CN111511914B - 减少PAPD5和PAPD7 mRNA的核酸分子用于治疗乙型肝炎感染 - Google Patents

减少PAPD5和PAPD7 mRNA的核酸分子用于治疗乙型肝炎感染 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与PAP相关结构域5(PAPD5)和PAP相关结构域7(PAPD7)互补的核酸分子，当使用单个核酸分子时导致抑制PAPD5和PAPD7两者的表达。本发明还提供PAPD5和PAPD7特异性核酸分子用于治疗和/或预防HBV感染，尤其是慢性HBV感染。本发明还包括用于治疗和/或预防HBV感染的药物组合物。

Description

减少PAPD5和PAPD7 mRNA的核酸分子用于治疗乙型肝炎感染
发明领域
本发明涉及与PAP相关结构域5(PAP associated domain containing5，PAPD5)和PAP相关结构域7(PAP associated domain containing 7，PAPD7)两者互补的核酸分子，当使用单个寡聚核苷酸时导致抑制PAPD5和PAPD7两者的表达。本发明还提供了PAPD5和PAPD7特异性核酸分子用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染(尤其是慢性HBV感染)。本发明还包括用于治疗和/或预防HBV感染的药物组合物。
发明背景
HBV感染仍然是世界范围内的主要健康问题，其涉及估计3.5亿慢性携带者。大约25％的携带者死于慢性肝炎、肝硬化或肝癌。乙型肝炎病毒是仅次于烟草的第二大致癌物质，导致60％至80％的原发性肝癌。HBV的传染性比艾滋病病毒(HIV)高100倍。
乙型肝炎病毒(HBV)是包膜的、部分双链的DNA病毒。紧凑的3.2kb HBV基因组由四个重叠的开放阅读框(ORF)组成，其编码核心、聚合酶(Pol)、包膜和X蛋白。Pol ORF最长，包膜ORF位于其中，而X和核心ORF与Pol ORF重叠。HBV的生命周期具有两个主要事件：1)从松弛环状(RC DNA)生成闭合环状DNA(cccDNA)，和2)前基因组RNA(pgRNA)逆转录产生RC DNA。在宿主细胞感染之前，HBV基因组作为RC DNA存在于病毒体(virion)内。已经确定HBV病毒体(virion)能够通过非特异性结合存在于人肝细胞表面上的带负电荷的蛋白聚糖(Schulze,Hepatology,46,(2007),1759-68)以及通过HBV表面抗原(HBsAg)与肝细胞钠-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)受体的特异性结合(Yan,J Virol,87,(2013),7977-91)而进入宿主细胞。所有HBV病毒mRNA均被加帽和多腺苷酸化，然后被输出到细胞质中进行翻译。在细胞质中，新病毒体的组装被启动，新生pgRNA被病毒Pol包裹，由此pgRNA可以开始通过单链DNA中间体被逆转录为RC DNA。
肝细胞和/或肝内免疫细胞响应HBV感染而分泌的抗病毒细胞因子在受感染肝脏的病毒清除中起重要作用。然而，由于病毒采取多种逃逸策略来抵抗宿主细胞识别***和随后的抗病毒应答，慢性感染的患者仅显示出弱的免疫应答。
许多观察表明，几种HBV病毒蛋白可以通过干扰病毒识别信号***和随后的干扰素(IFN)抗病毒活性来抵抗最初的宿主细胞应答。其中，HBV空亚病毒颗粒(SVP,HBsAg)的过度分泌被认为参与维持慢性感染患者(CHB)中观察到的免疫耐受状态。持续暴露于HBsAg和其他病毒抗原可导致HBV-特异性T-细胞缺失或进行性功能损伤(Kondo,Journal ofImmunology(1993),150,4659–4671；Kondo,Journal of Medical Virology(2004),74,425–433；Fisicaro,Gastroenterology,(2010),138,682-93)。此外，据报道HBsAg通过直接相互作用抑制免疫细胞如单核细胞、树突细胞(DC)和自然杀伤(NK)细胞的功能(Op denBrouw,Immunology,(2009b),126,280-9；Woltman,PLoS One,(2011),6,e15324；Shi,JViral Hepat.(2012),19,e26-33；Kondo,ISRN Gasteroenterology,(2013),Article ID935295)。
HBsAg定量是慢性乙型肝炎预后和治疗反应的重要生物标志物。然而，在慢性感染患者中很少观察到HBsAg减少和血清转换的实现，但这仍然是治疗的最终目标之一。目前的疗法如核苷(酸)类似物是抑制HBV DNA合成但不针对降低HBsAg水平的分子。即使长期使用核苷(酸)类似物治疗，也只表现出与天然观察到的HBsAg清除相当的弱的HBsAg清除(在-1％-2％之间)(Janssen,Lancet,(2005),365,123-9；Marcellin,N.Engl.J.Med.,(2004),351,1206-17；Buster,Hepatology,(2007),46,388-94)。最近的研究显示全部或部分整合的乙型肝炎病毒DNA是慢性感染个体中HbsAg表达的来源(参见Wooddell等2017Sci.Transl.Med.第9卷,第409期,eaan0241)。
乙型肝炎e抗原(也称为HBV包膜抗原或HBeAg)是由乙型肝炎感染的细胞分泌的病毒蛋白。HBeAg与慢性乙型肝炎感染有关，并被用作活动性病毒性疾病和患者传染程度的标志物。
乙型肝炎病毒前核心或HBeAg的功能尚不完全清楚。然而，众所周知，HBeAg在病毒持续感染中起关键作用。HBeAg被认为通过作为免疫调节蛋白发挥功能来促进HBV慢性化。特别地，HBeAg是分泌的辅助蛋白，其看起来可以减弱宿主对细胞内核衣壳蛋白的免疫应答(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。HBeAg作为促进HBV持续感染的免疫耐受原发挥作用，并且考虑到可溶性HBeAg穿过胎盘，其可能在子宫内发挥功能(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。此外，HBeAg下调：i)控制细胞内信号传导的细胞基因；和ii)Toll-样受体2(TLR-2)，以抑制对病毒感染的先天免疫应答(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。在没有HBeAg的情况下，HBV复制与TLR2通路的上调相关(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。因此，HBeAg在调节病毒/宿主相互作用以影响宿主免疫应答中具有显著作用(Walsh,Virology,2011,411(1):132-141)。因此，降低HBeAg阳性患者群中的HBeAg可导致HBV特异性免疫功能障碍的逆转(Milich,1997,J.Viral.Hep.4:48–59；Milich,1998,J.Immunol.160:2013–2021)。此外，分泌的HBeAg在引发T-细胞耐受方面比细胞内肝炎核心抗原(HBcAg)显著更有效，HBeAg和HBcAg之间分开的T细胞耐受以及HBc/HBeAg特异性T-细胞耐受的克隆异质性可能对天然HBV感染、特别是对于前核心阴性慢性肝炎具有重要意义(Chen,2005,Journal of Virology,79:3016-3027)。
因此，与单独抑制HBsAg的分泌相比，降低HBeAg以及HBsAg的分泌将导致改善对慢性HBV感染发展的抑制。此外，已报道在HBeAg阳性母亲的母胎和新生儿HBV传播病例中，急性感染转变为慢性的比例最高(>80％)(Liaw,Lancet,2009,373:582-592；Liaw,Dig.Dis.Sci.,2010,55:2727-2734；and Hadziyannis,2011,Journal of hepatology,55:183-191)。因此，降低孕妇的HBeAg不仅可以降低患者的传染性程度，还可以抑制其孩子的慢性HBV感染的发展。
因此，在HBV治疗中，存在抑制病毒表达、特别是抑制HBsAg和HBeAg分泌的未被满足的医疗需求(Wieland,S.F.&F.V.Chisari.J Virol,(2005),79,9369-80；Kumar等人,JVirol,(2011),85,987-95；Woltman等人,PLoS One,(2011),6,e15324；Op den Brouw等人,Immunology,(2009b),126,280-9)。
在WO 2017/066712中，描述了与端粒疾病的治疗和诊断相关的PAPD5的下调。已经描述了用于该目的的五种shRNA结构。
PCT/EP2017/064980公开了以核酸分子以及该分子的组合，靶向PAPD5或PAPD7来治疗HBV感染。
发明目的
本发明鉴定了能够抑制PAPD5和PAPD7两者在体内和体外表达的新型核酸分子。用单个分子抑制两个靶核酸的能力，在生产、靶细胞输送的简单性、药代动力学/药效动力学(PK/PD)的简单性、和实现治疗益处所需的浓度方面，具有明显优势。此外，本发明表明，PAPD5和PAPD7的敲低(knock down)与HBV抗原抑制(如HBsAg抑制)之间存在相关性。
附图简述
图1：描述了示例性反义寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸表示为波浪线(A-D)或“寡核苷酸”(E-H)或T2(I)，脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺部分。化合物A至D包括双-赖氨酸分支分子、PEG3间隔子和三个末端GalNAc碳水化合物部分。在化合物A和B中，寡核苷酸在没有接头的情况下直接连接到脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合物部分。在化合物C和D中，寡核苷酸通过C6接头连接到脱唾液酸糖蛋白受体靶向缀合物部分。化合物E-I包含商购可得的三分支分子(trebler brancher molecule)、不同长度和结构的间隔子和三个末端GalNAc碳水化合物部分。
图2：三价GalNAc簇(GN2)的结构式。GN2在本发明中用作缀合物部分。波浪线表明簇中与例如C6氨基接头或直接与寡核苷酸缀合的位点。
图3：显示了实施例1中Hela细胞中PAPD5和PAPD7敲低与实施例2中dHepRG细胞中HBsAg减少之间的相关性。
图4：CMP ID NO:20_12的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图5：CMP ID NO:20_13的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图6：CMP ID NO:20_14的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图7：CMP ID NO:20_15的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图8：CMP ID NO:20_18的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图9：CMP ID NO:20_36的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图10：CMP ID NO:20_30的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图11：呈现在人HeLa细胞系(A)和原代小鼠肝细胞(PMH,B)中以寡核苷酸靶向人和小鼠转录本(表5)实现的体外PAPD5和PAPD7减少。
图12：CMP ID NO:20_20的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图13：CMP ID NO:20_21的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图14：CMP ID NO:21_2的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图15：CMP ID NO:20_22的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图16：CMP ID NO:21_33的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图17：CMP ID NO:21_34的结构式。其药用盐包括与该化合物结合的单价或二价阳离子(如Na+、K+和Ca2+)或其混合物。
图18：以10毫克/千克的两种寡核苷酸(一种靶向PAPD5，一种靶向PAPD7)单次处理后，体内在AAV/HBV小鼠模型中随时间对HBsAg和HBeAg的影响。
发明概述
定义
核酸分子
如本领域技术人员通常理解的，本文所用的术语“核酸分子”或“治疗性核酸分子”定义为包含两个或更多个共价连接的核苷(即核苷酸序列)的分子。本发明方法中提到的核酸分子通常是长度低于50个核苷酸的治疗性寡核苷酸。核酸分子可以是或包含反义寡核苷酸，或可以是其它寡聚核酸分子，如CRISPR RNA、siRNA、shRNA、适体(aptamer)或核酶。核酸分子是通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化制备的组合物。当提及核酸分子的序列时，述及共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分的序列或顺序、或其修饰。本发明的核酸分子是人工的、化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的核酸分子可包含一种或多种修饰的核苷或核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含或由长度为12至50个核苷酸组成，如长度为13至40、如14至35、如15至30、如16至22、如16至18或15至17个连续核苷酸。
在一些实施方案中，核酸分子或其连续核苷酸序列包含或由22个或更少核苷酸、如20个或更少核苷酸、如18个或更少核苷酸、如14、15、16或17个核苷酸组成。应理解，本文给出的任何范围包括范围端点。因此，如果说核酸分子包含10至30个核苷酸，则包括10和30个核苷酸。
在一些实施方案中，连续核苷酸序列包含或由长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个连续核苷酸组成。
核酸分子(一个或多个)用于调节哺乳动物中靶核酸的表达。在一些实施方案中，核酸分子，如siRNA、shRNA和反义寡核苷酸，通常用于抑制靶核酸(一个或多个)的表达。
在本发明的一个实施方案中，核酸分子选自RNAi剂，如siRNA、shRNA。在另一个实施方案中，核酸分子是单链反义寡核苷酸，如高亲和力修饰的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，核酸分子是硫代磷酸酯核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含硫代磷酸酯核苷间连接。
在一些实施方案中，核酸分子可以与非核苷部分(缀合部分)缀合。
核酸分子文库应理解为变体核酸分子的集合。核酸分子文库的目的可以不同。在一些实施方案中，核酸分子文库由具有靶向PAPD5和PAPD7靶核酸之间共有区域的重叠核碱基序列的寡核苷酸组成，目的是鉴定核酸分子文库中最有效的序列。在一些实施方案中，核酸分子文库是亲本或祖先核酸分子的核酸分子设计变体(子核酸分子)的文库，其中核酸分子设计变体保留了亲本核酸分子的核心核碱基序列。
寡核苷酸
如本领域技术人员通常理解的，本文所用的术语“寡核苷酸”定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这种共价结合的核苷也可称为核酸分子或寡聚体。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化制备。当提及寡核苷酸的序列时，述及共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分的序列或顺序、或其修饰。本发明的寡核苷酸是人工的、化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸杂交，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。术语单链是本领域技术人员通常理解的。特别是，应理解，本发明的单链寡核苷酸能够形成发夹或分子间双链体结构(两个相同寡核苷酸分子之间的双链体)，只要分子内或分子间的自互补程度跨寡核苷酸的全长低于50％即可。
在本发明的一个实施方案中，反义寡核苷酸是招募RNaseH的寡核苷酸。与RNAi分子相反，反义寡核苷酸也在细胞的细胞核中起作用。为了靶向前mRNA序列，优选反义寡核苷酸，因为其在细胞的细胞核中起作用。
RNAi
本文中，术语“RNA干扰(RNAi)分子”是指短双链RNA分子，其能够在细胞的细胞质中通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)引起RNA依赖的基因沉默，在细胞质中这些短双链RNA分子与催化性RISC组分argonaute相互作用。一类RNAi分子是小干扰RNA(siRNA)，它是双链RNA分子，通过在转录后结合互补mRNA导致其降解和翻译损失。小发夹RNA(shRNA)是具有发夹结构的人工RNA分子，在表达后能够通过DICER和RNA诱导的沉默复合物(RISC)来减少mRNA。可以在感兴趣基因的RNA序列的基础上设计RNAi分子。然后可以化学合成或通过体外转录合成相应的RNAi，或者从载体或PCR产物表达RNAi。
siRNA和shRNA分子的长度通常在20到50个核苷酸之间，如长度在25到35个核苷酸之间，并且与被称为Dicer的内切核酸酶相互作用，所述Dicer被认为将dsRNA加工成具有特征性两碱基3’突出端的19-23碱基对短干扰RNA，然后并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。US8,349,809和US 8,513,207(通过引用并入本文中)描述了Dicer底物的有效延伸形式。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一个或多个内切核酸酶切割靶标以诱导沉默。可以使用修饰的核苷酸间连接和高亲和力核苷(如2’-4’双环核糖修饰的核苷，包括LNA和cET)化学修饰RNAi剂。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区。该术语在本文中可与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，并且可任选地包含其他核苷酸，例如可用于将官能团连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区。核苷酸接头区可以与靶核酸互补或不互补。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的构建单元，并且出于本发明的目的，核苷酸包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸，如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可互换地称为“单元”或“单体”。
修饰的核苷
如本文所用的术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比通过引入一个或多个糖部分或(核)碱基部分的修饰而修饰的核苷。在优选的实施方案中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”在本文中也可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区中具有修饰的核苷仍然通常被称为DNA或RNA，如果它们允许Watson Crick碱基配对的话。
修饰的核苷间连接(modified internucleoside linkage)
如本领域技术人员通常理解的，术语“修饰的核苷间连接”定义为不同于磷酸二酯(PO)键的连接，其将两个核苷共价偶联在一起。具有修饰的核苷间连接的核苷酸也称为“修饰的核苷酸”。在一些实施方案中，与磷酸二酯键相比，修饰的核苷间连接增加本发明核酸分子的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间连接包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间连接特别适用于稳定寡核苷酸以及siRNA用于体内使用，并且可用于防止本发明的寡核苷酸或siRNA中的DNA或RNA核苷区域处，例如在gapmer寡核苷酸的gap区中、以及在修饰核苷的区域中，的核酸酶切割。
在一个实施方案中，核酸分子(例如，反义寡核苷酸、shRNA或siRNA)包含一个或多个从天然磷酸二酯修饰的核苷间连接，例如其为对核酸酶攻击更具抗性的连接。可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定法(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来测定核酸酶抗性，两者都是本领域公知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间连接是指核酸酶抗性核苷间连接。在一些实施方案中，在反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间连接被修饰，例如在寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少60％、如至少70％、如至少80％或如至少90％的核苷间连接被修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的所有核苷间连接都被修饰。在一些实施方案中，将认识到，将本发明的寡核苷酸连接到非核苷酸官能团(如缀合物)的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间连接是核酸酶抗性的核苷间连接。
修饰的核苷间连接可选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯。在一些实施方案中，修饰的核苷间连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯)与本发明寡核苷酸的RNaseH招募相容。
在一些实施方案中，核苷间连接包含硫(S)，如硫代磷酸酯核苷间连接。
由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造，硫代磷酸酯核苷间连接特别有用。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间连接是硫代磷酸酯，例如寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少60％、如至少70％、如至少75％、如至少80％或如至少90％的核苷间连接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间连接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，至少一个硫代磷酸酯核苷间连接是立体限定的(stereodefined)，例如寡核苷酸中核苷间连接的至少20％、30％、40％、50％、60％、如至少70％、如至少75％、如至少80％或如至少90％的核苷间连接是立体限定的。立体限定的硫代磷酸酯键的合成例如描述于WO2014/012081和WO2016/079181中。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个中性核苷间连接，特别是选自磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛(formacetal)或硫代甲缩醛(thioformacetal)的核苷间连接。
其它核苷间连接在WO2009/124238中公开(通过引用并入本文)。在一个实施方案中，核苷间连接选自WO2007/031091(通过引用并入本文)中公开的接头。特别地，核苷间连接可以选自-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、0-PO(OCH3)-0-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-，和/或核苷间接头可选自：-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4-烷基。
核酸酶抗性连接(如硫代磷酸酯键)特别可以用于在与靶核酸形成双链体时能够招募核酸酶的反义寡核苷酸区，如gapmer的G区，或者头聚体(headmer)和尾聚体(tailmer)的未修饰的核苷区。然而，硫代磷酸酯键也有用于非核酸酶招募区和/或亲和力增强区，如gapmer的F和F’区，或者头聚体和尾聚体的修饰的核苷区。
然而，每个设计区可以包含不同于硫代磷酸酯的核苷间连接，如磷酸二酯键，特别是在其中修饰的核苷(如LNA)防止所述连接被核酸酶降解的区域。包含磷酸二酯键(如一个或两个键)，特别是在修饰的核苷单元之间或附近(通常在非核酸酶招募区中)包含磷酸二酯键，可以改变寡核苷酸的生物利用度和/或生物分布-参见WO2008/113832，通过参考将其并入本文。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯和/或硼烷磷酸酯键。优选地，寡核苷酸中的所有核苷间连接都是硫代磷酸酯键。
立体随机的(stereorandom)硫代磷酸酯键
硫代磷酸酯连接是核苷间磷酸酯键，其中一个非桥键氧被硫替代。一个非桥键氧被硫替换将引入一个手性中心，因此在单个硫代磷酸酯寡核苷酸中，每个硫代磷酸酯核苷间连接都将是S(Sp)或R(Rp)立体异构型。这种核苷间连接被称为“手性核苷间连接”。相比之下，磷酸二酯核苷间连接是非手性的，因为它们有两个非末端氧原子。
立体中心的手性的指定按照标准的Cahn-Ingold-Prelog规则(CIP顺序规则)确定，该规则最先发布在Cahn,R.S.；Ingold,C.K.；Prelog,V.(1966)."Specification ofMolecular Chirality".Angewandte Chemie国际版.5(4):385–415.doi:10.1002/anie.196603851中。
在标准的寡核苷酸合成过程中，偶联及随后的硫化的立体选择性不被控制。为此，每个硫代磷酸酯核苷间连接在立体化学上都随机是Sp或Rp，因此，通过传统寡核苷酸合成产生的硫代磷酸酯寡核苷酸实际上可以存在多达2X个不同的硫代磷酸酯非对映异构体，其中X是硫代磷酸酯核苷间连接的数目。这种寡核苷酸在本文被称为立体随机的硫代磷酸酯寡核苷酸，其不含有任何立体限定的核苷间连接。因此，立体随机的硫代磷酸酯寡核苷酸是源自非立体限定合成的各单个非对映异构体的混合物。在这种情况下，该混合物被定义为多达2X个不同的硫代磷酸酯非对映异构体。
立体限定的(stereodefined)核苷间连接
立体限定的核苷间连接是在寡核苷酸中引入手性中心的核苷间连接，在一群单寡核苷酸分子中其主要以一种立体异构形式(即R或S)存在。
应认识到，本领域使用的立体选择性寡核苷酸合成方法通常在每个核苷间连接立体中心提供至少约90％或至少约95％的立体选择性，因此多达约10％、如约5％的寡核苷酸分子可能具有替代的立体异构形式。
在一些实施方案中，每个立体限定硫代磷酸酯立体中心的立体选择性为至少约90％。在一些实施方案中，每个立体限定硫代磷酸酯立体中心的立体选择性为至少约95％。
立体限定的硫代磷酸酯键
立体限定的硫代磷酸酯键是在一群单寡核苷酸分子中以Rp或Sp构型化学合成的硫代磷酸酯键，因此在每个立体中心具有至少约90％或至少约95％的立体选择性(Rp或Sp)，并因此不超过约10％、如约5％的寡核苷酸分子可能具有替代的立体异构形式。
硫代磷酸酯核苷间连接的立体构型如下
其中3’R基团表示相邻核苷(5’核苷)的3’位置，5’R基团表示相邻核苷(3’核苷)的5’位置。
在本文中，Rp核苷间连接也可以表示为srP，Sp核苷间连接可以表示为ssP。
在一些实施方案中，每个立体限定硫代磷酸酯立体中心的立体选择性为至少约为97％。在一些实施方案中，每个立体限定硫代磷酸酯立体中心的立体选择性为至少约为98％。在一些实施方案中，每个立体限定硫代磷酸酯立体中心的立体选择性为至少约99％。
在一些实施方案中，立体选择性核苷间连接是存在于寡核苷酸分子群中的至少97％、例如至少98％、例如至少99％、或(基本上)所有的寡核苷酸分子中的相同立体异构形式。
可在仅具有非手性骨架(即磷酸二酯)的模型***中测定立体选择性，可通过例如将立体限定的单体偶联到以下模型***“5’t-po-t-po-t-po 3’”来测定每个单体的立体选择性。其结果将给出：5’DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po3’或5’DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po3’，可以使用HPLC对其进行分离。通过整合来自两种可能化合物的紫外信号并给出这些化合物的比率(例如98:2、99:1或大于99:1)来确定立体选择性。
应理解的是，特定的单个非对映异构体(单个立体限定的寡核苷酸分子)的立体异构百分比纯度将是每个核苷间位置上限定的立体中心的偶联选择性和待引入的立体限定的核苷间连接数目的函数。例如，如果每个位置的偶联选择性为97％，则对于具有15个立体限定的核苷间连接的立体限定的寡核苷酸，所得到的纯度为0.9715，即相对于其他非对映异构体的37％，所需的非对映异构体为63％。通过纯化，例如通过HPLC(如离子交换色谱或反相色谱)，可在合成后提高限定的非对映异构体的纯度。
在一些实施方案中，立体限定的寡核苷酸是指这样的寡核苷酸群，其中群的至少约40％、如至少约50％是所需的非对映异构体。
或者说，在一些实施方案中，立体限定的寡核苷酸是指这样的寡核苷酸群，其中群的至少约40％、如至少约50％由所需的(特定的)立体限定的核苷间连接基序(也称为立体限定基序)组成。
对于包含立体随机的和立体限定的核苷间立体中心的立体限定的寡核苷酸，立体限定的寡核苷酸的纯度参照保留了该定义的立体限定的核苷间连接基序的寡核苷酸群的百分比来确定，在计算中忽略立体随机的连接。
核碱基
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交期间是有功能的。在上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基(如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤)以及非天然存在的变体。这些变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷，第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.371.4.1.中。
在一些实施方案中，通过将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶来修饰核碱基部分，如取代的嘌呤或取代的嘧啶，如选自异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并胞嘧啶(5-thiozolo-cytosine)、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可以用各相应核碱基的字母代码表示，例如，A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有等同功能的修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA gapmer，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语修饰的寡核苷酸或修饰的核酸分子描述了包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间连接的寡核苷酸或核酸分子。术语“嵌合”是已经在文献中用于描述具有修饰的核苷的寡核苷酸或核酸分子(特别是gapmer寡核苷酸)的术语。
立体限定的寡核苷酸
立体限定的寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其中至少一个核苷间连接是立体限定的核苷间连接。
立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其中至少一个核苷间连接是立体限定的硫代磷酸酯核苷间连接。
立体限定的核苷间基序
立体限定的核苷间基序在本文中也称为立体限定的基序，是指立体限定的寡核苷酸中立体限定的R和S核苷间连接的模式，书写为5’–3’。例如，立体限定的寡核苷酸
5′-TsrP CssP AssP asrP csrP tssP tsrP tsrP cssP asrP cssP tsrP tssP CssP AssP G-3‘(SEQ ID NO 18)
具有立体限定的核苷间基序RSSRRSRRSRSRSSS。
关于立体限定的寡核苷酸的子文库，其将在立体随机的背景(可选地具有一个或多个非手性核苷间连接，例如磷酸二酯键)中包含共同的立体限定的核苷间基序。
例如，寡核苷酸
5′-Ts Cs As as csrP tssP tssP tsrP cs as cs ts ts Cs As G-3(SEQ ID NO 18)
具有立体限定的核苷间基序XXXXRSSRXXXXXXX，X表示立体随机的硫代磷酸酯核苷间连接(在化合物中显示为下标)。应注意的是，在此示例中，第一个5′立体限定的核苷间连接是从5′端起的第5个核苷间连接(在第4和5位的核苷之间)，因此上述基序也被称为第5位(核苷间连接)的“RSSR”基序。
当立体限定的核苷间基序(立体限定的基序)由一系列相邻的立体限定的核苷间连接(即位于连续的核苷之间)组成时，它在本文中被称为连续的立体限定的核苷间基序(连续的立体限定的基序)。应理解的是，连续的立体限定的基序必须包含两个或更多个相邻的立体限定的核苷间连接。
在子文库混合物中，立体限定的核苷间基序也可以是不连续的，即这些立体限定的核苷间连接被一个或多个立体随机的核苷间连接分散开。
例如化合物
5′-Ts CssP As as csrP tssP ts ts cs as cs ts tssP CsrP AssP G-3(SEQ ID NO 18)
具有不连续的基序XSXXRSXXXXXXSRS。
亲本寡核苷酸
亲本寡核苷酸是具有定义的核碱基序列(基序序列)的寡核苷酸。在本发明的方法中，亲本寡核苷酸通常是有待通过创建一个或多个文库并使用本发明的方法来改进的寡核苷酸。
通常，文库可以改变核苷修饰(设计文库)而保持亲本的核碱基序列和立体化学(通常是立体随机的)。
或者文库可以改变亲本寡核苷酸的立体化学而保持核碱基序列(基序序列)和核苷修饰模式(设计)。在这样的文库中，一个或多个(2+)核苷间连接的立体化学是立体限定的，并与亲本寡核苷酸的不同。
在一些实施方案中，亲本寡核苷酸是立体随机的硫代磷酸酯核苷酸。在一些实施方案中，亲本寡核苷酸是立体随机的硫代磷酸酯寡核苷酸gapmer。
在一些实施方案中，亲本寡核苷酸可以是包含共有的立体限定基序的子文库。
立体限定的变体(子寡核苷酸)
寡核苷酸的立体限定变体是这样的寡核苷酸，它保留了与亲本寡核苷酸相同的序列和核苷修饰(即相同的序列和核苷修饰化学与设计)，但在一个或多个立体限定的核苷间连接(如一个或多个立体限定的硫代磷酸酯核苷间连接)上不同(立体限定的硫代磷酸酯变体)。
立体限定的变体可以是子文库，或可以是完全立体限定的寡核苷酸。
立体限定的寡核苷酸的子文库
包含立体随机的和立体限定的寡核苷酸两者的寡核苷酸在本文中被称为子文库。子文库是完全立体随机的寡核苷酸的非对映异构体混合物的较低复杂度混合物，因此是所有可能的非对映异构体的子集。例如，假定100％的立体选择性偶联效率，从理论上讲，完全硫代磷酸酯立体随机的16mer是215个非对映异构体(32768)的混合物，而子文库(其中一个硫代磷酸酯核苷间连接是立体限定的)将具有一半的文库复杂性(16384个非对映异构体)，(2个立体限定的键＝8192个非对映异构体；3个立体限定的键＝4096个非对映异构体，4个立体限定的键＝2048个非对映异构体，5个立体限定的键＝1024个非对映异构体)。
完全立体限定的寡核苷酸
完全立体限定的寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其中存在于寡核苷酸中的所有手性核苷间连接都是立体限定的。完全立体限定的硫代磷酸酯寡核苷酸是这样的寡核苷酸，其中存在于寡核苷酸中的所有手性核苷间连接都是立体限定的硫代磷酸酯核苷间连接。
应理解的是，在一些实施方案中，完全立体限定的寡核苷酸可包含一个或多个非手性核苷间连接，如磷酸二酯核苷间连接，例如磷酸二酯连接可用在gapmer的侧翼区内、和/或用在连接末端核苷时，如用在连接gapmer序列和缀合物基团的DNA核苷短区域(可生物断裂接头)之间。
在完全立体限定的寡核苷酸的一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷区(如F-G-F’gapmer)中存在的所有核苷间连接都是立体限定的核苷间连接，如立体限定的硫代磷酸酯核苷间连接。
互补
术语“互补”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。Watson-Crick碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可以包含具有修饰的核碱基的核苷，例如常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此术语互补包括未修饰和修饰的核碱基之间的Watson Crick碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。
如本文所用，术语“互补％”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中如下连续核苷酸序列的核苷酸的数目百分比，其中所述核苷酸在给定位置与分开的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列互补(即与其形成Watson Crick碱基对)。(当将靶序列5’-3’和寡核苷酸序列3’-5’进行比对时)通过计算在两个序列之间形成配对的比对碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数再乘以100，来计算该百分比。在这种比较中，未比对上(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称为错配。优选地，在计算连续核苷酸序列的互补％时不允许***和缺失。
术语“完全互补”是指100％互补。
以下是与靶核酸区完全互补的寡核苷酸(SEQ ID NO:12)的实例。
同一性
如本文所用，术语“同一性”指核酸分子(例如寡核苷酸)中如下连续核苷酸序列的核苷酸的数目百分数，其中所述核苷酸在给定位置与分开的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列相同(即，在其与互补性核苷形成Watson Crick碱基对的能力方面)。通过以下方式计算该百分数：计数两个序列之间相同的比对碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并乘以100。同一性百分数＝(匹配数x100)/比对区域的长度。优选地，在计算连续核苷酸序列的％同一性时不允许***和缺失。
杂交
如本文所用的术语“杂交”应理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相对链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间的结合亲和力是杂交的强度。其常根据解链温度(Tm)描述，该解链温度定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm与亲和力不严格成比例(Mergny和Lacroix,2003,Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态Gibbs自由能ΔG°是结合亲和力更精确的表示，并且根据ΔG°＝-RTln(Kd)与反应的解离常数(Kd)相关，其中R是气体常数，T是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的非常低ΔG°反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与反应相关的能量，其中水性溶液浓度为1M，pH为7，温度为37℃。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，对于自发反应，ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验测量，例如，通过使用如Hansen等人,1965,Chem.Comm.36–38and Holdgate等人,2005,Drug Discov Today中描述的等温滴定量热法(ITC)测量。技术人员将知道商业设备可用于ΔG°测量。还可以通过使用如SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465所述的最近邻模型、使用Sugimoto等人,1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人,2004,Biochemistry43:5388–5405描述的适当衍生的热力学参数来数值估算ΔG°。为了获得通过杂交来调节其预期核酸靶的可能性，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，
本发明的寡核苷酸以低于-10kcal的估算ΔG°值与靶核酸杂交。在一些实施方案中，通过标准状态Gibbs自由能ΔG°测量杂交的程度或强度。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可以以低于范围-10kcal的估算ΔG°值与靶核酸杂交，如低于-15kcal、如低于-20kcal、如低于-25kcal。在一些实施方案中，寡核苷酸以-10至-60kcal的估算ΔG°值与靶核酸杂交、如-12至-40、如-15至-30kcal或-16至-27kcal、如-18至-25kcal。
靶核酸
根据本发明，存在被相同寡核苷酸调节的两个靶核酸。靶核酸是i)编码哺乳动物PAPD5的核酸(靶核酸1)和ii)编码哺乳动物PAPD7的核酸(靶核酸2)。靶核酸可以是例如基因、RNA、mRNA和前mRNA、成熟mRNA或cDNA序列。合适地，靶核酸编码PAPD5或PAPD7蛋白，特别是哺乳动物PAPD5或PAPD7，如人PAPD5或PAPD7，参见例如表1和2，其提供了人、猴和小鼠PAPD5和PAPD7的前mRNA序列。
在一些实施方案中，靶核酸选自SEQ ID NO:1、3和/或5或其天然存在的变体(例如编码哺乳动物PAPD5的序列)。
在一些实施方案中，靶核酸选自SEQ ID NO:2、4和/或6或11或其天然存在的变体(例如编码哺乳动物PAPD7的序列)。
表1A.PAPD5跨物种的基因组和组装信息。
表1B.PAPD7跨物种的基因组和组装信息。
Fwd＝正向链。Rev＝反向链。基因组坐标提供前mRNA序列(基因组序列)。
如果在研究或诊断中使用本发明的寡核苷酸，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。
对于体内或体外应用，本发明的寡核苷酸通常能够在表达PAPD5和PAPD7靶核酸的细胞中抑制PAPD5和PAPD7靶核酸的表达。如在寡核苷酸的整个长度上测量的，本发明寡核苷酸的连续核碱基序列通常与PAPD5和PAPD7靶核酸的保守区域互补，任选地除了一个或两个错配，并且任选地排除基于核苷酸的接头区，该接头区可以将寡核苷酸连接至可选的官能团如缀合物、或其他非互补的末端核苷酸(例如D’或D”区)。表2中提供了关于示例性靶核酸的进一步信息。
表2.PAPD5和PAPD7跨物种序列详情。
物种 靶标 RNA类型 长度(nt) SEQ ID NO
人 PAPD5 前mRNA 82393 1
人 PAPD7 前mRNA 44042 2
食蟹猴 PAPD5 前mRNA 86750 3
食蟹猴 PAPD7 前mRNA 49960 4
小鼠 PAPD5 前mRNA 60510 5
小鼠 PAPD7 前mRNA 36659 6
靶序列
如本文所用的术语“靶序列”是指靶核酸中存在的核苷酸序列，其包含与本发明的寡核苷酸或核酸分子互补的核碱基序列。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列(即亚序列)互补的区域组成。
在本发明中，靶序列存在于人PAPD5和人PAPD7靶核酸中。靶序列因此可被称为存在于PAPD5和PAPD7靶核酸中的双特异性靶序列。在有利的实施方案中，靶序列也存在于至少一种额外的物种中，如来自食蟹猴的PAPD5和PAPD7，和/或来自小鼠的PAPD5和PAPD7。
本发明的寡核苷酸或核酸分子包含与靶核酸上的区域(如本文所述的靶序列)互补或杂交的连续核苷酸序列。
与寡核苷酸互补或杂交的靶核酸序列通常包含至少10个核苷酸的一段连续核碱基。该连续核苷酸序列可以为10至50个核苷酸，如12至30个，如13至25个，如14至20个，如15至18个连续核苷酸。
天然存在的变体
术语“天然存在的变体”是指PAPD5或PAPD7基因的变体或起源于与靶核酸相同的遗传基因座的转录物，但是其可以不同，例如由于遗传密码的简并导致多种密码子编码相同的氨基酸，或由于前mRNA的可变剪接，或由于多态性如单核苷酸多态性和等位基因变体的存在。基于与寡核苷酸足够互补的序列的存在，本发明的寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。
在一些实施方案中，天然存在的变体与哺乳动物PAPD5靶核酸(如选自SEQ ID NO:1、3或5的靶核酸)具有至少95％，如至少98％或至少99％的同源性。在一些实施方案中，天然存在的变体与SEQ ID NO:1的人PAPD5靶核酸具有至少99％的同源性。在一些实施方案中，天然存在的变体具有列于表3A的多态性。
在一些实施方案中，天然存在的变体与哺乳动物PAPD7靶核酸(如选自SEQ ID NO:2、4或6的靶核酸)具有至少95％，如至少98％或至少99％的同源性。在一些实施方案中，天然存在的变体与SEQ ID NO:2的人PAPD7靶核酸具有至少99％的同源性。在一些实施方案中，天然存在的变体具有列于表3B的多态性。
在PAPD5或PAPD7基因中多个单核苷酸多态性是已知的，例如在表3A(人PAPD5前mRNA起始/参考序列为SEQ ID NO:1)和3B(人PAPD7前mRNA起始/参考序列为SEQ ID NO:2)中公开的那些。
表3A：PAPD5多态性(天然存在的变体)
次要等位基因 次要等位基因频率 在SEQ ID NO:1上起始
G 0,00399361 29
G 0,000199681 34
T 0,000399361 39
A 0,000599042 62
A 0,000599042 97
G 0,000199681 141
A 0,000199681 142
T 0,000199681 158
A 0,0241613 235
A 0,00239617 279
- 0,214058 370
G 0,000798722 450
CAGCA 0,000798722 603
A 0,0223642 1028
C 0,000199681 1044
A 0,0189696 1068
T 0,000199681 1181
T 0,0249601 1199
T 0,000998403 1258
A 0,000199681 1261
T 0,000599042 1441
T 0,000199681 1443
C 0,000599042 1469
A 0,000399361 1535
表3B：PAPD7多态性(天然存在的变体)
/>
表达的调节
如本文所用的术语“表达的调节”应理解为，当与施用核酸分子之前的PAPD5和PAPD7量比较时，核酸分子改变PAPD5和PAPD7的量的能力的总称。或者，可以通过参考对照实验来确定表达的调节。通常理解的是，对照是用盐水组合物处理的个体或靶细胞，或用非靶核酸分子(模拟)处理的个体或靶细胞。然而，其也可以是用标准疗法处理的个体。
一种类型的调节是，核酸分子(例如反义寡核苷酸)抑制、下调、减少、去除、阻止、防止、减轻、降低、避免或终止PAPD5和PAPD7表达的能力，例如，通过降解mRNA或阻断转录。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是修饰的核苷酸，当其并入寡核苷酸中时增强寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如如通过解链温度(Tm)测量的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选导致解链温度增加，按每个修饰核苷计，+0.5至+12℃、更优选+1.5至+10℃、最优选+3至+8℃。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，包括例如许多2’糖修饰的核苷，如2’取代的核苷如Ome和MOE，以及2’至4’桥接核酸如锁核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.AcidRes.,1997,25,4429-4443and Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213)。
糖修饰
本发明的核酸分子可包含一个或多个核苷，其具有修饰的糖部分，即与DNA和RNA中的核糖部分相比具有糖部分的修饰。
已经制备了许多具有核糖部分修饰的核苷，主要目的是改善核酸分子的某些性质，如亲和力和/或核酸酶抗性。
这些修饰包括如下修饰，其中核糖环结构被修饰，例如通过替代为己糖环(HNA)，或通常在核糖环的C2和C4碳之间具有双基桥(biradicle bridge)的双环(LNA)，或通常在C2和C3碳之间缺乏键的未连接的核糖环(例如UNA)而被修饰。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分取代的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的-OH基团而进行的修饰。例如取代基可以在2’、3’、4’或5’位置引入。
2’糖修饰的核苷
2’糖修饰的核苷是这样的核苷，所述核苷在2’位置具有除H或-OH之外的取代基(2’取代的核苷)，或包含能够在核糖环的2’碳和第二个碳之间形成桥的2’连接的双基，如LNA(2’-4’双基桥接)核苷。
实际上，许多注意力集中在开发2’取代的核苷上，大量2’取代的核苷被发现当其被并入到寡核苷酸中时具有有利特性。例如，2’修饰的糖可以为寡核苷酸提供增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2’取代的修饰核苷的实例是2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。更多的实例，请参见例如Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213,以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下面是一些2’取代的修饰核苷的描述。
涉及本发明时2’取代的不包括2’桥接的分子如LNA。
锁核酸核苷(LNA)
“LNA核苷”是2’糖修饰的核苷，其包含双基连接所述核苷的核糖糖环的C2’和C4’(称为“2’-4’桥”)，该双基连接限制或锁住核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥接的核酸或双环核酸(BNA)。当LNA被整合到互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的亲和力增强(双链体稳定)有关。这可以通过测量寡核苷酸/互补双链体熔解温度来常规地确定。
在一些实施方案中，本发明寡聚物的2’糖修饰核苷或LNA核苷具有结构式I或II的一般结构：
其中W选自-O-、-S-、-N(Ra)-、-C(RaRb)-，如在一些实施方案中为-O-；
B表示核碱基或修饰的核碱基部分；
Z表示至邻近核苷的核苷间连接或5’-末端基团；
Z*表示至邻近核苷的核苷间连接或3’-末端基团；
X表示选自由-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z组成的列表中的基团。
在一些实施方案中，X选自：-O-、-S-、NH-、NRaRb、-CH2-、CRaRb、-C(＝CH2)-和-C(＝CRaRb)-
在一些实施方案中，X是-O-
Y表示选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z的基团
在一些实施方案中，Y选自：-CH2-、-C(RaRb)-、–CH2CH2-、-C(RaRb)-C(RaRb)-、–CH2CH2CH2-、-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-和-C(Ra)＝N-
在一些实施方案中，Y选自-CH2-、-CHRa-、-CHCH3-、CRaRb-
或-X-Y-一起表示二价接头基团(也称为基)一起表示由1、2、3或4个基团/原子组成的二价接头基团，选自-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和>C＝Z，
在一些实施方案中，-X-Y-表示选自下组的双基：-X-CH2-、-X-CRaRb-、-X-CHRa-、-X-C(HCH3)-、-O-Y-、-O-CH2-、-S-CH2-、-NH-CH2-、-O-CHCH3-、-CH2-O-CH2、-O-CH(CH3CH3)-、-O-CH2-CH2-、OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-、-O-NCH2-、-C(＝CH2)-CH2-、-NRa-CH2-、N-O-CH2、-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
在一些实施方案中，-X-Y-表示-O-CH2-或-O-CH(CH3)-，
其中Z选自-O-、-S-和N(Ra)-，
且当存在Rb时，Ra和Rb各自独立地选自氢，任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-烯基，任选取代的C2-6-炔基、羟基，任选取代的C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-链烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、氨基甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺酰基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基(sulphanyl)、C1-6-烷硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以任选地被取代，并且其中两个偕位取代基Ra和Rb一起可以表示任选取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，不对称基团可以为R或S取向。
其中R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自：氢，任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-烯基，任选取代的C2-6-炔基、羟基、C1-6-烷氧基、C2-6-烷氧基烷基、C2-6-链烯氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、氨基甲酰胺基、C1-6-烷酰氧基、磺酰基(sulphono)、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基(sulphanyl)、C1-6-烷硫基，卤素，其中芳基和杂芳基可任选被取代，并且其中两个偕位取代基一起可表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自C1-6烷基，如甲基和氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R5和R5*均为氢。
在一些实施方案中，R1、R2、R3全部是氢，并且R5和R5*之一也是氢，而R5和R5*中的另一个不是氢，如C1-6烷基，如甲基。
在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb是氢或甲基。
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一个或两个是氢；
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一个是氢，另一个不是氢；
在一些实施方案中，Ra和Rb中的一个是甲基，另一个是氢；
在一些实施方案中，Ra和Rb均为甲基。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。这种LNA核苷在WO99/014226、WO00/66604、WO98/039352和WO2004/046160中公开(通过引用并入本文)，并且包括通常称为β-D-氧基LNA和α-L-氧基LNA核苷的那些。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-S-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。这种硫基LNA(thio LNA)核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-NH-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。此类氨基LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH2-CH2-或-O-CH2-CH2-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。这种LNA核苷公开于WO00/047599和Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12 73-76(在此引入作为参考)，并且包括通常称为2’-O-4’C-亚乙基桥接的核酸(ENA)。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH2-，W是O，并且R1、R2、R3的全部和R5和R5*中的一个是氢，R5和R5*中的另一个不是氢，如C1-6烷基，如甲基。这种5’取代的LNA核苷在WO2007/134181中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra和Rb中的一个或两个不是氢，如甲基，W是O，以及R1、R2、R3的全部和R5和R5*中的一个是氢，R5和R5*中的另一个不是氢，如C1-6烷基，如甲基。这种双修饰的LNA核苷在WO2010/077578中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-表示二价接头基团-O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem.第75(5)卷第1569-81页)。在一些实施方案中，双基-X-Y-表示二价接头基团-O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸-Seth等人,2010,J.Org.Chem.第75(5)卷第1569-81页)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CHRa-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。这种6’取代的LNA核苷在WO10036698和WO07090071中公开，其都通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH(CH2OCH3)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。此类LNA核苷在本领域中也称为环状MOE(cMOE)，其在WO07090071中公开。
在一些实施方案中，双基-X-Y-表示R-或S-构型的二价接头基团-O-CH(CH3)-。在一些实施方案中，双基-X-Y-一起表示二价接头基团-O-CH2-O-CH2-(Seth等人,2010,J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH(CH3)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。这种6’甲基LNA核苷在本领域中也称为cET核苷，并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，如WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)中所公开的，均通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra或Rb均不是氢，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb均为甲基。这种6’二取代的LNA核苷在WO2009006478中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-S-CHRa-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。这种6’取代的硫基LNA核苷在WO11156202中公开，其通过引用并入本文。在一些6’取代的硫基LNA实施方案中，Ra是甲基。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-C(＝CH2)-C(RaRb)-，如C(＝CH2)-CH2-或–C(＝CH2)-CH(CH3)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。这种乙烯基碳LNA核苷公开在WO08154401和WO09067647中，它们都通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基-X-Y-是-N(-ORa)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，如甲基。这种LNA核苷也称为N取代的LNA，并且在WO2008/150729中公开，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，双基-X-Y-一起表示二价接头基团-O-NRa-CH3-(Seth等人，2010，J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是-N(Ra)-，W是O，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，如甲基。
在一些实施方案中，R5和R5*中的一个或两个是氢，并且当被取代时，R5和R5*中的另一个是C1-6烷基，如甲基。在这样的实施方案中，R1、R2、R3可以全部是氢，并且双基-X-Y-可以选自-O-CH2-或-O-C(HCRa)-,如-O-C(HCH3)-。
在一些实施方案中，双基是-CRaRb-O-CRaRb-，如CH2-O-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，如甲基。这种LNA核苷也称为构象限制性核苷酸(CRN)，并且在WO2013036868中公开，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，双基是-O-CRaRb-O-CRaRb-，如O-CH2-O-CH2-，W是O并且R1、R2、R3、R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基，如甲基。这种LNA核苷也称为COC核苷酸，并且在Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research 2009 37(4)，1225-1238中公开，其通过引用并入本文。
除非另有说明，否则将认为LNA核苷可以是β-D或α-L立体异构体。
非限定性示例性LNA核苷描述于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人,Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76,Seth等人,J.Org.Chem.2010,第75(5)卷第1569-81页,以及Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238.中。
方案1中给出了LNA核苷的某些实例。
方案1
如实施例中所示，在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸中的LNA核苷是β-D-氧基-LNA核苷。
核酸酶介导的降解
核酸酶介导的降解是指当与互补核苷酸序列形成双链体时能够介导这种序列降解的寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸可通过核酸酶介导的靶核酸降解发挥作用，其中本发明的寡核苷酸能够招募核酸酶，特别是内切核酸酶，优选内切核糖核酸酶(RNase)，如RNaseH。通过核酸酶介导机制起作用的寡核苷酸设计的实例是，通常包含至少5或6个连续DNA核苷的区域、并且其在一侧或两侧侧接亲和力增强核苷的寡核苷酸，例如gapmer、头聚体(headmer)和尾聚体(tailmer)。
RNase H活性和招募
反义寡核苷酸的RNase H活性是指其在与互补RNA分子的双链体中时招募RNase H的能力。WO01/23613提供了用于测定RNaseH活性的体外方法，其可用于测定招募RNaseH的能力。典型地，如果当与互补的靶核酸序列一起提供时寡核苷酸具有如下测定的初始速率(以pmol/l/min计)的至少5％，如至少10％或超过20％，则认为所述寡核苷酸能够招募RNase H，其中所述的初始速率是使用WO01/23613(通过引用并入本文)的实施例91-95提供的方法，使用与待测修饰寡核苷酸具有相同的碱基序列、但仅含有DNA单体且寡核苷酸中所有单体之间硫代磷酸酯连接时测定的初始速率。可从Lubio Science GmbH,Lucerne,Switzerland获取重组人RNase H1用于测定RHase H活性。
Gapmer
本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是gapmer。反义gapmer通常用于通过Rnase H介导的降解来抑制靶核酸。gapmer寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，即5’-侧翼、gap和3’-侧翼，按5’至3’方向为F-G-F’。“gap”区(G)包含一段连续的DNA核苷酸，其使寡核苷酸能够招募RNase H。gap区侧翼为一个5’侧翼区(F)(其包含一个或多个糖修饰核苷，有利的是高亲和力糖修饰核苷)、和一个3’侧翼区(F’)(其包含一个或多个糖修饰核苷，有利的是高亲和力糖修饰核苷)。F和F’区中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，是亲和力增强型糖修饰核苷)。在一些实施方案中，F和F’区中的一个或多个糖修饰核苷是2’糖修饰(如高亲和力2’糖修饰)核苷，如独立选自LNA和2’-MOE。
在gapmer的设计中，gap区的5’和3’大多数核苷是DNA核苷，分别位于5’(F)或3’(F’)区的糖修饰核苷附近。这些侧翼可进一步定义为在距离gap区的最远末端(即在5’侧翼的5’末端和3’侧翼的3’末端)具有至少一个糖修饰的核苷。
F-G-F’区形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F’的gapmer区。
gapmer设计F-G-F’的总长度可以例如是12至32个核苷，如13至24个，如14至22个核苷，如14至17个，如16至18个核苷。
例如，本发明的gapmer寡核苷酸可以通过以下结构式来表示：
F1-8-G5-16-F’1-8，如
F1-8-G7-16-F’2-8
条件是，gapmer区F-G-F’的总长度至少为12，如长至少14个核苷酸。
在下面进一步定义了F、G和F’区，可以将其合并到F-G-F′结构式中。
Gapmer–gap，G区
gapmer的G区(gap区)是使寡核苷酸能够招募RNaseH(如人RNase H1)的核苷区，通常是DNA核苷。RNaseH是一种细胞酶，它识别DNA和RNA之间的双链体，并酶促裂解RNA分子。合适的gapmer可具有长度至少5或6个连续DNA核苷，如5至16个连续DNA核苷，如6至15个连续DNA核苷，如7至14个连续DNA核苷，如8至12个连续DNA核苷的gap区域(G)。在一些实施方案中，gap区G可以由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续DNA核苷组成。gap区中的胞嘧啶(C)DNA在某些情况下可被甲基化，这类残基被注释为5-甲基-胞嘧啶(meC或具有e而不是c)。如果gap中存在cg二核苷酸降低潜在的毒性，则gap中胞嘧啶DNA的甲基化是有利的，该修饰预期对寡核苷酸的功效没有显著影响。
在一些实施方案中，gap区G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续的硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施方案中，gap中所有核苷间连接都是硫代磷酸酯键。
虽然传统的gapmer具有DNA gap区，但有许多修饰的核苷的例子，这些修饰的核苷在gap区中使用时，允许进行RNase H招募。已报告在包括在gap区中时能够招募RNase H的修饰的核苷包括，例如α-L-LNA、C4’烷基化DNA(如PCT/EP2009/050349和Vester等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296–2300中描述，两者均通过引用并入本文)、***糖衍生的核苷如ANA和2′F-ANA(Mangos等人,2003J.AM.CHEM.SOC.125,654-661)、UNA(解锁核酸)(如Fluiter等人,Mol.Biosyst.,2009,10,1039中描述，通过引用并入本文)。UNA是解锁的核酸，通常其中核糖的C2和C3之间的键已经被去除，形成解锁的“糖”残基。在这种gapmer中使用的修饰的核苷可以是这样的核苷，当其被引入到gap区中时采取2’endo(DNA样)结构，即允许招募RNaseH的修饰)。在一些实施方案中，本文描述的DNA gap区(G)可以任选地含有1至3个糖修饰的核苷，所述核苷在被引入到gap区中时采用2’endo(DNA样)结构。
G区-“gap-断裂子”
或者，有许多关于***gapmer的gap区中的修饰的核苷的报告，所述修饰的核苷赋予3’endo构象，同时保留了一些RNaseH活性。具有包含一个或多个3’endo修饰核苷的gap区的gapmer称为“gap-断裂子”(gap-breaker)或“gap-破坏的”gapmer，参见例如WO2013/022984。gap-断裂子寡核苷酸在gap区内保留足够的DNA核苷区，以允许进行RNaseH招募。gap断裂子寡核苷酸设计招募RNaseH的能力通常是序列或甚至化合物特异性的-参见Rukov等人,2015Nucl.Acids Res.第43卷第8476-8487页，其公开了招募RNaseH的“gap断裂子”寡核苷酸，在某些情况下其提供靶RNA的更特异裂解。在gap断裂子寡核苷酸的gap区中使用的修饰核苷可以例如是赋予3’endo构象的修饰核苷，如2’-O-甲基(OMe)或2’-O-MOE(MOE)核苷，或β-D LNA核苷(核苷的核糖糖环的C2’和C4’之间的桥处于β构象)，如β-D-氧基LNA或ScET核苷。
与上文所述包含G区的gapmer一样，gap断裂子或gap破坏的gapmer的gap区在gap的5’末端(与F区的3’核苷相邻)处有DNA核苷、并在gap的3’末端(与F’区的5’核苷相邻)处有DNA核苷。包含破坏的gap的gapmer通常在gap区的5’末端或3’末端处保留至少3或4个连续DNA核苷的区域。
用于gap断裂子寡核苷酸的示例性设计包括
F1-8-[D3-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D1-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D3-4-E1-D1-4]-F’1-8
其中G区在括号[Dn-Er-Dm]内，D是连续DNA核苷序列，E是修饰的核苷(gap断裂子或gap破坏的核苷)，F和F’是本文定义的侧翼区域，并且条件是gapmer区F-G-F’的总长度为长至少12，如至少14个核苷。
在一些实施方案中，gap破坏的gapmer的G区包含至少6个DNA核苷，如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个DNA核苷。如上所述，DNA核苷可以是连续的，或者可以任选地间插有一个或多个修饰的核苷，条件是该gap G区能够介导RNaseH招募。
Gapmer-侧翼区域，F和F’
F区位置紧邻G区5’DNA核苷。F区的最3’端核苷是糖修饰的核苷，如高亲和力糖修饰核苷，例如2’取代核苷，如MOE核苷，或LNA核苷。
F’区位置紧邻G区3’DNA核苷。F’区的最5’端核苷是糖修饰的核苷，如高亲和力糖修饰核苷，例如2’取代核苷，如MOE核苷，或LNA核苷。
F区的长度为1至8个连续核苷酸，如1至6个、如2至6个、如3至4个连续核苷酸。有利的是，F区最5’端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中，F区的两个最5’端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中，F区的最5’端核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，F区的两个最5’端核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，F区的两个最5’端核苷是2’取代核苷，如两个3’MOE核苷。在一些实施方案中，F区的最5’端核苷是2’取代核苷，如MOE核苷。
F’区的长度为2至8个连续核苷酸，如3至6个、如4至5个连续核苷酸。有利的是，F’区最3’端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中，F’区的两个最3’端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施方案中，F’区的两个最3’端核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，F’区的最3’端核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，F’区的两个最3’端核苷是2’取代核苷，如两个3’MOE核苷。在一些实施方案中，F’区的最3’端核苷是2’取代核苷，如MOE核苷。
应注意的是，当F或F’区的长度为1时，则其为LNA核苷是有利的。
在一些实施方案中，F和F’区独立地包含糖修饰核苷的连续序列或由其组成。在一些实施方案中，F区的糖修饰核苷可独立选自2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、2’-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、***糖核酸(arabinonucleic acid)(ANA)单元和2’-氟-ANA单元。
在一些实施方案中，F和F’区独立包含LNA和2’取代的修饰的核苷(混合翼设计)。
在一些实施方案中，F和F’区由仅一类糖修饰的核苷组成，如仅MOE或仅β-D-氧基LNA或仅ScET。此类设计也称为一致侧翼或一致gapmer设计。
在一些实施方案中，F或F’、或F和F’区的所有核苷都是LNA核苷，如独立选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些实施方案中，F区由1至5个、如2至4个、如3至4个、如1、2、3、4或5个连续的LNA核苷组成。在一些实施方案中，F和F’区所有的核苷都是β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施方案中，F或F’、或F和F’区的所有核苷都是2’取代的核苷，如OMe或MOE核苷。在一些实施方案中，F区由1、2、3、4、5、6、7或8个连续的OMe或MOE核苷组成。在一些实施方案中，只有一个侧翼区可以由2’取代核苷，如OMe或MOE核苷组成。在一些实施方案中，5’(F)侧翼区由2’取代核苷，如OMe或MOE核苷组成，而3’(F’)侧翼区包含至少一个LNA核苷，如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施方案中，3’(F’)侧翼区由2’取代核苷，如OMe或MOE核苷组成，而5’(F)侧翼区包含至少一个LNA核苷，如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些实施方案中，F和F’区所有修饰的核苷都是LNA核苷，如独立选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中F或F’、或F和F’区可以任选地包含DNA核苷(交替侧翼，详细信息参见其定义)。在一些实施方案中，F和F’区的所有修饰的核苷都是β-D-氧基LNA核苷，其中F或F’、或F和F’区可以任选地包含DNA核苷(交替侧翼，详细信息参见其定义)。
在一些实施方案中，F和F’区的最5’端和最3’端核苷是LNA核苷，如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些实施方案中，F区与G区之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中，F’区与G区之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中，F或F’、或F和F’区的核苷之间的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
另外的gapmer设计公开于WO2004/046160、WO2007/146511和WO2008/113832中，通过引用将其并入本文。
LNA gapmer
LNA gapmer是这样的gapmer，其中F和F’区之一或两者包含LNA核苷或由其组成。β-D-氧基gapmer是这样的gapmer，其中F和F’区之一或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成。
在一些实施方案中，LNA gapmer的结构式为：[LNA]1–5-[G区]-[LNA]1-5，其中G区如gapmer G区定义中的定义。
在一些实施方案中，LNA是β-D-氧基-LNA，gapmer的结构式为：
F2-5 LNA,0-2DNA-G7-11 DNA-F’3-5LNA,0-2DNA
MOE gapmer
MOE gapmer是这样的gapmer，其中F和F’区由MOE核苷组成。在一些实施方案中，MOE gapmer设计为[MOE]1-8-[G区]-[MOE]1-8、如[MOE]2-7-[G区]5-16-[MOE]2-7、如[MOE]3-6-[G区]-[MOE]3-6，其中G区如gapmer定义中的定义。具有5-10-5设计的MOE gapmer(MOE-DNA-MOE)在本领域已被广泛应用。
混合翼gapmer
混合翼gapmer是LNA gapmer，其中F和F’区之一或两者包含2’取代核苷，如独立选自以下的2’取代核苷：2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、2’-烷氧基-RNA、MOE单元、***糖核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元，如MOE核苷。在一些实施方案中，其中F和F’区至少之一、或F和F’两者包含至少一个LNA核苷，F和F’区的剩余核苷独立地选自MOE和LNA。在一些实施方案中，其中F和F’区至少之一、或F和F’两者包含至少两个LNA核苷，F和F’区的剩余核苷独立地选自MOE和LNA。在一些混合翼实施方案中，F和F’区之一或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。
混合翼gapmer设计公开于WO2008/049085和WO2012/109395中，两者均通过引用并入本文。
交替侧翼gapmer
具有交替侧翼的寡核苷酸是LNA gapmer寡核苷酸，其中至少一个侧翼(F或F’)除了包含LNA核苷外，还包括DNA。在一些实施方案中，F或F’区至少之一、或F和F’两者包含LNA核苷和DNA核苷两者。在这类实施方案中，F或F’、或F和F’两者的侧翼区包含至少三个核苷，其中F和/或F’区的最5’和3’端核苷是LNA核苷。
包含LNA和DNA核苷的侧翼区被称为交替侧翼，因为它们包含交替基序LNA-DNA-LNA核苷。交替侧翼LNA gapmer公开于WO2016/127002中。
交替侧翼区可包含多达3个连续的DNA核苷，如1至2个或1个或2个或3个连续的DNA核苷。
交替侧翼可被注释为一系列整数，表示若干LNA核苷(L)和其后的若干DNA核苷(D)，例如
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2
在寡核苷酸设计中，这些通常会以数字表示，因此2-2-1表示5’[L]2-[D]2-[L]3’，1-1-1-1-1表示5’[L]-[D]-[L]-[D]-[L]3’。具有交替侧翼的寡核苷酸中侧翼(F和F’区)的长度可独立地为3至10个核苷，如4至8个核苷，如5至6个核苷，如4、5、6或7个修饰的核苷。在一些实施方案中，gapmer寡核苷酸中只有一个侧翼是交替的，而另一个则由LNA核苷酸组成。在3’侧翼(F’)的3’末端具有至少两个LNA核苷是有利的，其赋予额外的核酸外切酶抗性。具有交替侧翼的寡核苷酸的一些示例有：
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
条件是gapmer的总长度为至少12个、如至少14个核苷酸。
寡核苷酸中的D’或D”区
本发明的寡核苷酸在某些实施方案中可包含与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列(如gapmer F-G-F’)和另外的5’和/或3’核苷，或由其组成。所述另外的5’和/或3’核苷可以或可以不与靶核酸完全互补。此另外的5’和/或3’核苷在本文中可称为D’区和D”区。
添加D’或D”区可用于将连续核苷酸序列(如gapmer)与缀合物部分或其他官能团连接。当用于连接连续核苷酸序列与缀合物部分时，其可用作可生物裂解的接头。或者，它可用于提供核酸外切酶防护或便于合成或制造。
D’和D”区可分别与F区的5’末端或F’区的3’末端连接，产生以下结构式的设计：D’-F-G-F’、F-G-F’-D’或D’-F-G-F’-D”。在这种情况下，F-G-F’是寡核苷酸的gapmer部分，D’或D”区构成寡核苷酸的分开部分。
D’或D”区可独立地包含1、2、3、4或5个额外的核苷酸或由其组成，这些核苷酸可以与靶核酸互补或不互补。F或F’区附近的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，如DNA或RNA或其碱基修饰形式。D’或D”区可用作核酸酶易感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施方案中，以磷酸二酯键连接这些额外的5’和/或3’末端核苷酸，其是DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作D’或D”区的基于核苷酸的可生物裂解接头，其包括磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了在聚寡核苷酸构建体中使用可生物裂解的接头，其中这些接头用于在单个寡核苷酸中连接多个反义构建体(例如gapmer区)。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸除了包含构成gapmer的连续核苷酸序列外，还包含D’和/或D”区。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以用以下结构式表示：
F-G-F’；特别是F1-8-G5-16-F’2-8
D’-F-G-F’；特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8
F-G-F’-D”；特别是F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
D’-F-G-F’-D”；特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8-D”1-3
在一些实施方案中，位于D’区和F区之间的核苷间连接是磷酸二酯键。在一些实施方案中，位于F’区和D”区之间的核苷间连接是磷酸二酯键。
缀合物
如本文所用的术语缀合物是指与非核苷酸部分(缀合部分或C区或第三区)共价连接的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合，可以例如，通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄取或稳定性，改善寡核苷酸的药理学。在一些实施方案中，缀合部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、***、渗透性和/或细胞摄取，改变或增强寡核苷酸的药代动力学特性。特别地，缀合物可以将寡核苷酸靶向特定器官、组织或细胞类型，从而增强寡核苷酸在该器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如，脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。
WO 93/07883和WO2013/033230提供了合适的缀合部分，其通过引用并入本文。其他合适的缀合部分是能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的那些。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合部分适于结合ASGPR，参见例如WO 2014/076196、WO 2014/727232和WO 2014/179620(通过引用并入本文)。这样的缀合物用于增强肝脏对寡核苷酸的摄入而减少其在肾脏中的存在，因此相较于相同寡核苷酸的未缀合形式，增加了缀合寡核苷酸的肝/肾比率。
在一个实施方案中，非核苷酸部分(缀合部分)选自糖类、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或其组合。
缀合物接头
连接或接头是两个原子之间的连接，其通过一个或多个共价键将一个目标化学基团或片段连接到另一个目标化学基团或片段。缀合部分可以直接地或通过连接部分(例如接头或连接子)与寡核苷酸连接。接头用于共价地将一个区(例如缀合物部分)与另一个区(例如寡核苷酸(例如A或C区的末端))连接起来。
在本发明的一些实施方案中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可任选地包含位于寡核苷酸和缀合部分之间的接头区。在一些实施方案中，缀合物和寡核苷酸之间的接头是可生物裂解的。接头和寡核苷酸通常通过磷酸二酯键连接。
可生物裂解的接头(B区)包含或由生理学不稳定的键组成，其中在哺乳动物体内通常遇到的条件下或类似于哺乳动物体内通常遇到的条件下，该生理学不稳定的键可被裂解。生理学上不稳定的接头被化学转化(例如，裂解)的条件包括化学条件，如pH、温度、氧化或还原条件或试剂、以及盐浓度，其中所述条件在哺乳动物细胞中存在或与哺乳动物细胞中遇到的条件类似。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性的存在，如蛋白水解酶或水解酶或核酸酶。在一个实施方案中，可生物裂解的接头易受S1核酸酶裂解。在优选的实施方案中，核酸酶敏感性接头包含1至10个核苷，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷，更优选2至6个核苷，最优选2至4个连接的核苷，其包含至少两个连续的磷酸二酯键，如至少3或4或5个连续的磷酸二酯键。优选地，核苷是DNA或RNA。
在一个实施方案中，寡核苷酸和缀合部分之间的接头是生理学不稳定的接头，由反义化合物的连续核苷酸序列的5’或3’端处2至5个连续磷酸二酯连接的核苷组成。在一些实施方案中，连续的磷酸二酯键是具有选自以下序列的二核苷酸：AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG。在一些实施方案中，连续的磷酸二酯连接是具有以下序列的三核苷酸：AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC或GGG。在特定的实施方案中，磷酸二酯连接的CA二核苷酸具有三个连续的磷酸二酯键，被用作连续核苷酸序列和缀合物部分之间可生物裂解的接头。含有磷酸二酯的可生物裂解接头更详细地描述于WO2014/076195(通过引用并入本文)中。在具有可生物裂解接头的缀合化合物中，当与标准进行比较时，缀合物部分的至少约50％自寡核苷酸裂解，如，缀合物部分的至少约60％自寡核苷酸裂解、如至少约70％裂解、如至少约80％、如至少约85％裂解、如至少约90％裂解、如至少约95％裂解。
缀合物也可以通过不可生物裂解的接头与寡核苷酸连接，或者在一些实施方案中，缀合物可以包含与可生物裂解的接头共价连接的不可裂解的接头。接头不一定是可生物裂解的，但主要用于将缀合物部分共价连接至寡核苷酸或可生物裂解的接头，并潜在地于缀合物部分和寡核苷酸之间产生一些距离。
一些示例性接头(Y区)包括：8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、6-氨基己氧基、4-氨基丁酸、4-氨基环己基羧酸、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-酰氨基-己酸酯)(LCSMCC)、琥珀酰亚胺基间马来酰亚胺基-苯甲酸酯(MBS)、琥珀酰亚胺基N-表-马来酰亚胺基-己酸酯(EMCS)、琥珀酰亚胺基6-(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯(SMPH)、琥珀酰亚胺基N-(α-马来酰亚胺基乙酸酯)(AMAS)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、β-丙氨酸(β-ALA)、苯基甘氨酸(PHG)、4-氨基环己酸(ACHC)、β-(环丙基)丙氨酸(β-CYPR)、氨基十二烷酸(ADC)、烯化二醇(alylene diol)、聚乙二醇、氨基酸等。不可裂解的接头也可包含链结构或重复单元(如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基基团)的寡聚体。在一些实施方案中，接头(Y区)是氨基烷基，如C2-C36氨基烷基基团，包括，例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施方案中，接头(Y区)是C6氨基烷基基团(也称为C6接头)。通过使用氨基修饰的寡核苷酸和缀合物基团上的活性酯基团，可常规地将缀合物接头基团连接到寡核苷酸上。氨基烷基和寡核苷酸之间的接头基团可以是例如硫代磷酸酯或磷酸二酯、或本文中提及的其他核苷连接基团之一。本发明的缀合物化合物可由以下区域C-B-A(缀合物部分-生物可裂解接头-寡核苷酸/连续核苷酸序列)或C-Y-B-A(偶联物部分-不可裂解接头-生物可裂解接头-寡核苷酸/连续核苷酸序列)组成。
治疗
本文使用的术语“治疗”通常意指获得所需的药理学和/或生理学效果。就部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的副作用而言，该效果是治疗性的。本文所用的术语“治疗”涵盖对受试者疾病的任何治疗，包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展，如抑制HBsAg和/或HBeAg的增加；或(b)改善(即缓解)疾病，即引起疾病消退，如阻抑HBsAg和/或HBeAg产生。因此，改善和/或抑制HBV感染的化合物是治疗HBV感染的化合物。优选地，如本文所用的术语“治疗”涉及对已显现病症的医学干预，如治疗已经明确定义和表现的HBV感染。
预防
本文中术语“预防”或“防止”涉及预防性治疗，即涉及其目的是预防而不是治愈疾病的措施或方法。预防意味着获得所需的药理学和/或生理学效果，其在完全或部分预防疾病或其症状方面是预防性的。因此，本文中“预防HBV感染”包括预防受试者中发生HBV感染，以及预防HBV感染症状的发生。在本发明中，特别考虑预防孩子由HBV感染母亲而感染HBV。
患者
出于本发明的目的，“受试者”(或“患者”)可以是脊椎动物。在本发明的上下文中，术语“受试者”包括人和其他动物，特别是哺乳动物和其他生物。因此，本文提供的手段和方法适用于人类治疗和兽医应用。因此，本文的受试者可以是动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、雪貂、猫、狗、鸡、绵羊、牛物种、马、骆驼或灵长类动物。优选地，受试者是哺乳动物。更优选地，受试者是人。
HBV感染
术语“乙型肝炎病毒感染”或“HBV感染”在本领域中是公知的，并且是指由乙型肝炎病毒(HBV)引起并影响肝脏的传染病。HBV感染可以是急性或慢性感染。一些感染者在感染初期没有任何症状，有些患者出现呕吐、皮肤发黄、疲倦、尿色深、腹痛等病情的快速发作(“Hepatitis B Fact sheet N°204”.who.int.2014年7月，2014年11月4日检索)。这些症状常持续数周，可能导致死亡。症状开始可能需要30到180天。在出生时感染的个体中，90％发展为慢性乙型肝炎感染，而在5岁以后感染的个体中只有不到10％发展为慢性乙型肝炎感染(“Hepatitis B FAQs for the Public-Transmission”,美国疾病控制和预防中心(CDC),2011-11-29检索)。大多数慢性病患者没有症状；然而，最终可能发展为肝硬化和肝癌(Chang,2007,Semin Fetal Neonatal Med,12:160-167)。这些并发症导致15％至25％的慢性病患者死亡(“Hepatitis B Fact sheet N°204”.who.int.2014年7月,2014年11月4检索)。本文中，术语“HBV感染”包括急性和慢性乙型肝炎感染。术语“HBV感染”还包括初始感染的无症状阶段、症状阶段、以及HBV感染的无症状慢性阶段。
化合物
本文中，术语“化合物”意指任何核酸分子，如根据本发明的RNAi分子或反义寡核苷酸，或包含这种核酸分子的任何缀合物。例如，本文的化合物可以是靶向PAPD5和PAPD7的核酸分子，特别是反义寡核苷酸。
组合物
术语“组合物”也可用于描述核酸分子化合物。核酸分子组合物具有小于20％的杂质，优选小于15％或10％的杂质，更优选小于9％、8％、7％或6％的杂质，最优选小于5％的杂质。杂质通常是比主要核酸分子组分短一个或两个核苷酸(n-1或n-2)的核酸分子。
通过参考非限制性附图和实施方案进一步描述本发明。
本发明的详细描述
PAPD5和PAPD7是属于聚合酶β-样核苷酸转移酶超家族的非典型poly(A)聚合酶。在PCT/EP2017/064981中，通过以两个小分子在HBV感染期间抑制HBV表面抗原(HBsAg)的产生和HBV RNA的表达并随后以siRNA化合物池进行确认，将PAPD5和PAPD7鉴定为抑制HBV感染的相关靶标。在PCT/EP2017/064980中，描述了靶向PAPD5或PAPD7的反义寡核苷酸，并结合这些寡核苷酸实现HBV感染的体外抑制。
本发明鉴定了长度为12至22个核苷酸的靶序列，这些靶序列在人PAPD5和人PAPD7mRNA之间共享，这使得能够用单个核酸分子同时抑制两个靶标。人PAPD5和人PAPD7前mRNA之间有大约4500个共享靶位点。在生成可药用的分子方面，需要考虑其他参数，如脱靶的数量，与其他物种的保守性以允许在体内进行概念性验证，以及有意义的药代动力学/药效动力学(PK/PD)建模。
本发明的寡核苷酸
本发明鉴定了能够在体外和在体内抑制PAPD5和PAPD7两者表达的新型反义寡核苷酸。这些寡核苷酸与存在于人PAPD5和人PAPD7中长度16至22个核苷酸的三个靶点之一互补。
抑制是通过使反义寡核苷酸与编码PAPD5的靶核酸和编码PAPD7的靶核酸杂交来实现的。应理解的是，相同分子不需要与两个靶标同时杂交来产生效果。
靶核酸1可以是哺乳动物PAPD5序列，如选自SEQ ID NO:1、3和5的序列。
靶核酸2可以是哺乳动物PAPD7序列，如选自SEQ ID NO:2、4和6的序列。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸能够通过抑制或下调靶标来调节靶标1和靶标2的表达。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节产生至少50％的表达抑制，更优选与靶标的正常表达水平相比至少60％、70％、80％、90％、95％或98％的抑制。在一些实施方案中，使用HeLa细胞，本发明的寡核苷酸能够在体外抑制PAPD5和PAPD7mRNA的表达水平至少65％至98％，如70％至95％。此范围的靶标减少在选择与HBV抗原减少(如HBsAg和/或HBeAg减少)具有良好相关性的寡核苷酸方面是有利的。在一些实施方案中，使用HeLa细胞，本发明的化合物能够在体外抑制PAPD5和PAPD7蛋白的表达水平至少50％。材料和方法部分以及本文的实施例部分提供了可用于测量HeLa细胞中靶RNA抑制的测定方法。靶调节由寡核苷酸的连续核苷酸序列(如gapmer区)与靶核酸之间的杂交来触发。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含寡核苷酸或连续核苷酸序列与靶核酸之一或两者之间的错配。尽管存在错配，与靶核酸的杂交仍然可以足以显示出对PAPD5和PAPD7表达的所需调节。由于错配引起的结合亲和力降低，可以通过增加寡核苷酸的长度和/或在寡核苷酸序列中增加能够增加对靶标的结合亲和力的修饰核苷的数量而得到有利的补偿。有利的是，本发明的寡核苷酸含有能够增加结合亲和力的修饰的核苷，如2’糖修饰核苷，包括LNA。
本发明的一个方面涉及长度为12至32个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为12至22个核苷酸、能够抑制PAPD5和PAPD7两者表达的连续核苷酸序列。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的靶核酸或其天然变体至少90％互补，如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、或100％互补的连续序列。
在一个实施方案中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与靶核酸的一个区域完全互补(100％互补)，或在一些实施方案中可以在寡核苷酸和靶核酸之间包含一个或两个错配。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的靶核酸区至少93％互补，如完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的靶核酸至少93％互补，如完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的靶核酸至少93％互补，如完全(或100％)互补。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1上第64669至69429位和SEQ ID NO:2上第29514至29530位100％互补。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1上第64670至64685位和SEQ ID NO:2上第29515至29530位100％互补。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1上第69414至69429位和SEQ ID NO:2上第30731至30746位100％互补。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1上第759至781位和SEQ ID NO:2上第1032至1054位100％互补。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含长度12至32个核苷酸，如14至25个核苷酸、如15至22个核苷酸、如16至20个连续核苷酸，或由其组成。
在一些实施方案中，与靶核酸互补的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列包含长度12至22，如14至20、如16至20、如15至18、如16至18、如16至17个连续核苷酸，或由其组成。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含22个或更少的核苷酸，如20个或更少、如17个或更少的核苷酸，或由其组成。需理解的是，本文中给出的任何范围都包括范围的端点。因此，如果说一个寡核苷酸包括12至32个核苷酸，则12个和32个核苷酸都包括在内。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为12至32个核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自SEQ ID NO:7至16的序列具有至少93％的同一性，优选100％的同一性。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为12至32个核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自SEQ ID NO:17至19的序列具有至少93％的同一性，优选100％的同一性。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为12至32个核苷酸或由其组成，所述核苷酸与选自SEQ ID NO:17或18的序列具有至少93％的同一性，优选100％的同一性。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为12至32个核苷酸或由其组成，所述核苷酸与SEQ ID NO:19的序列具有至少93％的同一性，优选100％的同一性。
在另一个方面，本发明涉及siRNA分子，其中反义链与选自SEQ ID NO:17至19的序列具有至少93％的同一性，优选100％的同一性。
在另一个方面，本发明涉及shRNA分子，其中分子的一个区域与选自SEQ ID NO:17至19的序列具有至少93％的同一性，优选100％的同一性。
应理解的是，连续的核碱基序列(基序序列)可以被修饰以例如增加核酸酶抗性和/或与靶核酸的结合亲和力。
高亲和力修饰的核苷酸被整合到寡核苷酸序列中的模式通常被称为寡核苷酸设计。
本发明的寡核苷酸可以经设计具有修饰的核苷和DNA核苷。有利的是，使用高亲和力修饰的核苷。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含至少1个修饰的核苷，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个修饰的核苷。在一个实施方案中，寡核苷酸包含1至10个修饰的核苷，如2至9个修饰的核苷、如3至8个修饰的核苷、如4至7个修饰的核苷、如6或7个修饰的核苷。在“定义”部分中在“修饰的核苷”、“高亲和力修饰的核苷”、“糖修饰”、“2’糖修饰”和锁核酸(LNA)下描述了合适的修饰。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，如2’糖修饰的核苷。优选地，本发明的寡核苷酸包含一个或多个2’糖修饰的核苷，其独立地选自2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、***糖核酸(ANA)、2’-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁核酸(LNA)，则是有利的。常使用的LNA核苷是氧基-LNA或cET。
在另一个的实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间连接。在“定义”部分中在“修饰的核苷间连接”下描述了合适的核苷间修饰。如果连续核苷酸序列中至少75％(如所有)的核苷间连接是硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)核苷间连接，则是有利的。在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列中的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA核苷，如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA核苷，如2至6个LNA核苷，如3至7个LNA核苷、4至8个LNA核苷或3、4、5、6、7或8个LNA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸中至少75％的修饰核苷是LNA核苷，如80％、如85％、如90％的修饰核苷是LNA核苷。在另一个实施方案中，寡核苷酸中的所有修饰核苷都是LNA核苷。在另一个实施方案中，寡核苷酸可同时包含β-D-氧基-LNA、以及一种或多种以下LNA核苷：硫基-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA、ScET和/或ENA，以β-D或α-L构象或其组合存在。在另一个实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元均为5-甲基胞嘧啶。寡核苷酸或连续核苷酸序列在核苷酸序列的5’末端具有至少1个LNA核苷和在3’末端具有至少2个LNA核苷，对其核酸酶稳定性是有利的。
在本发明的一个实施方案中，本发明的寡核苷酸能够招募RNase H。
在本发明中，一种有利的结构设计是gapmer设计，其描述于“定义”部分中“gapmer”,“LNA gapmer”,“MOE gapmer”和“混合翼gapmer”“交替侧翼gapmer”下。gapmer设计包括具有一致侧翼、混合翼侧翼、交替侧翼和gap断裂子设计的gapmer。在本发明中，如果本发明的寡核苷酸是具有F-G-F’设计的gapmer，则是有利的。除了定义部分中描述的F-G-F’设计外，一种设计可以是其中F和F′翼区独立地包含1至8个2’糖修饰的核苷、且G是能够招募RNase H的5至16个核苷的gap区。
在一些实施方案中，gapmer是具有一致侧翼或具有交替侧翼的LNA gapmer。
在本发明的一些实施方案中，LNA gapmer选自以下一致侧翼设计：2-11-3、2-11-4、2-12-2、2-12-3、2-13-2、2-9-6、3-10-3、3-10-4、3-11-2、3-11-3、3-12-2、3-9-4、4-10-2、4-10-3、4-11-2、4-7-5、4-8-4、4-9-3、5-10-2、5-6-5、5-7-4、5-7-5、5-8-3、5-8-4、5-9-2或6-9-2。
在本发明的一些实施方案中，LNA gapmer选自以下交替侧翼设计：4-7-1-1-3、4-9-1-1-2、1-1-3-7-1-1-2、1-1-3-9-2、2-1-1-9-2、2-1-1-9-3。
表5和7(材料与方法部分)列出了每个基序序列的优选设计。
在所有情况下，F-G-F’设计可以进一步包括如“定义”部分中“核苷酸中的D’或D”区”下描述的D’和/或D”区。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸在gapmer区的5’或3’末端具有1、2或3个磷酸二酯连接的核苷单元，如DNA单元。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸由两个5’磷酸二酯连接的DNA核苷接着如“定义”部分中描述的F-G-F’gapmer区组成。除了定义部分中描述的D’-F-G-F’-D”设计外，一种设计可以是反义寡核苷酸，其中a)F区的长度在1至6个核苷酸之间，由2至5个相同的LNA核苷(如β-D-氧基LNA或cET)和0至3个DNA核苷组成；和b)F’区的长度在2至6个核苷酸之间，由2至5个相同的LNA核苷(如β-D-氧基LNA或cET)和0至3个DNA核苷组成；和c)G区由5至11个、如7至10个DNA核苷酸组成和d)可选地D’区由1至3个磷酸二酯连接的DNA核苷组成。在5’或3’末端含有磷酸二酯连接的DNA单元的寡核苷酸适合进行缀合，并可以进一步包含如本文所述的缀合物部分。ASGPR靶向部分作为缀合物部分对于递送至肝脏特别有利，更多详细信息参见以下“缀合物”部分。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP ID NO:7_1至7_83的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:8_1至8_81的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:9_1至9_12的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:10_1至10_18的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:11_1至11_26的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:12_1至12_15的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:13_1或13_2的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:14_1至14_13的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:15_1至15_21的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:16_1至16_5的寡核苷酸化合物(见表5中所列寡核苷酸)。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:17_1至17_183的寡核苷酸化合物(见表7中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:18_1至18_31或18_250至18_361的寡核苷酸化合物(见表7中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:18_32至18_249或18_362至18_610的寡核苷酸化合物(见表7中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自CMP-ID-NO:19_1至19_22的寡核苷酸化合物(见表7中所列寡核苷酸)，或其可药用的盐。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:18_1、18_5、18_10、18_15、18_18、18_19、18_24、18_27、18_30、18_346、18_347、18_357、17_10、17_137和17_139化合物的寡核苷酸。
对于本发明的某些实施方案，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:18_1、18_15、18_30、17_10、17_137和17_139化合物的寡核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，寡核苷酸可以包含至少一个立体限定的核苷间连接，如立体限定的硫代磷酸酯核苷间连接。
产生立体限定的寡核苷酸变体的一个关键优势是，能够增加序列基序的多样性、并选择立体限定的寡核苷酸，包括立体限定寡核苷酸的子文库，其与亲本寡核苷酸相比，具有改进的药用化学特性。
在一些实施方案中，改进的药用化学特性(或改进的特性)选自以下一个或多个特征：增强的效力、增强的特异活性、增强的组织摄取、增强的细胞摄取、增强的功效、改变的生物分布、降低的脱靶效应、增强的错配区分、降低的毒性、降低的免疫原性、改变的血清蛋白结合、提高的作用持续时间、和稳定性。与亲本寡核苷酸(如立体随机的亲本寡核苷酸)相比较来评估一个或多个特性上的改进。
在一些实施方案中，改进的特性可以是寡核苷酸(如通过增强和参与调节靶标表达的细胞机器的相互作用来)调节靶标表达的能力，例如增强的RNaseH活性，改进的剪接调节活性，或增强的microRNA抑制。
在一些实施方案中，改进的特性为RNaseH特异性、RNaseH等位基因识别(即识别单核苷酸多态性(SNP))和/或RNaseH活性。在一些实施方案中，改进的特性不是RNaseH特异性、RNaseH等位基因识别和/或RNaseH活性。在一些实施方案中，改进的特性是提高的细胞内摄取。在一些实施方案中，改进的特性是降低的毒性(如细胞毒性或肝毒性)。
与亲本寡核苷酸或其他立体限定的寡核苷酸相比，表现出一个或多个改进特性的立体限定的寡核苷酸被称为改进的硫代磷酸酯变体。
在本发明的实施方案中，寡核苷酸选自具有CMP-ID-NO:18_223、18_36、18_196、18_188、18_243的化合物的寡核苷酸。
在本发明的另一个方面，可以通过将本发明的核酸分子(如反义寡核苷酸)共价连接在能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)结合的缀合物部分(如二价或三价GalNAc簇)上，直接靶向肝脏。
缀合物
由于HBV感染主要影响肝脏中的肝细胞，将本发明的反义寡核苷酸与缀合物部分进行缀合是有利的，与未缀合的寡核苷酸相比，这将增加寡核苷酸向肝脏的递送。在一个实施方案中，肝脏靶向部分选自包含胆固醇或其他脂质的部分、或能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的缀合物部分。
在一些实施方案中，本发明提供了缀合物，其包含与缀合物部分共价连接的本发明的反义寡核苷酸。
脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)缀合物部分包含一个或多个能够以等于或大于半乳糖的亲和力与脱唾液酸糖蛋白受体结合的糖部分(ASPGR靶向部分)。已经研究(参见例如：Jobst,S.T.and Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)，或可以使用本领域常见的方法容易地测定，许多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力。
在一个实施方案中，缀合物部分包含至少一个脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分，其选自半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺和N-异丁酰半乳糖胺。有利的是，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
为了产生ASGPR缀合物部分，可以将ASPGR靶向部分(优选GalNAc)连接到缀合物基架(scaffold)上。通常，ASPGR靶向部分可以位于基架的同一端。在一个实施方案中，缀合物部分由两至四个与间隔子相连的末端GalNAc部分组成，所述间隔子将每个GalNAc部分与可和反义寡核苷酸缀合的分支分子连接起来。
在另一个的实施方案中，缀合物部分在脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分方面是单价、二价、三价或四价的。有利的是，脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分包含N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
组成缀合物部分的ASPGR靶向基架可以例如通过将GalNAc部分以其C-l碳与间隔子连接来产生。优选的间隔子是柔性亲水间隔子(美国专利5885968；Biessen等人,J.Med.Chern.1995第39卷第1538-1546页)。优选的柔性亲水间隔子是PEG间隔子。优选的PEG间隔子是PEG3间隔子。分支点可以是任何这样的小分子，其允许二或三个GalNAc部分或其他脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分的附着，并进一步允许分支点与寡核苷酸连接，这样的结构被称为GalNAc簇或GalNAc缀合物部分。示例性分支点基团是双-赖氨酸。双-赖氨酸分子含有三个胺基团(通过它们可以连接三个GalNAc部分或其他脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分)和一个羧基反应基团(通过它可以将双-赖氨酸与寡聚体连接)。Khorev,等人,2008Bioorg.Med.Chem.第16卷,第5216页中也描述了合适的三价分支分子的合成。其他可商业获取的分支分子有1,3-双-[5-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)戊基酰氨基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]磷酰亚胺(Glen Research目录号：10-1920-xx)；三-2,2,2-[3-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-磷酰亚胺(Glen Research目录号：10-1922-xx)；三-2,2,2-[3-(4,4′-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧甲基]亚甲氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-磷酰亚胺；和1-[5-(4,4′-二甲氧基-三苯甲氧基)戊基酰氨基]-3-[5-芴甲氧基-羰基-氧基-戊基酰氨基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-磷酰亚胺(Glen Research目录号：10-1925-xx)。
其他GalNAc缀合物部分可以包括例如WO 2014/179620、WO2016/055601和PCT/EP2017/059080(通过引用并入本文)中描述的那些，以及连接有GalNAc部分的小肽如Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3；与肝细胞上脱唾液酸糖蛋白受体结合的糖三肽，参见例如Duff等人,Methods Enzymol,2000,313,297)；基于赖氨酸的半乳糖簇(例如，L3G4；Biessen等人,Cardovasc.Med.,1999,214)；和基于胆烷的半乳糖簇(例如，脱唾液酸糖蛋白受体的糖识别基序)。
可以使用本领域已知的方法，将ASGPR缀合物部分，特别是三价GalNAc缀合物部分，连接到寡核苷酸的3’或5’末端。在一个实施方案中，ASGPR缀合物部分与寡核苷酸的5’端连接。
可以在缀合物部分(如在分支分子处)和寡核苷酸之间***一个或多个接头。在缀合物部分和反义寡核苷酸之间具有可生物裂解的接头，可选地与不可裂解的接头(如C6接头)结合使用，是有利的。接头可以选自“定义”部分中“缀合物接头”下描述的接头，特别地，可生物裂解的D’或D”区接头是有利的。
在一个实施方案中，缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，如图1所示、特别是图1D所示的那些。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物选自材料与方法部分表9中的化合物。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO:20_12。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_13。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_14。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_15。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_16。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_18。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_20。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_21。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_22。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_30。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_35。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 20_36。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 21_2。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 21_33。
在本发明的一个实施方案中，缀合化合物是CMP-ID-NO 21_34。
制造方法
在另一个方面，本发明提供用于制造本发明的反义寡核苷酸的方法，所述方法包括使核苷酸单元反应并由此形成包含于寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单位。优选地，该方法使用磷酰亚胺化学(参见例如Caruthers等人,1987,Methods in Enzymology第154卷,第287-313页)。在另一个实施方案中，该方法还包括使连续核苷酸序列与缀合部分(配体)反应以将缀合物部分与寡核苷酸共价连接。在另一个方面，提供了用于制造本发明组合物的方法，所述方法包括将本发明的寡核苷酸或缀合的寡核苷酸与可药用的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或辅助剂混合。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸和/或缀合化合物(或它们的盐)和可药用的稀释剂、载体、盐和/或辅助剂。典型的药物组合物通过将本发明的反义寡核苷酸或缀合化合物与稀释剂、载体或赋形剂进行混合来制备。
可药用的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，可药用的稀释剂是无菌的磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，寡核苷酸以50-300μM溶液的浓度用于可药用的稀释剂中。
对于核酸分子，反义寡核苷酸和包含这些的缀合化合物，合适制剂可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版,1985。关于药物递送方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249:1527-1533,1990)。WO 2007/031091进一步提供了可药用稀释剂、载体和辅助剂的合适和优选的实例(通过引用并入本文)。WO 2007/031091中还提供了合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂。
根据本发明的化合物可以以其可药用盐的形式存在。术语“可药用盐”是指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留本发明化合物的生物有效性和性质，并且可以由合适的无毒有机酸或无机酸或有机或无机碱形成。酸加成盐包括例如衍生自无机酸的那些，该无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸(sulfamic acid)、磷酸和硝酸；以及衍生自有机酸的那些，该有机酸例如对甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸等。碱加成盐包括衍生自铵、钾、钠和季铵氢氧化物例如氢氧化四甲基铵的那些。将药物化合物化学修饰成盐以获得改善的化合物的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性，是药物化学家熟知的技术。其例如描述于Bastin,Organic Process Research&Development 2000,4,427-435中，或Ansel,In:Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,第6版(1995),第196和1456-1457页中。例如，本文提供的化合物的可药用盐可以是钠盐或钾盐。
应用
本发明的寡核苷酸可用作研究试剂，例如用于诊断、治疗和预防。
在研究中，这种寡核苷酸可用于特异地调节细胞(如体外细胞培养物)和实验动物中PAPD5和PAPD7蛋白的合成，从而促进对靶标的功能分析或评估其作为治疗干预靶标的有用性。通常，靶标调节是通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA来实现的，从而防止蛋白质的形成，或者通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA的调节物来实现。
如果在研究或诊断中采用本发明的寡核苷酸，则靶核酸可以是源自DNA或RNA的cDNA或合成的核酸。
本发明还涵盖体内或体外方法，用于在表达PAPD5和PAPD7的靶细胞中调节PAPD5和PAPD7表达，所述方法包括对所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物。
在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞，特别是人细胞。靶细胞可以是体外细胞培养物或构成哺乳动物组织部分的体内细胞。在优选实施方案中，靶细胞存在于肝脏中。靶细胞可以是肝细胞。
本发明的一个方面涉及本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物用作药物。
在本发明的一个方面，本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物能够抑制HBV的增殖。特别是反义寡核苷酸能够影响以下一个或多个参数：i)降低病毒RNA的表达；ii)减少从病毒RNA(HBV RNA)产生病毒DNA(HBV DNA)；iii)减少新病毒颗粒(HBV颗粒)的产生；iv)减少HBV抗原，特别是HBsAg和/或HBeAg的产生。
例如，抑制HBV增殖的反义寡核苷酸可以i)与对照相比，使病毒RNA(HBV RNA)的表达减少至少40％，如50％、60％、70％、80％或90％；ii)与对照相比，使病毒DNA(HBV DNA)的产生减少至少40％，如50％、60％、70％、80％或90％；iii)与对照相比，使新病毒颗粒(HBV颗粒)的产生减少至少40％，如50％、60％、70％、80％或90％；或iv)与对照相比，使HBsAg和/或HBeAg的产生和/或分泌减少至少50％，例如至少60％、70％、80％、90％或甚至达到该一种或两种抗原的完全消除。对照可以是未经处理的细胞或动物、或经合适的对照处理的细胞或动物。
可以使用HBV感染的dHepaRG细胞或ASGPR-dHepaRG细胞在体外测量HBV增殖的抑制，或者使用“材料与方法”部分所述的AAV/HBV小鼠模型，针对与小鼠PAPD5和PAPD7互补的寡核苷酸，在体内测量HBV增殖的抑制。可以通过ELISA，例如，根据制造商的说明书使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic)，测量HBsAg和/或HBeAg分泌的抑制。可以通过实时PCR测量细胞内HBV mRNA产生的抑制，例如，如“材料与方法”部分所述。用于评估测试化合物是否抑制HBV增殖的其他方法是通过RT-qPCR测量HBV DNA的分泌，例如，如WO2015/173208中所述或如“材料与方法”部分所述；Northern印迹；原位杂交或免疫荧光。
由于HBsAg分泌的减少，本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物可用于抑制HBV感染的发展或治疗HBV感染。特别是，由于抑制HBsAg分泌，本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物与仅减少HBsAg分泌的化合物相比，更有效地抑制慢性HBV感染的发展或治疗慢性HBV感染。此外，减少孕妇中HBeAg也可以抑制她的孩子中慢性HBV感染的发展。因此，由于减少HBeAg分泌，本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物可以抑制慢性HBV感染的发展(如在HBV感染母亲的后代中慢性HBV感染的发展)，和降低HBV感染者的传染性。
因此，本发明的一个方面涉及使用本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物减少HBV感染个体中HBsAg和HBeAg的分泌。本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物能够减少整合到宿主基因组中的HBV DNA表达HBsAg，将有利的是。
本发明的另一个方面涉及使用本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物来治疗慢性HBV感染或抑制其发展。
本发明的另一个方面涉及使用本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物减少HBV感染者的传染性。在本发明的特定方面，本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物抑制受感染母亲的后代中慢性HBV感染的发展。该母亲优选是HBeAg阳性的。
待用本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物治疗(或预防性接受本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物)的受试者优选是人，更优选为HBsAg阳性和/或HBeAg阳性的人患者，更优选为HBsAg阳性和HBeAg阳性的人患者。所述人患者可以是孕妇，例如HBeAg阳性和/或HBsAg阳性的孕妇，更优选HBeAg阳性和HBsAg阳性的孕妇。
因此，本发明涉及治疗和/或预防HBV感染的方法，其中该方法包括施用有效量的本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物。
本发明还提供了使用本发明的核酸分子、反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物制造药物，特别是用于治疗或预防HBV感染或慢性HBV感染，或降低HBV感染者传染性的药物。在优选实施方案中，药物以皮下施用剂型制造。
本发明还提供了使用本发明的核酸分子、反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物制造药物的用途，其中药物为静脉内施用剂型。
本发明的核酸分子、反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物可以用于组合疗法。例如，本发明的核酸分子、反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物可以与其他抗HBV药剂组合，所述其他HBV药剂如干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林(ribavirin,)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、恩替卡韦(entecavir)、替诺福韦(tenofovir)、替比夫定(telbivudine，LdT)、阿德福韦(adefovir)或其他新兴抗HBV药剂，如HBV RNA复制抑制剂、HBsAg分泌抑制剂、HBV衣壳抑制剂、反义寡聚物(例如，如WO2012/145697和WO 2014/179629中所描述)、siRNA(例如，WO 2005/014806、WO 2012/024170、WO 2012/2055362、WO 2013/003520、WO 2013/159109、WO 2017/027350和WO2017/015175中所描述)、HBV治疗性疫苗、HBV预防性疫苗、HBV抗体疗法(单克隆或多克隆)，或用于治疗和/或预防HBV的TLR2、3、7、8或9激动剂。
施用
本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在此考虑的因素包括所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、药剂的递送部位、施用方法、施用方案、患者的年龄和性别、以及执业医师已知的其他因素。本文中，“有效量”(也称为“(治疗)有效剂量”)是指，将引起医师或其他临床医生正在寻求的受试者生物或医学反应的化合物的量。本发明的反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物的“有效量”将取决于这些考虑因素，并且是抑制HBsAg和/或HBeAg所需的最小量。例如，这样的量可以低于对受者的细胞或对整个哺乳动物有毒的量。
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物、或药物组合物以0.1至15毫克/千克，如0.2至10毫克/千克、如0.25至5毫克/千克的剂量施用。施用可以是每周一次，每两周一次，每三周一次，甚至每月一次。
本发明的核酸分子或药物组合物可以局部(如至皮肤、吸入、眼或耳)施用或肠内(如口服或通过胃肠道)施用或肠胃外(如静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内或鞘内)施用。
在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子、反义寡核苷酸、缀合化合物或药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注。在一个实施方案中，静脉内施用活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物。在另一个实施方案中，皮下施用GalNAc缀合的化合物，可能有利于延迟ASGP受体的饱和。
组合治疗
在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物用于与其他治疗剂组合治疗。治疗剂可以是例如上述疾病或病症的标准护理。
例如，本发明的寡聚物或寡聚物缀合物可以与其他活性物质组合使用，所述其他活性物质如基于寡核苷酸的抗病毒药，如序列特异性的基于寡核苷酸的抗病毒药，其通过反义(包括其他LNA寡聚物)、siRNA(如ARC520)、核酸适配体、吗啉核酸、或任何其他抗病毒的、核苷酸序列依赖性作用模式来发挥作用。
另外例如，本发明的寡聚物或寡聚物缀合物可以与其他活性物质组合使用，所述其他活性物质如免疫刺激性抗病毒化合物，如干扰素(例如PEG化干扰素α)、TLR7激动剂(例如GS-9620)或治疗性疫苗。
另外例如，本发明的寡聚物或寡聚物缀合物可以与其他活性物质组合使用，所述其他活性物质如具有抗病毒活性的小分子。这些其他活性物质可以是例如核苷/核苷酸抑制剂(例如，恩替卡韦(entecavir)或富马酸替诺福韦二吡呋酯(ttenofovir disoproxilfumarate))、衣壳化抑制剂、进入抑制剂(例如，Myrcludex B)。
在某些实施方案中，额外的治疗剂可以是HBV剂、丙型肝炎病毒(HCV)剂、化疗剂、抗生素、镇痛剂、非甾体抗炎(NSAID)剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗呕吐剂、抗腹泻剂或免疫抑制剂。
在特定的相关实施方案中，额外的HBV剂可以是干扰素α-2b、干扰素α-2a和干扰素alphacon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)、利巴韦林(ribavirin)；HBV RNA复制抑制剂；第二反义寡聚体；HBV治疗性疫苗；HBV预防性疫苗；拉米夫定(lamivudine)(3TC)；恩替卡韦(entecavir)(ETV)；富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)；替比夫定(telbivudine)(LdT)；阿德福韦(adefovir)；或HBV抗体治疗剂(单克隆或多克隆)。
在其他特定的相关实施方案中，额外的HCV剂可以是干扰素α-2b、干扰素α-2a、和干扰素alphacon-1(聚乙二醇化和非聚乙二醇化)；利巴韦林(ribavirin)；派罗欣(pegasys)、HCV RNA复制抑制剂(例如，ViroPharma′s VP50406系列)；HCV反义剂；HCV治疗性疫苗；HCV蛋白酶抑制剂；HCV解旋酶抑制剂；或HCV单克隆或多克隆抗体治疗剂。
本发明的实施方案
本发明的以下实施方案可与本文描述的任何其他实施方案组合使用。
1.长度为12至32个核苷酸的核酸分子，其包含长度为12至22个核苷酸的连续核苷酸序列，能够抑制PAPD5和PAPD7两者的表达。
2.实施方案1的核酸分子，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的靶核酸至少93％互补。
3.实施方案1或2的核酸分子，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的靶核酸至少100％互补。
4.实施方案1或3的核酸分子，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的靶核酸互补。
5.实施方案1或3的核酸分子，其中连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的靶核酸互补。
6.实施方案1至3或5的核酸分子，其中核酸分子与SEQ ID NO:1上的第759至781位和SEQ ID NO:2上的第1032至1054位互补。
7.实施方案1至4的核酸分子，其中核酸分子与SEQ ID NO:1上的第64669至69429位和SEQ ID NO:2上的第29514至29530位互补。
8.实施方案1至4的核酸分子，其中核酸分子与SEQ ID NO:1上的第69414至69429位和SEQ ID NO:2上的第30731至30746位互补。
9.实施方案1至8的核酸分子，其能够以低于-15kcal的ΔG°与SEQ ID NO:1和SEQID NO:2的靶核酸杂交。
10.实施方案2至9的核酸分子，其中靶核酸是RNA。
11.实施方案10的核酸分子，其中RNA是前mRNA。
12.实施方案1至11的核酸分子，其中核酸分子选自反义寡核苷酸、siRNA或shRNA。
13.实施方案1至11的核酸分子，其中核酸分子是单链反义寡核苷酸。
14.实施方案12或13的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列包含至少14个连续核苷酸(特别是15、16、17、18、19或20个连续核苷酸)或由其组成。
15.实施方案12或13的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列包含14至20个核苷酸或由其组成。
16.实施方案15的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列包含16至18个核苷酸或由其组成。
17.实施方案1至16的反义寡核苷酸，其中寡核苷酸包含长度为14至25个核苷酸或由其组成。
18.实施方案17的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含长度为15至22个核苷酸或由其组成。
19.实施方案17或18的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含长度为16至20个核苷酸或由其组成。
20.实施方案12至19的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19的序列或由其组成。
21.实施方案12至20的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14、15和16的序列或由其组成。
22.实施方案12至20的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列或由其组成。
23.实施方案12至20的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列包含SEQ ID NO:19或由其组成。
24.实施方案12至23的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与和其互补的靶核酸相比，具有0至3个错配。
25.实施方案24的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与靶核酸相比，具有1个错配。
26.实施方案24的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与靶核酸相比，具有2个错配。
27.实施方案24的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列与两个靶核酸序列均完全互补。
28.实施方案12至27的反义寡核苷酸，其包含一个或多个修饰的核苷。
29.实施方案28的反义寡核苷酸，其中一个或多个修饰的核苷是高亲和力修饰的核苷。
30.实施方案28或29的反义寡核苷酸，其中一个或多个修饰的核苷是2’糖修饰的核苷。
31.实施方案30的反义寡核苷酸，其中一个或多个2’糖修饰的核苷独立地选自2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-DNA、2’-氟-ANA和LNA核苷。
32.实施方案28至31的反义寡核苷酸，其中一个或多个修饰的核苷是LNA核苷。
33.实施方案32的反义寡核苷酸，其中修饰的LNA核苷选自氧基-LNA、氨基-LNA、硫基-LNA、cET和ENA。
34.实施方案32或33的反义寡核苷酸，其中修饰的LNA核苷是具有以下2’-4’桥-O-CH2-的氧基-LNA。
35.实施方案34的反义寡核苷酸，其中氧基-LNA是β-D-氧基-LNA。
36.实施方案32或33的反义寡核苷酸，其中修饰的LNA核苷是具有以下2’-4’桥-O-CH(CH3)-的cET。
37.实施方案36的反义寡核苷酸，其中cET是(S)cET，即6’(S)甲基-β-D-氧基-LNA。
38.实施方案32或33的反义寡核苷酸，其中LNA是具有以下2’-4’桥-O-CH2-CH2-的ENA。
39.实施方案12至33之任一的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间连接。
40.实施方案39的反义寡核苷酸，其中修饰的核苷间连接具有核酸酶抗性。
41.实施方案39或40的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列中至少75％的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接或硼烷磷酸酯核苷间连接。
42.实施方案39或40的反义寡核苷酸，其中连续核苷酸序列中所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
43.实施方案41或42的反义寡核苷酸，其中至少一个硫代磷酸酯核苷间连接是立体限定的。
44.实施方案12至43的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸能够招募RNase H。
45.实施方案44的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸或连续核苷酸序列是gapmer。
46.实施方案45的反义寡核苷酸，其中gapmer具有结构式5’-F-G-F’-3’，其中F和F’翼区独立地包含1至7个根据实施方案31至38的2’糖修饰核苷或由其组成，且G为能够招募RNaseH的5至16个核苷的区域。
47.实施方案46的反义寡核苷酸，其中每个翼(F和F’)的特征是在翼的5’端和3’端具有至少一个2’糖修饰核苷，且G区在邻近翼区处(例如G区的5’和3’端)具有至少一个DNA核苷。
48.实施方案46或47的反义寡核苷酸，其中F和F’区中所有2’糖修饰核苷都是相同的LNA核苷。
49.实施方案46至48的寡核苷酸，其中
a)F区的长度在1至6个核苷酸之间，由1至5个相同的LNA核苷和0至3个DNA核苷组成；和
b)F’区的长度在2至6个核苷酸之间，由2至5个相同的LNA核苷和0至3个DNA核苷组成；和
c)G区为能够招募RNaseH的5至11个核苷酸，和
d)可选地D’区具有1至3个磷酸二酯连接的DNA核苷，所述DNA核苷位于F区的5’末端。
50.实施方案47的反义寡核苷酸，其中F和F’区由相同的LNA核苷组成。
51.实施方案46至48的反义寡核苷酸，其中F和F’区中所有2’糖修饰核苷均为氧基-LNA核苷。
52.实施方案46或47的反义寡核苷酸，其中F和F’区的至少之一还包含至少一个2’取代的修饰核苷，所述修饰核苷独立地选自2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧基乙基-RNA、2’-氨基-DNA和2’-氟-DNA。
53.实施方案46至52的反义寡核苷酸，其中G区的RNaseH招募核苷独立地选自DNA、α-L-LNA、C4’烷基化DNA、ANA和2′F-ANA和UNA。
54.实施方案53的反义寡核苷酸，其中G区中的核苷是DNA和/或α-L-LNA核苷。
55.实施方案46或53或54的反义寡核苷酸，其中G区由至少75％的DNA核苷组成。
56.实施方案55的反义寡核苷酸，其中G区中所有核苷均为DNA核苷。
57.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:7_1至7_83，或其可药用盐。
58.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:8_1至8_81，或其可药用盐。
59.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:9_1至9_12，或其可药用盐。
60.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:10_1至10_18，或其可药用盐。
61.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:11_1至11_26，或其可药用盐。
62.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:12_1至12_15，或其可药用盐。
63.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:13_1或13_2，或其可药用盐。
64.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:14_1至14_13，或其可药用盐。
65.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:15_1至15_21，或其可药用盐。
66.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:16_1至16_5，或其可药用盐。
67.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:17_1至17_183，或其可药用盐。
68.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:18_1至18_31或18_250至18_361，或其可药用盐。
69.实施方案68的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:18_1、18_5、18_10、18_15、18_18、18_19、18_24、18_27、18_30、18_346、18_347、18_357、17_10、17_137和17_139，或其可药用盐。
70.实施方案69的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:18_1、18_15、18_27、18_30、17_10、17_137和17_139。
71.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:18_32至18_249或18_362至18_610，或其可药用盐。
72.实施方案71的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:18_223、18_36、18_196、18_188和18_243。
73.实施方案12至55的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自CMP ID NO:19_1至19_22，或其可药用盐。
74.缀合化合物，其包含根据实施方案1至11之任一的核酸分子或根据实施方案12至57之任一的反义寡核苷酸，且至少一个缀合物部分与所述反义寡核苷酸共价连接。
75.实施方案74的缀合化合物，其中缀合物部分选自糖类、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素、维生素、病毒蛋白或其组合。
76.实施方案74或75的缀合化合物，其中缀合物部分能够与脱唾液酸糖蛋白受体结合。
77.实施方案76的缀合化合物，其中缀合物部分包含至少一个选自半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰半乳糖胺、N-正丁酰半乳糖胺和N-异丁酰半乳糖胺的脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分。
78.实施方案77的缀合化合物，其中脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
79.实施方案77或78的缀合化合物，其中缀合物部分在脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分方面是单价、二价、三价或四价的。
80.实施方案79的缀合化合物，其中缀合物部分由2至4个末端GalNAc部分和间隔子(spacer)组成，所述间隔子将每个GalNAc部分与分支分子连接，所述分支分子能够缀合到反义化合物。
81.实施方案80的缀合化合物，其中间隔子是PEG间隔子。
82.实施方案76至81的缀合化合物，其中缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
83.实施方案76至82的缀合化合物，其中缀合物部分选自图1中的三价GalNAc部分之一。
84.实施方案83的缀合化合物，其中缀合物部分是图1D中的三价GalNAc部分。
85.实施方案74至84的缀合化合物，其包含接头，所述接头位于核酸分子或反义寡核苷酸和缀合物部分之间。
86.实施方案85的缀合化合物，其中接头是生理学不稳定的接头。
87.实施方案86的缀合化合物，其中生理学不稳定的接头是核酸酶敏感的接头。
88.实施方案86或87的寡核苷酸缀合物，其中生理学不稳定的接头由2至5个连续的磷酸二酯连接组成。
89.实施方案86至88的缀合化合物，其中反义寡核苷酸具有结构式D’-F-G-F’或F-G-F’-D”，其中F、F’和G如实施方案46至56中定义，且D’或D”包含具有磷酸二酯核苷间连接的1、2或3个DNA核苷。
90.实施方案88或89的寡核苷酸缀合物，其中至少两个连续的磷酸二酯核苷间连接与CA二核苷酸相关。
91.实施方案76至90的缀合化合物，其中相较于未缀合的核酸分子或反义寡核苷酸，缀合化合物显示在肝脏和肾脏之间改善的细胞分布或肝脏中增进的细胞摄入。
92.实施方案76至91的缀合化合物，其中缀合化合物选自CPM ID NO 20_12、20_13、20_14、20_15、20_16、20_18、20_20、20_21、20_22、20_30、20_35、20_36、21_2、21_33和21_34。
93.药物组合物，其包含根据实施方案1至11之任一的核酸分子、实施方案12至73的反义寡核苷酸、实施方案74至92的缀合化合物或其可用盐，以及药用稀释剂、载体、盐和/或辅助剂。
94.用于制造实施方案12至73的反义寡核苷酸的方法，其包括使核苷酸单元反应由此形成包含于反义寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。
95.实施方案94的方法，其进一步包括使连续核苷酸序列与实施方案76至84之任一中描述的非核苷酸缀合物部分反应。
96.用于制造实施方案93的组合物的方法，其包括将反义寡核苷酸与药用稀释剂、载体、盐和/或辅助剂混合。
97.用于在表达PAPD5和PAPD7的靶细胞中调节PAPD5和PAPD7表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的实施方案1至11之任一的核酸分子，实施方案12至73之任一的反义寡核苷酸，实施方案74至92之任一的缀合化合物或实施方案93的药物组合物。
98.实施方案97的方法，其中相较于无任何处理的水平，靶细胞中PAPD5和PAPD7的表达降低了至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％。
99.用于治疗或预防疾病的方法，其包括向患有该疾病或对该疾病易感的受试者施用治疗上或预防上有效量的实施方案1至11之任一的核酸分子、实施方案12至73之任一的反义寡核苷酸、实施方案74至92之任一的缀合化合物或实施方案93的药物组合物。
100.实施方案1至11之任一的核酸分子、实施方案12至57之任一的反义寡核苷酸、实施方案74至92之任一的缀合化合物或实施方案93的药物组合物用作治疗或预防受试者疾病的药物。
101.实施方案1至11之任一的核酸分子、实施方案12至73之任一的反义寡核苷酸、实施方案74至92之任一的缀合化合物在制备用于治疗或预防受试者疾病的药物的用途。
102.实施方案99至101的方法、核酸分子或用途，其中疾病是HBV感染或慢性HBV感染。
103.实施方案102的方法、核酸分子或用途，其中HBsAg和/或HBeAg的分泌和/或细胞内HBV mRNA和/或HBV DNA得以减少。
104.实施方案102或103的方法、核酸分子或用途，其中相较于无任何处理的水平，HBsAg减少了至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少95％。
105.实施方案99至104的方法、反义寡核苷酸或用途，其中受试者是哺乳动物。
106.实施方案105的方法、反义寡核苷酸或用途，其中哺乳动物是人。
实施例
实施例举例说明本发明。
材料和方法
寡核苷酸基序序列和寡核苷酸化合物
表4：靶向人和小鼠转录本的寡核苷酸基序序列列表
序列由SEQ ID NO、基序序列以及其靶向的人PAPD5转录本(SEQ ID NO:1)和人PAPD7转录本(SEQ ID NO:2)上的位置表示。
基序序列代表寡核苷酸中存在的核碱基的连续序列。
表5.寡核苷酸设计和特定反义寡核苷酸化合物列表
化合物以CMP ID NO表示，并基于表4中的基序序列。
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设计是指gapmer设计，F-G-F’。在经典的gapmer设计例如3-10-3中，侧翼(F和F′)中的所有核苷酸都由相同的2’糖修饰核苷(例如LNA、cET或MOE)构成，中间的一段DNA形成gap(G)。在具有交替侧翼设计的gapmer中，寡核苷酸的侧翼被注释为一系列整数，其表示若干2’糖修饰核苷(M)后接若干DNA核苷(D)。例如，具有2-2-1基序的侧翼表示5’[M]2-[D]2-[M]3’，1-1-1-1-1基序表示5’[M]-[D]-[M]-[D]-[M]3’。两个侧翼在5′和3′端都有2’修饰核苷。gap区(G)由多个DNA核苷(通常在5和16个之间)构成，位于侧翼之间。
表中的标题“寡核苷酸化合物”表示基序序列的特定设计。大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，而5-甲基胞嘧啶DNA以“e”代表，所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。
表6：靶向人和cyno的寡核苷酸基序序列列表
序列以SEQ ID NO、基序序列(核碱基序列)以及其靶向的人PAPD5转录本(SEQ IDNO:1)和人PAPD7转录本(SEQ ID NO:2)上的位置表示。
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基序序列代表寡核苷酸中存在的核碱基的连续序列。
表7.寡核苷酸设计和特定反义寡核苷酸化合物列表
化合物以CMP ID NO表示，并基于表6中的基序序列。
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设计是指gapmer设计，F-G-F’。在经典的gapmer设计例如3-10-3中，侧翼(F和F′)中的所有核苷酸都由相同的2’糖修饰核苷(例如LNA、cET或MOE)构成，中间的一段DNA形成gap(G)。在具有交替侧翼设计的gapmer中，寡核苷酸的侧翼被注释为一系列整数，其表示若干2’糖修饰核苷(M)后接若干DNA核苷(D)。例如，具有2-2-1基序的侧翼表示5’[M]2-[D]2-[M]3’，1-1-1-1-1基序表示5’[M]-[D]-[M]-[D]-[M]3’。两个侧翼在5′和3′端都有2’修饰核苷。gap区(G)由多个DNA核苷(通常在5和16个之间)构成，位于侧翼之间。
表中的标题“寡核苷酸化合物”表示基序序列的特定设计。大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，而5-甲基胞嘧啶DNA以“e”代表，所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。
表8：立体限定的变体列表。
亲本寡核苷酸化合物以其序列基序和设计表示。亲本化合物的核苷间连接的立体定义基序在序列和设计下方指出，并且反映完全立体随机的硫代磷酸酯gapmer。亲本的立体限定变体以CMP ID NO和亲本化合物下方的立体限定基序列出。该表包含三个亲本化合物CMP ID NO:18_1、18_347和18_12。
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关于亲本寡核苷酸CMP：大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，所有核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
关于立体定义/立体限定的基序：X表示立体随机的硫代磷酸酯核苷间连接，如描述中定义的，R表示一种立体异构体形式且S表示另一种立体异构体形式，H表示寡核苷酸3’端的的氢原子。立体限定的基序中第一个字母(X、R或S)对应于自寡核苷酸的5’末端起的核苷1和2之间的核苷间连接。
表9：具有5’ca可生物裂解接头的寡核苷酸基序序列和反义化合物。
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C6代表含有6个碳的氨基烷基基团，大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，所有LNA C均为5甲基胞嘧啶，下标o代表硫代磷酸二酯核苷间连接，且除非另有说明，其他核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
表10：GalNAc缀合的反义寡核苷酸化合物
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GN2代表图2中所示的三价GalNAc簇，C6代表含有6个碳的氨基烷基基团，大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母代表DNA核苷，所有LNA C均为5甲基胞嘧啶，下标o代表磷酸二酯核苷间连接，且除非另有说明，其他核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。图4至17显示代表某些分子的化学绘图。
AAV/HBV小鼠模型
在AAV/HBV小鼠模型中，以携带HBV基因组的重组腺相关病毒(AAV)(AAV/HBV)感染的小鼠维持稳定的病毒血症及抗原血症超过30周(Dan Yang等人,2014Cellular&Molecular Immunology 11,71–78)。
无特定病原体的雄性C57BL/6小鼠(4-6周龄)购自SLAC(中国科学院上海实验动物中心)并且圈养在动物护理设施中独立通风的笼内。遵循如WuXi IACUC所示的动物护理和使用指南(研究机构动物护理和使用委员会，WUXI IACUC实验方案编号R20131126-小鼠)。允许小鼠适应新环境3天并将其根据实验设计进行分组。
将重组AAV-HBV稀释于PBS中，每次注射200微升。这种重组病毒携带1.3拷贝的HBV基因组(基因型D，血清型ayw)。
在第0天，所有小鼠通过尾静脉注射200微升的AAV-HBV(1x1011的载体基因组)。在给药前第23天(D23,AAV-HBV注射后23天)，根据HBV标记物的血清水平和体重将动物分组。每组被圈养在铺有玉米芯垫料的聚碳酸酯笼子中(最多5只/笼)。分布低、中和高HBV滴度值，确保组均值在各组之间相似。可以用寡核苷酸处理动物组群，这些寡核苷酸可以是GalNAc缀合的或未缀合的。所有血清收集(0.1毫升血液/小鼠)都是在用异氟迷吸入麻醉动物后，通过眶后采血进行的。
HeLa细胞系
HeLa细胞系购自European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC,#93021013)，并按照供应商的建议在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中维持。为了进行测定，将2,500个细胞/孔接种在具有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺AQ、1％NEAA、25微克/毫升庆大霉素的Eagle’s最小必需培养基(Sigma，M2279)的96多孔板中。
分化的HepaRG细胞培养物(无HBV感染)
在37℃下于含5％CO2的潮湿空气中以完全HepaRG生长培养基培养HepaRG细胞(Biopredics International,Rennes,法国,录号HPR101)2周，所述完全HepaRG生长培养基由William’s E培养基(Sigma W4128)、生长培养基补充物(Biopredics,目录号ADD710)和1％(v/v)GlutaMAX-I(Gibco#32551)组成。
为了启动分化，使细胞在完全HepaRG生长培养基上生长2周，直到完全铺满。用HepaRG分化培养基交换一半的培养基，所述HepaRG分化培养基由William’s E培养基(Sigma W4128)、生长培养基补充物(Biopredics,目录号ADD710)和1％(v/v)GlutaMAX-I(Gibco#32551)组成,DMSO的终浓度为0.9％(v/v)。3天后，培养基被完全分化培养基(DMSO的终浓度为1.8％(v/v))完全取代，细胞在其中维持约2周，每7天更新一次分化培养基。分化的HepaRG细胞(dHepaRG)呈现由单层胆管样细胞围绕的肝细胞样细胞岛。在化合物处理之前，将dHepaRG细胞以每孔80,000个细胞接种到胶原蛋白I包被的96孔板(CorningBioCoat REF354407)中的100微升完全分化培养基中。在寡核苷酸处理之前，允许细胞在铺板后于96孔板中恢复其分化表型约1周。处理后6天分离RNA。
HBV感染的dHepaRG细胞
在37℃下于含5％CO2的潮湿空气中以完全HepaRG生长培养基培养HepaRG细胞(Biopredics International,Rennes,法国,录号HPR101)2周，所述完全HepaRG生长培养基由William’s E培养基(GIBCO)、生长培养基补充物(Biopredics,目录号ADD710)和1％(v/v)GlutaMAX-I(Gibco#32551)以及1x Pen/Strep(Gibco,#15140)组成。
为了启动分化，将0.9％(v/v)DMSO(Sigma-Aldrich,D2650)加入到铺满细胞的生长培养基中。一周后，培养基被完全分化培养基(补充有1.8％(v/v)DMSO的HepaRG生长培养基)取代，细胞在其中维持约4周，每7天更新分化培养基。分化的HepaRG细胞(dHepaRG)呈现由单层胆管样细胞围绕的肝细胞样细胞岛。
在HBV感染和化合物处理之前，将dHepaRG细胞以每孔60,000个细胞接种到胶原蛋白I包被的96孔板(Gibco，Cat#A11428-03)中的100微升完全分化培养基中。在HBV感染之前，允许细胞于铺板后在96孔板中恢复其分化表型约1周。
用HBV颗粒按MOI为30感染dHepaRG细胞。由产生HBV的HepG2.2.15细胞产生HBV颗粒(Sells等人1987Proc Natl Acad Sci U S A84,1005–1009)。先前已经描述了dHepaRG培养条件、分化和HBV感染(Hantz,2009,J.Gen.Virol.,2009,90:127-135)。简言之，每孔加入120微升含有4％PEG-8000和病毒原液(20至30GE/细胞)的完全分化培养基(由William’s E培养基(GIBCO)、生长培养基补充物(Biopredics,目录号ADD710)和1％(v/v)GlutaMAX-I(Gibco#32551)以及1x Pen/Strep(Gibco,#15140)组成的HepaRG生长培养基，补充有1.8％(v/v)DMSO)。感染后一天，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞4次，并在实验期间第4天和第7天更换培养基(完全分化培养基)。
HBV感染的ASGPR-dHepaRG
从HepaRG细胞系(Biopredics International,Rennes,法国,Cat#HPR101)，使用慢病毒方法生成稳定过量表达人ASGPR1和ASGPR2的细胞系。用Sirion biotech按需生产的慢病毒(CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro)按MOI为300转导正在增殖的HepaRG细胞，所述慢病毒编码受CMV启动子控制的人ASGPR1和2以及嘌呤霉素抗性基因。将转导的细胞用1微克/毫升嘌呤霉素选择11天，随后在相同浓度的抗生素中维持以确保转基因稳定表达。通过RT-qPCR在mRNA水平(ASGPR1：相对于未转导为8560倍；ASGPR2：相对于未转导为2389倍)，以及通过流式细胞分析在蛋白质水平，证实ASGPR1/2过量表达。分化的细胞称为ASGPR-dHepaRG细胞。
在感染之前，使用1.8％DMSO使ASGPR-HepaRG细胞分化至少2周。HBV感染按上述对dHepaRG细胞的一样进行。
原代小鼠肝细胞(PMH)
根据文献(Berry和Friend,1969,J.Cell Biol；Paterna等人,1998,Toxicol.Appl.Pharmacol.)进行2步灌注实验方案后，从戊巴比妥麻醉的C57BL/6J小鼠的肝脏分离原代小鼠肝细胞。第一步是以HBSS+15mM HEPES+0.4mM EGTA进行5分钟，然后是以HBSS+20mM NaHCO3+0.04％BSA(Sigma#A7979)+4mM CaCL2(Sigma#21115)+0,2毫克/毫升2型胶原蛋白酶(Worthington#4176)进行12分钟。在冰上在5毫升冷Williams培养基E(WME)(Sigma#W1878，补充有1x Pen/Strep/谷氨酰胺、10％(v/v)FBS(ATCC#30-2030))中捕获肝细胞。
通过70微米接着40微米的细胞滤网(Falcon#352350和#352340)过滤粗细胞悬浮液，用WME补充至25毫升，于室温下在50x g下离心5分钟，沉淀肝细胞。移除上清液，将肝细胞重新悬浮于25毫升WME中。加入25毫升90％的Percoll溶液(Sigma#P4937；pH＝8.5-9.5)，在25℃、50x g下离心10分钟，移除上清液和漂浮的细胞。为了去除剩余的Percoll，将沉淀重新悬浮于50毫升WME培养基中，于25℃在50xg下离心3分钟，丢弃上清液。将细胞沉淀重新悬浮于20毫升WME培养基中，测定细胞数量和存活力(Invitrogen,Cellcount)，稀释至250,000个细胞/毫升。将每孔25,000个细胞接种在胶原蛋白涂层的96孔板(PD BiocoatCollagen I#356407)上，在37℃、5％CO2下孵育。3至4小时后，用WME洗涤细胞以去除未结合的细胞并更换培养基。接种24小时后，加入所需浓度的寡核苷酸，将细胞在37℃、5％CO2下孵育72小时。分离RNA(Qiagen,RNeasy 96)，然后根据制造商的实验方案，使用TaqMan测定法对靶基因(PAPD5:Mm01244121_m1 FAM-MGB、PAPD7:Mm01349513_m1 FAM-MGB)和看家基因(GusB Mm_01197698_m1,VIC-MGB)进行一步法RT-QPCR(Quanta Bioscience,qScript XLT1-Step RT-qPCR ToughMix)。
原代人肝细胞(PHH)自然感染测定
从PhoenixBio(Hiroshima,日本)获得原代人肝细胞(PHH)，所述原代人肝细胞通过胶原蛋白酶灌注方法从具有人源化肝脏的嵌合uPA/SCID小鼠分离。按每孔7x 104个细胞的浓度将细胞接种在I型胶原蛋白包被的96孔板上Phoenix Bio提供的培养基中(进一步详细信息参见Ishida等人,2015Am J Pathol.第185卷第1275-1285页)。HBV基因型D源自HepG2.2.15细胞培养物上清液，并利用PEG沉淀进行浓缩。于37℃在含有4％PEG 8000的PHH培养基中按MOI为10感染PHH 20小时，然后用PBS洗涤细胞4次。在感染后第1天，将寡核苷酸递送到最终体积为125微升的PHH培养基中的细胞中。在感染后第4天和第7天再次处理细胞。在感染后第11天，收获上清液和细胞。使用CLIA ELISA测定法评估上清液中HBsAg和HBeAg水平(参见“材料和方法”部分；HBV抗原测量)。根据制造商的实验方案，使用MagNAPure机制人和MagNA Pure 96细胞RNA大体积试剂盒(Roche，#05467535001)从细胞中提取mRNA。使用如“材料和方法”部分中描述的实时PCR分析PAPD5和PAPD7 mRNA的相对表达水平。
HBV抗原测量
为了评估对HBV抗原表达和分泌的影响，在第11天收集上清液。根据制造商的实验方案，使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic#CL0310-2、#CL0312-2)测量HBV增殖参数、HBsAg和HBeAg的水平。简言之，将每孔25微升上清液转移到相应的抗体包被的微量滴定板中，并加入25微升酶缀合试剂。将板于室温下在摇床上孵育60分钟，然后使用自动洗涤器用洗涤缓冲液洗涤孔5次。向每个孔中加入25微升底物A和B。将板于室温下在摇床上孵育10分钟，然后使用Envision发光读数器(Perkin Elmer)测量发光。
HBV感染细胞的细胞内HBV mRNA的实时PCR
通过使用QuantStudio 12K Flex(Applied Biosystems)、TaqMan RNA-to-CT 1-Step试剂盒(Applied Biosystems,#4392938)、人ACTB内源对照(Applied Biosystems,#4310881E)以技术重复进行qPCR来定量HBV mRNA。Taqman试剂与商业ThermoFisherSceintific引物(HBV Pa03453406_s1、ACTB 4310881E)一起使用。使用归一化至参考基因ACTB和PBS处理细胞的比较循环阈值2-ΔΔCt方法，分析mRNA表达。
PAPD5和PAPD7 mRNA表达的实时PCR
以从处理的细胞或均质组织样本中提取的RNA进行QPCR。在RNA/LNA双链体变性(90℃，40秒)后，使用一步法实验方案(qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR Low ROXTM,Quanta Bioscience，#95134-500)，在双链体设置中使用下列TaqMan引物测定法(ThermoFisher Scientific)，根据提供者的建议，进行实时PCR：
PAPD5(Hs00223727_m1,FAM-MGB)
PAPD7(Hs00173159_m1,FAM-MGB)，
看家基因GUSB(Hu_4326320E,VIC-MGB)。
HBV DNA定量病毒颗粒滴度
根据制造商的实验方案，使用QIAamp UltraSens Virus试剂盒(Qiagen，#53704)进行HBV DNA提取，其中进行以下优化。将30微升和3微升病毒样品稀释到1毫升PBS中，然后加入缓冲液AC。第一个离心步骤在全速和4℃下进行45分钟。使用QuantStudio 12K Flex(Applied Biosystems)、TaqMan Gene Expression Master Mix(Applied Biosystems,#4369016)和上述表9中所示引物的1:1:0.5预混物、以及100μM重构的探针，通过qPCR一式两份定量HBV DNA。使用以下设置进行qPCR：UDG孵育(2分钟，50℃)，酶活化(10分钟，95℃)和qPCR(40个循环：95℃变性15秒，60℃退火和延伸1分钟)。基因组当量计算基于由已知浓度的HBV基因型D质粒稀释液产生的标准曲线。
可以使用HBV核心-特异性引物(Integrated DNA Technologies)(表11)，在从处理的细胞分离的细胞内mRNA上进行QPCR，来确定HBV颗粒滴度。
表11：HBV核心特异性TaqMan探针
ZEN为内部淬灭剂(internal quencher)
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成是本领域通常已知的。以下是可以应用的实验方案。本发明的寡核苷酸可以通过在装置、支持物和所用浓度方面稍微改变的方法制备。
使用亚磷酰胺方法在Oligomaker 48上以1μmol规模，在尿苷通用支持物上合成寡核苷酸。在合成结束时，使用氨水在60℃下5-16小时，将寡核苷酸从固体支持物上切下。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相提取，纯化寡核苷酸，并通过UPLC进行表征，并通过ESI-MS进一步确认分子量。
寡核苷酸的延长：
使用乙腈中0.1M的5’-O-DMT-保护的amidite溶液和乙腈中DCI(4,5-二氰基咪唑)(0.25M)作为激活剂，进行β-氰乙基-亚磷酰胺(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)或LNA-T)的偶联。对于最后的循环，可以使用具有所需修饰的亚磷酰胺，例如，用于连接缀合物基团的C6接头或缀合物基团本身。使用氢化黄原胶(0.01M，在9:1的乙腈/吡啶中)进行硫醇化用于引入硫代磷酸酯连接。可以使用在7:2:1的THF/吡啶/水中的0.02M碘，引入磷酸二酯连接。其余试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。
对于后固相合成缀合，可以在固相合成的最后一个循环中使用可商业获取的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在脱保护和从固体支持物切下后，分离氨基连接的脱保护的寡核苷酸。使用标准合成方法，通过官能团活化，引入缀合物。
通过RP-HPLC纯化：
通过制备型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10 mm柱上纯化粗化合物。使用0.1M乙酸铵pH8和乙腈作为缓冲液，流速为5毫升/分钟。将收集的级分冻干，得到纯化的化合物，通常为白色固体。
缩写：
DCI：4,5-二氰基咪唑
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMT：4,4’-二甲氧基三苯甲基
THF：四氢呋喃
BZ：苯甲酰基
Ibu：异丁酰基
RP-HPLC：反相高效液相色谱
Tm分析：
将寡核苷酸和RNA靶(磷酸盐连接的，PO)双链体在500毫升无RNase的水中稀释至3mM，并与500毫升2x Tm缓冲液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM磷酸钠，pH7.0)混合。将溶液加热至95℃，3分钟，然后在室温下退火30分钟。在配备有Peltier温度编程器PTP6的Lambda40UV/VIS分光光度计上使用PE Templab软件(Perkin Elmer)测量双链体解链温度(Tm)。温度从20℃斜坡上升到95℃然后下降到25℃，记录260纳米处的吸光度。使用解链和退火的一阶导数(first derivative)和局部最大值，来评估双链体Tm。
实施例1：在HeLa细胞中针对体外功效筛选靶向PAPD5和PAPD7(双特异性)的反义寡核苷酸
使用靶向SEQ ID NO:17、18和19的16至18mer gapmer进行寡核苷酸筛选。在表达PAPD5和PAPD7两者的HeLa细胞中在体外实验中进行功效测试。
如“材料与方法”部分描述，培养HeLa细胞。将细胞孵育24小时，然后加入溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸的最终浓度为5和25μM，最终培养体积为100微升/孔。添加寡核苷酸化合物后3天收获细胞，使用PureLink Pro 96RNA纯化试剂盒(Ambion)，根据制造商的说明书，提取RNA。
通过如“材料与方法”部分所述实时PCR，分析PAPD5和PAPD7mRNA水平。
PAPD5 mRNA和PAPD7 mRNA相对表达水平作为对照样本(PBS处理的细胞)平均值的百分比(即值越低，抑制越强)，显示在表12中。
表12：抗PAPD5/PAPD7化合物的体外功效(双链体QPCR的单次实验)。将PAPD5和PAPD7 mRNA水平归一化至HeLa细胞中的GUSB，并显示为对照(PBS处理的细胞)的百分比。
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实施例2：在HBV感染的HepaRG细胞中的体外EC50和功效
在HBV感染的dHepaRG细胞中测试实施例1中所有寡核苷酸对HBV增殖参数的影响。
为了比较目的，将本发明的反义寡核苷酸与直接靶向HBV mRNA的反义寡核苷酸进行比较。表13列出了HBV靶向寡核苷酸。
表13：进行比较的HBV靶向寡核苷酸
描述 化合物 SEQ ID NO 参考
HBV靶向1(HBV1) AGCgaagtgcacaCGG 27 WO2015/173208
HBV靶向2(HBV2) GCGtaaagagaGG 28 WO2015/173208
在96孔板中培养HBV感染的dHepaRG细胞(描述于“材料与方法”部分，HBV感染的dHepaRG细胞)。HBV感染后一天，使用无辅助摄入(gymnosis)，将三倍系列稀释液中的寡核苷酸(20.00、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.03、0.01μM寡核苷酸)添加到细胞中。测试总共49种寡核苷酸。一式三份进行实验，以及PBS作为对照。在第4天和第7天重复寡核苷酸处理。
在感染后第11天，收获上清液和细胞。
使用CLIA ELISA测定法评估上清液中HBsAg和HBeAg水平(参见“材料与方法”，HBV抗原测量)。
使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算HBV增殖参数HBsAg和HBeAg的EC 50、最大KD(功效)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。结果显示于表14中，为对照样本平均值(PBS对照和未感染(NIF))的百分比，计算方式为[(测试值–平均值PBS)/(平均值NIF–平均值PBS)]*100)。
表14：抗PAPD5/PAPD7化合物对HBV感染的dHepaRG细胞中HBsAg和HBeAg的EC50和最大KD(3次的平均)。
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从这些数据可以看出，大量的化合物对HBsAg和HBeAg具有良好的效果。具有SEQID NO 17和18的寡核苷酸基序的化合物似乎比使用SEQ ID NO:19的基序制备的化合物更有效。
在图3中，也可以看出，对于减少HeLa细胞中PAPD5和PAPD7超过70％的寡核苷酸，与这些寡核苷酸在HBV感染的dHepaRG细胞中减少HBsAg的能力具有高度相关性。
实施例3：在HeLa细胞中针对体外功效筛选靶向PAPD5和PAPD7的反义寡核苷酸
使用不同的设计扩展了SEQ ID NO:17、18和19的寡核苷酸基序的多样性，生成了298个寡核苷酸的另一文库。在如实施例1中描述的体外实验中进行功效测试，除了筛选仅在5μM下进行以外。
PAPD5 mRNA和PAPD7 mRNA相对表达水平作为对照样本(PBS处理的细胞)平均值的百分比(即值越低，抑制越强)，显示在表15中。
表15：抗PAPD5/PAPD7化合物的体外功效(双链体QPCR的单次实验)。将PAPD5和PAPD7 mRNA水平归一化至HeLa细胞中的GUSB，并显示为对照(PBS处理的细胞)的百分比。
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从这些数据可以看出，基于SEQ ID NO:19的基序序列的LNA-gapmer设计具有非常低(0至10％之间)的PAPD5和PAPD7敲低。
实施例4：选定的反义寡核苷酸在HeLa细胞中的体外EC50和功效。
使用相同的测定法以寡核苷酸浓度50、15.81、5.00、1.58、0.50、0.16、0.05和0.016μM，测定实施例1和3中表现最好的寡核苷酸的EC50和功效(KD)。
使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算PAPD5和PAPD7 mRNA表达的EC 50、最大KD(功效)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡核苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。结果显示于表16中。
表16：抗PAPD5/PAPD7化合物对HeLa细胞中PAPD5和PAPD7mRNA表达的EC50和最大KD
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实施例5：使用选定的靶向PAPD5和PAPD7的反义寡核苷酸对HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞的体外效应。
基本上使用实施例2的测定法(进行了以下更改)，在ASGPR-dHepaRG中筛选了实施例3中筛选的寡核苷酸选择物。在HBV感染的ASGPR-dHepaRG中，以浓度为20、6.67和2.22μM的寡核苷酸和表17中的比较分子，进行筛选。
为了比较目的，与本发明的寡核苷酸一起测试了表17中单靶向PAPD5和单靶向PAPD7寡核苷酸的组合。
表17：单靶向PAPD5和PAPD7寡核苷酸的组合
表18和19显示了HBsAg和HBeAg水平的降低，值越大，抑制越强。
表18：HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中三种浓度的抗PAPD5/PAPD7化合物对HBsAg的体外功效(3次的平均值)。
表19：HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中三种浓度的抗PAPD5/PAPD7化合物对HBeAg的体外功效(3次的平均值)。
从这些数据可以看出，与组合处理(2x 20μM)相比，表现最好的双特异性PAPD5/PAPD7寡核苷酸在一半寡核苷酸浓度(20μM)时对HBsAg和HBeAg减少方面效果更好。
实施例6：在HeLa细胞中针对体外功效筛选靶向PAPD5和PAPD7的立体限定的反义寡核苷酸
为了更进一步围绕SEQ ID NO:18的基序序列扩展多样性，基于CMP ID NO 18_1的立体随机亲本化合物，制备了立体限定的寡核苷酸文库。
在如实施例1中描述的体外实验中进行功效测试，除了筛选使用1μM以及一些使用5μM进行。
PAPD5 mRNA和PAPD7 mRNA相对表达水平作为亲本寡核苷酸的百分比(即值越大，抑制越好),显示在表20中。
表20：立体限定的抗PAPD5/PAPD7化合物的体外功效(双链体QPCR的单次实验)。将PAPD5和PAPD7 mRNA水平归一化至HeLa细胞中的GUSB，并显示为对照(PBS处理的细胞)的百分比。
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实施例7：选定的立体限定反义寡核苷酸在HeLa细胞中的体外EC50和功效。
使用相同的测定法，以寡核苷酸浓度33、10.44、3.33、1.044、0.33、0.104、0.033和0.01μM，测定实施例6中表现最好的寡核苷酸的EC50和功效(KD)。
使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算PAPD5和PAPD7 mRNA表达的EC 50、最大KD(功效)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。结果显示于表21中。
表21：抗PAPD5/PAPD7化合物对HeLa细胞中PAPD5和PAPD7 mRNA表达的EC50和最大KD。CMP ID NO 18_1是立体随机的亲本化合物。
从这些数据可以看出，与PAPD5和PAPD7敲低相关的EC50和功效的改进可以通过立体限定的子文库和通过完全立体限定的化合物两者来实现。
实施例8：使用选定的靶向PAPD5和PAPD7的立体限定反义寡核苷酸对HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞的体外效应。
测试从实施例6选择的最有效寡核苷酸对HBV感染的dHepaRG-ASGPR细胞中HBV增殖参数的效应。
实验按实施例5中的描述进行。
表22和23显示HBsAg和HBeAg水平的降低，值越大，抑制越强。
表22：HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中三种浓度的抗PAPD5/PAPD7化合物对HBsAg的体外功效(3次的平均值)。CMP ID NO 18_1是立体随机的亲本化合物。
表23：HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中三种浓度的抗PAPD5/PAPD7化合物对HBeAg的体外功效(3次的平均值)。CMP ID NO 18_1是立体随机的亲本化合物。
实施例9：使用选定的靶向PAPD5和PAPD7的GalNAc缀合的反义寡核苷酸对HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞的体外效应。
将从实施例1选择的最有效寡核苷酸与GalNAc缀合物部分缀合，在HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中测试它们对HBV增殖参数的效应。
按实施例2中所述，使用HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞和无比较的寡核苷酸，评估GalNAc缀合的寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的EC50和功效(KD)。结果显示于表24中。
除了实施例2中的程序外，将收获的细胞在PBS中洗涤一次，在MagNA Pure裂解缓冲液(Roche#05467535001)中裂解，储存在-80℃。使用MagNA Pure“96Cellular RNA LargeVolume试剂盒”(Roche#05467535001)提取RNA，按“材料与方法”部分PAPD5和PAPD7的实时PCR中所述，测定PAPD5和PAPD7 mRNA表达水平。使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算EC 50和功效(KD)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡核苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。结果显示于表24A中。
表24：抗PAPD5/PAPD7化合物对HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中HBsAg和HBeAg的EC50和最大KD(3次的平均)。
从这些数据可以看出，通过将GalNAc部分与寡核苷酸缀合，EC50值提高了至少40倍(注意，当前表格中以nM为单位中，而表14中以μM为单位)。例如，化合物20_15(GalNAc缀合)的HBsAg减少比化合物18_05(20_15的裸露版本)提高了176倍。
表24A：GalNAc缀合的抗PAPD5/PAPD7化合物的体外功效和效力(EC50)。将PAPD5和PAPD7 mRNA水平归一化至ASGPR-dHepaRG细胞中的GUSB，并显示为对照(PBS处理的细胞)的百分比。
从这些数据可以看出，大多数选定的靶向PAPD5和PAPD7的GalNAc缀合寡核苷酸能够降低mRNA水平至10％以下。
实施例10：在dHepaRG细胞中针对体外功效筛选靶向PAPD5和PAPD7的反义寡核苷酸
在dHepaRG细胞中筛选于HeLa细胞中针对PAPD5和PAPD7敲低筛选出来的寡核苷酸(实施例1和3)，以证明在肝细胞系中有效的敲低。
如“材料与方法”部分所述培养dHepaRG细胞。在100微升/孔的最终培养体积中使用浓度为50、15.81、5.00、1.58、0.50、0.16、0.05和0.016μM的寡核苷酸。添加寡核苷酸化合物后6天收获细胞，使用PureLink Pro 96RNA纯化试剂盒(Ambion)，根据制造商的说明提取RNA。
通过“材料与方法”部分中所描述的实时PCR，分析PAPD5和PAPD7mRNA水平。使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算PAPD5和PAPD7 mRNA表达的EC 50、最大KD(功效)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡核苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。
结果显示于表25中。
表25：抗PAPD5/PAPD7化合物对dHepaRG细胞中PAPD5和PAPD7 mRNA表达的EC50和最大KD。
从这些数据可以看出，在肝细胞衍生的细胞系中也可以实现有效的靶标减少。
实施例11：在dHepaRG细胞中针对体外功效筛选靶向PAPD5和PAPD7的立体限定的反义寡核苷酸
在dHepaRG细胞中筛选于HeLa细胞中针对PAPD5和PAPD7敲低筛选出来的立体限定的寡核苷酸(实施例7)，以证明在肝细胞系中有效的敲低。
按实施例10中所述以33、10.44、3.33、1.044、0.33、0.104、0.033和0.01μM的寡核苷酸浓度进行筛选。
通过“材料与方法”部分中所描述的实时PCR,分析PAPD5和PAPD7mRNA水平。使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算PAPD5和PAPD7 mRNA表达的EC 50、最大KD(功效)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡核苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。
结果显示于表26中。
表26：抗PAPD5/PAPD7立体限定的化合物对dHepaRG细胞中PAPD5和PAPD7 mRNA表达的EC50和最大KD。
从这些数据可以看出，立体限定的寡核苷酸在肝细胞衍生细胞系中也有效减少靶标。
实施例12：使用选定的靶向PAPD5和PAPD7的GalNAc缀合的反义寡核苷酸对HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞的体外效应。
将从实施例5选择的最有效的寡核苷酸与GalNAc缀合物部分缀合，在HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中测试它们对HBV增殖参数的效应。
为了比较目的，将本发明的反义寡核苷酸与表13中所示的HBV靶向寡核苷酸的GalNAc缀合版本进行比较。GalNAc缀合版本显示于表13A中。
表13A：进行比较的HBV靶向寡核苷酸
描述 化合物 SEQ ID NO 参考
HBV靶向1 GN2ocoaoAGCgaagtgcacaCGG 29 WO2015/173208
HBV靶向2 GN2ocoaoGCGtaaagagaGG 30 WO2015/173208
按实施例2中所述，使用HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞，评估GalNAc缀合的寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的EC50和功效(KD)。结果显示于表27中。
除了实施例2中的程序外，将收获的细胞在PBS中洗涤一次，在MagNA Pure裂解缓冲液(Roche#05467535001)中裂解，储存在-80℃。使用MagNA Pure“96Cellular RNA LargeVolume试剂盒”(Roche#05467535001)提取RNA，按“材料与方法”部分PAPD5和PAPD7的实时PCR中所述，测定PAPD5和PAPD7 mRNA表达水平。使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算EC 50和功效(KD)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。结果显示于表27A中。
表27：抗PAPD5/PAPD7化合物对HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中HBsAg和HBeAg的EC50和最大KD(3次的平均)。
表中所示的化合物如表10所示在C6接头之后的ca二核苷酸中具有磷酸二酯连接。
表27A：GalNAc缀合的抗PAPD5/PAPD7化合物的体外功效和效力(EC50)。将PAPD5和PAPD7 mRNA水平归一化至ASGPR-dHepaRG细胞中的GUSB，并显示为对照(PBS处理的细胞)的百分比。
Inf＝由于缺乏剂量响应不能计算EC50。
正如预期的那样，两种HBV靶向分子对PAPD5和PAPD7的效应很不显著，因此，它们的HBsAg和HBeAg效应与它们减少PAPD5或PAPD7的能力没有关系。其余经测试的化合物显示出靶标减少低于85％和EC50值低于0.09μM，这与表27中所见对HBsAg和HBeAg的效应具有良好的相关性。
实施例13：使用选定的靶向PAPD5和PAPD7的GalNAc缀合的反义寡核苷酸对HBV感染的PHH细胞的体外效应。
在HBV感染的原代人肝细胞中进一步测试选择的GalNAc缀合的寡核苷酸(见“材料与方法”部分；PHH自然感染测定)，以说明在具有天然ASGPR表达的体外***中的功效。使用的寡核苷酸浓度为三倍系列稀释液(20.00、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.03、0.01μM寡核苷酸)。
使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算HBV增殖参数HBsAg和HBeAg的EC 50、最大KD(功效)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡核苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。结果显示于表28中。
使用相同的算法计算PAPD5和PAPD7 mRNA表达的EC 50、最大KD(功效)。结果显示于表28A中。
表28：抗PAPD5/PAPD7化合物对HBV感染的PHH细胞中HBsAg和HBeAg的EC50、最大KD(3次的平均)。
表中所示的化合物如表10所示在C6接头之后的ca二核苷酸中具有磷酸二酯连接。
从这些数据可以看出，选定的靶向PAPD5和PAPD7的GalNAc缀合的寡核苷酸能够在感染的原代人肝细胞中减少HBV抗原分泌。
表28A：GalNAc缀合的抗PAPD5/PAPD7化合物的体外功效和效力(EC50)。将PAPD5和PAPD7 mRNA水平归一化至PPH细胞中的GUSB，并显示为对照(PBS处理的细胞)的百分比。
NA＝由于技术错误没有评估
从这些数据可以看出，选定的靶向PAPD5和PAPD7的GalNAc缀合的寡核苷酸能够将其靶标减少至11％或更低，例外的是化合物20_17看起来对PAPD5 mRNA具有非常小的效应，但保持了对PAPD7 mRNA的效应。
实施例14：在HeLa细胞和PMH细胞中针对体外功效筛选靶向人和小鼠PAPD5和PAPD7(双特异性)的反义寡核苷酸。
在人HeLa细胞系和在原代小鼠肝细胞(PMH)中，使用靶向PAPD5和PAPD7的人和小鼠转录本的gapmer寡核苷酸(表5)，进行寡核苷酸筛选。
按实施例1中所述以25μM的浓度进行HeLa细胞中的筛选。
按“材料与方法”部分中“原代小鼠肝细胞”下所述，使用5μM寡核苷酸进行PMH细胞中的筛选。
图11显示了筛选的结果，每个点代表了表5中的化合物和其减少PAPD7 mRNA(Y轴)和PAPD5 mRNA(X轴)的能力。在HeLa细胞(人)中，PAPD5和PAPD7 mRNA减少之间存在良好的相关性，而在PMH(小鼠)细胞中，看起来，与PAPD5 mRNA的减少相比，PAPD7mRNA的减少不是非常有效。
对小鼠肝细胞中PAPD7 mRNA不太强的抑制的合理解释是，原代小鼠肝细胞中表达的PAPD7的主要剪接mRNA转录本在寡核苷酸结合位点的下游有一个转录起始点。这一点直到对原代小鼠肝细胞进行全转录组鸟枪法测序(RNAseq)后才发现。
实施例15：使用选定的靶向PAPD5和PAPD7的GalNAc缀合的反义寡核苷酸对HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞的体外效应。
将从实施例2和5进一步选择的寡核苷酸与GalNAc缀合物部分缀合，在HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中测试它们对HBV增殖参数的效应。
按实施例2中所述，使用HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞，评估GalNAc缀合的寡核苷酸对HBsAg和HBeAg的EC50和功效(KD)。结果显示于表29中。
除了实施例2中的程序外，将收获的细胞在PBS中洗涤一次，在MagNA Pure裂解缓冲液(Roche#05467535001)中裂解，储存在-80℃。使用MagNA Pure“96Cellular RNA LargeVolume试剂盒”(Roche#05467535001)提取RNA，按“材料与方法”部分PAPD5和PAPD7的实时PCR中所述，测定PAPD5和PAPD7 mRNA表达水平。使用drc包(v3.0-1)中的R函数drm()计算EC 50和功效(KD)，以四参数log-logistic函数拟合感兴趣基因的表达作为寡苷酸浓度的函数以获得EC50值和最大敲低。结果显示于表29A中。
表29：抗PAPD5/PAPD7化合物对HBV感染的ASGPR-dHepaRG细胞中HBsAg和HBeAg的EC50和最大KD(3次的平均)。
/>
表29A：GalNAc缀合的抗PAPD5/PAPD7化合物的体外功效和效力(EC50)。将PAPD5和PAPD7 mRNA水平归一化至ASGPR-dHepaRG细胞中的GUSB，并显示为对照(PBS处理的细胞)的百分比。
实施例16：使用选定的双特异性PAPD5和PAPD7靶向寡核苷酸对自染色体整合的HBV DNA表达HBsAg的效应。
在目前的实验中，测试了对PAPD5和PAPD7具有良好效力的选择的GalNAc缀合抗PAPD5/7寡核苷酸是否能够减少人肝细胞癌细胞系Hep3B中HB抗原和mRNA表达，所述细胞系Hep3B自染色体整合的HBV DNA分泌HB抗原。
Hep3B细胞(Knowles等人,1980.Science 209pp.497-499)购自ATCC(ATCC HB-8064)，并在补充有10％FBS的Eagle’s最小基本培养基(EMEM)中培养。将细胞以每孔1.5x105个细胞的浓度涂铺在胶原蛋白包被的96孔板上，并在37℃下于含5％CO2的潮湿空气中培养。在接种细胞后一天，向细胞中添加寡核苷酸，使用浓度从20μM开始及其三倍系列稀释液(20.00、6.67、2.22、0.74、0.25、0.08、0.03、0.01μM寡核苷酸)。在第4天和第7天通过改变培养基，重复处理。在第11天，收获上清液用于HBsAg测量(按“材料与方法”部分HBV抗原测量下所述进行)，以PBS洗涤细胞一次，向每个孔中加入200微升MagNA Pure裂解缓冲液，将板储存在-80℃，用于RNA提取。
使用MagNA Pure机器人和MagNA Pure 96Cellular RNA Large Volume试剂盒(Roche,#05467535001)根据制造商的实验方案从裂解的Hep3B细胞提取细胞内mRNA。使用QuantStudio 12K Flex(Applied Biosystems)、TaqMan RNA-to-CT 1-Step试剂盒(Applied Biosystems,#4392938)、人ACTB内源对照(Applied Biosystems,#4310881E)、以及PAPD5和PAPD7 mRNA Taqman引物与试剂(Life Technologies,测定ID Hs00900790_m1(PAPD5)和Hs00173159_m1(PAPD7)以及定制测定ID APMFW4G(Small HBs))，分别进行RT-qPCR，以技术性重复定量PAPD5和PAPD7 mRNA。使用以下设置进行qPCR：UDG孵育(15分钟，48℃)、酶活化(10分钟、95℃)和qPCR(40个循环：95℃变性15秒，60℃退火和延伸1分钟)。
使用GraphPad Prism 7.02非线性拟合，计算HBsAg、HBs mRNA、PAPD5和PAPD7减少的EC 50和最大KD(以盐水％表示最大功效)。结果在显示于表30和31中。
表30：抗PAPD5/PAPD7化合物对Hep3B细胞中从染色体整合体表达的HBs mRNA和HBsAg的EC50和最大KD(3个生物学重复和2个技术性重复的平均值)。
NA＝不适用
表31：抗PAPD5/PAPD7化合物对Hep3B细胞中PAPD5和PAPD7mRNA表达的EC50和最大KD(3个生物学重复和2个技术性重复的平均值)。
从这些数据可以看出，7种测试的寡核苷酸中有4种能够将从整合的HB片段表达的HBsAg和HBs mRNA减少到盐水对照的55％以下。
实施例17：选定的双特异性PAPD5和PAPD7靶向寡核苷酸在非人类灵长类动物中的效应。
通过RNA测序对食蟹猴肝脏中PAPD5和PAPD7 mRNA表达的抑制进行量化。每周以盐水或以1、3或10毫克/千克/周的化合物ID NO20_12处理动物一次，为期4周(每组6只动物，第1、8、15、22和29天共5次给药)，并在第29天(给药后4周)处死。平行地，每周以盐水或以10毫克/千克/周的化合物ID NO 20_12处理动物一次，也为期4周，共5次给药，但是另有4周的恢复期，在第56天(4周给药+4周恢复)处死。
放血后20分钟内将肝脏样本采集在RNA-Later(Qiagen cat.76104)中。使用Tissue Lyser II(Qiagen)在800微升Magnapure裂解缓冲液(Roche)中对约10毫克组织进行裂解。然后将350微升等***解液转移到Magnapure 96Deep Well Plate中，并自动进行处理。使用吸收光谱仪(Nanodrop,ThermoFischer)定量RNA，使用装配RNA 6000Nanochips的Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent cat.5067-1511)进行微流毛细管阵列电泳来控制RNA的完整性(按照RNA完整数，RIN)。
为了构建带条形码的cDNA文库，将400纳克总RNA等分样作为输入物用于TruSeqTMStranded总RNA试剂盒(lllumina cat.20020598)以及Ribo-ZeroTMGold rRNA去除试剂盒(Illumina cat.MRZG12324)。使用Agilent高敏感性DNA试剂盒(cat.5067-4627)进行电泳来估计文库的大小分布。使用KAPA文库定量qRT-PCR试剂盒(Kapa Biosystemscat.KK4824)对文库进行定量。将文库以等摩尔浓度合并，稀释至11pM，然后如下加载到Illumina HiSeq 4000测序仪的流动池上。使用HiSeq PE Rapid Cluster试剂盒v2(lllumina cat.PE-402-4002)延伸文库。使用TruSeq Rapid SBS试剂盒-HS(Illuminacat.FC-402-4001)采取两头测序读长(paired-end reads)(50个碱基对)对携带扩增簇的流动池进行测序。使用HiSeq测序控制软件(HCS)进行实时图像分析和碱基召回(calling)。使用CASAVA软件1.8版产生序列读长对的FASTQ文件。
所获得的最低文库大小为1700万个读长对，最高为1.14亿读长对。每个样本平均有5000万个读长对，中位数为每个样本4700万个读长对。使用GSNAP程序将每个文库的读长对与RefSeq/NCBI数据库中的食蟹猴转录本进行比对，以生成基因水平的原始计数(rawcounts)。将这些数据相对相应的库大小进行归一化(用于样本间比较)，对于每个转录本，将数据相对于相应转录本的长度进一步归一化(用于转录本间比较)。对于所有样本，这生成以归一化的单位RPKM(每一百万个匹配的读长中每一千碱基转录本的读长数)表示的转录本水平的表达。在对应的时间点，将处理的动物中PAPD5和PAPD7的值相对于盐水处理的动物进行归一化，结果显示于表32中。
表32：以CMP ID NO 20_12处理的食蟹猴肝脏中PAPD5和PAPD7mRNA的表达。
*对于同一时间点，相对于对照动物进行归一化
相对于相应的溶媒对照组，结果显示，在CMP ID NO 20_12的所有测试的剂量水平下，主要组动物和恢复动物的肝脏中PAPD5和PAPD7mRNA均得到了下调。肝脏中PAPD5 mRNA的下调出现饱和，其中在3和10毫克/千克时为约80％。PAPD7 mRNA的下调与剂量相关，在10毫克/千克时达到mRNA减少66％。在以10毫克/千克/周给药的恢复动物中，PAPD5 mRNA的下调为78％。对于PAPD7 mRNA，下调达到55％。后一个数据表明，最后一次给药后，PAPD5和PAPD7 mRNA的抑制在肝脏中持续至少4周。
实施例18：施用PAPD5和PAPD7靶向寡核苷酸后HBV感染的小鼠中对HBsAg和HBeAg的效应
本研究旨在显示在AAV/HBV小鼠模型中减少PAPD5和PAPD7转录时对HBV增殖参数的体内效应。
实施例14和图11B表明，使用单个寡核苷酸同时靶向小鼠细胞系中的PAPD5和PAPD7具有挑战性。因此，在本研究中，使用了表33中所列的两种寡核苷酸的组合，一种靶向小鼠PAPD5(CMP ID NO:22_1)，一种靶向小鼠PAPD7 CMP ID NO:22_1)。
表33：靶向小鼠PAPD5(SEQ ID NO:5)或小鼠PAPD7(SEQ ID NO:6)的寡核苷酸
GN2代表图2中所示的三价GalNAc簇，C6代表具有6个碳的氨基烷基基团，大写字母表示β-D-氧基LNA核苷，小写字母表示DNA核苷，所有LNA C均为5-甲基胞嘧啶，下标o表示磷酸二酯核苷间连接，并且除非另有说明，核苷间连接为硫代磷酸酯核苷间连接。
使用“材料与方法”部分中描述的AAV/HBV小鼠模型。在第0天以化合物22_1和23_1每种10毫克/千克的单剂量(分两次注射，间隔6小时)或以5毫升/千克的盐水(对照)，对小鼠(每组3只)进行皮下注射。使用“材料与方法”部分所述的方法，每3天测量一次血清中的HBsAg和HBeAg。为了测量靶标的敲低，在第3天和第14天处死两个中间组的小鼠，在第27天处死其余的小鼠。处死后，进行PBS灌注，然后取出其肝脏。将灌注后的肝脏切成小块后直接冷冻。
通过将冷冻的肝脏碎片加入到内含陶瓷珠和1毫升MagNA Pure裂解缓冲液(Roche#05467535001)的2毫升管中，从肝脏中提取mRNA。使用TissueLyser(Qiagen)将肝脏碎片匀质化。使用MagNA Pure“96Cellular RNA Large Volume试剂盒”(Roche#05467535001)从组织匀浆中分离RNA。裂解液可储存在-80℃。基本上使用“材料与方法”部分所述的qPCR测量PAPD5和PAPD7 mRNA，在TaqMan引物测定中进行了以下更改，该测定采用以下两种测定(ThermoFisher Scientific)进行：
小鼠GUSB Mm1197698_m1
小鼠PAPD5 Mm1244121_m1
小鼠PAPD7 Mm1349513_m1
小鼠TBP Mm00446971_m1
小鼠PAPD5 Mm_011244125m1
小鼠PAPD7 Mm1349513_m1
GUSB和TBP是用于PAPD5和PAPD7 mRNA归一化的看家基因，PAPD5和PAPD7 mRNA以看家基因下方所示的引物测定进行测量。
结果显示于以下表34、35和36中。表34中的数据还呈现于图18A和B中。
表34：以PAPD5和PAPD7靶向寡核苷酸处理的AAV/HBV小鼠中的HBsAg(Log10 IU/毫升血清)。
数据显示，在单次处理的AAV/HBV小鼠模型中，靶向PAPD5和PAPD7导致了HBsAg持续2log减少直至处理后27天。
表35：以PAPD5和PAPD7靶向寡核苷酸处理的AAV/HBV小鼠中的HBeAg(Log10 IU/毫升血清)。
和HBsAg一样，靶向PAPD5和PAPD7导致血清中HBeAg水平减少，尽管不如HBsAg那么显著。
表36：在以PAPD5和PAPD7靶向寡核苷酸单剂量处理(各10毫克/千克)后，AAV/HBV小鼠中的PAPD5和PAPD7 mRNA(第3天和第14天3只动物，第27天5只)和ALT水平(第0天11只动物，第14天8只，第27天5只)。
从这些数据可以看出，PAPD5和PAPD7靶向寡核苷酸分别导致PAPD5和PAPD7 mRNA水平降低，且在AAV/HBV小鼠模型中耐受性良好。

Claims (27)

1.反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸选自：
(i)TcAACtttcactTcAG
(ii)TCaACtttcacttcAG
(iii)TcAACtttcacttcAG
(iv)TCAActttcacttCaGT
(v)TcAActttcacttCAGT
(vi)TcAactttcacttCAGT，
其中，大写字母代表β-D-氧基LNA核苷；小写字母代表DNA核苷；所有胞嘧啶LNA核苷均为5-甲基胞嘧啶；且所有核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。
2.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是TcAACtttcactTcAG或其可药用盐。
3.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是TCaACtttcacttcAG或其可药用盐。
4.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是TcAACtttcacttcAG或其可药用盐。
5.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是TCAActttcacttCaGT或其可药用盐。
6.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是TcAActttcacttCAGT或其可药用盐。
7.权利要求1的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是TcAactttcacttCAGT或其可药用盐。
8.缀合化合物，其包含权利要求1-7任一项的反义寡核苷酸和与所述反义寡核苷酸连接的缀合物部分。
9.权利要求8的缀合化合物，其中缀合物部分能够结合脱唾液酸糖蛋白受体。
10.权利要求9的缀合化合物，其中缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
11.权利要求8的缀合化合物，其中所述缀合物部分共价连接所述反义寡核苷酸。
12.权利要求8的缀合化合物，其中接头位于反义寡核苷酸和缀合物部分之间。
13.权利要求12的缀合化合物，其中接头是生理学不稳定的接头。
14.权利要求12的缀合化合物，其中生理学不稳定接头是S1核酸酶敏感接头。
15.权利要求13的缀合化合物，其中生理学不稳定的接头是具有三个连续的磷酸二酯键的磷酸二酯连接的胞苷-腺苷二核苷酸。
16.权利要求13的缀合化合物，其中C6氨基烷基基团位于缀合物部分和生理学不稳定接头之间。
17.权利要求16的缀合化合物，其中缀合物部分能够结合脱唾液酸糖蛋白受体，且其中缀合物部分是三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分；其中所述缀合物部分共价连接所述反义寡核苷酸；其中具有三个连续的磷酸二酯键的磷酸二酯连接的胞苷-腺苷二核苷酸位于反义寡核苷酸和缀合物部分之间；且其中C6氨基烷基基团位于缀合物部分和所述具有三个连续的磷酸二酯键的磷酸二酯连接的胞苷-腺苷二核苷酸之间。
18.权利要求8-17任一项的缀合化合物，其具有选自以下的式：
(i)GN2-C6ocoaoTcAACtttcactTcAG；
(ii)GN2-C6ocoaoTCaACtttcacttcAG；
(iii)GN2-C6ocoaoTcAACtttcacttcAG；
(iv)GN2-C6ocoaoTCAActttcacttCaGT；
(v)GN2-C6ocoaoTcAActttcacttCAGT；和
(vi)GN2-C6ocoaoTcAactttcacttCAGT；
其中，大写字母代表β-D-氧基LNA核苷；所有胞嘧啶LNA核苷均为5-甲基胞嘧啶；小写字母代表DNA核苷；下标o代表磷酸二酯核苷连接；且所有其他核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接；
其中C6代表具有6个碳的氨基烷基基团；且
其中GN2代表图2中所示的三价GalNAc簇；
其中图2中波浪型键线表示所述三价GalNAc簇与C6氨基烷基基团缀合的位点。
19.权利要求1-7任一项的反义寡核苷酸或权利要求8-18任一项的缀合化合物的可药用盐。
20.权利要求1-7任一项的反义寡核苷酸或权利要求8-18任一项的缀合化合物的可药用钠盐。
21.权利要求1-7任一项的反义寡核苷酸或权利要求8-18任一项的缀合化合物的可药用钾盐。
22.药物组合物，其包含根据权利要求1至7之任一的反义寡核苷酸、或权利要求8至18之任一的缀合化合物或权利要求19至21之任一的可用盐，以及可药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或辅助剂。
23.权利要求22的药物组合物，其中可药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。
24.用于在表达PAPD5和PAPD7的靶细胞中调节PAPD5和PAPD7表达的体外方法，所述方法包括向所述靶细胞施用有效量的根据权利要求1至7之任一的反义寡核苷酸、或根据权利要求8至18之任一的缀合化合物、或权利要求19至21之任一的可用盐。
25.根据权利要求1至7之任一的反义寡核苷酸、或权利要求8至18之任一的缀合化合物、或权利要求19至21之任一的可用盐在制备用于在受试者中治疗HBV感染的药物中的用途。
26.根据权利要求1至7之任一的反义寡核苷酸、或权利要求8至18之任一的缀合化合物、或权利要求19至21之任一的可用盐在制备用于在受试者中治疗慢性HBV感染的药物中的用途。
27.根据权利要求1至7之任一的反义寡核苷酸、或权利要求8至18之任一的缀合化合物、或权利要求19至21之任一的可用盐在制备用于减轻HBV感染受试者的传染性的药物中的用途。
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