promedio para, los polímeros de acrilato purificados fue aproximadamente 100-120kDa.
C. Tamaño de partícula y potencial Zeta. El potencial zeta de los polímeros fue medido utilizando un instrumento de la serie nano Malvern Zetasizer (Nano ZS) . El potencial zeta de los polímeros enmascarados con CDM variados entre 0 y -30 mV y más predominante entre 0 y -20 mV. El potencial Zeta fue medido en la glucosa isotónica amortiguada en pH 8 con HEPES residual. En pH 7, se esperaría que los conjugados ganaran una cierta carga positiva debido a la protonacion de algunas de las aminas .
D. Cuantificación de los grupos amina en el conjugado después de la modificación del reactivo con CDM. El polímero DW1360 fue sintetizado como es descrito previamente seguido por el tratamiento con 14 equivalentes por peso de base HEPES y 7 equivalentes por peso de una mezcla 2:1 peso: peso de CDM-NAG y CDM-PEG (11 unidades promedio) . Una hora más tarde, el contenido de la amina del conjugado tratado con el derivado de anhídrido maleico fue medido por el tratamiento con ácido trinitrobenceno sulfónico (TNBS) en 100 m de NaHC03. Cuando se normalizó a un conjugado que no había sido modificado con maleamato, se determinó que la cantidad de aminas modificadas era aproximadamente 75% del total. Este grado de modificación puede ser variado cambiando la cantidad de anhídrido maleico agregado o alterando las condiciones de reacción.
E. Lisis de liposo a. 10 mg de fosfatidilcolina de huevo fueron hidratados con 1 mi de solución amortiguadora que contenía 100 mM de carboxifluoresceina (CF) y 10 mM de HEPES pH 7.5. Las liposomas entonces fueron extruidas a través de filtros de policarbonato de poros de 100 nm (Nucleopore, Pleasanton, CA) . CF no atrapado fue removido por cromatografía de exclusión de tamaño usando Sepharose 4B-200 eluyendo con 10 mM de HEPES en pH 8 y 0.1 mol/L de NaCl . Una alícuota de 200 \ih de las liposomas cargadas con CF fue agregada a 1.8 mi de solución amortiguadora isotónica. La fluorescencia (Xex=488, Xem=540) fue medida 30 minutos después de la adición de 0.25 de polímeros a suspensiones de vesícula. En el final de cada experimento, las vesículas fueron interrumpidas por la adición de 40 µ? de una solución de Tritón X-100 al 1% para determinar lisis máxima.
Agentes de enmascaramiento de polímero Ejemplo 3: Agentes de enmascaramiento.
A. Síntesis del precursor del agente de enmascaramiento de anhídrido 2-propionico-3 -metilmaleico (anhídrido carboxidimetilmaleico o CDM) . anhídrido 2 -propionico- 3 -metilmaleico A una suspensión de hidruro de sodio (0.58 g, 25 mmol) en tetrahidrof rano anhidro de 50 mi se agregó trietil-2-fosfonopropionato (7.1 g, 30 mmol). Después de que la evolución de gas de hidrógeno hubiera parado, se agregó dimetil-2-oxoglutarato (3.5 g, 20 mmol) en tetrahidrofurano anhidro de 10 mi y agitado por 30 Min. 10 mi de agua después fueron agregados, y el tetrahidrofurano fue removido por evaporación rotatoria. La mezcla de sólido y agua resultante fue extraída con 3x50 mi de etil éter. Las extracciones del éter fueron combinadas, secadas con sulfato de magnesio, y concentradas a un aceite amarillo claro. El aceite fue purificado por elución de cromatografía de gel de sílice con éter:hexano 2:1 para producir 4 g (rendimiento de 82%) de triester puro. El anhídrido 2-propionico-3 -metilmaleico después fue formado disolviendo este triéster en 50 mi de una mezcla de 50/50 de agua y etanol que contenían 4.5 g (5 equivalentes) de hidróxido de potasio. Esta solución fue calentada a reflujo por 1 hora. El etanol entonces fue removido por la evaporación rotatoria y la solución fue acidificada a pH 2 con ácido clorhídrico. Esta solución acuosa después fue extraída con 200 mL de acetato de etilo, aislada, secada con sulfato de magnesio, y concentrada a un sólido blanco. Este sólido entonces fue recristalizado del diclorometano y hexano para producir 2 g (rendimiento de 80%) de anhídrido 2 -propionico-3 -metilmaleico.
Los tioésteres, ésteres, y amidas se pueden sintetizar del CDM por la conversión de CDM a su cloruro ácido con cloruro de oxalilo seguido por la adición de un tiol, un éster, o una amina y una piridina. CDM y sus derivados son modificados fácilmente, por los métodos estándares en el arte previo, con ligandos dirigidos, los estabilizadores estéricos, grupos cargados, y otros grupos reactivos. Las moléculas resultantes se pueden utilizar para modificar reversiblemente las aminas.
Los agentes de enmascaramiento fueron sintetizados con la modificación de CDM para producir preferiblemente agentes neutrales de carga: en donde Rl comprende un ligando dirigido ASGPr o estabilizador estérico (por ejemplo PEG) .
B. Agente de enmascaramiento que contiene un grupo ASGPr dirigido. Los ligandos dirigidos del hepatocito ampliamente estudiados se basan en galactosa, que es unida por el receptor de asialoglicoproteina (ASGPr) en hepatocitos. El acoplamiento de galactosa o un derivado de galactosa se ha demostrado que facilita el hepa.tocito de algunos polímeros sin carga, altamente solubles en agua, incluyendo: el oligosacárido quitosán, un derivado de poliestireno, y una poliacrilamida HPMA. Los grupos ASGPr dirigidos son fácilmente generados usando lactosa, un disacárido de galactosa-glucosa, vía la modificación del residuo de glucosa. Ácido lactobionico (LBA, un derivado de lactosa en el cual la glucosa se ha oxidado al ácido glucónico) se incorpora fácilmente en un derivado de anhídrido maleico usando técnicas de acoplamiento de amida estándares .
CDM-lactosa C. Estabilizador estérico CDM-PEG y síntesis del grupo dirigido CDM-NAG (Síntesis de N-acetil galactosamina) . A una solución de CDM (300 mg, 0.16 mmol) en 50 mi de cloruro de metileno se agregó cloruro de oxalilo (2 g, 10 eq. por peso) y dimetilformamida (5 µ?) . La reacción fue permitida proceder durante la noche, después de lo cual el exceso de cloruro de oxalilo y cloruro de metileno fueron eliminados por la evaporación rotatoria para producir cloruro ácido CDM. El cloruro ácido fue disuelto en 1 mi de cloruro de metileno. A esta solución se agregaron 1.1 equivalentes molares de monometil éter de polietilen glicol (MW promedio 550) para CDM-PEG o (aminoetoxi) etoxi-2- (acetilamino) -2-deoxi- -D-galactopiranosido (en este caso, amino bisetoxil-etil NAG) para CDM-NAG, y piridina (200 µ?, 1.5 eq) en 10 mi de cloruro de metileno. La solución entonces fue agitada 1.5 horas. El solvente después fue extraído y el sólido resultante fue disuelto en 5 mi de agua y purificado usando HPLC de fase inversa utilizando un gradiente de agua/acetonitrilo TFA al 0.1%.
CDM-PEG Preferiblemente, PEG que contiene desde 5 hasta 20 unidades de etileno se unen al anhídrido maleico disubstituido. Preferiblemente, el PEG que contiene 10-14 unidades de etileno se une al anhídrido maleico di-substituido. El PEG puede ser de longitud variable y tener una longitud promedio de 5 - 20 o 10-14 unidades de etileno. Alternativamente, el PEG puede ser monodisperso, uniforme o discreto; teniendo, por ejemplo, exactamente 11 o 13 unidades de etileno.
Como se muestra arriba, un espaciador de PEG se puede colocar entre el grupo anhídrido y el grupo ASGPr dirigido. Un espaciador de PEG preferido contiene 1-10 unidades de etileno.
CDM-NAG con espaciador de alquilo Modificación del polímero reversible Ejemplo 4. Modificación/enmascaramiento reversible de poliamina de membrana activa; en este caso, modificación del polímero de membrana activa con CDM-NAG o una mezcla de CDM- NAG más CDM-PEG. A una solución de x mg de poliamina de membrana activa (por ejemplo DW1360 descrito arriba) en glucosa isotónica se agregó 14mg de HEPES base libre seguido por ya sea 7x mg de CDM-NAG o una mezcla de 2.3 x mg de CDM- NAG y 4.6x mg de CDM-PEG, para ' un total de 7x de agente de ""enmascaramiento del anhídrido maleico disubstituido. La solución después fue incubada por lo menos 30 minutos a RT antes de la administración al animal. La reacción de CDM-NAG o CDM-PEG con la poliamina produjo: en donde R es el polímero y Rl comprende una fracción ASGPr dirigida o estabilizador estérico. El carboxilo anhídrido producido en la reacción entre el anhídrido y la amina del polímero exhibe ~l/20a de la carga esperada (Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). Por lo tanto, el polímero de membrana activa se neutraliza eficazmente en lugar de ser convertido a un polianión cargado altamente negativo.
Conjugado de AR si Ejemplo 5. Conjugados de la fracción dirigida del polinucleotido de RNAi A. Conjugado de ARNsi -hidrófobo. Varios grupos hidrofóbicos ligados covalentemente a los extremos 3' o 5' de las moléculas de ARNsi usando técnicas estándares en el arte previo.
B. Conjugado de agrupamiento de ARNsi -GalNAc . El agrupamiento de GalNAc fue hecho por el acoplamiento de tres grupos de GalNAc PEG3 a las aminas en un punto ramificado de di-lisina. El grupo carboxilo en la di-lisina está entonces disponible para el acoplamiento covalente al polinucleótido de ARNi, tal como un ARNsi.
Agrupamiento de GalNAc Liberación de ARNsi in vivo Ejemplo 6. Administración de polinucleotidos ARNi in vivo, y liberación a hepatocitos. Los conjugados del polinucleótido de ARNi y polímeros enmascarados fueron sintetizados como se describió anteriormente. Ratones de seis a ocho semanas de edad (cepa C57BL/6 o ICR, -18-20 g cada uno) fueron obtenidos de Harían Sprague Dawley (Indianapolis IN) . Los ratones fueron alojados por lo menos 2 días antes de la inyección. La alimentación fue realizado ad libitum con dieta de roedores Harían Teklad (Harían, Madison WI) . Los conjugados del polinucleótido de ARNi y polímeros enmascarados fueron sintetizados como se describió anteriormente. Los ratones fueron inyectados, con solución de 0.2 mi del polímero dé liberación y 0.2 mi de conjugados de AR si dentro de la vena de la cola. Para inyección simultánea del polímero y ARNsi , el conjugado de ARNsi fue agregado al polímero modificado antes de la inyección y la cantidad total, 0.4 mi, fue inyectada. La composición era soluble y no agregada en condiciones fisiológicas. Para las inyecciones en las cuales el polímero y el ARNsi se inyectan por separado, el polímero fue inyectado en 0.2 mi de solución de la formulación y ARNsi fue inyectado en 0.2 mi de glucosa isotónica. Las soluciones fueron inyectadas por la infusión en la vena de la cola. La inyección en otros vasos, por ejemplo inyección retro-orbital, fue igualmente eficaz.
Determinación de niveles de suero ApoB. Los ratones fueron ayunados por 4 horas (16 h para ratas) antes de la colección de suero por hemorragia submandibular . Los niveles de proteína de de suero ApoB fueron determinados por métodos de ELISA sándwich estándares. En resumen, un anticuerpo de ApoB anti-ratón de cabra policlonal y un anticuerpo ApoB anti-ratón de conejo (Biodesign inteARNcional) fueron utilizados como anticuerpos de captura y detección respectivamente. Un anticuerpo IgG anti-conejo de cabra conjugado con HRP (sigma) fue aplicado después de unir el complejo ApoB/anticuerpo . La absorbencia del desarrollo colorimétrico de tetrametil-benzidina (TMB, sigma) después fue medida por un lector de microplacas de Tecan Safire2 (Austria, Europa) en 450 nm.
Mediciones de la actividad del plasma Factor VII (F7) . Las muestras de plasma de ratones fueron preparadas recolectando sangre (9 volúmenes) por sangrado submandibular dentro de tubos de microcentrifuga que contenían 0.109 mol/L de anticoagulante de citrato de sodio (1 volumen) siguiendo procedimientos estándares. La actividad de F7 en plasma se mide con un método cromogénico usando un kit de BIOPHEN VII (Hyphen BioMed/Aniara, Masón, OH) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La absorbancia del desarrollo colorimétrico fue medida usando a un lector de microplacas de Tecan Safire2 en 405 nm.
Ejemplo 7. Liberación de ARNsi a hepatocitos in vivo utilizando conjugados de ARNsi-hidrófobo co-administrados con el polímero de liberación de DW1360 enmascarado. ARNsi y el olímero de liberación fueron preparados y administrados como se describió anteriormente usando las dosis indicadas de ARNsi y polímero.
A. liberación de polinucleótido de ARNi a hepatocitos in vivo. La co-administración del conjugado de ARNsi-colesterol y polímero de liberación de DW1360 enmascarado resultó en niveles de proteína de suero ApoB disminuidos, que indican la liberación del ARNsi a hepatocitos y la inhibición de la expresión del gen apoB. La liberación eficiente requirió el polímero de liberación y conjugación de colesterol al polinucleótido de ARNi (Tabla 1, Fig. 2) . No fue observada ninguna reducción significativa con hasta 5 mg/kg de ARNsi sin conjugar. Además, el grupo hidrofóbico podría ser unido al extremo 5' o 3' del ARNsi .
Tabla 1. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección de conjugado de ARNsi-hidrófobo más el polímero de liberación D 1360, Efecto de AR si-conjugado . a porcentaje de reducción en relación al grupo de control (n=3) inyectado con solución de glucosa isotónica. b ratón ICR B. Efecto de tamaño del grupo hidrofóbico en liberación del polinucleótido de ARNi a hepatocitos.
La liberación eficiente de ARNsi a hepatocitos, utilizando la co-administración con el polímero de liberación DW1360 requirió que el ARNsi sea conjugado a un grupo hidrofóbico que tiene aproximadamente 20 o más átomos de carbono (tabla 2, FIG. 3). Los conjugados de ARNsi-hidrófobo que tienen fracciones dirigidas hidrofóbicas con menos de 20 átomos de carbono exhibieron liberación funcional progresivamente menos eficiente. Las fracciones dirigidas de hidrófobo que tenían seis (6) o pocos carbonos eran ineficaces.
La eficacia de liberación no fue mejorada significativamente aumentando el tamaño de la fracción dirigida del hidrófobo más allá de 20 átomos de carbono.
Tabla 2. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNsi-hidrófobo más el polímero de liberación DW1360 - efecto del tamaño del grupo Porcentaje de reducción en relación con el grupo de control n=3) con solución de glucosa isotónica. número de átomos de carbono en el grupo hidrofóbico conjugado al ARNsi c ratones C57BL/6.
C. Efecto de la dosis de ARNsi en liberación del conjugado de ARNsi-hidrófobo a hepatocitos .
La reducción de la expresión del gen dirigido in vivo es dependiente en la dosis de ARNsi. Para el tratamiento de ratones, la administración de la dosis de más de 1.25 mg/kg de ARNsi no mejoró la reducción del gen dirigido in vivo (Tabla 3, FIG. 4). Dosificación tan baja como 0.25 mg/kg sin embargo proporcionó reducción significativa de- la expresión del gen dirigido en ratones cuando fue co-administrado con el polímero de liberación.
Tabla 3. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNsi-hidrófobo más el polímero de liberación de DW1360 - efecto de la dosis de ARNsi. a porcentaje de reducción en relación al grupo de control (n=3) inyectado con solución de glucosa isotónica. b ratones C57BL/6.
D. Reducción de la expresión del gen dirigido in vivo es dependiente de la dosis del polímero de liberación.
Para el tratamiento de ratones, la administración de aproximadamente 12.5 mg/kg del polímero de liberación proporcionó máxima o cerca del máximo de liberación de polinucleótido de ARNi como es evidenciado por la inhibición del gen dirigido (tabla 4, FIG. 5) . La reducción del gen dirigido es afectada por la dosis del polímero. El exceso de conjugado de ARNsi no mejoró la reducción del gen dirigido en ausencia de suficiente polímero para liberación.
Tabla 4. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNsi -hidrófobo más el polímero de liberación de DW1360 - efecto de la dosis del polímero de liberación. a Porcentaje de reducción en relación al grupo de control (n=3) inyectado con la solución de glucosa isotónica. b ratones ICR. 0 ratones C57BL/6.
E. Administración secuencial. El conjugado de fracción dirigido polinucleótido de ARNi-hidrófobo se puede administrar al animal secuencialmente . Para los conjugados de la fracción dirigida de polinucleótido de ARNi hidrofóbico, el conjugado de ARNi se puede administrar hasta 30 minutos antes de la administración del polímero de liberación. También para los conjugados de la fracción dirigida del polinucleótido de ARNi hidrofóbico, el polímero de liberación puede ser administrado hasta dos horas antes de la administración del conjugado de ARNi (Tabla 5) .
Tabla 5. Reducción del gen dirigido in vivo después de nyección del conjugado de AR si-hidrófobo más el polímero liberación de DW1360 - efecto de la administración secuecial de ARNsi y polímero. a porcentaje de proteína relacionada con el grupo de control (n=3) inyectado con- solución de glucosa isotónica F. Polímeros de liberación de poli (acrilato) de membrana activa. Las poliaminas de poli (acrilato) de membrana activa amfipáticas enmascaradas reversiblemente funcionan como polímeros de liberación eficaces.
Los polímeros de poli (acrilato) fueron preparados como se describió anteriormente y co-administrados con conjugados de ARNsi-colesterol en ratones como se describió para los polímeros de liberación DW1360. Los polímeros de liberación de poli (acrilato) fueron eficaces en facilitar la liberación de ARNsi a hepatocitos in vivo como es indicado por el suero ApoB reducido (Tabla 6) . La liberación eficiente requirió el polímero de liberación y la conjugación de colesterol al polinucleótido de AR i .
Tabla 6. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNsi-hidrófobo más los polímeros de liberación de poli (acrilato) enmascarados . liberación del conjugado del polinucleótido de ARNi hidrófobo al hígado no era dependiente del Receptor LDL o la proteína Relacionada con el receptor de la lipoproteína. La co-administración del conjugado de ARNsi-colesterol del factor VII y el polímero de liberación DW1360 enmascarado resultó en niveles de proteína del factor VII en suero disminuido en ratones knockout del Receptor LDL y ratones knockout dobles de proteína relacionada con el receptor de lipoproteína/Receptor LDL. Por lo tanto, el AR si-colesterol es dirigido a los hepatocitps por medios diferentes de partículas de LDL, Receptor LDL o proteína relacionada con el receptor de lipoproteína (Tabla 7) .
Tabla 7. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNsi-colesterol más el polímero de liberación DW1360; efecto del receptor LDL y de la proteína Relacionada con el Receptor de la lipoproteína en la liberación del ARNsi. relativo de proteína H. Muestras de polivinil (éter) liofilizadas . Para probar si el polímero de liberación se podría liofilizar para el almacenamiento y transporte mejorados, el polímero de liberación en la solución fue congelado y colocado en alto vacío en un liofilizador . Después de 16 horas, la muestra era un polvo cristalino que después fue redisuelto por la adición de agua desionizada. A la muestra de polímero redisuelto se agregó ARNsi (5' colesterol apoB) , y la muestra fue inyectada. La liofilización no demostró ningún efecto perjudicial sobre el polímero de liberación.
ARNsi dirigido al agrupamiento de Galactosa Ejemplo 8. Liberación de ARNsi a hepatocitos in vivo utilizando conjugados de agrupamiento de ARNsi -galactosa coadministrados con el polímero de liberación enmascarado de DW1360. ARNsi y el polímero de liberación fueron preparados y administrados como se describió anteriormente utilizando las dosis indicadas de ARNsi y polímero.
A. Co-administración de conjugado de agrupamiento de ARNsi -galactosa y polímero de liberación enmascarado DW1360. La co-administración del conjugado del agrupamiento de ARNsi-galactosa y polímero de liberación enmascarado DW1360 resultó en niveles de proteína de suero ApoB disminuidos, indicando la liberación del ARNsi a hepatocitos y la inhibición de la expresión del gen apoB . La liberación eficiente requirió ambos el polímero de liberación y conjugación de agrupamiento de galactosa al polinucleótido de ARNi (tabla 8) . Ninguna reducción significativa fue observada con hasta 5 mg/kg de ARNsi sin conjugar. Como con el ARNsi conjugado del hidrófobo arriba, el inicio de la inhibición máxima se obtiene con aproximadamente 12.5 mg/kg de la dosis del polímero de liberación. No se observó ninguna reducción del gen dirigido en ausencia del polímero de liberación co-administrado . El conjugado de ARNsi - agrupamient.o de galactosa no exhibió ninguna actividad por sí mismo.
Tabla 8. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNsi-agrupamiento de GalNAc más el polímero de liberación, efecto de la dosis del polímero . a mg de ARNsi o polímero por kilogramo de peso animal b % relativo de proteína B. agrupamiento de ARNsi -galactosa contra onómero de ARNsi -galactosa . Liberación funcional de ARNsi a hepatoc tos in vivo cuando es co-administrado con el polímero de liberación requirió una fracción dirigida de galactosa tri-antenaria conjugada al polinucleótido de interferencia de ARNi . No se observó ninguna reducción del gen dirigido cuando una sola molécula de galactosa fue conjugada al ARNsi (tabla 9) . El derivado de galactosa de GalNPr (N-propionil galactosamina) es conocido que tiene una afinidad más alta para el ASGPr que el derivado de GalNAc (N-acetil-galactosamina) galactosa, adennás indicando la necesidad del agrupamiento de galactosa triantenaria para liberación eficiente.
Tabla 9. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado del agrupamiento de ARNsi-GalNAc más el polímero de liberación; conjugado de ARN - galactosa trivalente contra monovalente . 1 a mg de ARNsi o por kilogramo de peso del animal b % relativo de proteína c Monómero de N-Propionil galactosamina d agrupamiento de N-acetil Galactosamina (trímero) C. Efecto de modificación de polímero con el derivado de galactosa, PEG, o derivado de galactosa más PEG. ARNsi-agrupamiento de galactosa y el polímero de liberación fueron preparados como se describió anteriormente excepto como sigue: el polímero de liberación fue enmascarado con N-acetilgalactosamina solo, PEG solo, o N-acetilgalactosamina más PEG. El ARNsi y polímero de liberación entonces fueron administrados a ratones como se describió anteriormente. Las muestras de sangre después fueron recogidas de ratones y probadas para determinar los niveles de ApoB . La galactosa y PEG fueron requeridos para liberación óptima. Modificando el polímero de membrana activa con galactosa y PEG, solamente la mitad de la dosis de ARNsi fue requerida para alcanzar el mismo efecto y polímero modificados con galactosa sola. La modificación del polímero con PEG solo resultó en la liberación de ARNsi disminuida comparada con el polímero modificado con galactosa sola o con galactosa más PEG.
Tabla 10. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNs i - agrupamiento de GalNAc más polímero de liberación; efecto de modificación del polímero . mg de ARNsi o polímero por kilogramo de peso del animal b % relativo de proteína D. Curso de tiempo de reducción de gen específico de secuencia después de la co-administración del conjugado de fracción dirigida de ARNsi y polímero de liberación. ARNsi y el polímero de liberación fueron preparados como y administrados a ratones como se describió anteriormente. Las muestras de sangre después fueron recogidas de ratones en los tiempos indicados y probadas para determinar los niveles de ApoB. Los niveles de ApoB fueron observados para disminuir gradualmente hasta que alcanzaron el 3% de la palanca de control después de 72 horas. Así, la reducción del gen dirigido máxima puede ocurrir después de aproximadamente (3) días . Esto retrasa en principio de la disminución máxima de niveles de proteína puede reflejar el tiempo requerido para aclarar o degradar la proteína ApoB en lugar que el tiempo requerido para liberación máxima del polinucleótido de ARNi o para la reducción del gen.
Tabla 11. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNsi-agrupamiento de GalNAc más el polímero de liberación; curso del tiempo de la reducción del gen dirigido. 3 mg de ARNsi o polímero por kilogramo de- peso del animal b % relativo de proteína E. Inyección secuencial del conjugado de ARNs -agrupamiento de galactosa y el polímero de liberación . Las cantidades indicadas del conjugado de ARNsi-agrupación de galactosa y polímero de liberación fueron preparadas y administradas a ratones como sé describió anteriormente . Las muestras de sangre después fueron recogidas de ratones y probadas para determinar los niveles de ApoB. Para ARNsi dirigido al hígado con el agrupamiento de galactosa, liberación óptima fue observada con liberación simultánea del ARNsi y polímero de liberación. Liberación significativa de ARNsi fue observada cuando el conjugado de ARNsi fue administrado hasta 15 minutos después de la administración del polímero. Solamente liberación modesta fué observada cuando el conjugado de ARNsi fue adnúnistrado antes (hasta 15 minutos) del polímero de liberación.
Tabla 12. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección del conjugado de ARNsi-agrupamiento de GalNAc más el polímero de liberación; administración simultánea y administración separada.
F. Inserción de un conectar PEG entre el ligando dirigido del agrupamiento de galactosa y el polinucleótido de ARNi . Conjugados de ARNsi-agrupamiento de galactosa fueron preparados insertando espaciadores de PEG, PEGi9 o PEG24, entre el agrupamiento de galactosa y el ARNsi o preparados sin un espaciador de PEG entre el agrupamiento de galactosa y el ARNsi. Los conjugados de ARNsi después fueron coadministrados con el polímero de liberación. La inserción de los espaciadores PEG no mejoró la liberación del ARNsi a los hepatocitos como es determinado por la reducción del gen.
El agrupamiento de galactosa sin el espaciador de PEG; ligando dirigido unido al ARNsi a través del grupo carboxilo.
El agrupamiento de galactosa con el espaciador de PEG; ligando dirigido unido al ARNsi a través del grupo carboxilo. Tabla 13. Reducción del gen dirigido in vivo después de la inyección de conjugado de ARNsi-agrupamiento de GalNAc más el polímero de liberación; efecto del conector de PEG en el conjugado de ARN. a mg de ARNsi o polímero por kilogramo del peso del animal b % relativo de proteína Ejemplo 9. Liberación de ARNsi a hepatocitos de primates in vivo. Los conjugados del polinucleótido de ARNi y polímeros enmascarados fueron sintetizados como se describió anteriormente .
Un macaco Rhesus (macho de 3.9 kg) se inyectó I.V. con 7.8 mi de una solución que contiene 1.0 mg/ml de colesterol-siApoB y 7.5 mg/ml de DW1360 modificados con 7X . proporción por peso de 2:1 CDM-PEG: CDM-NAG, dando una dosis final de 2 mg/kg de colesterol-siApoB y 15 mg/kg de D 1360. Otro macaco Rhesus (macho de 4.5 kg) fue inyectado con glucosa isotónica y sirvió como un control.
Determinación de niveles de suero ApoB. Los niveles de proteína de suero ApoB fueron monitoreados durante el curso. Los primates fueron ayunados por 4 horas antes de la colección de suero. Los niveles de proteína de suero ApoB fueron determinados por métodos de ELISA sándwich estándares . En resumen, un anticuerpo de ApoB contra-ratón de cabra policlonal y un anticuerpo ApoB contra-ratón de conejo (Biodesign international) fueron utilizados como anticuerpos de captura y detección respectivamente. Un anticuerpo IgG anti-conejo de cabra conjugado de HRP (sigma) fue aplicado después de unir el complejo ApoB/anticuerpo . La absorbencia del desarrollo colorimétrico de tetrametil-bencidina (TMB, sigma) después fue medida por un lector de microplacas de Tecan Safire2 (Austria, Europa) a 450 nm. Los resultados se dan en la tabla 14. El macaco Rhesus que recibió el colesterol-siApoB ARNsi mostró una disminución de los niveles de suero ApoB en un cierto plazo, alcanzando una precipitación máxima de 76% el día 15 después de la inyección comparada con los niveles de la pre-dosis del día 1. Los niveles de ApoB se recuperaron a los niveles cercanos a la pre-dosis del día 1 el día 50. No se observó ninguna disminución de niveles del suero ApoB del animal de control. Tabla 14. Niveles de suero de ApoB normalizados al día 1.
Ejemplo 10. Reducción simultánea de dos genes. La co-administración de conjugados A Nsi-colesterol a dos genes independientes, apoB y factores VII, y el polímero de liberación de DW1360 . enmascarado resultó en inhibición simultánea de ambos genes. La composición fue administrada a ratones como se describió anteriormente. (Tabla 15).
Tabla 15. Reducción simultánea de 2 genes dirigidos in vivo después de la inyección de dos diferentes conjugados de ARNsi-hidrófobo más 400 de polímero de liberación D 1360. a Porcentaje de reducción en relación al grupo de control (n=3) inyectado con una solución de glucosa isotónica.
Evaluación de la toxicidad Ejemplo 11. Toxicidad. La toxicidad potencial del sistema de liberación fue valorada midiendo niveles de suero de las enzimas de hígado y citocinas. Elevaciones ligeras de los niveles de ALT y AST fueron detectadas en ratones que recibieron conjugados de ARNsi o ARNsi apoB-1 de control cuando se compara con ratones tratados con solución salina 48 horas después de la inyección. Sin embargo, los niveles incrementados no fueron significativos (p<0.05), y la ex.aminación histológica de las secciones de hígado no reveló muestras de toxicidad del hígado. De manera similar, el análisis de TNF- y niveles IL-6 en suero utilizando ELISA reveló que ambos fueron elevados ligeramente 6 horas después de la inyección de conjugado de ARNsi de polímero. Los niveles de ambos volvieron a la línea base por 48 horas. No se midió ninguna toxicidad estadísticamente significativa en la dosis efectiva mínima en ratones o ratas. Estos resultados indican que el sistema de liberación dirigido fue bien tolerado .
Ejemplo 12. Los ARNsis tenían las siguientes secuencias: apoB ARNsi: sentido 5 ' GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA 3' (SEQ ID 1) antisentido 5 ' uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsü 3' (SEQ ID 2) factor VII ARNsi: sentido 5 ' GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTdT (SEQ ID 3) antisentido 5 ' GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT3 ' (SEQ ID 4) letra pequeña = sustitución 2 ' -0-CH3 s = enlace de fosforotioato nucleótido después de f = substitución 2'-F nucleótido antes de d = 2'-deoxi Ejemplo 13. Síntesis del agrupamiento de GalNAc .
A. Bencil éster del ácido {2- [2- (2-hidroxi-etoxi) -etoxi] -etoxi} -acético 2- [2- (2-Hidroxi-etoxi) -etoxi] -etanol (62.2 g, 414 mmol) fue disuelto bajo argón en 875 mi de DMF abs . y enfriado a 0°C. Se agregó cuidadosamente NaH (12.1 g, 277 mmol, 55% en aceite mineral) , el baño de hielo fue retirado cuidadosamente, y la agitación continuó por l hora a 80°C. La mezcla de reacción fue enfriada a temperatura ambiente y tratada con ácido bromoacético (18.98 g, 137 mmol) que fue agregado vía embudo de decantación como una solución de DMF (20 mi). Después de .30 min. adicionales a 75°C, se agregó bromometil-benceno (23.36 g, 137 mmol) directo y se permitió que la esterificación procediera por 30 min. Enfriar, vertiendo cuidadosamente sobre . hielo triturado, extracción con acetato de etilo, lavado con agua, secando con Na2S04, y la evaporación de todos los solventes seguidos por cromatografía flash (SÍQ2, acetato de etilo/heptano = 8/2) produjo 6.41 g del qompuesto del título como unaceite amarillo. MS (ISP) : 299.2 [M+H] + .
B. (3aR, 5R, 6R, 7R, 7aR) -6-acetoxi-5-acetoximetil-2-metil-5, 6, 7, 7a-tetrahidro-3aH-pirano [3, 2-d] oxazol-7-il éster del ácido acético (2S, 3R, 4R, 5R, 6R) -4 , 5-diacetoxi-6-acetoximetil-3- acetilamino-tetrahidro-pian-2-il éster del ácido acético disponible en el comercio (10.0 g, 26 mmol) fue disuelto en 116 ral de CH2C12 ABS . y tratado con triflato de trimetilsililo (14.27 g, 64 mmol). La reacción fue permitida proceder durante la noche a 45°C. Después de enfriarse a 0°C, se agregó trietilamina (4.88 mi, 35 mmol), la mezcla fue diluida con CH2C12 y lavada con solución de NaHC03 y agua. El secado con Na2S04 y la evaporación del solvente produjo 10.3 g del compuesto del título como un aceite pardusco , que fue utilizado sin purificación adicional para el paso siguiente. MS (ISP) : 330.0 [M+H] + .
C. Bencil éster del ácido (2- {2- [2- ( (2R, 3R, 4R, 5R, 6R) -4, 5-diacetoxi-6-acetoximetil -3-acetilamino-tetrahidro-piran-2-iloxi) -etoxi] -etoxi} -etoxi) -acético El (3aR, 5R, 6R, 7R, 7aR) -6-acetoxi-5-acetoximetil-2-metil-5 , 6 , 7 , 7a-tetrahidro-3aH-pirano [3 , 2-d] oxazol-7-il éster del ácido acético preparado arriba (10.3 g, 26 mmol) y bencil éster del ácido {2- [2- (2-hidroxi-etoxi) -etoxi] -etoxi} -acético (8.62 g, 29 mmol) fue mezclado en 520 mi de CH2C12 y tratado con 63 g de tamices moleculares de 4 angstrom. Después de 1 hora se agregó trimetilsilil triflato (6.13 g, 28 mmol). La mezcla de reacción fue agitada durante el fin de semana a temperatura ambiente. Se agregó trietilamina (5.21 mi, 37 mmol) , los tamices moleculares fueron filtrados, el filtrado diluido con CH2C12 y lavado con solución de NaHC03 y agua. El secado con Na2S04 y la evaporación del solvente seguido por cromatografía flash (Si02, acetato de etilo/AcOH/MeOH/agua = 60/3/3/2) produjo 15.7 g del compuesto del título como un aceite pardusco. MS (ISP) : 626.6 [M-H] " .
D. Ácido (2- {2- [2- ( (2R, 3R,4R, 5R, 6R) -4, 5-diacetoxi-6-acetoxi etil-3-acetilamino- tetrahidro-piran-2-iloxi) -etoxi) etoxi] -etoxi} -acético.
Bencil éster del ácido (2- {2- [2- ( (2R, 3R, 4R, 5R, 6R) -4 , 5-diacetoxi-6-acetoximetil-3-acetilamino-tetrahidro-piran-2-iloxi) -etoxi] -etoxi }etoxi) -acético preparado arriba (15.7 g, 25 mmol) fue disuelto en 525 mi de acetato de etilo e hidrogenado sobre 1.6 g de paladio/C (10%) bajo 1 atmósfera de H2 a temperatura ambiente por 3 horas. La filtración sobre celita y la evaporación del solvente, seguidos por cromatografía flash (Si02, CH2Cl2/MeOH = 80/20) dio 6.07 g del compuesto del título como goma pardusca. MS (ISP): 536.5 [M-H]".
E. Bencil éster del agrupa iento de GalNAc.
El ácido (2-{2- [2- ( (2R,3R,4R,5R,6R) -4 , 5 -diacetoxi- 6-acetoximetil-3-acetilamino-tetrahidro-piran-2-iloxi) -etoxi] -etoxi}etoxi) acético preparado arriba (2.820 g, 5.246 mmol) e hidrocloruro bencil éster del ácido (S) -6-amino-2- ( (S) -2 , 6-diamino-hexanoilamino) hexanoico (preparación ver abajo, 0.829 g, 1.749 mmol) fueron disueltos en una mezcla de 32 mi de CH2C12 y 3.2 mi de DMF, tratados sucesivamente con base de Hünig (2.096 mi, 12.25 mmol), l-hidroxi-7-azabenzotriazol (0.714 g, 5.248 mmol) e hidrocloruro de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (1.006 g, 5.248 mmol), agitados durante la noche a temperatura ambiente. Todos los volátiles fueron eliminados i.V., y la mezcla de reacción cruda purificada por HPLC preparatoria (38 coridas, los Gemini, 5Y, C18) para dar después de la liofilización 1.650 g del producto del título como un polvo blanco. MS (ISP) : 1945.8 [M+Na] + . NMR (600 MHz, D SO) .
F. Ácido libre del agrupa iento de GalNAc. (17S,20S)-1-( (2R, 3R, R, 5R, 6R) -3 -acetamido-4 , 5-diacetoxi-6-(acetoximetil) tetrahidro-2H-piran-2-iloxi) -20- (1-( (2R, 3R, 4R, 5R, 6R) -3 -acetamido-4 , 5-diacetoxi-6-(acetoximetiyl) tetrahidro-2H-piran-2-iloxi) -ll-oxo-3 ,6,9-trioxa-12-azahexadecan-16-il) -17- (2- (2- (2- (2-( (2R, 3R, 4R, 5R, 6R) -3 -acetamido-4 , 5-diacetoxi-6-(acetoximetil) etrahidro-2H-piran-2-iloxi) etoxi) etoxi) etoxi) cetamido) -11, 18-dioxo-3, 6 , 9-trioxa-12, 19-diazahenicosan-21-oico .
El bencil éster del agrupamiento de GalNAc preparado arriba (0.674 g, 0.350 mmo-1) fue disuelto en 50 mi de MeOH e hidrogenado sobre 0.065 g de paladio/C (10%) bajo 1 atmósfera de H2 a temperatura ambiente por 4 horas. La filtración sobre celita y la evaporación del solvente dejó 0.620 g del compuesto del título como espuma blanca. MS (ISP) : 1917.0 [M+2H]2+. MR (600 MHz, DMSO) .
Ejemplo 14. Hidrocloruro de bencil éster del ácido (S)-6- amino-2- ( (S) -2, 6-diamino-hexanoilamino) -hexanoico. El bloque de construcción necesario hidrocloruo de bencil éster del ácido (S) -6-amino-2- ( (S) -2, 6-diamino-hexanoilamino) -hexanoico fue sintetizado como sigue : A. Bencil éster del ácido (S) -6-tert-butoxicarbonilamino- 2- (9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino) -hexanoico. ácido (S) -6-tert-Butoxicarbonilamino-2- (9H-fluoren-9- ilmetoxicarbonilamino) -hexanoico (5.00 g, 10.67 mmol) y fenil- metanol (2.305 g, 21.34 mmol) fueron disueltos en 25 mi de CH2C12 y tratados sucesivamente con N-hidroxibenzotriazol (1.933 g, 11.74 mmol), hidrocloruro de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC, 2.250 g, 11.74 mmol), y etil-diisopropil-amina (2.137 mi, 12.49 mmol) . Después de agitar por 90 minutos, los volátiles fueron ¦ eliminados i.V. a temperatura ambiente, el residuo tomado en el acetato de etilo, lavado con agua, solución de HC1 y salmuera, secado con Na2S04, y evaporado. La mezcla cruda entonces fue disuelta en 20 mi de etanol, y el producto se precipitó agregando 10 mi de agua. La filtración y el secado produjeron 5.669 g del compuesto del título que fue recristalizado de etanol/hexano para dar 4.27 g de bencil éster puro. MS (ISP) : 559.2 [M+H]+.
B. Bencil éster del ácido (S) -2- ( (S) -2, 6-bis-ter-butoxicarbonilamino-hexanoilamino) -6-ter-butoxicarbonilamino-hexanóico.
El bencil éster del ácido (S) -6-ter-butoxicarbonilamino-2-(9H-fluoren-9-ilmetoxi-carbonilamino) -hexanóico (4.270 g, 7.643 mmol) preparado arriba fue disuelto en 15 mi de THF y tratado con 15 mi de dietilamina. Después de 4 horas a temperatura ambiente MS y TLC indicaron la ausencia del material de partida. La evaporación de los solventes y el secado azeotropico con tolueno produjo 4.02 g de la amina libre que fue utilizada directamente en el paso siguiente. Ácido (S) -2 , 6-bis-ter-butoxicarbonilamino-hexanoico disponible en el comercio (3.177 g, 9.17 mmol) fue disuelto en 13 mi de CH2C12 y tratado a 0°C con etil-diisopropil-amina (4.71 mi, 27.5 mmol), tetrafluoroborato de O- (1, 2-dihidro-2-oxo-piridil) - 1,1,3,3-tetrametiluronio (TPTU, 2.725 g, 9.172 mmol) y, 15 min. más adelante, con la amina preparada arriba como una solución en CH2C12 mínimo y 1.57 mi de etil-diisopropil-amina (1.2 eq.). La reacción fue permitida proceder por 2 horas a temperatura ambiente. Todos los volátiles fueron eliminados i.V., el residuo tomado en el acetato de etilo, lavado con solución de NaHC03, solución de H4C1 y agua, secado con Na2S04, y evaporado. La cromatografía flash (Si02, heptano/acetato de etilo = 4/6) seguida por la cristalización del heptano/cantidades mínimas de acetato de etilo produjo 4.516 g del compuesto del título como un sólido blanco. MS (ISP) : 665.4 [ +H]+.
C. Trihidrocloruro bencil éster del ácido (S) -S-amino-2- ( (S) -2, 6-dia ino-hexanoilamino) -hexanóico (S) -2 ( (S) -2, 6-bis-ter-butoxicarbonilamino-hexanoilamino) -6-ter-butoxicarbonilamino-hexanoico preparado anteriormente (4.516, 6.793 mmol) fue disuelto en 4 mol/L de HCl en dioxano. Después de un par de minutos, el gas se desarrolló y se formó un precipitado. Después de 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción fue evaporada cuidadosamente y secada escrupulosamente para producir 3.81 g del compuesto del título como una espuma blanca mate que fue utilizada sin purificación adicional por ejemplo 13. E. Bencil éster del agrupamiento de GalNAc arriba. MS (ISP) : 365.3 [M+H] + .
Ejemplo 15. Conjugados del agrupamiento de GalNAc-ARNsi .
A. Compuesto 1 (150 mg, 0.082 mmol) fue disuelto en metanol seco (5.5 mi) y 42 µ? de metilato de sodio fueron agregados (solución al 25% en MeOH) . La mezcla fue agitada bajo atmósfera de argón por 2 horas a RT. Una cantidad igual de metanol fue agregada así como porciones de un material de intercambio aniónico Amberlite IR- 120 para generar un pH de aproximadamente 7.0. El Amberlite fue eliminado por filtración. La solución fue secada con Na2S04 , y el solvente fue eliminado bajo presión reducida. El compuesto 2 fue obtenido en rendimiento cuantitativo como una espuma blanca. TLC (Si02, diclorometano (DCM) /MeOH 5:1 + 0.1% de CH3COOH) : Rf2 = 0.03; para detección de una solución de ácido sulfúrico (5%) en MeOH fue utilizada seguida por calentamiento. ESI-MS, inyección directa, modo negativo; [M-H] "Calculado: 1452.7; [ - H] 1 medido : 1452.5.
B. El compuesto 2 (20 mg, 0.014 mmol) fue co-evaporado con piridina y diclorometano. El residuo fue disuelto en DMF seco (0.9 mi) y una solución de N-Hidroxisuccinimida (NHS) en DMF (1.6 mg, 0.014 mmol) fue agregada mientras que se agitaba bajo atmósfera de argón. A 0°C se agregó lentamente una solución de ?,?' -Diciclohexilcarbodiimida (DCC) en DMF (3.2 mg, 0.016 mmol). La reacción fue permitida calentarse a RT y agitada durante la noche. El compuesto 3 fue utilizado sin purificación adicional para la conjugación al ARN.
C. Síntesis de ARN modificado con amina. El ARN equipado con el conector C-6-amino en el extremo 5 ' de la cadena con sentido fue producido por química de fosforamidita estándar en fase sólida en una escala de 1215 ymol usando un ÁKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Alemania) y vidrio de poro controlado como soporte sólido. ARN que contiene nucleótidos 2'-0-metilo fue generado empleando las fosforamiditas correspondientes, fosforatniditas de 2'-0-metilo y amidita del conector de TFA-hexilamino. La escisión y desprotección así como la purificación fueron logradas por los métodos conocidos en el campo (Wincott F. , et al, NAR 1995, 23, 14, 2677-84) .
El ARN modificado con amina fue caracterizado por HPLC de intercambio anionico (pureza: 96.1%) y la identidad fueron confirmados por ESI-MS ( [ +H] 1+calcuiada : 6937.4; [M+H] 1+medida: 6939.0.
Secuencia: 5' - ( H2C¾)GGAAUCiuAuAuuuGAUCcAsA-3' ;u,c: nucleótidos 2'-0-metilo de las bases correspondientes, s: fosforotioato .
D. Conjugación del agrupamiento de GalNAc al ARN. El ARN (2.54 µp?1) equipado con un conector de amina C6 en el extremo 5' fue liofilizado y disuelto en 250µ1 de solución amortiguadora de borato de sodio (0.1 mol/L de borato de sodio, pH 8.5, 0.1 mol/L KCl) y 1.1 mi de DMSO. Después de la adición de 8 µ? de N, -Diisopropiletilamina (DIPEA) , una solución del compuesto 3 (teóricamente 0.014 mmol) en DMF fue agregada lentamente bajo agitación continua a la solución de ARN. La mezcla de reacción fue agitada a 35 °C durante la noche. La reacción fue monitoreada usando RP-HPLC (Recurso RPC 3 mi, solución amortiguadora: A: 100 mM de acetato de trietilamonio (TEAA, 2.0 M, pH 7.0) en agua, B: 100 mm de TEAA en acetonitrilo al 95%, gradiente: 5% de B hasta 22% de B en 20 CV) . Después de la precipitación de ARN usando el acetato de sodio (3M) en EtOH a -20°C, el conjugado de ARN fue purificado usando las condiciones descritas arriba. Las fracciones puras fueron reunidas, y el conjugado deseado 4 fue precipitado usando acetato de sodio/EtOH para dar el conjugado de ARN puro. El conjugado 4 se ha aislado en rendimiento de 59% (1.50 µp???) . La pureza del conjugado 4 fue analizada por HPLC de intercambio aniónico (pureza: 85.5%) y la identidad fueron confirmadas por ESI-MS ( [M+H] 1+Caicuiado : 8374.4; [M+H] 1+raedido : 8376.0.
E. El conjugado 4 (cadena con sentido) fue alineado con una cadena antisentido modificada de 2 ' -O-metilo.
Secuencia: 5 ' -uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU-3 ' (SEC ID 2). El conjugado de ARNsi dirigido contra el ARNm de la apolipoproteína B fue generada mezclando una solución equimolar de cadenas complementarias en la solución amortiguadora de hibridación (20 mM de fosfato de sodio, pH 6.8; 100 mM de cloruro de sodio) , calentada en un baño de agua a 85-90°C por 3 minutos, y enfriada a RT durante 3-4 horas. La formación d plex fue confirmada por electroforesis de gel nativo.
Ejemplo 16. Conjugados del grupo hidrofóbico-ARNsi.
(NHSC10) GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT i Amina (Amina) GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT La síntesis de ARN fue realizada en fase sólida por química de fosforamidita convencional en un ÁKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Alemania) y vidrio de poro controlado (CPG) como soporte sólido.
La cadena con sentido modificada de éster 5'-C10-NHS, (NHSC10) GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfC-fUfUfACfdTsdT (SE ID 3) fue preparada empleando Modificador 5'-Carboxi CIO amidita de Glen Research (Virginia, USA) . El AR activado, todavía unido al soporte sólido fue utilizado para la conjugación con las aminas lipofílicas enumeradas en la tabla abajo. Cf y Uf son 2 ' -fluoronucleótidos de las bases correspondientes y s es un enlace de fosforotioato .
Secuencia de cadena con sentido: 5'- (COC9)GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT-3' (SEC ID 3) Secuencia de cadena antisentido: 5'-GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT-3 ' SEQ" (SEC ID 4) 100 mg de la cadena con sentido CPG (carga de 60 µ???/g, 0.6 µp??? de ARN) fueron mezclados con 0.25 mmol de la amina correspondiente obtenida de, de Sigma Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Alemania) o Fluka (Sigma Aldrich, Buchs, Suiza) .
Tabla 16. Aminas lipofílicas usadas en la formación onjugados de grupo hidrofóbico-AR si La mezcla fue sacudida por 18 horas a 40°C. El ARN fue escinido del soporte sólido y desprotegido con una solución acuosa de hidróxido de amonio (NH3, 33%) a 45°C durante la noche. El grupo de protección 2' fue removido con TEAx3HF a 65°C por 3.5 horas. Los oligoribonucleótidos crudos fueron purificados por RP-HPLC (recurso RPC 3 mi, solución amortiguadora: A: 100 mM de TEAA en agua, B: 100 mM de TEAA en CH3CN al 95%, gradiente: de 3% de B hasta 70% de B en 15 CV, excepto Nr 7: gradiente de 3% de B a 100% de B en 15CV) .
Tabla 17.. Conjugados de grupo hidrofóbico-ARN, caracterizados por RP-HPLC y ESI-MS (modo negativo) .
Para generar el AR si de la cadena solo de ARN, las cantidades equimolares de cadenas con sentido y antisentido complementarias fueron mezcladas en la solución amortiguadora de hibridación (20 mM de fosfato de sodio, pH 6.8; 100 mM de cloruro de sodio) , calentado a 80°C por 3 minutos, y enfriado a RT durante 3-4 horas. El ARNsi, que está dirigido contra ARNm del factor VII fue caracterizado por electroforesis de gel .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Una composición para liberar un oligonucleótido a una célula hepática in vivo caracterizada porque comprende: a) un oligonucleótido covalentemente ligado a un grupo hidrofóbico que tiene por lo menos 20 átomos de carbono; y, b) un polímero amfifático dirigido y reversiblemente enmascarado que comprende un terpolímero enmascarado de los monómeros que contienen amina, monómeros que contienen un grupo hidrofóbico inferior, y monómeros que contienen un grupo hidrofóbico superior a los cuales una pluralidad de derivados de galactosa y grupos de PEG están ligados individualmente al polímero por medio de enlaces maleámicos disustituidos lábiles a pH y en donde la escisión de los enlaces maleámicos disustituidos lábiles a pH producen grupos amina de este modo generando una poliamina de membrana activa .
2. Un sistema de liberación conjugado para liberar un Polinucleótido de ARN de interferencia a una célula hepática in vivo caracterizado porque comprende: N-A + en donde, P es una poliamina de membrana activa L2 es un enlace lábil a pH, M1 es un agente de enmascaramiento de carga neutra que contiene un derivado de galactosa M2 es un agente de enmascaramiento de carga neutra que contiene un polietilen glicol, Y y z son enteros mayores que 1 en donde el valor de y y z junto es mayor que 50 % en aminas de P, N es un polinucleotido de ARN de interferencia, A es un trímero de galactosa o un grupo hidrofóbico que tiene por lo menos 20 átomos de carbono, la carga positiva de P es neutralizada y la actividad de membrana de P es reversiblemente inhibida por la modificación de más de 50 % de aminas P por el acoplamiento de M1 y M2 a través de los enlaces fisiológicamente lábiles a pH L2, y escisión de L2 en respuesta a una disminución de pH restablece aminas y actividad de membrana de P.
3. Un método de fabricar una composición de liberación de oligonucleótido de ARN caracterizado porque comprende: a) formar un polímero de membrana activa b) formar un primer agente de enmascaramiento que comprende un anhídrido maleico disustituido de carga neutra que contiene un derivado de galactosa; c) formar un segundo agente de enmascaramiento que comprende un anhídrido maleico disustituido de carga neutra • que contiene un polietilen glicol; d) inhibir reversiblemente la actividad de la membrana de la poliamina. de membrana activa en donde la inhibición 5 consiste de modificar 50% o más de las aminas en la poliamina mediante la reacción de poliamina con el primero y segundo agentes de enmascaramiento de este modo uniendo una pluralidad de derivados de galactosa y una pluralidad de polietilen glicoles al polímero de membrana activa por medio 0 de enlaces de maleamato disustituidos fisiológicamente lábiles al pH; y, e) unir el Poliriucleótido de ARN de interferencia a trímero de galactosa o a un grupo hidrofóbico que tiene por lo menos 20 átomos de carbono; 5 f) proporcionar el polinucleótido de ARN de interferencia y la poliamina de membrana activa inhibida reversiblemente en solución apropiada para administración in vivo.
4. La composición de conformidad con la reivindicación 0 2, caracterizada porque el polinucleótido de ARN de interferencia es seleccionado del grupo que consiste de: ADN, ARN, ARNds, polinucleótido de interferencia de ARN, ARNsi, y ARNmi .
5. La composición de conformidad la reivindicación 2, 5 caracterizada porque el polímero de membrana activa contiene dos o más monómeros diferentes.
6. La ' composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el polímero de membrana activa está compuesto de monómeros que contienen amina, y un grupo que contiene monómeros.
7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la poliamina de membrana, activa enmascarada reversiblemente es soluble en agua.
8. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la poliamina de membrana activa es un copolímero aleatorio.
9. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque los agentes de enmascaramiento están ligados reversiblemente a por lo menos 70% de las aminas en la poliamina.
10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque los agentes de enmascaramiento están ligados reversiblemente a por lo menos 80% de las aminas en la poliamina.
11. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el polímero de reversibilidad modificada tiene un potencial zeta entre 0 y -20 mV en pH 8.
12. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque es suministrada en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque L2 es un enlace de maleamato disustituido.
• 14. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque N está ligado a A por medio de un enlace fisiológicamente lábil L1.
15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque L1 es un enlace covalente fisiológicamente lábil que es ortogonal a L2.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque A contiene un grupo hidrofóbico que tiene 20 o más átomos de carbono.
17. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque A contiene un trímero de galactosa.
18. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la relación de derivado de galactosa con respecto a PEG ligado al polímero es 1 a 0.5-2.
19. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el derivado de galactosa consiste de una N-acetilgalactosamina .
20. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el trímero de galactosa consiste de un trímero de N-acetilgalactosamina.
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